KR20210116115A - 돼지 유행성 설사병 바이러스와 결합하는 항체 및 이의 용도 - Google Patents

돼지 유행성 설사병 바이러스와 결합하는 항체 및 이의 용도 Download PDF

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차라미
최세은
현방훈
조영식
김선애
김정호
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Abstract

본 출원은 돼지 유행성 설사병 바이러스와 결합하는 항체 및 이를 이용한 돼지 유행성 설사병 바이러스에 대한 항체를 검출하는 방법에 관한 것으로서, 상기에 따르면, 시료 내 존재하는 돼지 유행성 설사병 바이러스 항체를 보다 간편하면서도 정확하게 검출할 수 있는 바, 관련 질병의 진단에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

돼지 유행성 설사병 바이러스와 결합하는 항체 및 이의 용도{Antibody binding to Porcine Epidemic Diarrhea virus and use thereof}
본 출원은 돼지 유행성 설사병 바이러스와 결합하는 항체 및 이를 이용한 돼지 유행성 설사병 바이러스에 대한 항체를 검출하는 방법에 관한 것이다.
돼지 유행성 설사병(porcine epidemic diarrhea: PED)은 원인체인 돼지 유행성 설사병 바이러스(porcine epidemic diarrhea virus: PEDV)의 감염에 의하여 연령에 관계없이 발생되는 돼지의 전염병으로 구토와 수양성 설사가 주요한 증상이다. 또한, 이 질병은 1992년 처음으로 국내에서 발생된 후 전국적으로 확산된 바 있으며, 포유자돈의 설사병 중 가장 큰 피해를 야기하는 질병으로서, 양돈 농가에 많은 경제적 피해를 주고 있다. 돼지 유행성 설사병을 일으키는 유행성 설사병 바이러스는 주로 소장 융모세포에 증식하여 융모 상피세포를 변성 또는 괴사시켜 융모의 위축과 탈락을 동반하고, 흡수장애를 초래하여 지속적인 수양성 설사를 일으킨다. 돼지의 연령에 상관없이 장염을 일으키며 심한 설사와 탈수현상을 동반하고 심지어 자돈에서의 치사율은 80~90%에 이른다. 최근 보고에 따르면, 2013년 말부터 돼지유행성설사병이 국내 180개 양돈장 (2013.11-2014.01)에서 34,168 두 감염 및 18,205두 폐사가 일어나 큰 경제적 피해를 일으켰다고 Kahis 통계는 파악하고 있으나 현장에서는 전국 양돈장의 30-40%가 피해를 보았다고 주장하고 있을 정도로 심각한 실정이다.
현재, 돼지 유행성 설사병의 진단은 임상 증상의 확인과 실험실 검사를 통해 이루어진다. 그러나, 동일한 코로나 바이러스 계열인 Transmissible Gastric Enteritidis(이하 TGE)와 유사한 임상증상의 양상을 보이기 때문에 이것만으로는 두 질병을 구분하는데 한계가 있으며, 감별진단을 위해서는 추가적인 실험실 검사가 이루어져야만 한다. 이를 위한 항원 검사로는 형광항체법(FA), 면역조직화학염색(IHC), ELISA, 전자현미경관찰(EM), PCR, 바이러스 분리법이 있으며, 항체 검사로는 바이러스 중화시험, 간접형광항체법, ELISA등이 있다. 바이러스성 설사병의 진단에 있어서, 과거에는 조직 배양을 이용한 원인체 분리, 감염된 자돈의 장 동결 절편을 이용한 형광항체검사법을 통한 진단법 등을 이용하고 있으나, 이러한 종래의 진단법은 별도의 검출 기기를 필요로 하고, 결과가 나오는데 시간이 오래 걸리며, 동시에 많은 시료를 처리할 수 없다는 단점이 있다.
이러한 기술적 배경 하에서, 효율적으로 모돈 내 항체가를 파악하고, 이들의 항체가 낮을 시 백신 접종을 권장하기 위해서, 기존의 중화 항체법을 쉽게 대체할 수 있을 만큼 정확하고, 대량으로 검사할 수 있는 검출 기술이 필요한 실정이나(한국 등록특허 제10-1618577호), 아직은 미비한 실정이다.
일 양상은 돼지 돼지 유행성 설사병 바이러스와 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공하는 것이다.
다른 양상은 상기 항체를 포함하는 돼지 유행성 설사병 바이러스에 대한 항체 검출용 키트를 제공하는 것이다.
다른 양상은 상기 키트를 이용한 돼지 유행성 설사병 바이러스에 대한 항체를 검출하는 방법을 제공하는 것이다.
본 출원의 다른 목적 및 이점은 첨부한 청구범위 및 도면과 함께 하기의 상세한 설명에 의해 보다 명확해질 것이다. 본 명세서에 기재되지 않은 내용은 본 출원의 기술 분야 또는 유사한 기술 분야 내 숙련된 자이면 충분히 인식하고 유추할 수 있는 것이므로 그 설명을 생략한다.
본 출원에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 출원에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 출원의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 출원의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.
일 양상은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어지는 LCDR1(Light chain complementarity determining region1: LCDR1), 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 상보성 결정 영역2(LCDR2), 및 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 상보성 결정 영역3(LCDR3)을 포함하는 경쇄 가변 영역; 서열번호 4의 중쇄 상보성 결정 영역1(Heavy chain complementarity determining region1: HCDR1), 서열번호 5의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 상보성 결정 영역2(HCDR2), 및 서열번호 6의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 상보성 결정 영역3(HCDR3)을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는, 돼지 유행성 설사병 바이러스와 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다.
