JPH01144993A - HBs抗原測定のための方法、ハイブリドーマ、モノクローナル抗体および感作血球 - Google Patents
HBs抗原測定のための方法、ハイブリドーマ、モノクローナル抗体および感作血球Info
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- JPH01144993A JPH01144993A JP63193654A JP19365488A JPH01144993A JP H01144993 A JPH01144993 A JP H01144993A JP 63193654 A JP63193654 A JP 63193654A JP 19365488 A JP19365488 A JP 19365488A JP H01144993 A JPH01144993 A JP H01144993A
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Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
1呈上立上月量1
本発明は、抗HBsモノクローナル抗体、固定血球への
抗HBsモノクローナル抗体の感作方法、抗HBsモノ
クローナル抗体感作血球、抗HBsモノクローナル抗体
感作血球を用いたHBs抗原の測定方法および抗HBs
モノクローナル抗体感作血球を用いたHBS抗原の測定
における非特異反応を抑制するモノクローナル抗体およ
びその抑制方法に関する。
抗HBsモノクローナル抗体の感作方法、抗HBsモノ
クローナル抗体感作血球、抗HBsモノクローナル抗体
感作血球を用いたHBs抗原の測定方法および抗HBs
モノクローナル抗体感作血球を用いたHBS抗原の測定
における非特異反応を抑制するモノクローナル抗体およ
びその抑制方法に関する。
更困五弦碧
B型肝炎はB型肝炎ウィルスに起因する疾患であり、一
般に血液を介して感染する。また乳幼児が母子感染によ
って該ウィルスに感染する場合もある。感染した保菌者
の約90%は発症しないが、保菌者の血液を介して他者
が該ウィルスに感染する危険性が有り、世界中でこの保
菌者は約2[2000万人と推定されている。特にこの
保菌者の比率はアジアで高く、わが国における患者数は
約100万人と推定されている。さらに、B型肝炎はき
らに重篤な肝硬変、肝癌へと移行する確率が高い。
般に血液を介して感染する。また乳幼児が母子感染によ
って該ウィルスに感染する場合もある。感染した保菌者
の約90%は発症しないが、保菌者の血液を介して他者
が該ウィルスに感染する危険性が有り、世界中でこの保
菌者は約2[2000万人と推定されている。特にこの
保菌者の比率はアジアで高く、わが国における患者数は
約100万人と推定されている。さらに、B型肝炎はき
らに重篤な肝硬変、肝癌へと移行する確率が高い。
以上のような状況により、B型肝炎患者またはその保菌
者の発見・診断および血液製剤中のB型肝炎ウィルスの
検出が重要となってきた。これらの検出にあたっては、
最近の細胞工学技術の発展に伴い、検体中のB型肝炎表
面抗原(HBs)を抗HBsモノクローナル抗体を用い
て測定する方法が用いられるようになってきた。抗HB
sモノクローナル抗体としては、様々な種類の抗体が得
られており(例えば、特開昭56−73029、特開昭
62−10098、特表昭57−501493、特表昭
58−500300など)、またそれらを赤血球に吸着
させた凝集試薬(例えば、特開昭58−127167、
特開昭6O−38656)や、それらを用いた測定法(
例えば、特表昭57−501493、特表昭58−50
0300など)も開発きれている。また、HBsに対す
るモノクローナル抗体を用いた診断キットが各社から発
売されている。
者の発見・診断および血液製剤中のB型肝炎ウィルスの
検出が重要となってきた。これらの検出にあたっては、
最近の細胞工学技術の発展に伴い、検体中のB型肝炎表
面抗原(HBs)を抗HBsモノクローナル抗体を用い
て測定する方法が用いられるようになってきた。抗HB
sモノクローナル抗体としては、様々な種類の抗体が得
られており(例えば、特開昭56−73029、特開昭
62−10098、特表昭57−501493、特表昭
58−500300など)、またそれらを赤血球に吸着
させた凝集試薬(例えば、特開昭58−127167、
特開昭6O−38656)や、それらを用いた測定法(
例えば、特表昭57−501493、特表昭58−50
0300など)も開発きれている。また、HBsに対す
るモノクローナル抗体を用いた診断キットが各社から発
売されている。
L記のような逆受身凝集反応においては、非特異的な凝
集が起こる場合があり、それを抑制する方法として、測
定対象の抗原と異なる抗原に対するモノクローナル抗体
を反応溶液中に添加する方法がある(特開昭62−15
464)。
集が起こる場合があり、それを抑制する方法として、測
定対象の抗原と異なる抗原に対するモノクローナル抗体
を反応溶液中に添加する方法がある(特開昭62−15
464)。
また、逆受身凝集反応に用いる赤血球としてはヒツジや
ニワトリの固定血球が一般に用いられるが、この血球へ
のモノクローナル抗体の感作は主にタンニン酸法によっ
て行なわれていた。
ニワトリの固定血球が一般に用いられるが、この血球へ
のモノクローナル抗体の感作は主にタンニン酸法によっ
て行なわれていた。
発明が解決しようとする。 1、
現在までに様々な抗HBsモノクローナル抗体が製造き
れ、種々のHBs測定用キットが開発されてきているが
、さらに非特異反応が少く感度の高いものが待望されて
いた。
れ、種々のHBs測定用キットが開発されてきているが
、さらに非特異反応が少く感度の高いものが待望されて
いた。
□ 1.を 決するための手段
本発明のモノクローナル抗体は、常法に従い以下の様に
して調製できる。
して調製できる。
まず、BALB/cなどのマウスに目的とする抗原をフ
ロイントの完全アジュバントなどの免疫助剤と共に投与
し免疫し、免疫後牌臓細胞を取りたし、抗体産生細胞と
して細胞融合に供する。得られたマウス肺臓細胞は、牛
胎児血清(Fe2)を10〜20%程度添加したイーグ
ルMEM、ダルベツコ変法培地、RPM11640など
の培地に懸濁し、赤血球を破壊した後、ヒポキサンチン
−グアニン−ホスホリボシルトランスフェラーゼ欠損(
HGPRT−)あるいはチミジンキナーゼ欠損(TK−
)の様な適切なマーカーを持つマウス骨髄腫細胞と融合
させる。融合剤としては、50%のポリエチレングリフ
ール(PEG)を加える。融合細胞はHAT(ヒポキサ
ンチン−アデニン−チミジン)培地に懸濁し、HAT培
地の半量を交換しながら培養する。ハイブリドーマの形
成を確認した培養上清中の抗体価は、上記抗原を感作し
た固定血球を用いるPHA(受身凝集反応)によって測
定できる。凝集陽性を示したハイブリドーマは限界希釈
法に従いさらに数回クローニングし、目的の抗体を安定
に産生ずるハイブリドーマを得る。
ロイントの完全アジュバントなどの免疫助剤と共に投与
し免疫し、免疫後牌臓細胞を取りたし、抗体産生細胞と
して細胞融合に供する。得られたマウス肺臓細胞は、牛
胎児血清(Fe2)を10〜20%程度添加したイーグ
ルMEM、ダルベツコ変法培地、RPM11640など
の培地に懸濁し、赤血球を破壊した後、ヒポキサンチン
−グアニン−ホスホリボシルトランスフェラーゼ欠損(
HGPRT−)あるいはチミジンキナーゼ欠損(TK−
)の様な適切なマーカーを持つマウス骨髄腫細胞と融合
させる。融合剤としては、50%のポリエチレングリフ
ール(PEG)を加える。融合細胞はHAT(ヒポキサ
ンチン−アデニン−チミジン)培地に懸濁し、HAT培
地の半量を交換しながら培養する。ハイブリドーマの形
成を確認した培養上清中の抗体価は、上記抗原を感作し
た固定血球を用いるPHA(受身凝集反応)によって測
定できる。凝集陽性を示したハイブリドーマは限界希釈
法に従いさらに数回クローニングし、目的の抗体を安定
に産生ずるハイブリドーマを得る。
目的のモノクローナル抗体は、得られたハイブリドーマ
をin v(troまたはin vivOで培養し
て製造される。in v(troにおいては上記のよ
うな一般的に使用される培地に懸濁して数日培着し培養
上清から目的の抗体を得る。in vfvoにおいて
は、マウスなどの哺乳動物の腹腔内にハイブリドーマを
接種し、10〜20日後に腹水を採取して目的のモノク
ローナル抗体を得る。
をin v(troまたはin vivOで培養し
て製造される。in v(troにおいては上記のよ
うな一般的に使用される培地に懸濁して数日培着し培養
上清から目的の抗体を得る。in vfvoにおいて
は、マウスなどの哺乳動物の腹腔内にハイブリドーマを
接種し、10〜20日後に腹水を採取して目的のモノク
ローナル抗体を得る。
この様にして得られた培養上清または腹水からの目的の
モノクローナル抗体の精製は、硫安分画、DEAEセフ
ァロースカラム、ハイドロキシアパタイトカラム、プロ
ティンAアフィニティーカラムなどの通常使用される精
製法を適宜組み合わせて行なう。
モノクローナル抗体の精製は、硫安分画、DEAEセフ
ァロースカラム、ハイドロキシアパタイトカラム、プロ
ティンAアフィニティーカラムなどの通常使用される精
製法を適宜組み合わせて行なう。
本発明においては、上記の方法に従い多種の抗HBsモ
ノクローナル抗体を得た。その内から、以下に示す方法
に従いHBsを測定する際に、非特異反応が少なく感度
の高い凝集試薬を提供するモノクローナル抗体HBs2
2B7.18E9および8C1を得た。以下の実施例に
示すように、いかなる抗HBsモノクローナル抗体でも
非特異反応が少なく感度の高い凝集試薬を提供するもの
では無く、即ち、これらのモノクローナル抗体は、特に
非特異反応が少なく感度の高いHBs測定を可能にする
有用なモノクローナル抗体である。
ノクローナル抗体を得た。その内から、以下に示す方法
に従いHBsを測定する際に、非特異反応が少なく感度
の高い凝集試薬を提供するモノクローナル抗体HBs2
2B7.18E9および8C1を得た。以下の実施例に
示すように、いかなる抗HBsモノクローナル抗体でも
非特異反応が少なく感度の高い凝集試薬を提供するもの
では無く、即ち、これらのモノクローナル抗体は、特に
非特異反応が少なく感度の高いHBs測定を可能にする
有用なモノクローナル抗体である。
同様に、本発明で得られた抗ムンプスウィルスモノクロ
ーナル抗体MPV10G3および抗ヒトIgMモノクロ
ーナル抗体10C9は、以下に示すHBsの測定方法に
おいて、特に非特異反応を抑制するモノクローナル抗体
として有用である。
ーナル抗体MPV10G3および抗ヒトIgMモノクロ
ーナル抗体10C9は、以下に示すHBsの測定方法に
おいて、特に非特異反応を抑制するモノクローナル抗体
として有用である。
さらに、本発明は、HBs抗原を免疫原として得られた
抗HBsモノクローナル抗体を血球に感作する方法およ
び該感作血球を用いたHBs抗原の測定方法を提供する
。
