KR101263913B1

KR101263913B1 - 우결핵 진단 키트 및 이를 이용한 우결핵 진단 방법

Info

Publication number: KR101263913B1
Application number: KR1020100112506A
Authority: KR
Inventors: 조영식; 하건우; 오진식; 강동석; 오연경; 박정애; 한선호; 구복경; 정석찬; 허문; 정갑수; 황인영; 조윤상
Original assignee: 대한민국(관리부서 : 농림축산식품부 농림축산검역본부); 유한회사 바이오노트
Priority date: 2010-11-12
Filing date: 2010-11-12
Publication date: 2013-05-14
Also published as: KR20120051196A

Abstract

소의 인터페론 감마에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체 및 폴리클론항체를 포함하는 우결핵 진단 키트 및 이를 이용한 우결핵 진단 방법에 관한 것이다. 일 구체예에 따른 소의 인터페론 감마에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체, 폴리클론 항체를 포함하는 우결핵 진단 키트 및 이를 이용한 우결핵 진단 방법에 따르면, 소과 동물의 우결핵 발병 여부를 효율적으로 측정할 수 있다.

Description

우결핵 진단 키트 및 이를 이용한 우결핵 진단 방법{Bovine tuberculosis diagnosing kit and diagnosing method using the same}

소의 인터페론 감마에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체를 포함하는 우결핵 진단 키트 및 이를 이용한 우결핵 진단 방법에 관한 것이다.

결핵은 사람과 동물에 공중 보건적 및 경제적으로 심각한 피해를 일으키고 있는 질병이다. 마이코박테리움 튜버클로시스, 마이코박테리움 보비스, 마이코박테리움 마이크로티 및 마이코박테리움 카네티를 포함하는 마이코박테리움 튜버클로시스군은 결핵을 일으키는 주요한 마이코박테리움 속균이며, 소에서는 특히, 마이코박테리움 보비스가 직접적인 결핵 원인균이다. 우결핵은 제2종 법정 가축 전염병으로 분류되는 질병으로, 잠복 기간이 길고, 증상이 뚜렷하지 않아 발견하기 어려우나, 인수 공통 전염병이므로 반드시 진단이 필요한 질병이다. 우결핵은 마이코박테리움 보비스에 의해 일어나는 질병으로 소와 다른 가축 그리고 야생동물에서 전 세계적으로 발생되고 있는 주요 질병이다. 마이코박테리움 보비스의 종간 또는 종내 전파는 주로 공기를 통한 전염이지만, 많은 수의 세균을 섭취하였을 때에도 감염될 수 있다. 우결핵은 원칙적으로 호흡기 질병으로서, 폐 및 그와 관련된 림프절을 감염시킨다. 임상적으로 나타났을 때에도 임상 소견은 특별하게 구별되지 않지만, 허약, 식욕부진, 수척, 림프절 종대가 있고, 우결핵이 진행됨에 따라 기침이 나온다. 주요 병변은 감염동물의 체강(body cavity)이나 기관들에서 감염 말기에 발견되는 것으로 알려져 있다.

사람 결핵에서와 같이 우결핵은 지연형 과민 반응에 의한 진단, 즉, 결핵 유래 단백질체의 피내 접종 후 종창 및 경결을 관찰하여 진단하는 방법이 일반적으로 사용되고 있다. 그러나, 이러한 진단법은 피내 접종을 해야한다는 환축의 부담과 3일 후에 관찰이 가능하다는 불편함이 있어 새로운 진단법에 대한 연구가 계속되어져 왔다. 우결핵의 야외 공인 진단법으로 사용되고 있는 피내 진단법은 우결핵 항원에 대한 면역 반응 중 식세포 및 T 세포 등이 관여하는 세포성 면역 반응 정도를 측정하는 것이다. 이러한 세포성 면역 반응은 우결핵 병변이 진행됨에 따라 증가하다가, 우결핵 말기에서는 감소하는 일반적인 경향을 보인다. 한편, 우결핵 항원에 대한 항체 반응은 우결핵 초기에는 반응을 나타내지 않다가, 우결핵 병변이 진행됨에 따라 서서히 증가하는 경향을 보이고 있다 (도 1). 따라서, 세포성 면역반응이 감소하는 시기에 우결핵 항원에 특이적으로 반응하는 항체를 측정하는 것은 세포성 면역 반응을 이용한 피내 진단법에서 나타날 수 있는 우결핵 감염 후 기개체의 음성 진단결과를 우결핵 특이항체 검출에 의해 양성으로 진단할 수 있어서 체액성 면역 반응을 이용한 우결핵 특이 항체 진단법은 세포성 면역 반응을 이용한 피내 진단법과 상호 보완적인 진단법으로 유용하다.

상기와 같이 우결핵은 체액성 면역 시기와 세포성 면역 시기의 진단 결과가 차이가 크게 날 수 있기 때문에 일반적인 항체 진단 키트로의 진단으로는 부족함이 있다. 따라서 개선책으로 민감도와 특이도가 뛰어난 인터페론 감마를 이용한 진단법이 각광받고 있다.

소의 인터페론 감마에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체, 이를 포함하는 우결핵 진단 키트 및 이를 이용한 우결핵 진단 방법을 제공하는 것이다.

일 양상은 소(bovine) 인터페론 감마의 수용체 결합 영역에서 서열번호 8의 아미노산 서열로 표시되는 에피토프에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체를 제공한다.

일 구체예에 따르면, 상기 단일클론 항체는 수탁번호가 KCTC 11794BP인 하이브리도마 세포에서 생산되는 것일 수 있다.

용어, "인터페론(interferon)"은 척추동물의 면역 세포에서 만들어지는 자연 단백질로서, 바이러스, 박테리아, 기생충, 종양 등 외부의 침입자들에 대응하는 당단백질 종류로, 본 명세서에서 용어, "소 인터페론 감마(bovine intereron-gamma)"는 소과 동물에서 유래하는 상기 인터페론의 종류 중 하나를 의미한다.

용어, "특이적으로 결합(specifically binding)" 또는 "특이적으로 인식(specifically recognizing)"은 당업자에게 통상적으로 공지되어 있는 의미와 동일한 것으로서, 항원 및 항체가 특이적으로 상호작용하여 면역학적 반응을 하는 것을 의미한다.

완전한 항체는 2개의 전장(full length) 경쇄 및 2개의 전장 중쇄를 가지는 구조이며 각각의 경쇄는 중쇄와 이황화 결합(disulfide bond, SS-bond) 항체의 불변 영역은 중쇄 불변 영역과 경쇄 불변 영역으로 나뉘어지며, 중쇄 불변 영역은 감마(γ), 뮤(μ), 알파(α), 델타(δ) 및 엡실론(ε) 타입을 가지고, 서브클래스로 감마1(γ1), 감마2(γ2), 감마3(γ3), 감마4(γ4), 알파1(α1) 및 알파2(α2)를 가진다. 경쇄의 불변 영역은 카파(κ) 및 람다(λ) 타입을 가진다.

