JP2000509269A - Ｂ型肝炎モノクローナル抗体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 野生型ＨＢｓＡｇ及び少なくとも２つの突然変異型ＨＢｓＡｇに対して特異的に結合し得るモノクローナル抗体は、両方のエスケープ変異体及び野生型ＨＢｓＡｇを検出するための改良イムノアッセイに使用され得、ＨＢＶに対する受動免疫化のために使用され得る。

Description

【発明の詳細な説明】 Ｂ型肝炎モノクローナル抗体 世界的規模で、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）は、慢性的に感染しているヒトの 数及び感染の合併症の重篤度の点で最も重要な肝親和性ウイルスである。 Ｂ型肝炎は、非経口治療、集団予防接種運動及び広範囲にわたる血液及びプー ルされた血液製剤(blood product)の輸血が導入された後に重要な問題として持 ち上がった。潜伏期間が長いこと、無症候感染が高頻度で発生すること及び感染 性保菌状態が存在することが、ＨＢＶをより血液伝播し易いようにしている。多 くの研究者がＨＢＶの性的感染の証拠を発表し、Ｂ型ウイルスの感染は周産期中 に保菌者の母親から乳児へ起こり得る。 ＤＮＡウイルスであるＨＢＶはヘパドナウイルス群の１員である。電子顕微鏡 検査は、ＨＢＶが「デーン粒子」と称される直径４２ｎｍの二重シェル構造の球 形粒子であることを示す。これらのウイルス粒子は、約２２〜２５ｎｍの直径を 有する高電子密度の球形内部コアと７ｎｍの厚さを有する外部コートを 有する。ウイルスの外部コートは、ウイルス中和抗体に対する表面抗原（本明細 書では“ＨＢｓ”または“ＨＢｓＡｇ”と称される）を有している。直径２０ｎ ｍの球形の内部コア粒子は、ウイルスコア抗原（ＨＢｃＡｇ）及びｅ抗原（ＨＢ ｅＡｇ）、ウイルスＤＮＡ、ＤＮＡポリメラーゼ活性及びタンパク質キナーゼ活 性を有する。 ＨＢｓＡｇは、アミノ酸１２４〜１４７に亘り且つすべてのＨＢＶ単離物に共 通である、“ａ”抗原決定基と称されるＨＢＶの主要な中和エピトープを含む。 例えば、Ｐｕｇｈら（１９８６）を参照されたい。急性または慢性ＨＢＶ感染後 の抗−ＨＢｓの発生は、通常回復及び良好な予後を伴っている。抗−ＨＢｓは予 防接種による中和抗体の産生にも関連している。回復期及び予防接種後の血清中 に認められる抗−ＨＢｓの大部分は、まだ特定されていない構造を有する“ａ” 抗原決定基の領域において結合している。“ａ”抗原決定基が非常に立体配座的 であることは明らかである。なぜならば、前記領域がアルキル化または還元によ り変性されるとＨＢｓＡｇ粒子の抗原性が非常に低下するからである。システィ ン残基問のジスルフィド架橋が正しい立体構造に関与していると考えられる。“ ａ”抗原決 定基の１つの考えられる構造は、アミノ酸１２４と１３７の間に第１ループを形 成するジスルフィド架橋及びアミノ酸１３９と１４７の間に第２ループを形成す る別のジスルフィド架橋を含んでいる。 抗−ＨＢｓは、主として第２ループに結合すると考えられるが、エピトープは １つのループのみに限定されないと考えられる。“ａ”抗原決定基の配列の全体 が多分抗原構造に関与している。“ａ”抗原決定基は、ＨＢＶの標準単離物にお いてある程度のアミノ酸の変動があるが保存されている。推定エピトープの第１ ループにより大きな変動があることから、この領域は中和エピトープに余り関与 していないことが暗示される。“ａ”抗原決定基はＨＢＶのすべてのサブタイプ で認められ、“ａ”抗原決定基の内部及び周りのアミノ酸の変動によりサブタイ プが生ずる。ＨＢｓＡｇはａｄｗ、ａｙｗ、ａｄｒ及びａｙｒの４つの主要な免 疫学的サブタイプに分類され得、各々は関連した地理学的分布を有する。ｄ／ｙ サブタイプ及びｗ／ｒサブタイプはそれぞれ、アミノ酸１２２及び１６０のリシ ンをアルギニンで置換することにより決定される。 最近、ＨＢｓＡｇの存在が或る患者の抗−ＨＢｓ血清サンプ ルにおいて認められた。これらの患者のＨＢｓＡｇは存在する抗−ＨＢｓにより 中和され得ないことから、ＨＢｓＡｇ変異体の存在が暗示される。重要な変異体 （突然変異体）が、予防接種、モノクローナル抗体治療、ポリクローナル抗体治 療、臨床検査で診断するのが困難なＨＢＶ感染の症例に関連づけられている。例 えば、Ｃａｒｍｅｎら（１９９２，１９９３）、Ｈａｒｒｉｓｏｎら（１９９３ ）、Ｈａｗｋｉｎｓら（１９９４）、Ｈｏｗａｒｄら（１９９３）、ＭｃＭａｈ ｏｎら（１９９２）、Ｏｋａｍｏｔｏら（１９９２）及びＷａｌｌａｃｅら（１ ９９４）参照。 分析すると、突然変異体は混合集団から選択され、“ａ”抗原決定基において アミノ酸置換を引き起こす点突然変異を有するようである。突然変異体は、遺伝 子型のプールを生ずる遺伝子内のランダム突然変異により生ずると考えられる。 今までに記載された突然変異体の場合、免疫応答が突然変異体を選択する際の主 要要因であると考えられる。 通常、インビトロでウイルス感染細胞にモノクローナル抗体を添加すると、該 抗体で中和されない単離物が選択される。従って、活性ウイルス複製を有する患 者にモノクローナル抗体を 与えるといわゆる「エスケープ」突然変異体か選択され得ることは驚くことでは ない。 臨床的に重要ないくつかの別個のエスケープ突然変異体が予防接種された個体 で見つけられた。３例では、ＨＢｓＡｇの“ａ”抗原決定基のアミノ酸１４５の コドンが点突然変異され、グリシンからアルギニンへのアミノ酸変化が生じるこ とが知見された。前記突然変異型ウイルスを１つ含む血清をチンパンジーに投与 して、前記物質が伝播性であることが判明した。 予防接種された集団における大規模感染に関係する突然変異型ウイルスでは、 “ａ”抗原決定基のアミノ酸１４１のリシンからグルタミン酸への突然変異が認 められた。それ以来、“ａ”抗原決定基において１個以上のアミノ酸置換を生ず る前記及び他の点突然変異が子防接種した個体で報告された。 エスケープ突然変異体は、幾つかの理由で心配の種である。まず、前記突然変 異体はイムノアッセイで検出できない。高選択性及び特異性を得るために診断用 アッセイが設計されている。ＨＢｓＡｇに対するアッセイは、被検サンプル中の 抗−ＨＢｓ試薬とＨＢｓＡｇの相互反応に基づいている。次いで、生じた抗−Ｈ Ｂｓ／ＨＢｓＡｇ複合体を検出する。ＨＢｓＡｇエピト ープが明らかに突然変異されており、抗−ＨＢｓで認識されないときには、ＨＢ ｓＡｇは検出されないか、または前記アッセイが極めて非感応性である。エスケ ープ突然変異体が検出され得ないと、前記突然変異体を有するヒトに悪影響を及 ぼすだけでなく、供血された血液、血液製剤または臓器を介して感染が伝播され 得る。あらかじめ免疫付与され抗−ＨＢｓ応答を有する個体であっても、突然変 異型ＨＢｓＡｇを有するＨＢＶは個体を冒し得る。 １２２位でのエスケープ突然変異体に対するモノクローナル抗体はＷＯ９４／ ２６９０４に記載されている。前記抗体は、野生型ＨＢｓＡｇと突然変異型とを 区別することができ、よって突然変異体を同定することができる。 本発明は、野生型ＨＢｓＡｇ及び少なくとも２つ、好ましくは３つ以上の突然 変異型ＨｂｓＡｇに対して特異的に結合し得るモノクローナル抗体を提供する。 本発明のモノクローナル抗体の野生型及び突然変異型ＨＢｓＡｇに特異的に結 合する能力から、該抗体は野生型タンパク質と突然変異型の間で保存される表面 抗原の領域に結合することが示唆される。保存領域、よって抗原決定基（エピト ープ）は “ａ”抗原決定基内、“ａ”抗原決定基の領域内または非−“ａ”領域内にも存 在し得る。 本発明のモノクローナル抗体は、突然変異型ＨＢｓＡｇ及び野生型タンパク質 の両方に対して特異的に結合する能力を有しているために、ＨＢｓＡｇの検出、 ＨＢＶ感染の臨床診断及び血液スクリーニングのためのイムノアッセイの有効性 を改善する際に特に有用である。血液の供給及び血液製剤の供給の安全性が、Ｈ ＢｓＡｇアッセイにおいて本発明のモノクローナル抗体を単独で、すなわち単一 の抗−ＨＢｓ抗体として使用するか、或いは特に１つ以上の他の抗−ＨＢｓ抗体 と一緒に使用することにより改善され得る。 添付図面の図１ａ及び図１ｂは、“ａ”抗原決定基を包含するＨＢＶ表面領域 の部分のアミノ酸及び核酸配列を示す。図１ｂは図１ａをタイプ清書したもので ある。図１ａ及び図１ｂの各々において、レーン１はサブタイプａｄｙｗの認識 されたアミノ酸変異型を示し、レーン２はサブタイプａｄｙｗの共通アミノ酸配 列を示し、レーン３はサブタイプａｄｙｗの共通核酸配列を示し、レーン４は認 識された核酸変異型を示し、レーン５は突然変異型ＨＢｓＡｇ II（ＭＡＭ Ｈ ＢｓＡｇ）をコー ドする核酸変異を示し、レーン６は突然変異型ＨＢｓＡｇ Ｉ（ＮＰ ＨＢｓＡ ｇ）をコードする核酸変異型を示す。 １４３位での別の認識されたヌクレオチド変異型では、ＴＣＧがＡＣＧに置換 され、その結果当該位置でセリンがスレオニンに置換されている。 本発明の推定モノクローナル抗体は、３つ以上の参照抗原、すなわち野生型Ｈ ＢｓＡｇ及び２つ以上の突然変異型ＨＢｓＡｇに対して特異的に結合する能力に ついてスクリーニングされ得る。当業者は、抗体と抗原間の特異的結合と非特異 的結合を容易に区別することができる。３つ以上の前記した参照抗原に対して特 異的に結合し得る抗体が本発明のモノクローナル抗体である。前記したスクリー ニング方法自体も本発明の一部をなす。本明細書中、用語「結合」は特異的結合 を指すことに留意されたい。 本発明のハイブリドーマ及びモノクローナル抗体の作製においてスクリーニン グするために及び／または抗原として使用されるＨＢｓＡｇは、完全長タンパク 質であるか、または野生型または突然変異型ＨＢｓＡｇの適当な抗原断片もしく は誘導体であり得る。 本発明のモノクローナル抗体は、任意の免疫グロブリンクラス、例えばＩｇＧ 、ＩｇＭまたはＩｇＡ及び任意のイソタイプを有し得る。 突然変異型ＨＢｓＡｇは、いわゆる「エスケープ突然変異体」中に存在するよ うな、野生型ＨＢｓＡｇに比して少なくとも１個のアミノ酸置換を誘起する突然 変異をもつ突然変異型ウイルス中に存在し得る。突然変異型ＨＢｓＡｇは、“ａ ”抗原決定基内または“ａ”抗原決定基の領域内に置換が生じているものでもよ く、例えば突然変異は点突然変異であってもよい。突然変異、例えば点突然変異 は、ＨＢｓＡｇのアミノ酸１３３〜１４５をコードする配列内で起こり得る。突 然変異により、１３３位及び／または１４５位でアミノ酸置換が生じ得る。追加 の及び／または別の置換が、例えば１３４、１４１、１４２、１４３及び１４４ の１個以上の位置に存在していてもよい。突然変異型ＨＢｓＡｇは、例えば１４ ３、１４４及び１４５の１個以上の位置で野生型に比してアミノ酸置換を有し得 る。前記突然変異は、他の突然変異に加えて“ａ”抗原決定基内または別の領域 内に存在し得る。 本発明のモノクローナル抗体は、例えば野生型ＨＢｓＡｇ及 び上記した２つ以上の別個の突然変異型ＨＢｓＡｇ（例えば、１３３、１３４、 １４１、１４２、１４３、１４４及び１４５の１個以上の位置で突然変異が生じ ているもの）に対して特異的に結合し得る。或いは、上記した１つの突然変異型 ＨｂｓＡｇ及び異なる領域において突然変異を有している突然変異型ＨＢｓＡｇ に対して結合することも可能である。 