JPH0968531A - 免疫測定法 - Google Patents
免疫測定法Info
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- JPH0968531A JPH0968531A JP7248524A JP24852495A JPH0968531A JP H0968531 A JPH0968531 A JP H0968531A JP 7248524 A JP7248524 A JP 7248524A JP 24852495 A JP24852495 A JP 24852495A JP H0968531 A JPH0968531 A JP H0968531A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】体液中に含まれている動物ＩｇＭクラス抗体と
反応する異好性抗体の影響を受けず、正確な測定値が得
られるヘテロジーニアス酵素免疫測定法。 【解決手段】非特異的なＩｇＭクラスの抗体を免疫反応
用緩衝液に共存させる。
反応する異好性抗体の影響を受けず、正確な測定値が得
られるヘテロジーニアス酵素免疫測定法。 【解決手段】非特異的なＩｇＭクラスの抗体を免疫反応
用緩衝液に共存させる。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、免疫測定法、更に
詳しくは高精度のヘテロジーニアス酵素免疫測定法に関
する。
詳しくは高精度のヘテロジーニアス酵素免疫測定法に関
する。
【０００２】
【従来の技術】従来、生物体液中の物質を測定するため
に免疫測定法が知られている。免疫測定法の極めて重要
な方法の一つはヘテロジーニアス免疫測定法である。ヘ
テロジーニアス免疫測定法は、標識物質の種類から放射
線免疫測定法、酵素免疫測定法、蛍光免疫測定法、化学
発光免疫測定法が知られている。この中でも酵素免疫測
定法は長期の保存安定性が優れており、測定法が簡便か
つ汎用性があり、高感度であることから、近年急速に普
及している。ヘテロジーニアス酵素免疫法では、文献
［たとえば、酵素免疫測定法第２版（石川栄治ら編集、
医学書院）1982年］記載のサンドウィッチ法や競合法な
どが広く用いられている。これらの方法では、抗体また
は抗原が結合した不溶性固体と被検体液や酵素標識物質
を反応させる際、免疫反応用緩衝液を用いる。ヘテロジ
ーニアス酵素免疫測定法に用いる免疫反応緩衝液の組成
は、リン酸緩衝液などにウシ血清アルブミンや抗体など
の蛋白質、塩化ナトリウムなどの無機塩を含有させたも
のが知られている。これらの組成物に加え、非特異的吸
着を防ぐブロッカーとして非特異的な抗体や抗体修飾タ
ンパクを免疫反応用緩衝液に共存させる方法が特公平６
−３４０１３号公報に記載されている。また、体液中に
共存するリウマチ因子やＨＡＭＡなどの影響を緩和させ
るために動物血清中から分離したのＩｇＧクラスの抗体
分画やＩｇＧクラスのマウスモノクローナル抗体を免疫
反応用緩衝液に共存させる方法が知られている。
に免疫測定法が知られている。免疫測定法の極めて重要
な方法の一つはヘテロジーニアス免疫測定法である。ヘ
テロジーニアス免疫測定法は、標識物質の種類から放射
線免疫測定法、酵素免疫測定法、蛍光免疫測定法、化学
発光免疫測定法が知られている。この中でも酵素免疫測
定法は長期の保存安定性が優れており、測定法が簡便か
つ汎用性があり、高感度であることから、近年急速に普
及している。ヘテロジーニアス酵素免疫法では、文献
［たとえば、酵素免疫測定法第２版（石川栄治ら編集、
医学書院）1982年］記載のサンドウィッチ法や競合法な
どが広く用いられている。これらの方法では、抗体また
は抗原が結合した不溶性固体と被検体液や酵素標識物質
を反応させる際、免疫反応用緩衝液を用いる。ヘテロジ
ーニアス酵素免疫測定法に用いる免疫反応緩衝液の組成
は、リン酸緩衝液などにウシ血清アルブミンや抗体など
の蛋白質、塩化ナトリウムなどの無機塩を含有させたも
のが知られている。これらの組成物に加え、非特異的吸
着を防ぐブロッカーとして非特異的な抗体や抗体修飾タ
ンパクを免疫反応用緩衝液に共存させる方法が特公平６
−３４０１３号公報に記載されている。また、体液中に
共存するリウマチ因子やＨＡＭＡなどの影響を緩和させ
るために動物血清中から分離したのＩｇＧクラスの抗体
分画やＩｇＧクラスのマウスモノクローナル抗体を免疫
反応用緩衝液に共存させる方法が知られている。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】しかしながら、体液中
には動物のＩｇＭクラス抗体と反応する異好性抗体が含