본 명세서에서 사용된 용어, "돼지 유행성 설사병 바이러스(PEDV)"는 돼지에서 유행성 설사병을 유발하는 원인 바이러스로서, 알파코로나바이러스(Alphacoronavirus) 속에 속하며, 단일가닥의 양방향성 RNA(single-stranded positive-sense RNA)를 유전체로 가진다. 돼지 유행성 설사병 바이러스의 유전체는 4 개의 구조 단백질을 암호화하는 총 7 개의 전자 해석틀(open reading frame, ORF)로 구성된다. 상기 바이러스 유사 입자는 돼지 유행성 설사병 바이러스의 스파이크 단백질, 멤브레인 단백질, 엔벨로프 단백질, 및 뉴클레오캡시드 단백질을 포함할 수 있다. 여기서, 스파이크 단백질은 바이러스 표면에 존재하며, 곤봉 모양의 돌기 형태로 이루어진 구조 단백질이다. 상기 단백질은 숙주세포의 당 단백질 수용체와 결합하는 것으로 알려져 있으며, 이는 세포막과 바이러스 외막의 융합, 그리고, 중화 항체의 생성을 야기할 수 있다. 또한, 뉴클레오캡시드 단백질은 외피의 내부에 존재하며, 세포성 면역 반응에 관여하는 것으로 알려져 있다.
본 명세서에 사용된 용어, "항체 (antibody)"는 돼지 유행성 설사병 바이러스에 대한 특이적인 항체로서, 구체적으로, 돼지 유행성 설사병 바이러스의 스파이크 1(spike 1) 단백질에 특이적으로 결합하는 항체일 수 있다. 상기 항체는 완전한 항체, 항체 분자의 항원 결합 단편, 합성 항체, 재조합 항체, 또는 항체 하이브리드 (antibody hybrid)를 포함할 수 있다. 한편, 상기 돼지 유행성 설사병 바이러스, 구체적으로, 코로나 바이러스에 관한 서열 정보는 당업계에 이미 알려져 있다. 상기 항체는 단일클론 항체, 이특이적 항체, 비-인간 항체, 인간 항체, 인간화 항체, 키메릭 항체, 단쇄 Fv (scFv), 단쇄 항체, Fab 단편, F(ab')단편, 다이설파이드-결합 Fv (sdFv) 및 항-이디오타입 (항-Id) 항체, 그리고 상기 항체들의 에피토프-결합 단편을 포함할 수 있다.
상기 완전한 항체는 2개의 전장 (full length) 경쇄 및 2개의 전장 중쇄를 가지는 구조이고, 각각의 경쇄는 중쇄와 이황화 결합 (disulfide bond, SS-bond) 항체의 불변 영역은 중쇄 불변 영역과 경쇄 불변 영역으로 나뉘어지며, 중쇄 불변 영역은 감마 (γ), 뮤 (μ), 알파 (α), 델타 (δ) 및 엡실론 (ε) 타입을 가지고, 서브클래스로 감마1 (γ1), 감마2 (γ2), 감마3 (γ3), 감마4 (γ4), 알파1 (α1) 및 알파2 (α2)를 가질 수 있다. 경쇄의 불변 영역은 카파 (κ) 및 람다 (λ) 타입을 가질 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어, "단일클론 항체 (monoclonal antibody)"는 상기 항체 분자가 단일 분자로 구성되도록 제조된 것을 의미한다. 단일클론 항체는 동일한 에피토프를 갖는 항원에 대해서만 반응하는 특이성을 가지며, 또한 특정 에피토프에 대해서만 친화성을 나타낸다.
일 구체예에서, 상기 돼지 유행성 설사병 바이러스와 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 7의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 가변 영역; 및 서열번호 8의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 가변영역을 포함할 수 있다.
상기 서열번호 1 내지 8의 아미노산 서열과 각각 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 상기 아미노산 서열에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인될 수 있다.
상기 항체는 실시예에서 기술하고 있는 하이브리도마 세포에서 생산되는 것일 수 있다.
상기 하이브리도마 세포는 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제조할 수 있다. 구체적으로, 상기 하이브리도마 세포는 유전자 재조합 PEDV 스파이크 1 단백질을 동물에 면역시키고, 상기 피면역 동물로부터 유래된 항체 생산세포인 B 세포를 골수종세포와 융합시켜서 하이브리도마를 제조한 다음, 그 중에서 유전자 재조합 PEDV 스파이크 1 단백질에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체를 생산하는 하이브리도마를 선택하는 방법으로 제조할 수 있다. 상기 피면역 동물은 실시예에서 사용된 마우스뿐만 아니라 염소, 양, 모르모트, 래트 또는 토끼와 같은 동물을 사용할 수 있다.