突然変異型ＨＢｓＡｇの例は、“ａ”抗原決定基の領域において野生型に比し て以下の置換を有するものである： 突然変異型ＨＢｓＡｇ Ｉ（“ＮＰ”ＨＢｓＡｇ） アミノ酸１３３がｍｅｔからｉｌｅに、アミノ酸１３４がｐｈｅからｈｉｓに 、アミノ酸１４４がａｓｐからｖａｌに置換されているもの； 突然変異型ＨＢｓＡｇ II（“ＭＡＭ”ＨＢｓＡｇ） アミノ酸１３３がｍｅｔからｉｌｅに、アミノ酸１３４がｐｈｅからａｓｎに 、アミノ酸１４２がｐｒｏからｓｅｒに、アミノ酸１４３がｓｅｒからｌｅｕに 、アミノ酸１４５がｇｌｙからｌｙｓに置換されているもの； 突然変異型ＨＢｓＡｇ III（“ＳＺ”ＨＢｓＡｇ） アミノ酸１４５がｇｌｙからａｒｇに置換されているもの； 突然変異型ＨＢｓＡｇ IV（“ＳＰ”ＨＢｓＡｇ） アミノ酸１４３がｓｅｒからｍｅｔに置換されているもの。 推定抗体を、例えば野生型ＨＢｓＡｇ及び上記した２つ以上の突然変異型に対 してスクリーニングし得る。例えば、本発明の推定モノクローナル抗体を、野生 型ＨＢｓＡｇ及び１３３、１３４、１４１、１４２、１４３、１４４及び１４５ 、特に１４３、１４４及び１４５の１個以上の位置で突然変異を有している２つ 以上の別個の突然変異型ＨＢｓＡｇに対してスクリーニングする。或いは、前記 した１つの突然変異体を別の領域に突然変異を有する突然変異型ＨＢｓＡｇと一 緒に使用し得る。上記した突然変異型Ｉ及びIVをスリーニングのために使用する ことができる。 本発明は、野生型ＨＢｓＡｇ及びアミノ酸１４３、１４４及び１４５をコード するコドンの１個以上で点突然変異を有する配列によりコードされ得る“ａ”抗 原決定基を有する少なくとも１つの突然変異型ＨＢｓＡｇに対して特異的に結合 し得るモノクローナル抗体を提供する。前記モノクローナル抗体は、２つ以上の 突然変異型ＨＢｓＡｇ及び別の異なる突然変異型ＨＢｓＡｇに結合し得る。 本発明のモノクローナル抗体の例は、Ｐ２Ｄ３、Ｍ３Ａ１０及びＭ４Ｆ５と称 されるハイブリドーマより産生される抗体である。前記ハイブリドーマは、特許 手続き上の微生物寄託の国際承認に関するブダペスト条約の下に、英国、ウィル トシャー州ＳＰ４ ０ＪＧ、ソールズベリー、ポートンダウンに所在のｔｈｅ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｓｔｒｕｃｔｕｒ ｅｓ（ＥＣＡＣＣ），Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｐｒｏｄｕｃｔ ｉｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｌａｂｏｒａｔ ｏｒｙ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｃｕｌｔｕｒｅ ｆｏｒ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍｉｃｒ ｏｂｉｏｌｏｇｙ ＆ Ｒｅｓｅａｒｃｈに寄託されている。ハイブリドーマ寄 託の受託番号及び受託日は次の通りである。 ハイブリドーマ 受託番号 受託日 Ｐ２Ｄ３ ECACC 97042331 1997/04/23 Ｍ３Ａ１０ ECACC 97042330 1997/04/23 Ｍ４Ｆ５ ECACC 97042519 1997/04/25 本明細書において、モノクローナル抗体は、該抗体を産生するハイブリドーマ と同じ呼称で呼ばれ得る。例えば。Ｐ２Ｄ３ と称されるモノクローナル抗体はハイブリドーマＰ２Ｄ３（ＥＣＡＣＣ ９７０ ４２３３１）より産生される抗体である。ハイブリドーマＰ２Ｄ３（ＥＣＡＣＣ ９７０４２３３１）、ハイブリドーマＭ３Ａ１０（ＥＣＡＣＣ ９７０４２３ ３０）及びハイブリドーマＭ４Ｆ５（ＥＣＡＣＣ ９７０４２５１９）及びこれ らハイブリドーマから産生されるモノクローナル抗体の詳細は、以下の実施例に 記載されている。 モノクローナル抗体Ｐ２Ｄ３、Ｍ３Ａ１０及びＭ４Ｆ５の各々は、(ｉ)野生型 ＨＢｓＡｇ、(ii)突然変異型ＨＢｓＡｇ Ｉ（ＮＰ ＨＢｓＡｇ）及び(iii)突 然変異型ＨＢｓＡｇ II(ＭＡＭ ＨＢｓＡｇ)に特異的に結合し得る。また、各 モノクローナル抗体は、突然変異型ＨＢｓＡｇ III(ＳＺ ＨＢｓＡｇ)及び突 然変異型ＨＢｓＡｇ IV（ＳＰ ＨＢｓＡｇ）にも特異的に結合し得る。モノク ローナル抗体Ｐ２Ｄ３及びＭ４Ｆ５はＩｇＧ抗体である。モノクローナル抗体Ｍ ３Ａ１０はＩｇＡ抗体である。 野生型ＨＢｓＡｇが多数の血清型を有していることは公知であり、例えばＰｕ ｇｈら（１９８０）に記載されているように複数の認識された突然変異体が存在 することも公知である。本 明細書において用語「野生型ＨＢｓＡｇ」には、当業界で野生型として認識され ているＨＢｓＡｇまたは野生型であると一般に認知されているＨＢｓＡｇのすべ てが含まれる。従って、この用語にはすべての血清型及びすべての認識された変 異体を有する野生型ＨＢｓＡｇが含まれる。本明細書で使用する用語「突然変異 型ＨＢｓＡｇ」には認識された野生型変異体は含まれない。 適当なスクリーニング試験は当業者には公知であり、交差競合アッセイ及び例 えば結合特異性を調べるために放射性標識モノクローナル抗体を用いるアッセイ が含まれる。 上記したように、本発明のモノクローナル抗体の野生型及び突然変異型ＨＢｓ Ａｇに結合する能力から、該抗体は野生型タンパク質及び突然変異型の間で保存 されている表面抗原の領域に結合することが示唆される（下記の総括参照）。前 記した保存領域及びよって保存エピトープの位置及び配列は、公知の方法により 、例えば適宜本発明のモノクローナル抗体を使用するエピトープマッピングによ り決定され得る。その後、エピトープペプチド及びポリペプチドは、例えば組換 え技術により、化学合成により、または異種方法の組合せにより作製され得る。 生じた抗原ペプチドまたはポリペプチドも免疫原性であり得る。本発明のモノク ローナル抗体に対するエピトープも本発明の一部をなす。 本発明には、本発明のモノクローナル抗体の断片及び誘導体、例えばＦａｂ及 びＦａｂ₂断片並びに結合体が包含される。誘導体はヒト化誘導体を含む。断片 及び（ヒト化誘導体を含めた）誘導体の作製方法は公知である。例えば、断片及 び誘導体は組換え技術により作製され得る。抗体の断片及び誘導体並びにその使 用は当業者に公知である。本明細書で使用される用語「モノクローナル抗体」は 該抗体の断片及び誘導体を含む。 本発明は、本発明のモノクローナル抗体に対する抗−イディオタイプ抗体をも 提供する。本来のエピトープの「内部イメージ」を含む前記抗体は、エピトープ 代替物として使用され得、立体配座依存エピトープの場合には特に有用である。 なぜならば、前記エピトープをマッピングすることは困難であり、立体配座依存 エピトープの場合には合成エピトープペプチドを作製することが不可能であり得 るからである。 本発明のモノクローナル抗体は、ＨＢｓＡｇを検出するための、よってＢ型肝 炎感染を検出するためのイムノアッセイにお いて、ＨＢＶアッセイにおいて現在使用されている抗−ＨＢｓ抗体の代替物とし て、或いは現在使用されている抗−ＨＢｓ抗体に加えて使用され得る。前記アッ セイは、臨床診断のためまたは血液スクリーニングのために使用され得、本発明 には本発明のモノクローナル抗体を含むイムノアッセイを用いて診断する方法及 び血液をスクリーニングする方法が包含される。 本発明のモノクローナル抗体は、受動免疫のための抗血清として治療もしくは 予防目的で使用され得、及び／または能動免疫におけるワクチンとして使用する ためのエピトープを規定するためにも使用され得る。本発明には、前記した抗血 清及び免疫方法、並びに前記抗血清により規定されるエピトープも包含される。 本発明のモノクローナル抗体は、野生型または突然変異型ＨＢｓＡｇ、その抗 原断片、抗原ペプチドまたは抗−イディオタイプ抗体を精製するためのアフィニ ティークロマトグラフィーにおいても使用される。 従って、本発明はＨＢｓＡｇを検出するためのイムノアッセイを提供し、該イ ムノアッセイは被検サンプルを本発明のモノクローナル抗体、その断片もしくは 誘導体、またはその２つ以 上の組合せと接触させ、生じた抗原−抗体複合体を検出することからなる。 本明細書中で使用される用語「検出」は検出及び／または測定を指し、定性、 定量及び半定量方法を含む。 本発明のモノクローナル抗体、その断片もしくは誘導体、またはそれらの組合 せを、ポリクローナル抗−ＨＢｓ抗体及び他のモノクローナル抗−ＨＢｓ抗体か ら選択される１つ以上の抗体と一緒に使用され得る。 本発明のイムノアッセイは、均一系または不均一系フォーマットであり得る。 前記フォーマットは捕獲または競合フォーマットであり得る。 Ｂ型肝炎コア抗原に対する抗体（抗−ＨＢｃ）を検出するためのイムノアッセ イは、ＨＢｓＡｇに対するアッセイと同時に行ってもよい。組合せＨＢＶ抗−コ ア／表面抗原アッセイは公知であり、使用されている。 本発明は更に、本発明のモノクローナル抗体、その断片もしくは誘導体、また はその２つ以上の組合せ、ＨＢｓＡｇに対するイムノアッセイを実施するために 必要な試薬、及び任意に抗−ＨＢｃ抗体を検出するための試薬を含むイムノアッ セイキッ トを提供する。ポリクローナル抗−ＨＢｓ抗体及び他のモノクローナル抗−ＨＢ ｓ抗体から選択される他の抗−ＨＢｓ抗体を１つ以上存在させてもよく、他の試 薬は洗浄液、希釈剤、標準溶液、コントロール試薬及び標識抗−ＨＢｓ抗体から 選択され得る。 本発明は更に、イムノアッセイで使用するために好適な固相をも提供し、該固 相上には本発明のモノクローナル抗体、その断片もしくは誘導体、またはその２ つ以上の組合せが固定化されている。ポリクローナル抗−ＨＢｓ抗体及び他のモ ノクローナル抗−ＨＢｓ抗体から選択される別の抗−ＨＢｓ抗体を１つ以上前記 固相に固定化させてもよい。更に、抗−ＨＢｃ抗体を捕獲し得る物質を抗−ＨＢ ｓ抗体に加えて前記固相に固定化させてもよい。 本発明は更に、受動免疫のために治療または予防目的で使用するのに好適な、 本発明のモノクローナル抗体、その断片もしくは誘導体、またはその２つ以上の 組合せを含む抗血清をも提供する。 本発明は、本発明のモノクローナル抗体、その断片もしくは誘導体、またはそ の２つ以上の組合せを医薬的に適当な抗体と 混合して含む、ＨＢＶに対する受動免疫のために治療または予防目的で使用する のに好適な組成物を提供する。 本発明の抗血清及び組成物は、ポリクローナル抗−ＨＢｓ抗体及び他のモノク ローナル抗−ＨＢｓ抗体から選択される他の抗体を１つ以上含み得る。 本発明は更に、本発明のモノクローナル抗体、その断片もしくは誘導体、また はその２つ以上の組合せを治療または予防有効量ヒトに投与することからなる、 治療または予防目的のＨＢＶに対する受動免疫化方法を提供する。モノクローナ ル及びポリクローナル抗−ＨＢｓ抗体から選択される他の抗体を１つ以上投与し 得る。 本発明は更に、単離した突然変異型ＨＢｓＡｇ Ｉ、突然変異型ＨＢｓＡｇ II、突然変異型ＨＢｓＡｇ III及び突然変異型ＨＢｓＡｇ IVを提供する。本 発明は、本発明のモノクローナル抗体、またはその断片もしくは誘導体に特異的 に結合し得る突然変異型ＨＢｓＡｇの断片もしくは誘導体をも提供する。突然変 異型ＨＢｓＡｇの断片もしくは誘導体も免疫原性であり得る。突然変異型ＨＢｓ Ａｇ、またはその断片もしくは誘導体は、天然ソースからまたは組換え技術によ り獲得することがで きる。例えば免疫原として使用するためには、突然変異型ＨＢｓＡｇ、またはそ の断片もしくは誘導体が部分的にまたは完全にグリコシル化された形態にあるこ とが好ましい。本発明は、化学的に合成された抗原性であり任意に免疫原性のエ ピトープペプチドをも提供する。 本発明は、本発明の突然変異型ＨＢｓＡｇ、その免疫原性断片もしくは誘導体 、またはその２つ以上の組合せ及び医薬的に好適な担体を含むワクチン組成物を 提供する。