抗HBsモノクローナル抗体を血球に感作する方法およ
び該感作血球を用いたHBs抗原の測定方法を提供する
。
本発明で使用する血球は、ニワトリ血球が望ましい。ニ
ワトリ血球は、有核細胞であり、哺乳類の細胞に比べて
大きく沈降速度が速いため、凝集反応試薬に用いれば約
1時間で判定可能であり、ヒツジなどの哺乳類血球の2
時間に比べ、操作性に優れている。また、ヒト血清中の
HBs抗原を測定する際には、ヒト血清中に異種血球に
対する凝集因子(異種凝集素)が存在し、凝集反応試薬
と非特異的に反応する。ニワトリ血球は、ヒツジ、ガチ
ョウなどの血球に比べて、ヒト血清中に含まれる異種凝
集素との反応が弱く、偽陽性となる非特異凝集反応が少
ないなどの利点がある。
ワトリ血球は、有核細胞であり、哺乳類の細胞に比べて
大きく沈降速度が速いため、凝集反応試薬に用いれば約
1時間で判定可能であり、ヒツジなどの哺乳類血球の2
時間に比べ、操作性に優れている。また、ヒト血清中の
HBs抗原を測定する際には、ヒト血清中に異種血球に
対する凝集因子(異種凝集素)が存在し、凝集反応試薬
と非特異的に反応する。ニワトリ血球は、ヒツジ、ガチ
ョウなどの血球に比べて、ヒト血清中に含まれる異種凝
集素との反応が弱く、偽陽性となる非特異凝集反応が少
ないなどの利点がある。
本発明で使用する血球は、溶血を防ぐためにグルタルア
ルデヒドやホルマリンで固定化することが望ましく、特
にグルタルアルデヒドが好ましい。ホルマリンで固定化
した場合には、血球どうしが凝集することがある。血球
を固定化するためのグルタルアルデヒド濃度は、血球の
量に比例して調節する。5%濃度の血球を用いる場合に
は、最終グルタルアルデヒド濃度を0.05〜0.2%
にy4整し、室温で1〜2時間反応させれば、固定が完
了する。10%濃度の血球を用いる場合には、5%濃度
の血球を用いた場合の倍量のグルタルアルデヒドを用い
ればよい、但し、血球濃度を30%以上にすると、非特
異的な血球の凝集が起こり、好ましくない、安定で凝集
塊のない固定化血球を作製するためには、約5〜7.5
%濃度の血球を用いて固定化すれはよい。グルタルアル
デヒドの濃度は、0.05%以下でも反応時間を長くす
れば固定できるが、1時間程度で操作性良く固定するた
めには、0.1%前後が良い。また、0.2%以−ヒで
も、反応時間を短くして固定化することができるが、時
間による固定の進行が速く、固定しすぎて凝集塊を作り
易く、安定して固定血球を作製するのは困難である。
ルデヒドやホルマリンで固定化することが望ましく、特
にグルタルアルデヒドが好ましい。ホルマリンで固定化
した場合には、血球どうしが凝集することがある。血球
を固定化するためのグルタルアルデヒド濃度は、血球の
量に比例して調節する。5%濃度の血球を用いる場合に
は、最終グルタルアルデヒド濃度を0.05〜0.2%
にy4整し、室温で1〜2時間反応させれば、固定が完
了する。10%濃度の血球を用いる場合には、5%濃度
の血球を用いた場合の倍量のグルタルアルデヒドを用い
ればよい、但し、血球濃度を30%以上にすると、非特
異的な血球の凝集が起こり、好ましくない、安定で凝集
塊のない固定化血球を作製するためには、約5〜7.5
%濃度の血球を用いて固定化すれはよい。グルタルアル
デヒドの濃度は、0.05%以下でも反応時間を長くす
れば固定できるが、1時間程度で操作性良く固定するた
めには、0.1%前後が良い。また、0.2%以−ヒで
も、反応時間を短くして固定化することができるが、時
間による固定の進行が速く、固定しすぎて凝集塊を作り
易く、安定して固定血球を作製するのは困難である。
得られた固定血球へのモノクローナル抗体の感作は、塩
化クロム法によって行なえば良い。従来のタンニン酸法
では、特にI g G lクラスの吸着が悪く、IgG
1.やIgMに関しても塩化クロム法を用いた方が感度
が高い、該感作は、1〜5%濃度の固定血球に対して、
5〜1000μg / mlのモノクローナル抗体と5
〜600μg / m 1の塩化クロムの存在下に行な
えば良い、好ましくは約2,5%濃度の固定血球に対し
て、10〜500118/m!のモノクローナル抗体と
10〜300μg / m lの塩化クロムの存在下に
感作を行なえば、高感度の感作血球が得られる。固定血
球の、41度を変化きせる場合には、モノクローナル抗
体および塩化クロムの濃度を固定血球濃度の変化に比例
させて増減すれば良い。2種以上の抗体を感作する場合
には、上記操作を繰り返して行なえばよい。本明細書中
の固定血球の濃度は生血球相当分の%(V/V)で示さ
れている。
化クロム法によって行なえば良い。従来のタンニン酸法
では、特にI g G lクラスの吸着が悪く、IgG
1.やIgMに関しても塩化クロム法を用いた方が感度
が高い、該感作は、1〜5%濃度の固定血球に対して、
5〜1000μg / mlのモノクローナル抗体と5
〜600μg / m 1の塩化クロムの存在下に行な
えば良い、好ましくは約2,5%濃度の固定血球に対し
て、10〜500118/m!のモノクローナル抗体と
10〜300μg / m lの塩化クロムの存在下に
感作を行なえば、高感度の感作血球が得られる。固定血
球の、41度を変化きせる場合には、モノクローナル抗
体および塩化クロムの濃度を固定血球濃度の変化に比例
させて増減すれば良い。2種以上の抗体を感作する場合
には、上記操作を繰り返して行なえばよい。本明細書中
の固定血球の濃度は生血球相当分の%(V/V)で示さ
れている。
上記の塩化クロム法によって、18Mクラスの抗HBs
モノクローナル抗体を血球に感作すると従来よりも高感
度のHBs抗原測定試薬が得られる。しかし、IgMは
一般に感度は高いものの、非特異反応が多いという欠点
を有する。逆に、IgGは、感度はIgMはど高くはな
いが特異性が高い。そこで、きらに該血球にIgGクラ
スの抗HBsモノクローナル抗体を感作すると、従来よ
りも高感度で非特異反応の少ない測定試薬が得られた。
モノクローナル抗体を血球に感作すると従来よりも高感
度のHBs抗原測定試薬が得られる。しかし、IgMは
一般に感度は高いものの、非特異反応が多いという欠点
を有する。逆に、IgGは、感度はIgMはど高くはな
いが特異性が高い。そこで、きらに該血球にIgGクラ
スの抗HBsモノクローナル抗体を感作すると、従来よ
りも高感度で非特異反応の少ない測定試薬が得られた。
さらに非特異反応を減少させるためには、IgGクラス
の抗HBsモノクローナル抗体を数種類使用して、Ig
MおよびIgGで感作した数種の感作血球を用いれば良
い。本発明によれば、HBs8C1(IgG)およびH
Bs22B7(IgM)で二重感作した血球およびHB
s18E9(IgG)およびHBs22B7で二重感作
した血球を混合して用いて目的の凝集試薬を得た。
の抗HBsモノクローナル抗体を数種類使用して、Ig
MおよびIgGで感作した数種の感作血球を用いれば良
い。本発明によれば、HBs8C1(IgG)およびH
Bs22B7(IgM)で二重感作した血球およびHB
s18E9(IgG)およびHBs22B7で二重感作
した血球を混合して用いて目的の凝集試薬を得た。
非特異反応を減少きせるためには、また、感作に用いた
IgMをグルタルアルデヒドや熱などによって変性した
ものを、反応液中に加えれば良い。さらに、感作に用い
たものとは異なる、変性または未変性のIgGおよびI
gMを加えるとさらに非特異反応が抑制される。本発明
においては、グルタルアルデヒド変性HBs22B7、
さらに所望により未変性HIgM10C9および熱変性
MPV10G3を反応溶液中に加えることにより非特異
反応を抑制することができた。添加量は、反応を阻害し
ない程度に多い方が好ましいが、それぞれ1〜100μ
K / m 1程度になるよう添加すれば非特異反応抑
制効果が得られる。
IgMをグルタルアルデヒドや熱などによって変性した
ものを、反応液中に加えれば良い。さらに、感作に用い
たものとは異なる、変性または未変性のIgGおよびI
gMを加えるとさらに非特異反応が抑制される。本発明
においては、グルタルアルデヒド変性HBs22B7、
さらに所望により未変性HIgM10C9および熱変性
MPV10G3を反応溶液中に加えることにより非特異
反応を抑制することができた。添加量は、反応を阻害し
ない程度に多い方が好ましいが、それぞれ1〜100μ
K / m 1程度になるよう添加すれば非特異反応抑
制効果が得られる。
上記方法を組み合わせれば、非常に高感度でかつ極めて
特異的にHBs抗原を測定することができる。
特異的にHBs抗原を測定することができる。
(以下余白)
医」Ull
1、免疫原の調製 (表1参照)
HBs抗原陽性血清を硫安45%で塩析し、HBs抗原
を沈殿させた(回収率85%)。このHBsalllk
50mMクエン酸バッファー(pH5,56)で透析後
間バッファーで平衡化したDEAEセファロースCL−
4Bカラムにかけ、非吸着画分を集めた(回収率49%
)、ついでHBS抗原画分を80mMクエン酸バッファ
ーで平衡化したCMセファロースCL−4Bカラムにか
け非吸着画分を集めた(回収率37%)、この両分をP
BSで透析後、ヤギ抗ヒト血清18Gセファロースカラ
ムに通し、ヒト血清成分を吸着除去して、素通り画分を
部分精製HBs抗原(回収率30%)とし、BALB/
eマウスへの免疫原とした。
を沈殿させた(回収率85%)。このHBsalllk
50mMクエン酸バッファー(pH5,56)で透析後
間バッファーで平衡化したDEAEセファロースCL−
4Bカラムにかけ、非吸着画分を集めた(回収率49%
)、ついでHBS抗原画分を80mMクエン酸バッファ
ーで平衡化したCMセファロースCL−4Bカラムにか
け非吸着画分を集めた(回収率37%)、この両分をP
BSで透析後、ヤギ抗ヒト血清18Gセファロースカラ
ムに通し、ヒト血清成分を吸着除去して、素通り画分を
部分精製HBs抗原(回収率30%)とし、BALB/
eマウスへの免疫原とした。
i、マウス肺臓細胞の調製
部分精製HBsAg100μgとフロイント完全アジュ
バントの混合物0.2mlをBALB/Cマウスの背皮
下に投与し、以後HBsAgのみ(100μg)を2週
問おきに3〜5回背皮下に投恨して、最終免疫の3日後
に肺臓細胞をマウスから取りだし、細胞動台に供した。
バントの混合物0.2mlをBALB/Cマウスの背皮
下に投与し、以後HBsAgのみ(100μg)を2週
問おきに3〜5回背皮下に投恨して、最終免疫の3日後
に肺臓細胞をマウスから取りだし、細胞動台に供した。
i、ハイブリドーマの調製
マウス肺臓細胞とマウス骨髄腫細胞SP210−Ag1
4(SF3)を常法により融合袴せた。
4(SF3)を常法により融合袴せた。
マウス肺臓細胞を取りだし、15%牛脂児血清(Fe2
)添加RPM11640培地10m1に懸濁し、遠心(
200x g、 5分間)後、細胞を適量の0.17M
塩化アンモニウムで処理して、含まれる赤血球を破壊し
た後、Fe2を含まないRPM11640培地5mlに
懸培地5ゥlじFe2を含まない培地5mlに懸濁した
SP2細胞を、肺臓細胞の115量加え、良く混合した