まれていることがあり、従来のＩｇＭクラスモノクロー
ナル抗体を結合した不溶性固体を用いるヘテロジーニア
ス酵素免疫測定法ではＩｇＧクラスの抗体を添加しても
異好性抗体の影響を受け、正確な測定値が得られないと
いう問題が生じる。
には動物のＩｇＭクラス抗体と反応する異好性抗体が含
まれていることがあり、従来のＩｇＭクラスモノクロー
ナル抗体を結合した不溶性固体を用いるヘテロジーニア
ス酵素免疫測定法ではＩｇＧクラスの抗体を添加しても
異好性抗体の影響を受け、正確な測定値が得られないと
いう問題が生じる。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記問題
を解決すべく鋭意検討した結果、ＩｇＭクラスのモノク
ローナル抗体を結合した不溶性固体を用いるヘテロジー
ニアス酵素免疫測定法用の免疫反応用緩衝液に非特異的
なＩｇＭクラスの抗体を共存させることにより、異好性
抗体の影響を防止できることを見いだし、本発明に到達
した。
を解決すべく鋭意検討した結果、ＩｇＭクラスのモノク
ローナル抗体を結合した不溶性固体を用いるヘテロジー
ニアス酵素免疫測定法用の免疫反応用緩衝液に非特異的
なＩｇＭクラスの抗体を共存させることにより、異好性
抗体の影響を防止できることを見いだし、本発明に到達
した。
【０００５】即ち本発明は、測定の対象となる抗原性物
質を、この抗原性物質を認識するＩｇＭクラスのモノク
ローナル抗体を結合した不溶性固体を用いるヘテロジー
ニアス酵素免疫測定法で測定するに際し、免疫反応用緩
衝液中に非特異的なＩｇＭクラスの抗体を共存させるこ
とを特徴とするヘテロジーニアス酵素免疫測定法であ
る。
質を、この抗原性物質を認識するＩｇＭクラスのモノク
ローナル抗体を結合した不溶性固体を用いるヘテロジー
ニアス酵素免疫測定法で測定するに際し、免疫反応用緩
衝液中に非特異的なＩｇＭクラスの抗体を共存させるこ
とを特徴とするヘテロジーニアス酵素免疫測定法であ
る。
【０００６】本発明において測定の対象となる抗原性物
質としては、特開平２−２０５７７４号公報記載の被測
定抗原性物質があげられる。これらのうち、特に高感度
の測定系が要求されるホルモン、腫瘍関連抗原及びウイ
ルスの測定に本発明の方法は好適である。
質としては、特開平２−２０５７７４号公報記載の被測
定抗原性物質があげられる。これらのうち、特に高感度
の測定系が要求されるホルモン、腫瘍関連抗原及びウイ
ルスの測定に本発明の方法は好適である。
【０００７】抗原性物質を認識するＩｇＭクラスのモノ
クローナル抗体としては、抗原性物質で免疫した動物の
脾臓細胞とミエローマー細胞を文献に記載の方法［たと
えば、ジー・ケラー、シー・ミルスタイン;ネイチャー
(G.Kohler,C.Milstein;Natur) Vol.256,PP.495(197
5)］によって融合させた細胞が産生するＩｇＭクラスの
モノクローナル抗体を用いることができる。
クローナル抗体としては、抗原性物質で免疫した動物の
脾臓細胞とミエローマー細胞を文献に記載の方法［たと
えば、ジー・ケラー、シー・ミルスタイン;ネイチャー
(G.Kohler,C.Milstein;Natur) Vol.256,PP.495(197
5)］によって融合させた細胞が産生するＩｇＭクラスの
モノクローナル抗体を用いることができる。
【０００８】ヘテロジーニアス酵素免疫測定法として
は、文献［たとえば、酵素免疫測定法第２版（石川栄治
ら編集、医学書院）1982年］記載のサンドウィッチ法、
競合法や特開平６−１３００６３記載の測定法を用いる
ことができる。サンドウィッチ法は、被検体液中の測定
の対象となる抗原性物質に 不溶性固体と結合しており、且つこの抗原性物質を認
識する抗体 酵素により標識されており、且つこの抗原性物質を認
識する抗体 を結合させて得た免疫複合体中の酵素の活性を測定する
ことにより抗原性物質の量を測定する方法である。競合
法は、被検体液中の測定の対象となる抗原性物質に 不溶性固体と結合しており且つこの抗原性物質を認識
する抗体 酵素により標識されている抗原性物質 を結合させて得た免疫複合体中の酵素の活性を測定する
ことにより抗原性物質の量を測定する方法である。
は、文献［たとえば、酵素免疫測定法第２版（石川栄治
ら編集、医学書院）1982年］記載のサンドウィッチ法、
競合法や特開平６−１３００６３記載の測定法を用いる
ことができる。サンドウィッチ法は、被検体液中の測定
の対象となる抗原性物質に 不溶性固体と結合しており、且つこの抗原性物質を認
識する抗体 酵素により標識されており、且つこの抗原性物質を認
識する抗体 を結合させて得た免疫複合体中の酵素の活性を測定する