ワクチン組成物が更に１つ以上の免疫原性ペプチドまたはポリペプチ ド、例えば他の免疫原性ＨＢｓＡｇペプチドまたはポリペプチドを含んでいても よい。 本発明は、治療有効量の本発明の突然変異型ＨＢｓＡｇ、その免疫原性断片も しくは誘導体、またはその２つ以上の組合せを任意に他の免疫原性ＨＢｓＡｇペ プチドまたはポリペプチドの１つ以上と組み合わせてヒトに投与することからな る、ヒトに対するＨＢＶの予防接種方法を提供する。 本発明は、上記した突然変異型ＨＢｓＡｇ Ｉ、突然変異型ＨＢｓＡｇ II、 突然変異型ＨＢｓＡｇ IIIまたは突然変異型ＨＢｓＡｇ IV、または本発明の モノクローナル抗体またはそ の断片もしくは誘導体に対して特異的に結合し得る前記突然変異型ＨＢｓＡｇの 断片または誘導体をコードする単離された核酸をも提供する。突然変異型ＨＢｓ Ａｇの断片または誘導体が免疫原性であることが好ましい。 本発明は本発明の核酸を含む組成物を提供し、特に哺乳動物に投与したときに コードされるアミノ酸配列を発現させるのに適した形態で本発明の核酸を含むワ クチン組成物を提供する。 本発明の用途及び使用に際し、本発明のモノクローナル抗体はモノクローナル 抗体Ｐ２Ｄ３、モノクローナル抗体Ｍ３Ａ１０、モノクローナル抗体Ｍ４Ｆ５ま たはその２つ以上の組合せであり得る。モノクローナル抗体Ｐ２Ｄ３、Ｍ３Ａ１ ０及びＭ４Ｆ５の１つ以上を本発明の他のモノクローナル抗体及び／または他の 抗−ＨＢＶ抗体、特に抗−ＨＢＳ抗体と一緒に投与してもよい。本発明のモノク ローナル抗体の断片もしくは誘導体を使用することもできる。 本発明は、本発明のモノクローナル抗体を産生し得るハイブリドーマ、例えば ハイブリドーマＰ２Ｄ３（受託番号ＥＣＡＣＣ ９７０４２３３１）、ハイブリ ドーマＭ３Ａ１０（受託番号ＥＣＡＣＣ ９７０４２３３０）及びハイブリドー マＭ４Ｆ ５（受託番号ＥＣＡＣＣ ９７０４２５１９）をも提供する。 本発明は、本発明のモノクローナル抗体を作製し得るハイブリドーマを産生す る方法を提供し、該方法は野生型ＨＢｓＡｇまたは突然変異型ＨＢｓＡｇを用い て動物を免疫化し、抗体産生細胞を不死化してハイブリドーマを形成し、生じた ハイブリドーマ培養物を野生型ＨＢｓＡｇ及び２つ以上の突然変異型ＨＢｓＡｇ についてスクリーニングし、野生型ＨＢｓＡｇ及び２つ以上の突然変異型ＨＢｓ Ａｇに特異的に結合し得るモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを選択 することからなる。 本発明のモノクローナル抗体は、本発明のハイブリドーマをインビトロもしく はインビボで培養し、培地からモノクローナル抗体を獲得することにより得られ 得る。インビボで作製する場合、培地は腹水であり得る。 ハイブリドーマ及びモノクローナル抗体を作製及びスクリーニングする方法は 当業者に公知である。一般的な方法はＫｏｈｌｅｒ ＆ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ（１ ９７５）に記載されており、その後この主題に関しては多くの刊行物が存在する 。本発明の方法に従ってハイブリドーマ及びモノクローナル抗体を作製及びスク リーニングするために、前記した任意の方法が利用され 得る。抗体を作製するために使用される抗原は、野生型ＨＢｓＡｇまたは上記し たような突然変異型ＨＢｓＡｇ、例えば上記した突然変異型Ｉ〜IVの１つ以上で あり得る。生じたハイブリドーマ及びモノクローナル抗体は、野生型ＨＢｓＡｇ 及び選択した突然変異型を使用する慣用の方法により各種型のＨＢｓＡｇに対し て特異的に結合する能力についてスクリーニングされ得る。上記したように、ス クリーニングは、参照抗原として野生型ＨＢｓＡｇ及び２つ以上の上記したよう な突然変異型ＨＢｓＡｇ、例えば突然変異型Ｉ〜IVの２つ以上を用いて実施され 得る。 スクリーニングのためには、非常に低いバックグラウンド及び大きな動的レン ジであり得且つ簡単に設定されるという利点をも有するＩｇＧ逆捕獲ラジオイム ノアッセイを使用するのが特に簡便である。 当該抗体に対するＩｇＧ逆捕獲アッセイでは、適切な抗−スピーシスＩｇＧを 固相、例えばミクロウェルに固定化する。例えば被検抗体をマウスで作製したと きには、固相を抗−マウスＩｇＧでコートする。次いで、被検サンプルを固定化 抗−スピーシスＩｇＧとインキュベートすると、サンプル中に存在する 総ＩｇＧに相当する量が捕獲される。次いで、固相を適当に標識された抗原と一 緒にインキュベートすると、前記抗原は当該捕獲抗体のみと複合体を形成する。 次いで、形成された複合体を検出し得る。 本発明の場合、被検サンプル、例えばハイブリドーマ培養由来の組織培養上清 または腹水を固定化抗−ＩｇＧと一緒にインキュベートする。捕獲された抗体を 、標識野生型ＨＢｓＡｇ及び上記したような標識突然変異型ＨＢｓＡｇ、例えば 突然変異型Ｉ〜IVから選択される２つ以上と別々にインキュベートする。野生型 ＨＢｓＡｇ及び２つ以上の突然変異型表面抗原に対して特異的に結合し得るサン プルは、本発明の範囲内のモノクローナル抗体を含む。 ＩｇＭまたはＩｇＡモノクローナル抗体を獲得するために逆相ＩｇＭまたはＩ ｇＡアッセイを同様に使用することもできる。 ＨＢｓＡｇのための市販イムノアッセイは、通常、抗−ＨＢｓが固相、一般に はミクロウェル、微細粒子またはビーズに固定化されている不均一相、すなわち 「捕獲」アッセイである。被検サンプル、通常血清を固定化抗−ＨＢｓと接触さ せるとき、サンプル中に存在するＨＢｓＡｇは固定化抗体に結合しなけれ ばならない。次いで、捕獲された抗原を、通常標識抗−ＨＢｓを用いて検出する 。慣用のアッセイの場合、捕獲または検出のために使用される抗体はモノクロー ナルでもポリクローナルであってもよい。 その特性から、ポリクローナル抗体は広範囲の特異性及び選択性を有する。Ｈ ＢＶの場合、これによりエスケープ突然変異体に結合し得る抗体は抗血清中に存 在し得る。しかしながら、このことは保証され得ず、バッチ毎に生成物の均一性 を得ることに固有の問題が存在する。モノクローナル抗体は特定の特異性及び選 択性を有し、従ってエスケープ突然変異体を検出することはできない。 野生型ＨＢｓＡｇ及び突然変異型ＨＢｓＡｇに対して特異的に結合し得る本発 明のモノクローナル抗体、その断片もしくは誘導体を含めた前記抗体の組み合わ せをＨＢｓＡｇに対するイムノアッセイに使用すると、アッセイの性能が改良さ れ、突然変異型ＨＢｓＡｇが検出される可能性が高くなる。本発明のモノクロー ナル抗体またはその２つ以上の組み合わせは、抗原捕獲のために及び／または生 じた抗体−抗原複合体の検出のために抗−ＨＢｓ抗体単独として使用され、また は好ましくはポリ クローナル抗−ＨＢｓまたは他のモノクローナル抗−ＨＢｓに加えて使用され得 る。本発明のモノクローナル抗体またはその２つ以上の組み合わせは、ＨＢｓＡ ｇに対する均一相アッセイにおける従来の抗−ＨＢｓと同様に使用され得る。従 って、本発明はＨＢｓＡｇを検出するためのイムノアッセイを提供し、該方法は ＨＢｓＡｇを含んでいると疑われるサンプルを本発明のモノクローナル抗体、そ の断片もしくは誘導体、その２つ以上の組み合わせを接触させ、生じた抗原−抗 体複合体を検出することからなる。前記モノクローナル抗体、断片、誘導体また はその組み合わせは、単独の抗−ＨＢｓ試薬として使用され得、またはポリクロ ーナル抗−ＨＢｓ及び他の抗−ＨＢｓモノクローナル抗体から選択される１つ以 上の他の抗−ＨＢｓ抗体と一緒に使用され得る。 各種異なるフォーマットを有するイムノアッセイ、それを実施するための方法 及び適当な試薬は公知であり、いろいろな書物及び論文、例えばＫｅｍｅｎｙ ＆ Ｃｈａｌｌａｃｏｍｅ（１９８８）及びＴｓｕ ＆ Ｈｅｒｚｅｎｂｅｒｇ （１９８０）に記載されている。任意の抗原検出方法が本発明で使用され得る。 本発明のアッセイは、いわゆる「サンドイッチ」アッセイ、競合アッセイまた は直接反応であり得る。モノクローナル抗体、断片、誘導体またはその組み合わ せは、それ自体を、またはポリクローナル抗−ＨＢｓ抗血清及び／または１つ以 上の他の抗−ＨＢｓモノクローナル抗体と混合して固体表面に固定化させること ができる。或いは、本発明のモノクローナル抗体またはその組み合わせ及び任意 の別の抗体は均一相にあり得る。生じた抗原−抗体複合体は標識抗−ＨＢｓを用 いて検出され得る。不均一相アッセイの場合、検出のために使用される抗−ＨＢ ｓは固体表面をコーティングするために使用したものと同じであっても異なって いてもよい。 その上に抗−ＨＢｓが固定化され得る適当な固体表面は公知であり、微量滴定 プレートのウェルの内側ウェル、ビーズ、パーティクル及びいわゆるラテックス を含む。例えばニトロセルロースまたはペーパーの膜及びストリップが使用され 得る。膜またはストリップはアッセイデバイスに組み込まれ得る。前記アッセイ デバイスも公知である。本発明は、その上に本発明のモノクローナル抗体、その 断片もしくは誘導体、またはその２つ以上の組み合わせが固定化されている固相 も包含する。 抗原−抗体複合体を検出するために使用される抗−ＨＢｓは、直接または間接 的にシグナルを発生し得る任意の物質を用いて標識し得る。前記物質は公知であ る。直接シグナルを発生し得る物質には放射性標識、色素原標識及び蛍光標識が 含まれる。間接的にシグナルを発生し得る物質には、色の変化を生じる反応を触 媒し得る酵素が含まれる。 本発明は、本発明のイムノアッセイを実施するのに必要な成分を含むキットを も提供する。前記キットは、例えば固体表面に固定化させた本発明のモノクロー ナル抗体またはその２つ以上の組み合わせ、及び例えば洗浄液、希釈剤、標準溶 液、コントロール試薬、標識抗−ＨＢｓ抗体及び酵素標識抗−ＨＢｓの場合には 着色試薬から選択される他の必要な試薬を含む容器と一緒に含む。 Ｂ型肝炎コアタンパク質（ＨＢｃ）に対する抗体のためのイムノアッセイは、 しばしば、例えば同じミクロウェルにおいてＨＢｓに対するアッセイと同時に実 施される。本発明は、前記アッセイにおける本発明のモノクローナル抗体の使用 、キット及び該アッセイに使用されるコートされた固相を包含する。 上記したように、本発明のモノクローナル抗体は、受動免疫 のために、例えばＨＢＶ感染患者に対する肝移植中に使用され得る。受動免疫の ために、抗体は非経口投与のための抗血清として使用するのに適した形態、例え ばヒト化を含めた誘導体化し得る形態とする。使用される抗体の用量は、各患者 の特定環境に依存し、ケースバイケースで決定される。 ２つ以上の組み合わせ、断片もしくは誘導体を含めた本発明のモノクローナル 抗体は、単独で、または他の抗−ＨＢｓポリクローナルまたはモノクローナル抗 体に加えて使用され得る。他の抗−ＨＢＶ抗体をも含めることができる。 本発明のモノクローナル抗体が結合する突然変異型ＨＢｓＡｇは、抗原、例え ばワクチンとして、モノクローナル抗体の作成に際し、及び本発明の推定抗体を スクリーニングするために使用され得る。前記突然変異型ＨＢｓＡｇは、ＨＢＶ エスケープ突然変異体を有していると認められる被験者から獲得され得る。前記 した被験者は通常抗−ＨＢｓポジティブであり且つＨＢｓＡｇポジティブである 。適当な被験者は、ＨＢＶ感染のためにモノクローナル抗体治療を受けた患者か ら、予防接種を受けた患者（特に防御突破感染が認められる患者）から、現在の 標準試験を用いる臨床検査では診断が困難なＨＢＶ感染の場合 に見つけられる。 上記した突然変異型のひとつ、例えば突然変異型Ｉ〜IVの突然変異型ＨＢｓＡ ｇは、組換えＤＮＡ技術により作製され得る。突然変異体をコードする天然ＤＮ Ａは、突然変異型ＨＢｓＡｇの発現用の適切な宿主に組み込まれ得る。