CN115850459B - 靶向新型冠状病毒n蛋白的抗体及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种靶向新型冠状病毒N蛋白的抗体及其应用。抗体的轻链、重链的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:3、4所示。利用该抗体开发了侧向流免疫层析检测试剂。该抗体灵敏度高，特异性好，在免疫诊断领域具有广泛的应用前景。

Description

靶向新型冠状病毒N蛋白的抗体及其应用

技术领域

本发明涉及免疫检测技术领域，具体地说，涉及一种靶向新型冠状病毒N蛋白的抗体及其应用。

背景技术

冠状病毒在分类学上属于套式病毒目冠状病毒科冠状病毒属(Coronavirus)，其是自然界广泛存在的一大类病毒，可感染如人、鼠、猪、猫、牛、禽类等多种动物，尤其是已知有多种可感染人的冠状病毒，所述病毒可使得病人患感冒、中东呼吸综合征(MERS)和严重急性呼吸综合征(SARS)等较严重疾病。目前引发新冠肺炎大流行的新型冠状病毒是以前从未在人体中发现的冠状病毒新毒株。

新型冠状病毒(SARS-CoV-2)是人类分离的第七类冠状病毒。该病毒属于β属，有包膜，颗粒呈圆形或椭圆形，常为多形性，直径60-140nm。其基因特征与SARS-CoV和MERS-CoV有明显区别。SARS-CoV-2基本结构为基因组RNA和磷酸化核衣壳蛋白(N蛋白)组成的包膜结构。包膜结构嵌合4种蛋白：刺突糖蛋白(S蛋白)、小包膜糖蛋白(E蛋白)、膜糖蛋白(M蛋白)和血凝素糖蛋白(HE蛋白)。N蛋白被埋在磷脂双层中被两种不同类型的刺突蛋白覆盖，负责营养物质运输的膜蛋白(M蛋白，属于Ⅲ型跨膜糖蛋白)和包膜蛋白(E蛋白)位于病毒包膜的S蛋白之间。N蛋白序列保守程度高，在病毒复制过程中发挥重要作用，N蛋白与病毒RNA结合形成复合体，随后在膜蛋白和包膜蛋白的共同作用下，包裹后进入病毒衣壳中，其具有很强的免疫原性，这使得N蛋白能够成为良好的检测靶位点。

新型冠状病毒变异毒株一般是指新型冠状病毒在复制的过程中，个别病毒中的某个或某些基因序列可能出现轻微的改变，基因序列的改变让病毒得以存活下来，并进行进一步的繁殖，一个新的新型冠状病毒变异毒株也由此形成。一种新的新型冠状病毒变异毒株的形成可能是在原有病毒毒株的基础上增强或减弱，变异毒株的临床表现、传播方式、传播速度等都有可能发生变化。新冠病毒属于RNA病毒，比DNA病毒更容易发生突变。

新型冠状病毒的检测方法主要包括：

a.病原学检测：病毒的病原学检测方法有细胞培养、血清学检测、核酸检测、电镜检测、抗原检测等。与其他方法相比较，核酸分子的检测具有快速、灵敏度高、特异性强等特点，已成为冠状病毒检测的主流方法。现有的冠状病毒核酸检测方法包括全基因组测序、RT-PCR法、CRISPR、逆转录环介导等温扩增法(RT-LAMP)和实时RT-LAMP等。针对SARS-CoV-2核酸的检测，当前最为普遍适用的方法是实时荧光定量PCR法，即通过对标本中的病毒RNA进行提取、逆转录、PCR扩增特定保守序列后，通过荧光等常规方法进行显示。此外，抗原检测针对的是病原体自身的检测，能够在发病早期检测出人体内是否含有病毒，从而提供病毒感染的直接证据。新冠病毒抗原检测是通过抗原和抗体结合反应在试纸条上检测患者口咽或鼻咽拭子中的病毒抗原，方便快捷，一般15-20分钟即可出结果。

