CN116041527A - 一种特异性结合e2-e2抗体复合物的抗体及其应用 - Google Patents

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Abstract

本申请提供了特异性结合E2‑E2抗体复合物的抗体及其应用。本申请提供的抗E2‑E2抗体复合物的抗体能够与E2‑E2抗体特异性结合，具有较好的结合活性和亲和力。通过使用本申请中的抗体进行夹心法检测E2，大大提高了E2检测的灵敏度和抗干扰能力，并且提高了低值样本的检出率。

Description

一种特异性结合E2-E2抗体复合物的抗体及其应用
技术领域
本发明涉及生物技术和医学技术领域，尤其是涉及一种抗雌二醇(E2)-雌二醇抗体复合物的抗体及其应用。
背景技术
雌二醇(Estradiol，E2)是固醇类激素，其基本骨架为甾体结构，即环戊烷多氢菲，由三个环己烷和一个环戊烷稠合而成。雌二醇是雌激素中最主要且生物活性最强的激素，其对哺乳动物的生殖系统、免疫反应和基因表达等方面起着重要作用。在血液中E2在男女的各种临床状况中均是重要的诊断标志物。
临床上，E2水平用于评估女性的月经失调，性早熟或青春期延迟以及卵巢功能，多毛症、多囊卵巢综合症，同时在妊娠相关疾病监测中，监测整个妊娠期间的E2水平，联合孕酮和抑制素B水平，预测妊娠患者葡萄胎的风险。男性E2的检测可用于男性乳房发育评估，青春期延迟或不育等。
目前临床上检测E2的主流方法学为免疫分析法，由于E2属于激素类小分子化合物，抗原决定簇单一，无法支持两个不同的抗体进行夹心检测，因此临床免疫测定一般采用竞争法。
然而，竞争法检测小分子抗原存在灵敏度和抗干扰能力差的问题，尤其是对低值样本检出能力较差。因此亟需解决现有竞争法检测E2的灵敏度低、抗干扰能力差的问题，并提高低值样本的检出率。
目前较为可行复合物抗体夹心法，具体的检测原理为，一株抗E2抗体(第一抗体)与待测抗原形成免疫复合物，另一株抗复合物抗体(第二株抗体)与前述免疫复合物结合形成免疫夹心复合物，识别位点为第一株抗体和小分子半抗原结合后形成的新表位，且要求复合物抗体与游离的第一株抗体和小分子半抗原均无结合。通过复合物抗体夹心法的运用，可以极大提高小分子抗原检测的灵敏度和准确度。然而筛选复合物抗体的难度较大，适用于夹心法的高亲和力复合物抗体目前暂未有报道。
发明内容
以下是对本文详细描述的主题的概述。本概述并非是为了限制权利要求的保护范围。
本申请提供了一种抗雌二醇(E2)-雌二醇抗体复合物的抗体及其应用。本申请提供的抗雌二醇(E2)-雌二醇抗体复合物的抗体能够与E2抗原特异性结合，具有较好的结合活性和亲和力。通过使用本申请中的抗体进行夹心法检测E2，大大提高了夹心法检测的检测灵敏度和抗干扰能力，并且提高了低值样本的检出率。
在一个方面中，本申请提供了一种特异性结合E2-E2抗体复合物的抗体或其功能性片段，所述抗体或其功能性片段包括以下互补决定区：
互补决定区CDR1-VH，其氨基酸序列为SYGVH(SEQ ID NO:1)；
互补决定区CDR2-VH，其氨基酸序列为VIWX1GGSTNYNSALMS(SEQ ID NO:19)，其中X1是A或G；
互补决定区CDR3-VH，其氨基酸序列为X2EGX3AX4AMDY(SEQ ID NO:20)，其中X2是D或G，X3是Y、S或T，X4是G或Y；
互补决定区CDR1-VL，其氨基酸序列为RASESVDNFGISFMN(SEQ ID NO:8)；
互补决定区CDR2-VL，其氨基酸序列为X5ASNQGS(SEQ ID NO:21)，其中X5是A或T；
互补决定区CDR3-VL，其氨基酸序列为QQSKEVPX6T(SEQ ID NO:22)，其中X6是Y、W或R。
在本申请的实施例中，所述抗体或其功能性片段的各互补决定区的突变位点选自下述突变组合中的任一种：
Figure BDA0004039737150000031
Figure BDA0004039737150000041