ことにより抗原性物質の量を測定する方法である。競合
法は、被検体液中の測定の対象となる抗原性物質に 不溶性固体と結合しており且つこの抗原性物質を認識
する抗体 酵素により標識されている抗原性物質 を結合させて得た免疫複合体中の酵素の活性を測定する
ことにより抗原性物質の量を測定する方法である。
【０００９】不溶性固体としては、特開平２−２０５７
７４号公報記載の不溶性固体があげられる。これらのう
ち好ましいものは、簡便且つ安定して抗体が結合でき、
更に、取扱いが容易なガラス（ガラスビーズ、ガラス試
験管など）、及びプラスチック（プラスチックチュー
ブ、プラスチックトレイなど）である。
７４号公報記載の不溶性固体があげられる。これらのう
ち好ましいものは、簡便且つ安定して抗体が結合でき、
更に、取扱いが容易なガラス（ガラスビーズ、ガラス試
験管など）、及びプラスチック（プラスチックチュー
ブ、プラスチックトレイなど）である。
【００１０】不溶性固体上に抗体を結合させる方法は、
特開平２−２０５７７４号公報記載の方法と同様でよ
い。即ち、ガラスとモノクローナル抗体を化学的に結合
させる方法（たとえば、米国特許第４２８０９９２号明
細書及び同第３６５２７６１号明細書）、及びプラスチ
ックに抗体を物理吸着させる方法（たとえば、イー・エ
ングバール、ジェー・ジョンソン、ピー・パールマン；
バイオキム．バイオフィス．アクタ(E.Engvall,J.Jons-
son,P.Parlmann;Biochim.Biopys.Acta),vol.251(1971)4
27〜434）がある。
特開平２−２０５７７４号公報記載の方法と同様でよ
い。即ち、ガラスとモノクローナル抗体を化学的に結合
させる方法（たとえば、米国特許第４２８０９９２号明
細書及び同第３６５２７６１号明細書）、及びプラスチ
ックに抗体を物理吸着させる方法（たとえば、イー・エ
ングバール、ジェー・ジョンソン、ピー・パールマン；
バイオキム．バイオフィス．アクタ(E.Engvall,J.Jons-
son,P.Parlmann;Biochim.Biopys.Acta),vol.251(1971)4
27〜434）がある。
【００１１】抗体に標識する酵素としては、ペルオキシ
ダーゼ、アルカリフォスファターゼ、β−ガラクトシダ
ーゼなどをあげられる。このうち好ましいものは、抗体
標識が容易で、且つ高い感度が得られるペルオキシダー
ゼである。
ダーゼ、アルカリフォスファターゼ、β−ガラクトシダ
ーゼなどをあげられる。このうち好ましいものは、抗体
標識が容易で、且つ高い感度が得られるペルオキシダー
ゼである。
【００１２】免疫反応用緩衝液としては、緩衝液（リン
酸緩衝液、トリス緩衝液、酢酸緩衝液、クエン酸緩衝
液、ホウ酸緩衝液、炭酸緩衝液など）に塩化ナトリウ
ム、無機塩類、牛血清アルブミン、カゼイン、加水分解
カゼイン、界面活性剤、防腐剤などを適量添加した溶液
を用いることができる。
酸緩衝液、トリス緩衝液、酢酸緩衝液、クエン酸緩衝
液、ホウ酸緩衝液、炭酸緩衝液など）に塩化ナトリウ
ム、無機塩類、牛血清アルブミン、カゼイン、加水分解
カゼイン、界面活性剤、防腐剤などを適量添加した溶液
を用いることができる。
【００１３】非特異的なＩｇＭクラスの抗体としては、
正常動物血清から分子量９０万の分画を硫安塩析、ゲル
ろ過クロマトグラフィーにより分離することにより得る
ことができる。正常動物血清としては、正常牛血清、正
常牛胎児血清、正常ウサギ血清、正常ウマ血清、正常マ
ウス血清、正常ヒツジ血清、正常ヤギ血清、正常ブタ血
清などを用いることができる。このうち好ましいもの
は、正常牛胎児血清、正常ウサギ血清、正常マウス血清
である。
正常動物血清から分子量９０万の分画を硫安塩析、ゲル
ろ過クロマトグラフィーにより分離することにより得る
ことができる。正常動物血清としては、正常牛血清、正
常牛胎児血清、正常ウサギ血清、正常ウマ血清、正常マ
ウス血清、正常ヒツジ血清、正常ヤギ血清、正常ブタ血
清などを用いることができる。このうち好ましいもの
は、正常牛胎児血清、正常ウサギ血清、正常マウス血清
である。
【００１４】
【実施例】以下、実施例により本発明を更に説明する
が、本発明はこれに限定されるものではない。 実施例１ 牛胎児血清の非特異的なＩｇＭクラスの抗体を含有する
免疫反応緩衝液を用いたＣＡ１９−９酵素免疫測定試薬
（サンドウィッチ法）の測定を行った。 （１）ＣＡ１９−９酵素免疫測定試薬の製造 ａ）抗ＣＡ１９−９モノクローナル抗体の製造 抗ＣＡ１９−９モノクローナル抗体は、文献［ヒラリー
・コプロスキー、ゼノン・ステプルスキー、ケネット・
ミッチェル、ミーンハード・ヘリン；ソマチック セル
