CN101809033A - 对丙型肝炎病毒(hcv)感染具有抑制活性的抗体和其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明的目的是提供抑制丙型肝炎病毒(HCV)感染的抗体。为此目的，本发明提供了抗体，所述抗体将获自丙型肝炎病毒(HCV)基因组的丙型肝炎病毒(HCV)颗粒识别为抗原并且对丙型肝炎病毒(HCV)感染具有抑制活性，所述基因组包含下列彼此连接的(i)和(ii)：(i)(a)丙型肝炎病毒(HCV)的JFH-1株的5’-非翻译区、核心蛋白编码序列、E1蛋白编码序列、E2蛋白编码序列和p7蛋白编码序列或(b)丙型肝炎病毒(HCV)的J6CF株的5’-非翻译区、核心蛋白编码序列、E1蛋白编码序列、E2蛋白编码序列和p7蛋白编码序列；和(ii)JFH-1株的NS2蛋白编码序列、NS3蛋白编码序列、NS4A蛋白编码序列、NS4B蛋白编码序列、NS5A蛋白编码序列、NS5B蛋白编码序列和3’-非翻译区。

Description

对丙型肝炎病毒(HCV)感染具有抑制活性的抗体和其用途
技术领域
本发明涉及对丙型肝炎病毒(HCV)感染具有抑制活性的抗体和其用途。
背景领域
丙型肝炎病毒(HCV)被发现和鉴定为非甲型和非乙型肝炎的主要致病病毒(非专利文献1)。此外，近年来已建立了用于检测HCV的高灵敏性方法，并且由于输血引起的新HCV患者的人数急剧减少。然而，日本的病毒携带者人数据推测超过2,000,000人，世界范围的数字超过170,000,000人，包括还未发生肝炎症状的所谓病毒携带者。这主要是因为由于HCV感染引起的肝炎的慢性率高达70％至80％，目前除了干扰素外还不存在有效的抗病毒剂。此外，丙型肝炎是具有不良预后的严重感染，因为大约一半的慢性丙型肝炎患者将无例外地经历从丙型肝炎至肝硬化和肝癌的症状的恶化。因此，目的在于预防肝炎携带者发生疾病或消除病毒的抗病毒剂或疫苗的开发还在等待中。
当具有包膜的病毒例如HCV感染细胞时，病毒首先需要结合细胞表面上的特定蛋白质(即，病毒受体)。之后，病毒膜与细胞膜融合，然后病毒基因被注入细胞。HCV的治疗和预防需要可抑制细胞感染的抗体的开发。特别地，可阻止HCV结合细胞表面上的病毒受体和侵入细胞的抗体是非常重要的。
HCV包膜蛋白被认为在HCV与细胞表面的结合中起着至关重要的作用。因此，进行了关于患者的血清中与包膜蛋白反应的抗体的检测的研究。展示与C100抗体(NS4-NS5抗体)或核心抗体阳性反应和展示与包膜蛋白抗体阳性反应的患者的百分比发现为大约10％。因为31位展示与包膜蛋白抗体阳性反应的患者中只有3位被天然治愈，因此认为这3位患者中产生了中和抗体(非专利文献2)。经历中和抗体的产生的患者的百分比低至所有患者的1％。
然而，在急性乙型肝炎的情况下，抗乙型肝炎病毒的包膜蛋白的抗体的产生是100％，并且病毒被破坏。在HIV的情况下，以很高的频率检测到抗HIV包膜蛋白的抗体。只在10％的患者中检测到抗HCV包膜蛋白的抗体的事实据推断是由于存在可使抗HCV包膜蛋白的抗体的产生复杂化的机制而引起的。(非专利文献3).
同时，已显示，哺乳动物细胞中表达的HCV E2蛋白可特异性结合存在于人细胞表面上的CD81(非专利文献4)。通过利用这样的实验系统，已尝试展示中和E2蛋白与来自丙型肝炎患者的CD81的结合的活性(即，结合的中和，称为“NOB”)的抗体的开发。
代表性实例是展示NOB活性的抗体，其可通过从基因型1a的慢性丙型肝炎患者的骨髓淋巴细胞制备抗体基因文库和通过噬菌体展示获得目的抗体来获得(专利文献1)。另一个研究小组从基因型1b的丙型肝炎患者的外周B细胞制备了杂交瘤并且获得展示NOB活性的抗体(非专利文献5，专利文献2)。
然而，根据从HCV患者获得单克隆抗体的上述方法，患者的数量是有限的，并且来源限制于其中存在抑制HCV感染的抗体的患者。因此，难以增加抑制感染的抗体的库和发现用作抗HCV试剂的抗体。
此外，已尝试了其中对小鼠施用重组包膜蛋白以诱导抗体的方法(专利文献3)和其中将淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合以制备产生抗体的杂交瘤从而获得抗包膜蛋白的抗体的方法(专利文献4，非专利文献6)。然而，抑制HCV感染的抗体仍然未被证实。
作为至于仍然没有通过用包膜蛋白免疫动物来制备中和HCV感染的抗体的原因，有人认为是用于免疫的重组包膜蛋白具有与病毒本身固有的包膜蛋白的结构不同的结构。已有报导重组包膜蛋白可能经历聚集，从而不能形成天然构象(非专利文献7)。
也已证明展示NOB活性的抗体将不总是抑制感染(非专利文献8)。因此，从通过使用抗体来治疗和预防HCV的观点来看，用于有效诱导抗包膜蛋白的能够抑制病毒感染的抗体和抑制病毒感染的抗体的方法的开发是必需的。
在上述情况下，近年来已开发了用于在细胞培养系统中制备感染性HCV颗粒的方法(专利文献5，专利文献6和专利文献7)。与其中包膜蛋白通过基因重组技术表达并且所得的产物用作抗原的情况相比，HCV颗粒展示传染性，从而认为HCV抗原的构象得到维持。因此，此类HCV颗粒可适合作为产生用于抑制HCV感染的抗体的抗原。
[专利文献1]日本专利公开案(kohyo)No.2005-531286A
[专利文献2]日本专利公开案(kohyo)No.2006-504645A
[专利文献3]日本专利公开案(kohyo)No.2004-500366A
[专利文献4]日本专利公开案(kohyo)No.H-06-505389A
[专利文献5]WO 05080575A1
[专利文献6]WO 06022422A1
[专利文献7]WO 06096459A2
[非专利文献1]Choo等，Science，1989，第244卷，pp.359-362
[非专利文献2]Matsuura等，J.Virol.，1992，第66卷，pp.1425-1431
[非专利文献3]Saito等，Jikken Igaku，1991，第9卷，pp.2075-2080
[非专利文献4]Pileri等，Science，1998，第282卷，pp.938-941
[非专利文献5]Hadlock等，J.Virol.，2000，第74卷，pp.10407-10416
[非专利文献6]Suzuki等，Saishin Igaku，2003，第58卷，pp.2017-2022
[非专利文献7]Op de Beeck等，J.Gen.Virol.，2001，第82卷，pp.2589-2595
[非专利文献8]Burioni等，J.Virol.，2002，第76卷，pp.11775-11779
发明的公开内容
发明解决的问题
本发明的目的是提供抑制丙型肝炎病毒(HCV)感染的抗体。
解决问题的方法
本发明的发明人对小鼠施用JFH-1株的丙型肝炎病毒(HCV)颗粒或J6CF株与JFH-1株的嵌合病毒作为抗原，然后测量已对其施用了HCV的小鼠的血清中对HCV感染的抑制活性。结果，他们发现此类HCV颗粒具有对HCV感染的抑制活性。
此外，从已对其施用了HCV颗粒的小鼠制备脾细胞，将脾细胞融合至小鼠骨髓瘤细胞系来制备产生抗体的杂交瘤，评估由这些杂交瘤产生的抗体对HCV感染的抑制活性，并且获得抑制HCV感染的单克隆抗体。这已导致本发明的完成。具体地，本发明包括下列。
[1]抗体，其识别获自丙型肝炎病毒(HCV)的基因组的丙型肝炎病毒(HCV)颗粒作为抗原并且对丙型肝炎病毒(HCV)感染具有抑制活性的抗体，其中所述丙型肝炎病毒(HCV)的基因组包括彼此连接的下列(i)和(ii)：
(i)(a)丙型肝炎病毒(HCV)的JFH-1株的5’非翻译区、核心蛋白编码序列、E1蛋白编码序列、E2蛋白编码序列和p7蛋白编码序列或(b)丙型肝炎病毒(HCV)的J6CF株的5’非翻译区、核心蛋白编码序列、E1蛋白编码序列、E2蛋白编码序列和p7蛋白编码序列；和
(ii)JFH-1株的NS2蛋白编码序列、NS3蛋白编码序列、NS4A蛋白编码序列、NS4B蛋白编码序列、NS5A蛋白编码序列、NS5B蛋白编码序列和3’非翻译区。
[2]根据上述[1]的抗体，其中丙型肝炎病毒(HCV)基因组是包含序列表的SEQ ID NO：1或2中所示的核苷酸序列的核酸(条件是当核酸是RNA时，将核苷酸序列中的“T”读作“U”)。
[3]根据上述[1]或[2]的抗体，其中所述抗体类别是IgM。
[4]根据上述[1]至[3]的任一项的抗体，其识别序列表的SEQ IDNO：24中所示的氨基酸序列的至少10个连续氨基酸。
[5]根据上述[4]的抗体，其具有含有序列表的SEQ ID NO：52中所示的氨基酸序列的重链可变区。
[6]根据上述[4]至[5]的抗体，其具有含有序列表的SEQ ID NO：54中所示的氨基酸序列的轻链可变区。
[7]根据上述[4]至[6]的任一项的抗体，其由登录号为FERMBP-10982的杂交瘤细胞系产生。
[8]根据上述[1]至[3]的任一项的抗体，其识别含有序列表的SEQID NO：44或45中所示的氨基酸序列中的至少10连续氨基酸。
[9]根据上面[8]的抗体，其由登录号为FERM BP-10980的杂交瘤细胞系产生。
[10]根据上述[1]至[3]的任一项的抗体，其识别含有序列表的SEQID NO：36、45、46、47或48中所示的氨基酸序列中的至少10连续氨基酸。
[11]根据上面[10]的抗体，其由登录号为FERM BP-10981的杂交瘤细胞系产生。
[12]用于丙型肝炎病毒(HCV)感染的抑制剂，其包含上述[1]至11]的任一项的抗体作为活性成分。
[13]药物，其包含上述[1]至11]的任一项的抗体作为活性成分。
[14]用于丙型肝炎的治疗剂或预防剂，其包含上述[1]至11]的任一项的抗体作为活性成分。
[15]用于检测丙型肝炎病毒(HCV)的方法，其包括使用根据上述[1]至11]的任一项的抗体检测丙型肝炎病毒(HCV)颗粒。
发明效果
本发明的对HCV感染具有抑制活性的抗体和其用途可用于治疗或预防丙型肝炎以及阐明HCV感染的机制的研究。
附图概述
图1A显示已对其施用了J6/JFH-1-HCV颗粒的小鼠的血清抑制基因2a HCV的感染的活性。图1B显示已对其施用了J6/JFH-1-HCV的小鼠的血清抑制基因型1b HCV的感染的活性。
图2显示已对其施用了JFH-1-HCV颗粒的小鼠的血清抑制基因2aHCV的感染的活性。
图3A显示已对其施用了J6/JFH-1-HCV颗粒的小鼠的血清IgG级分抑制HCV感染的活性。图3B显示已对其施用了J6/JFH-1-HCV的小鼠的血清IgM级分抑制HCV感染的活性。
图4显示抗J6/JFH-1-HCV单克隆抗体对HCV感染的抑制活性。在图中，“P.C”表示未向其中加入抗体的阳性对照的结果；“N.C”表示未向其中加入感染性HCV颗粒的阴性对照的结果；和“IgG”表示对照抗体的结果。
图5显示抗JFH-1-HCV单克隆抗体对HCV感染的抑制活性。在图中，“P.C”表示未向其中加入抗体的阳性对照的结果；和“N.C”表示未向其中加入感染性HCV颗粒的阴性对照的结果。
图6A显示JF/M1-4单克隆抗体对具有来源于JFH-1E1(包膜蛋白1)的序列的肽的结合强度。图6B显示JF/M1-4单克隆抗体对具有来源于JFH-1E2(包膜蛋白2)的序列的肽的结合强度。代表图6A中的肽编号53至56和图6B中肽编号11和112的条线图(vehicles)显示通过加入PBS而非肽进行的对照实验。
图7A显示当与具有来源于J6 E1(包膜蛋白1)的序列的肽结合时，J6/1G11-25单克隆抗体的结合强度。图7B显示当与具有来源于J6E2(包膜蛋白2)序列的肽结合时，J6/1G11-25单克隆抗体的结合强度。代表图7A中肽编号53至56和图7B中肽编号111和112的条线图(vehicles)显示通过加入PBS而非肽进行的对照实验。
图8A显示当与具有来源于J6 E1(包膜蛋白1)的序列的肽结合时，J6/4D4-2单克隆抗体的结合强度。图8B显示当与具有来源于E2(J6包膜蛋白2)的序列的肽结合时，J6/4D4-2单克隆抗体的结合强度。代表图8A中肽编号53至56和图8B中肽编号111和112的条线图(vehicles)显示通过加入PBS而非肽进行的对照实验。
图9显示JF/M1-4单克隆抗体的H链可变区中互补决定区(CDR)和构架区的结构和其氨基酸序列。该H链V区从N端至C端按顺序包含构架1(SEQ ID NO：55)、CDR1(SEQ ID NO：56)、构架2(SEQ ID NO：57)、CDR2(SEQ ID NO：58)、构架3(SEQ ID NO：59)、CDR3(SEQ IDNO：60)和构架4(也称为J区段，J区或J链)(SEQ ID NO：61)区域。
图10显示JF/M1-4单克隆抗体的L链可变区中互补决定区(CDR)和构架区的结构和其氨基酸序列。该L链V区从N端至C端按顺序包含构架1(SEQ ID NO：62)、CDR1(SEQ ID NO：63)、构架2(SEQ ID NO：64)、CDR2(SEQ ID NO：65)、构架3(SEQ ID NO：66)、CDR3(SEQ IDNO：67)和构架4(也称为J区段，J区或J链)(SEQ ID NO：68)区域。
实施本发明的最佳模式
本发明涉及可通过使用从特定HCV基因组产生的感染性HCV颗粒作为抗原诱导的并且可抑制HCV感染的抗体。
本发明可通过本领域技术范围内的常规分子生物学和免疫学技术来进行。此类技术完整地描述于例如Sambrook等，Molecular Cloning：ALaboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory(第3版，2001)或EdHarlow等，Antibodies：A Laboratory Manual，Cold Spring HarborLaboratory，1988。
本文中引用的所有出版物、专利和专利申请以全文引用的形式合并入本文。
本说明书包括本申请要求其优先权的日本专利申请案2007-193413中公开的部分或所有内容。
(1)感染性HCV颗粒的制备
可在细胞培养系统中产生在本发明中可用作抗原的感染性HCV颗粒。用于进行目的的基本技术描述于WO 04104198A1、WO 06022422A1、WO 06096459 A2、Wakita，T.等，Nat.Med.11：791-796，2005，Lindenbach，B.D.等，Science 309：623-626，2005，和Pietschmann，T.等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，103：7408-7413，2006。
可用于产生感染性HCV颗粒(所述颗粒用于产生本发明的对HCV感染具有抑制活性的抗体)的HCV基因组的特定实例是基因型2aJFH-1株的病毒基因组RNA，其从5’末端至3’末端按顺序包含5’非翻译区、核心蛋白编码序列、E1蛋白编码序列、E2蛋白编码序列、p7蛋白编码序列、NS2蛋白编码序列、NS3蛋白编码序列、NS4A蛋白编码序列、NS4B蛋白编码序列、NS5A蛋白编码序列、NS5B蛋白编码序列和3’非翻译区。备选地，此类HCV基因组可由两个或更多类型的HCV株的病毒基因组RNA组成，其从5末端至3’末端按顺序包含除JFH-1外的HCV株的5’非翻译区、核心蛋白编码序列、E1蛋白编码序列、E2蛋白编码序列、p7蛋白编码序列和NS2蛋白编码序列和JFH-1株的NS3蛋白编码序列、NS4A蛋白编码序列、NS4B蛋白编码序列、NS5A蛋白编码序列、NS5B蛋白编码序列和3’非翻译区。此外，HCV基因组可由两个或更多类型的HCV菌株的病毒基因组RNA组成，其从5’末端至3’末端按顺序包含除JFH-1株外的HCV株的5’非翻译区、核心蛋白编码序列、E1蛋白编码序列、E2蛋白编码序列和p7蛋白编码序列和JFH-1株的NS2蛋白编码序列、NS3蛋白编码序列、NS4A蛋白编码序列、NS4B蛋白编码序列、NS5A蛋白编码序列、NS5B蛋白编码序列和3’非翻译区。
根据本发明的优选实施方案，HCV基因组是嵌合基因组，其从5’末端至3’末端按顺序包含来源于基因型2a的JFH-1株的全长基因组(例如，包含如SEQ ID NO：1中所示的核苷酸序列的基因组)和J6CF株的5’非翻译区、核心蛋白编码区、E1蛋白编码区、E2蛋白编码区、p7蛋白编码区、NS2蛋白编码区的直至N端上氨基酸16的区域、NS2蛋白编码区的从N端上氨基酸17至C端的区域、来源于基因型2aJFH-1株的NS3蛋白编码区、NS4A蛋白编码区、NS4B蛋白编码区、NS5A蛋白编码区、NS5B蛋白编码区和3’非翻译区。其特别优选实例是被克隆入J6/JFH-1的核酸，包含如SEQ ID NO：2中所示的核苷酸序列。
根据本发明的特别优选实施方案，HCV基因组是包含如SEQ IDNO：1或2中所示的核苷酸序列的核酸，条件是当核酸是RNA时，将核苷酸序列中的核苷酸“T”读作“U”。本发明的感染性HCV颗粒可通过使用HCV基因组RNA或HCV基因组DNA来产生。
特别地，本发明涉及对HCV感染具有抑制活性的抗体，其与作为抗原的HCV颗粒反应，所述HCV颗粒可获自(a)HCV基因组，其从5’末端至3’末端按顺序包含JFH-1株的5’非翻译区、核心蛋白编码序列、E1蛋白编码序列、E2蛋白编码序列和p7蛋白编码序列、NS2蛋白编码序列、NS3蛋白编码序列、NS4A蛋白编码序列、NS4B蛋白编码序列、NS5A蛋白编码序列、NS5B蛋白编码序列和3’非翻译区，或(b)HCV基因组，其从5’末端至3’末端按顺序包含HCV的J6CF株的5’非翻译区、核心蛋白编码序列、E1蛋白编码序列、E2蛋白编码序列、p7蛋白编码序列和JFH-1株的NS2蛋白编码序列、NS3蛋白编码序列、NS4A蛋白编码序列、NS4B蛋白编码序列、NS5A蛋白编码序列、NS5B蛋白编码序列和3’非翻译区(优选所述HCV基因组从5’末端至3’末端按顺序包含J6CF株的5’非翻译区、核心蛋白编码序列、E1蛋白编码序列、E2蛋白编码序列、p7蛋白编码序列和编码NS2蛋白编码区的直至N端上氨基酸16的区域的序列和JFH-1株的编码NS2蛋白编码区的从N端上氨基酸17至C端的区域的序列、NS3蛋白编码序列、NS4A蛋白编码序列、NS4B蛋白编码序列、NS5A蛋白编码序列、NS5B蛋白编码序列和3’非翻译区)。
当评估本发明的抗体抑制感染的活性时，除了上述HCV颗粒(a)或(b)外，还可使用从HCV基因组(c)获得的HCV颗粒，所述HCV基因组(c)包含按下列顺序连接的JFH-1株的5’非翻译区，基因型1b TH株的核心蛋白编码序列、E1蛋白编码序列、E2蛋白编码序列和p7蛋白编码序列(Wakita，T.等，J.Biol.Chem.，269，14205-14210，1994，JP专利公开案(kokai)No.2004-179A)，JFH-1株的NS2蛋白编码序列、NS3蛋白编码序列、NS4A蛋白编码序列、NS4B蛋白编码序列、NS5A蛋白编码序列、NS5B蛋白编码序列和3’非翻译区(优选HCV基因组包含按下列顺序连接的来源于JFH-1株的5’非翻译区，TH株的核心蛋白编码序列、E1蛋白编码序列、E2蛋白编码序列、p7蛋白编码序列和编码NS2蛋白编码区的直至N端上氨基酸33的区域的序列、编码NS2蛋白编码区的从N端上氨基酸34至C端的区域的序列、NS3蛋白编码序列、NS4A蛋白编码序列、NS4B蛋白编码序列、NS5A蛋白编码序列、NS5B蛋白编码序列和3’非翻译区域)。