後遠心(200×g15分間)してRPMI培地を除き
、37℃に加温したl1111の50%ポリエチレング
リコール4.000 (RPM11640培地と等量
混合)を徐々に加え、良く攪拌して細胞を融合させた・
融合後、15%FC8添加RPM11640培地を徐々
に加え、細胞を遠心(200X g、5分間)洗浄して
ポリエチレングリフールを除いた後、HAT(ヒボキサ
ンチン、アミノプテリン、チミジン)培地に懸濁し、9
6穴平底マイクロプレートに1ウエルあたりの肺臓細胞
数が約5×106個/200μlとなるように蒔き込ん
だ。培養開始後4〜5日目に各ウェルの半量のHAT培
地を交換し、9〜13日目にハイブリドーマのコロニー
形成を確認して、培養上清のHBs抗体価をPHAM集
試薬(エーザイ、PHA法エーザイキット)で測定した
。培養上清25μIを生理食塩水100IIIで5倍に
希釈後、その5μmをとり、キット添付の希釈液50t
tlおよび抗原感作血球25μlを加えて混合し、凝集
陽性を示したウェルを抗HBs抗体産生ハイブリドーマ
を含むものとした。
)添加RPM11640培地10m1に懸濁し、遠心(
200x g、 5分間)後、細胞を適量の0.17M
塩化アンモニウムで処理して、含まれる赤血球を破壊し
た後、Fe2を含まないRPM11640培地5mlに
懸培地5ゥlじFe2を含まない培地5mlに懸濁した
SP2細胞を、肺臓細胞の115量加え、良く混合した
後遠心(200×g15分間)してRPMI培地を除き
、37℃に加温したl1111の50%ポリエチレング
リコール4.000 (RPM11640培地と等量
混合)を徐々に加え、良く攪拌して細胞を融合させた・
融合後、15%FC8添加RPM11640培地を徐々
に加え、細胞を遠心(200X g、5分間)洗浄して
ポリエチレングリフールを除いた後、HAT(ヒボキサ
ンチン、アミノプテリン、チミジン)培地に懸濁し、9
6穴平底マイクロプレートに1ウエルあたりの肺臓細胞
数が約5×106個/200μlとなるように蒔き込ん
だ。培養開始後4〜5日目に各ウェルの半量のHAT培
地を交換し、9〜13日目にハイブリドーマのコロニー
形成を確認して、培養上清のHBs抗体価をPHAM集
試薬(エーザイ、PHA法エーザイキット)で測定した
。培養上清25μIを生理食塩水100IIIで5倍に
希釈後、その5μmをとり、キット添付の希釈液50t
tlおよび抗原感作血球25μlを加えて混合し、凝集
陽性を示したウェルを抗HBs抗体産生ハイブリドーマ
を含むものとした。
HBs抗体産生ハイブリドーマを限界希釈法により3回
クローニングし、安定な抗HBsモノクローナル抗体産
生ハイブリドーマを26株得た。
クローニングし、安定な抗HBsモノクローナル抗体産
生ハイブリドーマを26株得た。
得られたハイブリドーマは90%FC3,10%ジメチ
ルスルホキシド中に懸濁し、−80°C庫および液体窒
素中に保存した。
ルスルホキシド中に懸濁し、−80°C庫および液体窒
素中に保存した。
■、モ・ツクローナル抗体の製造
8J!l令以上のBALB/cマウスの腹腔内にブリス
クン(2,6,10,14−テトラメゾルーペンタデカ
ン)0.25m1を投与し、3〜14日後に、PBS懸
濁液としたハイブリドーマ1×101個(1ml)を腹
腔内に投与した。投与10〜20日後に貯留した腹水を
採取した。腹水中にはPHA抗体価で4万〜512万倍
の抗HBsモノクローナル抗体が含まれていた。腹水の
採取量はBALB/Cマウス−匹あたり1〜5mlであ
った。
クン(2,6,10,14−テトラメゾルーペンタデカ
ン)0.25m1を投与し、3〜14日後に、PBS懸
濁液としたハイブリドーマ1×101個(1ml)を腹
腔内に投与した。投与10〜20日後に貯留した腹水を
採取した。腹水中にはPHA抗体価で4万〜512万倍
の抗HBsモノクローナル抗体が含まれていた。腹水の
採取量はBALB/Cマウス−匹あたり1〜5mlであ
った。
V、モノクローナル抗体のアイソタイプおよび該モノク
ローナル抗体の認識するHBs抗原のサブタイプ 分離確立した26種のハイブリドーマが産生するモノク
ローナル抗体のアイソタイプを以下の様にして同定した
。
ローナル抗体の認識するHBs抗原のサブタイプ 分離確立した26種のハイブリドーマが産生するモノク
ローナル抗体のアイソタイプを以下の様にして同定した
。
免疫グロブリンのアイソタイプはHBi抗体産生ハイブ
リドーマの培養上清および精製モノクローナル抗体(後
述)をヒツジ抗マウス免疫グロブリンM、G、A%G1
、G8いGo、G8、におよび入鎖面清とアガロースゲ
ル内で反応させ沈降線の生成により確認するオフタロ二
−二重免疫拡散法により同定した。この時、培養上清と
各血清とは1:1の比で反応きせることにより、精製モ
ノクローナル抗体は10”に適当に希釈することにより
、明瞭な沈降線が観察された。
リドーマの培養上清および精製モノクローナル抗体(後
述)をヒツジ抗マウス免疫グロブリンM、G、A%G1
、G8いGo、G8、におよび入鎖面清とアガロースゲ
ル内で反応させ沈降線の生成により確認するオフタロ二
−二重免疫拡散法により同定した。この時、培養上清と
各血清とは1:1の比で反応きせることにより、精製モ
ノクローナル抗体は10”に適当に希釈することにより
、明瞭な沈降線が観察された。
モノクローナル抗体の認識するHBs抗原のサブタイプ
を決定するために、まずサブタイプ既知HBs抗原(a
dr、 adw、ayr、 ayw )とのオフタロ二
−二重免疫拡散法により、各抗原を認識するモノクロー
ナル抗体22B7(抗a)、11F1(抗ar)、5A
5(抗d)、18E9(抗d)を得た。このサブタイプ
既知モノクローナル抗体で感作したニワトリ血球とのR
PHI法により、各モノクローナル抗体の認識するHB
s抗原のサブタイプを決定した。即ち、HBs抗yi、
陽性血清(抗原価256倍)を2〜256倍まで2倍段
階希釈した後、抗HBsモノクローナル抗体(抗体価1
000倍)25μlを各ウェルに加え、37℃で1時間
中和反応を行なわせ、ついで抗a(22B7)、抗5r
(IIFI)、抗d(5A5)、抗d(18E9)抗体
感作ニワトリ固定血球を25μl各ウエルに添加し、混
和後、室温に40〜60分間静置して凝集像を観察した
。HBsFJ′Lgと各モノクローナル抗体感作血球と
の凝集反応を2管以上阻止した場合を陽性とし、感作に
用いたモノクローナル抗体と同じサブタイプを認識して
いると判定した。
を決定するために、まずサブタイプ既知HBs抗原(a
dr、 adw、ayr、 ayw )とのオフタロ二
−二重免疫拡散法により、各抗原を認識するモノクロー
ナル抗体22B7(抗a)、11F1(抗ar)、5A
5(抗d)、18E9(抗d)を得た。このサブタイプ
既知モノクローナル抗体で感作したニワトリ血球とのR
PHI法により、各モノクローナル抗体の認識するHB
s抗原のサブタイプを決定した。即ち、HBs抗yi、
陽性血清(抗原価256倍)を2〜256倍まで2倍段
階希釈した後、抗HBsモノクローナル抗体(抗体価1
000倍)25μlを各ウェルに加え、37℃で1時間
中和反応を行なわせ、ついで抗a(22B7)、抗5r
(IIFI)、抗d(5A5)、抗d(18E9)抗体
感作ニワトリ固定血球を25μl各ウエルに添加し、混
和後、室温に40〜60分間静置して凝集像を観察した
。HBsFJ′Lgと各モノクローナル抗体感作血球と
の凝集反応を2管以上阻止した場合を陽性とし、感作に
用いたモノクローナル抗体と同じサブタイプを認識して
いると判定した。
■、モノクローナル抗体の精製
免疫グロブリンクラスIgG+に属するモノクローナル
抗体はプロティンAアフィニティークロマト法により精
製した。
抗体はプロティンAアフィニティークロマト法により精
製した。
腹水を遠心後、0.45μmメンプラン濾過した後、1
00mMリン酸バッファー(pH92)に透析し、同バ
ッファーで平衡化したプロティンAセファロースカラム
にか(す、吸着したIgG1を0.1M酢酸、0.14
M塩化ナトリウム溶液で溶出し、直ちに2Mトリス−塩
酸緩衝液(pH9,0)を適量加えて中和した後、PB
Sで透析して精製モノクローナル抗体(IgG+)とし
た。
00mMリン酸バッファー(pH92)に透析し、同バ
ッファーで平衡化したプロティンAセファロースカラム
にか(す、吸着したIgG1を0.1M酢酸、0.14
M塩化ナトリウム溶液で溶出し、直ちに2Mトリス−塩
酸緩衝液(pH9,0)を適量加えて中和した後、PB
Sで透析して精製モノクローナル抗体(IgG+)とし
た。
IgG、、クラスのモノクローナル抗体は、腹水を遠心
濾過後、100mMリン酸バッファー(pH8,2)に
透析し、以下IgG、と同様に操作して精製モノクロー
ナル抗体とした。
濾過後、100mMリン酸バッファー(pH8,2)に
透析し、以下IgG、と同様に操作して精製モノクロー
ナル抗体とした。
IgMクラスのモノクローナル抗体は、ハイドロキシア
パタイトクロマト法で精製した。腹水を遠心濾過して不
溶物を除いた後、0.1Mリン酸バッファー(pH6,
8)に透析し、同バッファーで平衡化したハイドロキシ
アパタイトカラムに吸着させた。吸着したIgMを、リ
ン酸濃度をステップワイズにあげて溶出しく0.2〜0
.4M)、溶出液をPBSで平衡化したセファデックス
G25カラムに通してバッファーをPBSに交換し、精
製モノクローナル抗体(I gM)とした。
パタイトクロマト法で精製した。腹水を遠心濾過して不
溶物を除いた後、0.1Mリン酸バッファー(pH6,
8)に透析し、同バッファーで平衡化したハイドロキシ
アパタイトカラムに吸着させた。吸着したIgMを、リ
ン酸濃度をステップワイズにあげて溶出しく0.2〜0
.4M)、溶出液をPBSで平衡化したセファデックス
G25カラムに通してバッファーをPBSに交換し、精
製モノクローナル抗体(I gM)とした。
■1等電点の測定
上記精製モノクローナル抗体のうち、14種について等
電点を測定した。
電点を測定した。
IgGクラスのモノクローナル抗体の等電点は薄層ポリ
アクリルアミドゲル等電点電気泳動法により、IgMク
ラスのモノクローナル抗体の等電点は薄層アガロース等
電点電気泳動法により測定した。
アクリルアミドゲル等電点電気泳動法により、IgMク
ラスのモノクローナル抗体の等電点は薄層アガロース等
電点電気泳動法により測定した。
(1)薄層ポリアクリルミドゲル等電点電気泳動アンフ
オラインFAGプレート(LKB社、pH3,5〜9.
5)の陽極に1Mリン酸、陰極に1M水酸化ナトリウム
を浸した電極濾紙をセットした。プレート上にIgGク
ラスのモノクローナル抗体を含ませたサンプルアプリケ
ーター濾紙をセットし、定電力30W1温度10℃で1
.5時間泳動した。泳動終了後、ゲルプレートを固定液
0につけ、60分間放置後、ゲル表面を脱色液0ですす
ぎ、60℃の染色液0中で10分間染色した。ついでゲ
ルを脱色液中に移し、余分の染色液を脱色後、ゲルをグ
リセリン保存液噛に60分間浸し、室温で一夜乾燥後、
プラスチックシートをかぶせて保存した。
オラインFAGプレート(LKB社、pH3,5〜9.