在本申请的实施例中，所述抗体或其功能性片段的各互补决定区的突变位点选自以下野生型或突变组合中的任一种：
Figure BDA0004039737150000042
Figure BDA0004039737150000051
Figure BDA0004039737150000061
Figure BDA0004039737150000071
在本申请的实施例中，所述抗体或其功能性片段与所述E2-E2抗体复合物以KD≤E-8数量级的亲和力结合。
在本申请的实施例中，所述抗体包括序列依次如SEQ ID NO:11-14所示的轻链骨架区FR1-L、FR2-L、FR3-L及FR4-L；和/或，序列依次如SEQ ID NO:4-7所示的重链骨架区FR1-H、FR2-H、FR3-H及FR4-H。
在本申请的实施例中，所述抗体还包含恒定区。
在本申请的实施例中，所述恒定区选自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgM、IgE和IgD中的任何一种的恒定区。
在本申请的实施例中，所述恒定区的种属来源为牛、马、猪、绵羊、山羊、大鼠、小鼠、狗、猫、兔、骆驼、驴、鹿、貂、鸡、鸭、鹅或人。
在本申请的实施例中，所述恒定区来源于小鼠。
在本申请的实施例中，轻链恒定区序列如SEQ ID NO:18所示，并且重链恒定区序列如SEQ ID NO:17所示。
在本申请的实施例中，所述功能性片段选自所述抗体的F(ab’)2、Fab’、Fab、Fv和scFv中的任意一种。
上述抗体的功能性片段通常具有与其来源抗体相同的结合特异性。本领域技术人员根据本发明记载的内容容易理解到，上述抗体的功能性片段可以通过例如酶消化的方法(包括胃蛋白酶或木瓜蛋白酶)和/或通过化学还原分裂二硫键的方法获得。在本申请公开了完整抗体的结构基础上，本领域技术人员容易获得上述的功能性片段。
上述抗体的功能性片段还可以通过本领域技术人员已知的重组遗传学技术或通过例如自动肽合成仪，诸如Applied BioSystems等销售的自动肽合成仪合成获得。
在另一方面中，本申请提供了一种核酸分子，所述核酸分子编码上述抗体或其功能性片段。
在另一方面中，本申请提供了一种载体，其包含上述核酸分子。
在另一方面中，本申请提供了一种宿主细胞，其包含上述核酸分子，或者包含上述载体。
在另一方面中，本申请提供了如上所述的抗雌二醇(E2)-雌二醇抗体复合物的抗体或其功能性片段、上述核酸分子、上述载体或上述宿主细胞在制备检测E2的产品中的应用。
在另一方面中，本申请提供了一种E2检测试剂盒，所述试剂盒包括上述抗体。
在另一方面中，本申请提供了一种用于检测测试样品中的E2的量的方法，包括：
a)在足以发生抗体和抗原结合反应的条件下，使抗E2的第一抗体与所述测试样品中的E2抗原接触以形成免疫复合物；和
b)使上述抗体或其功能性片段与来自步骤a)的所述免疫复合物结合以形成免疫夹心复合物；以及
c)通过检测所述免疫夹心复合物的量来确定所述E2抗原的量。
在本申请的实施例中，所述方法选自以下中的任意一种或多种：荧光免疫法、化学发光免疫法、胶体金免疫法、放射免疫法或酶联免疫法；
优选地，所述化学发光免疫法为化学发光免疫夹心法；
优选地，所述方法采用半自动免疫分析仪或全自动免疫分析仪进行分析。
在本申请的实施例中，所述样品选自全血、血清或血浆中的至少一种；
优选地，所述全血、血清或血浆来源于外周血。
本申请提供的特异性结合E2-E2抗体复合物的抗体能够与E2-E2抗体复合物特异性结合，具有较好的结合活性和亲和力。通过使用本申请中的抗E2-E2抗体复合物抗体进行夹心法检测E2，大大提高了E2检测灵敏度和抗干扰能力，并且提高了低值样本的检出率。
本申请的其它特征和优点将在随后的说明书中阐述，并且，部分地从说明书中变得显而易见，或者通过实施本申请而了解。本申请的其他优点可通过在说明书以及附图中所描述的方案来实现和获得。
附图说明
附图用来提供对本申请技术方案的理解，并且构成说明书的一部分，与本申请的实施例一起用于解释本申请的技术方案，并不构成对本申请技术方案的限制。