或いは、 野生型ＤＮＡは、例えば位置指定突然変異により修飾され、その後突然変異型の 発現を得るために使用され得る。 天然ソース、通常特定の被験者の血液から得られたＨＢｓＡｇは天然グリコシ ル化を有し、一般に前記ＨＢｓＡｇを抗原として使用するのが通常好ましい。血 液からＨＢｓＡｇを精製する方法は公知であり、例えばＣａｍｅｒｏｎら（１９ ８０）を参照されたい。部分的にもしくは完全にグリコシル化された組換え突然 変異型ＨＢｓＡｇを作製することが好ましいこともある。 ＨＢｓＡｇは完全長を有していても、適当な抗原断片を使用することもできる 。前記断片は組換え技術により得られ得る。或いは、例えば化学合成により作製 される抗原ペプチドである断片を使用することもできる。ワクチンとして使用す る場合、抗原は免疫原性、すなわち保護応答を生じ得なければならない。 ワクチンとして使用する場合、（完全長、断片またはペプチドであっても、組 換え技術により、合成によりまたは天然ソースから得られたものであっても）所 望の抗原は精製され、例えば慣用の担体及び適切な場合には添加剤を使用して適 当な形態に加工されなければならない。 ワクチン化のための抗原として使用する代替物として、前記抗原をコードする 核酸を使用することができる。インビボで発現し得る形態の核酸を作製する方法 は公知である。本発明は核酸ワクチンを包含する。 抗−イディオタイプ抗体を作製する方法は公知である。本発明の場合、本発明 のモノクローナル抗体は、抗−イディオタイプ抗体を作製する際に抗原として使 用され、生じた抗体は本発明のモノクローナル抗体に対してスクリーニングされ 得る。本発明の抗−イディオタイプ抗体は公知の方法でワクチンとして使用され 得る。 本発明を非限定的実施例により説明する。 実施例 Ｉ．材料及び方法 １：患者 以下のモノクローナル抗体は、２人の患者の突然変異型ＨＢｓＡｇに対して作 製した。前記患者は、相反する血清マーカーの結果として同定された。 患者ＭＡＭはＨＢＶ保菌者であった。血清は、最初１９８６年、ポリクローナ ルを用いる逆受身赤血球凝集反応アッセイ（ＲＰＨ）でＨＢｓＡｇ陽性であった がモノクローナルエンザイムイムノアッセイ（ＥＩＡ）では陰性であった。１９ ８８年に患者は腎移植を受けた。再び調べたところ、ＨＢｓＡｇはポリクローナ ル及びモノクローナル抗体を用いるアッセイで検出され得るようになったが、ポ リクローナル抗体アッセイのみで検出可能な状態に戻った。この患者の血清は、 フォローアップ期問中抗−ＨＢｃ及びＨＢｓＡｇ陽性であった。 患者ＮＰは１９８５年に腎移植を受けた。１９９０年、患者は抗−ＨＢｃ血清 陽性であったが、ＨＢｓＡｇ及び抗−ＨＢｓは検出されなかった。１９９３年か ら血液透析を始め、その年の後にはＨＢｓＡｇがポリクローナルを用いるアッセ イのみで検出された。 いずれの患者に対してもワクチン接種は今まで行っていなかった。 “ａ”抗原決定基の周りのＨＢｓＡｇ抗原の配列を、Ｈａｗｋｉｎｓら（１９ ９４）に記載されているＰＣＲ産物に対して直接実施した一本鎖配列決定により 決定した。 ２：モノクローナル抗体の作製 ２．１ 動物 雌Ｂａｌｂ／ｃマウスを使用した。 ２．２ ＨＢｓＡ の精製 マウスの免疫化に必要なＨＢｓＡｇの精製は、Ｃａｍｅｒｏｎら（１９８０） に記載されている方法に基づいた。 高力価ＨＢｓＡｇ陽性血清は、２０ｍｌ容量ずつＴｒｉｓで緩衝し且つ０．１ ％アジ化ナトリウムを含む０．９％ ＮａＣｌ ｐＨ７．６（Ｔｒｉｓ／Ｓａｌ ／ＡＺ）で平衡化したセファロース６Ｂ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｌｔｄ）のカラ ム（１００×５ｃｍ直径）に流して分画化した。アルブミン及びＩｇＧを含まな い富ＨＢｓＡｇ分画を、ＸＭ １００Ａメンブラン（Ａｍｉｃｏｎ Ｌｔｄ．） を取り付けた撹拌式２００ｍｌ限外濾過セルを用いて限外濾過することにより９ ｍｌ容量まで濃縮した。これに固体ＣｓＣｌ（２．６９ｇ）を添加し、容量を１ ０ｍｌに調節して密度１．２ｇ／ｃｍ³とした。次いで、材料を２０℃ において、ＳＷ５０−Ｌスイングバケットローター（Ｂｅｃｋｍａｎ ＲＩＩＣ Ｌｔｄ）において２本の５ｍｌチューブを用いて１２４０００ｇで３日間超遠 心すると、自己形成密度勾配で等密度バンドが形成された。 ２２ｎｍ小粒子を含む主ＨＢｓＡｇバンドを両チューブから取り出し、プール し、Ｔｒｉｓ／Ｓａｌ／ＡＺ中にＣｓＣｌを含む溶液（２．８８５ｇ＋１０ｍｌ ）で５ｍｌとし、最終密度を１．２ｇ／ｃｍ³とした。材料を１本の５ｍｌチュ ーブを用いて前記と同じ条件下で超遠心すると、第２の等密度バンドが形成され た。最終ＨＢｓＡｇバンドを取り出し、ＰＢＳ中で透析してＣｓＣｌを除去した 。 ３：動物の免疫化 等容量のＴｉｔｅｍａｘアジュバント（Ｖａｘｃｅｌ，Ｉｎｃ）中に混合した 精製ＮＰ ＨＢｓＡｇ（５０μｌ）を、雌Ｂａｌｂ／Ｃマウスに皮下注射した。 約２ヶ月後、３０μｌ用量を腹腔内（ｉ．ｐ．）投与し、３ヶ月後７５μｌ用量 をｉ．ｐ．投与した。最後に、融合の３日前にサリン中２５μｌのＨＢｓＡｇを 静脈投与した。 マウスにＭＡＭ ＨＢｓＡｇを用いて免疫化するときに同じ プロトコルを用いた。 ４：ミエローマ細胞の培養 Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８６５３（Ｋｅａｒｎｅｙら、１９７９）由来のＪＫ細胞を 、３７℃、空気中５％ＣＯ₂の雰囲気、１００％湿度で完全培地（試薬参照）に おいて培養した。 細胞を１週間に約３回１：２にスプリットし、２×１０⁵〜２×１０⁶細胞／ｍ ｌの濃度で維持した。指数的成長相にある細胞のみを脾細胞への融合のために使 用した。 融合のために、ミエローマ細胞を１，５００ｇで１０分間スピンし、同容量の 不完全培地（試薬参照）で３回洗浄した。再懸濁させたＪＫ細胞を不完全培地中 に１：１０希釈し、細胞の生存能力及び濃度をＮｅｕｂａｕｅｒチャンバーにて 細胞を計数することにより測定した。ＪＫ細胞の濃度は約５．８７×１０⁷細胞 ／ｍｌであることが判明した。 ４．１：支持細胞の作製 マウス腹腔滲出細胞をハイブリッド細胞に対する支持細胞層として使用した。 これらの細胞を融合を行う前の日に作製した。ヒポキサンチン、アミノプテリン 及びチミジンを含有する低温完全培地（ＨＡＴ培地、試薬参照）を、支持細胞の 作製のため に使用した。培地５ｍｌを殺したばかりのＢａｌｂ／ｃマウスの腹腔に注入し、 緩やかに撹拌した後、滲出細胞を含有する培地に無菌的に取り出した。細胞１０ ０μｌを、無菌の９６ウェルプレートの各ウェルに加えた（融合される脾臓につ き４〜５枚のプレートが必要であった）。融合日に、プレートが細菌もしくは真 菌で目に見える程度汚染されていないことを確認するために全てのプレートを試 験した。 ４．２：脾臓細胞の作製 ＭＡＭ ＨＢｓＡｇで免疫化されたマウス及びＮＰ ＨＢｓＡｇで免疫化され たマウス由来の脾臓細胞を同様にして作製した。 脾臓を殺したばかりのマウスから注意深く取り出し、低温完全培地５ｍｌを含 むペトリ皿に入れた。脾臓を小刀の尖っていない面を用いて注意深くばらばらに することにより、脾臓結合組織から細胞をそぎ離した。次いで、細胞懸濁液を無 菌の万能容器に移し、破片を底に沈降せしめた。上清を注意深く取り出し、細胞 を１５０ｇで１０分間ペレット化した。細胞を不完全培地１０ｍｌで３回洗浄し 、最終細胞ペレットを不完全培地１０ｍｌに再懸濁させた。脾臓細胞の収量及び 生存能力を Ｎｅｕｂａｕｅｒチャンバーを用いて測定した。ＮＰ脾臓からは約７×１０⁷個 の細胞が収集され、一方第１のＭＡＭ脾臓からは１０×１０⁷個の細胞、第２の ＭＡＭ脾臓からは２．５×１０⁷個の細胞が収集された。 ４．３：細胞融合 脾細胞をミエローマ細胞と４：１の比率で混合し、混合物を１５００ｇで１０ 分間遠心した。上清を取り出すと、容器の底に細胞のドライペレットが残った。 容器を３７℃の湯浴に入れた。予めオートクレーブ滅菌したポリエチレングリコ ール１５４０（ＰＥＧ）も３７℃の湯浴で加温した。細胞ペレットは容器の底で ほぐれ、容器を緩やかに撹拌しながらＰＥＧ溶液１ｍｌを滴下した。細胞／ＰＥ Ｇ混合物を３７℃で１分間放置した後、加温した不完全培地２ｍｌを添加した。 更に、不完全培地２５ｍｌが添加されるまで不完全培地を１分ごとに容量が２倍 になるようにゆっくり添加した。次いで、融合細胞を１５００ｇで１０分間遠心 し、ペレットをＨＡＴ培地１０ｍｌに再懸濁させた。細胞懸濁液を５枚の支持細 胞プレート上に均等に分配し、次いでＣＯ₂インキュベーターに入れた。 ４．４：ハイブリッド細胞の培養 約１週間後に増殖融合細胞のクラスターが現れた。この段階で、古い培地１０ ０μｌを新鮮なＨＡＴ培地で交換することにより細胞を再供給した。融合から約 １４日後、融合に成功した細胞クラスターが認められた各ウェルから上清液１０ ０μｌを取り出し、抗−ＨＢｓの存在についてアッセイした。上清をヒポキサン チン及びチミジンを含む完全培地（ＨＴ培地、試薬参照）で置換した。 ４．５：抗−ＨＢｓ分泌型ハイブリドーマを検出するための逆捕獲ＲＩＡ 生存ハイブリドーマ培養物からの上清を逆捕獲アッセイに基づいて抗−ＨＢｓ について試験した。 丸底Ｎｕｎｃミクロウェルを、家兎抗−マウスＩｇＧのＩｇＧ分画のＴｒｉｓ 緩衝液中１：１０００希釈物１００μｌでコートした。室温で２日後、ウェルを ツイーンサリンで洗浄し、トリス緩衝液中０．５％ウシ血清アルブミン（Ｔｒｉ ｓ ＢＳＡ緩衝液、試薬参照）を用いて１時間クエンチした。次いで、ウェルを シールし、湿気を含んだ４℃で保存した。洗浄はすべてツイーンサリンで行った 。 アッセイを行う前に、Ｔｒｉｓ ＢＳＡ緩衝液を除去した。融合に成功した細 胞クラスターが認められた各ウェルからの上清のリン酸緩衝液中１：１０希釈物 １００μｌをアッセイウェルに加え、３７℃で１時間インキュベートした。洗浄 後、精製¹²⁵Ｉ−野生型ＨＢｓＡｇ１００μｌを添加し、湿ったボックス中に室 温で一晩放置した。次いで、アッセイウェルを洗浄し、結合放射能を１６チャン ネルガンマカウンターを用いて測定した。抗−ＨＢｓを含む上清は、標識の高い 結合を示した。次いで、ハイブリドーマを、¹²⁵Ｉ−野生型ＨＢｓＡｇの代わり に¹²⁵Ｉ−ＭＡＭ標識及び¹²⁵Ｉ−標識を用いて同じアッセイで再試験した。実施 した各アッセイにはポジティブコントロール及びネガティブコントロールを含め た。使用したポジティブコントロールは野生型ＨＢｓＡｇに対するモノクローナ ルＤ２Ｈ５及びＨ３Ｆ５であった。抗−ＨＩＶ ｇａｇモノクローナル抗体３Ｄ ３Ｆ２及びリン酸緩衝食塩液をネガティブコントロールとして使用した。 アッセイの結果から、抗−ＨＢｓを分泌するコロニーを含有する親ウェルを更 なるスクリーニング及びクローニングのために選択した。 細胞が十分増殖したら、細胞をガラスパスツールピペットを用いて吸引し、Ｈ Ｔ培地中にマウス腹腔滲出細胞（ＰＥＣ）の層を含む２４ウェル無菌プレートに 無菌的に移した。 ４．６：限界希釈法によるクローニング 抗−ＨＢｓ陽性と同定されたハイブリドーマを限界希釈法によりクローニング した。これは、分泌された抗体が均質であり単一特異性であることを確認するた めに実施する。各ハイブリッド培養物について、１００個の細胞を含有する細胞 懸濁液の容量を計算し、この容量を完全培地１０ｍｌに添加した。この細胞懸濁 液１００μｌを、完全培地中に支持細胞を含む９６ウェルプレートの４８ウェル の各ウェルに添加した。１００個以上の細胞を完全培地の残り５ｍｌに添加し、 このより濃厚な細胞懸濁液１００μｌをプレートの２４ウェルに添加した。