CN115894673A - 一种抗新型冠状病毒的抗体及其在检测中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种抗新型冠状病毒的抗体及其在检测中的应用，涉及抗体技术领域。本发明提供的抗体所述抗体包括氨基酸序列依次如SEQ IDNo.1～3所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3，和氨基酸序列依次如SEQ IDNo.4～6所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3，该抗体特异性、灵敏度高，能用于新冠病毒的检测，基于所述抗体开发的新冠抗原检测试剂，能够在不受病毒突变株抗原蛋白突变的影响的情况下特异性检测新型冠状病毒，并且能够降低检测成本，缩短检测时间，提高检测效率。

Description

一种抗新型冠状病毒的抗体及其在检测中的应用

技术领域

本发明涉及抗体技术领域，具体而言，涉及一种抗新型冠状病毒的抗体及其在检测中的应用。

背景技术

冠状病毒是一个大型病毒家族，已知可引起感冒及中东呼吸综合征(MERS)和严重急性呼吸综合征(SARS)等较严重疾病。

新型冠状病毒(2019-nCoV，SARS-CoV-2)是人类分离的第七类冠状病毒。该病毒属于β属，有包膜，颗粒呈圆形或椭圆形，常为多形性，直径60-140nm。其基因特征与SARS-CoV和MERS-CoV有明显区别。SARS-CoV-2基本结构为基因组RNA和磷酸化核衣壳蛋白(N蛋白)组成的包膜结构。包膜结构嵌合4种蛋白：刺突糖蛋白(S蛋白)、小包膜糖蛋白(E蛋白)、膜糖蛋白(M蛋白)和血凝素糖蛋白(HE蛋白)。N蛋白被埋在磷脂双层中被两种不同类型的刺突蛋白覆盖，负责营养物质运输的膜蛋白(M蛋白，属于Ⅲ型跨膜糖蛋白)和包膜蛋白(E蛋白)位于病毒包膜的S蛋白之间。

新型冠状病毒变异毒株一般是指新型冠状病毒在复制的过程中，个别病毒中的某个或某些基因序列可能出现轻微的改变，基因序列的改变让病毒得以存活下来，并进行进一步的繁殖，一个新的新型冠状病毒变异毒株也由此形成。一种新的新型冠状病毒变异毒株的形成可能是在原有病毒毒株的基础上增强或减弱,变异毒株的临床表现、传播方式、传播速度等都有可能发生变化。新冠病毒属于RNA病毒，比DNA病毒更容易发生突变。截至2021年9月26日，已有39个国家发现德尔塔变异毒株，45个国家发现阿尔法变异毒株，40个国家发现贝塔变异毒株。2021年末出现的新冠病毒奥密克戎突变株，突变位点数量明显多于其它流行的所有新冠病毒变异株，尤其在病毒刺突(Spike)蛋白突变较多，导致这一病毒传播力及免疫逃逸能力加强。这些不断出现在世界各地的新冠病毒变异毒株，使得疫情防控及检测难度不断加剧，因此新冠疫情的防控是全世界国家与地区共同关心与面对的难题。

新型冠状病毒的检测方法主要包括如下。

a.病原学检测：病毒的病原学检测方法有细胞培养、血清学检测、核酸检测、电镜检测等。与其他方法相比较，核酸分子的检测具有快速、灵敏度高、特异性强等特点，已成为冠状病毒检测的主流方法。现有的冠状病毒核酸检测方法包括全基因组测序、RT-PCR法、CRISPR、逆转录环介导等温扩增法(RT-LAMP)和实时RT-LAMP等。针对SARS-CoV-2核酸的检测，当前最为普遍适用的方法是实时荧光定量PCR法，即通过对标本中的病毒RNA进行提取、逆转录、PCR扩增特定保守序列后，通过荧光等常规方法进行显示。此外，抗原检测针对的是病原体自身的检测，能够在发病早期检测出人体内是否含有病毒，从而提供病毒感染的直接证据。新冠病毒抗原检测是通过抗原和抗体结合反应在试纸条上检测患者口咽或鼻咽拭子中的病毒抗原，方便快捷，一般15-20分钟即可出结果。新冠抗原检测相对来说比较简便、快速。

b.血清学检查：血清学抗体检测已被纳入新冠肺炎确诊标准之一。与核酸检测相比，抗体检测具有采样简单、检测效率高等特点。IgM抗体是免疫应答中首先分泌的抗体,是病毒感染自体免疫过程中最早出现的抗体，可作为近期急性感染的标志。在通常情况下，IgM抗体产生早，一经感染，快速产生，多在3～5天后开始出现阳性，维持时间短，消失快，血液中IgM检测阳性可作为早期感染的指标。IgG抗体产生晚，维持时间长，消失慢，滴度恢复期较急性期有4倍及以上增高，血液中检测阳性可作为感染和既往感染的指标。因此，通过检测患者血清中IgM和IgG的阳性情况，将有助于判断患者所处SARS-CoV-2感染的不同时期。