5)の陽極に1Mリン酸、陰極に1M水酸化ナトリウム
を浸した電極濾紙をセットした。プレート上にIgGク
ラスのモノクローナル抗体を含ませたサンプルアプリケ
ーター濾紙をセットし、定電力30W1温度10℃で1
.5時間泳動した。泳動終了後、ゲルプレートを固定液
0につけ、60分間放置後、ゲル表面を脱色液0ですす
ぎ、60℃の染色液0中で10分間染色した。ついでゲ
ルを脱色液中に移し、余分の染色液を脱色後、ゲルをグ
リセリン保存液噛に60分間浸し、室温で一夜乾燥後、
プラスチックシートをかぶせて保存した。
モノクローナル抗体の等電点は、同時に泳動したキャリ
ブレーション用p!既知タンパクの泳動距離を基準にし
て求めた。
ブレーション用p!既知タンパクの泳動距離を基準にし
て求めた。
率固定液:メタノール 150m1
蒸留水 350m1
スルホサリチル酸 17.25 g
トリクロロ酢酸 57.5 g
染色液:コマジ−ブリリアントブルー
R2500,115g
脱色液 100m1
脱色液:エタノール 500m1
酢#160m1
蒸留水を加え全量を2Lとする
保存液:グリセリン 50m1
脱色液 500m1
(2)7ンフオライン・アガロース・プレート(LKB
社、pH3,5〜9,5)の陽極側に0゜5M酢酸、陰
極側に0.5M塩化ナトリウムを含ませた電極用濾紙を
置き、プレート上にモノクローナル抗体を含ませたアプ
リケーター濾紙を置き、初期電圧を5oovにセットし
、定電圧で30分間泳動する(10°C)、泳動後、ア
ガロースゲルを固定液0に10分間浸し、ついでエタノ
ールに10分間浸す、ゲルをドライヤーで乾燥後染色液
0に5分間浸し、ついで脱色液0で余分の脱色液を除く
。脱色後、ゲルを乾燥し、保存する。
社、pH3,5〜9,5)の陽極側に0゜5M酢酸、陰
極側に0.5M塩化ナトリウムを含ませた電極用濾紙を
置き、プレート上にモノクローナル抗体を含ませたアプ
リケーター濾紙を置き、初期電圧を5oovにセットし
、定電圧で30分間泳動する(10°C)、泳動後、ア
ガロースゲルを固定液0に10分間浸し、ついでエタノ
ールに10分間浸す、ゲルをドライヤーで乾燥後染色液
0に5分間浸し、ついで脱色液0で余分の脱色液を除く
。脱色後、ゲルを乾燥し、保存する。
モノクローナル抗体の等電点は同時に泳動したキャリブ
レーション用pt既知タンパクの泳動距離を基準にして
求めた。
レーション用pt既知タンパクの泳動距離を基準にして
求めた。
本固定液ニトリクロロ酢酸 100g
スルホサリチル酸 10g
蒸留水 10100O
染色液二コマジ−ブリリアントブルー
R2501,5g
脱色液 300m1
脱色液:95%エタノール 350ml氷酢酸 100
m1 蒸留水で10100Oとする 以北の結果を表2に示す。
m1 蒸留水で10100Oとする 以北の結果を表2に示す。
表2 モノクローナル抗体の性質
72 ([き) モノクローナル抗体の性質i モノク
ローナル抗体感作血球によるHBs抗凍0検出 得られたモノクローナル抗体の内、12種についてHB
s抗原の検出感度を測定した。
ローナル抗体感作血球によるHBs抗凍0検出 得られたモノクローナル抗体の内、12種についてHB
s抗原の検出感度を測定した。
(1〉ニワトリ固定血球の調整
ニワトリ固定血球を600gで5分間遠心後、ト清を捨
て、生理食塩水に浮遊させ、600gで5分間遠心して
上清を捨てる。この操作を3回繰り返した後、血球を5
(V/V)%になるようにPBSに浮遊させ、1〜1
.2%(V/V、PBS)グルタルアルデhドを171
0量加え、室温で1〜2時間ゆっくり混和して固定する
。固定後、血球を蒸留水で5回遠心洗浄(600g、5
分)し、5%濃度にした後、アジ化ナトリウムを0.1
%量加え、冷蔵庫内に保存する。
て、生理食塩水に浮遊させ、600gで5分間遠心して
上清を捨てる。この操作を3回繰り返した後、血球を5
(V/V)%になるようにPBSに浮遊させ、1〜1
.2%(V/V、PBS)グルタルアルデhドを171
0量加え、室温で1〜2時間ゆっくり混和して固定する
。固定後、血球を蒸留水で5回遠心洗浄(600g、5
分)し、5%濃度にした後、アジ化ナトリウムを0.1
%量加え、冷蔵庫内に保存する。
(2)モノクローナル抗体感作血球のy4!!ニワトリ
固定血ff (5V/V%)2mlを生理食塩水で3回
遠心洗浄(600g、5分)し、これに抗HBsモノク
ローナル抗体(25〜500μg/ m l )の生理
食塩水2mlを等量混合し、ついで塩化クロムを終濃度
25〜200μg / m lになるように加え、室温
で2時間緩やかに攪拌しながら感作する。感作後、0.
5%BSA/PBSで5回遠心洗浄(600g、5分)
し、最後に感作血球をO,S%BSA/PBS16ml
に浮遊してモノクローナル抗体感作血球とした。
固定血ff (5V/V%)2mlを生理食塩水で3回
遠心洗浄(600g、5分)し、これに抗HBsモノク
ローナル抗体(25〜500μg/ m l )の生理
食塩水2mlを等量混合し、ついで塩化クロムを終濃度
25〜200μg / m lになるように加え、室温
で2時間緩やかに攪拌しながら感作する。感作後、0.
5%BSA/PBSで5回遠心洗浄(600g、5分)
し、最後に感作血球をO,S%BSA/PBS16ml
に浮遊してモノクローナル抗体感作血球とした。
表3に感作血球のHBs抗原検出感度を示した。
(以下余白)
以上の様に、モノクローナル抗体HB s 18 E9
、HBs8C1、HBs22B7を用いた場合、最も検
出感度が高く非特異反応が少ない。
、HBs8C1、HBs22B7を用いた場合、最も検
出感度が高く非特異反応が少ない。
該抗HBs抗体産生ハイブリドーマは、英国Porto
n Down、 5alisbury Wiltshi
re SF30JGのECACC(Europeaa
Co11ection of AaLmal
Ce1lCultures)にブダペスト条約に基づき
寄託きれている。受託番号および受託日は下記のとおり
である。
n Down、 5alisbury Wiltshi
re SF30JGのECACC(Europeaa
Co11ection of AaLmal
Ce1lCultures)にブダペスト条約に基づき
寄託きれている。受託番号および受託日は下記のとおり
である。
(以下余白)
天」目1至
1、免疫原の調製
ヒトブール血清100m1を、遠心C2000g、10
分)、0.45d−メンプラン濾過後100mMリン酸
バッファ(p[,8)に透析し同バッファでv漸化した
ハイドaキシアパタイトカラムに吸着させた。吸着した
fgMをリン酸濃度をステップ・フイズにあげて溶出し
く0.2〜0.4M)、1iJf液をPBSで平衡化し
たセブアデンクス025カラムに通してバッファをPB
Sに交換し精製IgMとした 表4 ヒトIgMの精製 タンパクはLowry らの方法(J、 Riot、
Chem、、193265−275(1971)によ
り測定した。
分)、0.45d−メンプラン濾過後100mMリン酸
バッファ(p[,8)に透析し同バッファでv漸化した
ハイドaキシアパタイトカラムに吸着させた。吸着した
fgMをリン酸濃度をステップ・フイズにあげて溶出し
く0.2〜0.4M)、1iJf液をPBSで平衡化し
たセブアデンクス025カラムに通してバッファをPB
Sに交換し精製IgMとした 表4 ヒトIgMの精製 タンパクはLowry らの方法(J、 Riot、
Chem、、193265−275(1971)によ
り測定した。
i、hト18M感作血球の調製
抗ヒトIgM抗体検出試薬として1で精製したヒトIg
Mをニワトリ固定血球に感作し、 PHA法試薬を調
製した。
Mをニワトリ固定血球に感作し、 PHA法試薬を調
製した。
(1)ニワトリ固定血球の調製
ニアトリ保存血液を600g5分間遠心後上清をすて、
生理食塩水に浮遊させ600g5分間遠心し℃上清をす
てる。この操作を3回繰り返した後血球を5’/v%に
なるようにPBSに浮遊させ、1 ” 1.2%(’/
v P B S ) クル9ル”Iルテヒドを1八、量
加え室温で1〜2時間ゆっくり混和して固定する。固定
後、血球を蒸留水で5回遠心洗浄(600g、5分)し
、5v/v%濃度にした後NaN5を0.1%量加え、
冷蔵庫内に保存する。
生理食塩水に浮遊させ600g5分間遠心し℃上清をす
てる。この操作を3回繰り返した後血球を5’/v%に
なるようにPBSに浮遊させ、1 ” 1.2%(’/
v P B S ) クル9ル”Iルテヒドを1八、量
加え室温で1〜2時間ゆっくり混和して固定する。固定
後、血球を蒸留水で5回遠心洗浄(600g、5分)し
、5v/v%濃度にした後NaN5を0.1%量加え、
冷蔵庫内に保存する。
(クヒトIgM感作ニアトリ固定血球の調製ニワトリ固
定血球(5’/V%)2a+1をPBSで2回遠心・洗
浄(600g、5分)し、PBSで41の懸濁液とする
。これをタンニンmc5mg/di)PBS溶液と等量
混合し、37℃で10分間ゆるく攪拌しながらタンニン
酸処理する。タンニン酸処理血球をPBSで2回遠心洗
/$(600g、5分)後PB58mlの懸濁液とし、
精製ヒト I gM(100μg/ml PB
S 、 p)16.2 ) 溶液を等篭加えて室温で
2時間攪拌する。ついでグルタルアルデヒドを0.00
1%量加え、さらに室温で1時間攪拌する。0.5%B
SA/PBS で5回遠心洗浄(600g、5分)t
、16m1の懸濁液にしてヒトIgM感作血球とした。
定血球(5’/V%)2a+1をPBSで2回遠心・洗
浄(600g、5分)し、PBSで41の懸濁液とする
。これをタンニンmc5mg/di)PBS溶液と等量
混合し、37℃で10分間ゆるく攪拌しながらタンニン
酸処理する。タンニン酸処理血球をPBSで2回遠心洗
/$(600g、5分)後PB58mlの懸濁液とし、
精製ヒト I gM(100μg/ml PB
S 、 p)16.2 ) 溶液を等篭加えて室温で
2時間攪拌する。ついでグルタルアルデヒドを0.00
1%量加え、さらに室温で1時間攪拌する。0.5%B
SA/PBS で5回遠心洗浄(600g、5分)t
、16m1の懸濁液にしてヒトIgM感作血球とした。
−、マウス肺臓細胞の調製
BALB/c 7ウスに精製IgM 100μgとフ
ロイント完全アジュバントの混合物0 、2 mlを背
皮下に投与し以後18Mのみ(50ttg)を2週問お
きに3回〜5回背皮下に投与して最終免疫の3日後に肺
臓細胞をマウスから取り出し、細胞融合に供した。
ロイント完全アジュバントの混合物0 、2 mlを背
皮下に投与し以後18Mのみ(50ttg)を2週問お
きに3回〜5回背皮下に投与して最終免疫の3日後に肺
臓細胞をマウスから取り出し、細胞融合に供した。
■、ハイブリドーマの調製
マウス肺臓細胞とマウス骨髄腫細胞SP210−Ag1
4(SF3)を常法により融合させた。
4(SF3)を常法により融合させた。
マウス肺臓細胞を取り出し、15%FC8添加RPMI
1840培地10m1懸瀾液とし200×g、5分
間遠心後細胞を適量の0.17MNH4Clで処理して
、含まれる赤血球を破壊した後、FCSを含まないRP
MI 1640培地5mlに懸濁した。同じFCSを
含まない培地5mlに懸濁したSP2細胞を、上記の方
法で作製した肺臓細胞の1八I加え、良く混合した後、
200Xg、5分間遠心してRPMI 1640培地
を除き、37°Cに加温した50%ポリエチレングリフ
ール4.0001ml(RPMI 1640培地と等
量混合)を徐々に加え、良く攪拌して細胞を融合させた
。融合後、15%FC3添加RPMI 1640培地
を徐々に加λ9、細胞を200Xg、5分間遠心洗浄し
てポリエチレングリフールを除いた後、HAT(ハイポ
キサンチン、アミノプテリン、チミジン)培地に懸濁し
96穴平底マイクロプレートに1ウエルあたりの肺臓細
胞数が約5xio’個/200μmとなるようにまきこ
んだ、培養開始4〜5日目に各ウェルのHAT培地の半
量を交換し9〜13日目にハイブリドーマのコロニー形
成を確認して培養上清の抗IgM抗体価をiで得たP)
tA凝集試薬で測定した。
1840培地10m1懸瀾液とし200×g、5分
間遠心後細胞を適量の0.17MNH4Clで処理して
、含まれる赤血球を破壊した後、FCSを含まないRP
MI 1640培地5mlに懸濁した。同じFCSを
含まない培地5mlに懸濁したSP2細胞を、上記の方
法で作製した肺臓細胞の1八I加え、良く混合した後、
200Xg、5分間遠心してRPMI 1640培地