最後 に、更に１００個の細胞を残りの細胞懸濁液に添加し、これを最後の２４ウェル に分配した。幾つかの培養物の不正確な細胞数及び低生存能力を考慮して、各プ レートに対して細胞濃度に変化を付けた。選択した親ハイブリドーマのそれぞれ についてこの手順を繰り返した。 クローニングから約５日後、単一コロニーのみが生存してい るウェルについてプレートを調べた。これらのウェルから上清１００μｌを取り 出し、上記した逆捕獲アッセイを用いて抗−ＨＢｓについて再試験した。 次いで、抗−ＨＢｓを分泌するクローンを上記したように増殖させ、必要によ り組織培養上清１００μｌを除去し、新鮮な完全培地で置換することにより再供 給した。 ４．７：ハイブリッドクローンの培養 コロニーがウェルを十分に覆うほど大きくなったら、コロニーを支持細胞を含 む１２ｃｍ²組織培養フラスコで増殖させ、さらに２５ｃｍ²フラスコ及び７５ｃ ｍ²フラスコで増殖させた。細胞をほぼ２〜３日毎に新鮮な完全培地で１：２に スプリットした。 良好な増殖が確立されたら、数個の細胞を凍結し、１０％ジメチルスルホキシ ド及び５０％ウシ胎仔血清を補充した不完全培地において液体窒素下で保存した 。 ４．８：腹水の作製 １２〜２０週令の雌Ｂａｌｂ／ｃマウスをプリスタン０．５ｍｌでプライムし た。プライムから１〜４週間後、不完全培地に再懸濁させたクローン化ハイブリ ドーマ細胞１ｍｌを腹腔内 注射した。それから１〜３週間後腹水を吸引し、３０００ｇで１０分間遠心する ことにより細胞から腹水を分離した。その後腹水を−２０℃で保存した。 II．野生型及び突然変異型ＨＢｓＡｇに対するモノクローナル抗体のキャラクタ リゼーション １：モノクローナル抗体のイソタイビング モノクローナル抗体のイソタイピングを、組織培養上清中のモノクローナル抗 体のクラス及びサブクラスを同定すべく特別に設計されたＳｅｒｏｔｅｃ（Ｓｅ ｒｏｔｅｃｈ Ｌｉｍａｉｔｅｄ，２２ Ｂａｎｋｓｉｄｅ Ｓｔａｔｉｏｎ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｋｉｄｌｉｎｇｔｏｎ，Ｏｘｆｏｒｄｓ ＯＸ５ １ＢＲ） のキットを用いて実施した。製造業者の推奨に従って使用すると、マウスモノク ローナル抗体の特性が容易に決定づけられる。 ２：血清タンパク質電気泳動 血清タンパク質電気泳動（ＳＰＥ，Ｐａｒａｇｏｎ電気泳動システム，Ｂｅｃ ｋｍａｎ Ｌｔｄ．）によりモノクローナルタンパク質バンドの存在について各 クローンからの腹水を調べた。提供されているプロトコルに従って、キットによ って前記 腹水が高レベルでモノクローナル免疫グロブリンを含むことが簡便に同定された 。 Ｐａｒａｇｏｎ血清タンパク質電気泳動キットは、緩衝アガロースゲルにてタ ンパク質を電気泳動により分離するものである。電気泳動後、ゲル中のタンパク 質を固定液で固定し、ゲルをフィルムになるまで乾燥した。タンパク質パターン を、フィルムをタンパク質特異的染色剤で染色して可視化し、パターンを目視で 分析した。 ３：免疫グロブリンＧ調製 免疫グロブリンＧを各種腹水からイオン交換クロマトグラフィーにより調製し た。 予め膨潤状態で供給されるＤＥ５２ゲル（Ｗｈａｍａｎ Ｌｔｄ）を０．２Ｍ リン酸緩衝液（ｐＨ８．０）に再懸濁させた。その後、ゲルを蒸留水に分散させ て１０ｍＭ緩衝液濃度とした。 ＤＥ５２ゲルを、ゲル対サンプルの容量比が５：１となるようにＫ９カラム（ Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に充填した。全てのカラムを等容量の１０ｍＭリン酸緩衝 液（ＰＢ、試薬参照）で平衡化した。１０ｍＭ ＰＢを用いて４℃で一晩透析さ せた後、 サンプルをカラムの上部に重層し、３０分間にわたり吸収させた。 腹水からの免疫グロブリンＧを、１０ｍＭ、３０ｍＭ及び６０ｍＭ ＰＢを用 いて段階溶出させて回収した。各緩衝液をカラムに流し、溶離液の光学密度を２ ８０ｎｍでモニターし、記録した（紫外線分光光度計，ＬＫＢ Ｌｔｄ．）。３ 種の溶離液を別個に集め、逆捕獲ＲＩＡを用いて抗−ＨＢｓ活性についてアッセ イした。大量の抗−ＨＢｓ反応性を含む溶離液を同定できた。 腹水ＩｇＧのタンパク質濃度を、分光光度計にて１．４のＥ１％ １ｃｍ値を 用いて２８０ｎｍの吸光度を測定することにより計算した。 ４：免疫グロブリンＡ調製 ＩｇＧと同様に、ＩｇＡをイオン交換クロマトグラフィーを用いて調製した。 しかしながら、分離にはＳｅｐｈａｃｒｙゲルを用いた。ＤＥ５２と同様に、ゲ ルを１０ｍＭリン酸緩衝液で平衡化した。サンプルをカラムの上部に重層し、３ ０分間にわたり吸収させた。前記したように、腹水を段階溶出により分離した。 溶離液をモニターし、抗−ＨＢｓ反応性について試験 した。 ５：放射性標識方法 免疫グロブリン分画をヨードゲン法（Ｓａｌａｃｉｎｓｋｉら、１９７９）によ り標識した。 清潔な７．５×１０ｃｍガラス管をまずクロロホルム５μｇでコートした。ヨ ードゲン管に、ＰＢＳ中タンパク質１５μｇを添加した。最後にＮａ¹²⁵Ｉ（０ ．５ｍｉＣｉ，Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｐｌｃ）を添 加し、管中での反応を氷上で１０分間進行させた。ヨードゲンはＮａ¹²⁵Ｉに対 する穏和な酸化剤として作用し、タンパク質上のチロシン残基に結合する。 次いで、Ｋ９カラムにＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５を充填し、Ｔｒｉｓ ＢＳ Ａ緩衝液で平衡化した。ＰＢＳ中の非放射性ヨウ素（ＫＩ／ＮａＩ）は遊離¹²⁵ Ｉがカラムに粘着する傾向を減ずるので、ＫＩ／ＮａＩをＧ２５カラムに添加し た。次いで、反応混合物をヨードゲン管から取り出し、カラムに移した。このＢ ＳＡ緩衝液を溶出のために使用し、溶離液をモニターした。第１のピークから^{12 5} Ｉ標識タンパク質分画を集め、ピークが先細りし始めたら中止した。その後、 標識タンパク質を５％ ＢＳＡ含有トリス食塩緩衝液中で４℃で保存した。 遊離¹²⁵Ｉが完全に溶出されるまで（第２ピーク）溶出を続けた。このピーク の高さと第１ピークの高さとの比較から結合¹²⁵Ｉのパーセンテージを概算した 。 III．結果 １：患者 ＭＡＭ患者及びＮＰ患者からの血清を、ＨＢｓＡｇに対する一連のアッセイで 試験した。モノクローナル抗体及びポリクローナル抗体を用いる方法を比較した 結果を下表１に示す。 表１：ＨＢｓＡｇアッセイ検出：比較 （注） アッセイ１ 逆受身赤血球凝集反応アッセイ アッセイ２ モノクローナル抗体を用いるアッセイ アッセイ３ 混合モノクローナル／ポリクローナル抗体を用いるるアッセイ アッセイ４ 混合モノクローナル／ポリクローナル抗体を用いるアッセイ アッセイ５ モノクローナル抗体を用いるアッセイ 配列決定の結果から、両患者の“ａ”抗原決定基中に幾つかの点突然変異があ ることが判った。突然変異は、患者ＮＰ由来の増幅されたＨＢＶ ＤＮＡ（サブ タイプａｙｗ）において、表面抗原のアミノ酸１３３、１３４及び１４４をコー ドするコドンで認められた。突然変異は、患者ＭＡＭ由来の増幅されたＨＢＶ ＤＮＡ（サブタイプａｙｗ）においてアミノ酸１３３、１３４、１４２、１４４ 及び１４５をコードするコドンでも認められた。上記した突然変異は、移植前も 移植後でも検出された。ＨＢｓＡｇがモノクローナル及びポリクローナルの両抗 体を使用するアッセイで検出可能なときに比べて、ＨＢｓＡｇがポリクローナル 抗体を用いるアッセイのみで検出可能な間には、配列に違いはなかった。突然変 異を表２に示す。 ＭＡＭ ＨＢｓＡｇは突然変異型ＨＢｓＡｇ Ｉであり、ＮＰ ＨＢｓＡｇは 突然変異型ＨＢｓＡｇ IIである。ＨＢｓＡｇの完全アミノ酸配列及びＨＢｓＡ ｇをコードするヌクレオチド配列はＶａｌｅｎｚｕｅｌａら（１９７９）に記載 されている。 表２：患者ＭＡＭ及びＮＰのＨＢｓＡｇ“ａ”抗原決定基中で 検出された突然変異２：抗−ＨＢｓ分泌型モノクローナル抗体の同定及び分布 抗−ＨＢｓを分泌するハイブリドーマは最初逆捕獲アッセイを用いて同定され た（セクションII，４．５参照）。融合から約１週間後、増殖細胞のクラスター を含むウェルすべてについて抗−ＨＢｓ活性を試験した。実施したアッセイには すべてネガティブコントロール及びポジティブコントロールを含めた。 ＭＡＭ融合から生じた細胞をまず¹²⁵Ｉ ＭＡＭ ＨＢｓＡｇを用いてＲＩＡ で試験し、ＮＰ融合から生じた細胞を¹²⁵ＩＮＰ ＨＢｓＡｇを用いて試験した 。アッセイの結果は、クローンがそれぞれの表面抗原に対する抗体を産生するこ とを示し た。７５０ｃｐｍを越えるカウントを与えるハイブリドーマをポジティブと見做 した。試験した３２０個のＭＡＭクローンのうち１０％がポジティブであり、試 験した２００個のＮＰクローンのうち８％がポジティブであることが判明した。 野生型（ＷＴ）ＨＢｓＡｇに対する反応性を調べるために、前アッセイでポジ ティブを示したかに関わらず、ＮＰ融合及びＭＡＭ融合由来のクローンを¹²⁵Ｉ ＷＴ ＨＢｓＡｇ標識を用いて逆捕獲ＲＩＡで試験した。上記したように、標 識の結合が増加したら結果はポジティブとする。６５０ｃｐｍを越えるカウント を与えるハイブリドーマはポジティブと見做された。試験した３２０個のＭＡＭ クローンのうち６％がポジティブな結果を示し、ＮＰクローンのうち４％が¹²⁵ Ｉ ＷＴ ＨＢｓＡｇに結合することが判明した。 これまでに得られた結果から、ＭＡＭＮＮＰまたはＷＴ Ｂ型肝炎表面抗原を 特異的に認識し、よって該抗原に結合する抗−ＨＢｓを分泌するクローンを同定 することが可能であった。 上記したハイブリドーマ間に交差反応性があるかを調べるために、ＮＰクロー ンは¹²⁵Ｉ ＭＡＭ ＨＢｓＡｇを用いて、ＭＡＭクローンは¹²⁵Ｉ ＮＰ ＨＢ ｓＡｇを用いて試験し た。ＭＡＭクローンのうち４個がＮＰ標識を認識し、ＮＰクローンのうち５個が ＭＡＭ標識により認識されることが判った。 そこで、クローンをすべての標識の組合せを用いて試験した。こうして、¹²⁵ Ｉ ＭＡＭ、¹²⁵Ｉ ＮＰまたは¹²⁵Ｉ ＷＴＨＢｓＡｇを用いて常に強ポジティ ブな結果を与えるハイブリドーマを同定することが可能であった。モノクローナ ル抗体は以下のカテゴリーに分類され得る。すなわち、１）ＭＡＭ特異的；２） ＮＰ特異的；３）ＭＡＭ／ＮＰ特異的；４）ＭＡＭ／ＷＴ特異的；５）ＮＰ／Ｗ Ｔ特異的；６）ＮＰ／ＷＴ／ＭＡＭ特異的。 上記したカテゴリーのひとつに属する８個のＮＰ親ハイブリドーマ及び１０個 のＭＡＭ親ハイブリドーマを選択した。これらのハイブリドーマは、良好な細胞 増殖を示し、また抗−ＨＢｓ活性について試験したときに繰り返しポジティブで あったことから選択された。 次いで、選択された１８個のハイブリドーマを限界希釈法によりクローン化し た。クローニングから約１４日後、単一のコロニーを含むウェルを３個すべての 標識を用いて逆捕獲アッセイで試験した。８個のＮＰハイブリドーマのうち６個 はクロー ン化に成功し、抗−ＨＢｓ活性は依然としてポジティブであることが判明した。 しかしながら、ＭＡＭクローンの場合、選択した１０個のハイブリドーマのう ち６個のみがクローン化された。それぞれの親クローンからハイブリドーマを再 クローニングする試みは、各プレートに添加する細胞の濃度を増加させたにも関 わらず不成功に終わった。単一コロニーを含むうまくクローン化した６個のハイ ブリドーマについて抗−ＨＢｓ活性を試験した。６個のうち、Ｍ３Ｃ９及びＭ３ Ａ１０の２つのハイブリドーマ（これらは３方向に交差反応する）は抗−ＨＢｓ に関して依然としてポジティブであることが判明した。ＭＡＭ融合に由来するハ イブリドーマは、継代させると非常に不安定であることが判明した。 