용어, "단일클론 항체(monoclonal antibody)"는 상기 항체 분자가 단일 분자로 구성되도록 제조된 것을 의미한다. 단일클론 항체는 동일한 에피토프를 갖는 항원에 대해서만 반응하는 특이성을 가지며, 또한 특정 에피토프에 대해서만 친화성을 나타낸다.

상기 하이브리도마 세포는 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제조할 수 있다. 구체적으로, 상기 하이브리도마 세포는 면역원인 소 인터페론 감마를 동물에 면역시키고, 상기 피면역 동물로부터 유래된 항체 생산세포인 B 세포를 골수종세포와 융합시켜서 하이브리도마를 제조한 다음, 그 중에서 소 인터페론 감마에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체를 생산하는 하이브리도마를 선택하는 방법으로 제조할 수 있다. 상기 피면역 동물은 실시예에서 사용된 마우스뿐만 아니라 염소, 양, 모르모트, 래트 또는 토끼와 같은 동물을 사용할 수 있다.

상기 피면역 동물을 면역시키는 방법으로서는 당업계에 이미 공지된 방법을 사용할 수 있다. 예를 들어, 마우스를 면역시키는 경우 1회에 1-100 ㎍의 면역원을 동량의 생리 식염수 및/또는 프로인드 어주번트(Freund's adjuvant) 등의 항원 보조제로 유화시켜, 상기 피면역원 동물의 복부의 피하 또는 복강 내에 2-5주마다 2-6회 접종시키는 방법으로 수행될 수 있다. 피면역 동물을 면역시킨 후에는 최종 면역 3-5일 후 비장 또는 림프절을 적출하여 당업계에서 이미 공지되어 있는 세포 융합법에 따라서, 융합 촉진제의 존재 하에 이들의 조직에 포함되어 있는 B 세포를 골수종세포와 융합시키게 된다. 상기 융합 촉진제는 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜(PEG)과 같은 물질을 사용할 수 있다. 상기 골수종세포는 예를 들어, P3U1, NS-1, P3x63. Ag 8.653, Sp2/0-Ag14와 같은 마우스 유래 세포, AG1, AG2와 같은 래트 유래 세포를 사용할 수 있으나, 이에 한정하지 않는다. 또한 상기 당업계에 공지된 세포 융합법은 예를 들어, B 세포와 골수종세포를 1:1-10:1의 비율로 혼합시켜, 이에 분자량 1,000-6,000의 PEG를 10-80%의 농도로 첨가하여, 30-37℃에서 1-10분 동안 배양하는 방법으로 수행될 수 있다. 또한, 상기 소 인터페론 감마에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체를 생산하는 하이브리도마는 예를 들어, 하이브리도마만이 생존 가능한 HAT 배지 등의 선택 배지에서 배양하고, 하이브리도마 배양 상층액 중의 항체 활성을 ELISA 등의 방법을 이용하여 측정하여 선택할 수 있다. 최종적으로, 소 인터페론 감마에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체를 생산하는 하이브리도마는 예를 들어, 소 인터페론 감마에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체를 생산하는 하이브리도마에 대하여, 한계 희석 등의 방법에 의해 클로닝을 반복함으로써 선별될 수 있다. 한편, 상기 단일클론 항체는 IgG₁, IgG₂, IgG₃, IgG₄, IgM, IgE, IgA1, IgA₅, 또는 IgD 타입일 수 있다.

다른 양상은 상기 단일클론 항체의 항원 결합 단편을 제공한다.

용어 “항체(antibody)”는 소 인터페론 감마에 대한 특이 항체로서, 소 인터페론 감마에 대해 특이적으로 결합하며, 완전한 항체 형태뿐만 아니라 항체 분자의 항원 결합 단편을 포함한다. 완전한 항체에 대한 설명은 상기 언급한 바와 같다.

용어, "항원 결합 단편(antigen binding fragment)"은 면역글로불린 전체 구조에 대한 그의 단편으로, 항원이 결합할 수 있는 부분을 포함하는 폴리펩티드의 일부를 의미한다. 예를 들어, F(ab')₂, Fab', Fab, Fv 또는 scFv일 수 있으나, 이에 한정하지 않는다. 상기 항원 결합 단편 중 Fab는 경쇄 및 중쇄의 가변영역과 경쇄의 불변 영역 및 중쇄의 첫 번째 불변 영역(C_H1)을 가지는 구조로 1개의 항원 결합 부위를 가진다. Fab'는 중쇄 C_H1 도메인의 C-말단에 하나 이상의 시스테인 잔기를 포함하는 힌지 영역(hinge region)을 가진다는 점에서 Fab와 차이가 있다. F(ab')₂ 항체는 Fab'의 힌지 영역의 시스테인 잔기가 디설파이드 결합을 이루면서 생성된다. Fv는 중쇄 가변부위 및 경쇄 가변부위만을 가지고 있는 최소의 항체조각으로 Fv 단편을 생성하는 재조합 기술은 당업계에 널리 공지되어 있다. 이중쇄 Fv(two-chain Fv)는 비공유 결합으로 중쇄 가변부위와 경쇄 가변부위가 연결되어 있고 단쇄 Fv(single-chain Fv)는 일반적으로 펩타이드 링커를 통하여 중쇄의 가변 영역과 단쇄의 가변 영역이 공유 결합으로 연결되거나 또는 C-말단에서 바로 연결되어 있어서 이중쇄 Fv와 같이 다이머와 같은 구조를 이룰 수 있다. 상기 항원 결합 단편은 단백질 가수분해 효소를 이용해서 얻을 수 있고(예를 들어, 전체 항체를 파파인으로 제한 절단하면 Fab를 얻을 수 있고 펩신으로 절단하면 F(ab')₂단편을 얻을 수 있다), 유전자 재조합 기술을 통하여 제작할 수 있다.

상기 항체는 단일클론 항체, 이특이적 항체, 비-인간 항체, 인간 항체, 인간화 항체, 키메릭 항체, 단쇄 Fv(scFv), 단쇄 항체, Fab 단편, F(ab')단편, 다이설파이드-결합 Fv(sdFv) 및 항-이디오타입(항-Id) 항체, 그리고 상기 항체들의 에피토프-결합 단편을 포함하나 이에 한정되는 것은 아니다.

또 다른 양상은 소 인터페론 감마의 수용체 결합 영역에서 서열번호 8의 아미노산 서열로 표시되는 에피토프에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체를 생산하는 하이브리도마 세포(수탁번호: KCTC 11794BP)를 제공한다.

상기 하이브리도마 세포의 제조 방법은 상기한 바와 같다. 또한, 하기 실시예에 따라 제조된 상기 하이브리도마 세포는 2010년 10월 22일자로 부다페스트 조약 하의 국제 기탁기관인 생명공학연구소 생물자원센터 (Korean Collection for Type Cultures)에 기탁하였다(수탁번호: KCTC 11794BP). 한편, 기탁된 하이브라도마 세포는 미생물 기탁에 대한 부다페스트 조약의 규정에 따라 보관되고 상기 수탁 번호를 참조하여 일반인들에게 분양이 가능하다.