상기 피면역 동물을 면역시키는 방법으로서는 당업계에 이미 공지된 방법을 사용할 수 있다. 예를 들어, 마우스를 면역시키는 경우 1회에 1 내지 100㎍의 면역원을 동량의 생리 식염수 및/또는 프로인드 어주번트 (Freund's adjuvant) 등의 항원 보조제로 유화시켜, 상기 피면역원 동물의 복부의 피하 또는 복강 내에 2-5주마다 2-6회 접종시키는 방법으로 수행될 수 있다. 피면역 동물을 면역시킨 후에는 최종 면역 3-5일 후 비장 또는 림프절을 적출하여 당업계에서 이미 공지되어 있는 세포 융합법에 따라, 융합 촉진제의 존재 하에 이들의 조직에 포함되어 있는 B 세포를 골수종세포와 융합시키게 된다. 상기 융합 촉진제는 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜(PEG)과 같은 물질을 사용할 수 있다. 상기 골수종세포는 예를 들어, P3U1, NS-1, P3x63. Ag 8.653, Sp2/0-Ag14와 같은 마우스 유래 세포, AG1, AG2와 같은 래트 유래 세포를 사용할 수 있다. 또한 상기 당업계에 공지된 세포 융합법은 예를 들어, B 세포와 골수종세포를 1:1-10:1의 비율로 혼합시켜, 이에 분자량 1,000-6,000의 PEG를 10-80%의 농도로 첨가하여, 30-37℃에서 1-10분 동안 배양하는 방법으로 수행될 수 있다. 또한, 상기 돼지 유행성 설사병 바이러스에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체를 생산하는 하이브리도마는 예를 들어, 하이브리도마만이 생존 가능한 HAT 배지 등의 선택 배지에서 배양하고, 하이브리도마 배양 상층액 중의 항체 활성을 ELISA 등의 방법을 이용하여 측정하여 선택할 수 있다. 최종적으로, 돼지 유행성 설사병 바이러스에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체를 생산하는 하이브리도마는 예를 들어, 돼지 유행성 설사병 바이러스에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체를 생산하는 하이브리도마에 대하여, 한계 희석 등의 방법에 의해 클로닝을 반복함으로써 선별될 수 있다. 한편, 상기 단일클론 항체는 IgG1, IgG2, IgG2a, IgG2b, IgG3, IgG4, IgM, IgE, IgA1, IgA5, 또는 IgD 타입일 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어, "항원 결합 단편 (Antigen binding fragment)"은 면역글로불린 전체 구조에 대한 그의 단편으로, 항원이 결합할 수 있는 부분을 포함하는 폴리펩티드의 일부를 의미한다. 예를 들어, F(ab')2, Fab', Fab, Fv 또는 scFv일 수 있다. 상기 항원 결합 단편 중 Fab는 경쇄 및 중쇄의 가변영역과 경쇄의 불변 영역 및 중쇄의 첫 번째 불변 영역 (CH1)을 가지는 구조로 1개의 항원 결합 부위를 가진다. Fab'는 중쇄 CH1 도메인의 C-말단에 하나 이상의 시스테인 잔기를 포함하는 힌지 영역 (hinge region)을 가진다는 점에서 Fab와 차이가 있다. F(ab')2 항체는 Fab'의 힌지 영역의 시스테인 잔기가 디설파이드 결합을 이루면서 생성된다. Fv는 중쇄 가변부위 및 경쇄 가변부위만을 가지고 있는 최소의 항체조각으로 Fv 단편을 생성하는 재조합 기술은 당업계에 널리 공지되어 있다. 이중쇄 Fv (two-chain Fv)는 비공유 결합으로 중쇄 가변부위와 경쇄 가변부위가 연결되어 있고 단쇄 Fv (single-chain Fv)는 일반적으로 펩타이드 링커를 통하여 중쇄의 가변 영역과 단쇄의 가변 영역이 공유 결합으로 연결되거나 또는 C-말단에서 바로 연결되어 있어서 이중쇄 Fv와 같이 다이머와 같은 구조를 이룰 수 있다. 상기 항원 결합 단편은 단백질 가수분해 효소를 이용해서 얻을 수 있다 (예를 들어, 전체 항체를 파파인으로 제한 절단하면 Fab를 얻을 수 있고 펩신으로 절단하면 F(ab')2 단편을 얻을 수 있다). 또한 상기 항원 결합 단편은 유전자 재조합 기술을 통하여 제작할 수 있다.
다른 양상은 플레이트; 상기 플레이트의 표면에 코팅된 돼지 유행성 설사병 바이러스와 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편; 및 상기 돼지 유행성 설사병 바이러스와 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 결합되어, 외부로 노출되어 있는 돼지 유행성 설사병 바이러스의 스파이크 1 단백질을 포함하는, 돼지 유행성 설사병 바이러스에 대한 항체 검출용 키트를 제공한다.
상기 돼지 유행성 설사병 바이러스에 대한 항체 검출용 키트에 대한 설명에서 언급된 용어 또는 요소 중 이미 언급된 것과 동일한 것은 상술한 바와 같다.
본 명세서에서, 상기 돼지 유행성 설사병 바이러스에 대한 항체 검출용 키트는, 예를 들어, 유전자 재조합 PEDV 스파이크 1 단백질에 결합하는 항체를 검출하기 위한 것일 수 있으며, 상기 키트는 돼지 유행성 설사병의 진단 또는 판정용 키트와 상호 교환적으로 사용 가능하다.
일 구체예에서, 상기 키트는 항원-항체 반응을 검출할 수 있는 공지의 기술이 비제한적으로 적용될 수 있으며, 예를 들어, 효소면역분석법(ELISA), 웨스턴 블로팅(Western Blotting), 면역형광(Immunofluorescence), 면역조직학염색(Immunohistochemistry staining), 유세포 분석법(Flow cytometry), 면역세포화학법, 방사능면역분석법(RIA), 면역침전분석법(Immunoprecipitation Assay), 면역확산분석법(Immunodiffusion assay), 보체 고정 분석법(Complement Fixation Assay) 및 단백질 칩(Protein Chip) 중 어느 하나일 수 있으며, 바람직하게 ELISA 검출법에 사용되는 것일 수 있으며, 보다 구체적으로, indirect ELISA 검출법에 사용되는 것일 수 있다.
일 구체예에서, 상기 항원의 코팅 농도 1.0 내지 5.0㎍/㎖일 수 있으며, 예를 들어, 1.0 내지 4.0㎍/㎖, 1.0 내지 3.0㎍/㎖, 1.0 내지 2.0㎍/㎖, 2.0 내지 4.0㎍/㎖, 2.0 내지 3.0㎍/㎖, 또는 3.0 내지 4.0㎍/㎖일 수 있고, 바람직하게는 1.5 내지 2.5㎍/㎖일 수 있다.