増殖のために少なくとも３個のポジティブクローンを各ハイブリドーマから選 択した。クローンを培養中で増殖させ、２週間後に再試験した。ＮＰクローンは すべて抗−ＨＢｓ分泌に関して依然ポジティブであった。しかしながら、ＭＡＭ クローンのうちＭ３Ｃ９は非常に不安定であり、ＲＩＡでネガティブな結果を示 すことが判明した。 各融合からの最終的ポジティブ分泌型ハイブリドーマを下表３に示す。表には 、モノクローナル抗体特異性及び最も近い５００ｃｐｍに概算したＲＩＡ値をも 示す。 表３：ＮＰ融合及びＭＡＭ融合に由来するクローン、その特異 性及びＲＩＡ値ＰはＮＰ融合に由来するハイブリドーマ、ＭはＭＡＭ融合に由来するハイブリド ーマを示す。 ＊ ３方向交差反応性を示す。 第２のＭＡＭ融合を試みた。融合は上記したように実施した。 しかしながら、脾臓細胞の収量は、第１のＭＡＭ融合で記録した収量の２５％に すぎなかった。それから１週間後、増殖細胞のクラスターを含むウェルすべてに ついて、逆捕獲ＲＩＡを用いて抗−ＨＢｓ活性を試験した。上記したように、各 アッセイにはネガティブコントロール及びポジティブコントロールを含めた。融 合により生じたすべての細胞について¹²⁵Ｉ ＭＡＭＨＢｓＡｇ、¹²⁵Ｉ ＮＰ ＨＢｓＡｇ及び¹²⁵Ｉ ＷＴ ＨＢｓＡｇの各標識を用いて試験した。 試験した６８個のクローンのうち、３個のみがポジティブな結果を示した、１ 個のクローンはＭＡＭ特異性であり、Ｍ４Ｈ２及びＭ４Ｆ５の他の２個のクロー ンはＷＴ／ＮＰ／ＭＡＭ交差反応性であることが判明した（表４）。しかし、以 下により詳細に記載するように、Ｍ４Ｈ２は、第１のＭＡＭ融合に由来する幾つ かのハイブリドーマと同様に不安定であることが判った。このクローンは最終的 にはＭＡＭ特異性クローンとして安定化された。 表４：第２のＭＡＭ融合に由来するクローン、その特異性及び ＲＩＡ値 * ３方向交差反応性を示す。 ** 最初３方向交差反応性であることが判ったが、後に不安定でありＭＡＭ特異 性クローンに変化することが判った（以下参照）。 ３個のハイブリドーマはすべて良好な細胞増殖を示し、限界希釈法によりクロ ーン化された。この時点でのクローニングは成功したことが判明し、単一コロニ ーを含むウェルすべてについて３種の標識を用いて逆捕獲ＲＩＡで試験した。ク ローンは抗−ＨＢｓ活性に関して依然としてポジティブであることが判った。 増殖のために、５個のポジティブクローンを選択した。培養で更に増殖させた 後、クローンをスクリーニングし、抗−ＨＢｓ産生に関して依然としてポジティ ブであることが判った。 ＮＰ融合及び２回のＭＡＭ融合により得られたポジティブ親ハイブリドーマの 最終数、その抗体特異性及び交差反応性を表５に示す。 表５：クローンの最終数、その特異性及びＲＩＡ値 * ３方向交差反応性を示す。 ** 最初３方向交差反応性であることが判ったが、後に不安定でありＭＡＭ特異 性クローンに変化することが判った（以下参照）。 更に、抗体Ｐ２Ｄ３、Ｍ４Ｆ５及びＭ３Ａ１０とＷＴ、ＮＰ及びＭＡＭ ＨＢ ｓＡｇを用いて交差競合試験を行った。これらの各抗体は相互に交差競合したが 、生じた他のモノクローナル抗体とは交差競合しなかった。この段階でＭ２Ｈ４ は依然として３通り交差反応性であるようであった。 上記した結果は、本発明のモノクローナル抗体が別個のエピトープに結合する ことをも示す。 各親ハイブリドーマから１個のポジティブクローンを選択し、このクローンを 予めプリスタンを投与したＢａｌｂ／ｃマウスに注入した。腹腔内接種から１〜 ３週間後、マウスから腹水を採取した。すべてのクローンによりマウスにおいて 明らかに腹水腫瘍が生じた。各マウスから採取した腹水の量は１〜５ｍｌであっ た。 各種抗体のそれぞれとＷＴ、ＭＡＭ及びＮＰ ＨＢｓＡｇを用いてより詳細な 交差競合試験を行った。この試験は、上記し た逆捕獲ＲＩＡプロトコルに従って、ただしミクロウェルをヤギポリクローナル 抗−ＨＢｓ抗体をコートして実施した。各試験で、抗原１００μｌを加え、一晩 インキュベート後、¹²⁵Ｉ標識及び非標識モノクローナルを各５０μｌを加え、 結合を調べた。下表６ａ、６ｂ及び６ｃには、標識抗体を横欄に、非標識抗体を 縦欄にリストした。 表６ａ、６ｂ及び６ｃに示す結果から、３方向交差反応性の抗体Ｍ４Ｆ５及び Ｐ２Ｄ３は共通のエピトープに結合することが確認される。 Ｍ３Ａ１０は、すでに３方向交差反応性抗体であることが判明している（表４ 参照）。Ｍ３Ａ１０がＩｇＡ抗体であるという事実（以下のセクションIII．４ 参照）から、この種の抗体（ＩｇＡ）は精製しにくいので表６ａに示す結合が乏 しいという結果が説明づけられ得る。 上記したように、第２のＭＡＭ融合で産生されたハイブリドーマＭ４Ｈ２は最 初３方向交差反応性であることが判明した（表４参照）。しかしながら、培養で 更に増殖させると前記ハイブリドーマの¹²⁵Ｉ ＷＴ ＨＢｓＡｇ及び¹²⁵Ｉ Ｎ Ｐ ＨＢｓＡｇに対する結合が低くなることが判明した。ＷＴ及びＮＰ ＨＢｓ Ａｇに対する抗−ＨＢｓ活性を或る期間再試験したところ、ネガティブな結果が 得られた。しかしながら、Ｍ４Ｈ２は¹²⁵Ｉ ＭＡＭ ＨＢｓＡｇを認識し、強 く結合し続けた。従って、クローンの特異性は最初不安定であったが、経時的に ＭＡＭ特異性抗体を分泌するハイブリドーマになったと考えられる。¹²⁵Ｉ標識抗体の各種ＨＢｓＡｇに対する結合を、固相（ミクロウェル）上に コートしたポリクローナルヤギ抗−ＨＢｓを介してＨＢｓＡｇをミクロウェルに 固定化させたＲＩＡを用いて調べた。使用したＨＢｓＡｇは、上記したＷＴ、Ｍ ＡＭ及びＮＰ ＨＢｓＡｇ、ＳＰ ＨＢｓＡｇ並びにＳＺ ＨＢｓＡｇであった 。血清型ａｄｗであるＳＰ ＨＢｓＡｇでは、アミノ酸１４３のコドンが突然変 異されており、ｓｅｒがｍｅｔで置換されている。血清型ａｄｒであるＳＺ Ｈ ＢｓＡｇでは、１４５のｇｌｙがａｒｇで置換されてなる突然変異を示す。（Ｓ Ｐ ＨＢｓＡｇは突然変異型ＨＢｓＡｇ IVであり、ＳＺＨＢｓＡｇは突然変異 体ＨＢｓＡｇ IIIである。）予め試験してＢ型肝炎マーカーフリー（ＮＨＳ） であることが判明している正常ヒト血清のプールをコントロールとして使用した 。これは本発明のイムノアッセイの例である。結果を下表７に示す。ｎｔ＝試験せず 上記した結果は、３方向交差反応性抗体は、野生型ＨＢｓＡｇのみならず、抗 体のスクリーニングに用いたものとは異なる突然変異型ＨＢｓＡｇを含めた各種 突然変異体に由来するＨＢｓＡｇをも検出することを示す。これらの結果から、 ３方向交差反応性抗体が野生型タンパク質及び突然変異型タンパク質に共通のエ ピトープに結合することも確認され、ＨＢｓＡｇアッセイにおける抗体の有用性 が証明された。上記した抗体を用いるとエスケープ突然変異体の存在を検出する ことが可能である。 ３：モノクローナル抗体のイソタイビング モノクローナル抗体のイソタイピングをＳｅｔｏｔｅｃのキットを用いて実施 した。各イソタイピング試薬は、免疫グルブリンの単一クラス−サブクラスに対 して特異的な精製ラットモ ノクローナル抗体を羊赤血球細胞に結合させたものを含んだ。結合させたラット 抗体は、マウス免疫グロブリンの重鎖部分を認識した。試験系の原理は、高特異 性抗体が該抗体に対する特定のイソタイプを認識し結合するときにポジティブな 凝集結果が生ずる赤血球凝集に基づいていた。結合は、微量滴定プレートウェル の底に格子を形成した。試薬細胞が認識しない抗体のクラスを含む上清に該試薬 細胞を入れたときにはネガティブな結果が生じた。試薬細胞はウェルの底に落ち 、小さな“ボタン”が形成された。 モノクローナル抗体のイソタイプを表８に示す。 表８：モノクローナル抗体の免疫グロブリンクラス * ３方向交差反応性を示す。 ** 最初３方向交差反応性であることが判つたが、後に不安定でありＭＡＭ 特異性クローンに変化することが判った（以下参照）。 ４：腹水からの抗−ＨＢｓのＳＰＥ分析及び精製 モノクローナルタンパク質は、血清タンパク質電気泳動によりすべてのクロー ンの腹水中に認められた。モノクローナルタンパン質バンドの電気泳動移動度は モノクローナル腹水毎に僅かに異なったが、同一クローンから得られた腹水の各 種バッチでは同一であった。クローン間の泳動距離の違いはモノクローナルタン パク質のイオン電荷が違うためであった。ＳＰＥモノクローナルバンドで見られ る染色強度は、存在するモノクローナルタンパク質の量の指標を与えた。異なる クローンから得た腹水では染色強度に違いが生じた。しかしながら、ＳＰＥバン ドは、ＭＡＭ特異性モノクローナル抗体のＭ４Ｂ１２では見られなかった。回収 した腹水の抗−ＨＢｓ活性をＲＩＡで試験したところ、ネガティブな結果が生じ た。他のすべての腹水については予測されたようにポジティブな結果が生じた。 上記したように、ＭＡＭ特異性モノクローナル抗体は不安定であり、ポジティブ 分泌型ハイブリドーマからネガティブハイブリドーマに変化することが明らかと なった。（その後Ｍ４Ｂ１２親ハイブリドーマを再度クローン化し、再試験する 。） 腹水からの免疫グロブリンは上記したセクションIII，３及び III，４に記載されているように作製した。免疫グロブリンＧはＤＥ５２を用い るイオン交換クロマトグラフィーにより作製し、ＩｇＡはＳｅｐｈａｃｒｙｌカ ラムを用いて分離した。各モノクローナル腹水につきイオン強度を１０ｍＭから ３０ｍＭに上昇させ、最後に６０ｍＭ ＰＢとすると３個の別々のタンパク質ピ ークが得られた。ピークの大きさはモノクローナル抗体により異なった。各ピー クの溶離液を集めた。次いで、緩衝液濃度を変えて抗−ＨＢｓ ＩｇＧ／ＩｇＡ を¹²⁵Ｉ ＭＡＭＨＢｓＡｇ、¹²⁵Ｉ ＮＰ ＨＢｓＡｇ及び¹²⁵Ｉ ＷＴ ＨＢ ｓＡｇを用いる逆捕獲アッセイで測定した。このアッセイにより、異なる緩衝液 分画を直接比較することができた。このアッセイから、最高の抗−ＨＢｓ活性を 示す分画を選択することができた。選択した分画のタンパク質濃度を測定した（ 表９）。各モノクローナル抗体から得たＩｇＧ／ＩｇＡの量は集めた腹水のバッ チ毎に異なった。 表９：各モノクローナル腹水１ｍｌから集めたＩｇＧ／ＩｇＡの量 * ３方向交差反応性を示す。 ** 最初３方向交差反応性であることが判ったが、後に不安定でありＭＡＭ特異 性クローンに変化することが判った（以下参照）。 ＳＰＥにおけるモノクローナルバンドの染色強度は、表７に示すタンパク質濃 度と強いポジティブな相関関係を示した。例えば、Ｐ４Ｃ１１はＳＰＥにおいて 非常に暗く染色されたバンドを示し且つ高いタンパク質濃度を有していたが、Ｐ ２Ｈ９はかすかに染色されたバンドを示し且つ低いタンパク質濃度を有していた 。 総括 ＨＢｓＡｇ検出アッセイの結果から、突然変異の結果として、 血清中のＨＢｓＡｇは幾つかのモノクローナル抗体を用いるシステムにより検出 され得ないことが確認された。前記突然変異により、捕獲抗体または結合検出抗 体の結合が生じなくなり得る。これらの結果から、ＨＢＶ感染が疑われる症例に おいてＨＢｓＡｇに関する初期スクリーニング試験かネガティブであるとき第２ マーカーを試験することが重要であることが判る。ＮＰ及びＭＡＭは、モノクロ ーナル抗体を用いるアッセイでＨＢｓＡｇについて試験したときには抗−ＨＢｃ 単独プロフィールを示した。サンプル中のＨＢｓＡｇの存在は、ポリクローナル 抗体を用いるシステムにより試験したとき明らかになった。 アミノ酸１４５での突然変異（グリシンからリシン）が患者ＭＡＭで検出され た。この突然変異はワクチンエスケープ突然変異体で既に記載されている突然変 異（グリシンからアルギニン）とは異なっていたが、アミノ酸置換は抗原構造に 対する予期される効果が類似であるようなものであった。 