KR20190138443A - 랍도비리대 과 바이러스 검출용 항체 및 그의 용도 - Google Patents

랍도비리대 과 바이러스 검출용 항체 및 그의 용도 Download PDF

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Abstract

랍도비리대 과 바이러스와 특이적으로 결합하는 항체, 및 상기 항체를 포함하는 랍도비리대 과 바이러스 감염증 진단용 조성물 및 키트, 및 이를 이용한 랍도비리대 과 바이러스를 검출하는 방법을 제공한다.

Description

랍도비리대 과 바이러스 검출용 항체 및 그의 용도 {Antibody detecting Rhabdoviridae family virus and use thereof}
랍도비리대 과 바이러스 검출용 항체 및 그의 용도에 관한 것이다.
바이러스성 출혈성 패혈증 바이러스 (VHSV)는 랍도비리대 과에 속하는 바이러스로서, 무지개 송어의 양식에 큰 영향을 미치는 질병의 원인균으로 알려져 있다. 상기 바이러스는 유럽과 북미를 중심으로 다양한 해산어류에서 발견되고 있으며, 국내에서는 겨울과 봄의 저 수온기에 양식 넙치에서 피해 사례가 보고된 바 있다. 바이러스성 출혈성 폐혈증 바이러스에 감염된 어류는 활력이 떨어지거나, 이와 반대로 과도한 활력을 보여준다. 안구 돌출증과 체표 및 지느러미 끝 부위에서의 출혈이 관찰되며, 이들의 대부분은 삼투압 균형의 손상으로 죽게된다. 해부학적으로 복수 저류로 인한 복부팽만과 탈장, 아가미 퇴색 등이 관찰되며, 병어를 해부해 보면 복강에 맑은 복수가 차 있고 간의 충혈 현상이 나타난다. 개체에 따라 신장이 종대되어 있거나 회백색으로 퇴색되어 있으며, 비장은 비정상적으로 종대되어 있다. 발병 수온은 10～13℃이고, 병어의 크기에 상관없이 대부분 폐사로 이어진다. 주된 감염 장기는 심장, 및 신장이며, 이 외에도 비장, 뇌, 근육, 및 아가미 등이 있다.
또한, 전염성 조혈기 괴사 바이러스 (IHNV) 역시 랍도비리대 과에 속하는 바이러스로서, 캐나다와 미국의 태평양 연안에서 흔히 관찰되며, 상기 VHSV와 마찬가지로, 삼투압 불균형에 따라 폐사를 일으킨다. 최초로 보고된 전염성 조혈기 괴사 바이러스 감염증은 1950년경 워싱턴 및 오레곤 어부 부화장에서 발견되었으며, 이들은 배설물, 소변, 생식 관련 체액 및 외부 점액등 을 통해 다른 개체로 전염되는 것으로 알려져 있다. 발병 수온은 10～13℃이고, 구체적인 증상은 전술한 바이러스성 출혈성 패혈증 바이러스 감염증과 유사하며, 연어와 송어에서 높은 전염성을 나타낸다.
한편, 무리지어 생활하는 어류의 특성 및 좁은 공간에 많은 어류를 양식하는 양식 환경의 특성상, 상기 바이러스들에 의한 감염은 해당 군체에 확산될 가능성이 매우 높으므로, 감염 초기 단계에 감염 여부를 신속하게 진단하여 질병의 확산을 미연에 방지하여야 한다. 이러한 기술적 배경 하에서, 감염이 의심되는 개체를 대상으로 랍도비리대 과 바이러스의 감염 여부를 신속하고 정확하게 판별할 수 있는 기술을 필요로 하고 있으나, 아직은 미비한 실정이다.
일 양상은 바이러스성 출혈성 패혈증 바이러스와 특이적으로 결합하는, 랍도비리대 과 바이러스 감염증 진단용 항체를 제공하는 것이다.
다른 양상은 상기의 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는, 개체의 랍도비리대 과 바이러스 감염증 진단용 조성물을 제공하는 것이다.
또 다른 양상은 상기의 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는, 랍도비리대 과 바이러스 감염증 진단용 키트를 제공하는 것이다.
또 다른 양상은 상기의 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 개체로부터 분리된 시료를 접촉시키는 단계; 및 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편과의 결합에 의해 형성된 복합체를 검출하는 단계를 포함하는, 랍도비리대 과 바이러스를 검출하는 방법을 제공하는 것이다.
일 양상은 바이러스성 출혈성 패혈증 바이러스와 특이적으로 결합하는, 랍도비리대 과 바이러스 감염증 진단용 항체를 제공한다.
본 명세서에 사용된 용어, "항체 (antibody)"는 랍도비리대 과 바이러스 에 대한 특이적인 항체로서, 완전한 항체, 항체 분자의 항원 결합 단편, 합성 항체, 재조합 항체, 또는 항체 하이브리드 (antibody hybrid)를 포함할 수 있다. 한편, 상기 랍도비리대 과 바이러스, 특히, 바이러스성 출혈성 패혈증 바이러스, 전염성 조혈기 괴사 바이러스, 또는 히라메 랍도바이러스에 관한 서열 정보는 당업계에 이미 알려져 있다. 상기 항체는 단일클론 항체, 이특이적 항체, 비-인간 항체, 인간 항체, 인간화 항체, 키메릭 항체, 단쇄 Fv (scFv), 단쇄 항체, Fab 단편, F(ab')단편, 다이설파이드-결합 Fv (sdFv) 및 항-이디오타입 (항-Id) 항체, 그리고 상기 항체들의 에피토프-결합 단편을 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어, "특이적으로 결합(specifically binding)" 은 당업자에게 통상적으로 알려진 의미와 동일한 것으로서, 항원 및 항체가 특이적으로 상호작용하여 항원-항체 복합체를 형성할 수 있으며, 또한 면역학적 반응을 하는 것을 의미할 수 있다.