다른 양상은 상기 단일클론 항체 또는 항원 결합 단편 및 항-소 인터페론 감마 폴리클론 항체를 포함하는 우결핵 진단용 키트를 제공한다.

상기 키트는 소 인터페론 감마를 면역분석 방법에 따라 검출하여 우결핵을 진단하는 데 이용될 수 있다.

이러한 면역분석은 종래에 개발된 다양한 면역분석(immunoassay) 또는 면역염색(immunostaining) 프로토콜에 따라 실시될 수 있다. 상기 면역분석 또는 면역염색 포맷은 방사능면역분석, 방사능면역침전, 면역침전, ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay), 캡처-ELISA, 억제 또는 경쟁 분석, 샌드위치 분석, 유세포 분석(flow cytometry), 면역형광염색 및 면역친화성 정제를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 예를 들어, 본 발명의 방법이 방사능면역분석 방법에 따라 실시되는 경우, 방사능동위원소(예를 들어, C¹⁴, I¹²⁵, P³²및 S³⁵)로 레이블링된 항체가 소 인터페론 감마를 검출하는 데 이용될 수 있다.

본 발명의 방법이 ELISA 방식으로 실시되는 경우, 본 발명의 특정 실시예는 (i) 분석하고자 하는 미지의 세포 시료 분해물을 고체 기질의 표면에 코팅하는 단계; (ⅱ) 일차항체로서의 소 인터페론 감마와 상기 세포 분해물을 반응시키는 단계; (ⅲ) 상기 단계 (ⅱ)의 결과물을 효소가 결합된 이차항체와 반응시키는 단계; 및 (ⅳ) 상기 효소의 활성을 측정하는 단계를 포함할 수 있다.

상기 고체 기질로 적합한 것은 탄화수소 폴리머(예를 들어, 폴리스티렌 및 폴리프로필렌), 유리, 금속 또는 젤이며, 마이크로타이터 플레이트일 수 있다.

상기 이차항체에 결합된 효소는 발색반응, 형광반응, 발광반응 또는 적외선 반응을 촉매하는 효소를 포함하나, 이에 한정되지 않으며, 예를 들어, 알칼린 포스파타아제, β-갈락토시다아제, 호스 래디쉬 퍼옥시다아제, 루시퍼라아제 및 사이토크롬 P₄₅₀을 포함한다. 상기 이차항체에 결합하는 효소로서 알칼린 포스파타아제가 이용되는 경우에는, 기질로서 브로모클로로인돌일 포스페이트(BCIP), 니트로 블루 테트라졸리움(NBT)나프톨-AS-B1-포스페이트(naphthol-AS-B1-phosphate) 및 ECF(enhanced chemifluorescence)와 같은 발색반응 기질이 이용되고, 호스 래디쉬 퍼옥시다아제가 이용되는 경우에는 클로로나프톨, 아미노에틸카바졸, 디아미노벤지딘, D-루시페린, 루시게닌(비스-N-메틸아크리디늄 니트레이트), 레소루핀 벤질 에테르, 루미놀, 암플렉스 레드 시약(10-아세틸-3,7-디하이드록시페녹사진), HYR(p-phenylenediamine-HCl and pyrocatechol), TMB(tetramethylbenzidine), ABTS(2,2‘-Azine-di[3-ethylbenzthiazoline sulfonate]), o-페닐렌디아민(OPD) 및 나프톨/파이로닌, 글루코스 옥시다아제와 t-NBT(nitroblue tetrazolium) 및 m-PMS(phenzaine methosulfate)과 같은 기질이 이용될 수 있다.

본 발명의 방법이 캡처-ELISA 방식으로 실시되는 경우, 본 발명의 특정 실시예는 (i) 포획항체(capturing antibody)로서 항-소 인터페론 감마 항체를 고체 기질의 표면에 코팅하는 단계; (ⅱ) 포획 항체와 시료를 반응시키는 단계; (ⅲ) 상기 단계 (ⅱ)의 결과물을 시그널을 발생시키는 레이블이 결합되어 있고, 소 인터페론 감마에 특이적으로 반응하는 검출항체(즉, 본 발명의 단일클론 항체 또는 항원 결합 단편)와 반응시키는 단계; 및 (ⅳ) 상기 레이블로부터 발생하는 시그널을 측정하는 단계를 포함할 수 있다.

상기 검출 항체는 검출 가능한 시그널을 발생시키는 레이블을 가지고 있다. 상기 레이블은 화학물질(예를 들어, 바이오틴), 효소(알칼린 포스파타아제, β-갈락토시다아제, 호스 래디쉬 퍼옥시다아제 및 사이토크롬 P₄₅₀), 방사능물질((예를 들어, C¹⁴, I¹²⁵, P³²및 S³⁵), 형광물질(예를 들어, 플루오레신), 발광물질, 화학발광물질(chemiluminescent) 및 FRET(fluorescence resonance energy transfer)을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 ELISA 방법 및 캡처-ELISA 방법에서 최종적인 효소의 활성 측정 또는 시그널의 측정은 당업계에 공지된 다양한 방법에 따라 실시될 수 있다. 이러한 시그널이 검출은 소 인터페론 감마의 정성적 또는 정량적 분석을 가능하게 한다. 만일, 레이블로서 바이오틴이 이용된 경우에는 스트렙타비딘으로, 루시퍼라아제가 이용된 경우에는 루시페린으로 시그널을 용이하게 검출할 수 있다.

본 발명에서 이용되는 항-소 인터페론 감마 항체는 폴리클론 항체일 수 있다. 상기 폴리클론 항체는 소 인터페론 감마를 리간드로 사용한 친화성 크로마토그래피에 의해 얻어진 것일 수 있다.

예를 들어, 폴리클론 항체는 소 인터페론 감마 항원을 적합한 동물에게 주사하고, 이 동물로부터 항혈청을 수집한 다음, 공지의 친화성(affinity) 기술을 이용하여 항혈청으로부터 항체를 분리하여 얻을 수 있다. 상기 적합한 동물은 토끼 또는 마우스일 수 있으나, 이에 한정하지는 않는다.

상술한 면역분석 과정에 의한 최종적인 시그널의 세기를 분석함으로써, 우결핵 원인균의 감염 여부를 판단할 수 있다. 이에 대한 자세한 설명은 실시예 4에 기재되어 있다.

또 다른 양상은 생물학적 시료를 우결핵 원인균 유래의 우결핵 증상 유발 항원 및 조류결핵 원인균 유래의 조류결핵 증상 유발 항원과 혼합하여 배양하는 단계; 상기 단일클론 항체 또는 항원 결합 단편과 상기 배양된 혼합액을 접촉시키는 단계; 상기 항원과 상기 키트 내의 단일클론 항체, 항-소 인터페론 감마 폴리클론 항체 또는 항원 결합 단편의 반응 정도를 측정하는 단계; 및 상기 측정 결과로부터 상기 생물학적 시료의 우결핵 원인균 감염 여부를 검출하는 단계를 포함하는 우결핵 진단 방법을 제공한다.