ジェネッティックス（Hilary Koprowski,Zenon Stepl
ewski,KennethMitchell,Meenhard Helyn ;Somatic Cell
Genetics）Vol.5,pp.957-972(1979)］に記載の方法に
準じ次の通り製造した。ＳＷ１１１６細胞（大日本製薬
社から入手可能）1x106個をＢＡＬＢ／ｃマウスの静脈
内に投与し免疫した。１ヶ月後に再びＳＷ１１１６細胞
1x106 個を投与し３日後に脾臓を摘出して脾細胞を採
取した。ＲＰＭＩ１６４０培地にて洗浄した後、脾細胞
全量を2x107個のマウスミエローマ細胞（Ｐ３−ＮＳ１
／１−Ａｇ４．１）と混ぜ、３７℃の４２．５％ポリエ
チレングリコール１５４０および７．５％ジメチルスル
フォキシドを含むＲＰＭＩ１６４０培地１ｍｌ中で１分
間融合させた。１分後にその細胞懸濁物をＲＰＭＩ１６
４０培地５ｍｌで徐々に希釈した。それらの細胞を遠心
分離し、洗浄した後、ＨＡＴ培地（ヒポキサンチン、ア
ミノプテリン、チミジン、１０％牛胎児血清を含むＲＰ
ＭＩ１６４０培地）を２０ｍｌになるように加えて、９
６ウェル マイクロプレートに０．２ｍｌずつ分注して
２週間培養した後、増殖したウェル中の培養上清の抗体
活性を測定した。次に、活性の認められたウェルの細胞
を限界希釈法を使用して繰り返してクローン化し、Ｉｇ
Ｍクラスの抗ＣＡ１９−９モノクローナル抗体を産生す
る細胞を得た。この細胞を無血清培養液中で培養し、培
養上清液を採取した。この培養液中のモノクローナル抗
体をアフィ・ゲル・プロテインＡ ＭＡＰＳキット（バ
イオラッド社）を用いて精製単離し、以下の検討に用い
た。
が、本発明はこれに限定されるものではない。 実施例１ 牛胎児血清の非特異的なＩｇＭクラスの抗体を含有する
免疫反応緩衝液を用いたＣＡ１９−９酵素免疫測定試薬
（サンドウィッチ法）の測定を行った。 （１）ＣＡ１９−９酵素免疫測定試薬の製造 ａ）抗ＣＡ１９−９モノクローナル抗体の製造 抗ＣＡ１９−９モノクローナル抗体は、文献［ヒラリー
・コプロスキー、ゼノン・ステプルスキー、ケネット・
ミッチェル、ミーンハード・ヘリン；ソマチック セル
ジェネッティックス（Hilary Koprowski,Zenon Stepl
ewski,KennethMitchell,Meenhard Helyn ;Somatic Cell
Genetics）Vol.5,pp.957-972(1979)］に記載の方法に
準じ次の通り製造した。ＳＷ１１１６細胞（大日本製薬
社から入手可能）1x106個をＢＡＬＢ／ｃマウスの静脈
内に投与し免疫した。１ヶ月後に再びＳＷ１１１６細胞
1x106 個を投与し３日後に脾臓を摘出して脾細胞を採
取した。ＲＰＭＩ１６４０培地にて洗浄した後、脾細胞
全量を2x107個のマウスミエローマ細胞（Ｐ３−ＮＳ１
／１−Ａｇ４．１）と混ぜ、３７℃の４２．５％ポリエ
チレングリコール１５４０および７．５％ジメチルスル
フォキシドを含むＲＰＭＩ１６４０培地１ｍｌ中で１分
間融合させた。１分後にその細胞懸濁物をＲＰＭＩ１６
４０培地５ｍｌで徐々に希釈した。それらの細胞を遠心
分離し、洗浄した後、ＨＡＴ培地（ヒポキサンチン、ア
ミノプテリン、チミジン、１０％牛胎児血清を含むＲＰ
ＭＩ１６４０培地）を２０ｍｌになるように加えて、９
６ウェル マイクロプレートに０．２ｍｌずつ分注して
２週間培養した後、増殖したウェル中の培養上清の抗体
活性を測定した。次に、活性の認められたウェルの細胞
を限界希釈法を使用して繰り返してクローン化し、Ｉｇ
Ｍクラスの抗ＣＡ１９−９モノクローナル抗体を産生す
る細胞を得た。この細胞を無血清培養液中で培養し、培
養上清液を採取した。この培養液中のモノクローナル抗
体をアフィ・ゲル・プロテインＡ ＭＡＰＳキット（バ
イオラッド社）を用いて精製単離し、以下の検討に用い
た。
【００１５】ｂ）抗ＣＡ１９−９モノクローナル抗体結
合ガラスビーズの作製 米国特許第652761号明細書の方法に従い、ガラスビーズ
の表面に抗ＣＡ１９−９モノクローナル抗体をコーティ
ングした。 ｃ）ペルオキシダーゼ標識抗ＣＡ１９−９モノクローナ
ル抗体の作製 抗ＣＡ１９−９モノクローナル抗体を文献［エス・ヨシ
タケ、エム・イマガワ、イー・イシカワ、エトール；ジ
ェイ．バイオケム(S.YOSHITAKE,M.IMAGAWA,E.ISHIKAWA,
et.al.;J.Biochem.),Vol.92(1982) 1413-1424］に記載
の方法にてペルオキシダーゼと結合し、ペルオキシダー
ゼ標識抗ＣＡ１９−９モノクローナル抗体を得た。この
試薬は通常免疫反応用緩衝液で１０〜５０００倍に希釈
