CN117820482A - 一种抗孕酮-孕酮抗体复合物的抗体及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种特异性结合孕酮‑孕酮抗体复合物的抗体或其功能性片段，所述抗体或其功能性片段具有如下互补决定区：重链互补决定区CDR‑VH1：G‑Y‑S‑F‑T‑G‑Y‑F；重链互补决定区CDR‑VH2：I‑N‑P‑X1‑N‑G‑D‑T，其中：X1是Y或W；重链互补决定区CDR‑VH3：A‑R‑D‑Y‑X2‑G‑Y‑X3‑E‑S‑X4‑Y‑Y‑Y‑A‑M‑D‑Y，其中：X2是Y或S，X3是D或A；X4是L或T；轻链互补决定区CDR‑VL1：Q‑S‑V‑D‑Y‑D‑G‑D‑S‑Y；轻链互补决定区CDR‑VL2：I‑Y‑A‑A‑X5‑N，其中：X5是S或Y；轻链互补决定区CDR‑VL3：Q‑Q‑S‑N‑E‑X6‑P‑X7‑T，其中：X6是D或A，X7是Y或S。
Description
技术领域
本发明涉及抗体技术和医学技术领域，具体而言，涉及一种可特异性结合孕酮-孕酮抗体复合物的抗体及其应用。
背景技术
孕酮又称黄体酮、孕激素，相对分子质量为314.47g/mol，是一种性腺类固醇激素。内源性PROG主要有黄体期卵巢黄体产生，妊娠早期，母体血液PROG主要来源于卵巢黄体，胎盘绒毛合成分泌PROG，随着胎盘生长，绒毛增多，胎盘绒毛的PROG产量逐渐增加。妊娠8周，基本可取代黄体的功能，此后，PROG水平继续上升。
目前临床上检测孕酮的主流方法学为免疫分析法，由于孕酮属于激素类小分子化合物，抗原决定簇单一，无法支持两个不同的抗体进行夹心检测，因此临床免疫测定一般采用竞争法。竞争法检测小分子抗原存在灵敏度和抗干扰能力差的问题，尤其是对低值样本检出能力较差。因此亟需解决现有竞争法检测孕酮的灵敏度低、抗干扰能力差的问题，并提高低值样本的检出率。
目前较为可行复合物抗体夹心法，具体的检测原理为，一株抗孕酮抗体(第一抗体)与待测抗原形成免疫复合物，另一株抗复合物抗体(第二株抗体)与前述免疫复合物结合形成免疫夹心复合物，识别位点为第一株抗体和小分子半抗原结合后形成的新表位，且要求复合物抗体与游离的第一株抗体和小分子半抗原均无结合。通过复合物抗体夹心法的运用，可以极大提高小分子抗原检测的灵敏度和准确度。
发明内容
本发明的目的在于提供抗孕酮-孕酮抗体复合物的抗体及其制备方法和应用。为了实现上述目的，本发明采取的技术方案为：一种特异性结合孕酮-孕酮抗体复合物的抗体或其功能性片段，所述抗体或其功能性片段具有如下互补决定区：重链互补决定区CDR-VH1：G-Y-S-F-T-G-Y-F；重链互补决定区CDR-VH2：I-N-P-X1-N-G-D-T，其中：X1是Y或W；重链互补决定区CDR-VH3：A-R-D-Y-X2-G-Y-X3-E-S-X4-Y-Y-Y-A-M-D-Y，其中：X2是Y或S，X3是D或A；X4是L或T；轻链互补决定区CDR-VL1：Q-S-V-D-Y-D-G-D-S-Y；轻链互补决定区CDR-VL2：I-Y-A-A-X5-N，其中：X5是S或Y；轻链互补决定区CDR-VL3：Q-Q-S-N-E-X6-P-X7-T，其中：X6是D或A，X7是Y或S；所述抗体或其功能性片段选自如下突变组合任一种：
作为对所述特异性结合孕酮-孕酮抗体复合物的抗体或其功能性片段的改进，所述抗体包括序列依次如SEQ ID NO:13-16所示的重链骨架区FR1-H、FR2-H、FR3-H及FR4-H，序列依次如SEQ ID NO:17-20所示的轻链骨架区FR1-L、FR2-L、FR3-L及FR4-L。
作为对所述特异性结合孕酮-孕酮抗体复合物的抗体或其功能性片段的进一步改进，所述抗体还包含恒定区。
作为对所述特异性结合孕酮-孕酮抗体复合物的抗体或其功能性片段的进一步改进，所述恒定区选自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4中的任意一者的恒定区。
作为对所述特异性结合孕酮-孕酮抗体复合物的抗体或其功能性片段的进一步改进，所述恒定区的种属来源为牛、羊、兔、小鼠、大鼠或人。
作为对所述特异性结合孕酮-孕酮抗体复合物的抗体或其功能性片段的进一步改进，所述功能性片段选自所述抗体的Fab、F(ab’)2、Fv和scFv中的任意一种。