일 구체예에 따르면, 상기 접촉시키는 단계는, 상기 배양된 혼합액을 상기 항-소 인터페론 감마 폴리클론 항체가 코팅된 플레이트에 접촉시킨 이후, 상기 단일클론 항체 또는 항원 결합 단편을 추가로 상기 플레이트에 접촉시키는 단계를 포함하는 것일 수 있다.

상기 우결핵 진단 방법에 있어서, 감마 인터페론의 검사는 동물이 생체 내에서 외인성 혹은 내인성 항원에 의하여 자극받았을 때, 자극한 항원에 대한 면역학적 기억을 할 수 있는 혈액 중의 임파구를 가진다는 사실을 이용하는 것이다. 자극을 받은 동물로부터 채취한 혈액에 시험관 내에서 항원을 첨가하면 항원 특이적 기억세포가 빠르게 재자극(restimulation)이 되고, 이후 감마 인터페론을 분비되게 되며, 상기 인터페론을 항원에 의해 유도된 세포성 면역 반응의 특이 마커로 이용할 수 있다. 이에 대한 개략적인 모식도를 도 1에 나타내었다. 일 구체예에 따른 상기 우결핵 진단 방법은 샌드위치 효소면역 측정법을 이용하는 것이 가장 바람직하다.

일 구체예에 따르면, 상기 우결핵 원인균 유래의 우결핵 증상 유발 항원은 M. bovis의 정제 항원 복합물(purified protein derivative, PPD)이고, 조류결핵 원인균 유래의 조류결핵 증상 유발 항원은 M. avium의 정제 항원 복합물일 수 있다. 가장 바람직하게는, 상기 우결핵 원인균 유래의 우결핵 증상 유발 항원은 우결핵 원인균 유래 합성 펩티드 항원은 M. bovis strain AN5의 정제 항원 복합물을, 조류결핵 원인균 유래의 조류결핵 증상 유발 항원은 M. avium D4의 정제 항원 복합물을 사용할 수 있다.

일 구체예에 따르면, 상기 생물학적 시료는 소의 혈액, 세포 배양 상층액 및 림프액으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으나, 이에 한정하지는 않는다. 우결핵 진단 방법은 상기 우결핵 진단 키트를 이용하므로, 이 둘 사이에 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 그 기재를 생략한다.

일 구체예에 따른 소의 인터페론 감마에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체 및 폴리클론 항체를 포함하는 우결핵 진단 키트 및 이를 이용한 우결핵 진단 방법에 따르면, 소과 동물의 우결핵 발병 여부를 효율적으로 측정할 수 있다.

도 1은 우결핵 감염시 나타나는 면역 반응의 모식도이다.
도 2는 소의 전혈의 말초혈액 단핵세포에서 얻은 전체 RNA로부터 cDNA를 합성하고, 이를 주형으로 하여 얻은 소의 인터페론 감마 유전자를 포함하는 PCR 증폭 산물을 나타낸다.
도 3은 일 구체예에 따른 소의 인터페론 감마에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체를 제작하기 위한 항원을 얻기 위해 제조한 소 인터페론 감마 과발현 벡터의 지도를 나타낸다.
도 4는 대장균 숙주 세포에서 과발현시켜 소 인터페론 감마 항원을 정제한 결과이다. M은 단백질 사이즈 마커(Precision Plus Protein standards(Bio-RAD, Cat. No. 161-0373)를 나타낸다.
도 5는 일 구체예에 따른 시판중인 소 인터페론 감마에 대한 단일클론 항체(AbD Sertec, MCA2112)에 특이적으로 결합하는 소 인터페론 감마 내의 에피토프를 확인한 결과로서, (A)는 SDS-PAGE 후 CBB 염색을 한 결과이고, (B)는 소 인터페론 감마의 폴리펩티드 단편들에 대한 웨스턴 블롯 결과이다
도 6은 일 구체예에 따른 소 인터페론 감마에 대한 단일클론 항체에 특이적으로 결합하는 소 인터페론 감마 내의 에피토프를 확인한 결과로서, (A)는 SDS-PAGE 후 CBB 염색을 한 결과이고, (B)는 소 인터페론 감마의 폴리펩티드 단편들에 대한 웨스턴 블롯 결과이다.
도 7은 일 구체예에 따른 우결핵 진단 방법의 전혈 배양 단계에서 24-웰 세포 배양 플레이트에 시료를 첨가하는 일 구체예를 나타낸다. 대조는 PPD를 넣지 않은 PBS를 첨가한 웰이고, PPD-A는 Mycobacterium avium 유래의 PPD 감작 항원을 첨가한 웰이며, PPD-B는 Mycobacterium bovis 유래의 PPD 감작 항원을 첨가한 웰을 나타낸다.

이하 하나 이상의 구체예를 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 하나 이상의 구체예를 예시적으로 설명하기 위한 것으로 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 유전자 재조합 소(bovine) 인터페론 감마의 제조

(1) 주형 DNA의 추출

국립 수의과학 검역원으로부터 우결핵 양성 전혈을 입수하여 전혈을 동량의 Ficoll-Hysto-paque (Sigma Diagnostics, Inc., MO, USA)에 로딩하고 30분 동안 400×g로 원심 분리하여 중간층의 말초혈액 단핵세포(peripheral blood mononuclear cell)들을 분리한 다음, 이로부터 전체 RNA를 추출하였으며, 하기 프라이머 세트를 이용하여 RT-PCR을 통해 cDNA를 합성하였다.

정방향 프라이머: 5'-GGATCCCAGGGCCAATTTTTTAGA-3'(서열번호 9)

역방향 프라이머: 5'-GTCGACTTACGTTGATGCTCTCCG-3'(서열번호 10)

(2) 발현 벡터 제조 및 항원 제조

상기 합성된 cDNA를 주형으로 하고, 상기 동일한 프라이머 세트를 이용하여 소 감마인터페론 유전자를 포함하는 DNA 단편(서열번호 11)을 증폭하였으며(도 2), 상기 DNA 단편을 제한효소 BamHⅠ과 SalⅠ으로 절단한 다음, 동일한 제한효소로 절단한 발현 벡터인 pGEX-4T-1에 삽입한 후, E. coli BL21에 형질전환 하였다 (도 3). 상기 형질전환된 숙주 세포 콜로니를 50 ㎍/㎖의 암피실린을 첨가한 LB 배지에서 배양하고(37℃, 200 rpm), 1 mM의 IPTG를 첨가하여 단백질 과발현을 유도시킨 다음, GST 컬럼을 사용하여 정제하였다, 도 4에서 나타난 바와 같이, 레인 9 내지 14에서 정제된 단백질을 확인할 수 있었다.