상기 완전한 항체는 2개의 전장 (full length) 경쇄 및 2개의 전장 중쇄를 가지는 구조이고, 각각의 경쇄는 중쇄와 이황화 결합 (disulfide bond, SS-bond) 항체의 불변 영역은 중쇄 불변 영역과 경쇄 불변 영역으로 나뉘어지며, 중쇄 불변 영역은 감마 (γ), 뮤 (μ), 알파 (α), 델타 (δ) 및 엡실론 (ε) 타입을 가지고, 서브클래스로 감마1 (γ1), 감마2 (γ2), 감마3 (γ3), 감마4 (γ4), 알파1 (α1) 및 알파2 (α2)를 가질 수 있다. 경쇄의 불변 영역은 카파 (κ) 및 람다 (λ) 타입을 가질 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어, "단일클론 항체 (monoclonal antibody)"는 상기 항체 분자가 단일 분자로 구성되도록 제조된 것을 의미한다. 단일클론 항체는 동일한 에피토프를 갖는 항원에 대해서만 반응하는 특이성을 가지며, 또한 특정 에피토프에 대해서만 친화성을 나타낸다.
일 구체예에 있어서, 상기 항체는 실시예에서 기술하고 있는 하이브리도마 세포에서 생산되는 것일 수 있다.
상기 하이브리도마 세포는 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제조할 수 있다. 구체적으로, 상기 하이브리도마 세포는 바이러스성 출혈성 패혈증 바이러스를 동물에 면역시키고, 상기 피면역 동물로부터 유래된 항체 생산세포인 B 세포를 골수종세포와 융합시켜서 하이브리도마를 제조한 다음, 그 중에서 바이러스성 출혈성 패혈증 바이러스에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체를 생산하는 하이브리도마를 선택하는 방법으로 제조할 수 있다. 상기 피면역 동물은 실시예에서 사용된 마우스뿐만 아니라 염소, 양, 모르모트, 래트 또는 토끼와 같은 동물을 사용할 수 있다.
상기 피면역 동물을 면역시키는 방법으로서는 당업계에 이미 공지된 방법을 사용할 수 있다. 예를 들어, 마우스를 면역시키는 경우 1회에 1 내지 100㎍의 면역원을 동량의 생리 식염수 및/또는 프로인드 어주번트 (Freund's adjuvant) 등의 항원 보조제로 유화시켜, 상기 피면역원 동물의 복부의 피하 또는 복강 내에 2-5주마다 2-6회 접종시키는 방법으로 수행될 수 있다. 피면역 동물을 면역시킨 후에는 최종 면역 3-5일 후 비장 또는 림프절을 적출하여 당업계에서 이미 공지되어 있는 세포 융합법에 따라, 융합 촉진제의 존재 하에 이들의 조직에 포함되어 있는 B 세포를 골수종세포와 융합시키게 된다. 상기 융합 촉진제는 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜(PEG)과 같은 물질을 사용할 수 있다. 상기 골수종세포는 예를 들어, P3U1, NS-1, P3x63. Ag 8.653, Sp2/0-Ag14와 같은 마우스 유래 세포, AG1, AG2와 같은 래트 유래 세포를 사용할 수 있다. 또한 상기 당업계에 공지된 세포 융합법은 예를 들어, B 세포와 골수종세포를 1:1-10:1의 비율로 혼합시켜, 이에 분자량 1,000-6,000의 PEG를 10-80%의 농도로 첨가하여, 30-37℃에서 1-10분 동안 배양하는 방법으로 수행될 수 있다. 또한, 상기 랍도비리대 과 바이러스에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체를 생산하는 하이브리도마는 예를 들어, 하이브리도마만이 생존 가능한 HAT 배지 등의 선택 배지에서 배양하고, 하이브리도마 배양 상층액 중의 항체 활성을 ELISA 등의 방법을 이용하여 측정하여 선택할 수 있다. 최종적으로, 랍도비리대 과 바이러스에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체를 생산하는 하이브리도마는 예를 들어, 랍도비리대 과 바이러스에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체를 생산하는 하이브리도마에 대하여, 한계 희석 등의 방법에 의해 클로닝을 반복함으로써 선별될 수 있다. 한편, 상기 단일클론 항체는 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgE, IgA1, IgA5, 또는 IgD 타입일 수 있다.
다른 양상은 상기의 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는, 개체의 랍도비리대 과 바이러스 감염증 진단용 조성물을 제공한다.