b.血清学检查：血清学抗体检测已被纳入新冠肺炎确诊标准之一。与核酸检测相比，抗体检测具有采样简单、检测效率高等特点。IgM抗体是免疫应答中首先分泌的抗体，是病毒感染自体免疫过程中最早出现的抗体，可作为近期急性感染的标志。在通常情况下，IgM抗体产生早，一经感染，快速产生，多在3～5天后开始出现阳性，维持时间短，消失快，血液中IgM检测阳性可作为早期感染的指标。IgG抗体产生晚，维持时间长，消失慢，滴度恢复期较急性期有4倍及以上增高，血液中检测阳性可作为感染和既往感染的指标。因此，通过检测患者血清中IgM和IgG的阳性情况，将有助于判断患者所处SARS-CoV-2感染的不同时期。

免疫检测利用抗原与抗体特异性结合的原理，其具有操作简单、时间快、成本低且可实现现场快速检测的优势。新型冠状病毒表面存在多种结构蛋白，包括多个抗原表位，以此来制备抗体检测抗原的存在，可直接证明样本中含有新型冠状病毒；另一方法是测定人体内产生的抗体。病毒感染人体后，会刺激免疫细胞产生特异性抗体，主要为IgM和IgG两类。

免疫法快速检测一般采用试纸检测(1条红线阴性，1条红线阳性)，大多数基于抗原抗体的胶体金原理(图1)。基于免疫层析平台胶体金法检测抗原的原理，如图1a所示。胶体金标记的能与抗原特异结合的抗体1固定在结合垫上，NC膜上检测线处固定与抗原特异结合的抗体2，质控线处固定特异识别标记抗体的二抗。当待测样品滴加至样品垫加样处，样品向试纸吸水垫处移动，如含有待测抗原，抗原与结合垫上的金标抗体1结合，形成抗原抗体复合物，随后被检测线上的抗体2捕获，并显色。若待测样品中不含待测抗原，检测线不显色。同时质控线上抗体与金标抗体特异结合而显色，以验证试纸正常。抗体检测原理与抗原检测类似，如检测线上形成“标记抗原-抗体-捕获抗体”复合物，会显色，说明待测样本阳性。

然而，综合考虑现有技术新冠病毒检测方法的优劣来看，核酸检测对检测设备或平台要求较高，高灵敏度的RT-PCR仪价格昂贵，对实验室的洁净度和操作人员要求也较高。此外，核酸检测耗时较长，考虑到样本运输、样本积压的情况，通常24小时才可以报告结果。而抗体检测样本血液中被刺激产生的抗体，是间接证据，对临床有提示作用，且有漏检可能。此外，新冠变异毒株在主要抗原蛋白中的突变，显著降低抗原检测试剂的检出能力，易于造成临床上的假阴性结果。

因此，亟待开发新的新冠病毒检测抗体，以保证其能够用于新冠抗原检测试剂的开发，并且不受病毒突变株抗原蛋白突变的影响，降低检测成本，缩短检测时间，提高检测效率。

发明内容

本发明的目的是提供一种靶向新型冠状病毒N蛋白的抗体及其应用。

为了实现本发明目的，根据GenBank公布的新冠病毒序列获得新冠病毒N蛋白序列(SEQ ID NO:1)，再经过免疫原性、亲疏水性及表面可及性分析，最终筛选获得N蛋白抗原(SEQ ID NO:2)，将所述抗原与载体偶联后免疫小鼠，制备杂交瘤，筛选分泌抗新型冠状病毒N蛋白单克隆抗体的杂交瘤，腹水制备和纯化，从而获得新型冠状病毒N蛋白的特异性单克隆抗体。