실시예 2: 소(bovine) 인터페론 감마에 대한 단일클론 항체를 생산하는 하이브리도마의 제작 및 단일클론 항체 mAb anti-bovine IFN-r 3D6의 생산

(1) 마우스의 면역화

하이브리도마 세포주의 개발에 필요한 면역화된 마우스를 얻기 위하여, 2 마리의 쥐에 한 마리당 400 ㎍의 유전자 재조합 소 인터페론 감마와 동량의 완전 프로인드 어주번트(complete Freund's adjuvant)를 혼합하여 자성의 6주령 Balb/c 마우스(Orient-bio, Seongnam)의 복강 내에 주사하였다. 1주 후에 상기와 동일한 방법으로 항원(먼저 주사한 양의 절반)을 불완전 프로인드 어주번트(incomplete Freund's adjuvant)와 혼합하여 마우스의 복강 내에 주사하였다. 일주일 후, 3차 면역하였으며, 1주일 후 마지막 면역을 하였다. 마지막 부스팅(boosting)이 수행되고 3일 후에 상기 마우스의 꼬리에서 채혈하여 혈청을 얻은 뒤 1/1000로 PBS에 희석하여 ELISA로 소 인터페론 감마를 인지하는 항체의 역가가 증가됨을 확인하였다. 상기의 결과로 항체의 양이 충분하게 얻어지는 마우스를 선별하여 세포융합과정을 수행하였다.

(2) 세포 융합 및 하이브리도마의 제조

세포융합 실험 3일 전에 200 ㎍의 소 인터페론 감마를 인산 완충용액(PBS)에 녹여 꼬리정맥에 1일 간격 3회에 걸쳐 주사하고, 면역화된 마우스를 마취한 후 몸통의 좌측에 위치한 비장(spleen)을 적출하였다. 적출한 비장을 메쉬로 갈아서 세포를 분리하고, 배양배지 DMEM과 혼합하여 비장세포 현탁액을 만들었다. 이후, 상기 현탁액을 원심분리하여 세포층을 회수하였다. 상기 얻어진 비장세포 1개와 골수종세포(SP2/0) 5개를 혼합한 다음 원심분리하여 세포를 침전시켰다. 원심분리된 침전물을 천천히 분산시킨 다음, 폴리에틸렌 글리콜 1500(PEG 1500, Roche) 1 ㎖을 처리하고, 37 ℃에서 1분 동안 유지시킨 후, DMEM 1 ㎖을 첨가하였다. 이후 DMEM 10 ㎖을 1분 동안 첨가하고, 37℃의 물에서 5분 동안 방치한 후 50 ㎖로 맞추어 다시 원심분리하였다. 세포 침전물을 분리배지(HAT 배지)에 1~2×10⁵/㎖ 정도로 재현탁시키고, 96-웰(well) 플레이트에 0.1 ㎖씩 분주한 후 37 ℃ 이산화탄소 배양기에서 배양하였다.

(3) 소 인터페론 감마에 대한 단일클론 항체를 생산하는 하이브리도마 세포의 선별

상기 (2)에서 제조된 하이브리도마 세포군 중에서 소 인터페론 감마에만 특이적으로 반응하는 하이브리도마 세포를 선별하기 위하여 ELISA 분석 방법을 사용하였다.

마이크로타이터 플레이트에 소 인터페론 감마를 한 웰당 각각 50 ㎕ (2 ㎍/㎖)씩 가하여 플레이트 표면에 부착시키고, 반응하지 않은 항원은 세척하여 제거하였다. 하이브리도마 세포의 배양액을 각각 웰에 50 ㎕씩을 가하여 1 시간 동안 반응시킨 후 인산 완충용액-트윈 20(PBS-T) 용액으로 충분히 세척하여 반응하지 않은 배양액을 제거하였다. 여기에 염소 항-마우스 IgG-호스래디쉬 퍼옥시다제(goat anti-mouse IgG-HRP)를 가하여 1 시간 동안 실온에서 반응시킨 다음, PBS-T 용액으로 충분히 세척하였다. 이어서 퍼옥시다제의 기질용액(TMB)을 가하여 반응시키고, 그 반응정도는 엘리자 해독기(ELISA Reader)로 450 nm에서 흡광도를 측정하여 소 인터페론 감마에만 특이적으로 높은 결합력을 갖는 항체를 분비하는 하이브리도마 세포주들을 반복하여 선별하였다. 반복 선별을 통해 얻은 하이브리도마 세포주를 제한 희석(limiting dilution)하여 단일클론 항체를 생성하는 하이브리도마 세포주 1개의 클론을 최종적으로 얻었다. 최종 선별된 단일클론 항체 생산 하이브리도마를 mAb anti-bovine IFN-r 3D6으로 명명하고, 이를 생명공학연구소 유전자 은행에 기탁하여 수탁번호 KCTC 11794BP를 부여받았다.

(4) 단일클론 항체의 생산 및 정제

상기 (3)에서 얻은 하이브리도마 세포를 혈청 배지에서 배양하고 복수를 제조하여 단일클론 항체를 생산 정제하였다.

먼저 10% FBS이 포함된 DMEM 50 ㎖에서 배양된 하이브리도마 세포를 원심분리하여 세포 침전물을 20 ㎖ DMEM로 2회 이상 세척하여 FBS를 제거하고 DMEM으로 2 x 10⁶/㎖ 세포가 되도록 세포 침전물을 재현탁시킨 후 미리 감작된 마우스의 복강에 500 ㎕를 주입하여 6일 동안 사육하였다. 이후 복수가 찬 마우스에서 주사 바늘을 이용하여 복수를 회수하여 친화성 칼럼(Protein G agarose column; Pharmacia, USA)을 장착한 AKTA 정제 기기(GE Health)를 이용하여 항체를 순수 정제한 후 단백질 응집용 필터(Amicon)를 사용하여 PBS로 상층액을 치환하여 정제된 항체(단일클론 항체 mAb anti-bovine IFN-r 3D6으로 명명함)를 보관하고, 이후의 실험에 사용하였다.

실시예 3: 단일클론 항체가 특이적으로 결합하는 소 인터페론 감마 내의 에피토프의 확인

실시예 2에서 제조한 단일클론 항체가 소 인터페론 감마의 어느 부위의 아미노산 서열을 특이적으로 인식하는지 여부를 시판 중인 단일클론 항체(AbD Sertec, MCA2112)와 비교하여 확인하였다.

소 인터페론 감마의 전장 아미노산 서열을 포함하는 단백질(서열번호 1)의 24번째 아미노산을 시작점으로 하여 24 내지 47번째 아미노산을 포함하는 폴리펩티드(서열번호 2), 48 내지 71번째 아미노산을 포함하는 폴리펩티드(서열번호 3), 72 내지 95번째 아미노산을 포함하는 폴리펩티드(서열번호 4), 96 내지 119번째 아미노산을 포함하는 폴리펩티드(서열번호 5), 120 내지 143번째 아미노산을 포함하는 폴리펩티드(서열번호 6), 144 내지 166번째 아미노산을 포함하는 폴리펩티드(서열번호 7)의 총 7개의 폴리펩티드 각각에 우혈청 알부민(bovine serum albumin, BSA; Equitech-bio, Inc.)이 결합(conjugation)된 폴리펩티드를 Ab Frontier에 의뢰하여 제조하였다.