可通过从包含克隆入转录启动子下游离位点的根据上述(a)至(c)的任一项的全长HCV基因组RNA的cDNA的载体(例如，含有在T7启动子的控制之下的克隆的HCV基因组RNA的载体)合成RNA，然后将RNA导入细胞来制备上述感染性HCV颗粒。可使用试剂盒例如MEGAscript T7试剂盒(Ambion)，利用含有在T1启动子的控制之下的克隆的HCV cDNA的核酸在体外合成RNA。可将RNA导入任何细胞，只要此类细胞允许HCV颗粒产生。其实例包括Huh7细胞、HepG2细胞、IMY-N9细胞、HeLa细胞和293细胞的培养细胞。更优选实例是肝来源的培养细胞例如Huh7细胞。更优选实例包括Huh7细胞和来源于Huh7细胞的细胞(即，Huh7.5细胞和Huh7.5.1细胞)。此外，可使用通过在Huh7细胞、HepG2细胞、IMY-N9细胞、HeLa细胞或293细胞中表达CD81和/或密蛋白1基因获得的细胞。Huh7细胞或来自Huh7细胞的衍生株细胞是特别优选的。在本发明中，术语“衍生株”是指来源于相关细胞的细胞系。
可通过任何已知的方法将RNA导入细胞。此类方法的实例包括磷酸沉淀法、DEAE-葡聚糖法、脂质转染法(lipofection)、显微注射和电穿孔。脂质转染法和电穿孔法是优选的并且电穿孔是更优选的。
细胞产生病毒颗粒的能力可利用与释放在培养液中的构成HCV颗粒的因子例如核心蛋白、E1蛋白或E2蛋白反应的抗体来评估。此外，还可使用特异性引物扩增培养液中HCV颗粒中包含的HCV基因组RNA来间接检测HCV颗粒的存在。
可通过培养以上述方式向其中导入了HCV RNA的细胞，向HCV允许细胞(permissive cell)(例如，Huh7细胞)施用(加入)所得的上清液，然后在48小时后用抗核心抗体对细胞进行免疫染色以计数被感染的细胞的数目来评估制备的病毒是否具有感染性。备选地，可通过将细胞提取物在SDS聚丙烯酰胺凝胶上经历电游，然后通过Western印迹检测核心蛋白来进行评估。
(2)感染性HCV颗粒的纯化
将含有在上述(1)中获得的感染性HCV颗粒的病毒溶液经历例如离心和/或通过过滤器的过滤来除去细胞和细胞残渣。可使用具有100,000至500,000的分子截断值的超滤性膜将已从其除去残渣的溶液浓缩大约10至100倍。可以以任意组合或单独地通过层析和密度梯度离心纯化已从其除去残渣的含有HCV的溶液。此后，描述了代表性的层析或密度梯度离心技术，虽然技术不限于此。
优选使用含有丙烯基葡聚糖和N，N′-亚甲基双丙烯酰胺的交联聚合物作为凝胶基质的层析载体来进行凝胶过滤层析，更优选通过使用
Figure GPA00001068520400101
S-300、S-400和S-500层析来纯化HCV颗粒。
可使用，优选Q-
Figure GPA00001068520400102
作为阴离子交换树脂以及SP
Figure GPA00001068520400103
作为阳离子交换树脂进行离子交换层析来纯化HCV颗粒。
优选可使用树脂作为载体进行亲和层析，所述树脂包含与其结合的选自肝素、硫酸化cellulofine、凝集素和各种染料的基质作为纯化HCV颗粒的配体。更优选，可通过使用载体来纯化HCV颗粒，所述载体包含与其结合的HiTrapHeparin
Figure GPA00001068520400104
HiTrap Blue
Figure GPA00001068520400105
HiTrapBenzamidine
Figure GPA00001068520400106
硫酸化cellulofine、LCA、ConA、RCA-120和WGA。最优选方法是通过使用硫酸化cellulofine作为载体来纯化HCV颗粒。根据HCV RNA拷贝数对溶液中总蛋白质量的比率，HCV颗粒可被纯化30倍或更多倍。
优选可利用糖聚合物例如氯化铯、蔗糖、
Figure GPA00001068520400107
或
Figure GPA00001068520400108
作为产生密度梯度的溶质来进行通过密度梯度离心的纯化。优选还可使用蔗糖。优选，可使用水或缓冲液例如磷酸盐缓冲液、Tris、乙酸盐或甘氨酸缓冲液。在通过密度梯度离心进行纯化时使用的离心力优选是1×104至1×109g，更优选5×104至1×107g，和最优选5×104至5×105g。
优选在0℃至40℃，更优选0℃至25℃和最优选0℃至10℃下进行纯化。
当通过密度梯度离心与柱离层析组合进行纯化时，此类技术可以以任何顺序进行。优选，首先通过复数个层析柱，然后进行密度梯度离心来纯化HCV颗粒。更优选，将通过阴离子交换柱层析，然后亲和层析获得的HCV颗粒经历通过密度梯度离心进行纯化。最优选，通过将用Q-
Figure GPA00001068520400111
柱获得的含有HCV颗粒的级分进一步使用基于硫酸化cellulofine的柱子进行纯化，然后通过密度梯度离心纯化所得的含有HCV颗粒的级分。在柱层析和密度梯度离心的步骤过程中，可进行透析或超滤以置换含有HCV颗粒的溶液的溶质和/或浓缩HCV颗粒。
(3)感染性HCV颗粒的灭活
本发明的抗体与作为抗原的HCV颗粒反应。当产生本发明的抗体时，HCV颗粒的感染性与抗原性无关，虽然灭活的HCV颗粒的使用是优选的。可通过在例如病毒悬浮液中加入和混合灭活剂例如福尔马林、β-丙内酯或戊二醛并且让灭活剂与病毒反应来灭活感染性HCV颗粒(Appaiahgari等，Vaccine，22：3669-3675，2004)。此外，可用紫外线照射感染性HCV颗粒以消除病毒的感染性，病毒可被立即灭活。利用紫外线的照射实现了病毒的灭活而对构成病毒的蛋白质几乎没有影响。用于灭活的紫外线的来源可以是商购获得的杀菌灯(germicidallamp)。具体地，可使用15w杀菌灯，尽管来源不限于其。在本发明中，使用通过上述方法纯化的HCV颗粒，灭活的方法不受纯化的或未纯化的状态限制。优选，可在室温下以20mW/cm2的紫外线照射含有感染性HCV颗粒的溶液，进行至少5分钟以灭活感染性HCV颗粒。
(4)动物的免疫
可通过对动物施用HCV颗粒以通过免疫反应诱导抗体来获得本发明的抗体。任何可产生能够产生杂交瘤的脾细胞的非人动物(非人哺乳动物)例如小鼠、大鼠、仓鼠或兔子可用于免疫。在本发明中，小鼠是优选的，牵涉小鼠的使用的实例在下面进行了描述。
通常，可用上述步骤(1)至(3)中获得的HCV颗粒抗原免疫4至10周龄的小鼠。根据情况，可改变或省略纯化步骤，以及可省略病毒灭活。通常，通过皮下或腹膜内施用具有佐剂的抗原数次来进行免疫。佐剂的实例包括但不限于弗氏完全佐剂，弗氏不完全佐剂、含有百日咳疫苗的氢氧化铝凝胶(aluminum hydroxide gel with pertussisvaccine)、Titer Max Gold(Vaxel)和GERBU佐剂(GERBU Biotechnik)。在不使用佐剂的情况下进行终免疫，静脉内或腹膜内施用抗原，然后按照已知的方法(Antibodies：A Laboratory Manual，Cold Spring HarborLaboratory，1988)在HCV颗粒的最终施用后3至10天，优选4天从免疫小鼠的血清中获得多克隆抗体。免疫动物是否产生本发明的抗体可通过在终免疫前通过从免疫动物的眼底或尾静脉(caudal vein)的静脉丛采集血液样品，然后测量抑制用作抗原的HCV的感染的活性来检察。
根据本发明的抗体可以是单克隆抗体或多克隆抗体，优选单克隆抗体。此外，本发明的抗体可来源于任何生物，优选哺乳动物，更优选人。本发明的抗体可以是嵌合抗体(例如人抗体与来源于其他哺乳动物的嵌合抗体)。特别优选嵌合抗体的实例是通过将小鼠抗体的高变区上的序列移植入人抗体获得的人源化抗体。本发明的抗体可以是具有人抗体的构架区和来源于其他哺乳动物的抗体的重链可变区和/或轻链可变区(包括高变区)的嵌合抗体。
(5)产生单克隆抗体的杂交瘤细胞的制备
当制备本发明的抗体，特别地当制备单克隆抗体时，从免疫动物取出脾，将脾细胞与骨髓瘤细胞融合以制备杂交瘤细胞。可在体外繁殖的任何骨髓瘤细胞都可用于细胞融合。其实例包括小鼠来源的已建立的细胞例如抗8-氮杂鸟嘌呤小鼠(BALB/c-来源的)骨髓瘤细胞P3-X63Ag8-U1(P3-U1)、SP2/0-Ag14(SP2/0)、P3-X63-Ag8653(653)、P3-X63-Ag 8(X63)和P3/NS1/1-Ag4-1(NS1)。此类细胞系可从RIKENBioResource Center，ATCC(美国典型培养物保藏中心)或ECACC(欧洲细胞培养物保藏中心商购获得。按照常规技术(Antibodies：A LaboratoryManual，Cold Spring Harbor Laboratory，1988，Selected Methods inCellular Immunology W.H.Freeman and Company，1980)进行培养和传代培养。
清洗上面获得的脾细胞和骨髓瘤细胞，将骨髓瘤细胞与脾细胞以1∶1至10的比例混合，将聚乙二醇加入其中以进行细胞融合。聚乙二醇能够融合细胞，具有较小细胞毒性的聚乙二醇是优选的，例如，优选可使用聚乙二醇-1500(PEG-1500)。在细胞融合后，在培养基中悬浮和清洗细胞。使用用于骨髓瘤细胞培养的培养基例如Dulbecco′s改良MEN培养基或RPMI-1640清洗细胞。选择用于融合的细胞的培养基以选择性获得目的融合细胞，这样的培养基的实例是通过向HAT培养基(通过向用于骨髓瘤细胞培养的培养基例如Dulbecco′s改良MEN培养基中加入2-巯基乙醇(5×10-5M)、青霉素(100单位/ml)、链霉素(100μg/ml)和牛血清(FCS)(10％，Invitrogen)制备的培养基)中加入次黄嘌呤(10-4M)、胸苷(1.5×10-5M)和氨基蝶呤(4×10-7M)而制备的培养基。
在培养后，分离部分培养上清液，通过HCV感染检测选择产生抑制HCV感染的抗体的细胞。备选地，可通过酶免疫测定选择产生与HCV蛋白反应的抗体的细胞。随后，通过在甲基纤维素培养基中有限稀释(limiting dilution)或集落形成来进行克隆，选择已被证明产生与HCV蛋白反应的抗体和对HCV感染具有抑制活性的抗体的细胞作为单克隆产生抗体的杂交瘤细胞系。
(6)对HCV感染具有抑制活性的抗HCV单克隆抗体的选择
可通过如下或如下面实施例中所描述的使用感染性HCV颗粒测定对HCV感染的抑制活性的方法来选择产生对HCV感染具有抑制活性的抗HCV单克隆抗体的杂交瘤。
开始时，将感染性HCV颗粒(用于产生所述颗粒的方法描述于上文)与抗体样品混合，使反应在37℃下进行1小时。向前一天以5×103个细胞/孔在96孔板上培养的Huh7细胞中加入样品(50μl)，然后在37℃下进行培养2.5小时。在培养后，除去样品，用PBS清洗细胞，加入新鲜培养基，继续培养。48小时后除去培养上清液，用PBS清洗细胞一次，加入100μlISOGEN(Nippon Gene)，从细胞制备RNA，定量RNA，然后测量HCV基因组RNA的量。按照Takeuchi等(TakeuchiT.等，Gastroenterology，116：636-642，1999)的方法通过定量RT-PCR，通过检测HCV RNA的5′末端非翻译区的RNA来检测HCV RNA。
备选地，可通过下列方法评估对HCV感染的抑制活性。开始时，将抗体样品与感染性HCV颗粒混合，然后将所得的混合物在37℃下经历反应，进行1小时。随后，向前一天已以1×104个细胞/孔在96孔板上培养的Huh7细胞中加入样品(50μl)，然后在37℃下进行培养2.5小时。在培养后，除去样品，用PBS清洗细胞，加入新鲜培养基，继续培养。在72小时后除去上清液，向板中引入冰冷的甲醇，固定细胞。之后，通过空气干燥除去甲醇，通过使用含有0.3％
Figure GPA00001068520400131
-X 100(GE Healthcare)的Block
Figure GPA00001068520400132
(Dainippon Pharmaceutical Co.，Ltd.)透化细胞。使用克隆2H9抗HCV-核心抗体(Nat Med.，2005，11：pp.791-6)和山羊抗小鼠IgG-Alexa488(Molecular Probes)，在荧光显微镜IX-70；Olympus)下计数HCV感染的细胞的数目，其中HCV感染被抑制的孔中的样品称为阳性克隆。从而，可选择靶杂交瘤。所选择的由杂交瘤产生的单克隆抗体是根据本发明的优选实施方案的抗体。
产生本发明的抗体的杂交瘤不受特别限制，只要此类杂交瘤可以以上述方式选择。登录号为FERM BP-10980、登录号为FERM BP-10981和登录号为FERM BP-10982的杂交瘤细胞系是优选的。将杂交瘤细胞系J6/1G11-25(登录号：FERM BP-10980；从2007年7月19日保藏的登录号：FERM P-21318(受理号(Receipt Number)：FERM AP-21318)转移至国际保藏的)、J6/4D4-2(登录号：FERM BP-10981；从2007年7月19日保藏的登录号：FERM P-21319(受理号：FERM AP-21319)转移至国际保藏的)和JF/M1-4(登录号：FERM BP-10982；从2007年7月19日保藏的登录号：FERM P-21320(受理号：FERM AP-21320)转移至国际保藏的)从2007年7月19日起保藏在International Patent Organism Depositary ofthe National Institute of Advanced Industrial  Science and Technology(Central 6，1-1-1Higashi，Tsukuba，Ibaraki，305-8566，Japan)。优选可将此类杂交瘤细胞系在37℃下培养于通过向Dulbecco′s改良Eagle培养基(高葡萄糖)中加入1mM丙酮酸钠、55μM 2-巯基乙醇和10％胎牛血清而制备的培养基中。
为了分析以上述方式选择的杂交瘤细胞系产生的本发明的抗体的表位，可使用基于HCV蛋白的酶免疫测定(EIA)、Western印迹法、斑点印迹法或其他方法。通过进行用于抗HCV单克隆抗体的初筛的此类表位分析，可有效地筛选靶向给定的HCV蛋白的抗HCV单克隆抗体。
根据本发明的更优选的对HCV感染具有抑制活性的抗体识别氨基酸序列WLTPKCLVHYPYRLWHYPC(SEQ ID NO：24)或包含HCV(特别地，HCV的JFH-1株)的E2蛋白的WLTPKCLVHYPYRLWHYPC(SEQ ID NO：24)的至少10个连续氨基酸的氨基酸序列为表位。包含WLTPKCLVHYPYRLWHYPC中的至少10个连续氨基酸的氨基酸序列优选是LVHYPYRLWH(SEQ ID NO：18)、WLTPKCLVHY(SEQ ID NO：19)、PKCLVHYPYR(SEQ ID NO：20)或YPYRLWHYPC(SEQ ID NO：21)，以LVHYPYRLWH(SEQ ID NO：18)为更优选。识别HCV E2蛋白的氨基酸序列的NFTIFKIRMY(SEQ ID NO：22)或IFKIRMYVCG(SEQID NO：23)为表位的抗体是根据本发明的更优选的对HCV感染具有抑制活性的抗体。在本说明书中，例如，术语“E1蛋白的氨基酸1至162”是指E1蛋白质的氨基酸序列中从氨基酸1至162的区域。同样地，要类似地理解代表蛋白质或核酸的一部分的相似表述。
根据本发明的优选实施方案的抗体的实例是具有含有如SEQ IDNO：52中所示的氨基酸序列的重链可变区的抗体。此外，根据本发明的优选实施方案的抗体的另一个实例是具有含有如SEQ ID NO：54中所示的氨基酸的轻链可变区的抗体。具有含有如SEQ ID NO：52中所示的氨基酸序列的重链可变区和含有如SEQ ID NO：54中所示的氨基酸序列的轻链可变区的抗体(优选单克隆抗体)是更优选的。这样的单克隆抗体的实例在下面的实施例中被描述为JF/M1-4单克隆抗体。具有含有如SEQ ID NO：52中所示的氨基酸序列的重链可变区和/或含有如SEQ ID NO：54中所示的氨基酸序列的轻链可变区的抗体可以是来源于任何生物的抗体，优选来源于哺乳动物的抗体，更优选人抗体或嵌合抗体。可使用通过将来源于任意生物(例如可容易地进行基因工程改造的小鼠)的重链和/或轻链可变区或其互补决定区(高变区)移植入来源于有待对其施用目的抗体的生物(例如，人)的抗体(优选单克隆抗体)的等同位置获得的嵌合抗体。嵌合抗体的特别优选实例是通过将小鼠抗体的高变区(也称为“互补决定区(CDR)”)的序列移植入人抗体的相关位置而获得的人源化抗体。
本发明的抗体可包含来源于JF/M1-4单克隆抗体的分别具有SEQID NOs：56、58和60的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3作为H链V区(即，重链可变区)的互补决定区(CDR)。同样地，本发明的抗体可包含来源于JF/M1-4单克隆抗体的分别具有SEQ ID NOs：63、65和67的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3作为L链V区(即，轻链可变区)的互补决定区(CDR)。根据另外的优选实施方案，本发明的抗体可包含分别具有SEQ ID NOs：56、58和60的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3作为H链V区(即，重链可变区)的互补决定区(CDR)，和分别具有SEQ ID NOs：63、65和67的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3作为L链V区(即，轻链可变区)的互补决定区(CDR)。此类抗体可在重链可变区和轻链可变区中包含任何构架1至4区。此类抗体也包含来源于除了小鼠以外的生物的任何抗体类型的构架1至4区(例如，人来源的构架1至4区)。具有来源于JF/M1-4单克隆抗体的H链V区的CDR1至CDR3和/或L链V区的CDR1至CDR3的此类抗体显示抑制基因型2a HCV颗粒的感染的活性。
根据本发明的另一个实施方案，对HCV感染具有抑制活性的更优选抗体识别包含HCV(特别地，J6CF株的HCV)的E2蛋白的氨基酸序列NVTNPEDMPRPYCW(SEQ ID NO：44)或NYTIFKIRMYVGG(SEQ ID NO：45)中至少10个连续氨基酸残基的氨基酸序列为表位。包含氨基酸序列NVTNPEDMPRPYCW(SEQ ID NO：44)或NYTIFKIRMYVGG(SEQ ID NO：45)中至少10个连续氨基酸残基的氨基酸序列的实例包括NVTNPEDMRP(SEQ  ID NO：29)、NPEDMRPYCW(SEQ ID NO：30)、NYTIFKIRMY(SEQ ID NO：31)和IFKIRMYVGG(SEQ ID NO：32)。
