JP2011232361A - 動物において早期腎疾患を検出する方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】早期の腎疾患を検出する方法であって、(a)動物からサンプルを獲得する工程;および(b)該サンプル中のアルブミン量を決定する工程、を包含し、ここで、該サンプルの比重が1.010g/mlに対して正規化される場合、該サンプル中の10μg/ml〜300μg/mlの範囲のアルブミン量が、早期の腎疾患を示す、方法であって、該動物は、ネコ、イヌ、ウマまたはウシである、方法。
【選択図】なし
Description
本発明は、動物における早期腎疾患の検出に関し、より具体的には、早期腎疾患のマーカーとしてのミクロアルブミン尿症(microalbuminuria)の使用に関する。
糸球体疾患は、腎不全および死を導き得る多数の腎疾患を説明するために使用される広い用語である。糸球体に対する損傷は、タンパク質(例えば、アルブミン)に対する毛細管透過率を増大させ、尿中のタンパク質の存在を生じる(蛋白尿という)。
(1) 早期の腎疾患を検出する方法であって:
(a)動物からサンプルを獲得する工程;および
(b)該サンプル中のアルブミン量を決定する工程、
を包含し、ここで、該サンプルの比重が1.010g/mlに対して正規化される場合、該サンプル中の約10μg/ml〜約300μg/mlの範囲のアルブミン量が、早期の腎疾患を示す、方法。
(2) 後期段階の腎疾患の発達する危険のある動物を同定する方法であって:
(a)該動物からサンプルを獲得する工程;および
(b)該サンプル中のアルブミン量を決定する工程、
を包含し、ここで、該サンプルの比重が1.010に対して正規化される場合、該サンプル中の約10μg/ml〜約300μg/mlの範囲のアルブミン量が、その動物が後期段階の腎疾患の危険にあることを示す、方法。
(3) 項目1に記載の方法に従って早期の腎疾患を検出するための手段を備える、キット。
(4) 項目2に記載の方法に従って早期の腎疾患を検出するための手段を備える、キット。
(5) キットであって:
(a)動物アルブミンに選択的に結合するアルブミン結合化合物;および
(b)動物から収集されたサンプル中のアルブミン量を検出するための手段、
を備え、ここで、該アルブミン量が約10μg/ml〜約50μg/mlの範囲である場合、該手段は該サンプル中のアルブミンを検出する、キット。
(6) 項目3に記載のキットであって:および
(a)動物アルブミンに選択的に結合するアルブミン結合化合物;
(b)該サンプルの比重が1.010g/mlに対して正規化される場合に該アルブミン量が10μg/ml〜300μg/mlの範囲である場合、該サンプル中のアルブミン量を評価するための手段、
を備える、キット。
(7) 項目4に記載のキットであって:および
(a)動物アルブミンに選択的に結合するアルブミン結合化合物;
(b)該サンプルの比重が1.010g/mlに対して正規化される場合に該アルブミン量が10μg/ml〜300μg/mlの範囲である場合、該サンプル中のアルブミン量を評価するための手段、
を備える、キット。
(8) イヌ、ネコ、およびウマからなる群より選択される動物種のアルブミンに選択的に結合する単離されたモノクローナル抗体。
(9) イヌ、ネコ、およびウマからなる群より選択される動物のアルブミンに選択的に結合する抗体を産生する培養細胞。
(10) 前記サンプル中のアルブミン量が:
(a)該サンプルをアルブミン結合化合物と接触させてアルブミン−化合物複合体を形成し;
(b)該アルブミン−化合物複合体を検出し;そして
(c)検出される該アルブミン−化合物複合体の量から、該サンプル中に存在するアルブミン量を評価すること、
により決定される、項目1、2、3、4、5、6、または7に記載の発明。
(11) 前記アルブミン結合化合物が、抗アルブミン抗体である、項目10に記載の発明。
(12) 前記アルブミン結合化合物が、イヌ、ネコ、およびウマからなる群より選択される動物由来のアルブミンを認識する抗アルブミン抗体である、項目10に記載の発明。