图1为E2夹心法与质谱相关性的图。
图2为竞争法与质谱在低值区的相关性的图。
图3为夹心法与质谱在低值区的相关性的图。
具体实施方式
为使本申请的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下文中将对本申请的实施例进行详细说明。需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互任意组合。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。
实施例1.抗E2-E2 Ab复合物抗体杂交瘤细胞株的筛选
以下实施例的抗体筛选采用杂交瘤融合技术进行筛选。杂交瘤融合技术的原理是将免疫小鼠脾脏的淋巴B细胞，通过与小鼠的骨髓瘤细胞进行融合杂交，从而使淋巴B细胞获得无限增殖的能力，通过对细胞上清中的分泌抗体进行ELISA检测，筛选出表达特异性抗体的细胞孔，进一步亚克隆获得单克隆抗体。经过完整的体内免疫流程，动物体能产生高亲和力的抗体，结合电融合保证较高的融合率，及较大数量的融合，能筛选到性能优秀的目标抗体。本实施例的具体步骤如下：
1.E2抗体制备过程(Ab1)
A)免疫小鼠
购买E2-6-cmo-BSA(EastCoast Bio)作为免疫原，溶解后与等体积弗氏完全佐剂(Sigma)乳化均匀，取6-8周龄SPF级Balb/c小鼠，皮下多点注射200μg/只，间隔3周用弗氏不完全佐剂乳化抗原，皮下多点注射150μg/只，加强免疫2次，融合前3天腹腔注射进行冲击。
B)细胞融合及亚克隆筛选
取免疫小鼠的脾脏，研磨分离获得分散的单个脾细胞，利用PEG将脾细胞和骨髓瘤细胞混合，培养基终止后离心复溶铺至96孔板中，一周后换液，取上清进行酶免间接法检测，包被羊抗鼠IgG二抗(Jackson)，E2-17β-6-CMO-HRP(Pantex)为酶标抗原，采用竞争法评估细胞上清，挑选竞争效果良好的孔进一步考察对E3和E1的交叉，挑选交叉低的阳性孔通过有限稀释法进行亚克隆，培养一周后继续进行酶免竞争法检测，重复3-4次，直至检测孔全部为阳性且孔内细胞为单集落，扩培得到特异性杂交瘤细胞株3F4E6。
C)阳性细胞株腹水制备
对单集落细胞进行扩大培养，接种到IFA预刺激的小鼠体内制备腹水，收集腹水，经过SPA法亲和纯化获得特异性结合E2的抗体。
2.抗E2-Ab1/E2复合物抗体制备过程(Ab2)
A)免疫小鼠
E2天然标品(Sigma)与E2鼠抗(3F4E6)均透析到0.01M PBS中，按照摩尔比≥10：1的量进行孵育，在37℃孵育2h，透析至0.01M PBS去除过量的抗原，作为免疫原。
与等体积弗氏完全佐剂(Sigma)乳化均匀，取6-8周龄SPF级Balb/c小鼠，皮下多点注射200μg/只，间隔3周用弗氏不完全佐剂乳化抗原，皮下多点注射150μg/只，加强免疫2次，融合前3天腹腔注射进行冲击。
B)细胞融合及亚克隆筛选
取免疫小鼠的脾脏，研磨分离获得分散的单个脾细胞，利用PEG将脾细胞和骨髓瘤细胞混合，培养基终止后离心复溶铺至96孔板中，一周后换液，取上清进行酶免间接法检测。
检测方法如下：羊抗鼠IgG Fcγ二抗(Jackson，1μg/ml)为包被抗原，封闭后加入细胞上清，然后加入生物素标记的E2鼠抗Fab(简称Bio-Fab，指3F4E6经过酶切后再进行生物素标记)或Bio-Fab+E2的复合物，显色剂为HRP-SA，最终挑选出与Bio-Fab无或低反应，且与Bio-Fab+E2强反应的阳性孔，进一步通过有限稀释法进行亚克隆，培养一周后继续进行酶免间接法检测，继续挑选与Bio-Fab无或低反应，且与Bio-Fab+E2强反应的阳性孔进行有限稀释，重复3-4次，直至检测孔全部为阳性且孔内细胞为单集落时挑选与Bio-Fab无反应且与Bio-Fab+E2最强反应的细胞孔进行扩培，得到特异性杂交瘤细胞株4A8D6。
C)阳性细胞株腹水制备