일 실시예에 따르면, 상기 돼지 유행성 설사병 바이러스에 대한 항체 검출용 키트는 돼지 유행성 설사병 바이러스 항원을 항체와의 특이적 결합을 통해 외부로 노출시킴으로써, 외부 표면으로 노출되는 항원의 부위가 균일하게 정렬되고, 표면상에 존재하는 불순물이 추가적으로 제거되어 노출되는 항원의 순도를 증가시킬 수 있었으며, 이를 통해, 돼지 유행성 설사병 바이러스에 대한 항체의 검출 효능을 보다 향상시킬 수 있었다.
다른 양상은 상기 돼지 유행성 설사병 바이러스에 대한 항체 검출용 키트 상에 생물학적 시료를 첨가하는 단계; 및
상기 키트에서 형성된 항원-항체 복합체의 형성을 확인하는 단계를 포함하는, 돼지 유행성 설사병 바이러스에 대한 항체를 검출하는 방법을 제공한다.
상기 돼지 유행성 설사병 바이러스에 대한 항체를 검출하는 방법에 대한 설명에서 언급된 용어 또는 요소 중 이미 언급된 것과 동일한 것은 상술한 바와 같다.
본 명세서에서, 상기 돼지 유행성 설사병 바이러스에 대한 항체를 검출하는 방법은, 예를 들어, 유전자 재조합 PEDV 스파이크 1 단백질에 결합하는 항체를 검출하는 방법일 수 있으며, 상기 방법은 돼지 유행성 설사병을 진단 또는 판정하기 위하여 사용 가능하다.
일 구체예에서, 상기 생물학적 시료는 돼지로부터 분리한 조직, 세포, 전혈, 혈청, 및 혈장 중 어느 하나일 수 있다. 또한 상기 생물학적 시료의 희석 배수는 20 내지 80x일 수 있으며, 예를 들어, 20 내지 70x, 20 내지 60x, 20 내지 50x, 20 내지 40x, 20 내지 30x, 30 내지 80x, 30 내지 70x, 30 내지 60x, 30 내지 50x, 40 내지 50x일 수 있으며, 바람직하게 35 내지 45x일 수 있다.
일 구체예에서, 상기 항원-항체 복합체의 형성을 확인하는 단계는 항원-항체 반응을 검출할 수 있는 공지의 기술이 비제한적으로 적용될 수 있으나, 바람직하게, ELISA 검출법, 구체적으로 indirect ELISA 검출법을 통해 실시될 수 있다.
일 구체예에서, ELISA 검출법에 의해 항원-항체 복합체의 형성을 확인하는 경우, 반응의 온도는 실온 내지 40℃, 바람직하게 30 내지 40℃ 조건에서, 접합체액의 농도는 1.0 내지 4.0㎍/㎖, 바람직하게 2.0 내지 3.0 ㎍/㎖ 조건에서 진행될 수 있다. 또한, 검체 및 접합체액의 반응 시간은 20 내지 80분, 바람직하게 50분 내지 70분 동안 진행할 수 있다. 아울러, 판정 기준 값, 흡광도는 0.4 내지 0.6 중 어느 하나일 수 있고, 바람직하게는 약 0.4일 수 있다.
일 실시예에 따르면, 상기 돼지 유행성 설사병 바이러스에 대한 항체를 검출하는 방법은 기존의 다른 제품에 비해 민감도, 및 특이도 등이 우수하고, 특히, 항원이 직접 코팅된 키트를 이용하는 검출법에 비해, 항원-항체간 특이적 결합, 구체적으로, 항원의 에피토프와의 특이적 결합에 따라, 외부 표면으로 노출되는 항원의 부위가 균일하게 정렬되고, 표면상에 존재하는 불순물이 추가적으로 제거되어 노출되는 항원의 순도가 증가됨에 따라, 높은 검출 민감도를 나타낼 수 있다.
일 양상에 따른 돼지 유행성 설사병 바이러스와 특이적으로 결합하는 항체, 상기 항체를 포함하는 돼지 유행성 설사병 바이러스에 대한 항체 검출용 키트, 및 돼지 유행성 설사병 바이러스에 대한 항체를 검출하는 방법에 따르면, 시료 내 존재하는 돼지 유행성 설사병 바이러스 항체를 보다 간편하면서도 정확하게 검출할 수 있는 바, 관련 질병의 진단에 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 유전자 재조합 S1 단백질을 제조 과정을 개략적으로 나타낸 도이다.
도 2는 PEDV 스파이크 1 단백질에 대한 발현 벡터의 개열 지도이다.
도 3은 PEDV 스파이크 1 단백질의 발현을 확인한 것으로서, 도 3의 A는 PEDV 스파이크 1 단백질의 밴드를 SDS-PAGE를 통해 확인한 결과이고, 도 3의 B는 PEDV 스파이크 1 단백질의 벡터 내 도입 여부를 SDS-PAGE를 통해 확인한 결과이다.
도 4는 Ni-resin 이용한 단백 정제 Fraction을 확인한 결과이다.
도 5는 PEDV 스파이크 1 단백질의 발현 및 이의 항원-항체 반응을 확인한 결과이다.
도 6은 돼지 유행성 설사병 바이러스의 검출용 단일클론 항체의 개발 과정을 나타낸 도이다.
도 7은 돼지 유행성 설사병 바이러스에 대한 항체 검출용 키트의 제조 과정을 나타낸 것이다.
도 8은 유전자 재조합 돼지 유행성 설사병 바이러스 항원을 코팅 원료로 사용하여 제조된, 돼지 유행성 설사병 바이러스에 대한 항체 검출용 키트의 제조 과정을 나타낸 것이다.