を除き、37°Cに加温した50%ポリエチレングリフ
ール4.0001ml(RPMI 1640培地と等
量混合)を徐々に加え、良く攪拌して細胞を融合させた
。融合後、15%FC3添加RPMI 1640培地
を徐々に加λ9、細胞を200Xg、5分間遠心洗浄し
てポリエチレングリフールを除いた後、HAT(ハイポ
キサンチン、アミノプテリン、チミジン)培地に懸濁し
96穴平底マイクロプレートに1ウエルあたりの肺臓細
胞数が約5xio’個/200μmとなるようにまきこ
んだ、培養開始4〜5日目に各ウェルのHAT培地の半
量を交換し9〜13日目にハイブリドーマのコロニー形
成を確認して培養上清の抗IgM抗体価をiで得たP)
tA凝集試薬で測定した。
培養上清10μmをPBS 200μmで20倍に希
釈後、その25μmをとりヒトIgM感作血球25μm
を加えて混合し、凝集陽性を示したウェルを抗ヒトIg
M抗体産生ハイブリドーマを含むものとした。抗ヒトI
gM抗体産生ハイブリドーマを限界希釈法により3回ク
ローニングし安定な抗ヒトIgMモノクローナル抗体産
生ハイブリドーマを5株得た。得られたハイブリドーマ
は90%FC5,10%ジメチルスルホキシド中に懸l
開し、−80℃庫および液体窒素中に保存した。
釈後、その25μmをとりヒトIgM感作血球25μm
を加えて混合し、凝集陽性を示したウェルを抗ヒトIg
M抗体産生ハイブリドーマを含むものとした。抗ヒトI
gM抗体産生ハイブリドーマを限界希釈法により3回ク
ローニングし安定な抗ヒトIgMモノクローナル抗体産
生ハイブリドーマを5株得た。得られたハイブリドーマ
は90%FC5,10%ジメチルスルホキシド中に懸l
開し、−80℃庫および液体窒素中に保存した。
そのうちの1株をHIgM10C9と命名した。
該抗ヒトIgM抗体産生ハイブリドーマH18MI O
C9は、1987年3月19日から英国Porton
Down、 5alisbury Wiltshira
SF30JGのECACC(European Co
11ection of Animal Ce1lCu
ltures)にブダペスト条約に基づき受託番号87
031903として寄託されている。
C9は、1987年3月19日から英国Porton
Down、 5alisbury Wiltshira
SF30JGのECACC(European Co
11ection of Animal Ce1lCu
ltures)にブダペスト条約に基づき受託番号87
031903として寄託されている。
V、モノクローナル抗体の製造
8週令以上のBALB/cマウスの腹腔内にプリスタン
(2、6、10、14−tetramethyl−pe
ntadecana)0.25m1を投与し、3〜14
日後に、PBS懸濁液としたハイブリドーマlX10’
個(1ml)を腹腔内に投与した。投与後10〜20日
後に貯留した腹水を採取した。腹水中にはPHA抗体価
で16万〜64万の抗ヒトIgMモノクローナル抗体が
含まれていた。腹水の採取量はBALB/cマウス−匹
あたり1〜5mlであった。
(2、6、10、14−tetramethyl−pe
ntadecana)0.25m1を投与し、3〜14
日後に、PBS懸濁液としたハイブリドーマlX10’
個(1ml)を腹腔内に投与した。投与後10〜20日
後に貯留した腹水を採取した。腹水中にはPHA抗体価
で16万〜64万の抗ヒトIgMモノクローナル抗体が
含まれていた。腹水の採取量はBALB/cマウス−匹
あたり1〜5mlであった。
■、モノクローナル抗体の性質
分離・確立したハイブリドーマHIgM10C9の産生
するモノクローナル抗体の性質を表5に示した。
するモノクローナル抗体の性質を表5に示した。
免疫グロブリンのアイソタイプは抗ヒトIgM抗体産生
ハイブリドーマの培養上清をヒツジ抗マウス免疫グロブ
リンM、G、A、G1.Gs−Gsb−Gs。
ハイブリドーマの培養上清をヒツジ抗マウス免疫グロブ
リンM、G、A、G1.Gs−Gsb−Gs。
におよびλ鎖血清とアガロースゲル内で反応させ沈降線
の生成により確認するオフタロ二−二重免疫拡散法によ
り同定した。
の生成により確認するオフタロ二−二重免疫拡散法によ
り同定した。
モノクローナル抗体と免疫グロブリンとの反応は市販の
精製ヒトIgM、ヒトIgGおよびヒトIgA(カッペ
ル社)をニワトリ固定血球にタンニン酸法で感作したP
HA試薬(i、ヒトTgM感作血球の調製参照)により
確認した。
精製ヒトIgM、ヒトIgGおよびヒトIgA(カッペ
ル社)をニワトリ固定血球にタンニン酸法で感作したP
HA試薬(i、ヒトTgM感作血球の調製参照)により
確認した。
(以下余白)
・等電点の測定
モノクローナル抗体の等電点は薄層アガロース等1点寛
気泳動法により測定した。
気泳動法により測定した。
アンフオライン・アガロース・プレート(LKB社、p
H3,5〜9.5)の陽極側に0.5M酢酸、陰極側に
0゜5M塩化ナトリウムを含ませた電極用濾紙を置き、
プレート上にモノクローナル抗体を含ませたアプリケ−
タル濾紙を置き、初期電圧を500vにセットし、定電
圧で30分間泳動する(10℃)。泳動後、アガロース
ゲルを固定液1に10分間浸し、ついでエタノールに1
0分間浸す、ゲルをドライヤーで乾燥後染色液1に5分
間浸し、ついで脱色液9で余分の染色液を除く、脱色後
、ゲルを乾燥し、保存した。
H3,5〜9.5)の陽極側に0.5M酢酸、陰極側に
0゜5M塩化ナトリウムを含ませた電極用濾紙を置き、
プレート上にモノクローナル抗体を含ませたアプリケ−
タル濾紙を置き、初期電圧を500vにセットし、定電
圧で30分間泳動する(10℃)。泳動後、アガロース
ゲルを固定液1に10分間浸し、ついでエタノールに1
0分間浸す、ゲルをドライヤーで乾燥後染色液1に5分
間浸し、ついで脱色液9で余分の染色液を除く、脱色後
、ゲルを乾燥し、保存した。
モノクローナル抗体の等電点は同時に泳動したキャリブ
レーション用pt既知タンパクの泳動距離を基準にして
求めた。
レーション用pt既知タンパクの泳動距離を基準にして
求めた。
本固定液ニトリクロロ酢酸 100g
スルホサリチル酸 IQg
蒸留水 10100O
染色液:コマジ−ブリリアントブルー
R2501,5g
脱色液 300m1
脱色液=95%エタノール 350m1氷酢酸 100
m1 蒸留水で10100Oとする i、モノクローナル抗体の精製 抗ヒトIgMモノクローナル抗体l(IgM10C9は
、ハイドロキシアパタイトクロマト法で精製した。腹水
を遠心濾過して不溶物を除いた後、0.1Mリン酸バッ
ファー(pH6,8)に透析し、同バッファーで平衡化
したハイドロキシアパタイトカラムに吸着させた。吸着
したIgMを、リン#濃度をステップワイズにあげて溶
出しく0.2〜0.4M)、溶出液をPBSで平衡化し
たセファデックスG2Sカラムに通してバッファーをP
BSに交換し、精製モノクローナル抗体(IgM)とし
た。
m1 蒸留水で10100Oとする i、モノクローナル抗体の精製 抗ヒトIgMモノクローナル抗体l(IgM10C9は
、ハイドロキシアパタイトクロマト法で精製した。腹水
を遠心濾過して不溶物を除いた後、0.1Mリン酸バッ
ファー(pH6,8)に透析し、同バッファーで平衡化
したハイドロキシアパタイトカラムに吸着させた。吸着
したIgMを、リン#濃度をステップワイズにあげて溶
出しく0.2〜0.4M)、溶出液をPBSで平衡化し
たセファデックスG2Sカラムに通してバッファーをP
BSに交換し、精製モノクローナル抗体(IgM)とし
た。
(以下余白)
実施例3
抗ムンプスウィルスモノクローナル抗体書、免疫原の調
製 (1)ムンプスウィルス粗HA抗原液の調製ムンプスウ
ィルス(EXCH−2)をVero細胞(FlowLa
boratories Inc、 )で培養し産生され
たHA抗原を精製してHA抗原とした。Vero細胞5
X107個をローラーボトルに蒔きこみ、5%C3(子
牛血清)添加MEM培地で回転培養(0,3rpm。
製 (1)ムンプスウィルス粗HA抗原液の調製ムンプスウ
ィルス(EXCH−2)をVero細胞(FlowLa
boratories Inc、 )で培養し産生され
たHA抗原を精製してHA抗原とした。Vero細胞5
X107個をローラーボトルに蒔きこみ、5%C3(子
牛血清)添加MEM培地で回転培養(0,3rpm。
37℃)し単層にした。このVero細胞にムンブスウ
イJl−スEXCH−2をM、 O,1,−0,001
〜0.1テ感染きtt2%C8添加MEM培地で5〜7
日間培養し、CPE(細胞変性効果)が100%認めら
れた時点で細胞を集めてPBS浮遊液とし、超音波処理
C10KHz、2.IA、10分)後、細胞の残渣を遠
心(6000g、20分)して除き、上清を粗HA抗原
液とした。
イJl−スEXCH−2をM、 O,1,−0,001
〜0.1テ感染きtt2%C8添加MEM培地で5〜7
日間培養し、CPE(細胞変性効果)が100%認めら
れた時点で細胞を集めてPBS浮遊液とし、超音波処理
C10KHz、2.IA、10分)後、細胞の残渣を遠
心(6000g、20分)して除き、上清を粗HA抗原
液とした。
(りHA抗原の不活化
粗HA抗原液に1%量waen 80水溶液を1/、1
加え室温で5分間強く振盪する。ついで1八量の〉エチ
ルエーテルを加え4℃で15分間強く振盪する。この液
を1.600g、20分間遠心し、エーテル層を吸引除
去する。水層に適量のチッ素を通し残存するエーテルを
とばして不活化粗HA抗原液とした。
加え室温で5分間強く振盪する。ついで1八量の〉エチ
ルエーテルを加え4℃で15分間強く振盪する。この液
を1.600g、20分間遠心し、エーテル層を吸引除
去する。水層に適量のチッ素を通し残存するエーテルを
とばして不活化粗HA抗原液とした。
(3)ガチョウ固定血球の調製
ガブーヨウ保存血液を600g5分間遠心後上清をすて
、生理食塩水に浮遊させ600g5分間遠心して洗浄し
た。この洗浄操作を3回くり返した後血球を5v/v%
になるようにPBSに浮遊移せ、12%(v/vPBs
)グルタルアルデヒドを1八。1加え室温で1〜2時間
ゆっくり混和して固定する。固定後、血球を蒸留水で5
回遠心洗浄(600g、5分) L、 10 v/V%
濃度にした後NaN、を0.1%量加え、冷蔵庫内に保
存した。
、生理食塩水に浮遊させ600g5分間遠心して洗浄し
た。この洗浄操作を3回くり返した後血球を5v/v%
になるようにPBSに浮遊移せ、12%(v/vPBs
)グルタルアルデヒドを1八。1加え室温で1〜2時間
ゆっくり混和して固定する。固定後、血球を蒸留水で5
回遠心洗浄(600g、5分) L、 10 v/V%
濃度にした後NaN、を0.1%量加え、冷蔵庫内に保
存した。
(4) HA抗原の精製
不活化粗HA抗原液にガチョウ固定血球100m1を加
え、4℃−夜ゆるく攪拌してHA抗原を、血球に吸着さ
せた。未吸着のタンパクは4℃で3回遠心除去(600
g;、5分)後、血球をPBS50mlに浮遊許せ37
℃で3時間放置し、HA抗j東を血球から遊離させ、遠
心した上清を精製ムンゾスウィfレスHA抗原とした(
HA価384倍、タンパク420μg/ ml )。
え、4℃−夜ゆるく攪拌してHA抗原を、血球に吸着さ
せた。未吸着のタンパクは4℃で3回遠心除去(600
g;、5分)後、血球をPBS50mlに浮遊許せ37
℃で3時間放置し、HA抗j東を血球から遊離させ、遠
心した上清を精製ムンゾスウィfレスHA抗原とした(
HA価384倍、タンパク420μg/ ml )。
■、ムンプスウィルスHA抗原感作血球の調製(1)ニ
ワトリ固定血球の調製 、−′ノh IJ保存血球を600g5分間遠心後、上
清をすて、生理食塩水に浮遊きせ600g5分間遠心し
て上l^をすてる。この操作を3回くり返した後血球を
5v/v%になるようにPBSに浮遊さけ、1〜1.2
%(v/vPBS)グルタルアルデヒドを1八。1加え
、室温で1〜2時間ゆっくり混和して固定する。固定後
、血球を蒸留水で5回遠心洗711(600g、5分)
し5v/v%濃度にした後NaN、を0.1%量加え、
冷蔵庫内に保存する。
ワトリ固定血球の調製 、−′ノh IJ保存血球を600g5分間遠心後、上
清をすて、生理食塩水に浮遊きせ600g5分間遠心し
て上l^をすてる。この操作を3回くり返した後血球を
5v/v%になるようにPBSに浮遊さけ、1〜1.2
%(v/vPBS)グルタルアルデヒドを1八。1加え
、室温で1〜2時間ゆっくり混和して固定する。固定後