본 발명에서 사용되는 용어, "항원 결합 단편 (antigen binding fragment)"은 면역글로불린 전체 구조에 대한 그의 단편으로, 항원이 결합할 수 있는 부분을 포함하는 폴리펩티드의 일부를 의미한다. 예를 들어, F(ab')2, Fab', Fab, Fv 또는 scFv일 수 있다. 상기 항원 결합 단편 중 Fab는 경쇄 및 중쇄의 가변영역과 경쇄의 불변 영역 및 중쇄의 첫 번째 불변 영역 (CH1)을 가지는 구조로 1개의 항원 결합 부위를 가진다. Fab'는 중쇄 CH1 도메인의 C-말단에 하나 이상의 시스테인 잔기를 포함하는 힌지 영역 (hinge region)을 가진다는 점에서 Fab와 차이가 있다. F(ab')2 항체는 Fab'의 힌지 영역의 시스테인 잔기가 디설파이드 결합을 이루면서 생성된다. Fv는 중쇄 가변부위 및 경쇄 가변부위만을 가지고 있는 최소의 항체조각으로 Fv 단편을 생성하는 재조합 기술은 당업계에 널리 공지되어 있다. 이중쇄 Fv (two-chain Fv)는 비공유 결합으로 중쇄 가변부위와 경쇄 가변부위가 연결되어 있고 단쇄 Fv (single-chain Fv)는 일반적으로 펩타이드 링커를 통하여 중쇄의 가변 영역과 단쇄의 가변 영역이 공유 결합으로 연결되거나 또는 C-말단에서 바로 연결되어 있어서 이중쇄 Fv와 같이 다이머와 같은 구조를 이룰 수 있다. 상기 항원 결합 단편은 단백질 가수분해 효소를 이용해서 얻을 수 있다 (예를 들어, 전체 항체를 파파인으로 제한 절단하면 Fab를 얻을 수 있고 펩신으로 절단하면 F(ab')2 단편을 얻을 수 있다). 또한 상기 항원 결합 단편은 유전자 재조합 기술을 통하여 제작할 수 있다.
상기 조성물은 항체를 액체 중에서 포함하는 액체 조성물 형태로 제공될 수 있다. 상기 액체는 상기 항체를 용해시킬 수 있고 유지시킬 수 있는 것일 수 있다. 예를 들어, 물, 또는 PBS와 같은 버퍼 용액일 수 있으며, 상기 조성물은 상기 항체를 안정하게 유지하는 물질을 더 포함할 수 있다.
또 다른 양상은 상기의 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는, 개체의 랍도비리대 과 바이러스 감염증 진단용 키트를 제공한다.
상기 키트는 검출가능한 모이어티를 더 포함할 수 있다. 검출가능한 모이어티 (detectable moiety)는 모이어티의 존재, 상대적 양 및/또는 위치 (예를 들어, 어레이상의 위치)가 직접적으로 또는 간접적으로 결정될 수 있는 모이어티를 포함할 수 있다. 상기 검출가능한 모이어티는 해당 기술분야에서 잘 알려져 있다. 예를 들어, 검출가능한 모이어티는 특정 조건에 노출될 경우, 검출될 수 있는 것으로, 형광성 모이어티, 발광성 모이어티, 화학발광성 모이어티, 방사성 모이어티 (예, 방사성 원자), 및 효소 모이어티로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 예를 들어, 형광 모이어티는 형광성 모이어티의 여기 (excitation)를 야기하는 특정 파장 및 강도에서 방사선 (radiation)에 노출될 필요가 있을 수 있고, 이에 의해 검출될 수 있는 특정 파장 (wavelength)에서 검출가능한 형광을 발산하게 할 수 있다.
상기 모이어티는 금속 나노 입자를 포함할 수 있다. 상기 금속 나노 입자는 골드 입자일 수 있다. 상기 골드 나노 입자는 적색 골드 나노 입자 또는 청색 금 나노 입자일 수 있다. 상기 골드 나노 입자는 분산 상태, 예를 들어, 콜로이드일 수 있다.
상기 키트는 분석물을 포함하는 액체 시료가 적용되는 부위인 검체 패드 (1), 상기 검체 패드와 유체 소통가능하게 연결되어 있고, 골드 입자의 접합체가 이동가능하게 지지되어 있는 저장 패드 (2)로서, 상기 골드 입자의 접합체는 제1 항체 또는 그의 단편과 골드 입자의 접합체이고,
상기 저장 패드와 유체 소통가능하게 연결되어 있고 모세관 이동에 의하여 상기 액체 시료가 이동하는 크로마토그래피 막 (membrane) 물질 (3)로서, 상기 저장 패드의 하류에 제2 항체 또는 그의 단편이 비확산적으로 고정화되어 있는 검출 영역을 포함하는 크로마토그래피 막 물질;
상기 크로마토그래피 막 물질과 유체 소통가능하게 연결되어 있는 흡습 패드 (4); 및
상기 검체패드, 저장 패드, 크로마토그래피 막 물질 및 흡습 패드를 지지하는 고체 지지체 (5)를 포함하는, 랍도비리대 과 바이러스를 검출하기 위한 키트 형태로 제공될 수 있다. 상기 키트는 면역 크로마토그래피 검출 장치일 수 있다.
상기 제1 항체와 제2 항체는 예를 들어, 랍도비리대 과 바이러스와 특이적으로 결합하는 단일클론 항체, 구체적으로 일 실시예에 따른 mAb anti-pan-Rhabdoviridae 3A #2, mAb anti-pan-Rhabdoviridae 3A #64 중 어느 하나일 수 있다. 상기 제1 항체와 상기 제2 항체는 다른 것일 수 있다.
도 4는 일 구체예에 따른 랍도비리대 과 바이러스 검출용 키트를 나타내는 측면도이며, 도 5는 일 구체예에 따른 랍도비리대 과 바이러스 검출용 키트의 검출 원리를 개략적으로 나타낸 도이다.