도 9는 일 실시예에 따른 돼지 유행성 설사병 바이러스에 대한 항체 검출용 키트를 사용한 돼지 유행성 설사병 바이러스 항체 검출 방법에서, 항원의 코팅 농도(1.5, 2.0, 2.5㎍/㎖)에 따른 검출 수준을 비교한 것이다.
도 10은 일 실시예에 따른 돼지 유행성 설사병 바이러스에 대한 항체 검출용 키트를 사용한 돼지 유행성 설사병 바이러스 항체 검출 방법에서, 검체의 희석 배수(20x. 40x, 80x)에 따른 검출 수준을 비교한 것이다.
도 11은 일 실시예에 따른 돼지 유행성 설사병 바이러스에 대한 항체 검출용 키트를 사용한 돼지 유행성 설사병 바이러스 항체 검출 방법에서, 검사 반응의 온도(RT, 37℃)에 따른 검출 수준을 비교한 것이다.
도 12는 일 실시예에 따른 돼지 유행성 설사병 바이러스에 대한 항체 검출용 키트를 사용한 돼지 유행성 설사병 바이러스 항체 검출 방법에서, 접합체액의 농도(1.0, 2.0, 4.0㎍/㎖)에 따른 검출 수준을 비교한 것이다.
도 13은 일 실시예에 따른 돼지 유행성 설사병 바이러스에 대한 항체 검출용 키트를 사용한 돼지 유행성 설사병 바이러스 항체 검출 방법에서, 검체 반응 시간(30분, 60분)에 따른 검출 수준을 비교한 것이다.
도 14는 일 실시예에 따른 돼지 유행성 설사병 바이러스에 대한 항체 검출용 키트를 사용한 돼지 유행성 설사병 바이러스 항체 검출 방법에서, 접합체액 반응 시간(30분, 60분)에 따른 검출 수준을 비교한 것이다.
도 15는 일 실시예에 따른 돼지 유행성 설사병 바이러스에 대한 항체 검출용 키트와 Biovet사의 PED IgG Ab Indirect ELISA 키트간 검출 민감도를 비교한 결과이다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
제조예 1. 유전자 재조합 S1 단백질의 개발
도 1에 도시된 항원 개발 모식도에 따라 유전자 재조합 단백질을 개발하였다. 구체적으로, PEDV 스파이크 1 단백질 (이하, PED S1로 명명함.)에 대한 Template DNA를 합성한 후, PCR 반응을 통해 유전자를 증폭하였다. 이후, 도 2의 개열 지도를 갖는 발현 벡터를 제조하고, Clonetech사의 Baculovirus Exporession system을 이용하여 항원을 배양하였다.
SDS-PAGE와 Western blot을 통해, 유전자 재조합 항원의 발현 및 반응성을 확인하였다. 도 3에 나타낸 바와 같이, 증폭된 PEDV 스파이크 1 단백질의 발현 및 상기 단백질의 벡터 내 도입을 확인하였다. 이후, 도 4에 나타낸 바와 같이, Ni-resin을 이용하여, 항원 원료의 정제 및 이의 결과를 확인하였으며, 도 5에 나타낸 바와 같이, 중화 항체가가 확인된 PED 음성, 양성 돼지혈청을 이용하여, 항원-항체의 반응성을 확인하였다.
제조예 2. 단일클론 항체의 개발
하이브리도마 세포주의 개발에 필요한 면역화된 마우스를 얻기 위하여, 유전자 재조합 항원과 동량의 complete Freund’s adjuvant와 1:1로 혼합하여 자성의 6주령 Balb/c 마우스의 복강 내에 주사하였다. 동일한 방법으로 일주일 간격 3회 추가 면역을 수행하였고, 마지막 4차 면역 일주일 후 면역원으로 사용한 동일 항원을 1일 간격으로 3회 상기 마우스의 꼬리정맥에 주사하여 부스팅하였다. 세포융합을 하기 전 면역화된 마우스의 꼬리에서 채혈하여 혈청을 확보한 후, ELISA로 면역원에 대한 항체 역가가 증가함을 확인하여, 면역 여부를 확인하였다. 항체 역가를 확인하고 항체의 양이 충분하게 얻어지는 마우스를 선별하여 세포융합과정을 수행하였다. 면역화된 마우스의 비장을 적출하여, 세포를 분리하고, 비장세포 1개와 골수종세포 5개를 확보하여, 하이브리도마 세포를 제조하여 배양하였다.
하이브리도마 세포군 중 PEDV에만 특이적으로 반응하는 세포를 선별하기 위해, 재조합항원을 코팅한 마이크로플레이트를 이용하여 ELISA를 검사하여, 항원과 특이적으로 높은 결합력을 갖는 항체를 분비하는 하이브리도마 세포주들을 선별하였다. 선별된 세포를 마우스 복강에 주입하여, 복수를 제조한 뒤, Affinity chromatography법을 이용하여 단일클론 항체를 정제하였다.
상기와 같이 정제한 단일클론 항체의 서열 정보는 다음과 같다. 한편 경쇄 가변 영역, 및 중쇄 가변 영역 내 CDR 영역은 별도로 표기하였다.