对单集落细胞进行扩大培养，注射到提前接种IFA的小鼠体内制备腹水，收集腹水获得复合物抗体，经过SPA法亲和纯化。
实施例2.表达质粒构建
i)基因调取
扩培4A8D6杂交瘤细胞株，提取mRNA，通过反转录获得cDNA产物，该产物用rTaqDNA聚合酶进行加A反应后插入到pMD-18T载体中，转化到DH5α感受态细胞中，分别取重链和轻链基因克隆各10个菌斑送基因测序公司进行测序。
ii)抗体基因的序列分析
将上述测序所得的基因序列放在IMGT抗体数据库中进行分析，并利用VNTI11.5软件进行分析确定重链和轻链引物对扩增出的基因都是正确的。
iii)重组抗体表达质粒的构建
以pFastBacTMdual为载体构建重组抗体表达载体，简称为pFD载体；根据上述pMD-18T中抗体可变区基因测序结果，设计轻重链特异性引物对(参见附表1中第一阶段引物)，通过PCR扩增方法获得约0.7kb的轻链和约1.4kb的重链基因片段。设计相应引物(参见附表1第二阶段引物)，采用重叠PCR对上述基因片段引入信号肽gp64和酶切位点，轻重链所对应的酶切位点分别如下：XhoI-gp64-L-KpnI，BamHI-gp64-H-HindIII。
对pFD载体和BamHI-gp64-H-HindIII基因片段进行BamHI/HindIII双酶切，电泳回收目的片段，对基因片段和载体片段进行连接，转化DH5α感受态细胞，菌落PCR验证阳性后，扩大培养，提取已连接上重链的载体质粒，简称为pFD-H，然后对此质粒和XhoI-gp64-L-KpnI进行XhoI/KpnI双酶切，电泳回收目的片段，进行连接转化，验证合格后提取已连接上轻重链的载体，简称为pFD-HL。
将重组质粒转化至E.coli DH10Bac(含有AcNPV的Bacmid和辅助质粒)感受态细胞中，涂布于含卡那霉素(50μg/mL)、四环素(10μg/mL)、庆大霉素(7μg/mL)、IPTG(40μg/mL)、X-gal(100μg/mL)的LB琼脂平板上。通过蓝白斑筛选挑取白色菌落，用Omega BAC/PAC提取试剂盒提取重组bacmid。
iv)表达纯化
按照Gibco公司脂质体转染说明书将提取的重组bacmid转染Sf9细胞，传代密度1*10^6/ml，28℃培养6d，在避光条件下，过0.22μm滤器过滤收集得到的上清即为第1(P1)代病毒液。将P1病毒再次感染Sf9细胞获得高滴度的重组病毒液，如此获得P2/P3病毒液，最后将P3代病毒液转入HF细胞，28℃培养3d，收集上清。
按照GE AKTA Pure蛋白质分离纯化系统说明书的操作，对上述表达上清进行SPA柱纯化，获得纯化的E2复合物抗体。
Figure BDA0004039737150000131
实施例3.重组抗体表达
按照Gibco公司脂质体转染说明书将实施例2中提取的重组bacmid转染Sf9细胞，传代密度1*10^6/ml，28℃培养6d，在避光条件下，过0.22μm滤器过滤收集得到的上清即为第1(P1)代病毒液。将P1病毒再次感染Sf9细胞获得高滴度的重组病毒液，如此获得P2/P3病毒液，最后将P3代病毒液转入HF细胞，28℃培养3d，收集上清。
按照GE AKTA Pure蛋白质分离纯化系统说明书的操作，对上述表达上清进行SPA柱纯化，获得纯化的重组抗体，序列如下：
重链CDR区氨基酸序列
CDR1-VH：
SEQ ID NO:1：SYGVH
CDR2-VH：
SEQ ID NO:2：VIWGGGSTNYNSALMS
CDR3-VH：
SEQ ID NO:3：GEGSAYAMDY
重链框架区氨基酸序列
FR1-H:
SEQ ID NO:4：QVQLKESGPGLVAPSQSLSITCTVSGFSLI FR2-H:
SEQ ID NO:5：WVRQPPGKGLEWLG
FR3-H:
SEQ ID NO:6：RLSISKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAMYYCVR FR4-H:
SEQ ID NO:7：WGQGTSVTVSS