患者ＮＰの場合、コドン１４５は突然変異していなかったが、患者ＭＡＭの場 合のように複数の突然変異が見られた。いずれの突然変異が検出可能性の喪失に 関与しているかは不明であった。興味深いことに、患者ＭＡＭではＨＢｓＡｇ検 出アッセイ におけるＨＢｓＡｇ特異性の変化によってヌクレオチド配列は変化しなかった。 これは、存在する野生型ウイルスの発生率が直接配列分析による検出限界である 総ウイルス負荷の１５〜２５％未満であるためであった。 突然変異型Ｂ型肝炎抗原に対するモノクローナル抗体の作製は成功した。ＮＰ および第１ＭＡＭ融合で産生されたクローン数及び生じた抗体の特異性の相対分 布は良好であった。抗−ＨＢｓ分泌型ハイブリドーマを同定するために、感受性 であり迅速なスクリーニングアッセイが要求された。ＩｇＧ逆捕獲ラジオイムノ アッセイが選択された。このアッセイは簡単にセットされるが、非常に低いバッ クグラウンド及び大きな動的レンジを有し得る。標識された野生型及び突然変異 型ＨＢｓＡｇのポジティブクローンによる相対結合は、明白に高く且つ一定であ って、信頼できる結果か得られた。 ハイブリドーマのスクリーニングは、最初、ＭＡＭ融合に由来するＭＡＭクロ ーンを¹²⁵Ｉ ＭＡＭ ＨＢｓＡｇを用いて、ＮＰクローンを¹²⁵Ｉ ＮＰ ＨＢ ｓＡｇを用いて実施した。このアッセイの結果は、これらのクローンはＭＡＭ ＨＢｓＡｇまたはＮＰ ＨＢｓＡｇを認識し、これに結合する抗− ＨＢｓを特異的に産生することを示した。次いで、２つの融合の結果として産生 されたクローンすべてを¹²⁵Ｉ ＷＴ ＨＢｓＡｇで試験した。ＷＴ ＨＢｓＡ ｇのみにポジティブな反応を示す単一クローンはなかった。ＭＡＭ／ＷＴ交差反 応性もＮＰ／ＷＴ交差反応性も見られなかった。 従って、ＭＡＭ ＨＢｓＡｇまたはＮＰ ＨＢｓＡｇを認識するクローンを同 定することが可能であった。ＮＰ及びＷＴＨＢｓＡｇにも結合するクローンも同 定された。ハイブリドーマ間の交差反応性を試験するために、ＭＡＭ融合により 産生されたクローンを¹²⁵Ｉ ＮＰ ＨＢｓＡｇを用いて、或いはその逆で試験 した。スクリーニングアッセイの結果、結果のセクションにリストしたようにク ローンを分類することができた。 上記アッセイに含めたポジティブコントロールは２つの公知のＷＴ ＨＢｓＡ ｇモノクローナル抗体、すなわちＨ３Ｆ５及びＤ２Ｈ５であり、ネガティブコン トロールは抗−ＨＢＶｇａｇモノクローナル抗体であるＰＢＳ及び３Ｄ３Ｆ２で あった。¹²⁵Ｉ ＷＴ ＨＢｓＡｇ ＲＩＡで使用したときに予測されたように 、Ｈ３Ｆ５及びＤ２Ｈ５は強いポジティブ結果を示した。しかしながら、¹²⁵Ｉ ＭＡＭ ＨＢｓＡｇに対して 試験したときＨ３Ｆ５のみがポジティブリーディングを示し¹²⁵Ｉ ＮＰ ＨＢ ｓＡｇを用いて試験したときにはネガティブであった。Ｄ２Ｈ５は¹²⁵Ｉ ＮＰ ＨＢｓＡｇを用いたときポジティブシグナルを生じたが、¹²⁵Ｉ ＭＡＭ Ｈ ＢｓＡｇに対して試験したときには非常に弱かった。ＭＡＭ ＨＢｓＡｇにおけ る突然変異によりＤ２Ｈ５に対するエピトープが排除され、ＮＰ ＨＢｓＡｇに おける突然変異によりＨ３Ｆ５エピトープが排除された。 ＳＰ及びＳＺ突然変異型ＨＢｓＡｇを用いた試験で得た結果から、３方向交差 反応性抗体はスクリーニング過程で使用した突然変異型ＨＢｓＡｇに加えて他の 突然変異形態のＨＢｓＡｇを検出できることが判明した。このことから、抗体が 野生型タンパン質及び突然変異体の間で保存されるエピトープに結合することが 確認され、よってＨＢｓＡｇアッセイにおいて前記抗体を含める重要性が確認さ れた。 ＭＡＭ融合に由来するハイブリドーマの幾つかは不安定であることが判明した が、３方向交差反応性がＭＡＭ融合及びＮＰ融合から容易に得られた。ＭＡＭ及 びＮＰ形態以外の突然変異体型のＨＢｓＡｇは、上記したプロトコルに従ってモ ノクロー ナル抗体を産生及び／またはスクリーニングするために使用され得る。 注：図１ｂは図１ａをタイプ清書したものである。図１ａと図１ｂとの間に何ら かの不一致がある場合には図１ａを真正図面と見做す。試薬 完全培地 Ｈｅｐｅｓ緩衝液５ｍＭ、Ｌ−グルタミン２ｍＭ、２−メルカプトエタノール ０．０５Ｍ、ウシ胎仔血清２０％ｖ／ｖ、フンジゾン２５μｇ／ｍｌ、ペニシリ ン１０２単位／ｍｌ及びストレプトマイシン１００μｇ／ｍｌを補充したＲＰＭ Ｉ。不完全培地 Ｈｅｐｅｓ緩衝液５ｍＭ及びＬ−グルタミン２ｎＭを補充したＲＰＭＡ。ＨＡＴ培地 ヒポキサンチン５×１０^-5Ｍ、アミノプテリン２×１０^-3Ｍ及びチミジン８× １０^-4Ｍを加えた完全培地。ＨＴ培地 ヒポキサンチン５×１０^-5Ｍ及びチミジン８×１０^-4Ｍを 加えた完全培地。０．０２Ｍ トリス緩衝液、ｐＨ７．６（Ｔｒｉｓ緩衝液） アジ化ナトリウム１．００ｇ、トリス（ヒドロキシメチル）メチルアミン２． ４２ｇ及び蒸留水９００ｍｌ。 濃ＨＣｌでｐＨを７．６に調節し、前記緩衝液で１Ｌとする。０．０２Ｍ Ｔｒｉｓ ＢＳＡ緩衝液 ０．０２Ｍ トリス緩衝液（ｐＨ７．６）に０．５％ ＢＳＡを添加する。０．２Ｍリン酸緩衝液（ＰＢ） 溶液Ａ＝０．２Ｍ ＫＨ₂ＰＯ₄ 溶液Ｂ＝０．２Ｍ Ｎａ₂ＨＰＯ₄ 溶液Ｂを２００ｍｌ取り、溶液ＡでｐＨ８．０に調節する。１０、２０、３０及び６０ｍＭ ＰＢ １０ｍＭ ＰＢの場合、０．２Ｍ ＰＢを蒸留水で１：２０に希釈する。 ３０ｍＭ ＰＢの場合、０．２Ｍ ＰＢを蒸留水で１：６．６に希釈する。 ６０ｍＭ ＰＢの場合、０．２Ｍ ＰＢを蒸留水で１：３．３に希釈する。

【手続補正書】 【提出日】平成１０年１１月５日（１９９８．１１．５） 【補正内容】 請求の範囲 １． 野生型ＨＢｓＡｇ及び少なくとも２つの突然変異型ＨＢｓＡｇに特異的に 結合し得るモノクローナル抗体、またはその断片もしくは誘導体。 ２． 野生型ＨＢｓＡｇ及び少なくとも２つの突然変異型ＨＢｓＡｇに特異的に 結合し得るモノクローナル抗体であって、それぞれの突然変異型ＨＢｓＡｇは１ ３３、１３４、１４１、１４２、１４３、１４４及び１４５の１個もしくはそれ 以上の位置で野生型ＨＢｓＡｇに比して少なくとも１個のアミノ酸置換を有する 請求の範囲第１項に記載のモノクローナル抗体、またはその断片もしくは誘導体 。 ３． 野生型ＨＢｓＡｇ及び以下の突然変異型ＨＢｓＡｇの少なくとも２つ、す なわち 突然変異型ＨＢｓＡｇ Ｉ（“ＮＰ”ＨＢｓＡｇ）：アミノ酸１３３のｍｅｔが ｉｌｅに、アミノ酸１３４のｐｈｅがｈｉｓに、且つアミノ酸１４４のａｓｐが ｖａｌに置換されているもの、 突然変異型ＨＢｓＡｇ II（“ＭＡＭ”ＨＢｓＡｇ）：アミノ酸１３３のｍｅｔ がｉｌｅに、アミノ酸１３４のｐｈｅがａｓｎに、アミノ酸１４２のｐｒｏがｓ ｅｒに、アミノ酸１４３のｓｅｒがｌｅｕに且つアミノ酸１４５のｇｌｙがｌｙ ｓに置換されているもの、 突然変異型ＨＢｓＡｇ III（“ＳＺ”ＨＢｓＡｇ）：アミノ酸１４５のｇｌｙ がａｒｇに置換されているもの、及び 突然変異型ＨＢｓＡｇ IV（“ＳＰ”ＨＢｓＡｇ）：アミノ酸１４３のｓｅｒが ｍｅｔに置換されているもの、 に特異的に結合し得る請求の範囲第１項に記載のモノクローナル抗体、またはそ の断片もしくは誘導体。 ４． ＥＣＡＣＣに受託番号ＥＣＡＣＣ ９７０４２３３１で寄託されている、 Ｐ２Ｄ３と称されるハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体Ｐ２Ｄ ３、またはその断片もしくは誘導体。 ５． ＥＣＡＣＣに受託番号ＥＣＡＣＣ ９７０４２３３０で寄託されている、 Ｍ３Ａ１０と称されるハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体Ｍ３ Ａ１０、またはその断片もしくは誘導体。 ６． ＥＣＡＣＣに受託番号ＥＣＡＣＣ ９７０４２５１９で寄託されている、 Ｍ４Ｆ５と称されるハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体Ｍ４Ｆ ５、またはその断片もしくは誘導体。 ７． ＨＢｓＡｇを検出するためのイムノアッセイであつて、被検サンプルを請 求の範囲第１項ないし第６項のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体、また はその断片もしくは誘導体と接触させ、生じた抗原−抗体複合体を検出すること からなる前記イムノアッセイ。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ０７Ｋ 16/08 Ｃ０７Ｋ 16/08 16/42 16/42 Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｐ 21/08 21/02 Ｃ // Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，Ｓ Ｄ，ＳＺ，ＵＧ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ， ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，Ｇ Ｂ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ， ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，Ｎ Ｏ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ， ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ (72)発明者 イジヤズ，サムリーン イギリス国、ロンドン・ダブリユ・１・ピ ー・６・デイー・ビー、クリーブランド・ ストリート・46、デパートメント・オブ・ バイアロロジー、ウインダイアー・ビルデ イング、ユー・シー・エル・メデイカル・ スクール (72)発明者 フアーンズ，ルース・ブリジエツト イギリス国、ロンドン・ダブリユ・１・ピ ー・６・デイー・ビー、クリーブランド・ ストリート・46、デパートメント・オブ・ バイアロロジー、ウインダイアー・ビルデ イング、ユー・シー・エル・メデイカル・ スクール