根据本发明的另外的实施方案，对HCV感染具有抑制活性的更优选抗体识别这样的氨基酸序列为表位，所述氨基酸序列包含HCV(特别地，J6CF株的HCV)的E1蛋白的氨基酸序列FIVSPQHHWFVQDCNC(SEQ ID NO：46)或MAWDMMMNWS(SEQID NO：36)中至少10个连续氨基酸残基的氨基酸序列或E2蛋白的氨基酸序列LIDYPYRLWHYPC(SEQ ID NO：47)、NPEDMRPYCWHYPPRQ(SEQ ID NO：48)或NYTIFKIRMYVGG(SEQID NO：45)。各自包含E2蛋白的FIVSPQHHWFVQDCNC(SEQ ID NO：46)，MAWDMMMNWS(SEQ ID NO：36)、LIDYPYRLWHYPC(SEQ IDNO：47)、NPEDMRPYCWHYPPRQ(SEQ ID NO：48)或NYTIFKIRMYVGG(SEQ ID NO：45)中的氨基酸序列的至少10个氨基酸的氨基酸序列的实例包括E1来源的表位的FIVSPQHHWF(SEQ IDNO：33)、SPQHHWFVQD(SEQ ID NO：34)、HHWFVQDCNC(SEQ IDNO：35)和MAWDMMMNWS(SEQ ID NO：36)。E2-来源的表位的实例包括LIDYPYRLWH(SEQ ID NO：37)、YPYRLWHYPC(SEQ ID NO：38)、DMRPYCWHYP(SEQ ID NO：39)、NPEDMRPYCW(SEQ ID NO：40)和PYCWHYPPRQ(SEQ ID NO：41)。
为了选择本发明的抗体，更特别地，将HCV蛋白固定在载体(即，固相化)上，然后向其加入抗体样品，然后让反应在足以形成抗体/抗原复合物的条件下进行一定的时间。随后，将所形成的复合物与识别已与信号酶、染料或放射性同位素结合的抗体样品的抗体(即，二抗)接触从而形成第二混合物。将第二混合物在足以形成抗体/抗原复合物的条件下经历反应进行一定的时间。借助于酶、染料或放射性同位素检测识别HCV蛋白的抗体的存在。
可如将HCV蛋白固定至载体上那样使用HCV颗粒。备选地，可使用利用包含HCV基因组的核心蛋白编码序列、E1蛋白编码序列、E2蛋白编码序列、p7蛋白编码序列、NS2蛋白编码序列、NS3蛋白编码序列、NS4A蛋白编码序列、NS4B蛋白编码序列、NS5A蛋白编码序列或NS5B蛋白编码序列的cDNA在大肠杆菌(E.Coli)、酵母、哺乳动物细胞、昆虫细胞等中表达的蛋白质。此外，可化学合成和使用此类蛋白。有待用于固定的蛋白质的氨基酸序列的长度不受限制，这样的长度是3个或更多个氨基酸，更优选8个氨基酸。
其中作为JFH-株或J6CF株的包膜蛋白的E1蛋白和E2蛋白在哺乳动物细胞中表达的实例在下面进行了描述。当氨基酸1如于全长JFH-1蛋白的氨基酸序列(NCBI蛋白质登录号BAB32872)的起始甲硫氨酸时，JFH-株或J6CF株的E1蛋白始于氨基酸192和终于氨基酸383。E1蛋白的从氨基酸353至氨基酸383的区域被认为是跨膜结构域(也称为“C末端疏水结构域”)(Cocquerel，L.等，J.Virol.74：3623-3633，2000)。
JFH-1株或J6CF株的E2蛋白始于上述氨基酸序列的氨基酸384并且终于氨基酸750。E2蛋白的从氨基酸722至氨基酸750的区域被认为是跨膜结构域(Cocquerel，L.等，J.Virol.74：3623-3633，2000)。
当在哺乳动物细胞中蛋白质分泌入和表达于培养上清液时，此类蛋白质必需具有信号肽，但它们不必具有跨膜结构域。
因此，不具有E1或E2蛋白的跨膜结构域的蛋白质包含从氨基酸192至氨基酸352的区域或从氨基酸384至氨基酸721的区域。氨基酸位置的偏移不是问题，只要氨基酸在性质上等同即可。在本发明中，JFH-1株的E1蛋白的从氨基酸192至氨基酸352的序列，E2蛋白的从氨基酸384至氨基酸720的序列(和优选从氨基酸384至氨基酸714的序列)，和J6CF株的E1蛋白的从氨基酸192至氨基酸352的序列，和E2蛋白的从氨基酸384至氨基酸720的序列可用作不包含跨膜结构域的蛋白质。当此类氨基酸编号用于其他序列时，可用在与全长JFH-1蛋白的氨基酸序列的比对(alignment)中相应的氨基酸编号命名序列。
基于GenBank中给定的JFH-1的氨基酸序列，可使用JFH-1的cDNA作为模板通过PCR合成编码不含有E1或E2蛋白的任何跨膜结构域的蛋白质的核酸，或可完全合成此类核酸。
可通过比对序列(进行比对)来容易地确定除了JFH-1外的HCV株的相应的E1和E2蛋白区域，从而在考虑HCV株的序列的置换或缺失的情况下，比对的序列的长度在与JFH-1序列比较中变得最长。可使用遗传信息处理软件(例如，GENETYX，Software Development Co.，Ltd.)进行此类分析。
当不包含E1或E2蛋白的跨膜结构域的蛋白质在哺乳动物细胞中被分泌和表达时，将编码此类蛋白质的核酸以使密码子的读框正确排列(即，符合读框)的方式与编码信号肽的核酸的下游位点连接，将终止密码子加至3′末端，然后将所得的核酸插入表达载体。信号肽主要由疏水氨基酸组成，其包含位于分泌蛋白的N端的至少15至30个氨基酸残基，信号肽与蛋白质转运通过细胞膜的机制相关。
可用于蛋白质在哺乳动物细胞中分泌和表达的信号肽可以是分泌蛋白的信号肽。具有信号肽的载体的实例包括具有小鼠GM-CSF的信号肽序列的载体(日本专利公开案(kokai)No.S63-276490A(1988))、具有IgG κ链的信号肽序列的pSecTag/FRT/V5-His载体(Invitrogen)、具有前原胰蛋白酶(preprotrypsin)的信号肽序列的p3xFLAG-CMV13载体(Sigma)、具有IL-2的信号肽序列的pFUSE-Fc2载体(InvivoGen)和具有IgM的信号肽序列的pTriEx-7载体(Novagen)。
当表达蛋白质时，此类蛋白以靶蛋白与标记蛋白的融合蛋白的形式表达，可利用与标记蛋白或分子反应的抗体(所述标记蛋白或分子特异性结合至其)来检测或纯化融合蛋白。此类标记蛋白也称为“标签(tag)”。标记蛋白不受限制，其实例包括FLAG肽(也称为flag肽或Flag肽)、3x FLAG肽(也称为3x FLAG肽、3x Flag肽或3x flag肽)、HA肽、3x HA肽、myc肽、6x His肽、GST多肽、MBP多肽、PDZ结构域多肽、碱性磷酸酶、免疫球蛋白和抗生物素蛋白。通常将此类肽或多肽融合至靶蛋白的N或C末端，但也可根据需要将此类肽或多肽插入靶蛋白内。具有前原胰蛋白酶信号肽和3x FLAG肽的融合多肽的载体可以p3xFLAG-CMV-9载体的形式从Sigma商购获得。
(7)单克隆抗体的制备
使上述(6)中选择的杂交瘤适应无血清培养基例如杂交瘤-SFM(Invitrogen)，可将无血清培养基中培养的上清液指定为单克隆抗体样品。可使用烧瓶、培养皿、旋动培养瓶、转瓶或高密度培养瓶(CELLine，Becton，Dickinson and Company)进行培养。
当从动物制备单克隆抗体时，将上面获得的抗HCV单克隆产生抗体的杂交瘤以2×107至5×106个细胞/小鼠腹膜内注射入姥鲛烷(pristane)处理的8至10周龄的小鼠、裸小鼠或SCID小鼠(腹膜内注射0.5ml 2，6，10，14-四甲基五烯(姥鲛烷)并且生长2周)。杂交瘤在10至21天内经历腹水瘤形成。从小鼠或裸小鼠中采集腹水样品来制备单克隆抗体样品。将获得的抗体样品离心以除去细胞或破碎的细胞，使样品经历使用40％至50％的饱和硫酸铵的盐析，辛酸沉淀、DEAE-琼脂糖柱、A蛋白柱、G蛋白柱、HiTrap IgM纯化HP-柱(GE Healthcare)、甘露聚糖结合蛋白-柱(Pierce)或凝胶过滤注，单独地或以适当的组合进行此类技术来回收IgG或IgM级分。从而获得纯化的单克隆抗体。可使用例如小鼠单克隆抗体分型试剂盒(Pierce)来确定纯化的单克隆抗体亚类。上述(4)至(7)中获得的本发明的对HCV感染具有抑制活性的抗体的种类不受特别地限制。在本发明中，IgG或IgM是优选的，IgM抗体为更优选。
(8)人源化抗HCV单克隆抗体的制备
人源化抗体也称为改型(reshaped)人抗体，此类改型人抗体通过将哺乳动物而非人(例如，小鼠抗体)的互补决定区(CDR)移植入人抗体的互补决定区来获得，一般基因重组技术是已知的(EP专利公开案EP 125023)。特别地，使用经制备从而具有在CDR和FR的末端区域重叠的区域的几种寡核苷酸引物，通过PCR来合成被设计来将小鼠抗体的CDR连接至人抗体的构架区(FR)的DNA序列。
选择通过互补决定区(CDR)连接的人抗体(其中CDR形成良好的抗原结合位点)的构架区。根据需要，可置换抗体可变区中构架区中的氨基酸，以使改型人抗体的CDR形成适当的抗原结合位点(Sato，K.，等，Cancer Res.53：851-856，1993)。
当制备本发明的对HCV感染具有抑制活性的人源化抗HCV单克隆抗体时，例如，首先以下列方式获得编码抗HCV单克隆抗体的H链V区(VH)和L链V区(VL)的cDNA。从产生抗HCV单克隆抗体的杂交瘤提取mRNA以合成cDNA。将合成的cDNA插入噬菌体或质粒载体以制备cDNA文库。利用小鼠的C或V区作为探针从所得的文库分离具有编码VH的重组噬菌体或质粒以及具有编码VL的cDNA的重组噬菌体或质粒。确定重组噬体或质粒上靶抗体的VH和VL的完整核苷酸序列，基于核苷酸序列推导VH和VL的完整氨基酸序列。
备选地，可通过PCR克隆编码VH和VL的cDNA。将以上述方式制备的杂交瘤的cDNA用作模板，使用复数个基于在相关基因中保守的氨基酸序列设计的引物扩增模板，将cDNA片段克隆入克隆性载体。从而，可获得编码VH和VL的cDNA。
可将编码抗HCV抗体的VH和VL的cDNA插入编码人抗体的H链C区(CH)和L链C区(CL)的基因的上游区域来构建编码人源化抗HCV单克隆抗体的cDNA。在CH中，可使用Cγ1、Cγ2、Cγ3和Cγ4，在CL中，可使用Cκ和Cλ。为了提高抗体的稳定性或其产量，可修饰C区。
在哺乳动物的情况下，可将在哺乳动物中表达目的基因的启动子、待表达的抗体和poly A信号与3’末端下游位点有效连接。可使用其表达目的基因。可使用的启动子的实例包括病毒启动子/增强子，例如人巨细胞病毒、逆转录病毒、多瘤病毒、腺病毒和猿猴病毒40(SV40)和来源于哺乳动物细胞的启动子/增强子例如延伸因子1α(EF1α)。
在大肠杆菌的情况下，可将可在大肠杆菌细胞中表达目的基因的启动子、用于抗体分泌的信号序列和待表达的抗体基因有效连接来表达目的基因。启动子的实例包括lacz启动子、araB启动子、Trp启动子和T7启动子。在昆虫细胞的情况下，可将可在昆虫细胞中表达目的基因的启动子、待表达的抗体基因和poly A信号与3’末端的下游位点有效连接来表达目的基因。可使用的启动子的实例包括多角体蛋白启动子和杆状病毒OpNMPV来源的立即早期OpIE2启动子。
可以以与上述用于制备人源化单克隆抗体的方法相似的方法制备根据本发明的具有含有如SEQ ID NO：52中所示的氨基酸序列的重链可变区和/或含有如SEQ ID NO：54中所示的氨基酸序列的轻链可变区的抗体。
(9)用作HCV感染的抑制剂
当将根据本发明的对HCV感染具有抑制活性的抗体用作HCV感染的抑制剂时，抗体用作阐明HCV感染机制的研究工具。此外，其优选用作药物(例如，药物组合物)，其更优选用作抗丙型肝炎的治疗剂或预防剂。当根据本发明的抗体用作抗丙型肝炎的治疗剂或预防剂时，其用于预防由来自供体器官的器官移植引起的HCV感染。此外，其可与现有的抗病毒剂例如干扰素和三氮唑核苷(ribavirin)组合使用。
根据本发明的对HCV感染具有抑制活性的抗体对于任意形式的丙型肝是有效的。例如，其对于慢性肝炎或暴发性肝炎是有效的，其对由基因型2a或1b HCV诱导的丙型肝炎尤其有效。
当对患者施用本发明的抗丙型肝炎的治疗剂或预防剂时，作为活性成分的本发明的抗体的有效量为0.001mg至1,000mg/kg的体重。备选地，剂量可以是0.01至100,000mg/kg患者的体重，虽然剂量不限于此。此外，可在患者发生疾病的临床症状之前或之后施用治疗剂或预防剂。
按照常规技术(Remington’s Pharmaceutical Science，the latestedition，Mark Publishing Company，Easton，U.S.A.)制备本发明的抗丙型肝炎的治疗剂或预防剂，此类试剂可包含药学上可接受的载体或添加剂。
此类药学上可接受的载体和添加剂的实例包括水、药学上可接受的有机溶剂、胶原、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚羧乙烯(carboxyvinylpolymer)、羧甲基纤维素钠、聚丙烯酸钠、s海藻酸钠、水溶性葡聚糖、羧甲淀粉钠、果胶、甲基纤维素、乙基纤维素、黄原胶(xanthan gum)、阿拉伯胶、酪蛋白、琼脂、聚乙二醇、；二甘油、甘油、丙二醇、凡士林、石蜡油、硬脂醇、硬脂酸、人血清白蛋白(HSA)、甘露醇、山梨醇、乳糖和表面活性剂，其作为药物添加剂是可接受的。
实际的添加剂根据本发明的抗丙型肝炎的治疗剂或预防剂的剂型选自上述添加剂，此类添加剂可单独地或以适当地组合使用，虽然添加剂不限定于上述添加剂。当添加剂用于注射制剂时，例如，将纯化的抗HCV抗体溶解于溶剂例如生理盐水、缓冲液或葡萄糖溶液中时，向其中加入吸附抑制剂例如Tween 80、Tween 20、明胶、人血清白蛋白等，可使用所得的混合物。备选地，可冻干添加剂以使其以允许其在使用前被溶解和重建的剂型存在。可用于冷冻干燥的赋形剂的实例包括糖醇例如甘露醇或葡萄糖以及糖。
(10)抗体用于HCV检测的用途
可将本发明的抗体用于用于HCV检测的诊断组合物。
例如，使已将本发明的抗体固定在其上的载体或板与可包含HCV抗原的受试样品接触，以产生混合物。将所得的混合物在足以形成抗体/抗原复合物的条件下经历反应，进行一段时间。然后，将所产生的复合物与识别已结合信号酶、染料或放射性同位素的HCV抗原的抗体接触，从而产生第二混合物。将第二混合物在足以形成抗体/抗原复合物的条件下经历反应，进行一段时间。借助于酶、染料或放射性同位素的信号，检测HCV抗原的存在。
备选地，将可含有HCV抗原的受试样品点在可将蛋白质固定至其上的膜(例如，硝酸纤维素膜或PVDF膜)上以固定受试样品中含有的蛋白质。然后，将该膜浸渍于5％脱脂牛奶或1％BSA溶液中以封闭膜。在清洗膜后，将膜浸渍于已结合酶、染料或放射性同位素的本发明的抗体的溶液中，让反应在足以允许固定在膜上的抗原与本发明的抗体形成复合物的条件下进行一段时间。在清洗膜后，然后借助于酶、染料或放射性同位素的信号检测固定在膜上的HCV抗原A的存在。
(11)用于抗HCV抗体检测
作为本发明的另一个用途，可检测识别与本发明的抗体识别的表位相同的表位的抗HCV抗体。本发明可用作与针对本发明的与HCV抗原反应的抗体和受试抗体的竞争性探针。例如，将HCV抗原固定在板或膜上，加入已结合酶、染料或放射性同位素的本发明的抗体和受试抗体，让反应在足以允许HCV抗原与抗体形成复合物的条件下进行一定的时间。通过分析酶、染料或放射性同位素信号与固相的结合的减少，可检测受试抗体是否可检测由本发明的抗体识别的相同表位。
实施例
在下文中，参照实施例更详细地描述本发明。应当指出这些实施例被提供用于举例说明目的，本发明的技术范围不限定于这些实施例。
[实施例1]JFH-1-HCV颗粒、J6/JFH-1-HCV颗粒和TH/JFH-1-HCV颗粒的制备
如Wakita，T.等，Nat.Med.，11，2005，pp.791-796和国际公开案WO2004/104198中所述，制备作为通过克隆cDNA(基因组长度的cDNA)获得的质粒DNA的pJFH-1，所述cDNA是通过逆转录pUC19质粒的T7RNA启动子序列下游的丙型肝炎病毒(HCV)的JFH-1株(基因型2a)(所述病毒株是从暴发性肝炎患者分离的)的整个基因组RNA区域获得的。来源于JFH-1株的被插入pJFH-1的基因组长度的cDNA的核苷酸序列如SEQ ID NO：1中所示。用EcoRI消化pJFH-1，然后用BclI部分消化以制备质粒DNA片段，该片段缺少从EcoRI位点至第一个BclI位点的大约2,840bp的片段，纯化所得的片段。
如国际公开案WO 2006/022422所述，制备作为通过克隆pUC19质粒的T7RNA启动子序列下游的来源于HCV J6CF株的基因组长度的cDNA(GenBank登录号AF177036，Yanagi，M.，等，Virology 262：250-263，1999)获得的pJ6CF。用EcoRI和BclI部分消化pJ6CF，纯化所得的大约2,840bp的片段，将所得片段连接至缺少上述EcoRI-BclI的pJFH-1片段，从而制备质粒DNA pJ6/JFH-1。克隆入pJ6/JFH-1的DNA(SEQ IDNO：2)是嵌合病毒基因组长度的cDNA，其包含J6CF株的基因组长度的cDNA的5’非翻译区、编码核心的序列、E1、E2和p7蛋白和编码NS2蛋白的从N末端至氨基酸16的区域的序列；和与其连接的JFH-1株的基因组长度的cDNA的编码NS2蛋白的从氨基酸残基17至C末端的区域的序列、按顺序编码NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B蛋白以及3’非翻译区的序列。
然后以下列方式制备质粒DNA pTH/JFH-1。开始时，向作为模板的JFH-1中的基因组长度的cDNA中加入10μl的Phusion High-FidelityDNA Polymerase试剂盒(FINNZYMES)提供的10x缓冲液、4μl 2mMdNTP混合物、1μl的各自10μM的引物JFH-1-A(SEQ ID NO：4：TGTAAAACGACGGCCAGT)和JFH-1-B(SEQ ID NO：5：GGTTTAGGATTCGTGCTCATGGTGCACGGTCTACGAGACC)，然后加入去离子水以使总量最终达到49.5μl。然后，向其中加入0.5μl PhusionDNA聚合酶(FINNZYMES)，进行PCR以扩增DNA片段，所述DNA片段，除了JFH-1株的5’非翻译区以外，还包含JFH-1-B引物序列中含有的HCV TH株的核心蛋白编码序列的一部分。使用30个循环(98℃下进行10秒，55℃下进行15秒和72℃下进行30秒)来进行PCR。所得的PCR产物称为1号PCR产物。然后，向作为模板的包含来源于HCV TH株的基因组长度的cDNA的pTH质粒(Wakita等，J.Biol.Chem.，269：14205-14210，1994；和Moradpour等，Biochem.Biophys.Res.Commun.，246：920-924，1998)中加入10μl的Phusion High-FidelityDNA Polymerase试剂盒(FINNZYMES)提供的10x缓冲液、4μl 2mMdNTP混合物和1μl的各自10μM的引物TH-C(SEQ ID NO：6：GGTCTCGTAGACCGTGCACCATGAGCACGAATCCTAAACC)和TH-D(SEQ ID NO：7：AGATAGCACAACCACCACAGGAGCTTGGCGAGGAATGCCT)，然后加入去离子水以使总量最终达到49.5μl。向其中加入0.5μl Phusion DNA聚合酶(FINNZYMES)，进行PCR以扩增DNA片段，除了包含TH株的从核心蛋白编码序列的大部分至NS2蛋白编码序列的一部分的区域的序列外，所述DNA片段还包含TH-C引物序列中含有的JFH-1株的5’非翻译区的一部分和YH-D引物序列中含有的JFH-1株的NS2蛋白编码序列的一部分。使用30个循环(98℃下进行10秒，55℃下进行15秒和72℃下进行30秒)来进行PCR。所得的PCR产物命名为2号PCR产物。此外，向作为模板的上述pJFH-1中加入10μl由Phusion High-Fidelity DNA Polymerase试剂盒(FINNZYMES)提供的10x缓冲液、4μl 2mM dNTP混合物和1μl的各自10μM的引物JFH-1-E(SEQ ID NO：8：AGGCATTCCTCGCCAAGCTCCTGTGGTGGTTGTGCTATCT)和JFH-1-F(SEQ ID NO：9：CAGCTACCGAGGGGTTAAGC)，然后加入去离子水以使最终总量达到49.5μl。向其中加入0.5μl Phusion DNA聚合酶(FINNZYMES)，进行PCR以扩增DNA片段，除了JFH-1株的NS2和NS3蛋白编码序列的一部分外，所述片段还包含JFH-1-E引物序列中含有的TH株的NS2蛋白编码序列的一部分。使用30个循环(98℃下进行10秒，55℃下进行15秒和72℃下进行30秒)来进行PCR。将所得的PCR产物命名为3号PCR产物。