进一步地，所述载体为匙孔血蓝载体蛋白KLH，具体地，将所述抗原的C端偶联匙孔血蓝载体蛋白KLH，从而获得合成肽COVID-KLH，并将所述合成肽用于免疫小鼠。

进一步地，所述抗体为IgG，其亚型为IgG1，抗体的轻链为κ链。

抗体在本发明中涵盖各种抗体结构，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体如双特异性抗体和抗体片段，特别地，所述抗体片段具有相应的抗原结合活性。抗体片段的例子包括但不限于Fv，Fab，Fab’，Fab’-SH，F(ab’)₂；双抗体；线性抗体；单链抗体分子(如scFv)；以及由抗体片段形成的多特异性抗体。

第一方面，本发明提供一种特异性靶向新型冠状病毒N蛋白的抗体或其抗原结合片段，所述抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示，所述抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。

进一步地，所述抗体的靶向结合肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

进一步地，所述抗体或其抗原结合片段选自单克隆抗体、双特异性抗体、嵌合抗体、合成抗体、单链抗体、双链抗体、Fab、Fab’、F(ab’)₂。

进一步地，所述抗体的轻链可变区的CDR序列分别为：CDR1，氨基酸序列如SEQ IDNO:5所示；CDR2，氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示；CDR3，氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示。

进一步地，所述抗体的重链可变区的CDR序列分别为：CDR1，氨基酸序列如SEQ IDNO:8所示；CDR2，氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示；CDR3，氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示。

第二方面，本发明提供编码所述抗体或其抗原结合片段的核酸。

第三方面，本发明提供一种用于特异性检测新型冠状病毒的试剂、试剂盒或组合物，所述试剂、试剂盒或组合物包括所述的抗体或其抗原结合片段，以及任选的免疫诊断方法中常用的合适试剂。

第四方面，本发明提供所述抗体或其抗原结合片段在制备新型冠状病毒的检测试剂、试剂盒或组合物中的应用。

所述试剂、试剂盒可用于新冠病毒的诊断，尤其是用于新冠病毒的免疫诊断，所述免疫诊断包括但不限于酶联免疫分析、化学发光检测、侧向流免疫层析及免疫荧光检测。

第五方面，本发明提供一种侧向流免疫层析试剂，所述试剂包括所述抗体或其抗原结合片段。

借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：

本发明提供一种特异性靶向新型冠状病毒的单克隆抗体，所述抗体能够高特异性、高灵敏地用于新型冠状病毒的检测，基于所述抗体开发的新冠抗原检测试剂，能够在不受病毒突变株抗原蛋白突变的影响的情况下特异性检测新型冠状病毒，并且能够降低检测成本，缩短检测时间，提高检测效率。

附图说明

图1为抗原抗体的胶体金原理示意图；

图2为本发明较佳实施例中利用Western blot对单克隆抗体的特异性检测结果；其中，1、新型冠状病毒N蛋白；2、流感A的NP蛋白；3、流感B的NP蛋白；4、RSV病毒的F蛋白；5、上样buffer；6、空白。

图3为本发明较佳实施例中侧向流免疫层析试剂对灭活新冠病毒培养物的灵敏度测试结果。

图4为本发明较佳实施例中侧向流免疫层析试剂对标准化重组新冠病毒N蛋白的灵敏度测试结果。

图5为本发明较佳实施例中侧向流免疫层析试剂不同新冠病毒突变株的检测结果。

图6为本发明较佳实施例中为侧向流免疫层析试剂的临床样本检测结果。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecular Cloning:a Laboratory Manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。

实施例1新型冠状病毒特异性抗体的制备

1)新冠病毒N抗原的设计、制备及载体偶联

根据GenBank上的新冠病毒蛋白序列(登录号：YP-00972439)获得新冠病毒N蛋白序列(SEQ ID NO:1)。经过免疫原性、亲疏水性及表面可及性分析，最终筛选N蛋白区的N端50-108氨基酸序列作为抗原(SEQ ID NO:2)，该肽及C端偶联匙孔血蓝载体蛋白KLH的合成肽(COVID-N2-KLH)抗原由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