SDS-PAGE를 위해 10%의 폴리아크릴아미드 겔을 제조한 다음, 상기 겔에 대조군으로 사용한 BSA 및 상기 제조한 6개의 BSA가 결합된 폴리펩티드를 각각 1.25 ㎍씩 로딩하였다. 이후, 160V, 400 mA의 조건으로 1시간 동안 SDS-PAGE를 수행한 다음, Mini-Protean3 Electrophoresis(BIO-RAD)를 이용하여, 니트로셀룰로즈 멤브레인(GE healthcare)에 200V, 200 mA의 조건으로 1시간 동안 상기 폴리펩티드들을 트랜스퍼(transfer)하였다.

상기 폴리펩티드들이 트랜스퍼된 멤브레인을 5% 스킴 밀크에 넣고, 상온에서 30분 동안 블로킹시킨 다음, 구입한 소인터페론 감마에 대한 단일클론항체(AbD Sertec, MCA2112)와 본 발명의 소 인터페론 감마에 대한 단일클론 항체를 상기 스킴 밀크에 첨가하여 상온에서 1시간 동안 반응시켰다. 이후, 세척액(1M Tris, 0.0025% Proclin 300, 0.1% Tween 20, 0.15 mM NaCl)을 사용하여 10분 동안 3회 세척을 반복하여 멤브레인 상의 폴리펩티드와 결합하지 않은 단일클론 항체를 제거하였다. 그런 다음, 5 ㎍/㎖의 스트랩트아비딘-호스래디쉬 퍼옥시다제 결합체(Pierce)를 상기 스킴 밀크에 첨가하여 상온에서 1시간 동안 반응시킨 후, 상기 세척 과정을 반복하여 반응하지 않은 스트랩트아비딘-호스래디쉬 퍼옥시다제 결합체를 제거하고, 화학 발광 기질 (Thermo Scientific, SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate)로 발색시킨 다음, X-ray 필름(AGFA)에 2분 동안 감광시키고, 그 결과를 확인하였다.

웨스턴 블롯의 결과, 도 5에서 보는 바와 같이, 기존 경쟁사 단일클론항체는 레인 b의 24 내지 47번째 아미노산을 포함하는 폴리펩티드에 대해 특징적으로 반응하였다. 반면, 도 6에서 보는 바와 같이, 본 발명의 단일클론 항체는 레인 e 및 f의 96 내지 119번째 아미노산을 포함하는 폴리펩티드 및 120 내지 143번째 아미노산을 포함하는 폴리펩티드에 대해 특이적으로 반응하는 것을 확인할 수 있었다. 밴드의 발색 정도가 레인 e에서 더욱 강한 것으로 보아, 소 인터페론 감마의 96 내지 119번째 아미노산을 포함하는 폴리펩티드에 더욱 강하게 결합하는 것으로 보였다. 따라서 상기 결과로부터 상기 실시예 1에서 제작한 소 인터페론 감마에 대한 본 발명의 단일클론 항체는 소 인터페론 감마 단백질의 96 내지 143번째 아미노산 서열 부분(서열번호 8)이 에피토프임을 확인할 수 있었으며, 기존의 단일클론 항체보다 우수한 결합력을 가지는 것을 알 수 있었다.

실시예 4: 소(bovine) 인터페론 감마에 대한 폴리클론 항체의 생산

토끼 한 마리당 1 mg의 소 인터페론 감마(실시예 1에서 사용한 것과 동일)와 동량의 완전 프로인드 어주번트(complete Freund's adjuvant)를 혼합하여 유제를 제조하고, 해당 유제를 토끼의 피하에 주사하여 면역시켰다. 면역은 1회당 1 mg의 상기 변성 단백질이 투여되도록 실시하고, 일주일 간격으로 5회 투여하였다. 최종 면역을 종료한지 1주일 후에 면역시킨 토끼의 전혈을 채집하고, 항혈청을 제조하였다. 해당 항혈청으로부터 폴리클론 항체는 상기 토끼의 면역에 사용한 소 인터페론 감마 단백질을 HiTrap NHS-activated (Amersham Pharmacia)에 공유결합으로 고상화시키고, 상기 고상화 수지에 상기 항혈청을 로딩한 다음, 상기 고상화 수지상의 단백질 분획에 결합시킨 항체를 0.1M 글리신-HCl(pH 2.7)로 용출시켜 얻었다.

실시예 5: 소 인터페론 감마에 대한 단일클론 항체 및 폴리클론 항체를 사용한 우결핵의 진단 실험

우결핵의 진단을 위하여 대상이 되는 소의 혈장 내의 소 감마 인터페론의 양을 측정하였다. 소 감마 인터페론 양의 측정을 위해, 상기 실시예 2에서 제조한 단일클론 항체 및 상기 실시예 4에서 제조한 폴리클론 항체를 이용한 샌드위치 효소면역 측정법이 사용되었다.

실험에 사용된 재료는 다음과 같다.

감작 항원 : 실험의 정확성과 재현성을 위하여 우결핵 원인균 유래 복합항원 및 조류결핵 원인균 유래 복합 항원을 사용하였다.

우결핵 원인균 유래 복합 항원

M. bovis strain AN5 중 정제 항원 복합물인 PPD(purified protein derivative)를 구입(AgriQuality Austrailian Pty Ltd., Austrailia)하여 사용하였으며, 상기 감작 항원을 PPD-B라고 명명하였다.

조류결핵 원인균 유래 복합항원

M. avium D4 중 정제 항원 복합물인 PPD(purified protein derivative)를 구입(AgriQuality Austrailian Pty Ltd., Austrailia)하여 사용하였으며, 상기 감작 항원을 PPD-A라고 명명하였다.

단일클론 항체 : 상기 실시예 2에서 제조한 단일클론 항체를 사용하였으며, 증폭액으로 사용하였다. 항 인터페론 감마 항체를 함유한 복수는 Balb/c 마우스 복강에 상기 실시예 2에서 제조한 하이브라도마 세포를 접종한 다음 채취하였다. 단일클론 항체는 Protein G 친화성 크로마토그래피를 이용하여 정제하였으며, 단일클론 항체의 품질은 10-15% SDS-PAGE를 수행한 다음, 실버 염색(PHAST system)을 통해 확인하였다.

폴리클론 항체 : 상기 실시예 4에서 제조한 폴리클론 항체를 사용하였으며, ELISA 플레이트의 코팅 항체로 사용하였다.

ELISA 플레이트 : 코팅 버퍼(래빗-항 IFN-γ를 포함하는 소듐 카보네이트 완충액)를 이용하여 Nunc 플레이트에 코팅하고, 흡인한 다음, 블로킹 버퍼(4 mM 포스페이트 버퍼, 0.05% Tween 20, 0.01% Proclin 300)로 블로킹한 후, 진공 건조시켜 사용하였다.

증폭액 : 소 감마 인터페론에 대한 단일클론 항체를 사용하였다. 상기 실시예 2에서 제조한 단일클론 항체에 비오틴을 결합시킨 다음, 안정제로서 1% 젤라틴을 넣어 동결건조하여 제조하였다.