然后，使用如上制备的1号PCR产物、2号PCR产物和3号PCR产物，利用JFH-1-A引物(SEQ ID NO：4)和JFH-1-E引物(SEQ ID NO：8)进行PCR。从而，获得包含彼此连接的JFH-1株的5’非翻译区、TH株的从核心蛋白编码序列至NS2蛋白质编码序列的一部分的区域和JFH-1株的从NS2蛋白编码序列的一部分至NS3蛋白质编码序列的一部分的区域的片段(4号PCR产物)。
然后，用EcoRI和SpeI限制性内切酶处理pJFH-1和4号PCR产物，将所得的片段连接以获得质粒DNA pTH/JFH-1。克隆入所得的pTH/JFH-1的嵌合病毒基因组长度的cDNA的核苷酸序列示于SEQ IDNO：3中。
用XbaI切割pJFH-1、pJ6/JFH-1和pTH/JFH-1，然后将其经历酚/氯仿提取和乙醇沉淀。将切割的质粒各自用作模板，使用MEGAscriptT7试剂盒(Ambion)合成RNA(参见WO 2006/022422)。如下所述将所合成的HCV RNA各自用于导入细胞。
将Huh-7细胞(3×106个细胞)和5μg HCV RNA悬浮于400μlCytomix溶液(120mM KCl、0.15mM CaCl2、10mM K2HPO4/KH2PO4、25mM Hepes、2mM EGTA、5mM MgCl2、20mM ATP和50mM谷光甘肽)中，将悬浮液转移至4-mm小杯中，使用Gene Pulser(BioRad)以260V和950μF将其经历HCV RNA至Huh-7细胞内的电穿孔。然后，将已向其中导入HCV RNA的细胞接种在10cm2皿中，然后进行传代培养。在传代培养时，使用HCV antigen ELISA test试剂盒(ORTHO)定量培养上清液中含有的HCV核心蛋白以确认HCV颗粒的产量。选择含有大量核心蛋白和具有高HCV颗粒产生活性的培养上清液并且以病毒原液的形式贮存。
向已在10-cm培养皿中于10％FCS-DMEM培养基(1％MEM非必需氨基酸溶液(Invitrogen)、10mM HEPES-Tris(pH7.3)和1mM丙酮酸钠)中培养的Huh-7细胞中加入上述获得的大约100μl JFH-1或J6/JFH-1病毒原液以用HCV病毒感染Huh-7细胞。
将细胞充分地传代培养，同时避免细胞培养物变得汇合，将其在225cm2的培养瓶中从一个培养瓶至4个培养瓶，然后至12个培养瓶进行扩增培养。然后，从8个这样的225-cm2培养瓶中分离细胞，将其接种在两个5层CellstacksTM(Corning)中，以650ml/cellstack的量向其中加入培养基。将获自另外4个瓶中的细胞接种在12个瓶中，继续有效地产生病毒。
在传代培养的第二天，弃去培养基，加入650ml的2％FCS-DMEM培养基(1％MEM非必需氨基酸溶液(Invitrogen)、10mM HEPES-Tris(pH7.3)、1mM丙酮酸钠)。在培养基更换后3天回收培养基，将其通过0.45-μm过滤器，然后将所得产物贮存于低温冰箱中。此外，在回收培养上清液后向Cellstack中加入650ml的2％FCS-DMEM培养基(1％MEM非必需氨基酸溶液、10mM HEPES-Tris(pH7.3)和1mM丙酮酸钠)，然后继续培养。在更换培养基后2天重复相似的方法，回收培养上清液。然后再重复一次相似的方法。将如此回收的培养上清液用于下面的实施例。
由此，证明了在已向其中导入了各自从pJFH-1、pJ6/JFH-1和pTH/JFH-1合成的RNA的细胞的培养上清液中产生了感染性HCV颗粒。
[实施例2]JFH-1、J6/JFH-1和TH/JFH-1HCV颗粒的纯化
通过下列4个步骤纯化实施例1中产生的病毒颗粒。
1)浓缩
通过使用Pellicon 2Mini Ultrafiltration Module PLCMK V 0.1m2(300kDa截断值，登录号P2C300V01，Millipore，在下文中称为“pellicon 2 mini”)，将上述实施例中获得的含有HCV颗粒的培养上清液浓缩大约30至50倍。将浓缩物通过0.45-μm过滤器过滤，然后于-80℃下贮存。
2)密度梯度超速离心
向Ultra-clear 25×89mm离心管(登录号344058，Beckman Coulter)中加入3ml含有冷60％蔗糖的TNE缓冲液(10mM Tris-HCl(pH7.4)、150mM NaCl，1mM EDTA)，然后在上面覆盖7ml含有20％蔗糖的TNE缓冲液。此外，将25ml样品覆盖在含有20％蔗糖的TNE缓冲液上。使用SW-28(Beckman Coulter)以28,000rpm在4℃进行超速离心4小时。
使用25G注射针头(Terumo)穿透管的底部，连续地获得2.5ml、3ml、4.5ml和25ml的级分。
3)肝素柱子的纯化
用20mM磷酸盐缓冲液(pH7)平衡5-ml HiTrap Heparin HP柱子。将稀释的级分(不超过6个柱子)以5ml/分钟或更慢的流速用于HiTrapHeparin。通过流过50ml 20mM磷酸盐缓冲液(pH7)清洗柱子。通过对其使用25ml含有500mM NaCl的20mM磷酸盐缓冲液(pH7)来获得洗脱级分。此外，通过流过50ml含有3.8M NaCl的20mM磷酸盐缓冲液(pH7)来清洗柱子，然后用20mM磷酸盐缓冲液(pH7)平衡柱子，并且贮存柱子。
4)浓缩和缓冲液交换
使用Amicon Ultra-15离心式过滤器单位(Centrifugal Filter Unit)(Millipore)和TNE缓冲液将洗脱级分经历浓缩和缓冲液交换。在下述的免疫步骤中，将所获得的浓缩物用作含有感染性病毒颗粒的病毒溶液。
[实施例3]病毒灭活
通过紫外线照射灭活通过实施例2中的步骤1)至4)获得的浓缩的丙型肝炎病毒。关于紫外线的来源，可使用GL-15(Toshiba)。将含有纯化的丙型肝炎病毒颗粒(JFH-1株)的溶液(其具有1×106ffu/ml的感染效价)引入硅涂铺的聚乙烯Eppendorf管(Assist Co.，Ltd，)中，将管以与紫外线源相距使得可以以20mW/cm2的强度使用紫外线的距离放置，使用UV-C进行5分钟。
在紫外线照射后，将丙型肝炎病毒颗粒于Dulbecco’s改良Eagle培养基(DMEM)中系列稀释50倍、250倍、1,250倍、6,250倍、31,250倍、156,250倍和781,250倍。
在前一天，将Huh-7细胞以1×104个细胞/孔接种在96孔多聚L赖氨酸涂铺的板(Corning 96孔透明平底多聚L赖氨酸涂铺的微量培养板，Corning)，将系列稀释的病毒颗粒接种于其中，在37℃下培养72小时。
在除去培养上清液后，将板浸渍于冰冷的甲醇中以固定细胞。然后，通过空气干燥除去甲醇，使用含有0.3％-X 100(GEHealthcare)的Block(Dainippon Pharmaceutical Co.，Ltd.)透化细胞。使用克隆2H9抗HCV核心抗体(Wakita，T.等，Nat.Med.11：791-796，2005)和山羊抗小鼠IgG-Alexa488(Molecular Probes)检测HCV感染的细胞，在荧光显微镜(IX-70；Olympus)下计数HCV感染的细胞的数目。发现紫外照射的丙型肝炎病毒的感染效价低于检测极限。在下列实施例中将被证明已完全丧失感染性的HCV颗粒用于对小鼠施用。
[实施例4]使用灭活的HCV颗粒进行的小鼠的免疫
首先制备佐剂。向100μl含有已如实施例3中所述灭活的J6/JFH-1-HCV颗粒(相当于1.4μg HCV核心蛋白；相当于10μg总HCV蛋白)的溶液中加入等量的弗氏完全佐剂(Difco)以产生乳剂。乳剂的产生通过在烧杯中制备足够量的水，将相关混合物的小滴滴在液体表面，然后观察液体将不扩散来确认。用醚麻醉Balb/c小鼠(7周龄，雌性)，然后对其腹膜内施用所制备的含有灭活的J6/JFH-1-HCV颗粒的乳剂来免疫小鼠。
两周后，向100μl含有J6/JFH-1-HCV颗粒的溶液(相当于1.4μgHCV核心蛋白；相当于10μg总HCV蛋白)中加入等量的弗氏不完全佐剂(Difco)以产生乳剂，然后如上所述通过腹膜内施用乳剂再次免疫小鼠。3周后再对小鼠腹膜内施用乳剂以进一步免疫。
同样，也以相同的方式按照上述免疫方案使用实施例3中灭活的JFH-1-HCV颗粒来免疫小鼠。
[实施例5]来源于用灭活的HCV颗粒免疫的小鼠的血清中对HCV感染的抑制活性的测量
在已在实施例4中免疫的小鼠中，将血清样品经历对HCV感染的抑制活性的测量，所述血清样品通过从用具有基因型2a的结构蛋白的灭活的HCV颗粒(J6/JFH-1-HCV颗粒或JFH-1-HCV颗粒)免疫的小鼠部分血样取样获得。
将Huh7细胞以5×103个细胞/孔接种在96孔板上，然后将细胞培养过夜。向实施例2的步骤1)中获得的浓缩的J6/JFH-1-HCV病毒溶液中加入血清和肝素(10个单位/ml)，将所得物在37℃下温育1小时。在使用前用培养基(含有10％FCS(Invitrogen)、1％MEM非必需氨基酸溶液(Invitrogen)、10mM HEPES-Tris(pH7.3)和1mM丙酮酸钠的DMEM)将血清稀释20倍和100倍。在弃去培养基后，以50μl/孔加入病毒溶液，然后在37℃下温育3小时。在弃去培养基后，用PBS清洗板一次，以100μl/孔加入培养基，然后在37℃下温育48小时。在弃去培养基后，用PBS清洗板一次，以100μl/孔加入Isogen(Wako PureChemical Industries，Ltd.)，按照所附说明书提取总RNA。通过定量RT-PCR对总RNA进行定量，测定每1μg总RNA的RNA拷贝数。
此外，以下列方式检查来源于用具有基因型2a的结构蛋白的J6/JFH-1-HCV颗粒免疫的小鼠的血清是否具有抑制具有基因型1b的结构蛋白的HCV的感染的活性。为此目的，以与上所述方式相同的方式将实施例1和实施例2中制备的嵌合HCV颗粒(TH/JFH-1-HCV)(其具有基因型1b的TH株的结构蛋白)和嵌合J6/JFH-1-HCV颗粒(其具有基因型2a的结构蛋白)用作感染剂来测量血清抑制感染的活性。除了使用在施用HCV颗粒之前取样的正常小鼠的血清外，以相同的方式进行对照实验。
结果，发现在用J6/JFH-1-HCV颗粒对小鼠免疫后62天从其获得的稀释20倍的血清具有与对照实验(100％)相比较下降至15％的J6/JFH-1-HCV的感染水平，从而发现血清具有抑制具有基因型2a(图1A)的结构蛋白的HCV颗粒的感染的活性。此外，与对照实验(100％)相比较，稀释20倍的血清使TH/JFH-1-HCV的感染水平下降至34％，从而发现血清具有抑制具有基因型1b(图1B)的结构蛋白的HCV颗粒的感染的活性。这些结果显示通过用基因型2a进行的HCV免疫诱导的抗体包括抑制基因型1b HCV的感染的抗体以及抑制基因型2a HCV的感染的抗体。
甚至当将从用JFH-1-HCV颗粒免疫后42天获得的两只小鼠获得的血清稀释100倍以进行使用时，与对照实验中HCV颗粒施用前收集的血清(100％)相比较，基因型2a JFH-1-HCV的感染水平降低，从而确认血清具有抑制感染的活性(图2)。
然后，将200μl来自已对其施用了J6/JFH-1-HCV颗粒的小鼠的血清和从HCV颗粒施用前的正常小鼠收集的血清各自用于1-mlG蛋白琼脂糖柱(GE Healthcare)，以1ml/级分的量用0.1M甘氨酸缓冲液(pH3.0)洗脱样品，然后进行柱清洗。洗脱的蛋白质峰级分命名为IgG级分，将IgG级分和非吸附级分(IgM级分)分别制备为纯化的级分。如下，以与上所述方式相似的方式测量它们对其HCV感染的抑制活性。
以100μg/ml或10μg/ml使用从已对其施用了HCV颗粒的小鼠的血清获得的纯化的IgG而非用于上述测量的血清样品，或以100μg/ml使用从正常小鼠血清获得的纯化的IgG。将HCV颗粒(病毒溶液中的)与IgG等混合以获得107个拷贝/ml，让其在室温下静置1小时。然后，弃去用于Huh-7细胞(所述细胞已在前一天以4×104个细胞/孔接种在24孔板中并且在其中进行培养)的培养基，以200μl/孔向细胞加入上述病毒颗粒与IgG抗体的混合物。将细胞在37℃下温育3小时，弃去含有病毒颗粒的溶液，用PBS清洗孔一次。向其中加入新鲜培养基，进行培养2天，弃去培养基，用PBS清洗孔一次，然后使用Trizol试剂(Invitrogen)从细胞提取RNA。测定提取的RNA中含有的HCV RNA的拷贝数。按照Takeuchi等(Gastroenterology，1999，116，pp.636-42.)的方法测定RNA的拷贝数。
然后，以相同的方式测量不吸附至G蛋白琼脂糖的级分(即，IgM级分)的抑制感染的活性。作为阳性对照，使用获自已对其施用了J6/JFH-1-HCV颗粒的小鼠的血清(未纯化的)样品。测量从已对其施用J6/JFH-1-HCV颗粒的小鼠获得的血清样品中的蛋白质含量和IgM级分中蛋白质的含量，然后在向样品加入相同量的蛋白质的情况下进行抑制感染的活性的测量的实验。特别地，将获自已对其施用了J6/JFH-1-HCV颗粒的小鼠的血清混合以达到5％，将HCV颗混合以成为107个拷贝/ml的混合物。以这样的量混合IgM级分，以使包含与上述5％的小鼠血清中的量相同的量的蛋白，混合HCV颗粒以成为107个拷贝/ml。让混合物在室温下静置1小时。弃去用于Huh-7细胞(已在前一天将所述细胞以4×104个细胞/孔接种于24孔板上并且在其中进行培养)的培养基，将病毒颗粒和血清或IgM的混合物以200μl/孔加入其中。将细胞于37℃下温育3小时，弃去含有病毒颗粒的溶液，用PBS清洗孔一次。加入新鲜培养基，培养2天，弃去培养基，用PBS清洗孔一次，使用Trizol试剂(Invitrogen)从细胞提取RNA。测定提取的RNA中含有的HCV RNA的拷贝数。按照Takeuchi等(Gastroenterology，1999，116，pp.636-42.)的方法测定RNA拷贝数。
结果，发现来源于获自已对其施用了J6/JFH-1-HCV颗粒的小鼠的血清的IgM级分对HCV感染具有抑制活性，如图3中所示。
[实施例6]杂交瘤的制备
在含有5×10-5M 2-巯基乙醇、100个单位/ml青霉素、100μg/ml链霉素和10％胎牛血清(FCS，Invitrogen)的Dulbecco’s改良MEM培养基(Invitrogen)中培养小鼠骨髓瘤细胞系SP2/0细胞(获自ECACC)，在对数生长期中获得SP2/0细胞。用无血清Dulbecco’s改良MEM清洗细胞3次。
然后，从已对其施用了实施例4的HCV颗粒(JFH-1颗粒或J6/JFH-1颗粒)的小鼠制备脾细胞，用无血清Dulbecco’s改良MEM清洗3次。将SP2/0细胞和小鼠脾细胞以1∶5的比例导入50-ml离心管，以1,000rpm离心细胞10分钟。将上清液完全吸出，用手指轻敲管底以使细胞沉淀松散。向细胞中加入1ml 50％的于37℃下加热的聚乙二醇-1500溶液(Roche)，进行1分钟，让反应在37℃下继续进行1分钟。然后，逐渐加入1ml无血清Dulbecco’s改良MEM进行1分钟，再逐渐地加入1ml无血清Dulbecco’s改良MEM，进行1分钟。最后，加入7ml无血清Dulbecco’s改良MEM进行3分钟以稀释聚乙二醇溶液。以1,000rpm离心稀释剂中的细胞10分钟，向其中加入50ml HT培养基(含有5×10-5M 2-巯基乙醇、100个单位/ml青霉素、100μg/ml链霉素、10％FCS，10-4M次黄嘌呤和1.5×10-5M胸苷的Dulbecco’s改良MEM培养基)，通过移液器吸打使细胞沉淀松散。将细胞转移至两个75-cm2培养瓶中，在37℃下于5％CO2的培养箱中培养过夜。
以1,000rpm离心细胞10分钟，回收细胞。通过轻敲松散细胞沉淀，重悬浮于10ml的Dulbecco’s改良MEM中。将细胞悬浮液加入至且充分混合于90ml甲基纤维素HAT选择培养基(Stem CellTechnology)中，将所得的混合物以10ml/皿的量加入至10-cm培养皿，将培养物在37℃下于5％CO2的培养箱中进行培养。
在培养10至14天后，用移液器尖头吸出各自被认为长自单个细胞的杂交瘤集落，将其各自导入已向其中加入了200μl的含有10％杂交瘤生长因子(Bio Veris)的各HT培养基的96孔板的孔，然后继续培养。
[实施例7]产生抑制HCV感染的抗体的杂交瘤的筛选
当实施例6中制备的杂交瘤已充分增殖时，回收培养上清液，如下对其进行筛选。
通过将E1蛋白和E2蛋白固定在板上，通过EIA评估杂交瘤上清液中的抗体是否结合固定在板上的蛋白质，并且评估杂交瘤上清液中的抗体是否能够抑制HCV感染。
1)来源于J6CF株的E1和E2蛋白的制备
如下制备J6CF菌株的E1和E2蛋白。通过使用来源于基因型2aJ6CF株的基因组长度的cDNA(GenBank登录号AF177036)作为模板，使用Advantage GC2PCR试剂盒(Takara Bio)，利用J6E1dTM-s(SEQ IDNO：10：CACAAGCTTGCCGAAGTGAAGAACATCAGT)及J6E1dTM-as(SEQ ID NO：11：GCTCTAGATTAATGAGCCCCGCTAATGATGTC)通过PCR扩增编码缺少跨膜区的E1蛋白的基因，当氨基酸1始于J6CF株的全长蛋白质序列(即，由J6CF株的基因组序列：GenBank登录号AF177036编码的连续蛋白质序列)的N端上起始甲硫氨酸时，所述跨膜区相当于从氨基酸192至352的区域。将扩增的DNA片段克隆入pCR-TOPO(Invitrogen)，将3个克隆经历核苷酸序列分析。包含具有正确核苷酸序列的插入物的克隆被命名为pTOPO-J6E1dTM。
用HindIII和XbaI部分消化pTOPO-J6E1dTM，切取含有大约500bp的所得的DNA片段(E1片段)的凝胶。使用GeneElute(SIGMA)从凝胶纯化DNA片段。类似地，用HindIII和XbaI消化p3xFLAG-CMV-9(SIGMA)，将所得产物在1％琼脂糖凝胶上进行电泳，切取含有大约6,400bp的片段的凝胶，使用GeneElute(SIGMA)从凝胶纯化DNA片段。使用T4连接酶(Takara Bio)将纯化的DNA片段彼此连接，从而获得已将J6CF E1片段整合入其中的动物细胞表达载体CMV-3xFLAGJ6E1dTM。