して使用した。 ｄ）ＣＡ１９−９標準溶液の調製 ＳＷ１１１６細胞を１０％牛胎児血清含有ＲＰＭＩ１６
４０培地で培養し、培養上清液を採取した。培養上清液
中のＣＡ１９−９濃度をグラオザイムＣＡ１９−９（三
洋化成工業株式会社）を用いて測定し、濃度が３０、６
０、１２０、２４０Ｕ／ｍｌなるように１％牛血清アル
ブミン含有緩衝液で希釈し標準溶液とした。 ｅ）非特異的な牛胎児血清ＩｇＭクラス抗体 正常牛胎児血清（ＧＩＢＣＯ社）１０ｍｌに飽和硫安１
０ｍｌを加え攪拌し、遠心分離によりを行い生成した沈
澱分離した。沈澱に０．９％ＮａＣｌ水溶液１０ｍｌを
加え沈澱を溶解し、０．９％ＮａＣｌ含有０．０２Ｍリ
ン酸緩衝液中で透析した。透析後、セファロース４Ｂカ
ラム（ファルマシア社）でゲルろ過クロマトグラフィー
を行い、分子量９０万のＩｇＭ分画を採取した。
合ガラスビーズの作製 米国特許第652761号明細書の方法に従い、ガラスビーズ
の表面に抗ＣＡ１９−９モノクローナル抗体をコーティ
ングした。 ｃ）ペルオキシダーゼ標識抗ＣＡ１９−９モノクローナ
ル抗体の作製 抗ＣＡ１９−９モノクローナル抗体を文献［エス・ヨシ
タケ、エム・イマガワ、イー・イシカワ、エトール；ジ
ェイ．バイオケム(S.YOSHITAKE,M.IMAGAWA,E.ISHIKAWA,
et.al.;J.Biochem.),Vol.92(1982) 1413-1424］に記載
の方法にてペルオキシダーゼと結合し、ペルオキシダー
ゼ標識抗ＣＡ１９−９モノクローナル抗体を得た。この
試薬は通常免疫反応用緩衝液で１０〜５０００倍に希釈
して使用した。 ｄ）ＣＡ１９−９標準溶液の調製 ＳＷ１１１６細胞を１０％牛胎児血清含有ＲＰＭＩ１６
４０培地で培養し、培養上清液を採取した。培養上清液
中のＣＡ１９−９濃度をグラオザイムＣＡ１９−９（三
洋化成工業株式会社）を用いて測定し、濃度が３０、６
０、１２０、２４０Ｕ／ｍｌなるように１％牛血清アル
ブミン含有緩衝液で希釈し標準溶液とした。 ｅ）非特異的な牛胎児血清ＩｇＭクラス抗体 正常牛胎児血清（ＧＩＢＣＯ社）１０ｍｌに飽和硫安１
０ｍｌを加え攪拌し、遠心分離によりを行い生成した沈
澱分離した。沈澱に０．９％ＮａＣｌ水溶液１０ｍｌを
加え沈澱を溶解し、０．９％ＮａＣｌ含有０．０２Ｍリ
ン酸緩衝液中で透析した。透析後、セファロース４Ｂカ
ラム（ファルマシア社）でゲルろ過クロマトグラフィー
を行い、分子量９０万のＩｇＭ分画を採取した。
【００１６】（２）免疫反応用緩衝液の作製 １Ｗ／Ｖ％牛血清アルブミン、０．９Ｗ／Ｖ％ＮａＣｌ
含有０．０２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）に非特異的
な牛胎児血清ＩｇＭクラス抗体を０．０５ｍｇ／ｍｌ、
０．１ｍｇ／ｍｌ、０．２ｍｇ／ｍｌの濃度になるよう
に添加した免疫反応用緩衝液および牛胎児血清ＩｇＭク
ラス抗体無添加の免疫反応用緩衝液をそれぞれ作製し
た。 （３）異好性抗体含有試料の測定 標準溶液又は被検試料５０μｌ、免疫反応用緩衝液４５
０μｌを入れた試験管に抗ＣＡ１９−９モノクローナル
抗体結合ガラスビーズを１個入れインキュベーション
（３７℃、１５分間）したのち、生理食塩水にてビーズ
を洗浄した。次に、ペルオキシダーゼ標識抗ＣＡ１９−
９モノクローナル抗体含有免疫反応用緩衝液５００μｌ
中にビーズを移し、インキュベーション（３７℃、１５
分間）した。再度、生理食塩水にてビーズを洗浄したの
ち、ビーズを基質溶液（過酸化水素含有オルト−フェニ
レンジアミン溶液）５００μｌ中に移し、インキュベー
ション（３７℃、１５分間）したのち、１．５規定硫酸
水溶液３ｍｌを加えて反応を停止した。この液の４９２
ｎｍの吸光度を測定し、ビーズに結合した酵素の酵素活
性を測定した。ＣＡ１９−９標準溶液０、３０、６０、
１２０、２４０Ｕ／ｍｌの吸光度から検量線を得た。被
検試料として正常ヒト血清とＩｇＭクラス抗体に対する
異好性抗体含有ヒト血清を測定し、検量線から濃度を読
み取った。それぞれの免疫反応用緩衝液を用いた時の結
果を表１に示した。
含有０．０２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）に非特異的
な牛胎児血清ＩｇＭクラス抗体を０．０５ｍｇ／ｍｌ、
０．１ｍｇ／ｍｌ、０．２ｍｇ／ｍｌの濃度になるよう
に添加した免疫反応用緩衝液および牛胎児血清ＩｇＭク
ラス抗体無添加の免疫反応用緩衝液をそれぞれ作製し
た。 （３）異好性抗体含有試料の測定 標準溶液又は被検試料５０μｌ、免疫反応用緩衝液４５
０μｌを入れた試験管に抗ＣＡ１９−９モノクローナル
抗体結合ガラスビーズを１個入れインキュベーション