轻链CDR区氨基酸序列
CDR1-VL：
SEQ ID NO:8：RASESVDNFGISFMN
CDR2-VL：
SEQ ID NO:9：TASNQGS
CDR3-VL：
SEQ ID NO:10：QQSKEVPYT
轻链框架区氨基酸序列
FR1-L:
SEQ ID NO:11：DIVLTQSPASLAVSLGQRATISC FR2-L:
SEQ ID NO:12：WFQQKPGQPPKLLIY
FR3-L:
SEQ ID NO:13：GVPARFSGSGSGTDFSLNIHPMEEDDTAMYFC FR4-L:
SEQ ID NO:14：FGGGTKLEIK
重链可变区氨基酸序列：
SEQ ID NO:15：
QVQLKESGPGLVAPSQSLSITCTVSGFSLISYGVHWVRQPPGKGLEWLGVIWGGGSTNYNSALMSRLSISKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAMYYCVRGEGSAYAMDYWGQGTSVTVSS
轻链可变区氨基酸序列：
SEQ ID NO:16：
DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASESVDNFGISFMNWFQQKPGQPPKLLIYTASNQGSGVPARFSGSGSGTDFSLNIHPMEEDDTAMYFCQQSKEVPYTFGGGTKLEIK
重链恒定区氨基酸序列：
SEQ ID NO:17：
AKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVPSSTWPSETVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDCGCKPCICTVPEVSSVFIFPPKPKDVLTITLTPKVTCVVVDISKDDPEVQFSWFVDDVEVHTAQTQPREEQFNSTFRSVSELPIMHQDWLNGKEFKCRVNSAAFPAPIEKTISKTKGRPKAPQVYTIPPPKEQMAKDKVSLTCMITDFFPEDITVEWQWNGQPAENYKNTQPIMDTDGSYFVYSKLNVQKSNWEAGNTFTCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPGK
轻链恒定区氨基酸序列：
SEQ ID NO:18：
RADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC
实施例4.抗体的性能检测
1.抗E2-E2 Ab复合物抗体及其突变体的活性检测
经过序列分析，前述获得的单克隆抗体可变区的互补决定区氨基酸序列如下：
CDR1-VH：SYGVH(SEQ ID NO:1)；
CDR2-VH：V-I-W-(X1)-G-G-T-N-Y-N-S-A-L-M-S(SEQ ID NO:19)；
CDR3-VH：(X2)-E-G-(X3)-A-(X4)-A-M-D-Y(SEQ ID NO:20)；
CDR1-VL：R-A-S-E-S-V-D-N-F-G-I-S-F-M-N(SEQ ID NO:8)；
CDR2-VL：(X5)-A-S-N-Q-G-S(SEQ ID NO:21)；
CDR3-VL：Q-Q-S-K-E-V-P-(X6)-T(SEQ ID NO:22)。
在上述单克隆抗体基础上，对互补决定区中与抗体活性和亲和力有关的位点进行突变，其中，X1、X2、X3、X4、X5和X6均为突变位点，参见下表1：
表1：与抗体亲和力有关的突变位点突变方案
Figure BDA0004039737150000161
Figure BDA0004039737150000171
Figure BDA0004039737150000181
Figure BDA0004039737150000191
Figure BDA0004039737150000201