、血球を蒸留水で5回遠心洗711(600g、5分)
し5v/v%濃度にした後NaN、を0.1%量加え、
冷蔵庫内に保存する。
(2)ムンプスウィルスHA抗原感作ニワトリ固定血球
の調製(PHA凝集法試薬) ニワトリ固定血球(5v/v%)2m1をPBSで2回
遠心・洗浄(600g、5分)し、PBSで4mlの懸
濁液とする。この固定血球とタンニン酸(5mg/di
) P B S溶液とを等量混合し、37°Cで10分
間ゆるく攪拌しながらタンニン酸処理する。タンニン酸
処理血球をPBSで2回遠心洗浄(600g、5分)後
PB38mlの懸濁液とし、精製ムンプスウィルスHA
抗原(100μg/mlPBS、pH8,2)溶液を等
1加えて室温で2時間攪拌する。0.5%BSA/PB
Sで5回遠心洗4(600g、5分)1,16m1の懸
濁液にしてムンクスウイルスHA抗原感作血球とした。
の調製(PHA凝集法試薬) ニワトリ固定血球(5v/v%)2m1をPBSで2回
遠心・洗浄(600g、5分)し、PBSで4mlの懸
濁液とする。この固定血球とタンニン酸(5mg/di
) P B S溶液とを等量混合し、37°Cで10分
間ゆるく攪拌しながらタンニン酸処理する。タンニン酸
処理血球をPBSで2回遠心洗浄(600g、5分)後
PB38mlの懸濁液とし、精製ムンプスウィルスHA
抗原(100μg/mlPBS、pH8,2)溶液を等
1加えて室温で2時間攪拌する。0.5%BSA/PB
Sで5回遠心洗4(600g、5分)1,16m1の懸
濁液にしてムンクスウイルスHA抗原感作血球とした。
鍔、マウス肺臓細胞の調製
ムンプスウィルスHA抗! 1008gとフロイント完
全アジュバントの混合物0.2mlをBAI。
全アジュバントの混合物0.2mlをBAI。
B/c マウスの背皮下に投与し、以後HA抗原のみ
(50μg)を2週問おきに3回〜5回背皮下に投与し
て最終免疫の3日後に肺臓細胞をマウスから取り出し、
細砲融合番こ供した。
(50μg)を2週問おきに3回〜5回背皮下に投与し
て最終免疫の3日後に肺臓細胞をマウスから取り出し、
細砲融合番こ供した。
■、ハイブリドーマの調製
マウス肺臓!m胞とマウス骨髄腫細胞SP 210−A
g14 (SF3)を常法により融合させた。マウス肺
臓細胞を取り出し、15%FC3添加RPMI1640
培地10m1懸濁液とし200g、5分間遠心後、細胞
を適量の0.17M NH,C1で処理して、含まれる
赤血球を破壊した後、Fe2を含まない培地5mlに懸
濁したSP2細胞を、肺臓細胞の1八景加え、良く混合
した後、200Xg、5分間遠心してRPMI 16
40培地を除き、37℃に加温した50%ポリエデレン
グリコール4.0001 ml(RPMI 1640培
地と等量混合)を徐々に加え、良く攪拌して細胞を融合
させた。融合後、15%FC5添加RPMI 164
G培地を徐々に加え、細胞を200Xg、5分間遠心洗
浄してポリエチレングリコールを除いた後、HAT(ハ
イポキサンチン、アミノプテリン、デミジン)培地に懸
濁し96穴平底マイクロプレートに1ウエルあたりの肺
臓細胞数が約5X10”個/200μmとなるようにま
きこんだ、培養開始4〜5日間に各ウェルの半量のHA
T培地を交換し9〜13日目にハイブリドーマのコロニ
ー形成を確認して培養上清の抗ムンプスウィルス抗体価
をiで調製したPHA凝集試薬で測定した。培養土l青
10μmを2%C8添加PBS100μmに加えて11
倍希釈後、25μmをとり、ムンプスウィルスHA抗原
感作血球25μmを加えて混合し、凝集陽性を示したウ
ェルを、抗ムンプスウィルス抗体産生ハイブリドーマを
含むものとした。抗ムンプスウィルス抗体産生ハイブリ
ドーマを限界希釈法により3回クローニングし安定な抗
ムンプスウィルスモノクローナル抗体産生ハイブリドー
マを6株得た。得られたハイブリドーマは90%FC8
,10%ジメチルスルホキサイド中に懸濁し、−80℃
庫および液体窒素中に保存した。そのうち1株をMPV
10G3.!:全命名た。
g14 (SF3)を常法により融合させた。マウス肺
臓細胞を取り出し、15%FC3添加RPMI1640
培地10m1懸濁液とし200g、5分間遠心後、細胞
を適量の0.17M NH,C1で処理して、含まれる
赤血球を破壊した後、Fe2を含まない培地5mlに懸
濁したSP2細胞を、肺臓細胞の1八景加え、良く混合
した後、200Xg、5分間遠心してRPMI 16
40培地を除き、37℃に加温した50%ポリエデレン
グリコール4.0001 ml(RPMI 1640培
地と等量混合)を徐々に加え、良く攪拌して細胞を融合
させた。融合後、15%FC5添加RPMI 164
G培地を徐々に加え、細胞を200Xg、5分間遠心洗
浄してポリエチレングリコールを除いた後、HAT(ハ
イポキサンチン、アミノプテリン、デミジン)培地に懸
濁し96穴平底マイクロプレートに1ウエルあたりの肺
臓細胞数が約5X10”個/200μmとなるようにま
きこんだ、培養開始4〜5日間に各ウェルの半量のHA
T培地を交換し9〜13日目にハイブリドーマのコロニ
ー形成を確認して培養上清の抗ムンプスウィルス抗体価
をiで調製したPHA凝集試薬で測定した。培養土l青
10μmを2%C8添加PBS100μmに加えて11
倍希釈後、25μmをとり、ムンプスウィルスHA抗原
感作血球25μmを加えて混合し、凝集陽性を示したウ
ェルを、抗ムンプスウィルス抗体産生ハイブリドーマを
含むものとした。抗ムンプスウィルス抗体産生ハイブリ
ドーマを限界希釈法により3回クローニングし安定な抗
ムンプスウィルスモノクローナル抗体産生ハイブリドー
マを6株得た。得られたハイブリドーマは90%FC8
,10%ジメチルスルホキサイド中に懸濁し、−80℃
庫および液体窒素中に保存した。そのうち1株をMPV
10G3.!:全命名た。
該抗ムンプスウィルス抗体産生ハイブリドーマMPVI
OG3は、1987年3月19日から英国Porto
n Down、 5alisbury 5Jiltsh
ire SF30JGのECACC(European
Co11ection of Animal Ce1
lCultures )にブリペスト条約に基づき受託
番号87031902として寄託されている。
OG3は、1987年3月19日から英国Porto
n Down、 5alisbury 5Jiltsh
ire SF30JGのECACC(European
Co11ection of Animal Ce1
lCultures )にブリペスト条約に基づき受託
番号87031902として寄託されている。
替、モノクローナル抗体の製造
8週令以上のBALB/cマウスの腹腔内にブリスタン
(2、6、10、14−t@tramathyl−pe
ntadecane) 0 、25 mlを投与し、3
〜14日後にPBSQfI4液としたバイブリドーマ
lX10ゝ個(1ml)を腹腔内に投与した。投与後1
0〜20日後に貯留した腹水を採取した。腹水中にはP
HA抗体価で25万倍の抗ムンプスウィルスモノクロー
ナル抗体が含まれていた。腹水の採取量はBALB/e
マウス−匹あたり1〜5mlであった。
(2、6、10、14−t@tramathyl−pe
ntadecane) 0 、25 mlを投与し、3
〜14日後にPBSQfI4液としたバイブリドーマ
lX10ゝ個(1ml)を腹腔内に投与した。投与後1
0〜20日後に貯留した腹水を採取した。腹水中にはP
HA抗体価で25万倍の抗ムンプスウィルスモノクロー
ナル抗体が含まれていた。腹水の採取量はBALB/e
マウス−匹あたり1〜5mlであった。
ψ、モノクローナル抗体の性質
分離・確立したモノクローナル抗体MPVI OG3の
性質を表6に示した。
性質を表6に示した。
免疫グログリンのアイソタイプは抗ムンプスウィルス抗
体産生ハイブリドーマの培養上清とヒツジ抗マウス免疫
グロブリンM、G、A、G、、、C85、G m、抗に
および入鎖血清とをアガロース・ゲル内で反応させ沈降
線の生成により確認するオフタロ二−二重免疫拡散法に
より同定した。
体産生ハイブリドーマの培養上清とヒツジ抗マウス免疫
グロブリンM、G、A、G、、、C85、G m、抗に
および入鎖血清とをアガロース・ゲル内で反応させ沈降
線の生成により確認するオフタロ二−二重免疫拡散法に
より同定した。
(以下余白)
表6
モノクローナル抗体はムンプスウィルスEXCH−2株
のHA抗原と良く反応するが、Enders株のHA抗
原との反応は弱かった。またムンプスウィルスCF抗原
とは反応しなかった。
のHA抗原と良く反応するが、Enders株のHA抗
原との反応は弱かった。またムンプスウィルスCF抗原
とは反応しなかった。
・等電点の測定
モノクローナル抗体・の等電点は薄層ポリアクリルアミ
ドゲル等電点電気泳動法により測定した。
ドゲル等電点電気泳動法により測定した。
アンフオラインFAGプレート(LKB社、州3.5〜
9.5)の陽極に1Mリン酸、陰極にI M NaOH
をひたした電極濾紙をセットした。プレート上にIgG
クラスのモノクローナル抗体を含ませたサンプル・アプ
リケーター濾紙をセットし定電力30W、温度10℃で
1.5時間泳動した。泳動終了後ゲル・プレートを固定
液につけ60分間放置後ゲル表面を脱色液ですすぎ、6
0℃の染色液中で10分間染色した。ついでゲルを脱色
液中にうつし余分の染色液を脱色後、ゲルをグリセリン
保存液に60分間浸し、室温で一夜乾燥後プラスチック
シートをかぶせて保存した。
9.5)の陽極に1Mリン酸、陰極にI M NaOH
をひたした電極濾紙をセットした。プレート上にIgG
クラスのモノクローナル抗体を含ませたサンプル・アプ
リケーター濾紙をセットし定電力30W、温度10℃で
1.5時間泳動した。泳動終了後ゲル・プレートを固定
液につけ60分間放置後ゲル表面を脱色液ですすぎ、6
0℃の染色液中で10分間染色した。ついでゲルを脱色
液中にうつし余分の染色液を脱色後、ゲルをグリセリン
保存液に60分間浸し、室温で一夜乾燥後プラスチック
シートをかぶせて保存した。
モノクローナル抗体の等電点は、同時に泳動したキャリ
ブレーション用p1既知タンパクの泳動距離を基準にし
て求めた。
ブレーション用p1既知タンパクの泳動距離を基準にし
て求めた。
固定液:メタノール 150m1
蒸留水 350m1
スルホサリチル酸 17.25 g
トリクロロ酢酸 57.5 g
染色液:コマジ−ブリリアントブルーR2500,11
5g 脱色液 100a+1 脱色液:エタノール 500m1 酢酸 J、80m1 蒸留水を加え、全量を22とする 保存液:グリセリン 50m1 脱色液 500m1 i、モノクローナル抗体の精製 免疫グロブリン・クラスIgG+に属する抗ムンプスウ
ィルスモノクローナル抗体MPV10G3はプロティン
Aアフィニテイクロマト法により精製した。腹水を遠心
後、0.45μmメンプラン濾通した後、100mMリ
ン酸バッファpH9,2に透析し、同バッファで平衡化
したプロティンAセファロースカラムにかけ、吸着した
IgG、を、0.1M酢酸、0.14MNaC1溶液で
溶出し、ただちに2Mトリス−塩酸バッファpH9,0
を適量加えて中和した後、PBSで透析して精製モノク
ローナル抗体(EgG+)とした。
5g 脱色液 100a+1 脱色液:エタノール 500m1 酢酸 J、80m1 蒸留水を加え、全量を22とする 保存液:グリセリン 50m1 脱色液 500m1 i、モノクローナル抗体の精製 免疫グロブリン・クラスIgG+に属する抗ムンプスウ
ィルスモノクローナル抗体MPV10G3はプロティン
Aアフィニテイクロマト法により精製した。腹水を遠心
後、0.45μmメンプラン濾通した後、100mMリ
ン酸バッファpH9,2に透析し、同バッファで平衡化
したプロティンAセファロースカラムにかけ、吸着した
IgG、を、0.1M酢酸、0.14MNaC1溶液で
溶出し、ただちに2Mトリス−塩酸バッファpH9,0
を適量加えて中和した後、PBSで透析して精製モノク
ローナル抗体(EgG+)とした。
(以下余白)
衷JIi玉
ニワトリ保存血液を、生理食塩水で3〜5回遠心洗浄(
1,50Orpm、5分)し、血清成分、白血球を除去
する。得られた赤血球を約7゜5 % (W/V)にP
BSに浮遊きせる。1.5%グルタルアルデートを約7
.5%赤血球の10分の11′添加し、室温で1.5時
間スターラーでゆっくり混和する6反応後、蒸留水で5
回以上遠心洗浄(同」二)L、、0.1%アジ化ナトリ
ウムを含む蒸省水に約10%になるよう浮遊させる。抗