(13) 前記サンプル中のアルブミン量が、酵素連結イムノアッセイ、ラジオイムノアッセイ、蛍光イムノアッセイ、化学発光アッセイ、ラテラルフローアッセイ、ディプスティックアッセイ、凝集アッセイ、粒子ベースのアッセイ、免疫沈降アッセイ、イムノドットアッセイ、イムノブロットアッセイ、免疫拡散アッセイ、リン光アッセイ、フロー−スルーアッセイ、クロマトグラフィーアッセイ、PAGeベースのアッセイ、電気的検知アッセイ、表面プラスモン共鳴アッセイ、および蛍光相関分光アッセイからなる群より選択されるアッセイを用いて決定される、項目1、2、3、4、5、6、または7に記載の発明。
(14) 前記サンプル中のアルブミン量が、酵素連結イムノソルベント検定法(ELISA)を用いて決定される、項目1、2、3、4、5、6、または7に記載の発明。
(15) 前記サンプル中のアルブミン量が、単回工程アッセイを用いて決定される、項目1、2、3、4、5、6、または7に記載の発明。
(16) 前記サンプル中のアルブミン量が、ディップスティックベースのアッセイを用いて決定される、項目1、2、3、4、5、6、または7に記載の発明。
(17) 前記アルブミン量が、該アルブミン量が約10μg/ml〜約25μg/mlの範囲である場合に前記サンプル中のアルブミンを検出するアッセイを用いて決定される、項目1、2、3、4、5、6、または7に記載の発明。
(18) 前記アルブミン量が、該アルブミン量が約50μg/mlである場合に前記サンプル中のアルブミンを検出するアッセイを用いて決定される、項目1、2、3、4、5、6、または7に記載の発明。
(19) 前記アルブミン量が、該アルブミン量が約25μg/mlである場合に前記サンプル中のアルブミンを検出するアッセイを用いて決定される、項目1、2、3、4、5、6、または7に記載の発明。
(20) 前記アルブミン量が、該アルブミン量が約10μg/mlである場合に前記サンプル中のアルブミンを検出するアッセイを用いて決定される、項目1、2、3、4、5、6、または7に記載の発明。
(21) 前記動物が、イヌ、ネコ、およびウマからなる群より選択される、項目1、2、3、4、5、6、または7に記載の発明。
(22) 前記動物がイヌである、項目1、2、3、4、5、6、または7に記載の発明。
(23) 前記動物がネコである、項目1、2、3、4、5、6、または7に記載の発明。
(24) 前記動物がウマである、項目1、2、3、4、5、6、または7に記載の発明。
(25) 前記サンプルが、糸球体からのアルブミンの漏出を測定するのに有用な体液である、請求項1、2、3、4、5、6、または7に記載の発明。
(26) 前記サンプルが尿である、項目1、2、3、4、5、6、または7に記載の発明。
(27) 前記サンプルが、アルブミン量を決定する前に前処理される、項目1、2、3、4、5、6、または7に記載の発明。
(28) 前記サンプルが、比重を調節することにより前処理される、項目1、2、3、4、5、6、または7に記載の発明。
(29) 前記サンプルが、比重を1.010g/mlに調節することにより前処理される、項目1、2、3、4、5、6、または7に記載の発明。
(30) 前記アルブミン量が、単回工程アッセイを用いて決定される、項目1、2、3、4、5、6、または7に記載の発明。
(31) 前記アルブミン量が、ディップスティックアッセイまたはELISAアッセイを用いて決定される、項目1、2、3、4、5、6、または7に記載の発明。
(32) 前記抗体が、H352、H386、H387、H388、H389、H390、H391、H393、H394、H395、H396、H397、H398、H399、H400、H401、およびH402からなる群より選択される抗体のアルブミンに対する選択的結合を阻害する、項目8または9に記載の抗体。
(33) 前記抗体が、H352、H386、H387、H388、H389、H390、H391、H393、H394、H395、H396、H397、H398、H399、H400、H401、およびH402からなる群より選択される抗体により認識される同一のエピトープに結合する、項目8または9に記載の抗体。
(34) 前記抗体が、H352、H386、H387、H388、H389、H390、H391、H393、H394、H395、H396、H397、H398、H399、H400、H401、およびH402からなる群より選択される、項目8または9に記載の単離