验证发现，上述突变体与野生型(WT)的亲和力相当或有上下起伏，总体而言，均≤E-8，能够满足免疫夹心法检测E2的基本要求，其中有33组突变体的亲和力比WT的亲和力有相当显著提升，见表2，其中，平衡解离常数KD(M)代表平衡状态下抗原抗体的解离程度，KD(M)越小说明抗原抗体亲和力越强。
表2：突变抗体亲和力检测结果
Figure BDA0004039737150000202
Figure BDA0004039737150000211
Figure BDA0004039737150000221
2.抗E2-E2 Ab复合物抗体及其突变体的特异性
表3：针对一抗和抗原的结合实验
Figure BDA0004039737150000222
Figure BDA0004039737150000231
结果表明，复合物抗体不会与反应体系中游离的一抗或抗原结合。
实施例5.突变体1应用于E2的检测
1.试剂盒组分及检测原理：
采用一株抗E2抗体(自产)包被磁性微球，ABEI发光剂标记一株抗E2复合物抗体(检测抗体)。第一步将样本、缓冲液和磁性微球混合一起孵育，样本中的待测物抗原与包被磁性微球的抗体结合形成免疫复合物；孵育后通过磁分离清洗去除未结合的物质；第二步加入发光标记物进行孵育，ABEI标记的抗体与磁性微球上形成的免疫复合物进行反应，孵育后通过磁分离清洗去除未结合的物质。最后，加入全自动免疫检验系统用底物液，启动化学发光反应，产生光信号。通过光电倍增管测出的相对光强度(RLU)与样本中的E2浓度成一定比例关系。
以上实验涉及材料及用品均为新产业生物自产，仪器选择新产业化学发光免疫分析仪MAGLUMI 4000P。
2.灵敏度试验
采用E2高值样品(质谱赋值4000pg/ml)，加入人血清中，配置成不同梯度浓度的样本，采用同一台Maglumi 4000p，分别采用竞争法和夹心法进行评估，光强度(Rlu)数据如下所示。
表4.竞争法与夹心法对梯度浓度样本的检测结果
Figure BDA0004039737150000241
控制相邻样本之间的浓度梯度为2，计算竞争法和夹心法相邻样本之间的光强度梯度，分别对应于表1中的N/N-1和N+1/N，从中可以看出，在≤160pg/ml时，竞争法之间的梯度变化＜2，而夹心法则均＞2，反应出来在所检测梯度范围内，夹心法的灵敏度更高。
3.抗干扰验证
将下表中分析物加入一定值的E2样本中进行检测，检测结果与真实值的偏差如下表，偏差在10％内视为无影响。
表5竞争法与夹心法对干扰物质的检测结果
Figure BDA0004039737150000242
结果表明，使用本方案的夹心法及复合物抗体对E2进行检测，在存在干扰物的情况下，测试偏差均低于1％，尤其是与E2结构近似度较高的雌酮，在三个浓度下，检测偏差均远远低于使用竞争法的方案。
4.与质谱方法学的相关度
随机收集286例样本，包括不同年龄段以及不同妊娠周期的样本，每份样品分成两份，一份送至第三方检验中心进行质谱检测，另一份在新产业公司Maglumi 4000p设备上进行发光检测。
如图1所示，整个检测范围内相关性良好，R2可达到0.99。
5.低值样本检测
从上述病例中选取小于40pg/ml的低值样本共35例，比较竞争法和夹心法与质谱的相关性，显示R2从0.85提高至0.94，表明夹心法在低值区的检出性能有提升，如图2和图3所示。

Claims (18)

1.一种特异性结合E2-E2抗体复合物的抗体或其功能性片段，其特征在于，所述抗体或其功能性片段包括以下互补决定区：
互补决定区CDR1-VH，其氨基酸序列为SYGVH(SEQ ID NO:1)；
互补决定区CDR2-VH，其氨基酸序列为VIWX1GGSTNYNSALMS(SEQ ID NO:19)，其中X1是A或G；
互补决定区CDR3-VH，其氨基酸序列为X2EGX3AX4AMDY(SEQ ID NO:20)，其中X2是D或G，X3是Y、S或T，X4是G或Y；
互补决定区CDR1-VL，其氨基酸序列为RASESVDNFGISFMN(SEQ IDNO:8)；