然后，使用Advantage GC2PCR试剂盒(Takara Bio)，利用J6E2dTM-s(SEQ ID NO：12：CACAAGCTTCGCACCCATACTGTTGGGG)和J6E2dTM-as(SEQ ID NO：13：GCTCTAGATTACCATCGGACGATGTATTTTGT)通过PCR克隆编码缺少跨膜区的E2蛋白的基因，当氨基酸1始于J6CF株的全长蛋白质序列的N端上的起始甲硫氨酸时，所述跨膜区相当于从氨基酸384至720的区域。将扩增的DNA片段克隆入pCR-TOPO(Invitrogen)，将3个克隆经历核苷酸序列分析。包含具有正确核苷酸序列的插入物的克隆被命名为pTOPO-J6E2dTM。
然后，借助于T4DNA连接酶将通过用HindIII和XbaI消化p3xFLAG-CMV-9(SIGMA)而获得的DAN连接至用HindIII和XbaI从pTOPO-J6E2dTM切取的大约1,000bp的DNA片段以进行环化。所得的载体被命名为CMV-3xFLAGJ6E2dTM。
如下所述，将CMV-3xFLAGJ6E 1dTM和CMV-3xFLAGJ6E2dTM导入来源于猴肾细胞(登录号RCB0143，获自Riken细胞库)的COS1细胞以在其中表达蛋白质。
将COS1细胞培养于含有10％胎牛血清(Invitrogen)、100U/ml青霉素和100μg/ml硫酸链霉素的Dulbecco’s MEM(D-MEM：Invitrogen)。将COS1细胞在基因导入的前一天以1∶2的分流比(splitratio)接种在150-cm2培养瓶(Corning Coaster)中，将细胞在37℃下于5％CO2的培养箱中培养过夜。
分别地，向D-MEM培养基(Invitrogen)中加入DEAE葡聚糖(Pharmacia)和氯奎(SIGMA)以分别形成400μg/ml和100μM的终浓度，每13ml的溶液以0.1μg/μl加入50μg表达载体(CMV-3xFLAGJ6E1dTM或CMV-3xFLAGJ6E2dTM)，然后进行培养。然后吸除培养的COS 1细胞的上清液，向其中加入10ml PBS(-)(Nissui)，清洗细胞一次。在将PBS(-)吸除后，每150-cm2培养瓶向其中加入13ml的DEAE葡聚糖-DNA混合物，然后在5％CO2存在的情况下于37℃进行温育4小时。
4小时后，吸除DEAE葡聚糖-DNA混合物，然后用10ml PBS清洗细胞一次。以每瓶50ml的量向其中加入CHO-SFM培养基(Invitrogen)，在5％CO2存在的情况下于37℃进行培养。4天后将培养上清液收集在50-ml离心管(Corning Coaster)中。在4℃下以6,000rpm(通过使用HITACHI RPR9-2转子)离心收集的上清液，然后通过0.2-μm过滤器(Whatman)进行过滤。
如下使用抗FLAG M2琼脂糖(SIGMA)来纯化培养上清液。向500ml培养上清液中加入1ml抗FLAG M2琼脂糖，让反应在4℃(在低温舱)中进行2小时，同时在转瓶中进行搅拌。2小时后，将上清液与抗FLAG M2琼脂糖的混合物转移至Econo-Column(BIO-RAD)，收集流过级分。然后，用10ml TBS(50mM Tris-HCl、150mM NaCl，pH7.4)清洗柱子2次。通过使用0.1M甘氨酸-HCl(pH3.5)洗脱6个级分(每一个级分1ml)。在洗脱后立即加入1M Tris-HCl(pH9.5)进行中和。将级分(各20μl)在还原条件下经历SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，使用考马斯亮蓝染色。结果，发现来源于J6CF株的E1和E2蛋白被纯化
2)来源于JFH-1株的E1和E2蛋白的制备
如下制备JFH-1株的E1和E2蛋白。通过使用来源于基因型2aJFH-1株的基因组长度的cDNA作为模板，使用Advantage GC2PCR试剂盒(Takara Bio)利用JFHE1dTM-s(SEQ ID NO：14：CACAAGCTTGCCCAGGTGAAGAATACCAGT)和JFHE1dTM-as(SEQID NO：15：GCTCTAGATTAGTGAGCCCCGCTAACGATGTC)通过PCR扩增编码E1蛋白的基因，当氨基酸1始于J6CF株的全长蛋白质序列(即，由JFH-1株的基因组序列编码的连续蛋白质序列：氨基酸序列公开于GenBank登录号AB047639；Kato，T.等，Gastroenterology，125，2003，pp.1808-1817)的N端上的起始甲硫氨酸时，所述E1蛋白相当于从氨基酸192至352的区域。将扩增的DNA片段克隆入pCR-TOPO(Invitrogen)，将3个克隆经历核苷酸序列分析。包含具有正确核苷酸序列的插入物的克隆被命名为pTOPO-JFHE1dTM。
用HindIII和XbaI消化pTOPO-JFHE1dTM，切取含有大约500bp的所得的DNA片段(E1片段)的凝胶。使用GeneElute(SIGMA)从凝胶纯化DNA片段。类似地，用HindIII和XbaI消化p3xFLAG-CMV-9(SIGMA)，将所得产物在1％琼脂糖凝胶上进行电泳，切取含有大约6,400bp的片段的凝胶，使用GeneElute(SIGMA)从凝胶纯化DNA片段。使用T4连接酶(Takara Bio)将纯化的DNA片段彼此连接，从而获得已将JFH-1E 1片段整合入其中的动物细胞表达载体CMV-3xFLAGJFHE1dTM。
然后，使用Advantage GC2PCR试剂盒(Takara Bio)利用JFE2dTM-s(SEQ ID NO：16：CACAAGCTTGGCACCACCACCGTTGGAG)和JFE2dTM-as(SEQ ID NO：17：GCTCTAGATTATGTGATAGCAGGTGAGAGGCC)通过PCR克隆编码缺少跨膜区的E2蛋白的基因，氨基酸1始于JFH-1株的全长蛋白质序列的N端上的起始甲硫氨酸时，所述跨膜区相当于从氨基酸384至714的区域。将扩增的DNA片段克隆入pCR-TOPO(Invitrogen)，将3个克隆经历核苷酸序列分析。包含具有正确核苷酸序列的插入物的克隆被命名为pTOPO-JFHE2dTM。
用HindIII和XbaI消化pTOPO-JFHE2dTM，切取含有大约1,000bp的所得的E2片段的凝胶。使用GeneElute(SIGMA)从凝胶纯化DNA片段。类似地，用HindIII和XbaI消化p3xFLAG-CMV-9载体(SIGMA)，将所得产物在1％琼脂糖凝胶上进行电泳，切取含有大约6,400bp的片段的凝胶，使用GeneElute(SIGMA)从凝胶纯化DNA片段。使用T4连接酶(Takara Bio)将纯化的DNA片段彼此连接，从而获得已将JFH-1E2片段整合入其中的动物细胞表达载体CMV-3xFLAGJFHE2dTM。
如下所述，将CMV-3xFLAGJFHE1dTM和CMV-3xFLAGJFHE2dTM导入来源于猴肾细胞(登录号RCB0143，获自Riken细胞库)的COS1细胞以在其中表达蛋白质。
将COS1细胞培养于含有10％胎牛血清(Invitrogen)、100U/ml青霉素和100μg/ml硫酸链霉素的Dulbecco’s MEM(D-MEM：Invitrogen)。将COS1细胞在基因导入的前一天以1∶2的分流比接种在150-cm2培养瓶(Corning Coaster)中，将细胞在37℃下于5％CO2的培养箱中培养过夜。
分别地，向D-MEM培养基(Invitrogen)中加入DEAE葡聚糖(Pharmacia)和氯奎(SIGMA)以分别形成400μg/ml和100μM的终浓度，每13ml的溶液中以0.1μg/μl加入50μg表达载体(CMV-3xFLAGJFHE1dTM或CMV-3xFLAGJFHE2dTM)，然后进行培养。随后，吸除培养的COS 1细胞的上清液，向其中加入10ml PBS(-)(Nissui)，清洗细胞一次。在将PBS(-)吸除后，每150-cm2培养瓶向其中加入13ml的DEAE葡聚糖-DNA混合物，然后在5％CO2存在的情况下于37℃下温育4小时。
4小时后，吸除DEAE葡聚糖-DNA混合物，然后用10ml PBS清洗细胞一次。以每瓶50ml的量向其中加入CHO-SFM培养基(Invitrogen)，在5％CO2存在的情况下于37℃进行培养。4天后将培养上清液收集在50-ml离心管(Corning Coaster)中。在4℃下以6,000rpm(通过使用HITACHI RPR9-2转子)离心收集的上清液，然后通过0.2-μm过滤器(Whatman)过滤。
如下使用抗FLAG M2琼脂糖(SIGMA)来纯化培养上清液。向500ml培养上清液中加入抗FLAG M2琼脂糖，让反应在4℃下(在低温舱中)进行2小时，同时在转瓶中进行搅拌。2小时后，将上清液与抗FLAGM2琼脂糖的混合物转移至Econo-Column(BIO-RAD)，收集流过级分。然后，用10ml TBS(50mM Tris-HCl、150mM NaCl、pH7.4)清洗柱子2次。通过使用0.1M甘氨酸-HCl(pH3.5)洗脱6个级分(每一个级分1ml)。在洗脱后立即加入1M Tris-HCl(pH9.5)进行中和。将级分(各20μl)在还原条件下经历SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，使用考马斯亮蓝染色。结果，发现来源于JFH-1株的E1和E2蛋白被纯化。
3)E1和E2蛋白固定板的制备
用PBS洗脱来源于J6CF菌株的E1和E2蛋白以产生1μg/ml的两种蛋白的每一种蛋白。向免疫板(immunoplate)(NUNC)的孔中加入E1和E2蛋白混合物的溶液(50μl)，让板在4℃下放置过夜，从而使蛋白质固定在板上。除去蛋白质溶液，向每个孔中加入150μl Block Ace(Dainippon Pharmaceutical Co.，Ltd.)，然后将板在室温下经历封闭，进行4小时。
用PBS洗脱来源于JFH-1的E1和E2蛋白以产生1μg/ml的两种蛋白中的每一种蛋白。向免疫板(immunoplate)(NUNC)的孔中加入E1和E2蛋白混合物的溶液(50μl)，让板在4℃下放置过夜，从而使蛋白质固定在板上。除去蛋白质溶液，向每个孔中加入150μl Block Ace(Dainippon Pharmaceutical Co.，Ltd.)，然后将板在室温下经历封闭，进行4小时。
如下所述将这些板用于筛选杂交瘤的培养上清液中的抗HCV抗体。
4)使用J6/JFH-1-HCV颗粒抗原制备的杂交瘤的培养上清液的筛选
用含有0.1％Tween 20(SIGMA)的PBS清洗上述步骤3)中制备的已在其上固定了来源于J6CF株的E1和E2蛋白的板4次，向孔中加入50μl实施例6中获得的杂交瘤上清液样品，让反应在室温下进行1小时，同时用板混合器摇动板。在反应后，用含有0.1％Tween 20(SIGMA)的PBS清洗板4次，向各孔中加入50μl已用含有0.1％Tween 20的PBS稀释了5,000倍的HRP-标记的抗小鼠IgG抗体(AmershamBiosciences)，让反应在室温下进行1小时，同时摇动板。在反应后，用含有0.1％Tween 20(SIGMA)的PBS清洗板4次，使用针对过氧化物酶的显色试剂盒(Sumitomo Bakelite Co.，Ltd.)进行显色，使用Multi-Scan(Titer-Tech)测量450nm处的吸光率，并且选择阳性克隆。
然后，使用J6/JFH-1-HCV颗粒作为感染剂来评估对阳性克隆的培养上清液的HCV的感染的抑制活性。随后，将含有J6/JFH1-HCV颗粒的具有1×106ffu/ml的感染效价的溶液与等量的杂交瘤上清液混合，将混合物在37℃下培养1小时。此后，向已在前一天将Huh-7细胞以1×104个细胞/孔接种入其中的96孔多聚L赖氨酸涂铺的板(Corning 96孔透明平底多聚L赖氨酸包被的微量培养板，Corning)中加入J6/JFH-1-HCV颗粒与杂交瘤培养上清液的混合样品，在37℃下培养72小时。
在除去样品后，将板浸渍于冰冷的甲醇中以固定细胞。然后，通过空气干燥除去甲醇，使用含有0.3％
Figure GPA00001068520400371
-X 100(GE Healthcare)的Block
Figure GPA00001068520400372
(Dainippon Pharmaceutical Co.，Ltd.)透化细胞。使用克隆2H9抗HCV核心抗体(Wakita，T.等，Nat.Med.11：791-796，2005)和山羊抗小鼠IgG-Alexa488(Molecular Probes)检测HCV感染的细胞，在荧光显微镜(IX-70；Olympus)下计数HCV感染的细胞的数目。两个各自展示更少数目的感染细胞的样品被选择作为产生对HCV感染活性具有抑制作用的单克隆抗体的杂交瘤细胞。通过有限稀释克隆这些细胞系，获得克隆J6/1G11-25(登录号：FERM BP-10980)和J6/4D4-2(登录号：FERM BP-10981)。
5)使用JFH-1-HCV颗粒抗原制备的杂交瘤的培养上清液的筛选
用含有0.1％Tween 20(SIGMA)的PBS清洗上述步骤3)中制备的已在其上固定了来源于JFH-1株的E1和E2蛋白的板4次，向孔中加入50μl实施例6中获得的杂交瘤上清液样品，让反应在室温下进行1小时，同时用板混合器摇动板。在反应后，用含有0.1％Tween 20(SIGMA)的PBS清洗板4次，向各孔中加入50μl已用含有0.1％Tween20的PBS稀释了5,000倍的HRP-标记的抗小鼠IgG抗体(AmershamBiosciences)，同时摇动板。在反应后，用含有0.1％Tween 20(SIGMA)的PBS清洗板4次，使用针对过氧化物酶的显色试剂盒(SumitomoBakelite Co.，Ltd.)进行显色，使用Multi-Scan(Titer-Tech)测量450nm处的吸光率。从阳性克隆中选择4个克隆作为产生识别JFH-1株的E1和/或E2蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞系。然后，使用J6/JFH-1-HCV颗粒作为感染剂以与4)中相同的方式评估对阳性克隆的培养上清液的HCV感染的抑制活性。作为结果，获得阳性克隆JF/M1-4(登录号：FERM BP-10982)。阳性克隆JF/M1-4是产生识别JFH-1株的E1和/或E2蛋白的单克隆抗体和产生抑制J6/JFH-1-HCV感染的抗体的杂交瘤细胞系。
[实施例8]抑制HCV感染的单克隆抗体的分析
将实施例7中选择的3个杂交瘤细胞系：J6/1G11-25(登录号：FERMBP-10980)、J6/4D4-2(登录号：FERM BP-10981)和JF/M1-4(登录号：FERM BP-10982)从2007年7月19日起保藏于International PatentOrganism Depositary of the National Institute of Advanced IndustrialScience and Technology(Central 6，1-1-1 Higashi，Tsukuba，Ibaraki，305-8566，Japan)。
如下分析从此类杂交瘤细胞系产生的抑制HCV感染的单克隆抗体的性质。
1)抗体亚类
通过使用ImmunoPure Antibody Isotyping试剂盒(Pierce)分析阳性克隆的培养上清液来确定小鼠抗体亚类。作为克隆的同种型分析的结果，发现所有克隆具有μ-型H链和κ-型L链。因此，发现这些克隆为IgM亚类。
2)分子量
将杂交瘤培养在无血清培养基中，将培养上清液经历使用50％硫酸铵的盐析，然后对PBS进行透析。之后，将所得产物在还原条件下经历SDS-聚丙烯酰胺凝胶电脉，用考马斯亮蓝染色，估计抗体的H链和L链的分子量。作为结果，发现来自所有克隆的抗体具有分子量为70kDa的H链和分子量为23kDa的L链。
3)单克隆抗体的对HCV感染的抑制活性的评估
从各杂交瘤细胞系的培养上清液纯化单克隆抗体。通过将适应于或培养在无血清培养基杂交瘤-SFM中的杂交瘤的上清液经历50％硫酸铵沉淀和对PBS的透析来进行抗体的纯化。通过使用纯化的小鼠IgMκ(Sigma)作为标准和使用考马斯染色进行SDS-PAGE来测定纯化的抗体样品的浓度。
以与上所述方式相同的方式评估所制备的纯化的来源于杂交瘤细胞系的单克隆抗体的对HCV感染的抑制活性。即，向细胞加入抗体和感染性HCV颗粒，进行温育，测量感染细胞中HCV RNA的浓度，分析细胞中HCV RNA的量。由于细胞中HCV RNA是从感染性HCV颗粒复制而来的，因此如果感染被单克隆抗体抑制，则细胞中HCV RNA的量应当减少。
特别地，将纯化的单克隆抗体各自与感染性HCV颗粒(J6/JFH-1-HCV颗粒)混合以使单克隆抗体成为10μg/ml的混合物以及感染性HCV颗粒达到107个拷贝/ml的混合物，让所得的产物在室温下放置1小时。弃去用于已在前一天以4×104个细胞/孔接种于24孔板并且在其中培养的Huh-7细胞的培养基，以200μl/孔向其中加入J6/JFH-1-HCV颗粒和纯化的单克隆抗体的混合物。将细胞在37℃下温育3小时，弃去含有病毒颗粒的溶液，用PBS清洗孔一次。加入新鲜培养基，进行培养2天，弃去培养基，用PBS清洗孔一次，使用Trizol试剂(Invitrogen)提取RNA。测定提取的RNA中含有的HCV RNA的拷贝。根据Takeuchi等(Gastroenterology，1999，116，pp.636-42.)的方法测定RNA拷贝数目。
图4显示评估纯化的来源于杂交瘤细胞系J6/1G11-25、J6/4D4-2和JF/M1-4的单克隆抗体(分别称为J6/1G11-25单克隆抗体、J6/4D4-2单克隆抗体和JF/M 1-4单克隆抗体)和对照抗体(人IgG)对J6/JFH-1-HCV感染的抑制活性的结果。同样地，图5显示评估纯化的来源于杂交瘤细胞系J6/JFH-1-HCV的单克隆抗体和对照抗体对J6/JFH-1-HCV感染的抑制活性的结果。如图4和图5中所示，除了对照抗体外的所有抗体显示抑制HCV感染的活性。
[实施例9]JF/M1-4单克隆抗体的表位的分析
关于JFH-1株的E1蛋白的氨基酸1至162(SEQ ID NO：25)和JFH-1株的E2蛋白的氨基酸1至337(SEQ ID NO：26)，合成含有具有10个连续氨基酸的氨基酸序列的肽，所述氨基酸序列被设计为各自从N端偏移3个氨基酸。对肽的N末端进行生物素化，C末端是甘氨酰胺(委托JPT合成肽)。
将合成肽溶解于DMSO中，然后以0.01nmol/μl的浓度溶解于PBS中。向链霉抗生物素蛋白涂铺的板(Nunc)的孔中加入肽溶液(50μl)，让反应在室温下进行1小时。然后，弃去肽溶液，以200μl/孔加入BlockingOne(Nacalai Tesque)，让板在室温下静置5小时。弃去Blocking One溶液，用150μl/孔的含有0.05％Tween 20的PBS(pH7.2)清洗板4次，以50μl/孔加入用含有0.05％Tween 20的PBS(pH7.2)稀释的1μg/ml的JF/M1-4单克隆抗体，让反应在室温下进行1小时。然后，弃去抗体溶液，用150μl/孔的含有0.05％Tween 2的PBS(pH7.2)清洗板5次，加入50μl/孔的用含有0.05％Tween 20的PBS稀释5,000倍的HRP-标记的抗小鼠IgG山羊抗体(GE Healthcare)，让反应在室温下进行1小时。在反应后，弃去抗体溶液，用150μl/孔的含有0.05％Tween20的PBS(pH7.2)清洗板5次。在清洗后，使用针对HRP的显色试剂盒(Sumitomo Bakelite Co.，Ltd.)检测结合至肽的抗体。