された抗体。
(発明の要旨)
本発明は、動物において早期腎疾患を検出するための方法およびキットに関する。早期腎疾患について試験される好ましい動物は、コンパニオン動物であり、イヌ、ネコおよびウマが最も好ましい。本明細書中に開示される方法およびキットの実施形態は、動物由来のサンプル中の、10μg/ml〜300μg/mlの範囲のアルブミンの存在が、早期腎疾患を示すとして使用され得るという発見に基づく。試験される最も好ましいサンプルは尿であるが、糸球体からのアルブミンの漏出を測定するために有用な任意のサンプルが使用され得る。アルブミンを検出し得る任意のアッセイが、本発明の方法およびキットにおいて使用され得るが、好ましい方法およびキットは、免疫学ベースのアッセイ、特に一工程アッセイを使用する。最も好ましいアッセイは、抗アルブミン抗体を使用する、免疫学ベースのアッセイである。
本発明は一般に、動物における早期腎疾患を検出する新規方法に関し、そして1種以上の動物種由来のアルブミンに選択的に結合する新規抗体に関する。より具体的には、本発明は、ミクロアルブミン尿症の存在が、動物における早期腎疾患、特に免疫媒介性の腎疾患を予測するために使用され得るという発見に関する。従って、この方法はまた、動物についての処置を処方するために有用であり得る。適切な処置は、後期腎疾患の発症を遅延または予防するために設計され得る。このような処置の例としては、例えば、薬理学的改変または食事改変が挙げられる。本発明はまた、処方された処置の有効性をモニタリングする際に有用である。
(a)動物からサンプルを獲得する工程;および
(b)このサンプル中のアルブミンの量を決定する工程。
このサンプル中の約10μg/ml〜約300μg/mlの範囲のアルブミンの量が、早期腎疾患を示す。
and Newman,D編、Principles and Practice of Immunoassay、第2版(1997)Stockton Press,NY,NY(これらの両方はその全体が参考として本明細書中に援用される)を参照のこと。
(正常なCRFイヌおよびARFイヌにおけるミクロアルブミン尿症の測定)
尿サンプルを、Colorado State University Teaching Hospitalにおいて134匹のイヌ被験体から収集した。これらのサンプルは、正常なイヌ由来の尿、慢性腎不全に罹患するイヌ由来の尿、急性腎不全に罹患するイヌ由来の尿、および腎不全を有さない蛋白尿イヌ由来の尿を含んだ。サンプルを、−20℃で少なくとも24時間凍結し、その後、使用前に解凍した。アルブミンレベルを、McDonald,Weber & Thiele、「Construction and Use of a Template Block for Radial Immunodiffusion」Anal Biochem 186:165−168(1990)に記載されるように、市販の抗アルブミン抗体(ポリクローナルウサギ抗イヌアルブミン(Accurate Chemical and Scientific Corp.,Westbury,N.Y.によって配給されるNordic Immunologyから入手可能)を用いて、微量放射免疫拡散アッセイ(microradial immunodiffusion assay)によって定量した。このアッセイに関して、1.5%(vol/vol)の抗体を、PBS中の溶解した0.75%(wt/vol)EEOアガロースに添加した。0.75mmの厚みのゲルを、2枚のガラスプレート間に注いだ。ゲルを固形化し、そして、一方のガラスプレートを取り外した後、ゲルをわずかに乾燥させた。アクリルブロック(McDonaldら(前出)に記載される)を、アガロースゲル上に配置し、そして5μlのサンプルまたは標準物質を、そのアクリルブロックの各ウェルに配置した。サンプルを希釈せずに泳動するか、または生じる環が測定するには大きすぎる場合は、サンプルを希釈して再度試験した。イヌアルブミンを用いた標準曲線(Sigma,St.Louis,MOから入手可能なイヌアルブミン画分V)は、10〜100μg/mlの範囲内で直線状であった。アクリルブロックをアガロース上に残し、そしてそのユニットを、湿潤チャンバに配置し、室温で一晩インキュベートした。次いで、アガロースゲルを希釈水に数時間浸漬して、過剰なタンパク質をゲルから除去し、ゲルを乾燥させ、次いで、沈降素環が容易に可視化され得るようにクマシーブリリアントブルーを用いて染色した。各環の直径を測定し、そして各サンプルからの環の直径を標準曲線と比較し、そして各サンプルのアルブミン濃度を計算した。