상기 키트는 고체 지지체 (5) 상에 제2 항체가 고정화되어 있는 검출 영역 (T)과 대조 영역 (C)이 형성되어 있는 크로마토그래피 물질 막 (3)이 지지되어 있고 여기에 검체패드 (1), 제1 항체와 골드 접합체가 지지되어 있는 저장 패드(2) 및 흡습 패드가 중첩되어 연결되어 있다. 스트립에 시료를 검체패드 (1)에 첨가하면, 모세관 현상에 의하여 저장패드 (2)로 이동하여 시료 중의 항원은 저장패드 중의 제1 항체와 골드의 접합체와 결합하고 크로마토그래피 물질 막 (3)을 통하여 흡습 패드 (4)의 방향의 하류로 모세관 이동하게 된다. 상기 항원과 상기 접합체의 결합체가 검출 영역 (T)에 도달하게 되면 상기 결합체와 제2 항체가 특이적으로 결합하여 발색하게 되고, 상기 결합체가 없는 경우에는 발색을 하지 않게 된다. 또한, 상기 시료와 함께 제1 항체와 골드 입자의 접합체는 대조 영역 (C)을 통과하는 경우에는 상기 제1 항체와 골드 입자의 접합체는 상기 대조 영역 중의 제1 항체와 골드 입자 접합체에 특이적인 항체와 결합하여 발색함으로써, 모세관 이동이 제대로 되었는지를 확인할 수 있다.
상기 키트는 항원 또는 항체와 같은 면역화학 성분의 고상 담체로서 다공성 물질을 이용하는 면역분석 키트일 수 있다. 본 발명의 일 구체예에서 사용되는 검체패드, 저장 패드, 크로마토그래피 막 물질 및 흡습 패드는 분석될 액체 시료를 수용하고 포함하기 충분한 다공성 (porosity)과 부피를 가진 물질이며, 예를 들어, 마이크로다공성 막 물질일 수 있다. 상기 마이크로다공성 막 물질의 예에는 나일론, 셀룰로즈 물질, 폴리술폰, 폴리비닐리덴 디플루오라이드, 폴리에스테르 및 유리 섬유가 포함된다. 상기 마이크로다공성 막 물질의 바람직한 예는, 니트로셀룰로스 막이다. 상기 분석 장치는 스트립의 형태를 가질 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "유체 소통가능하게 연결되어 있는 (in flow communication with)"이라는 표현은 하나의 위치 (예, 검체패드)에 액체 시료가 적용되었을 경우 모세관 이동에 의하여 다른 위치 (예, 저장 패드)로 이용가능하게 연결되어 있는 것을 말한다. 또한, 용어 "이동가능하게 지지되어 있는 (movably supported)"이라는 표현은 액체 시료의 모세관 이동과 함께 골드 입자의 접합체가 이동가능하게 저장 패드에 고정화되어 있는 것을 의미한다. 또한, 용어 "비확산적으로 고정화되어 있는 (nondiffusively immobilized)"이라는 표현은 제2 항체 또는 그의 단편이 상기 검출 영역 내에 상기 액체 시료의 모세관 이동에 의하여 함께 확산되지 않도록 고정화되어 있는 것을 의미한다. 항원 및/또는 항체를 비확산적으로 고정화하는 방법은 상기 크로마토그래피 막 물질과 항원 및/또는 항체를 크로마토그래피 막 물질의 상기 검출 영역에 비확산적으로 고정화할 수 있는 것이면 임의의 방법이 포함될 수 있다. 예를 들어, 공유결합법이 포함되나 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 검출 영역은 임의의 모양, 예를 들어, 사각형 및 원형의 형태를 취할 수 있으며 그 면적은 상기 크로마토그래피 막 물질의 면적보다는 작다.
일 구체예에 따른 키트에 사용되는 항체와 골드 접합체는 당업계에 잘 알려져 있는 방법에 의하여 제조될 수 있다. 예를 들어, 골드 콜로이드 용액을 만들고, 상기 용액 중의 골드를 항체와 공유결합시킴으로써 제조될 수 있다. 항체와 골드 접합체는 예를 들어, 참조에 의하여 그 전체로서 본 명세서에 포함되는 미국 특허 제5,514,302호 및 제4,313,734호에 개시된 방법에 의하여 제조될 수 있다.
또한, 상기 키트는 랍도비리대 과 바이러스를 면역분석 방법에 따라 검출하여 랍도비리대 과 바이러스 감염증을 진단하는 데 이용될 수 있다. 이러한 면역분석은 종래에 개발된 다양한 면역분석 (immunoassay) 또는 면역염색 (immunostaining) 프로토콜에 따라 실시될 수 있다. 상기 면역분석 또는 면역염색 포맷은 방사능면역분석, 방사능면역침전, 면역침전, ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay), 캡처-ELISA, 억제 또는 경쟁 분석, 샌드위치 분석, 유세포 분석 (flow cytometry), 면역형광염색 면역친화성 정제, 면역 크로마토그래피 (immunochromatography), 및 이들의 조합으로부터 선택된 하나 이상을 포함할 수 있다.
예를 들어, 본 발명의 방법이 방사능면역분석 방법에 따라 실시되는 경우, 방사능동위원소(예를 들어, C14, I125, P32 및 S35)로 표지된 항체가 랍도비리대 과 바이러스를 검출하는 데 이용될 수 있다.
또한, 예를 들어, 본 발명의 방법이 ELISA 방식으로 실시되는 경우, 특정 구체예는 (i) 분석하고자 하는 미지의 세포 시료 분해물을 고체 기질의 표면에 코팅하는 단계; (ⅱ) 랍도비리대 과 바이러스에 대한 일차항체와 상기 세포 분해물을 반응시키는 단계; (ⅲ) 상기 단계 (ⅱ)의 결과물을 효소가 결합된 이차항체와 반응시키는 단계; 및 (ⅳ) 상기 효소의 활성을 측정하는 단계를 포함할 수 있다.