아미노산 서열 (5’->3’) 서열번호
Light chain
 DIVITQSPALMSASPGEKVTMTC SASSSVNYMY WYQQKPRSSPKPWIY LTSNLAS GVPARFSGSGSGT
SYSLTISSMEAEDAATYYC QQWSSNPLTF GAGTKLELKRADAAPTVS		 7
Heavy chain
 EVQLQQSGPG LVQPSQSLSITCTVS GFSLTSYGVH WVRQSPGKGLEWLG MIWSGGSTDYN
AAFISRLSISKDNSKSQVFFEMNSLQANDTAIYYCAR NSDGVRGIIYYALDY WGQGTSVT
VSS		 8
제조예 3. 돼지 유행성 설사병 바이러스 항체 검출용 키트의 제조
도 7에 도시한 바와 같이, 제조예 1의 PED S1에 대한 단일클론 항체를 4ug/mL의 농도로 포함하는 코팅 용액을 마이크로플레이트에 주입한 뒤, 4℃ 조건에서 Overnight 반응시켜, 1차 코팅을 진행하였다. 반응이 끝난 후, 용액을 제거하고, 플레이트에 흡착되지 않은 표면을 blocking 시키기 위하여, 0.1% Casein blocking solution을 반응시켰다. 반응이 끝난 후, 용액을 제거하고, PED S1 항원 코팅용액을 추가 첨가하여, 37℃에서 반응시켰다. 이후, 플레이트 표면에 흡착된 PED S1에 대한 단일클론 항체와 추가 주입한 Rec. PED S1 항원이 특이적인 결합반응에 의해, complex를 형성하고, 그 외 반응되지 않은 인자들은 제거하였다. 이후, 플레이트의 코팅된 원료를 안정하게 흡착시킨 상태의 보존성을 높이기 위하여, 플레이트 안정제(stabilizer)를 반응시킨 후, 반응물을 제거하고, 플레이트를 건조하였다. 그 후, 실리카 겔과 함께 밀봉한 뒤, 사용 전까지 2~8℃의 냉장 조건에서 보관하였다.
비교예 1. 돼지 유행성 설사병 바이러스 항원이 코팅된 키트의 제조
도 8에 도시한 바와 같이, 돼지 유행성 설사병 바이러스 항원이 플레이트의 표면에 직접 코팅된 키트를 제조하였다. PED S1 항원을 포함하는 코팅 용액을 사용하여, 37℃ 조건에서 Overnight 반응시켜, 코팅을 진행하였다. 반응이 끝난 후, 용액을 제거하고, 플레이트에 흡착되지 않은 표면을 blocking 시키기 위하여, 0.1% Casein blocking solution을 반응시켰다. 이후, 플레이트의 코팅된 원료를 안정하게 흡착시킨 상태의 보존성을 높이기 위하여, 플레이트 안정제(stabilizer)를 반응시킨 후, 반응물을 제거하고, 플레이트를 건조하였다. 그 후, 실리카 겔과 함께 밀봉한 뒤, 사용 전까지 2~8℃의 냉장 조건에서 보관하였다.
실험예 1. 돼지 유행성 설사병 바이러스 항체의 검출 조건의 확립
제조예 3의 돼지 유행성 설사병 바이러스 항체 검출용 키트를 사용하여, 하기 표 2의 실험 조건 하에서, Indirect ELISA 검출법을 통해 돼지 유행성 설사병 바이러스를 검출하였다.
단 계 용법 및 용량
1 검체 반응 검체를 검체희석액으로 40배 희석 하여,
100㎕씩 분주하여 잘 혼합한 후, 37℃에서 60분 반응.
2 세척1 5회, 350㎕/well
3 접합체액 반응 최종농도가 2㎍/㎖인 접합체액을 각well에 100㎕씩 분주한 후37℃에서 30분
반응.
4 세척2 5회, 350㎕/well
5 기질액 반응 TMB기질액을 100㎕씩 각 well에 분주하고 실온(15~25℃)에서 15분간 반응
6 반응정지 1N 황산을 100㎕/well씩 기질액이 반응한 well에 분주.
7 측정파장 620nm를 reference로 하여 450nm에서 측정
이와 함께, 항원의 코팅 농도(1.5, 2.0, 2.5㎍/㎖), 검체의 희석 배수(20x. 40x, 80x), 검사 반응의 온도(RT, 37℃), 접합체액의 농도(1.0, 2.0, 4.0㎍/㎖), 검체 반응 시간(30분, 60분), 또는 접합체액 반응 시간(30분, 60분)에 따른 검출 수준을 비교하여, 해당 조건들을 최적화하였다.
그 결과, 도 9 및 도 14에 나타낸 바와 같이, 약 2.0㎍/㎖의 항원 코팅 농도, 약 40x의 검체 희석 배수, 약 37℃의 검사 반응의 온도, 약 2.0㎍/㎖의 접합체액의 농도, 4.0), 약 60분의 검체 반응 시간, 및 약 60분의 접합체액 반응 시간 조건에서 최적의 검출 효율을 나타냄을 확인하였다.
실험예 2. 유효성 검증
돼지 유행성 설사병에 대한 5종의 음성 혈청과 11종의 양성 혈청을 대상으로 일 실시예에 따른 돼지 유행성 설사병 바이러스 항체 검출법과 중화 시험법(기존의 중화 항체법)간 결과를 비교함으로써, 본 검출법의 유효성을 평가하였다.
표 3은 일 실시예에 따른 돼지 유행성 설사병 바이러스 항체 검출법과 중화 시험법의 판정 결과를 나타낸 것이다. 표 3에 나타낸 바와 같이, 일 실시예에 따른 돼지 유행성 설사병 바이러스 항체 검출법은 중화 시험법과 모두 동일한 결과를 보여 주었으며, 이를 통해 본 검출법의 유효성을 확인하였다.
중화 시험법
음성 양성 합계
PED IgG Indirect ELISA 음성 5 0 5
양성 0 11 11
합계 5 11 16
또한, Biovet사의 PED IgG Ab Indirect ELISA 키트를 사용하여 해당 검체를 추가로 판정하여, 그 결과를 비교하였다. 그 결과, 도 15에 나타낸 바와 같이, 일 실시예에 따른 돼지 유행성 설사병 바이러스 항체 검출법은 Biovet사의 PED IgG Ab Indirect ELISA 검출법에 비해 우수한 민감도를 나타냄을 확인하였다.