免疫法快速检测一般采用试纸检测(1条红线阴性，1条红线阳性)，大多数基于抗原抗体的胶体金原理(图1)。胶体金标记的能与抗原特异结合的抗体1固定在结合垫上，NC膜上检测线处固定与抗原特异结合的抗体2，质控线处固定特异识别标记抗体的二抗。当待测样品滴加至样品垫加样处，样品向试纸吸水垫处移动，如含有待测抗原，抗原与结合垫上的金标抗体1结合，形成抗原抗体复合物，随后被检测线上的抗体2捕获，并显色。若待测样品中不含待测抗原，检测线不显色。同时质控线上抗体与金标抗体特异结合而显色，以验证试纸正常。抗体检测原理与抗原检测类似，如检测线上形成“标记抗原-抗体-捕获抗体”复合物，会显色，说明待测样本阳性。

然而，综合考虑现有技术新冠病毒检测方法的优劣来看，核酸检测对检测设备或平台要求较高，高灵敏度的RT-PCR仪价格昂贵，对实验室的洁净度和操作人员要求也较高。此外，核酸检测耗时较长，考虑到样本运输、样本积压的情况，通常24小时才可以报告结果。抗体检测样本血液中被刺激产生的抗体，是间接证据，对临床有提示作用，且有漏检可能。此外，新冠变异毒株在主要抗原蛋白中的突变，显著降低抗原检测试剂的检出能力，易于造成临床上的假阴性结果。

因此，仍然有强烈的动机开发新的新冠病毒检测抗体，以保证其能够用于新冠抗原检测试剂的开发，并且不受病毒突变株抗原蛋白突变的影响，降低检测成本，缩短检测时间，提高检测效率。

鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供一种抗新型冠状病毒的抗体及其在检测中的应用。

本发明是这样实现的：

第一方面，本发明实施例提供了一种特异性靶向新型冠状病毒N蛋白的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包括重链可变区和轻链可变区；所述轻链可变区包括氨基酸序列依次如SEQ ID No.1～3所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；所述重链可变区包括氨基酸序列依次如氨基酸序列依次如SEQ ID No.4～6所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3。

第二方面，本发明实施例提供了编码如前述实施例所述的抗体或其抗原结合片段的核酸。

第三方面，本发明实施例提供了一种抗体偶联物，其包括：前述实施例所述的抗体或其抗原结合片段。

第四方面，本发明实施例提供了一种检测新型冠状病毒的试剂、试剂盒或组合物，其包括如前述实施例所述的抗体或其抗原结合片段。

第五方面，本发明实施例提供了如前述实施例所述的抗体或其抗原结合片段在制备免疫诊断的产品中的应用。

第六方面，本发明实施例提供了一种免疫层析试纸或试剂盒，其包括如前述实施例所述的抗体或其抗原结合片段。

本发明具有以下有益效果：

本发明的创新在于提供了一种特异性靶向新型冠状病毒的单克隆抗体，所述抗体能够高特异性、高灵敏度用于新型冠状病毒的检测，基于所述抗体开发的新冠抗原检测试剂，能够在不受病毒突变株抗原蛋白突变的影响的情况下特异性检测新型冠状病毒，并且能够降低检测成本，缩短检测时间，提高检测效率。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为胶体金免疫检测原理图；

图2为单克隆抗体H2B4的特异性检测结果；

图3为侧向流免疫层析试剂对灭活新冠病毒培养物的灵敏度测试结果；

图4为侧向流免疫层析试剂对标准化重组新冠病毒N蛋白的灵敏度测试结果；

图5为侧向流免疫层析试剂不同新冠病毒突变株的检测结果；

图6为侧向流免疫层析试剂的临床样本测试结果。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

首先，本发明实施例提供了一种特异性靶向新型冠状病毒N蛋白的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包括重链可变区和轻链可变区；所述轻链可变区包括氨基酸序列依次如SEQ ID No.1～3所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；所述重链可变区包括氨基酸序列依次如氨基酸序列依次如SEQ ID No.4～6所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3。