2)免疫小鼠

将合成多肽蛋白COVID-N2-KLH与弗氏完全佐剂按1:1混匀500μl乳化后，皮下多点注射6-8周龄雌性Balb/c小鼠3只，每只小鼠抗原接种剂量为50μg，三周后抗原与弗氏不完全佐剂按1:1混匀500μl乳化后皮下多点注射，每只小鼠抗原接种剂量为50μg，间隔三周后50μg不加佐剂腹腔注射，共免疫4次。

3)免疫血清效价测定

采用间接ELISA法测定免疫血清效价。取50μg合成肽COVID-N2-KLH溶解于10ml0.05M pH9.6磷酸盐缓冲液，包被聚苯乙烯96孔板，100μl/孔，4℃过夜。使用PBS(含有0.05％(V/V)Tween-20)洗板三次，用10mM PBS含1％BSA封闭液100μl/孔，37℃封闭2h，用PBS(含有0.05％(V/V)Tween-20)洗板三次，第三次免疫后10天小鼠尾静脉采血，鼠免疫血清用含1％BSA 10mM PBS进行10-2～10-8倍稀释，加入96孔板，100μl/孔37℃1h，PBS(含有0.05％(V/V)Tween-20)洗板三次后，加入1:10000倍稀释的辣根过氧化物酶标记羊抗小鼠IgG(Sigma,INC.)，100μl/孔，37℃30min，同上洗板后，TMB显色，100μl/孔，室温避光10min，加50μl/孔2M H₂SO₄终止反应，测定450nm吸收值，以免疫前小鼠血清作为阴性对照，以测定值与对照值之比≥2.1为阳性判断值来确定免疫血清效价(表1)。

表1

稀释倍数	免疫小鼠1	免疫小鼠2	免疫小鼠3	免疫小鼠4
					10000	2.62	2.73	2.53	2.60
50000	1.65	1.69	1.61	1.68
					100000	1.03	0.96	0.91	1.10
500000	0.56	0.57	0.52	0.60
					1000000	0.20	0.22	0.14	0.25

4)杂交瘤的制备

取稀释10⁶后的血清效价高于0.15的小鼠，融合前3天，取合成肽COVID-N2-KLH与等体积的PBS混匀后，以每只50μg/500μL的量腹腔注射BALB/c待融合小鼠进行加强免疫。无菌取小鼠脾脏，制成脾细胞悬液与对数生长期的小鼠骨髓瘤细胞株SP2/0按1:1的比例混合，1000g室温离心5min，弃上清，用手指轻弹离心管底部，使沉淀松散，离心管置于37℃水浴中，将在37℃水浴保温的50％聚乙二醇(PEG，MW4000，Sigma)用滴管一滴滴加入离心管中，边滴边摇动离心管，1min内滴完，滴完后静置2min，每隔1min加入37℃预热的无血清1640培养基1ml、2ml、3ml、4ml、5ml和10ml来终止聚乙二醇的作用，细胞混合物1000g室温离心5min，弃上清，加入HAT培养液(次黄嘌呤(H)、氨基喋呤(A)和胸腺嘧啶核苷(T)(HAT，Sigma))轻轻重悬细胞，将细胞分至96孔板中，每孔200μl。培养三天后，观察细胞融合情况，更换一半HAT培养液，连续数日，直至有克隆形成，融合后七天更换HT培养液(次黄嘌呤(H)和胸腺嘧啶核苷(T)(HT，Sigma))培养。

5)筛选分泌抗新冠N蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞

间接ELISA法筛选细胞培养上清，选择效价较高的阳性克隆杂交瘤细胞进行亚克隆化，并用有限稀释法连续克隆化2-3次，直至到100％细胞阳性率。对于最终得到的5株效价较高的杂交瘤细胞株培养上清进行间接ELISA方法检测，同时采用0.02M PBS进行稀释检测，结果如表2所示：