상기 고체 기질로 적합한 것은 탄화수소 폴리머(예를 들어, 폴리스티렌 및 폴리프로필렌), 유리, 금속 또는 젤이며, 마이크로타이터 플레이트일 수 있다.
상기 이차항체에 결합된 효소는 발색반응, 형광반응, 발광반응 또는 적외선 반응을 촉매하는 효소를 포함할 수 있으며, 예를 들어, 알칼린 포스파타아제, β-갈락토시다아제, 호스 래디쉬 퍼옥시다아제, 루시퍼라아제 및 사이토크롬 P450을 포함한다. 상기 이차항체에 결합하는 효소로서 알칼린 포스파타아제가 이용되는 경우에는, 기질로서 브로모클로로인돌일 포스페이트(BCIP), 니트로 블루 테트라졸리움(NBT)나프톨-AS-B1-포스페이트(naphthol-AS-B1-phosphate) 및 ECF(enhanced chemifluorescence)와 같은 발색반응 기질이 이용되고, 호스 래디쉬 퍼옥시다아제가 이용되는 경우에는 클로로나프톨, 아미노에틸카바졸, 디아미노벤지딘, D-루시페린, 루시게닌(비스-N-메틸아크리디늄 니트레이트), 레소루핀 벤질 에테르, 루미놀, 암플렉스 레드 시약(10-아세틸-3,7-디하이드록시페녹사진), HYR(p-phenylenediamine-HCl and pyrocatechol), TMB(tetramethylbenzidine), ABTS(2,2'-Azine-di[3-ethylbenzthiazoline sulfonate]), o-페닐렌디아민(OPD) 및 나프톨/파이로닌, 글루코스 옥시다아제와 t-NBT(nitroblue tetrazolium) 및 m-PMS(phenzaine methosulfate)과 같은 기질이 이용될 수 있다.
상기 방법이 캡처-ELISA 방식으로 실시되는 경우, 본 발명의 일 구체예는 (i) 포획항체 (capturing antibody)로서 랍도비리대 과 바이러스 항체를 고체 기질의 표면에 코팅하는 단계; (ⅱ) 포획 항체와 시료를 반응시키는 단계; (ⅲ) 상기 단계 (ⅱ)의 결과물을 시그널을 발생시키는 레이블이 결합되어 있고, 랍도비리대 과 바이러스에 특이적으로 반응하는 검출항체(예, 본 발명의 항체 또는 항원 결합 단편)와 반응시키는 단계; 및 (ⅳ) 상기 레이블로부터 발생하는 시그널을 측정하는 단계를 포함할 수 있다.
상기 검출 항체는 검출 가능한 시그널을 발생시키는 레이블을 가지고 있다. 상기 레이블은 화학물질 (예를 들어, 바이오틴), 효소 (알칼린 포스파타아제, β-갈락토시다아제, 호스 래디쉬 퍼옥시다아제 및 사이토크롬 P450), 방사능물질 (예를 들어, C14, I125, P32 및 S35), 형광물질 (예를 들어, 플루오레신), 발광물질, 화학발광물질 (chemiluminescent) 및 FRET (fluorescence resonance energy transfer)을 포함할 수 있다.
상기 ELISA 방법 및 캡처-ELISA 방법에서 최종적인 효소의 활성 측정 또는 시그널의 측정은 당업계에 공지된 다양한 방법에 따라 실시될 수 있다. 이러한 시그널이 검출은 랍도비리대 과 바이러스 감염의 정성적 또는 정량적 분석을 가능하게 한다. 만일, 레이블로서 바이오틴이 이용된 경우에는 스트렙타비딘으로, 루시퍼라아제가 이용된 경우에는 루시페린으로 시그널을 용이하게 검출할 수 있다.
또 다른 양상은 상기의 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 개체로부터 분리된 시료를 접촉시키는 단계; 및 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편과의 결합에 의해 형성된 복합체를 검출하는 단계를 포함하는, 랍도비리대 과 바이러스를 검출하는 방법을 제공한다.
상기 랍도비리대 과 바이러스를 검출하는 방법은 상술한 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 시료를 접촉시키는 단계를 포함할 수 있다. 상기 접촉시키는 단계는 시료를 상술한 랍도비리대 과 바이러스 항체 또는 이의 항원 결합 단편 ('1차 항체 또는 이의 항원 결합 단편'이라고 지칭)이 코팅된 플레이트에 접촉시킨 이후, 랍도비리대 과 바이러스 항체 또는 이의 항원 결합 단편 ('2차 항체 또는 이의 항원 결합 단편'이라고 지칭)을 추가로 상기 플레이트에 접촉시키는 단계를 포함하는 것일 수 있다. 상기 1차 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 2차 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 동일하거나 상이한 것일 수 있다. 상기 1차 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 2차 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 검출가능한 모이어티가 결합된 것일 수 있다. 예를 들어, 2차 항체 또는 이의 결합 단편은 금 (gold)과 같은 검출가능한 모이어티를 포함하는 것일 수 있다. 상기 1차 및 2차 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 각각, 일 실시예에 따른 mAb anti-pan-Rhabdoviridae 3A #2, 및 mAb anti-pan-Rhabdoviridae 3A #64일 수 있거나, 또는 그 반대일 수 있다.
상기 랍도비리대 과 바이러스를 검출하는 방법은 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편과의 결합에 의해 형성된 복합체를 검출하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 검출은 상기 복합체에 결합된 검출가능한 모이어티를 측정함으로써 상기 랍도비리대 과 바이러스의 검출 또는 정량을 할 수 있다.