在本发明中，术语“抗体”涵盖各种抗体结构，包括但不限于单克隆抗体，多克隆抗体，多特异性抗体(例如双特异性抗体、三特异性抗体、四特异性抗体等等)，鼠源抗体，嵌合抗体，全长抗体等，只要它们展示出所期望的抗原结合活性。

在本发明中，术语“互补性决定区”、“CDR”或“CDRs”是指免疫球蛋白的重链和轻链的高度可变区，其是抗体可变结构域内主要促成与抗原特异性结合的区域。在本发明具体实施方式中，CDRs是指所述抗体的重链和轻链中2个以上高度可变区。

在本发明中，重链互补决定区用HCDR表示，重链可变区中含有的3个CDR区：HCDR1、HCDR2和HCDR3；轻链互补决定区用LCDR表示，轻链可变区中含有的3个CDR区：LCDR1、LCDR2和LCDR3。

在一些实施例中，所述抗体或其抗原结合片段的特异性靶向结合的氨基酸序列如SEQ ID No.10所示。

在一些实施例中，所述轻链可变区和重链可变区还包括骨架区。在本发明中，“骨架区”或“FR”区是指抗体重链可变区和轻链可变区中除CDR之外的区域；重链骨架区可以被进一步细分成被CDRs分隔开的毗邻区域(FR1、FR2、FR3和FR4)，其中，重链骨架区可以被进一步细分成被CDR分隔开的毗邻区域，包含HFR1、HFR2、HFR3和HFR4骨架区；轻链骨架区可以被进一步细分成被LCDR分隔开的毗邻区域，包含LFR1、LFR2、LFR3和LFR4骨架区。重链可变区由以下编号的CDR与FR(从氨基末端排到羧基末端)排列连接获得：HFR1-HCDR1-HFR2-HCDR2-HFR3-HCDR3-HFR4；轻链可变区由以下编号的CDR与FR(从氨基末端排到羧基末端)排列连接获得：LFR1-LCDR1-LFR2-LCDR2-LFR3-LCDR3-LFR4。

在一些实施例中，所述抗体或其抗原结合片段还包括恒定区。可选地，所述恒定区包括重链恒定区和/或轻链恒定区。全长抗体的轻链包括轻链可变区结构域VL及恒定区结构域CL，VL处于轻链的氨基末端，CL结构域处于羧基末端，轻链包括κ链及λ链；全长抗体重链包括重可变区结构域VH及恒定区CH，VH处于重链的氨基末端，CH结构域处于羧基末端。

在一些实施例中，所述重链恒定区选自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgM、IgE和IgD中的任意一者的恒定区。轻链恒定区为κ链或λ链。

在一些实施例中，所述重链恒定区为IgG1；轻链恒定区为κ链。

在一些实施例中，所述恒定区的种属来源为牛、马、猪、羊、大鼠、小鼠、狗、猫、兔、驴、鹿、貂、鸡、鸭、鹅或人。

在一些实施例中，所述轻链的氨基酸序列如SEQ ID No.7所示，所述重链的氨基酸序列如SEQ ID No.8所示。

“抗原结合片段”是完整抗体的部分，所述部分与完整抗体所结合的抗原特异性结合。本领域技术人员根据本发明记载的内容容易理解到，抗原结合片段可以通过本领域已知方法制备获得，例如，酶消化的方法(包括胃蛋白酶或木瓜蛋白酶)和/或通过化学还原分裂二硫键的方法获得，还可以通过重组遗传学技术或通过自动肽合成仪(如AppliedBioSystems的自动肽合成仪)合成获得。