一种抗体或其功能性片段在制备用于孕酮检测试剂或试剂盒中的应用。
一种检测孕酮的试剂或试剂盒，所述试剂盒包括权利要求1-6中任一项所述的抗体或其功能性片段。
一种用于检测孕酮的量的方法，使抗孕酮的第一抗体与待测样品中的孕酮免疫反应形成孕酮-孕酮抗体复合物，使权利要求1-6中任一项所述的抗体或其功能性片段与孕酮-孕酮抗体复合物结合以形成免疫夹心复合物，通过检测免疫夹心复合物的量来确定待测样品中孕酮的量。
作为对本发明所述的一种用于检测孕酮的量的方法的改进，所述方法选自下述的任意一种：荧光免疫法、化学发光免疫法、胶体金免疫法、放射免疫法或酶联免疫法。
附图说明
图1是本发明试剂盒检测线性。
具体实施方式
实施例1.抗孕酮-孕酮抗体复合物特异性抗体杂交瘤细胞株的制备
1、抗孕酮抗体制备
用PROG-BSA作为免疫原免疫Balb/c小鼠，ELISA间接法检测小鼠血清效价超过106后，取免疫小鼠脾脏，研磨分离获得分散的单个脾细胞，采用PEG法将脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0进行融合，铺至96孔板培养一周，取上清用PROG-KLH进行酶免间接法筛选阳性杂交瘤细胞系，通过有限稀释法进行亚克隆，培养一周后继续用PROG-KLH进行酶免间接法筛选，得到可分泌抗PROG特异性抗体的杂交瘤细胞株P6H5。将该杂交瘤细胞注射小鼠腹腔，收集腹水经过亲和纯化得到抗孕酮特异性抗体。
2、孕酮-抗体复合物制备
将孕酮标准品与抗孕酮特抗体P6H5按照摩尔比20:1进行37℃孵育2h，透析至0.02M PBS去除过量的孕酮，作为免疫原。
3、抗孕酮-抗体复合物杂交瘤细胞制备
将上步制备的孕酮-抗体复合物与等体积弗氏完全佐剂乳化均匀，免疫6-8周龄Balb/c小鼠，初免剂量为100ug/只小鼠，第一次免疫后间隔21天、42天分别进行第二次和第三次免疫，免疫剂量均为50ug/只小鼠。第三次免疫7天后眼眶采血、分离血清，用孕酮-抗体复合物采用间接法检测血清效价，取血清效价大于107的小鼠进行脾内加强免疫，免疫剂量为100ug/只小鼠。
加强免疫后3天取其脾脏细胞与sp2/0骨髓瘤细胞按照8:1的比例融合，融合后的细胞使用含HAT的DMEM培养基上进行培养。融合后6-7天左右，用包被孕酮-抗体复合物的96孔板间接法检测细胞培养上清中的特异性抗体含量，选择OD值不低于0.7的阳性孔用有限稀释法进行亚克隆，得到能稳定分泌抗孕酮-抗体复合物的杂交瘤细胞株。
4、抗孕酮-孕酮抗体复合物特异性抗体杂交瘤细胞株筛选
将上述获得抗孕酮-抗体复合物杂交瘤细胞培养6-7天，分别用包被孕酮-抗体复合物、PROG-BSA、P6H5抗体的96孔板间接法检测细胞培养上清中，选择细胞上清与孕酮-抗体复合物反应、而与PROG-BSA及P6H5抗体不反应的杂交瘤细胞株，确定为可以分泌抗孕酮-抗体复合物特异性的抗体的细胞株，将筛选到的1株细胞株命名为C8F3。将该杂交瘤细胞扩大培养，注射小鼠腹腔制备腹水，收集腹水经过亲和纯化得到抗孕酮-孕酮抗体复合物特异性抗体。
实施例2.抗孕酮-孕酮抗体复合物特异性抗体可变区的分析
1、基因钓取
单克隆抗体C8F3杂交瘤细胞株进行扩培，待进入对数生周期，取107个细胞，提取总mRNA，通过反转录获得cDNA产物，该产物用rTaq DNA聚合酶进扩增并回收后插入到pMD-18T载体中，转化到DH5α感受态细胞中，长出菌落后分别取重链和轻链基因克隆各3个克隆送基因测序公司进行测序。
2、重链和轻链可变区基因的序列分析
编码单克隆抗体C8F3的重链可变区的核苷酸序列(375bp)如下：
GAAGTGCAACTTCAGCAGTCTGGGCCTGAGTTAGTGAAGCCAGGAGCAAGTGTCAAGATCTCCTGCAAAGCATCTGGATACTCCTTCACTGGCTACTTCATGAACTGGGTGATGCAGAGCCATGGCAAATCCCTGGAGTGGATTGGTCGGATAAATCCCTACAATGGGGACACCTTTTATAACCAGAAGTTTAAAGGCAGGGCGACCTTGACAGTGGACAAGAGCAGCAGCACAGCCCACATGGAGCTGAGAAGTCTCGCTAGTGAAGATTCAGCTGTCTATTACTGTGCCCGCGATTATTATGGATATGATGAATCACTGTACTACTATGCCATGGACTACTGGGGGCAAGGTACGTCCGTTACTGTATCTTCG