互补决定区CDR2-VL，其氨基酸序列为X5ASNQGS(SEQ ID NO:21)，其中X5是A或T；
互补决定区CDR3-VL，其氨基酸序列为QQSKEVPX6T(SEQ ID NO:22)，其中X6是Y、W或R。
2.根据权利要求1所述的抗体或其功能性片段，其中，所述抗体或其功能性片段选自如下任一种突变组合：
Figure FDA0004039737140000011
Figure FDA0004039737140000021
。
3.根据权利要求1所述的抗体或其功能性片段，其中，所述抗体或其功能性片段选自如下野生型或任一种突变组合：
Figure FDA0004039737140000022
Figure FDA0004039737140000031
Figure FDA0004039737140000041
Figure FDA0004039737140000051
Figure FDA0004039737140000061
4.根据权利要求1-3中任一项所述的抗体或其功能性片段，其中，所述抗体或其功能性片段与所述E2-E2抗体复合物以KD≤E-8数量级的亲和力结合。
5.根据权利要求1-3中任一项所述的抗体或其功能性片段，其中，所述抗体包括序列依次如SEQ ID NO:11-14所示的轻链骨架区FR1-L、FR2-L、FR3-L及FR4-L；和/或，序列依次如SEQ ID NO:4-7所示的重链骨架区FR1-H、FR2-H、FR3-H及FR4-H。
6.根据权利要求1-3中任一项所述的抗体或其功能性片段，其中，所述抗体还包含恒定区。
7.根据权利要求6所述的抗体或其功能性片段，其中，所述恒定区选自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgM、IgE和IgD中的任何一种的恒定区。
8.根据权利要求7所述的抗体或其功能性片段，其中，所述恒定区的种属来源为牛、马、猪、绵羊、山羊、大鼠、小鼠、狗、猫、兔、骆驼、驴、鹿、貂、鸡、鸭、鹅或人；
优选地，所述恒定区来源于小鼠。
9.根据权利要求8所述的抗体或其功能性片段，其中，轻链恒定区序列如SEQ ID NO:18所示，并且重链恒定区序列如SEQ ID NO:17所示。
10.根据权利要求7所述的抗体或其功能性片段，其中，所述功能性片段选自所述抗体的F(ab’)2、Fab’、Fab、Fv和scFv中的任意一种。
11.一种核酸分子，所述核酸分子编码权利要求1-10中任一项所述的抗体或其功能性片段。
12.一种载体，所述载体包含权利要求11所述的核酸分子。
13.一种宿主细胞，所述宿主细胞包含权利要求11所述的核酸分子，或者包含权利要求12所述的载体。
14.根据权利要求1-10中任一项所述的抗体或其功能性片段、根据权利要求11所述的核酸分子、根据权利要求12所述的载体或根据权利要求13所述的宿主细胞在制备检测E2的产品中的应用。
15.一种E2检测试剂盒，所述试剂盒包括权利要求1至10中任一项所述的抗体。
16.一种用于检测测试样品中的E2的量的方法，包括：
a)在足以发生抗体和抗原结合反应的条件下，使抗E2的第一抗体与所述测试样品中的E2抗原接触以形成免疫复合物；和
b)使权利要求1-10中任一项所述的抗体或其功能性片段与来自步骤a)的所述免疫复合物结合以形成免疫夹心复合物；以及
c)通过检测所述免疫夹心复合物的量来确定所述E2抗原的量。
17.根据权利要求16所述的方法，其中，所述方法选自以下中的任意一种或多种：荧光免疫法、化学发光免疫法、胶体金免疫法、放射免疫法或酶联免疫法；
优选地，所述化学发光免疫法为化学发光免疫夹心法；
优选地，所述方法采用半自动免疫分析仪或全自动免疫分析仪进行分析。
18.根据权利要求16所述的方法，其中，所述样品选自全血、血清或血浆中的至少一种；
优选地，所述全血、血清或血浆来源于外周血。
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