상기 시료는 개체로부터 유래된 생물학적 물질일 수 있다. 상기 개체는 어류일 수 있고, 예를 들어, 연어, 무지개송어, 넙치, 및 송어 등과 같은 양식 어종의 어류일 수 있다. 또한, 상기 시료는 혈액 또는 혈액 구성성분 (blood constituent), 체액 (bodily fluid), 장기로부터 유래된 조직 시료일 수 있고, 예를 들어, 간 , 신장, 및 비장 등으로부터 유래한 조직 시료일 수 있다.
또 다른 양상은 상기의 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 시료를 접촉시키는 단계; 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편과의 결합에 의해 형성된 복합체를 검출하는 단계; 및 상기 검출 결과로부터 랍도비리대 과 바이러스의 감염 여부를 검출하는 단계를 포함하는 랍도비리대 과 바이러스 감염증의 진단 방법을 제공한다.
상기 랍도비리대 과 바이러스 감염증의 진단 방법은 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 랍도비리대 과 바이러스의 복합체가 검출되는 경우 상기 시료가 유래된 개체가 랍도비리대 과 바이러스 감염증에 감염된 것으로 결정하는 단계를 포함할 수 있다. 또한, 상기 복합체가 검출되지 않는 경우 상기 시료가 유래된 개체는 랍도비리대 과 바이러스에 감염되지 않은 것으로 결정하는 단계를 포함할 수 있다.
일 구체예에 따른 랍도비리대 과 바이러스와 특이적으로 결합하는 항체, 및 상기 항체를 포함하는 랍도비리대 과 바이러스 감염증 진단용 조성물 및 키트 등에 따르면, 랍도비리대 과 바이러스의 감염 여부를 효율적으로 검출할 수 있는 바, 관련 질병의 진단에 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 일 구체예에 따른 랍도비리대 과 바이러스 검출용 키트를 사용하여 다양한 바이러스 역가를 갖는 바이러스성 출혈성 패혈증 바이러스를 검출한 결과이다.
도 2는 일 구체예에 따른 랍도비리대 과 바이러스 검출용 키트를 사용하여 다양한 바이러스 역가를 갖는 전염성 조혈기 괴사 바이러스를 검출한 결과이다.
도 3은 일 구체예에 따른 랍도비리대 과 바이러스 검출용 키트의 랍도비리대 과 바이러스에 대한 반응성을 확인한 결과이다.
도 4는 일 구체예에 따른 랍도비리대 과 바이러스 검출용 키트의 구성을 개략적으로 나타낸 도이다.
도 5는 일 구체예에 따른 랍도비리대 과 바이러스 검출용 키트의 검출 원리를 개략적으로 나타낸 도이다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 랍도비리대 과 바이러스 검출용 단일 클론 항체의 제조
1-1. 면역원의 제조
pan-Rhabdoviridae 항체의 제조를 위한 면역용 항원은 VHS 바이러스 (VHSV)를 이용하였으며, 초고속원심분리기를 이용하여 바이러스 배양액에서 바이러스를 순수 분리한 후, 다음과 같이 면역원을 제작하였다. 1차 면역에 사용하는 면역원은 Complete Freud's Adjuvant (Sigma사)를 1:1로 현탁하여 제조하였고, 2차-4차 면역에 사용하는 면역원은 Incomplete Freud's Adjuvant (Sigma사)를 1:1로 현탁하여 제조하였다.
1-2. 면역
상기의 방법으로 제조된 면역원을 BALB/c 마우스, 6주령, 암컷에 다음과 같이 면역하였다. 200ul/마리의 양으로 1주 간격으로 4회 복강 주사하고, 마지막 복강 주사로부터 일주일 후, 동일 항원을 인산염완충용액 (Phosphate buffered saline, 이하 - PBS) 에 20% 농도(v/v)로 희석하여 1일 간격으로 3회 꼬리 정맥에 20㎕/회 주사하였다. 3차 정맥 주사 후, 꼬리 정맥으로부터 채취한 혈청으로 중간 역가 검사를 실시하였다. 상기의 결과에 따라, 항체의 양이 충분하게 얻어지는 마우스를 선별하여 세포 융합과정을 실시하였다.
1-3. 하이브리도마 세포주의 제작
VHSV 면역 후 항체가 생성된 마우스의 비장 세포를 떼어 70um 구멍 크기의 세포 strainer (BD falcon사)를 통해 걸러내었다. 걸러진 비장세포를 원심분리하여 침전물을 획득하고 적혈구 용해 버퍼 (Red blood cell lysis buffer, Sigma사)를 5ml 섞어준 뒤, 1분간 방치하여 적혈구를 제거하였다. 적혈구가 제거된 비장세포를 DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium, Gibco사)에 넣어 3회 세척하고 세포 카운팅을 실시하였다. 비장세포와 융합시킬 세포로는 마우스 유래 골수종 세포인 SP2/0-Ag 14(ATCC CRL-1581) 세포주를 사용하였으며, 혼합 비율이 10:1 (비장세포 : SP2/0)이 되도록 섞어주었다. 혼합된 세포를 DMEM으로 2회 세척한 후, PEG1500 (Roche사)를 사용하여 이들 세포를 융합하였다. 세포 융합은 PEG1500을 1분간 1.7ml 점적, 30초간 정치, DMEM 1분간 1ml 점적, 30초간 정치, DEME 1분간 2ml 점적, DMEM 30초간 6ml 점적, 30초간 정치 후, 마지막으로 DMEM을 30초간 10ml 점적하여 실시되었다. 융합이 완료된 세포를 원심분리하여 침전물을 획득하고 HAT (Gibco사), 항생제 (Gibco사), 및 소태아혈청 (Fetal bovine serum, Hyclone사)이 10% 첨가된 DMEM ('HAT 배지'로 명명함.)과 잘 섞어준 뒤, 200 ㎕/well의 용량으로 96-웰 조직 배양플레이트에 분주하고 3일간 배양기에서 성장시켰다.