（３７℃、１５分間）したのち、生理食塩水にてビーズ
を洗浄した。次に、ペルオキシダーゼ標識抗ＣＡ１９−
９モノクローナル抗体含有免疫反応用緩衝液５００μｌ
中にビーズを移し、インキュベーション（３７℃、１５
分間）した。再度、生理食塩水にてビーズを洗浄したの
ち、ビーズを基質溶液（過酸化水素含有オルト−フェニ
レンジアミン溶液）５００μｌ中に移し、インキュベー
ション（３７℃、１５分間）したのち、１．５規定硫酸
水溶液３ｍｌを加えて反応を停止した。この液の４９２
ｎｍの吸光度を測定し、ビーズに結合した酵素の酵素活
性を測定した。ＣＡ１９−９標準溶液０、３０、６０、
１２０、２４０Ｕ／ｍｌの吸光度から検量線を得た。被
検試料として正常ヒト血清とＩｇＭクラス抗体に対する
異好性抗体含有ヒト血清を測定し、検量線から濃度を読
み取った。それぞれの免疫反応用緩衝液を用いた時の結
果を表１に示した。
【００１７】
【表１】
【００１８】実施例２ マウス血清ＩｇＭクラス抗体を含有する免疫反応緩衝液
を用いたβ2-マイクログロブリンの酵素免疫測定試薬
（競合法）の測定を行った。 （１）β2-マイクログロブリン酵素免疫測定試薬の製造 ａ）抗β2-マイクログロブリン抗体結合ガラスビーズの
作製 米国特許第652761号明細書の方法に従い、ガラスビーズ
の表面に抗β2-マイクログロブリンポリクローナル抗体
（ダコ社）をコーティングした。 ｂ）ペルオキシダーゼ標識β2-マイクログロブリンの作
製 β2-マイクログロブリンに文献［ナカネ・ピー・ケイ、
カワオイ・エイ；ジェイ．ヒストケム．サイトケム(NAK
ANE,P.K.,KAWAOI,A.;J.Histochem.Cytochem.),Vol.22(1
974) 1084］記載の方法にてペルオキシダーゼを結合
し、ペルオキシダーゼ標識β2-マイクログロブリンを得
た。この試薬は通常免疫反応用緩衝液で１０〜５０００
倍に希釈して使用した。 ｃ）β2-マイクログロブリン標準溶液の調製 ヒトβ2-マイクログロブリン（ゼルコ社）を１Ｗ／Ｖ％
牛血清アルブミン含有０．０２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ
７．２）で、濃度が１、２、４、８ｍｇ／Ｌとなるよう
に希釈した。 ｄ）非特異的なマウス血清ＩｇＭクラス抗体 ＢＡＬＢ／ｃマウスから採血した正常マウス血清１０ｍ
ｌに飽和硫安１０ｍｌを加え攪拌し、遠心分離によりを
行い生成した沈澱分離した。沈澱に０．９％ＮａＣｌ水
溶液１０ｍｌを加え沈澱を溶解し、０．９％ＮａＣｌ含
有０．０２Ｍリン酸緩衝液中で透析した。透析後、セフ
ァロース４Ｂカラム（ファルマシア社）でゲルろ過クロ
マトグラフィーを行い、分子量９０万のＩｇＭ分画を採
取した。
を用いたβ2-マイクログロブリンの酵素免疫測定試薬
（競合法）の測定を行った。 （１）β2-マイクログロブリン酵素免疫測定試薬の製造 ａ）抗β2-マイクログロブリン抗体結合ガラスビーズの
作製 米国特許第652761号明細書の方法に従い、ガラスビーズ
の表面に抗β2-マイクログロブリンポリクローナル抗体
（ダコ社）をコーティングした。 ｂ）ペルオキシダーゼ標識β2-マイクログロブリンの作
製 β2-マイクログロブリンに文献［ナカネ・ピー・ケイ、
カワオイ・エイ；ジェイ．ヒストケム．サイトケム(NAK
ANE,P.K.,KAWAOI,A.;J.Histochem.Cytochem.),Vol.22(1
974) 1084］記載の方法にてペルオキシダーゼを結合
し、ペルオキシダーゼ標識β2-マイクログロブリンを得
た。この試薬は通常免疫反応用緩衝液で１０〜５０００
倍に希釈して使用した。 ｃ）β2-マイクログロブリン標準溶液の調製 ヒトβ2-マイクログロブリン（ゼルコ社）を１Ｗ／Ｖ％
牛血清アルブミン含有０．０２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ
７．２）で、濃度が１、２、４、８ｍｇ／Ｌとなるよう
に希釈した。 ｄ）非特異的なマウス血清ＩｇＭクラス抗体 ＢＡＬＢ／ｃマウスから採血した正常マウス血清１０ｍ
ｌに飽和硫安１０ｍｌを加え攪拌し、遠心分離によりを
行い生成した沈澱分離した。沈澱に０．９％ＮａＣｌ水
溶液１０ｍｌを加え沈澱を溶解し、０．９％ＮａＣｌ含
有０．０２Ｍリン酸緩衝液中で透析した。透析後、セフ
ァロース４Ｂカラム（ファルマシア社）でゲルろ過クロ
マトグラフィーを行い、分子量９０万のＩｇＭ分画を採
取した。
【００１９】（２）免疫反応用緩衝液の作製 １Ｗ／Ｖ％牛血清アルブミン、０．９Ｗ／Ｖ％ＮａＣｌ
含有０．０２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）に非特異的