在一些实施例中，所述抗原结合片段选自抗体的F(ab’)₂、Fab’、Fab、Fv和scFv中的任意一种。

另一方面，本发明实施例还提供了编码如前述任意实施例所述的抗体或其抗原结合片段的核酸。

另一方面，本发明实施例提供了一种抗体偶联物，其包括：前述任意实施例所述的抗体或其抗原结合片段。

在一些实施例中，所述抗体偶联物还包括与抗体或其抗原结合片段偶联的固相载体。

可选地，所述固相载体包括但不限于磁性微球、塑料微球、塑胶微粒、微孔板、玻璃、毛细管、尼龙和硝酸纤维素膜中的至少一种。

在一些实施例中，所述抗体偶联物还包括与抗体或其抗原结合片段偶联的可被检测的标记物。

在一些实施例中，所述标记物选自荧光染料、酶、放射性同位素、化学发光试剂和纳米颗粒类标记物中的至少一种。

在实际的使用过程中，本领域技术人员可以根据检测条件或实际需要选择其它合适的标记物，无论使用何种标记物，均属于本发明的保护范围。

在一些实施例中，所述荧光染料包括但不限于荧光素类染料及其衍生物(例如包括但不限于异硫氰酸荧光素(FITC)羟基光素(FAM)、四氯光素(TET)等或其类似物)、罗丹明类染料及其衍生物(例如包括但不限于红色罗丹明(RBITC)、四甲基罗丹明(TAMRA)、罗丹明B(TRITC)等或其类似物)、Cy系列染料及其衍生物(例如包括但不限于Cy2、Cy3、Cy3B、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、Cy3等或其类似物)、Alexa系列染料及其衍生物(例如包括但不限于AlexaFluor350、405、430、488、532、546、555、568、594、610、33、647、680、700、750等或其类似物)和蛋白类染料及其衍生物(例如包括但不限于藻红蛋白(PE)、藻蓝蛋白(PC)、别藻蓝蛋白(APC)、多甲藻黄素-叶绿素蛋白(preCP)等)。

在一些实施例中，所述酶包括但不限于辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶、碳酸酐酶、乙酰胆碱酯酶以及6-磷酸葡萄糖脱氧酶。

在一些实施例中，所述放射性同位素包括但不限于²¹²Bi、¹³¹I、¹¹¹In、⁹⁰Y、¹⁸⁶Re、²¹¹At、¹²⁵I、¹⁸⁸Re、¹⁵³Sm、²¹³Bi、³²P、⁹⁴mTc、⁹⁹mTc、²⁰³Pb、⁶⁷Ga、⁶⁸Ga、⁴³Sc、⁴⁷Sc、¹¹⁰mIn、⁹⁷Ru、⁶²Cu、⁶⁴Cu、⁶⁷Cu、⁶⁸Cu、⁸⁶Y、⁸⁸Y、¹²¹Sn、¹⁶¹Tb、¹⁶⁶Ho、¹⁰⁵Rh、¹⁷⁷Lu、¹⁷²Lu和¹⁸F。

在一些实施例中，所述化学发光试剂包括但不限于鲁米诺及其衍生物、光泽精、甲壳动物荧光素及其衍生物、联吡啶钌及其衍生物、吖啶酯及其衍生物、二氧环乙烷及其衍生物、洛粉碱及其衍生物和过氧草酸盐及其衍生物。

在一些实施例中，所述纳米颗粒类标记物包括但不限于纳米颗粒和胶体，所述纳米颗粒包括但不限于有机纳米颗粒、磁性纳米颗粒、量子点纳米颗粒和稀土络合物纳米颗粒。

在一些实施例中，所述胶体包括但不限于胶体金属、胶体硒、分散型染料、染料标记的微球和乳胶。

在一些实施例中，所述胶体金属包括但不限于胶体金或胶体银。

另一方面，本发明实施例还提供了如前述任意实施例所述的抗体或其抗原结合片段在制备新型冠状病毒检测产品中的应用。

在一些实施例中，所述产品包括试纸、试剂和试剂盒中的任意一种。

在一些实施例中，所述检测的方法选自：ELISA、免疫荧光法、化学发光免疫分析、Western blot、免疫层析法、电化学免疫分析和磁珠法中的任意一种。

在一些实施例中，所述检测产品为免疫层析检测试纸或试剂盒。

在一些实施例中，所述免疫层析检测试纸的结合垫上采用的捕获抗体为所述抗体或其抗原结合片段。

在一些实施例中，所述免疫层析检测试纸的检测线的检测抗体为所述抗体或其抗原结合片段。

另一方面，本发明实施例提供了一种侧向免疫层析试剂或试剂盒，其包括如前述任意实施例所述的抗体或其抗原结合片段。

在本发明公开了抗体的氨基酸序列的基础上，本领域技术人员可以采用基因工程技术或其他技术(化学合成、重组表达)制备得到该抗体，例如从能够重组表达如上任一项所述的抗体的重组细胞的培养产物中分离纯化得到该抗体，这对本领域技术人员来说是容易实现的，基于此，无论采用何种技术制备本发明的抗体，其均属于本发明的保护范围。