1-4. 세포 배양
융합이 완료된 세포주는 37℃, 5% 탄산가스, 가습 조건이 유지되는 세포배양기에서 성장시켰으며, 2일 간격으로 일주일 간 HAT 배지를 교체하여 융합된 세포주를 선별하였다.
1-5. 단일클론 항체를 생산하는 하이브리도마 세포의 선별
HAT 배지로 선별이 완료된 세포주는 효소연결면역흡광도분석법 (Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)을 통해 양성 클론들을 선별하였다. 구체적으로, 96-웰 조직 배양플레이트 각각의 웰에서 자라고 있는 융합된 세포주 배양액을 순수 분리한 바이러스 VHSV 항원이 2.5ug/ml의 농도로 코팅된 96-웰 흡착 플레이트 (Costar사)에 100㎕/well의 용량으로 분주하고 37℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 1시간 동안 반응시킨 후, 5회 세척하고 항 마우스 IgG HRP 콘주게이트와 항 마우스 IgM HRP 콘주게이트를 100㎕/well의 용량으로 분주하고 37℃에서 30분간 반응시켰다. 30분 동안 반응시킨후, 5회 세척하고 기질액을 100㎕/well의 용량으로 분주하여 15분간 발색반응시키고 100㎕/well 용량의 반응정지액을 첨가하였다. 반응을 정지시킨 후 판독기에서 450nm 파장으로 흡광도를 측정하여 높은 수치를 나타내는 양성클론 VHSV 3A #2, VHSV 3A #64 클론을 선별하였다. 선별된 양성클론을 24-웰 조직 배양플레이트로 옮긴 뒤, 3일간 배양하고 위와 동일한 방법으로 2차 검색하여 즉, 반복 선별을 통해 얻은 하이브리도마 세포주를 제한 희석 (limiting dilution)하여 최종적으로 분류학상으로 Mononegavirales 목, Rhabdoviridae 과 에 속하는 IHNV, VHSV 두 종류의 바이러스 등에 공통으로 반응하는 단일 양성 클론 pan-Rhabdoviridae 3A #2, pan-Rhabdoviridae 3A #64 을 선별하였다 (상기 최종 선별된 단일클론 항체를 mAb anti-pan-Rhabdoviridae 3A #2, mAb anti-pan-Rhabdoviridae 3A #64로 명명함.).
1-6. 마우스 복수액 채취
최종 선별된 양성클론은 T75 (SPL사) 배양접시로 옮긴 뒤, 3일간 배양하였다. 이후, 1×106 cell/ml의 세포 밀도로 0.5ml씩 마우스의 복강에 주사한 뒤, 일주일 후 복수액을 채취하였다.
1-7. 항체 정제
상기 방법을 통하여 얻어낸 마우스 복수액은 원심분리 (3000rpm, 10분, 4℃)를 통해 부유물을 침전시키고, 상층액을 결합 버퍼 (Binding buffer, Thermo scientific사)와 1:1 비율로 섞어준 뒤 상온에서 1시간 동안 반응시켰다. 1시간 후 원심분리 (3000rpm, 10분, 4℃)를 통해 다시 한번 부유물을 침전시키고, 1.2 um 구멍크기를 가지는 필터를 사용하여 침전되지 않은 부유물을 재차 걸러내었다. 부유물이 완전히 제거된 복수액은 Protein G 레진 (Pierce사)이 들어있는 컬럼에 넣어, 항체와 Protein G 간의 결합을 유도하였다. 복수액을 컬럼에 모두 통과시킨 후 인산염완충용액으로 3회 세척한 뒤 용출버퍼 (Elution buffer, Thermo scientific사)을 사용하여 용출시켰다. 용출된 항체는 다시 PD-10 컬럼 (GE heathcare사)에 적용하고 인산염완충용액으로 용출시켜 최종 정제하였다.
실시예 2. 랍도비리대 과 바이러스의 검출 실험
2-1. 랍도비리대 과 바이러스 검출용 키트의 제조
상기 제조된 mAb anti-pan-Rhabdoviridae 3A #2를 도 3에 도시한 키트의 검출 영역 (T)에 고정화시켰다. 한편, mAb anti-pan-Rhabdoviridae 3A #64는 다음과 같은 방법으로 골드 입자와 접합시켜 검출 용액을 제조하였다. 우선, Gold chloride를 0.01%로 증류수에 용해한 뒤, 0.1% sodium citrate 용액을 첨가하면서 약 10분간 가열한 후, 냉각하여 냉장 보관하였다. 이후, mAb anti-pan-Rhabdoviridae 3A #64가 최종 20㎍/㎖의 농도가 되도록 콜로이드 골드용액에 10분간 반응시켜 접합반응을 유도하였다. 골드 입자를 안정화시킨 후, 10,000g에서 30분간 원심하여 침전을 생성시켰다. 상기 침전물을 다시 생리 식염수에 용해시키고 0.45㎛여과기로 여과한 뒤, 540nm에서 흡광도를 측정하여 최종 20이 되도록 희석하였다. 이후, 상기 용액을 도 3에 도시한 키트의 저장 패드 (2)에 첨가하였다.