图6A显示JF/M1-4单克隆抗体对来源于JFH-1株的E1蛋白的表位(肽编号1至52)的结合强度，所述结合强度用如在OD 450nm处测定的抗体水平来表示。图6B显示JF/M1-4单克隆抗体对来源于JFH-1株的E2蛋白的肽(肽编号1至110)的结合强度，所述结合强度用如在OD 450nm处测定的抗体水平来表示。当在OD 450nm处的测量值(即，图6A或6B中沿着垂直轴的值)为高时，JF/M1-4单克隆抗体对肽的结合强度高，这表示抗体识别表位。
作为结果，JF/M1-4单克隆抗体不识别来源于JFH-1株的E1蛋白的任何肽(图6A)但识别来源于JFH-1株的E2蛋白的一些肽(图6B)。特别强的表位是LVHYPYRLWH(SEQ ID NO：18；图6B中的肽编号77)，与所述强肽重叠的肽WLTPKCLVHY(SEQ ID NO：19；p图6B中的肽编号75)、PKCLVHYPYR(SEQ ID NO：20；图6B中的肽编号76)和YPYRLWHYPC(SEQ ID NO：21；图6B中的肽编号78)是弱表位。此外，肽NFTIFKIRMY(SEQ ID NO：22；图6B中的肽编号82)和IFKIRMYVCG(SEQ ID NO：23；图6B中的肽编号83)被鉴定为弱表位。
因此，发现JF/M1-4单克隆抗体能够识别JFH-1株的E2蛋白内的包含强表位的WLTPKCLVHYPYRLWHYPC(SEQ ID NO：24)为表位。
[实施例10]J6/1G11-25单克隆抗体和J6/4D4-2单克隆抗体对J6/JFH-1-HCV颗粒的表位的分析
关于J6CF株的E1蛋白的氨基酸1至162(SEQ ID NO：27)和J6CF株的E2蛋白的氨基酸1至337(SEQ ID NO：28)，合成含有具有10个连续氨基酸的氨基酸序列的肽，所述氨基酸序列被设计为各自从N端偏移3个氨基酸。对肽的N末端进行生物素化，C末端是甘氨酰胺(委托JPT合成肽)。
将合成的肽溶解于DMSO中，然后以0.01nmol/μl的浓度溶解于PBS中。向链霉抗生物素蛋白涂铺的板(Nunc)的孔中加入肽溶液(50μl)，让反应在室温下进行1小时。然后，弃去肽溶液，以200μl/孔加入Blocking One(Nacalai Tesque)，让板在室温下静置5小时。弃去Blocking One溶液，用150μl/孔的含有0.05％Tween 20的PBS(pH7.2)清洗板4次，以50μl/孔加入用含有0.05％Tween 20的PBS(pH7.2)稀释的1μg/ml的J6/1G11-25或J6/4D4-2单克隆抗体，让反应在室温下进行1小时。然后，弃去抗体溶液，用150μl/孔的含有0.05％Tween2的PBS(pH7.2)清洗板5次，加入50μl/孔的用含有0.05％Tween 20的PBS稀释5,000倍的HRP-标记的抗小鼠IgG山羊抗体(GEHealthcare)，让反应在室温下进行1小时。在反应后，弃去抗体溶液，用150μl/孔的含有0.05％Tween 20的PBS(pH7.2)清洗板5次。然后，借助于针对HRP的显色试剂盒(Sumitomo Bakelite Co.，Ltd.)，使用分光光度计(在OD 450nm)检测结合至肽的抗体。
图7A显示J6/1G11-25单克隆抗体对来源于J6CF株的E1蛋白的表位(肽编号1至52)的结合强度。图7B显示J6/1G11-25单克隆抗体对来源于J6CF株的E2蛋白的肽(肽编号1至110)的结合强度。当在OD450nm处的测量值(即，图7A或7B中沿着垂直轴的值)高时，J6/1G11-25单克隆抗体对肽的结合强度高，这表示抗体特异性识别表位。
作为结果，J6/1G11-25单克隆抗体不识别来源于J6CF的E1蛋白的任何肽(图7A)但识别来源于J6CF株的E2蛋白的一些肽(图7B)。由J6/1G11-25单克隆抗体识别的肽是NVTNPEDMRP(SEQ ID NO：29；图7B中的肽编号32)和与其重叠的NPEDMRPYCW(SEQ ID NO：30；图7B中的肽编号33)、和NYTIFKIRMY(SEQ ID NO：31；图7B中的肽编号82)和与其重叠的IFKIRMYVGG(SEQ ID NO：32；图7B中的肽编号83)。
图8A显示J6/4D4-2单克隆抗体对来源于J6CF株的E1蛋白的表位(肽编号1至52)的结合强度。图8B显示J6/4D4-2单克隆抗体对来源于J6CF株的E2蛋白的肽(肽编号1至110)的结合强度。当在OD 450nm处的测量值(即，图8A或8B中沿着垂直轴的值)高时，J6/4D4-2单克隆抗体对肽的结合强度高，这表示抗体特异性识别肽。
作为结果，J6/4D4-2单克隆抗体识别来源于J6CF的E1蛋白的一些肽和来源于J6CF株的E2蛋白的一些肽，如图8中所示的。E1来源的强肽是FIVSPQHHWF(SEQ ID NO：33；图8A中的肽编号34)，与所述强肽重叠的SPQHHWFVQD(SEQ ID NO：34；图8A中的肽编号35)和HHWFVQDCNC(SEQ ID NO：35；图8A中的肽编号36)是弱表位。另一个强表位是MAWDMMMNWS(SEQ ID NO：36；图8A中的肽编号43)。
E2-来源的强表位是LIDYPYRLWH(SEQ ID NO：37；图8B中的肽编号77)和与该肽重叠的YPYRLWHYPC(SEQ ID NO：38；图8B中的肽编号78)，和DMRPYCWHYP(SEQ ID NO：39；图8B中的肽编号34)。与最后一个强肽重叠的NPEDMRPYCW(SEQ ID NO：40；图8B中的肽编号33)和PYCWHYPPRQ(SEQ ID NO：41；图8B中的肽编号35)是弱表位。
相对强的表位是NYTIFKIRMY(SEQ ID NO：31；图8B中的肽编号82)，与其重叠的IFKIRMYVGG(SEQ ID NO：32；图8B中的肽编号83)是弱表位。
此外，STRPPLGSWF(SEQ ID NO：42；图8B中的肽编号54)和GSWFGCTWMN(SEQ ID NO：43；图8B中的肽编号56)被鉴定为弱表位。
因此，发现J6/1G11-25单克隆抗体识别J6CF株的E2蛋白内的氨基酸序列NVTNPEDMPRPYCW(SEQ ID NO：44)和NYTIFKIRMYVGG(SEQ ID NO：45)为表位。
此外，还发现J6/4D4-2单克隆抗体识别J6CF株的E1蛋白内的氨基酸序列FIVSPQHHWFVQDCNC(SEQ ID NO：46)和MAWDMMMNWS(SEQ ID NO：36)为表位以及识别J6CF株的E2蛋白内的氨基酸序列LIDYPYRLWHYPC(SEQ ID NO：47)、NPEDMRPYCWHYPPRQ(SEQ ID NO：48)和NYTIFKIRMYVGG(SEQID NO：45)作为为表位。
[实施例11]编码JF/M1-4单克隆抗体的V区的DNA的克隆
如下克隆编码抗HCV颗粒的JF/M1-4小鼠单克隆抗体的可变区的DNA。
1)总RNA的制备
按照所附手册中所述的方法使用PureLink Micro-to-Midi(Invitrogen)从JF/M1-4杂交瘤细胞系制备总RNA。特别地，将2×108个杂交瘤株JF/M1-4细胞悬浮于2.4mlRNA裂解溶液，使用18计量注射针将细胞通过注射器数次来进行匀浆。离心所得的匀浆，向相同量的所得上清液中加入70％的乙醇，将混合物用于RNA旋转药筒(spincartridge)。通过加入清洗溶液充分清洗药筒，使用不含RNA酶的水洗脱RNA。
2)单链cDNA的合成
通过使用μ-型H链-和κ-型L链特异性引物，如下从上述1)中制备的总RNA合成链特异性引物、单链cDNA。
i)编码JF/M1-4单克隆抗体的μ-型H的cDNA的合成
向5μg RNA中加入50pmol的μ-型H链特异性引物mCHm-as(SEQ ID NO：49；5’-AGGCTTACTAGTAGCTGGAATGGGCACATGCAGATC-3’)以进行退火，向其中加入5μl 0.1M DTT、1.25μl 20mM dNTP溶液和10μl SuperScriptII提供的5x RT缓冲液，向其中加入蒸馏水(DW)以使终体积达到49μl。
然后，加入1μl逆转录酶SuperScriptII(Invitrogen)，在42℃下进行反应30分钟，和在50℃下进行反应30分钟，然后将反应溶液直接用于下一步骤，即聚合酶链式反应(PCR)。
ii)编码JF/M1-4单克隆抗体的κ-型L链的cDNA的合成
向5μg RNA中加入50pmol的κ-型L链特异性引物mCK1-as(SEQ ID NO：50；5’-CATGTCTAGAACACTCATTCCTGTTGAAGCTCTTG-3’)以进行退火，向其中加入5μl 0.1M DTT、1.25μl 20mM dNTP溶液和10μl SuperScriptII提供的5x RT缓冲液，向其中加入蒸馏水(DW)以使终体积达到49μl。然后，加入1μl逆转录酶SuperScriptII(Invitrogen)，在42℃下进行反应30分钟，和在50℃下进行反应30分钟，然后将反应产物直接用于下一步骤，即聚合酶链式反应(PCR)。
3)通过PCR法进行的编码JF/M1-4单克隆抗体的可变区的基因的扩增
利用GeneAmp(R)PCR System 9700(Applied Biosystems)，使用Advantage GC2DNA polymerase试剂盒(TAKARA)进行PCR。
i)编码小鼠H链V区的cDNA的扩增
按照所附手册中描述的条件使用小鼠Ig引物组(69831-3，Novagen)进行PCR。
特别地，使用试剂盒提供的MuIgVH5′-A至MuIgVH5′-F引物(与小鼠H链的前导序列杂交的)和MuIgMVH3′-1引物(与小鼠μ-型H链C区杂交的)进行PCR。
向5μl上面制备的因合成成编码μ-型H链的单链cDNA而产生的反应混合物中加入10μl试剂盒提供的5x PCR缓冲液、10μl GCMelt、4μl 2.5mM dNTP溶液、1.25个单位的Advantage GC2DNA聚合酶混合物(TAKARA)、1μl 10pmol/μl MuIgVH5′引物和1μl 5pmol/μl MuIgMVH3′-1引物。再加入蒸馏水(DW)以使终体积达到50μl。按如下顺序在94℃下温育PCR溶液(50μl)进行4分钟，然后在94℃下加热1分钟，在50℃(在MuIgVH5′-A和MuIgVH5′-B的情况下)或60℃(在MuIgVH5′-C至MuIgVH5′-F的情况下)进行1分钟，在72℃下进行2分钟。重复该热循环40次，然后将反应混合物在72℃下再温育6分钟。
ii)编码小鼠L链V区的基因的扩增
按照所附手册中所述的条件使用小鼠Ig引物组(69831-3，Novagen)进行PCR。
特别地，使用试剂盒提供的MuIgκVL5′-A至MuIgκVL5′引物(与小鼠κ-型L链的前导序列杂交的)和MuIgκVL3′-1引物(与小鼠κ-型L链C区杂交的)进行PCR。
向5μl上面制备的因合成编码κ-型L链的单链cDNA而产生的反应混合物中加入10μl试剂盒提供的5x PCR缓冲液、10μl GC Melt、4μl 2.5mM dNTP溶液、1.25个单位的Advantage GC2DNA聚合酶混合物(TAKARA)、1μl 10pmol/μl MuIgκVL 5′引物和1μl 5pmol/μl MuIg κVL3′-1引物。再加入蒸馏水(DW)以使终体积达到50μl。按如下顺序在94℃下温育PCR溶液(50μl)进行4分钟，然后在94℃下加热1分钟，在50℃(在MuIgVL5′-A和MuIgVL5′-B的情况下)或60℃(在MuIgVL5′-C至MuIgVL5′-F的情况下)进行1分钟，在72℃下进行2分钟。重复该热循环40次，然后将反应混合物在72℃下再温育6分钟。
4)PCR产物的纯化和其至质粒载体的克隆
通过琼脂糖凝胶电泳分离如上所述扩增的DNA片段PCR。使用GeneElute(Sigma)纯化长度为大约450bp的DNA片段。使用TOPO TACloning试剂盒(Invitrogen)克隆DNA片段。加入试剂盒提供的pCR-TOPO载体、DNA片段和试剂盒提供的盐溶液，让所得物在室温下静置5分钟，向大肠杆菌Mach1(Invitrogen)的感受态细胞中加入一部分反应溶液。将大肠杆菌感受态细胞置于冰上进行30分钟，然后于42℃下加热30秒，再置于冰上进行1分钟。向其中加入SOC培养基(室温)，将细胞在37℃下培养1小时，然后将其接种在琼脂培养基上，然后在37℃下培养过夜。从所得的转化株制备质粒DNA，按照常规技术测定克隆的DNA的核苷酸序列。
5)编码JF/M1-4单克隆抗体的V区的cDNA的核酸序列的分析
如下分析克隆在质粒中的DNA，在上述步骤4)中确定了其核苷酸序列(其为编码JF/M1-4小鼠单克隆抗体的H链V区和L链V区的cDNA)。
i)编码小鼠H链V区的cDNA的核酸序列的分析
发现许多所得的克隆中克隆的H链V区的核酸序列除了小鼠H链前导序列的区域外都相同。这表明复数个所测试的克隆来源于使用不同的编码小鼠H链前导序列的引物的混合物通过PCR获得的独立的分离株。此外，通过就根据它们的核酸序列推导的编码的氨基酸序列搜索数据库，推导了来自JF/M1-4小鼠单克隆抗体的H链V区的从构架1至J区段(构架4)的区域的序列(SEQ ID NOs：55至61)。核酸序列和由其确定的氨基酸序列分别示于序列表的SEQ ID NOs：51和52中。此外，从氨基酸序列推导的CDR1至CDR3示于图9中。已显示JF/M1-4小鼠单克隆抗体的H链V区(核酸序列：SEQ ID NO：51；氨基酸序列：SEQ ID NO：52)在抗体对表位(即，WLTPKCLVHYPYRLWHYPC(SEQID NO：24)或其含有10或更多个连续氨基酸残基的部分)的识别起着重要作用。
ii)编码小鼠L链V区的cDNA的核酸序列的分析
除了小鼠L链的前导序列外，发现许多所得的克隆中克隆的L链的V区的核酸序列是相同的。这表明复数个所检测的克隆来源于使用不同的编码小鼠L链前导序列的引物的混合物通过PCR获得的独立的分离株。此外，通过就根据它们的核酸序列推导的编码的氨基酸序列搜索数据库，可推导出JF/M 1-4小鼠单克隆抗体的L链V区的从构架1至J区段(构架4)的区域的序列(SEQ ID NO：62至68)。核酸序列和由其确定的氨基酸序列分别示于序列表的SEQ ID NOs：53和54中。此外，从氨基酸序列推导的CDR1至CDR3示于图10中。已显示JF/M1-4小鼠单克隆抗体的L链V区(核酸序列：SEQ ID NO：53；氨基酸序列：SEQ ID NO：54)在抗体对表位(即，WLTPKCLVHYPYRLWHYPC(SEQID NO：24)或其含有10或更多个连续氨基酸残基的部分)的识别起着重要作用。
工业适用性
根据本发明的具有对HCV感染的抑制活性的抗体可用作HCV感染的治疗性或预防性药物。
序列表自由正文
SEQ ID NO：1公开了克隆入pJFH-1的HCV基因组长度的cDNA。
SEQ ID NO：2公开了克隆入pJ6/JFH-1的嵌合HCV基因组长度的cDNA序列。
SEQ ID NO：3公开了克隆入pTH/JFH-1的HCV基因组长度的cDNA序列。
SEQ ID NO：4公开了引物(JFH-1-A)的序列。
SEQ ID NO：5公开了引物(JFH-1-B)的序列。
SEQ ID NO：6公开了引物(TH-C)的序列。
SEQ ID NO：7公开了引物(TH-D)的序列。
SEQ ID NO：8公开了引物(JFH-1-E)的序列。
SEQ ID NO：9公开了引物(JFH-1-F)的序列。
SEQ ID NO：10公开了引物(J6E1dTM-s)的序列。
SEQ ID NO：11公开了引物(J6E1dTM-as)的序列。
SEQ ID NO：12公开了引物(J6E2dTM-s)的序列。
SEQ ID NO：13公开了引物(J6E2dTM-as)的序列。
SEQ ID NO：14公开了引物(JFHE1dTM-s)的序列。
SEQ ID NO：15公开了引物(JFHE1dTM-as)的序列。
SEQ ID NO：16公开了引物(JFHE2dTM-s)的序列。
SEQ ID NO：17公开了引物(JFHE2dTM-as)的序列。
SEQ ID NOs：18至24公开了合成肽的序列。
SEQ ID NO：25公开了包含JFH-1株的E1蛋白的氨基酸1至162的氨基酸序列。
SEQ ID NO：26公开了包含JFH-1株的E2蛋白的氨基酸1至337的氨基酸序列。
SEQ ID NO：27公开了包含J6CF株的E1蛋白的氨基酸1至162的氨基酸序列。
SEQ ID NO：28公开了包含J6CF株的E2蛋白的氨基酸1至337的氨基酸序列。
SEQ ID NOs：29至48公开了合成肽的序列。
SEQ ID NO：49公开了引物(mCHm-as)的序列。
SEQ ID NO：50公开了引物(mCK1-as)的序列。
SEQ ID NO：51公开了编码JF/M1-4单克隆抗体的H链V区(即，重链可变区)的基因的核苷酸序列。
SEQ ID NO：52公开了编码JF/M1-4单克隆抗体的H链V区(即，重链可变区)的基因的氨基酸序列。
SEQ ID NO：53公开了编码JF/M1-4单克隆抗体的L链V区(即，轻链可变区)的基因的核苷酸序列。
SEQ ID NO：54公开了编码JF/M1-4单克隆抗体的L链V区(即，轻链可变区)的基因的氨基酸序列。
SEQ ID NO：55公开了JF/M1-4单克隆抗体的H链V区的构架1的氨基酸序列。
SEQ ID NO：56公开了JF/M1-4单克隆抗体的H链V区的CDR1的氨基酸序列。
SEQ ID NO：57公开了JF/M1-4单克隆抗体的H链V区的构架2的氨基酸序列。
SEQ ID NO：58公开了JF/M1-4单克隆抗体的H链V区的CDR2的氨基酸序列。
SEQ ID NO：59公开了JF/M1-4单克隆抗体的H链V区的构架3的氨基酸序列。
SEQ ID NO：60公开了JF/M1-4单克隆抗体的H链V区的CDR3的氨基酸序列。
SEQ ID NO：61公开了JF/M1-4单克隆抗体的H链V区的构架4(即，J区段)的氨基酸序列。
SEQ ID NO：62公开了JF/M1-4单克隆抗体的L链V区的构架1的氨基酸序列。
SEQ ID NO：63公开了JF/M1-4单克隆抗体的L链V区的CDR1的氨基酸序列。
SEQ ID NO：64公开了JF/M1-4单克隆抗体的L链V区的构架2的氨基酸序列。
SEQ ID NO：65公开了JF/M1-4单克隆抗体的L链V区的CDR2的氨基酸序列。
SEQ ID NO：66公开了JF/M1-4单克隆抗体的L链V区的构架3的氨基酸序列。
SEQ ID NO：67公开了JF/M1-4单克隆抗体的L链V区的CDR3的氨基酸序列。
SEQ ID NO：68公开了JF/M1-4单克隆抗体的L链V区的构架4(即，J区段)的氨基酸序列。
序列表
<110>Japan as represented by Director-General of National Institute of Infectious DiseasesToray Industries Inc.
 