以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。

实施例1

1、杂交瘤单克隆抗体的制备：

(1)新冠病毒N抗原的设计、制备及载体偶联

根据GenBank上的新冠病毒蛋白序列(SEQ ID No.9)获得新冠病毒N蛋白序列。经过免疫原性、亲疏水性及表面可及性分析，最终筛选N蛋白区的N端1-55氨基酸序列为抗原(SEQ ID No.10)，该肽及C端偶联匙孔血蓝载体蛋白KLH的合成肽(COVID-KLH)抗原由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

(2)免疫小鼠

将合成多肽蛋白(COVID-KLH)与弗氏完全佐剂按1:1混匀500μl乳化后，皮下多点注射6-8周龄雌性Balb/c小鼠3只，每只小鼠抗原接种剂量为50μg，三周后抗原与弗氏不完全佐剂按1:1混匀500μl乳化后皮下多点注射，每只小鼠抗原接种剂量为50μg，间隔三周后50μg不加佐剂腹腔注射，共免疫4次。

(3)免疫血清效价测定

采用间接ELISA法测定免疫血清效价。取50μg合成肽COVID-KLH溶解于10mL 0.05MpH9.6磷酸盐缓冲液，包被聚苯乙烯96孔板，100μl/孔，4℃过夜。使用PBS(含有0.05％(V/V)Tween-20)洗板三次，用10mM PBS含1％BSA封闭液100μl/孔，37℃封闭2h，用PBS(含有0.05％(V/V)Tween-20)洗板三次，第三次免疫后10天小鼠尾静脉采血，鼠免疫血清用含1％BSA 10mM PBS进行10^-2～10^-8倍稀释，加入96孔板，100μl/孔37℃1h，PBS(含有0.05％(V/V)Tween-20)洗板三次后，加入1：10000倍稀释辣根过氧化物酶标记羊抗小鼠IgG(Sigma,INC.)，100μl/孔37℃30min，同上洗板后，TMB显色，100μl/孔，室温避光10min，加50μl/孔2MH₂SO₄终止反应，测450nm吸收值，以免疫前小鼠血清作为阴性对照，以测定值与对照值之比≥2.1为阳性判断值来确定免疫血清效价，结果如表1所示。

表1免疫血清效价

稀释倍数	免疫小鼠1	免疫小鼠2	免疫小鼠3	免疫小鼠4
					10000	2.54	2.65	2.53	2.58
50000	1.66	1.70	1.68	1.71
					100000	1.01	1.08	1.05	1.10
500000	0.53	0.55	0.57	0.62
					1000000	0.13	0.25	0.18	0.23

(4)杂交瘤的制备

取血清效价大于1:10⁵的小鼠，融合前3天，取合成肽COVID-KLH与等体积的PBS混匀后，以每只50μg/500μL的量腹腔注射BALB/c待融合小鼠进行加强免疫。无菌取小鼠脾脏，制成脾细胞悬液与对数生长期的小鼠骨髓瘤细胞株SP2/0按1：1的比例混合，1000g室温离心5min，弃上清，用手指轻弹离心管底部，使沉淀松散，离心管置于37℃水浴中，将在37℃水浴保温的50％聚乙二醇(PEG，MW4000，Sigma)用滴管一滴滴加入离心管中，边滴边摇动离心管，1min内滴完，滴完后静置2min，每隔1min加入37℃预热的无血清1640培养基1ml、2ml、3ml、4ml、5ml和10ml来终止聚乙二醇的作用，细胞混合物1000g室温离心5min，弃上清，加入HAT培养液(次黄嘌呤(H)、氨基喋呤(A)和胸腺嘧啶核苷(T)(HAT，Sigma))轻轻重悬细胞，将细胞分至96孔板中，每孔200μl。培养三天后，观察细胞融合情况，更换一半HAT培养液，连续数日，直至有克隆形成，融合后七天更换HT培养液(次黄嘌呤(H)和胸腺嘧啶核苷(T)(HT，Sigma))培养。

(5)筛选分泌抗新冠N蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞

间接ELISA法筛选细胞培养上清，选择效价较高的阳性克隆杂交瘤细胞进行亚克隆化，并用有限稀释法连续克隆化2-3次，直至到100％细胞阳性率。对于最终得到的5株效价格较高的杂交瘤细胞株培养上清进行间接ELISA方法检测，同时采用0.02M PBS进行稀释检测，测结果如表2所示。