2-2. VHSV의 검출
상기 실시예 2-1에서 제조된 키트를 사용하여 바이러스성 출혈성 패혈증 바이러스를 검출하였으며, 검체로는 TCID50이 측정된 VHSV (8.08 ×106 TCID50/ml) 배양액 및 이의 희석액이 사용되었다. 실험 결과는 하기 표 1 및 도 1에 나타낸 바와 같다.
VHSV Ag
NO Virus titer Dilution Color scale(%)
1 8.08 × 106 TCID50/ml 20 40
2 4.04 ×106 TCID50/ml 2-1 16
3 2.02 ×106 TCID50/ml 2-2 10
4 1.01 ×106 TCID50/ml 2-3 7
5 5.05 × 105 TCID50/ml 2-4 3
6 2.52 × 105 TCID50/ml 2-5 1
7 1.26 ×105 TCID50/ml 2-6 ±
8 0.63 × 105 TCID50/ml 2-7 -
9 0.31 × 105 TCID50/ml 2-8 -
10 Buffer (Control) 0 0
상기 한 바와 같이, 랍도비리대 과 바이러스 검출용 키트를 사용하여 검출한 결과, 음성 검체 (Control, #10)의 경우 밴드가 전혀 검출되지 않았던 반면, 2.52 ×105 TCID50/ml 이상의 바이러스 역가 (Virus titer) 부터는 바이러스의 검출을 나타내는 밴드가 확인되었다.
2-3. IHNV의 검출
상기 실시예 2-1에서 제조된 키트를 사용하여 전염성 조혈기 괴사 바이러스 를 검출하였으며, 검체로는 TCID50이 측정된 IHNV (9.79×106 TCID50/ml) 배양액 및 이의 희석액이 사용되었다. 실험 결과는 하기 표 2 및 도 2에 나타낸 바와 같다.
IHNV Ag
NO Virus titer Dilution Color scale(%)
11 9.79 × 106 TCID50/ml 20 3
12 4.89 × 106 TCID50/ml 2-1 1
13 2.44 × 106 TCID50/ml 2-2 ±
14 1.22 × 106 TCID50/ml 2-3 -
15 6.11 × 105 TCID50/ml 2-4 -
16 3.05 ×105 TCID50/ml 2-5 -
17 1.52 × 105 TCID50/ml 2-6 -
18 0.76 × 105 TCID50/ml 2-7 -
19 0.38 × 105 TCID50/ml 2-8 -
20 Buffer (Control) 0 0
상기 한 바와 같이, 랍도비리대 과 바이러스 검출용 키트를 사용하여 검출한 결과, 음성 검체 (Control, #20)의 경우 밴드가 전혀 검출되지 않았던 반면, 4.89 ×105 TCID50/ml 이상의 바이러스 역가 (Virus titer) 부터는 바이러스의 검출을 나타내는 밴드가 확인되었다.
2-4. 랍도비리대 과 바이러스에 대한 반응성 확인
상기 실시예 2-1에서 제조된 키트를 사용하여, 상기 항체의 랍도비리대 과 바이러스에 대한 반응성을 확인하였다. 반응성 여부를 확인하기 위한 검체로는 바이러스성 출혈성 패혈증 바이러스, 전염성 조혈기 괴사 바이러스, 및 히라메 랍도바이러스 (Hirame rhabdovirus: HIRRV)를 사용하였다.
그 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이, 랍도비리대 과 바이러스 검출용 키트는 VHSV, IHNV, 및 HIRRV인 총 3종의 바이러스 모두와 항원-항체 반응을 하여, 손쉽게 검출할 수 있음을 확인할 수 있었다.

Claims (11)

  1. 바이러스성 출혈성 패혈증 바이러스 (Viral haemorrhagic septicemia virus: VHSV)와 특이적으로 결합하는, 랍도비리대 과 (Rhabdoviridae family) 바이러스 감염증 진단용 항체.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 랍도비리대 과 바이러스는 바이러스성 출혈성 패혈증 바이러스, 전염성 조혈기 괴사 바이러스 (Infectious hematopoietic necrosis virus: IHNV), 히라메 랍도바이러스 (Hirame rhabdovirus: HIRRV), 및 이의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인, 항체.
  3. 청구항 1에 있어서, 상기 항체는 단일클론 항체인 것인, 항체.
  4. 청구항 1의 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는, 개체의 랍도비리대 과 바이러스 감염증 진단용 조성물.
  5. 청구항 4에 있어서, 상기 개체는 어류인 것인, 진단용 조성물.
  6. 청구항 1의 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는, 개체의 랍도비리대 과 바이러스 감염증 진단용 키트.
  7. 청구항 6에 있어서, 상기 개체는 어류인 것인, 진단용 키트.
  8. 청구항 1의 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 개체로부터 분리된 시료를 접촉시키는 단계; 및
    상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편과의 결합에 의해 형성된 복합체를 검출하는 단계를 포함하는, 랍도비리대 과 바이러스를 검출하는 방법.
  9. 청구항 8에 있어서, 상기 개체는 어류인 것인, 랍도비리대 과 바이러스를 검출하는 방법.
  10. 청구항 8에 있어서, 상기 시료는, 장기 유래 조직 시료인 것인, 랍도비리대 과 바이러스를 검출하는 방법.
  11. 청구항 8에 있어서, 상기 랍도비리대 과 바이러스는 바이러스성 출혈성 패혈증 바이러스, 전염성 조혈기 괴사 바이러스, 히라메 랍도바이러스, 및 이의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인, 랍도비리대 과 바이러스를 검출하는 방법.
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