(ミクロアルブミン尿症のELISA定量)
ウサギ抗イヌ血清アルブミンIgG(抗CSA IgG)をコーティング緩衝液(50mM Na2CO2/NaCHO3、pH9.6)中で375ng/mlに希釈する。この希釈した抗CSA IgG溶液を、MaxiSorpTM C8 Break−apart Microwells(Nuncカタログ番号473768)のプレートに100μl/ウェルで添加し、被覆し、そして一晩(16〜24時間)4℃でインキュベートする。このプレートを0.05% Tween20を含むリン酸緩衝化生理食塩水(PBS−T)を用いて自動プレート洗浄器中で4回洗浄し、ドライブロット(blot dry)した。ブロッキング緩衝液(StabilCoatTM(Surmodicsカタログ番号SC01−1000から入手可能))を200μl/ウェルで添加し、被覆し、そして室温で少なくとも1時間インキュベートする。
(イヌ尿における微量蛋白尿検出用ImmunoDipTMスティックの使用)
ヒトにおける微量蛋白尿検出用の3つのImmunoDipTMスティック(製品番号
700−01)を、Diagnostic Chemicals Limited,Charlottetown,Prince Edward Island,Canadaから得た。2つのイヌ尿サンプル(1086および1098と番号付けた)を、Colorado State University Veterinary Teaching Hospital,Fort Collins,Coloradoのイヌから得た一群のサンプルから選択した。サンプル1086および1098は、イヌにおける微量蛋白尿を検出するためのインハウスELISAにより決定したそれらのアルブミンレベルに基づいて、選択した。サンプル1086は、陰性サンプルであり、サンプル1098は、アルブミン濃度221μg/mlを有した。陽性コントロールとして、約50μlのヒト血液を、5mlの脱イオン水に添加した。
(イヌ尿における微量蛋白尿検出用Micral(登録商標)試験片の使用)
ヒトにおける微量蛋白尿検出用の14個のMicral(登録商標)尿試験片(製品番号417146)を、Roche BMC,Indianapolis,Indianaから得た。13個のイヌ尿サンプルを、従業員のイヌから得た一群のサンプルから選択した。使用のためのサンプルは、イヌにおける微量蛋白尿を検出するためのインハウスELSIAにより決定したそれらのアルブミンレベルに基づいて、選択した。サンプル2A、4A、および16Aは、陰性サンプルであったが、残りのサンプルは、31.3μg/ml〜>650μg/mlの値の範囲のアルブミン濃度を有した。陽性コントロールとして、50μlのヒト血液を、5mlの脱イオン水に添加した。
(イヌ尿における微量蛋白尿検出用ImmunoDipTMスティックの使用)
ヒトにおける微量蛋白尿検出用の14個のImmunoDipTMスティック(製品番号700−01)を、Diagnostic Chemicals Limited,Charlottetown,PE,Canadaから得た。13個のイヌ尿サンプルを、見かけ上正常であるイヌから得た一群のサンプルから選択した。使用のためのサンプルは、イヌにおける微量蛋白尿を検出するためのインハウスELISAにより決定したそれらのアルブミンレベルに基づいて、選択した。サンプル2A、4Aおよび16Aは、陰性サンプルであったが、残りのサンプルは、31.3μg/ml〜>650μg/mlの値の範囲のアルブミン濃度を有した。陽性コントロールとして、50μlのヒト血液を、5mlの脱イオン水に添加した。
(イヌ尿における微量蛋白尿検出用Micral(登録商標)試験片の使用)