접합체액 : 접합체액은 비오틴과 친화력이 높은 스트랩트아비딘에 호스래디쉬 퍼옥시다제를 결합시킨 다음, 보존제로서 1% 카세인 용액을 제조하여 사용하였다.

희석액 : 증폭액과 접합체액의 희석액으로 0.5%의 사카로스, 150 mM의 NaCl, 10%의 소태아 혈청이 첨가된 2.5% 카세인 용액을 제조하여 사용하였다.

검체희석액 : 혈장 희석액으로서 붉은색 색소(Reactive Red 120m, Sigma) 및 마우스의 복수(소 IFN-γ과 관련 없는 항원에 특이적인 단일클론 항체를 포함함)를 사용하였다.

효소 기질액 : 발색제는 테트라메틸벤지딘(TMB), DMSO 및 N-메틸 피롤리돈(NMP)를 이용하여 제조하였다.

반응정지액 : 반응 정지액은 2 mM의 묽은 황산을 사용하였다.

세척액 : 세척액은 PBS에 계면활성제를 첨가한 인산염 완충액으로서 pH 를 8.0으로 조정한 다음, 무균 여과하여 제조하였다.

양성대조액 : 표준 양성 검체는 호주산 소 혈청으로서, 상기 유전자 재조합된 소 감마 인터페론과 혼합하여 제조하였다. 안정제로서 1% 젤라틴을 넣어 동결건조하여 제조하였다.

음성대조액 : 표준 음성 검체는 호주산 소 혈청으로서, 안정제로서 1% 젤라틴을 넣어 동결건조하여 제조하였다.

검사 방법

제 1 단계 - 전혈 배양

혈액 검체는 인터페론 감마를 생산하기 위한 림프구 자극을 위하여 상기 항원과 밤샘 배양이 필요하였다. 따라서, 기존에 PPD 검사 성적(PPD 양성 119 검체, PPD 음성 31 검체)이 있는 소전혈 150 검체를 24-웰 세포배양용 플레이트에 소 1두당 3개의 웰에 각각 1.5 ㎖씩을 무균상태로 첨가하였다(도 7).

소 1두당 3개의 웰에 각각 100 ㎕씩 PBS(대조군), 감작 항원 PPD-A, 감작 항원 PPD-B를 첨가하고, 마이크로플레이트 쉐이커를 이용하여 분주된 혈액과 1분 동안 섞어주었다. 이후, 감작 항원이 첨가된 24-웰 플레이트를 37℃에서 16~24 시간 동안 CO₂ 항온기에서 배양하였다.

제 2 단계 - 소의 인터페론 감마에 대한 효소면역 측정

상기 단계에서 수집된 각 웰의 혈장 상층액으로부터 샌드위치 효소면역측정법을 사용하여 혈장 내에 포함된 인터페론 감마의 양을 측정하였다.

감작된 혈장 시료를 검체 희석액으로 희석(검체 희석액 100㎕ + 감작된 혈장 시료 50 ㎕)하여 검체 중에 존재하는 소 인터페론 감마가 플레이트에 결합되어 있는 소 인터페론 감마에 대한 폴리클론 항체와 결합하도록 하였다. 플레이트를 30분 동안 37℃에서 반응시키고, 세척액 350 ㎕씩 5회 세척하여 반응되지 않은 소 인터페론 감마를 제거시켰다. 각 플레이트 웰에 비오틴이 결합된 소 인터페론 감마에 대한 단일클론 항체 증폭액 100 ㎕를 플레이트의 각 웰에 첨가하여 상기 플레이트에 코팅된 폴리클론 항체에 결합된 인터페론 감마와 반응시킨 다음, 30분 동안 37℃에서 반응시켰다. 반응후 세척액 350 ㎕씩 5회 세척하여 반응되지 않은 증폭액을 제거시켰다. 비오틴과 친화력이 높은 스트랩트아비딘에 호스래디쉬 퍼옥시다제를 결합시킨 접합체액을 다시 반응시키고 각 플레이트 웰에 효소 기질액 100 ㎕를 첨가하였다. 기질액의 변환 비율은 상기 기질액이 결합된 인터페론 감마의 양과 비례한다. 상기 반응은 30분 후에 반응 정지액 100 ㎕를 첨가하여 종료시키며, 변화된 색깔의 정도를 분광 광도계(sunrise basic tecan)를 이용하여 측정하였다.

제 3 단계 - 결과의 판정

먼저, 각 검체당 음성 대조 항원, 조류결핵 원인균 유래 합성 폴리펩티드, 우결핵 원인균 유래 합성 폴리펩티드에 대한 평균 흡광도 값을 측정한 다음, 각 검체당 음성 대조 항원, 조류결핵 원인균 유래 합성 폴리펩티드, 우결핵 원인균 유래 합성 폴리펩티드에 대한 평균 흡광도 값을 비교하였다. 우결핵의 양성, 음성 여부는 다음과 같은 방법에 의해 판정하였다.

우결핵 원인균 유래 합성 폴리펩티드의 흡광도 - 음성 대조 항원 흡광도 ≥ 0.1 이면서, 우결핵 원인균 유래 합성 폴리펩티드의 흡광도 - 조류결핵 원인균 유래 합성 폴리펩티드의 흡광도 ≥ 0.1이면, 양성으로 판정하였다.

우결핵 원인균 유래 합성 폴리펩티드의 흡광도 - 음성 대조 항원 흡광도 〈 0.1 또는 우결핵 원인균 유래 합성 폴리펩티드의 흡광도 - 조류결핵 원인균 유래 합성 폴리펩티드의 흡광도 〈 0.1이면, 음성으로 판정하였다.

표준 검체의 평균 흡광도 범위는 다음과 같았다.

1. 음성 소 인터페론 감마 대조액 < 0.130 (흡광도 값 차이 < 0.040, 평균값으로부터)

2. 양성 소 인터페론 감마 대조액 > 0.700 (변이 < 30%, 평균값으로부터)

3. 음성 대조 항원 < 0.30 (변이 < 흡광도 값 차이 < 0.040, 평균값으로부터)

상기 결과에 따르면, 본 발명의 검사법은 71.4%(89/119)의 감도와 93.5%(29/31)의 특이도를 나타내어 일치율이 76%이었다. 하기 표 1은 본 발명의 키트를 사용한 경우 및 종래의 PPD 검사법을 사용한 경우의 감도와 특이도를 비교한 결과이다.

		PPD 검사		계
		양성	음성	계
인터페론검사	양성	85	2	87
인터페론검사	음성	34	29	63
계		119	31	150

일치율 = ((85+29)/150) x 100 = 76%

이는 기존 발표된 PPD 검사법과 인터페론 감마 검사법의 일치율이 70 ~80% 결과에 부합하는 결과로, 본 발명의 방법으로부터 우결핵을 단시간 내에 정확하게 진단할 수 있음을 알 수 있었다.