실험예 3. 판정 기준 값의 선정
일 실시예에 따른 돼지 유행성 설사병 바이러스 항체 검출법에서 음성과 양성 판정을 위한 판정 기준 값, 즉, 흡광도 수준을 구체적으로 확립하고자 하였다. 이를 위하여, 수득한 돼지 혈청을 대상으로 일 실시예에 따른 돼지 유행성 설사병 바이러스 항체 검출법을 실시하되, 판정 기준 값을 각각 흡광도 0.4, 0.5, 또는 0.6으로 설정하여 시험 결과를 판정하였다. 이후, 중화 시험법의 결과를 기준으로, 민감도, 특이도, 및 일치율을 확인하였다.
표 4는 판정 기준값의 변화에 따른 일 실시예에 따른 돼지 유행성 설사병 바이러스 항체 검출법과 중화 시험법의 검출 결과를 나타낸 것이다. 표 4에 나타낸 바와 같이, 흡광도 0.4로 설정하여 판정한 경우, 중화 시험법과 비교하여, 93.8%의 민감도, 84.2%의 특이도, 89.9%의 일치율을 나타내어, 가장 우수한 검출 효능을 보여주었다.
흡광도 중화시험법 양성
(176검체) 		중화시험법 음성
(120검체) 		민감도(%) 특이도(%) 일치율(%)
판정 일치한 양성검체 판정 일치한 음성검체
0.4 165 101 93.8% 84.2% 89.9%
0.5 146 115 82.9% 95.5% 88.0%
0.6 116 132 75.2% 96.7% 83.9%
실험예 4. 중화시험법 대비 검출 민감도 및 특이도 비교
국내의 돼지 농장으로부터 총 296개의 혈청 샘플을 확보하였고, 이에 대하여, 일 실시예에 따른 돼지 유행성 설사병 바이러스 항체 검출법과 중화 시험법을 통해 판정을 실시하였다. 중화 시험법은 8배 이상을 양성으로 판정하였고, PED IgG ELISA은 S/P ratio 0.4를 판정기준으로 하여, 0.4이상을 양성으로 판정하였다. 이후, 중화 시험법의 판정값을 기준으로 일 실시예에 따른 돼지 유행성 설사병 바이러스 항체 검출법의 민감도, 특이도, 및 일치율을 확인하였다.
표 5는 총 297개의 혈청샘플을 대상으로 일 실시예에 따른 돼지 유행성 설사병 바이러스 항체 검출법과 중화 시험법의 판정 결과를 나타낸 것이다. 표 5에 나타낸 바와 같이, 일 실시예에 따른 돼지 유행성 설사병 바이러스 항체 검출법은 93.8%의 민감도, 84.2%의 특이도, 89.9%의 일치율을 나타내었다.
혈청검체 중화시험법
양성 음성 합계
BIONOTE
PEDIgG
ELISA		 양성 165 19 184
음성 11 101 112
합계 176 120 296
아울러, 상기와 동일한 방법으로, 중화시험법의 판정결과를 기준으로 동일 목적의 시약인 BioVet사의 PED IgG ELISA의 민감도, 특이도, 및 일치율을 확인하였다.
표 6는 총 296개의 혈청샘플을 대상으로 BioVet사의 PED IgG ELISA 검출법과 중화 시험법의 판정 결과를 나타낸 것이다. 표 6에 나타낸 바와 같이, BioVet사의 PED IgG ELISA 검출법은 42.0%의 민감도, 90.8%의 특이도, 61.8%의 일치율을 나타내었다.
혈청검체 중화시험법
양성 음성 합계
BIOVet
PEDIgG
ELISA		 양성 74 11 85
음성 102 109 211
합계 176 120 296
이러한 실험 결과로부터, 일 실시예에 따른 돼지 유행성 설사병 바이러스 항체 검출법은 종래의 기술에 비해 우수한 검출 민감도, 및 특이도 등을 나타냄을 확인하였다.
실험예 5. 돼지 유행성 설사병 바이러스 항원을 이용한 키트와의 검출능 비교
일 실시예에 따른 돼지 유행성 설사병 바이러스 항체 검출법(indirect ELISA)과 비교예인 돼지 유행성 설사병 바이러스 항원이 플레이트의 표면에 직접 코팅된 키트를 사용한 검출법(indirect ELISA)간 검출 효능을 비교하였다.
표 7은 일 실시예에 따른 돼지 유행성 설사병 바이러스 항체 검출법과 비교예 검출법의 판정 결과를 나타낸 것이다. 표 7에 나타낸 바와 같이, 일 실시예에 따른 돼지 유행성 설사병 바이러스 항체 검출법은 비교예에 비해 높은 검출 민감도를 보여주었다.
플레이트 코팅방법 항원 Direct 코팅 본 발명 코팅 방법
　 　 O.D S/P ratio 판정 O.D S/P ratio 판정
음성 4-3 0.1830 0.1 - 0.1660 0.1 -
12-7 0.1170 0.0 - 0.1500 0.0 -
23-42 0.1030 0.0 - 0.1470 0.0 -
G13-2 0.0980 0.0 - 0.1600 0.1 -
G13-3 0.2340 0.1 - 0.1440 0.0 -
양성 31-42 0.6320 0.4 양성 0.9460 0.7 양성
87-27 0.7310 0.5 양성 1.0290 0.8 양성
58-04 0.9000 0.7 양성 1.3410 1.0 양성
82-67 1.3050 1.0 양성 1.7770 1.4 양성
O1 0.2140 0.1 - 0.6770 0.5 양성
O2 0.2390 0.1 - 0.6060 0.4 양성
O3 0.3140 0.2 - 0.9500 0.7 양성
10 0.6920 0.5 양성 1.4500 1.1 양성
Q2 0.3070 0.2 - 0.5790 0.4 -
Q3 0.5590 0.4 - 1.0020 0.8 양성
이러한 실험 결과는, 일 실시예에 따른 검출법은 항원이 직접 코팅된 키트를 이용하는 검출법에 비해, 항원-항체간 특이적 결합, 구체적으로, 항원의 에피토프와의 특이적 결합에 따라, 외부 표면으로 노출되는 항원의 부위가 균일하게 정렬되고, 표면상에 존재하는 불순물이 추가적으로 제거되어 노출되는 항원의 순도가 증가되는 효과에 기인하여, 높은 검출 민감도를 나타냄을 보여주는 것이다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.