<120>对丙型肝炎病毒(HCV)感染具有抑制活性的抗体和其用途
 
<130>PH-3644-PCT
 
<140>PCT/JP2008/063424
<141>2008-07-25
 
<150>JP 2007-193413
<151>2007-07-25
 
<160>68
 
<170>PatentIn version 3.4
 
<210>1
<211>9678
<212>DNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>pJFH-1中的克隆HCV基因组cDNA
 
<220>
<223>发明人：Wakita，Takaji
发明人：Suzuki，Tetsuro
发明人：Morikawa，Kenichi
发明人：Omi，Noriaki
发明人：Nakamura，Noriko
发明人：Akazawa，Daisuke
 
<400>1
acctgcccct aataggggcg acactccgcc atgaatcact cccctgtgag gaactactgt   60
cttcacgcag aaagcgccta gccatggcgt tagtatgagt gtcgtacagc ctccaggccc  120
ccccctcccg ggagagccat agtggtctgc ggaaccggtg agtacaccgg aattgccggg  180
aagactgggt cctttcttgg ataaacccac tctatgcccg gccatttggg cgtgcccccg  240
caagactgct agccgagtag cgttgggttg cgaaaggcct tgtggtactg cctgataggg  300
cgcttgcgag tgccccggga ggtctcgtag accgtgcacc atgagcacaa atcctaaacc  360
tcaaagaaaa accaaaagaa acaccaaccg tcgcccagaa gacgttaagt tcccgggcgg  420
cggccagatc gttggcggag tatacttgtt gccgcgcagg ggccccaggt tgggtgtgcg  480
cacgacaagg aaaacttcgg agcggtccca gccacgtggg agacgccagc ccatccccaa  540
agatcggcgc tccactggca aggcctgggg aaaaccaggt cgcccctggc ccctatatgg  600
gaatgaggga ctcggctggg caggatggct cctgtccccc cgaggctctc gcccctcctg  660
gggccccact gacccccggc ataggtcgcg caacgtgggt aaagtcatcg acaccctaac  720
gtgtggcttt gccgacctca tggggtacat ccccgtcgta ggcgccccgc ttagtggcgc  780
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tccggtctct gctgcccagg tgaagaatac cagtagcagc tacatggtga ccaatgactg  960
ctccaagtac agcatcactt ggcagctcga ggctgcggtt ctccacgtcc ccgggtgcgt  1020
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tgtgcggcag cccggtgccc tcacgcaggg tctgcggacg cacatcgata tggttgtgat  1140
gtccgccacc ttctgctctg ctctctacgt gggggacctc tgtggcgggg tgatgctcgc  1200
ggcccaggtg ttcatcgtct cgccgcagta ccactggttt gtgcaagaat gcaattgctc  1260
catctaccct ggcaccatca ctggacaccg catggcatgg gacatgatga tgaactggtc  1320
gcccacggcc accatgatcc tggcgtacgt gatgcgcgtc cccgaggtca tcatagacat  1380
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gtgggcgaag gtcattgtca tccttctgct ggccgctggg gtggacgcgg gcaccaccac  1500
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gaattgcaat gactccttga acaccggctt tctcgcggcc ttgttctaca ccaaccgctt  1680
taactcgtca gggtgtccag ggcgcctgtc cgcctgccgc aacatcgagg ctttccggat  1740
agggtggggc accctacagt acgaggataa tgtcaccaat ccagaggata tgaggccgta  1800
ctgctggcac taccccccaa agccgtgtgg cgtagtcccc gcgaggtctg tgtgtggccc  1860
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cacctacaca tggggagaga atgagacaga tgtcttccta ctgaacagca cccgaccgcc  1980
gcagggctca tggttcggct gcacgtggat gaactccact ggtttcacca agacttgtgg  2040
cgcgccacct tgccgcacca gagctgactt caacgccagc acggacttgt tgtgccctac  2100
ggattgtttt aggaagcatc ctgatgccac ttatattaag tgtggttctg ggccctggct  2160
cacaccaaag tgcctggtcc actaccctta cagactctgg cattacccct gcacagtcaa  2220
ttttaccatc ttcaagataa gaatgtatgt agggggggtt gagcacaggc tcacggccgc  2280
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tcctctgttg cactctacca cggaatgggc catcctgccc tgcacctact cagacttacc  2400
cgctttgtca actggtcttc tccaccttca ccagaacatc gtggacgtac aatacatgta  2460
tggcctctca cctgctatca caaaatacgt cgttcgatgg gagtgggtgg tactcttatt  2520
cctgctctta gcggacgcca gagtctgcgc ctgcttgtgg atgctcatct tgttgggcca  2580
ggccgaagca gcattggaga agttggtcgt cttgcacgct gcgagtgcgg ctaactgcca  2640
tggcctccta tattttgcca tcttcttcgt ggcagcttgg cacatcaggg gtcgggtggt  2700
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gtggtggttg tgctatctcc tgaccctggg ggaagccatg attcaggagt gggtaccacc  2940
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gggctgcgct agcggcgcct atgacatcat catagtcgat gaatgccacg ctgtggatgc  4320
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cttcctactc cccgctcggt agagcggcac acactaggta cactccatag ctaactgttc 9480
cttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt ttttcttttt tttttttttc 9540
cctctttctt cccttctcat cttattctac tttctttctt ggtggctcca tcttagccct 9600
agtcacggct agctgtgaaa ggtccgtgag ccgcatgact gcagagagtg ccgtaactgg 9660
tctctctgca gatcatgt                                               9678
 
<210>2
<211>9683
<212>DNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>pJ6/JFH-1中的克隆HCV基因组cDNA
 
<400>2
acccgcccct aataggggcg acactccgcc atgaatcact cccctgtgag gaactactgt  60
cttcacgcag aaagcgtcta gccatggcgt tagtatgagt gtcgtacagc ctccaggccc  120
ccccctcccg ggagagccat agtggtctgc ggaaccggtg agtacaccgg aattgccggg  180
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cgcgacaagg aagacttcgg agcggtccca gccacgtgga aggcgccagc ccatccctaa  540
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caactcgtca ggatgtcccg aacgcatgtc cgcctgccgc agtatcgagg ccttccgggt  1740
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gaccgtgatg accggggagg ccatcacgta ctccacatat ggcaaatttc tcgccgatgg  4260
gggctgcgct agcggcgcct atgacatcat catatgcgat gaatgccacg ctgtggatgc  4320
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tctctctgca gatcatgtct aga                                          9683
 
<210>3
<211>9669
<212>DNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>pTH/JFH-1中的克隆HCV基因组cDNA
 
<400>3
acctgcccct aataggggcg acactccgcc atgaatcact cccctgtgag gaactactgt  60
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cacgcgctgc ccttgcggcg ccaacatctc tggcaatgtc cgcctgggct ctatgaggat 6480
cacagggcct aaaacctgca tgaacacctg gcaggggacc tttcctatca attgctacac 6540
ggagggccag tgcgcgccga aaccccccac gaactacaag accgccatct ggagggtggc 6600
ggcctcggag tacgcggagg tgacgcagca tgggtcgtac tcctatgtaa caggactgac 6660
cactgacaat ctgaaaattc cttgccaact accttctcca gagtttttct cctgggtgga 6720
cggtgtgcag atccataggt ttgcacccac accaaagccg tttttccggg atgaggtctc  6780
gttctgcgtt gggcttaatt cctatgctgt cgggtcccag cttccctgtg aacctgagcc  6840
cgacgcagac gtattgaggt ccatgctaac agatccgccc cacatcacgg cggagactgc  6900
ggcgcggcgc ttggcacggg gatcacctcc atctgaggcg agctcctcag tgagccagct  6960
atcagcaccg tcgctgcggg ccacctgcac cacccacagc aacacctatg acgtggacat  7020
ggtcgatgcc aacctgctca tggagggcgg tgtggctcag acagagcctg agtccagggt  7080
gcccgttctg gactttctcg agccaatggc cgaggaagag agcgaccttg agccctcaat  7140
accatcggag tgcatgctcc ccaggagcgg gtttccacgg gccttaccgg cttgggcacg  7200
gcctgactac aacccgccgc tcgtggaatc gtggaggagg ccagattacc aaccgcccac  7260
cgttgctggt tgtgctctcc ccccccccaa gaaggccccg acgcctcccc caaggagacg  7320
ccggacagtg ggtctgagcg agagcaccat atcagaagcc ctccagcaac tggccatcaa  7380
gacctttggc cagcccccct cgagcggtga tgcaggctcg tccacggggg cgggcgccgc  7440
cgaatccggc ggtccgacgt cccctggtga gccggccccc tcagagacag gttccgcctc  7500
ctctatgccc cccctcgagg gggagcctgg agatccggac ctggagtctg atcaggtaga  7560
gcttcaacct cccccccagg gggggggggt agctcccggt tcgggctcgg ggtcttggtc  7620
tacttgctcc gaggaggacg ataccaccgt gtgctgctcc atgtcatact cctggaccgg  7680
ggctctaata actccctgta gccccgaaga ggaaaagttg ccaatcaacc ctttgagtaa  7740
ctcgctgttg cgataccata acaaggtgta ctgtacaaca tcaaagagcg cctcacagag  7800
ggctaaaaag gtaacttttg acaggacgca agtgctcgac gcccattatg actcagtctt  7860
aaaggacatc aagctagcgg cttccaaggt cagcgcaagg ctcctcacct tggaggaggc  7920
gtgccagttg actccacccc attctgcaag atccaagtat ggattcgggg ccaaggaggt  7980
ccgcagcttg tccgggaggg ccgttaacca catcaagtcc gtgtggaagg acctcctgga  8040
agacccacaa acaccaattc ccacaaccat catggccaaa aatgaggtgt tctgcgtgga  8100
ccccgccaag gggggtaaga aaccagctcg cctcatcgtt taccctgacc tcggcgtccg  8160
ggtctgcgag aaaatggccc tctatgacat tacacaaaag cttcctcagg cggtaatggg  8220
agcttcctat ggcttccagt actcccctgc ccaacgggtg gagtatctct tgaaagcatg  8280
ggcggaaaag aaggacccca tgggtttttc gtatgatacc cgatgcttcg actcaaccgt  8340
cactgagaga gacatcagga ccgaggagtc catataccag gcctgctccc tgcccgagga  8400
ggcccgcact gccatacact cgctgactga gagactttac gtaggagggc ccatgttcaa  8460
cagcaagggt caaacctgcg gttacagacg ttgccgcgcc agcggggtgc taaccactag  8520
catgggtaac accatcacat gctatgtgaa agccctagcg gcctgcaagg ctgcggggat  8580
agttgcgccc acaatgctgg tatgcggcga tgacctagta gtcatctcag aaagccaggg  8640
gactgaggag gacgagcgga acctgagagc cttcacggag gccatgacca ggtactctgc  8700
ccctcctggt gatcccccca gaccggaata tgacctggag ctaataacat cctgttcctc  8760
aaatgtgtct gtggcgttgg gcccgcgggg ccgccgcaga tactacctga ccagagaccc  8820
aaccactcca ctcgcccggg ctgcctggga aacagttaga cactccccta tcaattcatg  8880
gctgggaaac atcatccagt atgctccaac catatgggtt cgcatggtcc taatgacaca  8940
cttcttctcc attctcatgg tccaagacac cctggaccag aacctcaact ttgagatgta  9000
tggatcagta tactccgtga atcctttgga ccttccagcc ataattgaga ggttacacgg  9060
gcttgacgcc ttttctatgc acacatactc tcaccacgaa ctgacgcggg tggcttcagc  9120
cctcagaaaa cttggggcgc cacccctcag ggtgtggaag agtcgggctc gcgcagtcag  9180
ggcgtccctc atctcccgtg gagggaaagc ggccgtttgc ggccgatatc tcttcaattg  9240
ggcggtgaag accaagctca aactcactcc attgccggag gcgcgcctac tggacttatc  9300
cagttggttc accgtcggcg ccggcggggg cgacattttt cacagcgtgt cgcgcgcccg  9360
accccgctca ttactcttcg gcctactcct acttttcgta ggggtaggcc tcttcctact  9420
ccccgctcgg tagagcggca cacactaggt acactccata gctaactgtt cctttttttt  9480
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttctttt tttttttttt ccctctttct  9540
tcccttctca tcttattcta ctttctttct tggtggctcc atcttagccc tagtcacggc  9600
tagctgtgaa aggtccgtga gccgcatgac tgcagagagt gccgtaactg gtctctctgc  9660
agatcatgt                                                          9669
 
<210>4
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>引物
 
<400>4
tgtaaaacga cggccagt                                                18
 
<210>5
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>引物
 
<400>5
ggtttaggat tcgtgctcat ggtgcacggt ctacgagacc    40
 
<210>6
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>引物
 
<400>6
ggtctcgtag accgtgcacc atgagcacga atcctaaacc    40
 
<210>7
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>引物
 
<400>7
agatagcaca accaccacag gagcttggcg aggaatgcct    40
 
<210>8
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>引物
 
<400>8
aggcattcct cgccaagctc ctgtggtggt tgtgctatct    40
 
<210>9
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>引物
 
<400>9
cagctaccga ggggttaagc                          20
 
<210>10
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>引物
 
<400>10
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<210>11
<211>32
<212>DNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>引物
 
<400>11
gctctagatt aatgagcccc gctaatgatg tc    32
 
<210>12
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>引物
 
<400>12
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<210>13
<211>32
<212>DNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>引物
 
<400>13
gctctagatt accatcggac gatgtatttt gt   32
 
<210>14
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>引物
 
<400>14
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<210>15
<211>32
<212>DNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>引物
 
<400>15
gctctagatt agtgagcccc gctaacgatg tc    32
 
<210>16
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>引物
 
<400>16
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<210>17
<211>32
<212>DNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>引物
 
<400>17
gctctagatt atgtgatagc aggtgagagg cc      32
 
<210>18
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>合成肽
 
<400>18
Leu Val His Tyr Pro Tyr Arg Leu Trp His
1        5              10
 
<210>19
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>合成肽
<400>19
 
Trp Leu Thr Pro Lys Cys Leu Val His Tyr
1        5         10
 
<210>20
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>合成肽
 
<400>20
Pro Lys Cys Leu Val His Tyr Pro Tyr Arg
1        5            10
 
<210>21
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>合成肽
 
<400>21
 
Tyr Pro Tyr Arg Leu Trp His Tyr Pro Cys
1         5           10
 
<210>22
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>合成肽
 
<400>22
Asn Phe Thr Ile Phe Lys Ile Arg Met Tyr
1        5              10
 
<210>23
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>合成肽
 
<400>23
Ile Phe Lys Ile Arg Met Tyr Val Cys Gly
1           5           10
 
<210>24
<211>19
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>合成肽
 
<400>24
 
Trp Leu Thr Pro Lys Cys Leu Val His Tyr Pro Tyr Arg Leu Trp His
1        5            10            15
Tyr Pro Cys
 
<210>25
<211>162
<212>PRT
<213>丙型肝炎病毒株JFH-1
 
<400>25
 
Ala Gln Val Lys Asn Thr Ser Ser Ser Tyr Met Val Thr Asn Asp Cys
1        5             10            15
Ser Asn Asp Ser Ile Thr Trp Gln Leu Glu Ala Ala Val Leu His Val
       20            25            30
Pro Gly Cys Val Pro Cys Glu Arg Val Gly Asn Thr Ser Arg Cys Trp
    35            40           45
Val Pro Val Ser Pro Asn Met Ala Val Arg Gln Pro Gly Ala Leu Thr
  50            55          60
Gln Gly Leu Arg Thr His Ile Asp Met Val Val Met Ser Ala Thr Phe
65           70            75           80
Cys Ser Ala Leu Tyr Val Gly Asp Leu Cys Gly Gly Val Met Leu Ala
         85           90           95
Ala Gln Val Phe Ile Val Ser Pro Gln Tyr His Trp Phe Val Gln Glu
       100           105           110
Cys Asn Cys Ser Ile Tyr Pro Gly Thr Ile Thr Gly His Arg Met Ala
    115           120            125
Trp Asp Met Met Met Asn Trp Ser Pro Thr Ala Thr Met Ile Leu Ala
  130          135          140
Tyr Val Met Arg Val Pro Glu Val Ile Ile Asp Ile Val Ser Gly Ala
145          150          155             160
His Trp
 