ヒトにおける微量蛋白尿検出用の5個のMicral(登録商標)尿試験片(製品番号417146)を、Roche BMC,Indianapolis,Indianaから得た。13個のイヌ尿サンプルを、見かけ上正常であるイヌから得た一群のサンプルから選択した。使用のためのサンプルは、イヌにおける微量蛋白尿を検出するためのインハウスELSIAにより決定したそれらのアルブミンレベルに基づいて、選択した。サンプル7および12は、陰性サンプルであったが、サンプル14および25は、それぞれ、621μg/mlおよび>650μg/mlのアルブミンレベルを有した。陽性コントロールとして、50μlのヒト血液を、5mlの脱イオン水に添加した。
(イヌにおける微量蛋白尿の有病率)
この研究のために、2つの別個の集団を試験した。1つのサンプル集団は、臨床的に正常なイヌ(n=86)に由来した。第2のサンプル集団は、慣用的健康スクリーニング、選択手順、および健康問題評価について示された、Colorado State University Teaching Hospitalの患者(n=150)に由来した。抗原捕捉ELISAを使用して、微量蛋白尿を定量した。この測定の結果を、比重1.010に正規化して、種々の尿濃度を計算に入れた。この病院の患者の尿中のアルブミンをまた、Petstix 8TM尿タンパク質試験片(Idexxカタログ番号98−06959−00)を使用して試験した。
この実施例は、イヌ血清アルブミンを生成するための方法を開示する。イヌ血清を、50%(重量/体積)硫酸アンモニウムに調節し、そしてその溶液を4℃にて3時間振動させ、そして10,000×gで30分間の遠心分離によって不溶性物質を沈殿させた。その上清を取り出し、25mM Tris(pH8.0)中に透析した。その可溶性物質を、予め平衡化したHi−Trap Q−Sepharoseカラム(Pharmacia,Peapack,NJ)上にローディングし、そして25カラム体積(CV)に対する直線勾配0〜1.0M NaClを使用して、タンパク質を溶出した。収集した画分を、SDS−PAGEによって分析し、そしてイヌアルブミンを含む画分をプールし、そして必要になるまで保存した。この方法を使用して、414mgのアルブミンを、20mlのイヌ血清から精製した。タンパク質配列決定によって、その精製タンパク質がイヌアルブミンであることを確認した。
(抗イヌアルブミン抗体の生成)
この実施例は、イヌ血清アルブミン(CSA)を認識するモノクローナル抗体(Mab)であるTNB1、TNB2、TNB3、TNB4、TNB5、TNB6を生成するために使用される方法を開示する。
この実施例は、サブトラクティブハイブリダイゼーション技術を利用して、イヌ血清アルブミン(CSA)を認識するモノクローナル抗体(Mab)を作製する手順を開示する。
この実施例は、抗イヌ血清アルブミン(CSA)抗体がCSAを検出する能力を試験するための固相ELISAの使用を開示する。
Tween−20含有PBS中の0.1% カゼイン)を各ウェルに添加した。このプレートを室温(RT)にて30分間インキュベートし、その後、そのブロッキング緩衝液を除去し、50μlのハイブリドーマ上清(ブロッキング緩衝液中で希釈するか、希釈しないかのいずれか)を各ウェルに添加した。RTにて1時間インキュベートした後、そのウェルを、洗浄緩衝液(0.05% Tween−20含有PBS)を使用して洗浄し、50μlのHRP結合体化ヤギ抗マウスIgGおよびIgM(KPL Labs,Gaithersburg,MDから入手可能)を各ウェルに添加し、そのプレートをRTにて30分間インキュベートした。そのウェルを洗浄緩衝液で2回洗浄し、50μlのTMB Substrate System (KPL Labsから入手可能)を各ウェルに添加した。このプレートを、RTにて10分間インキュベートし、その後、50μlの2N スルホン酸を各ウェルに添加することにより、反応を停止させた。ELISAプレートリーダーを使用して450nMにてこのプレートを読み取り、その結果を、以下の表7に示す。
この実施例は、ウェルを、ウシ血清アルブミン(BSA)、イヌ血清アルブミン(CSA)、ウマ血清アルブミン(HSA)またはヒト血清アルブミン(HuSA)アルブミンを3×段階希釈液(5μg/ml〜0.002g/ml)でコーティングしたことを除いて、実施例11に概説したプロトコルを使用したELISAにより、3種類の抗イヌアルブミンモノクローナルAbが示されたアルブミンを認識する能力を実証する。さらに、10μgの示された抗体を、各ウェルにて使用した。この結果を、表8に示す。