表2稀释检测结果

最后获得效价最高的稳定分泌抗新冠N蛋白单克隆抗体细胞株，标记为H2B4。将克隆化后阳性率达100％的细胞扩增培养后液氮冻存。

(6)腹水的制备和纯化

将杂交瘤细胞株H2B4以1×10⁶/只的量注入液体石蜡预处理的8-10周龄的BALB/c雌性小鼠腹腔，饲养观察10-14天后小鼠腹部膨大时抽取腹水。采用亲和色谱法Protein GSepharose Fast Flow纯化单克隆抗体，以SDS-PAGE测定单克隆抗体的纯度，纯度达到90％以上。

实施例2：本发明单克隆抗体的特性鉴定

(1)抗体浓度的测定：经杂交瘤细胞H2B4制备的腹水经纯化后获得新冠病毒N蛋白单克隆抗体H2B4，使用Thermofisher公司生产的Nanodrop核酸蛋白测定仪测定，其浓度为3.70mg/ml。

(2)抗体亚型鉴定：采用Thermofisher的鼠单抗亚型鉴定试剂盒鉴定杂交瘤细胞株的亚型，H2B4分泌抗体的亚型为IgG1型，轻链为κ链。

(3)纯化抗体的效价鉴定：50μg合成新冠病毒N蛋白肽溶于10ml pH9.6的0.05M碳酸盐包被缓冲液中，加入96孔板，每孔100μL，4℃过夜。PBS(含有0.05％(v/v)Tween-20)洗板三次，用10mM PBS含1％BSA封闭液150μL/孔，37℃封闭2h，使用PBS(含有0.05％(v/v)Tween-20)洗板三次，每孔加入100μL纯化抗体，37℃孵育1h，PBS(含有0.05％(v/v)Tween-20)洗板三次，加入辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG多克隆抗体为二抗，37℃孵育30min，PBS(含有0.05％(v/v)Tween-20)洗板三次，每孔加入100μl，TMB显色，37℃孵育15min后，加入2M H₂SO₄溶液终止反应，酶标仪在吸光度值450nm处检测。多次结果显示抗体的效价在1×10⁶以上。

(4)亲和力测试：

用1×CB将新冠病毒重组表达N抗原蛋白分别稀释到0.5μg/ml、1μg/ml,以100μl/孔的量加入酶标板孔中，并做复孔，置4℃过夜或37℃吸附2小时。将包被好的微孔板甩干，按照洗板机设定的操作程序(AFP程序)清洗一遍，按200μl/孔的量加入封闭液，置于37℃温箱中2h，之后置于4℃过夜。临用前，将封闭好的微孔板从4℃取出，甩干，加入清洗液(1×PBS-T)使酶标版湿润；将本发明所述单克隆抗体H2B4用1×PBS预稀释至30μg/ml，并记录预稀释的倍数m，在稀释10倍即3μg/ml作为(S1)最高浓度然后再以1：3梯度稀释(在96深孔板中稀释)，一共8个稀释梯度(S1-S8)。

将100μl稀释好的抗体，加入在吸水纸上拍干净的96孔微孔板，37℃孵育30min；

孵育后将酶标板甩干，在吸水纸上拍干，用洗板机清洗酶标板3次，1-4列每孔加入100μl的1×PBS；5列与6列每孔，加入200ul尿素处理液，37℃孵育30min；孵育后将酶标板甩干，在吸水纸上拍干，用洗板机清洗酶标板3次，每孔加入100μl预先用二抗稀释液稀释10000倍的GAM-HRP酶标二抗，37℃孵育30min；孵育后将酶标板甩干，在吸水纸上拍干，用洗板机清洗酶标板3次，取TMB显色液，每孔加入100μl显色液，37℃孵育5-10min；显色后每孔加入50μl终止液。在酶标仪上设置进行450nm/630nm读值。根据所读数值分别计算出在0.5μg/ml与1μg/ml两个浓度抗原下，抗原-抗体复合物的浓度占总浓度的一半时，H2B4抗体对应的浓度值K_0.5和K₁，并以此计算出抗体H2B4的亲和力常数为：1.35×10¹⁰。