编码重链可变区CDRH1核苷酸序列：
GGATACTCCTTCACTGGCTACTTC(SEQ ID NO:1)
重链可变区CDRH1氨基酸序列：
GYSFTGYF(SEQ ID NO:7)
编码重链可变区CDRH2核苷酸序列：
ATAAATCCCTACAATGGGGACACC(SEQ ID NO:2)
重链可变区CDRH2氨基酸序列：
INPYNGDT(SEQ ID NO:8)
编码重链可变区CDRH3核苷酸序列：
GCCCGCGATTATTATGGATATGATGAATCACTGTACTACTATGCCATGGACTAC(SEQ ID NO:3)
重链可变区CDRH3氨基酸序列：
ARDYYGYDESLYYYAMDY(SEQ ID NO:9)
重链框架区氨基酸序列:
FR1-H：EVQLQQSGPELVKPGASVKISCKAS(SEQ ID NO:13)
FR2-H：MNWVMQSHGKSLEWIGR(SEQ ID NO:14)
FR3-H：FYNQKFKGRATLTVDKSSSTAHMELRSLASEDSAVYYC(SEQ ID NO:15)
FR4-H：WGQGTSVTVSS(SEQ ID NO:16)
编码单克隆抗体C8F3的轻链可变区的核苷酸序列(336bp)如下：
GACATTGTTCTAACTCAGTCTCCAGCATCACTGGCTGTCTCCTTGGGACAAAGAGCCACCATCAGTTGTAAAGCGAGCCAGTCTGTGGATTATGATGGAGACAGCTACATGAACTGGTTCCAGCAGAAGCCTGGCCAGCCGCCCAAGCTCCTTATATATGCAGCTTCCAATCTGGATTCTGGTATTCCAGCCCGGTTTTCAGGAAGTGGCTCCGGCACAGACTTCACCCTCAACATCCACCCTGTGGAGGAAGAGGATGCTGCCACTTACTACTGCCAGCAAAGCAATGAAGACCCCTATACGTTTGGGGGTGGGACAAAACTGGAGATCAACAGG
编码轻链可变区CDRL1核苷酸序列：
CAGTCTGTGGATTATGATGGAGACAGCTAC(SEQ ID NO:4)
轻链可变区CDRL1氨基酸序列：
QSVDYDGDSY(SEQ ID NO:10)
编码轻链可变区CDRL2核苷酸序列：
ATATATGCAGCTTCCAAT(SEQ ID NO:5)
轻链可变区CDRL2氨基酸序列：
IYAASN(SEQ ID NO:11)
编码轻链可变区CDRL3核苷酸序列：
CAGCAAAGCAATGAAGACCCCTATACG(SEQ ID NO:6)
轻链可变区CDRL3氨基酸序列:
QQSNEDPYT(SEQ ID NO:12)
轻链框架区氨基酸序列:
FR1-L：DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCKAS(SEQ ID NO:17)
FR2-L：MNWFQQKPGQPPKLL(SEQ ID NO:18)
FR3-L：LDSGIPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYC(SEQ ID NO:19)
FR4-L：FGGGTKLEINR(SEQ ID NO:20)
实施例3.抗孕酮-孕酮抗体复合物特异性抗体及其突变体表达与活性检测
1、抗体的突变方案
在C8F3单克隆抗体基础上，对可变区中与抗体活性及亲和力有关的位点进行突变，其中X1、X2、X3、X4、X5、X6、X7为突变位点，见下表1。
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/>
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表1与抗体活性及亲和力有关的突变方案