(実施例13:抗アルブミンmAb H402、TNB3およびTNB6を使用する競合ELISA)
この実施例は、H402モノクローナル抗体、TNB3モノクローナル抗体およびTNB6モノクローナル抗体が、イヌ血清アルブミン(CSA)への結合について競合する能力を比較する。抗体間の競合を、ELISAプレート全体をCSAでコーティングし、標識一次抗体をこのプレートのウェル全てに添加し、次いで、いくつかの非標識抗体がCSAへの結合について一次抗体と競合する能力を測定することにより、測定した(全ての一次抗体を、Pierce Chemical,Rockford,ILから入手可能なビオチンを使用して、製造業者の指示に従って標識した)。このようにして、各プレートを
使用して、単一の一次抗体がCSAに結合する能力について2つの他の抗アルブミン抗体と競合する能力を試験した。さらに、ヒト高親和性IgEレセプターα鎖(抗FceRIα)の細胞外ドメインに対して惹起された抗体を、各プレートに対してネガティブコントロールとして使用した。アッセイの詳細は、以下のとおりである。
この実施例は、3種類の抗アルブミン抗体(H352、H398およびTNB3)がイヌアルブミン(CSA)またはネコアルブミン(FSA)に結合する能力を比較する。
この実施例は、イヌDirofilaria immitis誘導性ネフロパシーに存在するアルブミンレベルを開示する。このモデルにおいて、動物に、Grauer,G.F.ら,American Journal or Tropical Medicine and Hygiene;39(4),1988,p380−387に記載されるように、抗原−抗体複合体に起因した腎損傷を生じるD.immitisを感染させ、糸球体損傷を誘導した。このモデルにおいて、感染の約7ヵ月後に、D.immitis抗原が血液中に存在することは公知である。この実施例に関しては、動物にD.immitisを感染させ、カテーテル挿入により1ヶ月に1回尿サンプルを回収した。いくつかの場合には、カテーテル挿入のプロセスが、上昇したアルブミンレベルを招き得ることに注意のこと;結果として、動物が、2つの連続したサンプル中でミクロアルブミン尿症(microalbuminuric)であることが分かった場合は、ミクロアルブミン尿症(microalbuminuria)について陽性と判断されるのみである。各サンプル中のアルブミン量を、ELISAアッセイを使用して決定した。結果を、以下の表11に示す。N/Aと表示したボックスは、サンプルが利用可能でなかったことを示す。
この実施例は、ミクロアルブミン尿症(MA)のレベルと、腎疾患について一般的に使用されているマーカー(尿タンパク質/クレアチニン(UP/C)比)とを遺伝性腎炎(HD)に罹患した動物において経時的に比較する。このモデルにおいて、動物は、Lee,GE,American Journal of Veterinary Research,1999:60,p373−383に記載されるように、動物の寿命の間に腎疾患の急速な発症を生じる遺伝的欠損を有する。この実施例において、正常なイヌの集団(colony)およびHDに罹患したイヌの集団から、尿を定期的に回収した。各サンプル中のアルブミン量を、ELISAアッセイを使用して決定した。さらに、尿タンパク質/クレアチニン(UP/C)比を、獣医関係の実験室を使用して決定した。この測定により、腎疾患は、UP/C比が1.0より大きい場合に存在すると考えられる。この研究の結果を、以下の表12に示す。
Claims (1)
- 本明細書に記載される発明。
Applications Claiming Priority (4)
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---|---|---|---|
US27939101P | 2001-03-28 | 2001-03-28 | |
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