表3亲和力结果

(5)特异性检测

通过Western blot方式对单克隆抗体H2B4的特异性进行检测，使用的抗原分别为流感病毒A的NP重组蛋白，流感病毒B的NP重组蛋白，RSV病毒的F蛋白以及新型冠状病毒的N蛋白。上述蛋白用上样缓冲液稀释后，经SDS-PAGE后用Bio-Rad电转移装置将蛋白转移至PVDF膜上，5％脱脂奶粉封闭1h，pH7.4的Tris-HCl缓冲液(含有0.1％(V/V)Tween-20)洗膜3次，每次5min，1:1000加入经纯化的抗新冠病毒单克隆抗体H2B4，4℃孵育过夜，pH7.4的Tris-HCl缓冲液(含有0.1％(V/V)Tween-20)洗膜3次，每次5min，加入1:10000稀释的羊抗鼠IgG多克隆抗体(Sigma)为二抗，室温孵育2h，TBST洗膜3次，用滤纸吸去多余的溶液，平铺于干净的保鲜纸上，加入1.4ml Pierce-Thermo Scientific ECL系列Western化学发光底物反应液(A:B＝1:1)，使膜完全浸润于反应液中，迅速取出，用滤纸吸去多余液体，铺于另一张保鲜纸上，用保鲜纸把膜包好，放入X射线摄影暗盒，在暗房中显影。抗新冠病毒单克隆抗体H2B4与新型冠状病毒N蛋白发生特异性反应，出现单一的特异性条带。结果显示除新型冠状病毒的N蛋白外，其余抗原的检测结果均为阴性，结果如图2所示。

实施例3：单克隆抗体H2B4测序

取纯化后的抗新冠病毒N蛋白的单克隆抗体H2B4共5mg，由艾柏森生物科技有限公司进行抗体轻链可变区与重链可变区的测序，具体序列见表4。

表4抗体的序列信息

实施例4：侧向流免疫层析试剂的制备

需要说明的是，在其他实施例中，本发明提供的抗体还可用于酶联免疫、化学发光及免疫荧光检测等免疫诊断试剂的制备，本实施例以侧向流层析试剂的制备为例：

(1)胶体金的制备：

采用还原法制备，制金条件为1/万氯金酸100ml+1.8ml 1％柠檬酸三钠。

(2)抗体配对优选实验：将挑选的抗体H2B4、F7A1、G4D8、E9C2、D7F1、F5H2、E7G6、C8A6、C2F3分别进行酶标记。另外用1×CB将重组新冠病毒N抗原分别稀释到0.1μg/mL、0.2μg/mL、0.5μg/mL、1μg/mL四个浓度，每个样本复孔检测，每孔加入100μL样本。结果如下表所示。

根据上述结果，选择线性关系最优的抗体D7F1作为标记单抗使用。单克隆抗体D7F1序列如下所示。

轻链(下划线部分为轻链可变区，加粗部分对应轻链的CDR1～CDR3)：

CDR-L1	EASENIYSNLA
		CDR-L2	TATRLAD
CDR-L3	QEFWGTPYT

重链(下划线部分为轻链可变区，加粗部分对应重链的CDR1～CDR3)：

(3)胶体金标记鼠抗新冠病毒N蛋白单抗

物理吸附法，通过调节pH值使胶体金与抗体结合起来。具体标记条件为：pH8.3的条件下，每毫升胶体金加入0.1M碳酸钾溶液20μL，小鼠抗新冠病毒N蛋白单抗(D7F1)标记浓度为16μg/mL。

(4)检测线

取适当浓度1.0mg/mL(其他实施例中，可选0.1～2.8mg/ml)的小鼠抗新冠病毒N蛋白单克隆抗体H2B4包被在硝酸纤维素膜上制备检测线。37℃干燥。喷点量为0.5μL/mm(其他实施例中，可选0.3～1.5μL/mm)。

d.质控线

取1.2mg/mL(其他实施例中，可选自0.5～2.5mg/mL)山羊抗小鼠IgG多克隆抗体，在纤维膜上制备质控线，37℃干燥。喷点量为0.6μL/mm(其他实施例中，可选0.1～1.5μL/mm)。