2、抗体的重组表达
(1)重组抗体表达质粒的构建
按上述的突变方案，统一重链骨架区FR1-H、FR2-H、FR3-H及FR4-H，轻链骨架区FR1-L、FR2-L、FR3-L及FR4-L，并在重轻链基因序列5’端分别加入重链信号肽MKHLWLFLLFLVTAGVHS与轻链MRLPAQLLFLLMLWIPGSSA，在保证氨基酸序列不变的前提下，根据HEK293细胞偏好密码子对核苷酸序列进行优化，合基因序列。重链基因片段和轻链基因片段分别插入pTRIOZ-mIgG1e2表达载体的AgeI/Eco47III，SgrAI/BstAPI酶切位点间，得到可表达全抗体的重组表达质粒，并转化E.coli DH5α。
(2)重组抗体的瞬时表达
按照TIANGEN生物无内毒素质粒大提试剂盒说明书提取抗体的重组表达质粒，用0.22μm滤器过滤后转染50mL密度为2.0*106cells/mL HEK293细胞，转染后，于37℃，120rpm，5％二氧化碳浓度的摇床培养箱中孵育5-6天，收集上清经Protein A亲和纯化，获得重组抗体。
3、抗体的活性检测
对表1中的抗体结合活性检测：
用包被液稀释孕酮-孕酮抗体复合物至2μg/mL，每孔100μL，4℃过夜；次日，用洗涤液清洗3次，甩干；加入封闭液(含10％BSA的PBS)，每孔200μL，37℃，2h，甩干；加入稀释后的纯化抗体，100μL/孔，37℃，30min；洗涤液清洗3次，甩干；加入HRP标记羊抗鼠IgG，每孔100μL，37℃，30min；洗涤液清洗5次，甩干；加入体积混合A/B显色液，每孔50μL，37℃，10min；加入终止液，每孔50μL；酶标仪上450nm处读OD值。
抗体活性检测结果如下：
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表2抗体活性检测结果
验证发现，相较于野生型，突变体与孕酮-孕酮抗体复合物的结合力相当或有上下起伏，其中，以突变组合96的结合活性最优。
4、抗体的亲和力检测
选取部分活性较优的突变体测试亲和力。
使用WeSPR 100进行抗体亲和力检测。用配体稀释液将抗体稀释至20μg/mL，加入再生后的96孔芯片板(已包被Protein A)，每孔50μl，孵育10min；洗涤液清洗3次，再将特定浓度的抗原加入芯片板，每孔50μL；超纯水清洗1次，拍干后加入抗原稀释液，每孔150μL，进行解离曲线检测，并分析检测结果，分别获得结合常数Ka、解离常数Kd和平衡亲和力常数KD。
抗体亲和力检测结果如下：
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表3抗体亲和力检测结果
验证发现，上述突变体与野生型的亲和力相当或更优，总体而言，均KD≤E-9，能够满足免疫夹心法检测孕酮的要求，其中有10组突变体的亲和力显著优于野生型，KD≤E-10数量级，优选此类突变体用于孕酮检测试剂盒开发。
实施例4.突变体96应用于孕酮免疫夹心的检测
1、试剂组分及检测原理
用包被抗体(mAb-P6H5)包被化学发光微孔板制成固相抗体，然后加入孕酮样本，游离的孕酮与微孔中的固相抗体结合，洗涤除去未结合物质，加入浓度一定的HRP标记过的抗孕酮-孕酮抗体复合物特异性抗体(突变组合96)偶联物，与微孔中与孕酮-孕酮抗体复合物结合，洗涤除去未结合物质，加入化学发光底物A和B，化学发光底物在HRP酶的催化下发光，然后用化学发光免疫分析仪读取相对发光强度(RLU)，最后通过校准曲线计算样品中孕酮的浓度，实现检测样品中孕酮含量的功能。
2、试剂最低检测限及线性范围
以标准品浓度和RLU值绘制标准曲线，标准曲线的R2＝0.999(图1)。
以零标准品测量20次，计算其平均RLU值及标准差，以RLU平均值加上2倍标准差所得的RLU值代入标准曲线方程计算得出的浓度为其最低检测量。
本试剂最低检测限0.006ng/mL，有效线性范围在0.006～90ng/mL。
标准品浓度和对应的RLU值如下：
| 标准品浓度ng/mL | 测试RLU |
| 90 | 48654.0 |
| 30.00 | 16275.6 |
| 10.02 | 5493.0 |
| 3.36 | 1898.8 |