なマウス血清ＩｇＭクラス抗体を０．０５ｍｇ／ｍｌ、
０．１ｍｇ／ｍｌ、０．２ｍｇ／ｍｌの濃度になるよう
に添加した免疫反応用緩衝液およびマウス血清ＩｇＭ抗
体無添加の免疫反応用緩衝液をそれぞれ作製した。 （３）抗ＩｇＭ抗体含有試料の測定 標準溶液又は被検試料５０μｌ、ペルオキシダーゼ標識
β2-マイクログロブリン含有免疫反応用緩衝液４５０μ
ｌを入れた試験管に抗β2-マイクログロブリン抗体結合
ガラスビーズを１個入れインキュベーション（３７℃、
１５分間）した。生理食塩水にてビーズを洗浄したの
ち、ビーズを基質溶液（過酸化水素含有オルトーフェニ
レンジアミン溶液）５００μｌ中に移し、インキュベー
ション（３７℃、１５分間）したのち、１．５規定硫酸
水溶液３ｍｌを加えて反応を停止した。この液の４９２
ｎｍの吸光度を測定し、ビーズに結合した酵素の酵素活
性を測定した。β2-マイクログロブリン標準溶液０、
１、２、４、８ｍｇ／Ｌの吸光度から検量線を得た。被
検試料として正常ヒト血清とＩｇＭクラス抗体に対する
異好性抗体含有ヒト血清を測定し、検量線から濃度を読
み取った。それぞれの免疫反応用緩衝液を用いた時の結
果を表２に示した。
含有０．０２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）に非特異的
なマウス血清ＩｇＭクラス抗体を０．０５ｍｇ／ｍｌ、
０．１ｍｇ／ｍｌ、０．２ｍｇ／ｍｌの濃度になるよう
に添加した免疫反応用緩衝液およびマウス血清ＩｇＭ抗
体無添加の免疫反応用緩衝液をそれぞれ作製した。 （３）抗ＩｇＭ抗体含有試料の測定 標準溶液又は被検試料５０μｌ、ペルオキシダーゼ標識
β2-マイクログロブリン含有免疫反応用緩衝液４５０μ
ｌを入れた試験管に抗β2-マイクログロブリン抗体結合
ガラスビーズを１個入れインキュベーション（３７℃、
１５分間）した。生理食塩水にてビーズを洗浄したの
ち、ビーズを基質溶液（過酸化水素含有オルトーフェニ
レンジアミン溶液）５００μｌ中に移し、インキュベー
ション（３７℃、１５分間）したのち、１．５規定硫酸
水溶液３ｍｌを加えて反応を停止した。この液の４９２
ｎｍの吸光度を測定し、ビーズに結合した酵素の酵素活
性を測定した。β2-マイクログロブリン標準溶液０、
１、２、４、８ｍｇ／Ｌの吸光度から検量線を得た。被
検試料として正常ヒト血清とＩｇＭクラス抗体に対する
異好性抗体含有ヒト血清を測定し、検量線から濃度を読
み取った。それぞれの免疫反応用緩衝液を用いた時の結
果を表２に示した。
【００２０】
【表２】
【００２１】
【発明の効果】本発明の免疫反応用緩衝液は、異好性抗
体の影響を受けない優れたものである。すなわち、従来
の免疫反応用緩衝液を用いた場合、体液中に含まれてい
る動物のＩｇＭクラス抗体と反応する異好性抗体の影響
を受けて測定値が異常となり、正確な測定値が得られな
いという問題があったが、本発明の免疫反応用緩衝液を
用いると、異好性抗体の影響がなくなるため、正確な測
定値を得ることができる。以上の点から、本発明は、す
べてヘテロジーニアス酵素免疫測定法に応用でき、特に
高感度の測定系が要求されるホルモン、腫瘍関連抗原及
びウイルスの測定に有用である。
体の影響を受けない優れたものである。すなわち、従来
の免疫反応用緩衝液を用いた場合、体液中に含まれてい
る動物のＩｇＭクラス抗体と反応する異好性抗体の影響
を受けて測定値が異常となり、正確な測定値が得られな
いという問題があったが、本発明の免疫反応用緩衝液を
用いると、異好性抗体の影響がなくなるため、正確な測
定値を得ることができる。以上の点から、本発明は、す
べてヘテロジーニアス酵素免疫測定法に応用でき、特に
高感度の測定系が要求されるホルモン、腫瘍関連抗原及
びウイルスの測定に有用である。
Claims (3)
- 【請求項１】 測定の対象となる抗原性物質を、この抗
原性物質を認識するＩｇＭクラスのモノクローナル抗体
を結合した不溶性固体を用いるヘテロジーニアス酵素免
疫測定法で測定するに際し、免疫反応用緩衝液中に非特
異的なＩｇＭクラスの抗体を共存させることを特徴とす
るヘテロジーニアス酵素免疫測定法。 - 【請求項２】 非特異的なＩｇＭクラスの抗体が牛胎児
血清のＩｇＭクラスの抗体である請求項１記載の免疫測
定法。 - 【請求項３】 非特異的なＩｇＭクラスの抗体の濃度が
免疫反応用緩衝液中０．０１〜１ｍｇ／ｍｌである請求