表2

最后获得稳定分泌抗新冠N蛋白单克隆抗体细胞株，标记为D7F1。将克隆化后阳性率达100％的细胞扩增培养后液氮冻存。

6)腹水的制备和纯化

将杂交瘤细胞株D7F1以1×10⁶/只的量注入液体石蜡预处理的8-10周龄的BALB/c雌性小鼠腹腔，饲养观察10-14天后小鼠腹部膨大时抽取腹水。采用亲和色谱法Protein GSepharose Fast Flow纯化单克隆抗体，以SDS-PAGE测定单克隆抗体的纯度，纯度达到90％以上。

实施例2单克隆抗体性能鉴定

1)抗体浓度的测定：经杂交瘤细胞D7F1制备的腹水经纯化后获得新冠病毒N蛋白单克隆抗体，使用Thermofisher公司生产的Nanodrop Smart Spec plus核酸蛋白测定仪测定，其浓度为3.50mg/ml。

2)抗体亚型鉴定：采用Roche公司Thermofisher的鼠单抗亚型鉴定试剂盒鉴定杂交瘤细胞株的亚型，D7F1分泌抗体的亚型为IgG1型，轻链为κ链。

3)纯化抗体的效价鉴定：

50μg合成新冠病毒N蛋白肽溶于10ml pH9.6的0.05M碳酸盐包被缓冲液中，加入96孔板，每孔100μL，4℃过夜。PBS(含有0.05％(V/V)Tween-20)洗板三次，用10mM PBS含1％BSA封闭液150μl/孔，37℃封闭2h，使用PBS(含有0.05％(V/V)Tween-20)洗板三次，每孔加入100μl纯化抗体，37℃孵育1h，PBS(含有0.05％(V/V)Tween-20)洗板三次，加入辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG多克隆抗体为二抗，37℃孵育30min，PBS(含有0.05％(V/V)Tween-20)洗板三次，每孔加入100μl，TMB显色，37℃孵育15min后，加入2M H2SO4溶液终止反应，酶标仪在吸光度值450nm处检测。多次结果显示抗体的效价在1×10⁶以上。

4)亲和力测试：

用1×CB将重组新冠病毒N抗原分别稀释到0.5μg/ml、1μg/ml，以100μl/孔量加入酶标板孔中，并做复孔，置4℃过夜。将包被好的微孔板甩干，按照洗板机设定的操作程序清洗一遍；按200μl/孔的量加入封闭液，置于37℃温箱中2h，然后于4℃过夜。封闭好的微孔板使用前，从4℃取出，甩干，加入清洗液(1×PBS-T)使酶标版湿润；将本发明所述单克隆抗体用1×PBS预稀释至30μg/ml，并记录预稀释的倍数，在稀释10倍即3μg/ml作为(S1)最高浓度然后再以1:3梯度稀释(在96深孔板中稀释)，一共8个稀释梯度(S1-S8，见表3)；微孔板在吸水纸上拍干净中后加入100μl稀释好的上述抗体，37℃孵育30min；孵育后将酶标板甩干，在吸水纸上拍干，用洗板机清洗酶标板3次，1-4列每孔加入100μl的1×PBS；5列与6列每孔，加入200μl尿素处理液，37℃孵育30min；孵育后将酶标板甩干，在吸水纸上拍干，用洗板机清洗酶标板3次，每孔加入100μl预先用二抗稀释液稀释10000倍的羊抗鼠-HRP酶标二抗，37℃孵育30min；孵育后将酶标板甩干，在吸水纸上拍干，用洗板机清洗酶标板3次，取TMB显色液，每孔加入100μl显色液，37℃孵育5-10min；显色后每孔加入50μl终止液；在酶标仪上用450nm/630nm读值。根据所读数值分别计算出在0.5μg/ml与1μg/ml两个浓度抗原下，抗原-抗体复合物的浓度占总浓度的一半时，抗体对应的浓度值K_0.5和K₁，并以此计算出抗体的亲和力常数为：1.57×10⁹。实验结果见表3：