体感作時まで4°Cで保存する。この固定赤血球は約2
年間保存できる。
1,50Orpm、5分)し、血清成分、白血球を除去
する。得られた赤血球を約7゜5 % (W/V)にP
BSに浮遊きせる。1.5%グルタルアルデートを約7
.5%赤血球の10分の11′添加し、室温で1.5時
間スターラーでゆっくり混和する6反応後、蒸留水で5
回以上遠心洗浄(同」二)L、、0.1%アジ化ナトリ
ウムを含む蒸省水に約10%になるよう浮遊させる。抗
体感作時まで4°Cで保存する。この固定赤血球は約2
年間保存できる。
グルタルアルデヒドによる固定以外に、ホルマリン固定
を実施したが、固定後、血球どうしが凝集し、使用でき
なかった。
を実施したが、固定後、血球どうしが凝集し、使用でき
なかった。
l皇皇潴二至jヱlΣ−ナル抗イ本止
5%ニワトリ固定血球を生理食塩水(0,85%)で遠
心洗浄(2,00Orpm、5分)し、125〜500
11 g / m +のモノクローナル抗体HB 81
1 F 1 (IgGs−)を等量混合する。さらに、
12.5〜150I18/mlになるように塩化クロム
を添加し、室温で2時間、スターラーでゆっくり混合す
る0反応後、0.5%BSA−PBSで5回遠心洗浄(
2,00Orpm、5分)し、未吸着の抗体を除去し、
抗体感作血球を作成した。
心洗浄(2,00Orpm、5分)し、125〜500
11 g / m +のモノクローナル抗体HB 81
1 F 1 (IgGs−)を等量混合する。さらに、
12.5〜150I18/mlになるように塩化クロム
を添加し、室温で2時間、スターラーでゆっくり混合す
る0反応後、0.5%BSA−PBSで5回遠心洗浄(
2,00Orpm、5分)し、未吸着の抗体を除去し、
抗体感作血球を作成した。
得られた抗体感作血球のHBs抗原の最小検出感度を測
定した結果を以下に示す。
定した結果を以下に示す。
(以下余白)
以上のように、IgGタイプ、特にIgG、、タイプの
モノクローナル抗体を感作する場合には、2.5%固定
赤血球に対し、50〜150μg/mlの塩化クロムの
存在下に、50〜250μg/mlのモノクローナル抗
体を感作すれば、感度が高く非特異反応も少ない感作血
球が作成できた。
モノクローナル抗体を感作する場合には、2.5%固定
赤血球に対し、50〜150μg/mlの塩化クロムの
存在下に、50〜250μg/mlのモノクローナル抗
体を感作すれば、感度が高く非特異反応も少ない感作血
球が作成できた。
同様にして、HBs22B?(IgM)を固定血球に感
作し、その検出感度を測定した結果を次に示す。
作し、その検出感度を測定した結果を次に示す。
(以下余白)
以上のように18Mタイプのモノクローナル抗イ本も塩
化クロム法によって感作すれば、高感度の感作血球を作
製できる。
化クロム法によって感作すれば、高感度の感作血球を作
製できる。
以上の通り、25%固定血球に対して、10〜300
I18/mlの塩化クロムの存在下に、10〜500
I18/mlのモノクローナル抗体を感作すれば高感度
の感作血球を作製できる。
I18/mlの塩化クロムの存在下に、10〜500
I18/mlのモノクローナル抗体を感作すれば高感度
の感作血球を作製できる。
タンニン酸法との比較
モノクローナル抗体HB s 18 E 9 (IgG
、)、HB s 11 F 1 (IgGz−)および
HB s 22 B 7(IgM)をタンニン酸法によ
り感作した。5%のニワトリ固定血球をPBSで2回遠
心洗浄(2゜000rpm、5分)した後、5mg/m
lのタンニン酸と等量混合し、37°Cの水浴中で、1
0分間反応させる。PBSで2回洗浄した後、pH6,
4のPBSに2.5%になるように浮遊させ、100μ
g/mlのモノクローナル抗体と等量混合する。
、)、HB s 11 F 1 (IgGz−)および
HB s 22 B 7(IgM)をタンニン酸法によ
り感作した。5%のニワトリ固定血球をPBSで2回遠
心洗浄(2゜000rpm、5分)した後、5mg/m
lのタンニン酸と等量混合し、37°Cの水浴中で、1
0分間反応させる。PBSで2回洗浄した後、pH6,
4のPBSに2.5%になるように浮遊させ、100μ
g/mlのモノクローナル抗体と等量混合する。
室温で2時間、スターラーでゆっくり混和し、モノクロ
ーナル抗体を血球に吸着させる。遠心洗浄して未吸着の
抗体を除去して抗体感作血球を得た。得られたタンニン
酸法による抗体感作血球と、上記の塩化クロム法(塩化
クロム濃度100μg/ml、抗体濃度200 ttg
/ml)によって得られた抗体感作血球のHBs抗原最
少検出感度を比較した。
ーナル抗体を血球に吸着させる。遠心洗浄して未吸着の
抗体を除去して抗体感作血球を得た。得られたタンニン
酸法による抗体感作血球と、上記の塩化クロム法(塩化
クロム濃度100μg/ml、抗体濃度200 ttg
/ml)によって得られた抗体感作血球のHBs抗原最
少検出感度を比較した。
以上のとおり、固定血球にモノクローナル抗体を感作す
る時は、従来のタンニン酸法よりも塩化クロム法が好ま
しく、より高感度の抗体感作血球が得られた。
る時は、従来のタンニン酸法よりも塩化クロム法が好ま
しく、より高感度の抗体感作血球が得られた。
兆丑」」聾釦ユa1
5%のニワトリ固定血球を100μs/mlの塩化クロ
ム中で100μg / m +の抗HBsモノクローナ
1しIgG(HBs8C1またはHBs18E9)と等
量混合し、室温で1時間反応させ、抗体を血球に感作し
た。さらに、塩化クロムと抗HBsモノクローナルIg
M(HBs22B7)を、それぞれ25μg/ml、2
0μs/m+になるように混合し、さらに1時間反応許
せた。この血球を、0.5%BSA−PBSで5回遠心
洗hc2.00Orpm、5分)して、0.5%に浮遊
して、抗HBsモノクローナル抗体感作血球とした。
ム中で100μg / m +の抗HBsモノクローナ
1しIgG(HBs8C1またはHBs18E9)と等
量混合し、室温で1時間反応させ、抗体を血球に感作し
た。さらに、塩化クロムと抗HBsモノクローナルIg
M(HBs22B7)を、それぞれ25μg/ml、2
0μs/m+になるように混合し、さらに1時間反応許
せた。この血球を、0.5%BSA−PBSで5回遠心
洗hc2.00Orpm、5分)して、0.5%に浮遊
して、抗HBsモノクローナル抗体感作血球とした。
被検血清(HBsBs抗性陰性販のR−PHA試薬で測
定)180検体を用意した。0.25%BSA−PBS
を、マイクロプレートに25μmつつ分注し、これに上
記の血清5μ!を加え、さらに上記で作成した感作血球
を50μl加え1時間後の凝集像を観察した。すると、
180検体中88検体中で完全凝集、42検体で弱凝集
が見られ、非特異反応がかなり強いことがわかった。
定)180検体を用意した。0.25%BSA−PBS
を、マイクロプレートに25μmつつ分注し、これに上
記の血清5μ!を加え、さらに上記で作成した感作血球
を50μl加え1時間後の凝集像を観察した。すると、
180検体中88検体中で完全凝集、42検体で弱凝集
が見られ、非特異反応がかなり強いことがわかった。
上記の0.25%BSA−PBSに感作に用いたモノク
ローナルIgM(HBs22B7)をグルタルアルデヒ
ドで変性させたものを10〜100μm1 / m 1
添加した0、l:記の180検体について同様に非特異
反応の出現の有無を調べたところ、非特異反応は88検
体から39検体に減少した。
ローナルIgM(HBs22B7)をグルタルアルデヒ
ドで変性させたものを10〜100μm1 / m 1
添加した0、l:記の180検体について同様に非特異
反応の出現の有無を調べたところ、非特異反応は88検
体から39検体に減少した。
さらに、抗HBs抗原活性の無い、ヒトIgMに対する
モノクローナルIgM(HIgM10C9)を10〜t
ooμg/mlを添加すると、非特異反応は23検体に
減少した。
モノクローナルIgM(HIgM10C9)を10〜t
ooμg/mlを添加すると、非特異反応は23検体に
減少した。
続いて、熱処理(60℃、30分)した抗ムンプスモノ
クローナル抗体MPV10G3(IgG、)を10〜1
00μs/m+添加したところ強弁特異検体は23検体
から13検体に減少した。
クローナル抗体MPV10G3(IgG、)を10〜1
00μs/m+添加したところ強弁特異検体は23検体
から13検体に減少した。
モノクローナルIgM(HBs22B7)はHBs抗体
活性があるため、そのまま添カロするとHBsM厘を中
和してしまい、キットの感度を低下させる。そのため、
変性させて抗体活性を失わせたものを添加する必要があ
る。変性法として、グルタルアルデヒド処理、2−メル
カプトエタノール処理および加熱(65℃)の方法を用
いたが、グルタルアルデヒド0.01〜0.1%の濃度
で処理して変性させるとHBs抗体活性がなくなるもし
くは低くなり、かつ、非特異反応抑制効果があった。他
の2−メルカプトエタノールおよび加熱処理は、抗体活
性がなくなると同時に非特異反応抑制効果もなくなり、
有効な方法ではなかった。
活性があるため、そのまま添カロするとHBsM厘を中
和してしまい、キットの感度を低下させる。そのため、
変性させて抗体活性を失わせたものを添加する必要があ
る。変性法として、グルタルアルデヒド処理、2−メル
カプトエタノール処理および加熱(65℃)の方法を用
いたが、グルタルアルデヒド0.01〜0.1%の濃度
で処理して変性させるとHBs抗体活性がなくなるもし
くは低くなり、かつ、非特異反応抑制効果があった。他
の2−メルカプトエタノールおよび加熱処理は、抗体活
性がなくなると同時に非特異反応抑制効果もなくなり、
有効な方法ではなかった。
反応液中に添加するI g G +に関しては、熱変性
のものと未変性のものとを比較したが、リウマチ因子陽
性検体に対する非特異反応に関しては、熱変性したもの
の方が、非特異反応抑制効果が大きかった。
のものと未変性のものとを比較したが、リウマチ因子陽
性検体に対する非特異反応に関しては、熱変性したもの
の方が、非特異反応抑制効果が大きかった。
旦m装置Z
5%のニワトリ固定血球を100μg/mlの塩化クロ
ム中で100μg / m 1の抗HBsモノクローナ
ルIgG(HBs8C1またはHBs18E9)と等量
混合し、室温で1時間反応させ、抗体を血球に感作した
。さらに、25μg / m 1の塩化クロムと20μ
g / m lの抗HBsモノクローナルigM(22
B7)を混合し、きらに1時間反応させた。この血球を
、0.5%BSA−PBSで5回遠心洗浄し、0.5%
に浮遊して、HBs8C1およびHBs22B7感作血
球とHBs18E9およびHBs22B7感作血球を得
た。
ム中で100μg / m 1の抗HBsモノクローナ
ルIgG(HBs8C1またはHBs18E9)と等量
混合し、室温で1時間反応させ、抗体を血球に感作した
。さらに、25μg / m 1の塩化クロムと20μ
g / m lの抗HBsモノクローナルigM(22
B7)を混合し、きらに1時間反応させた。この血球を
、0.5%BSA−PBSで5回遠心洗浄し、0.5%
に浮遊して、HBs8C1およびHBs22B7感作血
球とHBs18E9およびHBs22B7感作血球を得
た。
上記の0.25%BSA−PBSに感作に用いたモノク
ローナル抗体HBs22B7をグルタルアルデヒドで変
性させたものとモノクローナル抗体HI gMl 0C
9をそれぞれ25μg/mlに、モノクローナル抗体M
PV10G3を熱変性させたものを50μg / m
1に添加した。
ローナル抗体HBs22B7をグルタルアルデヒドで変
性させたものとモノクローナル抗体HI gMl 0C
9をそれぞれ25μg/mlに、モノクローナル抗体M
PV10G3を熱変性させたものを50μg / m
1に添加した。
上記反応液25μ!をマイクロプレートに移し、検体5
μlを加えた。そこへさらに、8C1/22B7感作血
球50μI、18E9/22B7感作血球50μ11ま
たは8 C1/22 B 7感作血球と18E9/22
B7感作血球を当量混合したもの50μlを加え、1時
間後の凝集像を観察した。その結果を次に示す。
μlを加えた。そこへさらに、8C1/22B7感作血
球50μI、18E9/22B7感作血球50μ11ま
たは8 C1/22 B 7感作血球と18E9/22
B7感作血球を当量混合したもの50μlを加え、1時
間後の凝集像を観察した。その結果を次に示す。
上記のように、何れの場合に於ても良好な感度が得られ