| 1.14 | 700.7 |
| 0.36 | 279.7 |
| 0.12 | 150.2 |
| 0.00 | 85.5 |
表4标准品浓度和对应的RLU值
零值标准品检测的RLU值如下：
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表5零值标准品检测的RLU值
3、试剂特异性验证
针对孕酮系列衍生物，分析下列物质交叉反应性：
| 分析物 | 夹心法(本方案) | 竞争法(比对试剂) |
| 雄烯二酮 | 0.055％ | 0.136％ |
| 皮质酮 | 0.264％％ | 0.687％ |
| 甲羟孕酮 | 0.363％ | 0.812％ |
| 17α-羟基孕酮 | 0.773％ | 1.300％ |
| 5α-孕烯-3β-醇-20-酮 | 0.855％ | 0.858％ |
| 5-β-二氢孕酮 | 8.430％ | 20.700％ |
表6交叉反应性对比
结果表明，使用本方案的夹心法及复合物抗体对孕酮衍生物进行检测，交叉反应性均优于市面竞争法比对试剂，尤其是与孕酮结构高度相似的5-β-二氢孕酮，交叉性远低于使用竞争法的比对试剂。
以上所述仅为本发明的优选实施方式而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种特异性结合孕酮-孕酮抗体复合物的抗体或其功能性片段，其特征在于所述抗体或其功能性片段具有如下互补决定区：
重链互补决定区CDR-VH1：G-Y-S-F-T-G-Y-F；
重链互补决定区CDR-VH2：I-N-P-X1-N-G-D-T，其中：X1是Y或W；
重链互补决定区CDR-VH3：A-R-D-Y-X2-G-Y-X3-E-S-X4-Y-Y-Y-A-M-D-Y，其中：X2是Y或S，X3是D或A；X4是L或T；
轻链互补决定区CDR-VL1：Q-S-V-D-Y-D-G-D-S-Y；
轻链互补决定区CDR-VL2：I-Y-A-A-X5-N，其中：X5是S或Y；
轻链互补决定区CDR-VL3：Q-Q-S-N-E-X6-P-X7-T，其中：X6是D或A，X7是Y或S；
所述抗体或其功能性片段选自如下突变组合任一种：
2.根据权利要求1任一项所述特异性结合孕酮-孕酮抗体复合物的抗体或其功能性片段，其特征在于，所述抗体包括序列依次如SEQ ID NO:13-16所示的重链骨架区FR1-H、FR2-H、FR3-H及FR4-H，序列依次如SEQ ID NO:17-20所示的轻链骨架区FR1-L、FR2-L、FR3-L及FR4-L。
3.根据权利要求1-2任一项所述特异性结合孕酮-孕酮抗体复合物的抗体或其功能性片段，其特征在于，所述抗体还包含恒定区。
4.根据权利要求3所述的抗体或其功能性片段，其特征在于，所述恒定区选自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4中的任意一者的恒定区。
5.根据权利要求4所述的抗体或其功能性片段，其特征在于，所述恒定区的种属来源为牛、羊、兔、小鼠、大鼠或人。
6.根据权利要求1-2任一项所述特异性结合孕酮-孕酮抗体复合物的抗体或其功能性片段，其特征在于，所述功能性片段选自所述抗体的Fab、F(ab’)2、Fv和scFv中的任意一种。
7.如权利要求1-6任一项所述的抗体或其功能性片段在制备用于孕酮检测试剂或试剂盒中的应用。
8.一种检测孕酮的试剂或试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1-6中任一项所述的抗体或其功能性片段。
9.一种用于检测孕酮的量的方法，其特征在于，使抗孕酮的第一抗体与待测样品中的孕酮免疫反应形成孕酮-孕酮抗体复合物，使权利要求1-6中任一项所述的抗体或其功能性片段与孕酮-孕酮抗体复合物结合以形成免疫夹心复合物，通过检测免疫夹心复合物的量来确定待测样品中孕酮的量。
10.根据权利要求9所述的一种用于检测孕酮的量的方法，其特征在于，所述方法选自下述的任意一种：荧光免疫法、化学发光免疫法、胶体金免疫法、放射免疫法或酶联免疫法。
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