表3

5)特异性检测：

通过Western blot方式对单克隆抗体的特异性进行检测，使用的抗原分别为流感病毒A的NP重组蛋白，流感病毒B的NP重组蛋白，RSV病毒的F蛋白以及新型冠状病毒的N蛋白。上述蛋白用上样缓冲液稀释后，经SDS-PAGE后用Bio-Rad电转移装置将蛋白转移至PVDF膜上，5％脱脂奶粉封闭1h，pH7.4的Tris-HCl缓冲液(含有0.1％(V/V)Tween-20)洗膜3次，每次5min，1:1000加入经纯化的杂交瘤细胞D7F1制备的抗新冠病毒单克隆抗体，4℃孵育过夜，pH7.4的Tris-HCl缓冲液(含有0.1％(V/V)Tween-20)洗膜3次，每次5min，加入1:10000稀释的羊抗鼠IgG多克隆抗体(Sigma)为二抗，室温孵育2h，TBST洗膜3次，用滤纸吸去多余的溶液，平铺于干净的保鲜纸上，加入1.4ml Pierce-Thermo Scientific ECL系列Western化学发光底物反应液(A:B＝1:1)，使膜完全浸润于反应液中，迅速取出，用滤纸吸去多余液体，铺于另一张保鲜纸上，用保鲜纸把膜包好，放入X射线摄影暗盒，在暗房中显影。杂交瘤细胞D7F1制备的抗新冠病毒单克隆抗体与新型冠状病毒N蛋白发生特异性反应，出现单一的特异性条带。结果显示除新型冠状病毒的N蛋白外，其余抗原的检测结果均为阴性，结果如图2所示。

单克隆抗体的氨基酸序列测定：取纯化后的杂交瘤细胞D7F1制备的抗新冠病毒N蛋白的单克隆抗体共5mg，由艾柏森生物科技有限公司进行抗体轻链可变区与重链可变区的测序。上述新冠病毒N蛋白单克隆抗体的轻链可变区序列为SEQ ID NO:3，重链可变区序列为SEQ ID NO:4。

抗体的轻链可变区的CDR序列分别为：CDR1，氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示；CDR2，氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示；CDR3，氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示。

抗体的重链可变区的CDR序列分别为：CDR1，氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示；CDR2，氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示；CDR3，氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示。

实施例3侧向流免疫层析试剂的制备

本发明抗体可用于多种免疫诊断相关试剂、试剂盒和或组合物的制备，下面以侧向流层析试剂的制备为例：

1)胶体金的制备：

采用还原法制备，制金条件为2％氯金酸5mL+10mL 1％柠檬酸三钠。

2)抗体配对优选实验：将挑选的抗体H2B4、F7A1、G4D8、E9C2、D7F1、F5H2、E7G6、C8A6、C2F3分别进行酶标记。另外用1×CB将重组新冠病毒N抗原分别稀释到0.1μg/mL、0.2μg/mL、0.5μg/mL、1μg/mL四个浓度，每个样本复孔检测，每孔加入100μL样本。实验结果见表4：

表4

选择线性关系最优的抗体H2B4作为标记单抗使用。

3)胶体金标记鼠抗新冠病毒N蛋白单抗

物理吸附法，通过调节pH值使胶体金与抗体结合起来。具体标记条件为：pH8.5的条件下，每毫升胶体金加入0.1M碳酸钾溶液20μL，小鼠抗新冠病毒N蛋白单抗H2B4(轻链、重链的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:11、12所示)标记浓度为15μg/mL。