한국생명공학연구원

KCTC11794BP

20101022

<110> BioNote, Inc. <120> Kit and method for diagnosing bovine tuberculosis <160> 11 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 166 <212> PRT <213> Bos taurus <220> <221> SIGNAL <222> (1)..(23) <223> signal peptide <400> 1 Met Lys Tyr Thr Ser Tyr Phe Leu Ala Leu Leu Leu Cys Val Leu Leu 1 5 10 15 Gly Phe Ser Gly Ser Tyr Gly Gln Gly Gln Phe Phe Arg Glu Ile Glu 20 25 30 Asn Leu Lys Glu Tyr Phe Asn Ala Ser Asn Pro Asp Val Ala Lys Gly 35 40 45 Gly Pro Leu Phe Ser Glu Ile Leu Lys Asn Trp Lys Asp Glu Ser Asp 50 55 60 Lys Lys Ile Ile Gln Ser Gln Ile Val Ser Phe Tyr Phe Lys Leu Phe 65 70 75 80 Glu Asn Leu Lys Asp Asn Gln Val Ile Gln Arg Ser Met Asp Ile Ile 85 90 95 Lys Gln Asp Met Phe Gln Lys Phe Leu Asn Gly Ser Ser Glu Lys Leu 100 105 110 Glu Asp Phe Lys Lys Leu Ile Gln Ile Pro Val Asp Asp Leu Gln Ile 115 120 125 Gln Arg Lys Ala Ile Asn Glu Leu Ile Lys Val Met Asn Asp Leu Ser 130 135 140 Pro Lys Ser Asn Leu Arg Lys Arg Lys Arg Ser Gln Asn Leu Phe Arg 145 150 155 160 Gly Arg Arg Ala Ser Thr 165 <210> 2 <211> 24 <212> PRT <213> Bos taurus <400> 2 Gln Gly Gln Phe Phe Arg Glu Ile Glu Asn Leu Lys Glu Tyr Phe Asn 1 5 10 15 Ala Ser Asn Pro Asp Val Ala Lys 20 <210> 3 <211> 24 <212> PRT <213> Bos taurus <400> 3 Gly Gly Pro Leu Phe Ser Glu Ile Leu Lys Asn Trp Lys Asp Glu Ser 1 5 10 15 Asp Lys Lys Ile Ile Gln Ser Gln 20 <210> 4 <211> 24 <212> PRT <213> Bos taurus <400> 4 Ile Val Ser Phe Tyr Phe Lys Leu Phe Glu Asn Leu Lys Asp Asn Gln 1 5 10 15 Val Ile Gln Arg Ser Met Asp Ile 20 <210> 5 <211> 24 <212> PRT <213> Bos taurus <400> 5 Ile Lys Gln Asp Met Phe Gln Lys Phe Leu Asn Gly Ser Ser Glu Lys 1 5 10 15 Leu Glu Asp Phe Lys Lys Leu Ile 20 <210> 6 <211> 21 <212> PRT <213> Bos taurus <400> 6 Gln Ile Pro Val Asp Asp Leu Gln Ile Gln Arg Lys Ala Ile Asn Glu 1 5 10 15 Leu Ile Lys Val Met 20 <210> 7 <211> 17 <212> PRT <213> Bos taurus <400> 7 Ser Pro Lys Ser Asn Leu Arg Lys Arg Lys Arg Ser Gln Asn Leu Phe 1 5 10 15 Arg <210> 8 <211> 45 <212> PRT <213> Bos taurus <400> 8 Ile Lys Gln Asp Met Phe Gln Lys Phe Leu Asn Gly Ser Ser Glu Lys 1 5 10 15 Leu Glu Asp Phe Lys Lys Leu Ile Gln Ile Pro Val Asp Asp Leu Gln 20 25 30 Ile Gln Arg Lys Ala Ile Asn Glu Leu Ile Lys Val Met 35 40 45 <210> 9 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for amplifying bovine interferon gamma gene <400> 9 ggatcccagg gccaattttt taga 24 <210> 10 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for amplifying bovine interferon gamma gene <400> 10 gtcgacttac gttgatgctc tccg 24 <210> 11 <211> 444 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA fragment including bovine interferon gamma gene <220> <221> misc_feature <222> (1)..(6) <223> linker DNA <220> <221> misc_feature <222> (439)..(444) <223> linker DNA <400> 11 ggatcccagg gccaattttt tagagaaata gaaaacttaa aggagtattt taatgcaagt 60 agcccagatg tagctaaggg tgggcctctc ttctcagaaa ttttgaagaa ttggaaagat 120 gaaagtgaca aaaaaattat tcagagccaa attgtctcct tctacttcaa actctttgaa 180 aacctcaaag ataaccaggt cattcaaagg agcatggata tcatcaagca agacatgttt 240 cagaagttct tgaatggcag ctctgagaaa ctggaggact tcaaaaagct gattcaaatt 300 ccggtggatg atctgcagat ccagcgcaaa gccataaatg aactcatcaa agtgatgaat 360 gacctgtcac caaaatctaa cctcagaaag cggaagagaa gtcagaatct ctttcgaggc 420 cggagagcat caacgtaagt cgac 444

Claims

소 인터페론 감마의 수용체 결합 영역에서 서열번호 5의 아미노산 서열에 결합하는 단일클론 항체로서, 상기 단일클론 항체는 수탁번호 KCTC 11794BP인 하이브리도마 세포에서 생산되는 것인 단일클론 항체.
삭제
제1항의 단일클론 항체의 항원 결합 단편.
소 인터페론 감마의 수용체 결합 영역에서 서열번호 5의 아미노산 서열에 결합하는 단일클론 항체를 생산하는 하이브리도마 세포(수탁번호: KCTC 11794BP).
제1항의 단일클론 항체 또는 제3항의 항원 결합 단편 및 항-소 인터페론 감마 폴리클론 항체를 포함하는 우결핵 진단용 키트.
생물학적 시료를 우결핵 원인균 유래의 우결핵 증상 유발 항원 또는 조류결핵 원인균 유래의 조류결핵 증상 유발 항원과 혼합하여 배양하는 단계;
제1항의 단일클론 항체 또는 제3항의 항원 결합 단편과 상기 배양된 혼합액을 접촉시키는 단계로서, 상기 배양된 혼합액을 항-소 인터페론 감마 폴리클론 항체가 코팅된 플레이트에 접촉시킨 이후, 제1항의 단일클론 항체 또는 제3항의 항원 결합 단편을 추가로 상기 플레이트에 접촉시키는 것인 단계;
소 인터페론 감마와 제1항의 단일클론 항체 또는 제3항의 항원 결합 단편, 및 상기 항-소 인터페론 감마 폴리클론 항체의 반응 정도를 측정하는 단계; 및
상기 측정 결과로부터 상기 생물학적 시료의 우결핵 원인균 감염 여부를 검출하는 단계를 포함하는 우결핵 진단 방법.
삭제
제6항에 있어서, 상기 생물학적 시료는 소의 혈액, 세포 배양 상층액 및 림프액으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
제6항에 있어서, 상기 우결핵 원인균 유래의 우결핵 증상 유발 항원은 M. bovis의 정제 항원 복합물이고, 조류결핵 원인균 유래의 조류결핵 증상 유발 항원은 M. avium의 정제 항원 복합물인 것인 방법.