<210>26
<211>337
<212>PRT
<213>丙型肝炎病毒株JFH-1
 
<400>26
Gly Thr Thr Thr Val Gly Gly Ala Val Ala Arg Ser Thr Asn Val Ile
1         5           10            15
Ala Gly Val Phe Ser His Gly Pro Gln Gln Asn Ile Gln Leu Ile Asn
       20           25            30
Thr Asn Gly Ser Trp His Ile Asn Arg Thr Ala Leu Asn Cys Asn Asp
    35            40            45
Ser Leu Asn Thr Gly Phe Leu Ala Ala Leu Phe Tyr Thr Asn Arg Phe
   50          55           60
Asn Ser Ser Gly Cys Pro Gly Arg Leu Ser Ala Cys Arg Asn Ile Glu
65           70           75           80
Ala Phe Arg Ile Gly Trp Gly Thr Leu Gln Tyr Glu Asp Asn Val Thr
         85           90            95
Asn Pro Glu Asp Met Arg Pro Tyr Cys Trp His Tyr Pro Pro Lys Pro
      100           105           110
Cys Gly Val Val Pro Ala Arg Ser Val Cys Gly Pro Val Tyr Cys Phe
    115           120           125
Thr Pro Ser Pro Val Val Val Gly Thr Thr Asp Arg Arg Gly Val Pro
  130           135           140
Thr Tyr Thr Trp Gly Glu Asn Glu Thr Asp Val Phe Leu Leu Asn Ser
145           150           155           160
Thr Arg Pro Pro Gln Gly Ser Trp Phe Gly Cys Thr Trp Me tAsn Ser
         165           170           175
Thr Gly Phe Thr Lys Thr Cys Gly Ala Pro Pro Cys Arg Thr Arg Ala
      180           185           190
Asp Phe Asn Ala Ser Thr Asp Leu Leu Cys Pro Thr Asp Cys Phe Arg
    195           200           205
Lys His Pro Asp Ala Thr Tyr Ile Lys Cys Gly Ser Gly Pro Trp Leu
  210           215           220
Thr Pro Lys Cys Leu Val His Tyr Pro Tyr Arg Leu Trp His Tyr Pro
225           230           235           240
Cys Thr Val Asn Phe Thr Ile Phe Lys Ile Arg Met Tyr Val Gly Gly
         245           250           255
Val Glu His Asg Leu Thr Ala Ala Cys Asn Phe Thr Arg Gly Asp Arg
      260           265           270
Cys Asp Leu Glu Asp Arg Asp Arg Ser GlnLeu Ser Pro Leu Leu His
     275           280           285
Ser Thr Thr Glu Trp Ala Ile Leu Pro Cys Thr Tyr Ser Asp Leu Pro
  290           295           300
Ala Leu Ser Thr Gly Leu Leu His Leu His Gln Asn Ile Val Asp Val
305           310           315           320
Gln Tyr Met Tyr Gly Leu Ser Pro Ala Ile Thr Lys Tyr Val Val Arg
          325           330           335
Trp
 
<210>27
<211>162
<212>PRT
<213>丙型肝炎病毒株J6CF
 
<220>
<223>E1(1-162)
 
<400>27
Ala Glu Val Lys Asn Ile Ser Thr Gly Tyr Met Val Thr Asn Asp Cys
1        5             10            15
Thr Asn Asp Ser Ile Thr Trp Gln Leu Gln Ala Ala Val Leu His Val
      20             25            30
Pro Gly Cys Val Pro Cys Glu Lys Val Gly Asn Ala Ser Gln Cys Trp
     35            40          45
Ile Pro Val Ser Pro Asn Val Ala Val Gln Arg Pro Gly Ala Leu Thr
   50            55            60
Gln Gly Leu Arg Thr His Ile Asp Met Val Val Met Ser Ala Thr Leu
65           70           75           80
Cys Ser Ala Leu Tyr Val Gly Asp Leu Cys Gly Gly Val Met Leu Ala
         85           90           95
Ala Gln Met Phe Ile Val Ser Pro Gln His His Trp Phe Val Gln Asp
       100           105           110
Cys Asn Cys Ser Ile Tyr Pro Gly Thr Ile Thr Gly His Arg Met Ala
     115           120           125
Trp Asp Met Met Met Asn Trp Ser Pro Thr Ala Thr Met Ile Leu Ala
   130           135           140
Tyr Ala Met Arg Val Pro Glu Val Ile Ile Asp Ile Ile Ser Gly Ala
145           150           155           160
His Trp
 
<210>28
<211>337
<212>PRT
<213>丙型肝炎病毒株J6CF
 
<220>
<223>E2(1-337)
 
<400>28
Arg Thr His Thr Val Gly Gly Ser Ala Ala Gln Thr Thr Gly Arg Leu
1         5           10            15
Thr Ser Leu Phe Asp Met Gly Pro Arg Gln Lys Ile Gln Leu Val Asn
      20            25           30
Thr Asn Gly Ser Trp His Ile Asn Arg Thr Ala Leu Asn Cys Asn Asp
    35           40             45
Ser Leu His Thr Gly Phe Ile Ala Ser Leu Phe Tyr Thr His Ser Phe
  50            55             60
Asn Ser Ser Gly Cys Pro Glu Arg Met Ser Ala Cys Arg Ser Ile Glu
65           70           75           80
Ala Phe Arg Val Gly Trp Gly Ala Leu Gln Tyr Glu Asp Asn Val Thr
         85           90           95
Asn Pro Glu Asp Met Arg Pro Tyr Cys Trp His Tyr Pro Pro Arg Gln
      100           105           110
Cys Gly Val Val Ser Ala Lys Thr Val Cys Gly Pro Val Tyr Cys Phe
     115           120           125
Thr Pro Ser Pro Val Val Val Gly Thr Thr Asp Arg Leu Gly Ala Pro
  130           135           140
Thr Tyr Thr Trp Gly Glu Asn Glu Thr Asp Val Phe Leu Leu Asn Ser
145           150           155           160
Thr Arg Pro Pro Leu Gly Ser Trp Phe Gly Cys Thr Trp Met Asn Ser
         165           170           175
Ser Gly Tyr Thr Lys Thr Cys Gly Ala Pro Pro Cys Arg Thr Arg Ala
        180           185           190
Asp Phe Asn Ala Ser Thr Asp Leu Leu Cys Pro Thr Asp Cys Phe Arg
    195           200           205
Lys His Pro Asp Thr Thr Tyr Leu Lys Cys Gly Ser Gly Pro Trp Leu
  210           215           220
Thr Pro Arg Cys Leu Ile Asp Tyr Pro Tyr Arg Leu Trp His Tyr Pro
225           230           235           240
Cys Thr Val Asn Tyr Thr Ile Phe Lys Ile Arg Met Tyr Val Gly Gly
          245           250           255
Val Glu His Arg Leu Thr Ala Ala Cys Asn Phe Thr Arg Gly Asp Arg
      260           265           270
Cys Asn Leu Glu Asp Arg Asp Arg Ser Gln Leu Ser Pro Leu Leu His
    275           280           285
Ser Thr Thr Glu Trp Ala Ile Leu Pro Cys Ser Tyr Ser Asp Leu Pro
  290           295           300
Ala Leu Ser Thr Gly Leu Leu His Leu His Gln Asn Ile Val Asp Val
305           310           315           320
Gln Phe Met Tyr Gly Leu Ser Pro Ala Leu Thr Lys Tyr Ile Val Arg
         325           330           335
Trp
 
<210>29
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>合成肽
 
<400>29
 
Asn Val Thr Asn pro Glu Asp Met Arg Pro
1        5            10
 
<210>30
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>合成肽
 
<400>30
 
Asn Pro Glu Asp Met Arg Pro Tyr Cys Trp
1        5           10
<210>31
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>合成肽
 
<400>31
 
Asn Tyr Thr Ile Phe Lys Ile Arg MetTyr
1        5              10
 
<210>32
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>合成肽
 
<400>32
 
Ile Phe Lys Ile Arg Met Tyr Val Gly Gly
1          5            10
 
<210>33
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>合成肽
 
<400>33
 
Phe Ile Val Ser Pro Gln His His Trp Phe
1          5            10
 
<210>34
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>合成肽
 
<400>34
 
Ser Pro Gln His His Trp Phe Val Gln Asp
1         5             10
 
<210>35
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>合成肽
 
<400>35
 
His His Trp Phe Val Gln Asp Cys Asn Cys
1         5            10
 
<210>36
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>合成肽
 
<400>36
 
Met Ala Trp Asp Met Met Met Asn Trp Ser
1        5           10
 
<210>37
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>合成肽
 
<400>37
 
Leu Ile Asp Tyr Pro Tyr Arg Leu Trp His
1         5             10
 
<210>38
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>合成肽
 
<400>38
 
Tyr Pro Tyr Arg Leu Trp His Tyr Pro Cys
1         5           10
 
<210>39
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成肽
 
<400>39
 
Asp Met Arg Pro Tyr Cys Trp His Tyr Pro
1        5            10
 
<210>40
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>合成肽
 
<400>40
 
Asn Pro Glu Asp Met Arg Pro Tyr Cys Trp
1         5           10
 
<210>41
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>合成肽
 
<400>41
 
Pro Tyr Cys Trp His Tyr Pro Pro Arg Gln
1         5            10
 
<210>42
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>合成肽
 
<400>42
 
Ser Thr Arg Pro Pro Leu Gly Ser Trp Phe
1         5            10
 
<210>43
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>合成肽
 
<400>43
 
Gly Ser Trp Phe Gly Cys Thr Trp Met Asn
1         5            10
 
<210>44
<211>14
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>合成肽
 
<400>44
 
Asn Val Thr Asn Pro Glu Asp Met Pro Arg Pro Tyr Cys Trp
1        5            10
 
<210>45
<211>13
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>合成肽
 
<400>45
 
Asn Tyr Thr Ile Phe Lys Ile Arg Met Tyr Val Gly Gly
1        5              10
 
<210>46
<211>16
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>合成肽
 
<400>46
 
Phe Ile Val Ser Pro Gln His His Trp Phe Val Gln Asp Cys Asn Cys
1          5            10           15
 
<210>47
<211>13
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>合成肽
<400>47
 
Leu Ile Asp Tyr Pro Tyr Arg Leu Trp His Tyr Pro Cys
1         5             10
 
<210>48
<211>16
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>合成肽
 
<400>48
 
Asn Pro Glu Asp Met Arg Pro Tyr Cys Trp His Tyr Pro Pro Arg Gln
1        5            10           15
 
<210>49
<211>36
<212>DNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>引物
 
<400>49
aggcttacta gtagctggaa tgggcacatg cagatc                           36
 
<210>50
<211>35
<212>DNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>引物
 
<400>50
catgtctaga acactcattc ctgttgaagc tcttg                            35
 
<210>51
<211>360
<212>DNA
<213>小鼠(Mus musculus)
 
<400>51
gaggttcagc tccagcagtc tgggactgtg ctggcaaggc ctggggcttc agtgaagatg  60
tcctgcaagg cttctggcta cacctttacc agctactgga tgcactgggt aaaacagagg  120
cctggacagg gtctggaatg gattggcgct atttatcctg gaaatagtga tactagctac  180
aaccagaagt tcaagggcaa ggccaaactg actgcagtca catccaccag cactgcctac  240
atggagctca gcagcctgac aaatgaggac tctgcggtct attactgtac aagagatggt  300
tactacaggg gaaactactt tgactactgg ggccaaggca ccactctcac agtctcctca  360
 
<210>52
<211>120
<212>PRT
<213>小鼠(Mus musculus)
 
<400>52
 
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Thr Val Leu Ala Arg Pro Gly Ala
1         5           10            15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
       20            25            30
Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
    35            40           45
Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Ser Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe
  50            55            60
Lys Gly Lys Ala Lys Leu Thr Ala Val Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65            70           75           80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Asn Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
         85            90          95
Thr Arg Asp Gly Tyr Tyr Arg Gly Asn Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
      100           105           110
Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser
    115           120
 
<210>53
<211>336
<212>DNA
<213>小鼠(Mus musculus)
 
<220>
<221>misc_feature
<222>(295)..(297)
<223>n是a，c，g或t
 
<220>
<223>
<400>53
gacattgtgc tgacacagtc tcctgcttcc ttagctgtat ctctggggca gagggccacc  60
atctcataca gggccagcaa aagtgtcagt acatctggct atagttatat gcactggaac  120
caacagaaac caggacagcc acccagactc ctcatctatc ttgtatccaa cctagaatct  180
ggggtccctg ccaggttcag tggcagtggg tctgggacag acttcaccct caacatccat  240
cctgtggagg aggaggatgc tgcaacctat tactgtcagc acattaggga gcttnnnacg  300
ttcggagggg ggaccaagct ggaaataaaa cgggct                            336
 
<210>54
<211>114
<212>PRT
<213>小鼠(Mus musculus)
 
<220>
<221>misc_feature
<222>(101)..(101)
<223>Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
 
<220>
<223>
 
<400>54
 
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1          5           10            15
Gln Arg Ala Thr Ile Ser Tyr Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser
      20            25            30
Gly Tyr Ser Tyr Met His His Trp Asn Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro
    35            40            45
Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Leu Val Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro
  50            55            60
Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile
65            70            75            80
His Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His His
          85            90            95
Ile Arg Glu Leu Xaa Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
        100           105          110
Arg Ala
 
<210>55
<211>31
<212>PRT
<213>小鼠(Mus musculus)
 
<220>
<223>JF/M1-4单克隆抗体的H链V区的构架1
 
<400>55
 
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Thr Val Leu Ala Arg Pro Gly Ala
1        5            10            15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser
      20            25            30
 
<210>56
<211>4
<212>PRT
<213>小鼠(Mus musculus)
 
<220>
<223>JF/M1-4单克隆抗体的H链V区的CDR1
 
<400>56
 
Tyr Trp Met His
1
 
<210>57
<211>14
<212>PRT
<213>小鼠(Mus musculus)
 
<220>
<223>JF/M1-4单克隆抗体的H链V区的构架2
 
<400>57
 
Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly
1        5             10
 
<210>58
<211>17
<212>PRT
<213>小鼠(Mus musculus)
 
<220>
<223>JF/M1-4单克隆抗体的H链V区的CDR2
<400>58
 
Ala Ile Trp Pro Gly Asn Ser Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Lys
1          5            10           15
 
Gly
 
<210>59
<211>32
<212>PRT
<213>小鼠(Mus musculus)
 
<220>
<223>JF/M1-4单克隆抗体的H链V区的构架3
 
<400>59
 
Lys Ala Lys Leu Thr Ala Val Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu
1         5           10            15
Leu Ser Ser Leu Thr Asn Glu Asp Ser Asa Val Tyr Tyr Cys Thr Arg
      20            25           30
 
<210>60
<211>11
<212>PRT
<213>小鼠(Mus musculus)
 
<220>
<223>JF/M1-4单克隆抗体的H链V区的CDR3
 
<400>60
 
Asp Gly Tyr Tyr Arg Gly Asn Tyr Phe Asp Tyr
1        5             10
 
<210>61
<211>11
<212>PRT
<213>小鼠(Mus musculus)
 
<220>
<223>JF/M1-4单克隆抗体的H链V区的构架4(J区段)
 
<400>61
 
Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser
1        5            10
 
<210>62
<211>23
<212>PRT
<213>小鼠(Mus musculus)
 
<220>
<223>JF/M1-4单克隆抗体的L链V区的构架1
 
<400>62
 
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1         5            10            15
Gln Arg Ala Thr Ile Ser Tyr
      20
 
<210>63
<211>15
<212>PRT
<213>小鼠(Mus musculus)
 
<220>
<223>JF/M1-4单克隆抗体的L链V区的CDR1
 
<400>63
Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser Gly Tyr Ser Tyr Met His
1        5            10             15
 
<210>64
<211>16
<212>PRT
<213>小鼠(Mus musculus)
 
<220>
<223>JF/M1-4单克隆抗体的L链V区的构架2
 
<400>64
 
His Trp Asn Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Arg Leu Leu Ile Tyr
1        5           10            15
 
<210>65
<211>7
<212>PRT
<213>小鼠(Mus musculus)
 
<220>
<223>JF/M1-4单克隆抗体的L链V区的CDR2
 
<400>65
 
Leu Val Ser Asn Leu Glu Ser
1         5
<210>66
<211>32
<212>PRT
<213>小鼠(Mus musculus)
 
<220>
<223>JF/M1-4单克隆抗体的L链V区的构架3
 
<400>66
Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
1         5            10           15
Leu Asn Ile His Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys
       20           25             30
 
<210>67
<211>9
<212>PRT
<213>小鼠(Mus musculus)
 
<220>
<221>misc_feature
<222>(8)..(8)
<223>Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
 
<220>
<223>JF/M1-4单克隆抗体的L链V区的CDR3
 
<400>67
 
Gln His His Ile Arg Glu Leu Xaa Thr
1         5
 
<210>68
<211>12
<212>PRT
<213>小鼠(Mus musculus)
 
<220>
<223>JF/M1-4单克隆抗体的L链V区的构架4(J区段)
 
<400>68
 
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala
1         5           10

Claims (15)

1.抗体，其识别获自丙型肝炎病毒(HCV)的基因组的丙型肝炎病毒(HCV)颗粒为抗原并且对丙型肝炎病毒(HCV)感染具有抑制活性，其中所述丙型肝炎病毒(HCV)的基因组包括彼此连接的下列(i)和(ii)：
(i)(a)丙型肝炎病毒(HCV)的JFH-1株的5’非翻译区、核心蛋白编码序列、E1蛋白编码序列、E2蛋白编码序列和p7蛋白编码序列，或
(b)丙型肝炎病毒(HCV)的J6CF株的5’非翻译区、核心蛋白编码序列、E1蛋白编码序列、E2蛋白编码序列和p7蛋白编码序列；和
(ii)JFH-1株的NS2蛋白编码序列、NS3蛋白编码序列、NS4A蛋白编码序列、NS4B蛋白编码序列、NS5A蛋白编码序列、NS5B蛋白编码序列和3’非翻译区。
2.权利要求1的抗体，其中所述丙型肝炎病毒(HCV)基因组是含有序列表的SEQ ID NO：1或2中所示的核苷酸序列的核酸(条件是当所述核酸是RNA时，将核苷酸序列中的核苷酸“T”读为“U”)。
3.权利要求1或2的抗体，其中所述抗体类别是IgM。
4.权利要求1至3的任一项的抗体，其识别序列表的SEQ IDNO：24中所示的氨基酸序列中的至少10个连续氨基酸。
5.权利要求4的抗体，其具有含有序列表的SEQ ID NO：52中所示的氨基酸序列的重链可变区。
6.权利要求4或5的抗体，其具有含有序列表的SEQ ID NO：54中所示的氨基酸序列的轻链可变区。
7.权利要求4至6的任一项的抗体，其由登录号为FERM BP-10982的杂交瘤细胞系产生。
8.权利要求1至3的任一项的抗体，其识别序列表的SEQ ID NO：44或45中所示的氨基酸序列中的至少10个连续氨基酸。
9.权利要求8的抗体，其由登录号为FERM BP-10980的杂交瘤细胞系产生。
10.权利要求1至3的任一项的抗体，其识别序列表的SEQ ID NO：36、45、46、47或48中所示的氨基酸序列中的至少10个连续氨基酸。
11.权利要求10的抗体，其由登录号为FERM BP-10981的杂交瘤细胞系产生。
12.丙型肝炎病毒(HCV)感染的抑制剂，其包含权利要求1至11的任一项的抗体作为活性成分。
13.药物，其包含权利要求1至11的任一项的抗体作为活性成分。
14.用于丙型肝炎的治疗剂或预防剂，其包含权利要求1至11的任一项的抗体作为活性成分。
15.用于检测丙型肝炎病毒(HCV)的方法，其包括使用权利要求1至11的任一项的抗体检测丙型肝炎病毒(HCV)颗粒。
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