(5)检验方法

将检测卡(检测条)、样本稀释液和样本恢复至18～30℃。检测卡或检测条检测方法如下：

a.从铝箔袋中取出检测卡或检测条，做好样本标记，放在水平工作台面上平置；

b.取20μL鼻咽或口咽拭子样本提取液直接加入到加样孔中(检测卡)或指示箭头下端的加样处(检测条)；

c.再加入100μL(2～3滴)样本稀释液；

d.15～20分钟内判读结果，20分钟后检验结果无效。

(6)检验结果的解释

a.检测线阳性：检测线和质控线显色。提示样本检出新型冠状病毒(2019-nCoV)I抗原，可能处于早期感染或现症感染，需结合临床症状进行最终的确认。

b.阴性：检测窗仅出现一条红色质控线。表示样本未检出新型冠状病毒(2019-nCoV)抗原。

c.无效：检测窗无红色质控线出现。

实施例5：新冠抗原侧向流免疫层析试剂性能测试

1)灵敏度测试

a.灭活新冠病毒培养物测试

使用本发明实施例的抗体制备的侧向流免疫层析试剂检测灭活新冠病毒培养物，最低可测试到低至10TCID50/mL的病毒培养物。实验结果如下图3所示。

b.标准化重组新冠病毒N蛋白测试

采用中国计量科学研究院制备的新型冠状病毒核衣壳蛋白溶液标准物质(标准物质编号：GBW(E)091097)对实施例1所述抗体开发的侧向流免疫层析快检试剂进行检测。如图4所示，可检出最低达10pg/mL的标准重组新冠病毒N蛋白。

2)特异性测试

a.重组新冠变异病毒株N蛋白测试

采用系列重组新冠变异病毒株N蛋白，检测本专利所述抗体开发的侧向流免疫层析快检试剂对重组新冠变异病毒毒株N蛋白的检出能力。结果显示，检测试剂可检出不同突变株的重组N蛋白，所示突变株分别为新型冠状病毒beta株、新型冠状病毒delta株、新型冠状病毒Gamma株、新型冠状病毒Omicron株，具体结果如图5所示。

实施例6：侧向流免疫层析试剂临床样本测试

使用本发明实施例提供的侧向流免疫层析试剂检测100例正常人的鼻拭子样本以及新冠病毒感染者的鼻拭子样本，检测结果如图6所示(篇幅所限，仅示例部分结果)。由图可以看出，检测结果清晰可见，背景干净，表明该产品特异性良好，可用于临床样本的快速检测。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种特异性靶向新型冠状病毒N蛋白的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或其抗原结合片段包括重链可变区和轻链可变区；所述轻链可变区包括氨基酸序列依次如SEQ ID No.1～3所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；所述重链可变区包括氨基酸序列依次如氨基酸序列依次如SEQ ID No.4～6所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3。

2.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或其抗原结合片段的特异性靶向结合的氨基酸序列如SEQ ID No.10所示；

优选地，所述抗体选自：单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体、鼠源抗体和嵌合抗体中的任意一种；

优选地，所述多特异性抗体包括双特异性抗体、三特异性抗体和四特异性抗体中的任意一种；

优选地，所述抗原结合片段选自抗体的F(ab’)₂、Fab’、Fab、Fv和scFv中的任意一种。

3.根据权利要求1～2任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或其抗原结合片段还包括恒定区；

优选地，所述恒定区包括重链恒定区和轻链恒定区，所述重链恒定区选自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgD、IgE或IgM中的任一种；轻链恒定区为κ链或λ链；

优选地，所述重链恒定区为IgG1；轻链恒定区为κ链；

优选地，所述轻链的氨基酸序列如SEQ ID No.7所示，所述重链的氨基酸序列如SEQ IDNo.8所示。

4.编码如权利要求1～3任一项所述的抗体或其抗原结合片段的核酸。

5.一种抗体偶联物，其特征在于，其包括：权利要求1～3任一项所述的抗体或其抗原结合片段；

优选地，所述抗体偶联物还包括与抗体或其抗原结合片段偶联的固相载体；

优选地，所述抗体偶联物还包括与抗体或其抗原结合片段偶联的可被检测的标记物。

6.一种检测新型冠状病毒的试剂、试剂盒或组合物，其特征在于，其包括如权利要求1～3任一项所述的抗体或其抗原结合片段；

优选地，所述试剂、试剂盒或组合物还包括用于免疫诊断方法的试剂。

7.根据权利要求6所述的检测新型冠状病毒的试剂、试剂盒或组合物，其特征在于，所述免疫诊断方法包括：酶联免疫分析、化学发光检测、侧向流免疫层析和免疫荧光检测中的任意一种。

8.如权利要求1～3任一项所述的抗体或其抗原结合片段在制备新型冠状病毒检测的产品中的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述新型冠状病毒检测的方法包括：酶联免疫分析、化学发光检测、侧向流免疫层析和免疫荧光检测中的任意一种；

优选地，所述产品选自试剂、试纸和试剂盒中的任意一种。

10.一种侧向免疫层析试剂或试剂盒，其特征在于，其包括如权利要求1～3任一项所述的抗体或其抗原结合片段。

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