<110> BIONOTE, INC. REPUBLIC OF KOREA(Animal and Plant Quarantine Agency) <120> Antibody binding to Porcine Epidemic Diarrhea virus and use thereof <130> PN130917KR <160> 8 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LCDR1 <400> 1 Ser Ala Ser Ser Ser Val Asn Tyr Met Tyr 1 5 10 <210> 2 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LCDR2 <400> 2 Leu Thr Ser Asn Leu Ala Ser 1 5 <210> 3 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LCDR3 <400> 3 Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr Phe 1 5 10 <210> 4 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HCDR1 <400> 4 Gly Phe Ser Leu Thr Ser Tyr Gly Val His 1 5 10 <210> 5 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HCDR2 <400> 5 Met Ile Trp Ser Gly Gly Ser Thr Asp Tyr Asn 1 5 10 <210> 6 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HCDR3 <400> 6 Asn Ser Asp Gly Val Arg Gly Ile Ile Tyr Tyr Ala Leu Asp Tyr 1 5 10 15 <210> 7 <211> 115 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> light chain variable region <400> 7 Asp Ile Val Ile Thr Gln Ser Pro Ala Leu Met Ser Ala Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Asn Tyr Met 20 25 30 Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Arg Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr 35 40 45 Leu Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu 65 70 75 80 Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr 85 90 95 Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro 100 105 110 Thr Val Ser 115 <210> 8 <211> 123 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> heavy chain variable region <400> 8 Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Gln Pro Ser Gln 1 5 10 15 Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Ser Tyr 20 25 30 Gly Val His Trp Val Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu 35 40 45 Gly Met Ile Trp Ser Gly Gly Ser Thr Asp Tyr Asn Ala Ala Phe Ile 50 55 60 Ser Arg Leu Ser Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Phe 65 70 75 80 Glu Met Asn Ser Leu Gln Ala Asn Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Asn Ser Asp Gly Val Arg Gly Ile Ile Tyr Tyr Ala Leu Asp Tyr 100 105 110 Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 115 120

Claims (10)

  1. 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어지는 LCDR1(Light chain complementarity determining region1: LCDR1), 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 상보성 결정 영역2(LCDR2), 및 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 상보성 결정 영역3(LCDR3)을 포함하는 경쇄 가변 영역; 서열번호 4의 중쇄 상보성 결정 영역1(Heavy chain complementarity determining region1: HCDR1), 서열번호 5의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 상보성 결정 영역2(HCDR2), 및 서열번호 6의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 상보성 결정 영역3(HCDR3)을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는, 돼지 유행성 설사병 바이러스와 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  2. 청구항 1에 있어서, 서열번호 7의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 가변 영역; 및 서열번호 8의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 가변영역을 포함하는 것인, 돼지 유행성 설사병 바이러스와 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  3. 청구항 1에 있어서, 상기 항체는 단일클론 항체인 것인, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  4. 청구항 1에 있어서, 상기 항체는 돼지 유행성 설사병 바이러스의 스파이크 1 단백질와 특이적으로 결합하는 것인, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  5. 플레이트;
    상기 플레이트의 표면에 코팅된 돼지 유행성 설사병 바이러스와 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편; 및
    상기 돼지 유행성 설사병 바이러스와 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 결합되어, 외부로 노출되어 있는 돼지 유행성 설사병 바이러스의 스파이크 1 단백질을 포함하는, 돼지 유행성 설사병 바이러스에 대한 항체 검출용 키트.
  6. 청구항 5에 있어서, 상기 항체는 돼지 유행성 설사병 바이러스의 스파이크 1 단백질에 특이적으로 결합하는 것인, 돼지 유행성 설사병 바이러스에 대한 항체 검출용 키트.
  7. 청구항 5에 있어서, 상기 키트는 ELISA 검출법에 사용되는 것인, 돼지 유행성 설사병 바이러스에 대한 항체 검출용 키트.
  8. 청구항 5의 키트 상에 생물학적 시료를 첨가하는 단계; 및
    상기 키트에서 형성된 항원-항체 복합체의 형성을 확인하는 단계를 포함하는, 돼지 유행성 설사병 바이러스에 대한 항체를 검출하는 방법.
  9. 청구항 8에 있어서, 상기 생물학적 시료는 돼지로부터 분리한 조직, 세포, 전혈, 혈청, 및 혈장 중 어느 하나인 것인, 돼지 유행성 설사병 바이러스에 대한 항체를 검출하는 방법.
  10. 청구항 8에 있어서, 상기 항원-항체 복합체의 형성을 확인하는 단계는 ELISA 검출법을 통해 실시되는 것인, 돼지 유행성 설사병 바이러스에 대한 항체를 검출하는 방법.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN111686246A (zh) * 2020-05-29 2020-09-22 安徽省农业科学院畜牧兽医研究所 一种用于猪流行性腹泻病毒的抗原抗体复合物疫苗及其制备方法
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