項１〜２記載の免疫測定法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP7248524A JPH0968531A (ja) | 1995-08-31 | 1995-08-31 | 免疫測定法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP7248524A JPH0968531A (ja) | 1995-08-31 | 1995-08-31 | 免疫測定法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0968531A true JPH0968531A (ja) | 1997-03-11 |
Family
ID=17179473
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP7248524A Pending JPH0968531A (ja) | 1995-08-31 | 1995-08-31 | 免疫測定法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0968531A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2016065795A (ja) * | 2014-09-25 | 2016-04-28 | ヤマサ醤油株式会社 | 非特異的反応阻害剤、それを用いた免疫学的測定法 |
Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS579723A (en) * | 1980-06-20 | 1982-01-19 | Mitsubishi Chem Ind Ltd | Stabilizing agent for immunological reaction and measuring method of antigen-antibody reaction |
| JPS61217762A (ja) * | 1985-03-25 | 1986-09-27 | Eiji Ishikawa | 高感度免疫測定法 |
| JPS6312960A (ja) * | 1986-07-04 | 1988-01-20 | Green Cross Corp:The | 免疫学的試験用水性溶媒 |
| JPH01144993A (ja) * | 1987-08-19 | 1989-06-07 | Shionogi & Co Ltd | ＨＢｓ抗原測定のための方法、ハイブリドーマ、モノクローナル抗体および感作血球 |
| JPH02205774A (ja) * | 1989-02-03 | 1990-08-15 | Sanyo Chem Ind Ltd | 免疫測定法および免疫測定試薬 |
| JPH04503570A (ja) * | 1989-02-21 | 1992-06-25 | ピットマン―ムーア・インコーポレイテッド | Ｅｌｉｓａにおける偽陽性結果防止方法 |
-
1995
- 1995-08-31 JP JP7248524A patent/JPH0968531A/ja active Pending
Patent Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS579723A (en) * | 1980-06-20 | 1982-01-19 | Mitsubishi Chem Ind Ltd | Stabilizing agent for immunological reaction and measuring method of antigen-antibody reaction |
| JPS61217762A (ja) * | 1985-03-25 | 1986-09-27 | Eiji Ishikawa | 高感度免疫測定法 |
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| JPH02205774A (ja) * | 1989-02-03 | 1990-08-15 | Sanyo Chem Ind Ltd | 免疫測定法および免疫測定試薬 |
| JPH04503570A (ja) * | 1989-02-21 | 1992-06-25 | ピットマン―ムーア・インコーポレイテッド | Ｅｌｉｓａにおける偽陽性結果防止方法 |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2016065795A (ja) * | 2014-09-25 | 2016-04-28 | ヤマサ醤油株式会社 | 非特異的反応阻害剤、それを用いた免疫学的測定法 |
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