4)检测线及质控线

检测线：取适当浓度(0.1-3.0mg/ml)的小鼠抗新冠病毒N蛋白单克隆抗体包被在硝酸纤维素膜上制备检测线，37℃干燥，喷点量为0.3-1.2μL/mm。

质控线：取适当浓度(0.5-2.0mg/mL)山羊抗小鼠IgG多克隆抗体，在纤维膜上制备质控线，37℃干燥，喷点量为0.1-1.2μL/mm。

5)检验方法

将检测卡(检测条)、样本稀释液和样本恢复至18～30℃。

检测卡或检测条检测方法如下：

a.从铝箔袋中取出检测卡或检测条，做好样本标记，放在水平工作台面上平置；

b.取20μL鼻咽或口咽拭子样本提取液直接加入到加样孔中(检测卡)或指示箭头下端的加样处(检测条)；

c.再加入100μL(2～3滴)样本稀释液；

d.15～20分钟内判读结果，20分钟后检验结果无效。

5)检验结果的解释

a.检测线阳性：检测线和质控线显色。提示样本检出新型冠状病毒I抗原，可能处于早期感染或现症感染，需结合临床症状进行最终的确认。

b.阴性：检测窗仅出现一条红色质控线。表示样本未检出新型冠状病毒抗原。

c.无效：检测窗无红色质控线出现。

实施例4侧向流免疫层析试剂性能测试

1)灵敏度测试

a.灭活新冠病毒培养物测试

使用本发明所述抗体开发的侧向流免疫层析快检试剂检测灭活新冠病毒标准株，最低可测试到低至10TCID₅₀/mL的病毒培养物。实验结果见图3。

b.标准化重组新冠病毒N蛋白测试

采用中国计量科学研究院制备的新型冠状病毒核衣壳蛋白(N蛋白)溶液标准物质(标准物质编号：GBW(E)091097)对本发明所述抗体开发的侧向流免疫层析快检试剂进行检测。结果表明可检出最低达10pg/mL的标准重组新冠病毒N蛋白，结果如图4所示。

2)特异性测试

a.重组新冠变异病毒株N蛋白测试

采用系列重组新冠变异病毒株N蛋白，检测本发明所述抗体开发的侧向流免疫层析快检试剂对重组新冠变异病毒毒株N蛋白的检出能力。结果显示，检测试剂可检出不同突变株的重组N蛋白，所示突变株分别为新型冠状病毒beta株、新型冠状病毒delta株、新型冠状病毒Gamma株、新型冠状病毒Omicron株，具体结果如图5所示。

实施例5侧向流免疫层析试剂临床样本测试

使用侧向流免疫层析快检试剂检测100例正常人的鼻拭子样本以及新冠病毒感染者的鼻拭子样本，部分检测结果如图6所示。由图可以看出，检测结果清晰可见，背景干净，表明该产品特异性良好，可用于临床样本的快速检测。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.特异性靶向新型冠状病毒N蛋白的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示，所述抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQID NO:4所示。

2.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体的靶向结合肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

3.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体选自单克隆抗体、双特异性抗体、嵌合抗体、双链抗体，所述抗原结合片段选自scFv、Fab、Fab’、F(ab’)₂。

4.根据权利要求1-3任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体的亚型为IgG1，所述抗体的轻链为κ链。

5.编码权利要求1-3任一项所述抗体或其抗原结合片段的核酸。

6.一种用于特异性检测新型冠状病毒的试剂、试剂盒或组合物，其特征在于，所述试剂、试剂盒或组合物包括权利要求1-4任一项所述的抗体或其抗原结合片段。

7.权利要求1-4任一项所述抗体或其抗原结合片段在制备新型冠状病毒的检测试剂、试剂盒或组合物中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述试剂、试剂盒或组合物为新型冠状病毒免疫诊断用的试剂、试剂盒或组合物。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述免疫诊断选自酶联免疫分析、化学发光检测、侧向流免疫层析、免疫荧光检测。

10.一种侧向流免疫层析试剂，其特征在于，所述试剂包括权利要求1-4任一项所述抗体或其抗原结合片段。

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