非特異反応も少ないが、2種の異なる感作血球を用いれ
ば非特異反応がさらに抑制された。
非特異反応も少ないが、2種の異なる感作血球を用いれ
ば非特異反応がさらに抑制された。
2種の異なる感作血球を用いる場合には、8C1/22
B7と18E9/22B7の組合わせが最も良好であっ
た。
B7と18E9/22B7の組合わせが最も良好であっ
た。
i里五皇1
従来のキットにおいては非特異反応が多い為に検体血清
をあらかじめ200倍程に希釈する必要があったが、本
発明に従いHBs抗原を測定する場合には、6倍程度の
希釈でよく、高感度で非特異反応の少ないHBs抗原の
測定が可能になった。
をあらかじめ200倍程に希釈する必要があったが、本
発明に従いHBs抗原を測定する場合には、6倍程度の
希釈でよく、高感度で非特異反応の少ないHBs抗原の
測定が可能になった。
特許出願人 塩野義製薬株式会社
r 〜 )
代 理 人 弁理士 潮1)雄−フ −し−〜−−J
Claims (36)
- (1)抗HBsモノクローナル抗体HBs8C1、HB
s18E9またはHBs22B7。 - (2)ハイブリドーマHBs8C1が産生し、HBsの
d抗原を認識し、IgG_1/κに属する請求項1に記
載のモノクローナル抗体HBs8C1。 - (3)ハイブリドーマHBs18E9が産生し、HBs
のd抗原を認識し、IgG_1/κに属する請求項1に
記載のモノクローナル抗体HBs18E9。 - (4)ハイブリドーマHBs22B7が産生し、HBs
のa抗原を認識し、IgM/κに属する請求項1に記載
のモノクローナル抗体HBs22B7。 - (5)抗HBsモノクローナル抗体を感作した血球を用
いる逆受身凝集反応において、グルタルアルデヒドで変
性された後反応溶液中に添加され、該反応の非特異反応
を抑制することを特徴とする請求項4に記載のモノクロ
ーナル抗体HBs22B7。 - (6)抗ヒトIgMモノクローナル抗体HIgM10C
9。 - (7)ハイブリドーマHIgM10C9が産生し、Is
M/κに属する請求項6に記載のモノクローナル抗体H
IgM10C9。 - (8)抗HBsモノクローナル抗体を感作した血球を用
いる逆受身凝集反応において、反応溶液中に添加され、
該反応の非特異反応を抑制することを特徴とする請求項
6に記載のモノクローナル抗体HIgM10C9。 - (9)抗ムンプスウイルスモノクローナル抗体MPV1
0G3。 - (10)ハイブリドーマMPV10G3が産生し、Ig
G_1/κに属する請求項9に記載のモノクローナル抗
体MPV10G3。 - (11)抗HBsモノクローナル抗体を感作した血球を
用いる逆受身凝集反応において、反応溶液中に熱変性後
添加され、該反応の非特異反応を抑制することを特徴と
する請求項9に記載のモノクローナル抗体MPV10G
3。 - (12)請求項1に記載の抗HBsモノクローナル抗体
HBs8C1を産生するハイブリドーマHBs8C1。 - (13)請求項1に記載の抗HBsモノクローナル抗体
HBs18E9を産生するハイブリドーマHBs18E
9。 - (14)請求項1に記載の抗HBsモノクローナル抗体
HBs22B7を産生するハイブリドーマHBs22B
7。 - (15)請求項6に記載の抗ヒトIgMモノクローナル
抗体HIgM10C9を産生するハイブリドーマHIg
M10C9。 - (16)請求項9に記載の抗ムンプスウイルスモノクロ
ーナル抗体MPV10G3を産生するハイブリドーマM
PV10G3。 - (17)抗HBsモノクローナル抗体を塩化クロムの存
在下に固定血球に感作することを特徴とする抗HBsモ
ノクローナル抗体の感作方法。 - (18)5〜600μg/mlの塩化クロムの存在下に
、1〜5%濃度の固定血球に対して、5〜1000μg
/mlの抗HBsモノクローナル抗体を感作することを
特徴とする請求項17に記載の感作方法。 - (19)該固定血球がグルタルアルデヒド固定ニワトリ
赤血球である請求項17または18に記載の感作方法。 - (20)抗HBsモノクローナルIgGおよび抗HBs
モノクローナルIgMを、請求項17〜19のいずれか
に記載の方法に従い、固定血球へ二重感作したことを特
徴とする抗HBsモノクローナル抗体感作固定血球。 - (21)該抗HBsモノクローナルIgMがHBs22
B7であり、該抗HBsモノクローナルIgGがHBs
8C1またはHBs18E9であることを特徴とする請
求項20に記載の固定血球。 - (22)該固定血球がグルタルアルデヒド固定ニワトリ
赤血球である請求項20または21に記載の固定血球。 - (23)抗HBsモノクローナル抗体を感作した固定血
球を用いる逆受身凝集反応において、反応溶液中に感作
に用いた抗HBsモノクローナル抗体を変性させて添加
し、所望により、さらにHBs以外の抗原に対する1種
以上の変性または未変性のモノクローナル抗体を添加す
ることを特徴とする非特異反応の抑制方法。 - (24)該抗HBsモノクローナル抗体がIgMに属す
ることを特徴とする請求項23に記載の抑制方法。 - (25)該抗HBsモノクローナル抗体がHBs22B
7であり、グルタルアルデヒドで変性したHBs22B
7を該反応液中に添加することを特徴とする請求項23
に記載の抑制方法。 - (26)該固定血球に感作する抗HBsモノクローナル
抗体がIgGおよびIgMであり、該IgMを変性させ
て反応液中に添加することを特徴とする請求項23に記
載の抑制方法。 - (27)該IgGがHBs8C1および/またはHBs
18E9であり該IgMがHBs22B7であり、グル
タルアルデヒドで変性させたHBs22B7を反応液中
に添加することを特徴とする請求項26に記載の抑制方
法。 - (28)該固定血球を2種用いることを特徴とする請求
項23に記載の抑制方法。 - (29)該固定血球がHBs8C1およびHBs22B
7で感作した固定血球およびHBs18E9およびHB
s22B7で感作した固定血球であり、グルタルアルデ
ヒドで変性させたHBs22B7を反応液中に添加する
ことを特徴とする請求項28に記載の抑制方法。 - (30)該HBs以外の抗原に対するモノクローナル抗
体がIgGおよび/またはIgMであることを特徴とす
る請求項23に記載の抑制方法。 - (31)該HBs以外の抗原に対するモノクローナル抗
体が抗ヒトIgMモノクローナル抗体および/または抗
ムンプスウイルスモノクローナル抗体であることを特徴
とする請求項23に記載の抑制方法。 - (32)該HBs以外の抗原に対するモノクローナル抗
体が未変性のHIgM10C9および/または熱変性し
たMPV10G3であることを特徴とする請求項23に
記載の抑制方法。 - (33)反応溶液中にそれぞれのモノクローナル抗体を
1〜100μg/mlとなるよう添加することを特徴と
する請求項23に記載の抑制方法。 - (34)該固定血球がグルタルアルデヒド固定ニワトリ
赤血球であることを特徴とする請求項23に記載の抑制
方法。 - (35)該感作が請求項17〜19のいずれかに記載の
方法でなされることを特徴とする請求項23に記載の抑
制方法。 - (36)抗HBsモノクローナル抗体を感作した固定血
球を用いる逆受身凝集反応において、請求項20〜22
のいずれかに記載の固定血球を用い、請求項23〜35
のいずれかに記載の方法により該反応中の非特異反応を
抑制することを特徴とするHBs抗原の測定方法。
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Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP63193654A JPH01144993A (ja) | 1987-08-19 | 1988-08-02 | HBs抗原測定のための方法、ハイブリドーマ、モノクローナル抗体および感作血球 |
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP62-205955 | 1987-08-19 | ||
JP20595587 | 1987-08-19 | ||
JP63193654A JPH01144993A (ja) | 1987-08-19 | 1988-08-02 | HBs抗原測定のための方法、ハイブリドーマ、モノクローナル抗体および感作血球 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH01144993A true JPH01144993A (ja) | 1989-06-07 |
Family
ID=26508001
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP63193654A Pending JPH01144993A (ja) | 1987-08-19 | 1988-08-02 | HBs抗原測定のための方法、ハイブリドーマ、モノクローナル抗体および感作血球 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPH01144993A (ja) |
Cited By (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO1997007400A1 (fr) * | 1995-08-21 | 1997-02-27 | Teikoku Seiyaku Kabushiki Kaisha | Reactif permettant d'etudier l'agglutination d'un virus et materiel destine a l'etude du virus |
JPH0968531A (ja) * | 1995-08-31 | 1997-03-11 | Sanyo Chem Ind Ltd | 免疫測定法 |
JPH11183478A (ja) * | 1997-12-25 | 1999-07-09 | Hitachi Chem Co Ltd | 抗体測定試薬及びその製造法 |
JP2001118743A (ja) * | 1999-10-18 | 2001-04-27 | Murata Mfg Co Ltd | セラミックグリーンシートの製造装置 |
WO2010026758A1 (ja) * | 2008-09-05 | 2010-03-11 | 積水メディカル株式会社 | モノクローナル抗体及びこれを用いた免疫学的測定方法 |
JPWO2016147747A1 (ja) * | 2015-03-13 | 2017-12-28 | ソニー株式会社 | 電気的特性測定用試料及び電気的特性測定方法並びに電気的特性測定装置 |
-
1988
- 1988-08-02 JP JP63193654A patent/JPH01144993A/ja active Pending
Cited By (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO1997007400A1 (fr) * | 1995-08-21 | 1997-02-27 | Teikoku Seiyaku Kabushiki Kaisha | Reactif permettant d'etudier l'agglutination d'un virus et materiel destine a l'etude du virus |
JPH0968531A (ja) * | 1995-08-31 | 1997-03-11 | Sanyo Chem Ind Ltd | 免疫測定法 |
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JP2001118743A (ja) * | 1999-10-18 | 2001-04-27 | Murata Mfg Co Ltd | セラミックグリーンシートの製造装置 |
WO2010026758A1 (ja) * | 2008-09-05 | 2010-03-11 | 積水メディカル株式会社 | モノクローナル抗体及びこれを用いた免疫学的測定方法 |
JPWO2016147747A1 (ja) * | 2015-03-13 | 2017-12-28 | ソニー株式会社 | 電気的特性測定用試料及び電気的特性測定方法並びに電気的特性測定装置 |
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