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． 野生型ＨＢｓＡｇ及び少なくとも２つの突然変異型ＨＢｓＡｇに対して特 異的に結合し得るモノクローナル抗体。 ２． 突然変異型ＨＢｓＡｇが野生型ＨＢｓＡｇに比して少なくとも１個のアミ ノ酸置換を有する請求の範囲第１項に記載のモノクローナル抗体。 ３． 突然変異型ＨＢｓＡｇがＨＢＶエスケープ突然変異体中に存在するＨＢｓ Ａｇ配列を有する請求の範囲第１項または第２項に記載のモノクローナル抗体。 ４． 突然変異型ＨＢｓＡｇが“ａ”抗原決定基または“ａ”抗原決定基の領域 に少なくとも１個のアミノ酸置換を有する請求の範囲第１項〜第３項のいずれか １項に記載のモノクローナル抗体。 ５． アミノ酸置換が点突然変異に起因する請求の範囲第２項〜第４項のいずれ か１項に記載のモノクローナル抗体。 ６． 突然変異型ＨＢｓＡｇがＨＢｓＡｇのアミノ酸１３３〜１４５をコードす る配列内にアミノ酸置換を有する請求の範囲第１項〜第５項のいずれか１項に記 載のモノクローナル抗体。 ７． 突然変異型ＨＢｓＡｇが１３３、１３４、１４１、１４２、１４３、１４ ４及び１４５の１個もしくはそれ以上の位置で野生型ＨＢｓＡｇに比して少なく とも１個のアミノ酸置換を有する請求の範囲第１項〜第６項のいずれか１項に記 載のモノクローナル抗体。 ８． １４３、１４４及び１４５の１個もしくはそれ以上の位置が置換されてい る請求の範囲第７項に記載のモノクローナル抗体。 ９． 更に、置換が“ａ”抗原決定基または他の領域における１個もしくはそれ 以上の他の置換である請求の範囲第７項に記載のモノクローナル抗体。 １０． 野生型ＨＢｓＡｇ及び以下の突然変異型ＨＢｓＡｇ、すなわち 突然変異型ＨＢｓＡｇ Ｉ（“ＮＰ”ＨＢｓＡｇ）：アミノ酸１３３のｍｅｔが ｉｌｅに、アミノ酸１３４のｐｈｅがＳｈｉｓに、且つアミノ酸１４４のａｓｐ がｖａｌに置換されているもの、 突然変異型ＨＢｓＡｇ II（“ＭＡＭ”ＨＢｓＡｇ）：アミノ酸１３３のｍｅｔ がｉｌｅに、アミノ酸１３４のｐｈｅがａｓｎ に、アミノ酸１４２のｐｒｏがｓｅｒに、アミノ酸１４３のｓｅｒがｌｅｕに且 つアミノ酸１４５のｇｌｙがｌｙｓに置換されているもの、 突然変異型ＨＢｓＡｇ III（“ＳＺ”ＨＢｓＡｇ）：アミノ酸１４５のｇｌｙ がａｒｇに置換されているもの、及び 突然変異型ＨＢｓＡｇ IV（“ＳＰ”ＨＢｓＡｇ）：アミノ酸１４３のｓｅｒが ｍｅｔに置換されているもの、 の少なくとも１つに特異的に結合し得る請求の範囲第１項に記載のモノクローナ ル抗体。 １１． 野生型ＨＢｓＡｇ、及びアミノ酸１４３、１４４及び１４５をコードす る１つ以上のコドンに点突然変異を有する配列によりコードされる“ａ”抗原決 定基を有する少なくとも１つの突然変異型ＨＢｓＡｇに対して特異的に結合し得 るモノクローナル抗体。 １２． ＩｇＧ、ＩｇＭまたはＩｇＡ免疫グロブリンである請求の範囲第１項〜 第１１項のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体。 １３． ＥＣＡＣＣに受託番号ＥＣＡＣＣ ９７０４２３３１で寄託されている 、Ｐ２Ｄ３と称されるハイブリドーマにより 産生されるモノクローナル抗体Ｐ２Ｄ３。 １４． ＥＣＡＣＣに受託番号ＥＣＡＣＣ ９７０４２３３０で寄託されている 、Ｍ３Ａ１０と称されるハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体Ｍ ３Ａ１０。 １５． ＥＣＡＣＣに受託番号ＥＣＡＣＣ ９７０４２５１９で寄託されている 、Ｍ４Ｆ５と称されるハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体Ｍ４ Ｆ５。 １６． ヒト化形態である請求の範囲第１項〜第１５項のいずれか１項に記載の モノクローナル抗体。 １７． 請求の範囲第１項〜第１６項のいずれか１項に記載のモノクローナル抗 体の断片または誘導体。 １８． 請求の範囲第１項に記載のモノクローナル抗体を産生し得るハイブリド ーマの作製方法であって、動物に、任意に適当な抗原断片または誘導体の形態を 有する野生型ＨＢｓＡｇまたは突然変異型ＨＢｓＡｇ抗原を投与し、抗体産生細 胞を不死化してハイブリドーマを形成し、任意に適当な抗原断片または誘導体の 形態を有する野生型ＨＢｓＡｇ及び２つ以上の突然変異型ＨＢｓＡｇについてハ イブリドーマ培養物をスクリーニングし、野生型ＨＢｓＡｇ及び２つ以上の突然 変異型ＨＢｓＡｇ に結合する抗体を産生するハイブリドーマを選択するからなる前記方法。 １９． 突然変異型ＨＢｓＡｇが請求の範囲第２項〜第１１項のいずれか１項に 定義されている請求の範囲第１８項に記載の方法。 ２０． 請求の範囲第１項〜第１１項のいずれか１項に記載のモノクローナル抗 体を産生し得るハイブリドーマ。 ２１． ＥＣＡＣＣに受託番号ＥＣＡＣＣ ９７０４２３３１で寄託されている 、Ｐ２Ｄ３と称されるハイブリドーマ。 ２２． ＥＣＡＣＣに受託番号ＥＣＡＣＣ ９７０４２３３０で寄託されている 、Ｍ３Ａ１０と称されるハイブリドーマ。 ２３． ＥＣＡＣＣに受託番号ＥＣＡＣＣ ９７０４２５１９で寄託されている 、Ｍ４Ｆ５と称されるハイブリドーマ。 ２４． 請求の範囲第１項に記載のモノクローナル抗体を作製する方法であって 、請求の範囲第２０項〜第２３項のいずれか１項に記載のハイブリドーマまたは 請求の範囲第１８項または第１９項に記載の方法により得られ得るハイブリドー マをインビトロまたはインビボで培養し、培地からモノクローナル抗体を獲得す ることからなる前記方法。 ２５． 請求の範囲第２４項に記載の方法により獲得し得るモノクローナル抗体 。 ２６． ＨＢｓＡｇを検出するためのイムノアッセイであって、被検サンプルを 請求の範囲第１項〜第１６項のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体、請求 の範囲第１７項に記載の前記モノクローナル抗体の断片もしくは誘導体、または それらの２つ以上の組合せと接触させ、生じた抗原−抗体複合体を検出すること からなる前記イムノアッセイ。 ２７． 前記モノクローナル抗体、その断片、誘導体または組合せを、ポリクロ ーナル抗−ＨＢｓ抗体及び他のモノクローナル抗−ＨＢｓ抗体から選択される１ つ以上の他の抗体と組合せて使用する請求の範囲第２６項に記載のイムノアッセ イ。 ２８． 均一系または不均一系フォーマットである請求の範囲第２６項または第 ２７項に記載のイムノアッセイ。 ２９． 捕獲もしくは競合フォーマットである請求の範囲第２８項に記載のイム ノアッセイ。 ３０． Ｂ型肝炎コアタンパク質（ＨＢｃ）に対する抗体を検出するためのイム ノアッセイをＨＢｓＡｇに対するアッセイと同時に実施する請求の範囲第２６項 〜第２９項のいずれか１項 に記載のイムノアッセイ。 ３１． 請求の範囲第１項〜第１６項のいずれか１項または請求の範囲第２５項 に記載のモノクローナル抗体、請求の範囲第１７項に記載の前記モノクローナル 抗体の断片もしくは誘導体またはこれらの２つ以上の組合せと、ＨＢｓＡｇに対 するイムノアッセイを実施するために必要な他の試薬と、任意に抗−ＨＢｃ抗体 を検出するための試薬とを含むイムノアッセイキット。 ３２． ポリクローナル抗−ＨＢｓ抗体及び他のモノクローナル抗−ＨＢｓ抗体 から選択される１つ以上の他の抗−ＨＢｓ抗体をも含む請求の範囲第３１項に記 載のイムノアッセイキット。 ３３． 他の試薬が洗浄溶液、希釈剤、標準溶液、コントロール試薬及び標識抗 −ＨＢｓ抗体から選択される請求の範囲第３１項または第３２項に記載のイムノ アッセイキット。 ３４． 請求の範囲第１項〜第１６項のいずれか１項または請求の範囲第２５項 に記載のモノクローナル抗体、請求の範囲第１７項に記載の前記モノクローナル 抗体の断片もしくは誘導体またはこれらの２つ以上の組合せが固定化されている イムノアッセイに使用するのに適した固相。 ３５． ポリクローナル抗−ＨＢｓ抗体及び他のモノクローナ ル抗−ＨＢｓ抗体から選択される１つ以上の更なる抗−ＨＢｓ抗体が前記固相に 固定化されている請求の範囲第３４項に記載の固相。 ３６． 抗−ＨＢｓ抗体を捕捉し得る物質も固定化されている請求の範囲第３４ 項または第３５項に記載の固相。 ３７． 請求の範囲第１項〜第１６項のいずれか１項または請求の範囲第２５項 に記載のモノクローナル抗体、請求の範囲第１７項に記載の前記モノクローナル 抗体の断片もしくは誘導体、またはこれらの２つ以上の組合せを含む、受動免疫 のために治療または予防目的で使用するのに適した抗血清。 ３８． 請求の範囲第１項〜第１６項のいずれか１項または請求の範囲第２５項 に記載のモノクローナル抗体、請求の範囲第１７項に記載の前記モノクローナル 抗体の断片もしくは誘導体またはこれらの２つ以上の組合せを医薬的に適当な担 体と混合して含む、ＨＢＶに対する受動免疫のために治療または予防目的で使用 するのに適した組成物。 ３９． ポリクローナル抗−ＨＢｓ抗体及び他のモノクローナル抗−ＨＢｓ抗体 から選択される１つ以上の他の抗体をも含む請求の範囲第３７項に記載の抗血清 または請求の範囲第３８項 に記載の組成物。 ４０． 治療または予防有効量の、請求の範囲第１項〜第１６項のいずれか１項 または請求の範囲第２５項に記載のモノクローナル抗体、請求の範囲第１７項に 記載の前記モノクローナル抗体の断片もしくは誘導体、またはこれらの２つ以上 の組合せを被検者に投与することからなる治療または予防目的のＨＢＶ感染に対 する受動免疫化方法。 ４１． モノクローナル及びポリクローナル抗−ＨＢｓ抗体から選択される１つ 以上の他の抗体をも投与することからなる請求の範囲第４０項に記載の方法。 ４２． 請求の範囲第１項〜第１６項のいずれか１項または請求の範囲第２５項 に記載のモノクローナル抗体、請求の範囲第１７項に記載の前記モノクローナル 抗体の断片もしくは誘導体に対する抗−イディオタイプ抗体。 ４３． 請求の範囲第１０項に記載の単離された突然変異型ＨＢｓＡｇ Ｉ、突 然変異型ＨＢｓＡｇ II、突然変異型ＨＢｓＡｇ IIIまたは突然変異型ＨＢｓ Ａｇ IV。 ４４． 天然ソースから得られ得る請求の範囲第４３項に記載の突然変異型ＨＢ ｓＡｇ。 ４５． 組換え技術により得られ得る請求の範囲第４３項に記載の突然変異型Ｈ ＢｓＡｇ。 ４６． グリコシル化されている請求の範囲第４５項に記載の突然変異型ＨＢｓ Ａｇ。 ４７． 請求の範囲第４３項〜第４６項のいずれか１項に記載のモノクローナル 抗体、または請求の範囲第１７項に記載の前記モノクローナル抗体の断片もしく は誘導体に特異的に結合し得る、請求の範囲第４３項〜第４６項にいずれか１項 に記載の突然変異型ＨＢｓＡｇの断片もしくは誘導体。 ４８． 免疫原性である請求の範囲第４７項に記載の断片もしくは誘導体。 ４９． 請求の範囲第４３項〜第４６項のいずれか１項に記載の突然変異型ＨＢ ｓＡｇ、請求の範囲第４８項に記載の前記突然変異型ＨＢｓＡｇの断片もしくは 誘導体、またこれらの２つ以上の組合せ及び医薬的に適当な担体を含むワクチン 組成物。 ５０． 更に１つ以上の他の免疫原性ペプチドまたはポリペプチドをも含む請求 の範囲第４９項に記載のワクチン組成物。 ５１． 免疫原性ペプチドまたはポリペプチドが免疫原性ＨＢｓＡｇペプチドま たはポリペプチドである請求の範囲第５０項 に記載のワクチン組成物。 ５２．被検者に対してＨＢＶに対する予防接種をする方法であって、被検者に対 して、治療または予防有効量の請求の範囲第４３項〜第４６項のいずれかに１項 記載の突然変異型ＨＢｓＡｇ、請求の範囲第４８項に記載の前記突然変異型ＨＢ ｓＡｇの断片もしくは誘導体、またはこれらの２つ以上の組合せを任意に１つ以 上の他の免疫原性ＨＢｓＡｇペプチドまたはポリペプチドと一緒に投与すること からなる前記方法。 ５３． 請求の範囲第１０項に記載の突然変異型ＨＢｓＡｇＩ、突然変異型ＨＢ ｓＡｇ II、突然変異型ＨＢｓＡｇ IIIまたは突然変異型ＨＢｓＡｇ IVをコ ードする単離された核酸。 ５４． 請求の範囲第１０項に記載された突然変異型ＨＢｓＡｇの断片もしくは 誘導体をコードする核酸であって、前記断片もしくは誘導体が請求の範囲第１項 〜第１６項のいずれか１項または請求の範囲第２５項に記載のモノクローナル抗 体に対して、または請求の範囲第１７項に記載の前記モノクローナル抗体の断片 もしくは誘導体に対して特異的に結合し得る前記核酸。 ５５． 突然変異型ＨＢｓＡｇの断片もしくは誘導体が免疫原性である請求の範 囲第５４項に記載の核酸。 ５６． 請求の範囲第５３項〜第５５項のいずれか１項に記載の核酸を含む組成 物。 ５７． 哺乳動物に投与したときにコードされているアミノ酸を発現させるのに 適した形態で、請求の範囲第５３項または第５５項に記載の核酸を含むワクチン 組成物。 ５８． 被検者に対して、請求の範囲第５３項または第５７項に記載の核酸、ま たは請求の範囲第５７項に記載のワクチン組成物を治療または予防有効量投与す ることからなるＨＢＶに対する予防接種方法。