CN101835896A - 表位标记的丙型肝炎病毒颗粒的制备和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了具有编码天然或嵌合的丙型肝炎病毒(HCV)基因组E2蛋白高变区1中的表位标记肽的核酸序列的核酸；这种核酸所编码的表位标记HCV颗粒；通过使用具有固定化于其上的抗表位标签抗体的支持体以简单方式和高纯度纯化HCV颗粒的方法。

Description

表位标记的丙型肝炎病毒颗粒的制备和应用

技术领域

本发明涉及表位标记的丙型肝炎病毒颗粒、用于产生所述病毒的载体和产生所述病毒颗粒的细胞系。本发明还涉及纯化所述病毒颗粒的方法、通过钝化所述病毒颗粒获得的疫苗和针对所述病毒颗粒的抗丙型肝炎病毒抗体。

背景技术

丙型肝炎病毒(以下可简称为“HCV”)被发现并鉴定为非甲型和非乙型肝炎的主要致病病毒(Choo，QL.等，Science，244：359-362，1989)，并已建立了高灵敏度的检测HCV的方法。因此，由于输血引起的新的HCV患者人数显著下降。然而，据统计，日本的病毒携带者人数超过2,000,000而全世界超过170,000,000，包括所谓的尚未有肝炎症状的病毒携带者。这主要是因为由HCV感染引起的慢性肝炎的比率高达70-80％，并且除了干扰剂之外目前还没有有效的抗病毒剂。此外，丙型肝炎是一种预后较差的严重传染病，大约一半的慢性丙型肝炎患者将无一例外地经历从丙型肝炎到肝硬化和肝癌的症状恶化。因此，有待于开发针对防止病毒携带者发病或消除病毒的抗病毒剂或疫苗。

为了开发HCV的治疗剂，需要一套用于研究感染性HCV颗粒或HCV颗粒生长机制的细胞培养系统。在过去，可有效培养HCV的可用实验系统仅限于使用黑猩猩的动物实验系统，它是造成拖延开发HCV治疗剂的主要原因。然而，在2005年，Wakita等人开发了一种在细胞培养系统中制备感染性病毒的方法(WO 05080575 A1、WO06022422 A1和Wakita，T.等，Nat.Med.，11：791-796，2005)，使得使用感染性HCV颗粒来开发HCV治疗剂成为可能。

在上述情况下，需要开发比传统技术更简单、更高纯度的可纯化感染性HCV颗粒的新技术，用于纯化在培养细胞系统产生的感染性HCV颗粒(WO 06022422 A1和Zahn，A.& Allain1，J.P.，J.Gen.Virol.，86：677-685，2005)。

作为以高纯度和简单的方式纯化从细胞培养系统得到的蛋白质的方法，已知的有以下方法：该方法中，使目标蛋白表达成具有蛋白标记物的融合蛋白，并且用针对所述蛋白标记物的抗体或与之特异性结合的分子来纯化融合蛋白。

蛋白标记物称为表位标签或简称为标签。已知的表位标签的实例包括：FLAG肽、3XFLAG肽、HA肽、3XHA肽、myc肽、6XHis肽、GST多肽、MBP多肽、PDZ结构域多肽、串联亲和纯化(TAP)肽、碱性磷酸酶和抗生物素蛋白。这样的肽或多肽通常与目标蛋白的N-或C-末端融合，这样的肽或多肽可任选插入目标蛋白内。

然而，当将表位标签添加到蛋白时，所述蛋白的生物活性或固有构象不能一直得以维持，这取决于蛋白的类型、表位标签的类型、表位标签所添加的蛋白位点等等。因此，根据每种类型的蛋白、每种类型的表位标记或表位标签所添加的每个位点，来研究表位标记的蛋白的生物学功能是必不可少的。

HCV基因组是含有大约9,600个核苷酸的单链(+)RNA。该基因组RNA含有5′-非翻译区(也称作″5′NTR″或″5′UTR″)、由结构区和非结构区组成的翻译区、以及3′-非翻译区(也称为″3′NTR″或″3′UTR″)。结构区编码HCV结构蛋白，非结构区编码大量非结构蛋白。所述HCV结构蛋白(核心、E1、E2和p7)和非结构蛋白(NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B)首先从翻译区翻译成一系列多蛋白，经过蛋白酶的限制性降解，然后释放。在结构蛋白中，核心是核心蛋白，E1和E2是包膜蛋白。已知非结构蛋白与病毒自身复制有关，NS2具有金属蛋白酶活性，NS3具有丝氨酸蛋白酶活性(N-末端的三分之一)和解旋酶活性(C-末端的三分之二)。此外，据报道NS4A是NS3蛋白酶活性的辅因子，NS5B具有RNA依赖性的RNA聚合酶活性。

HCV被一种叫做包膜的外壳包裹。包膜含有来源于宿主细胞膜的组分和来源于病毒的蛋白。构成HCV包膜的蛋白含有包膜蛋白1(称为″E1″)、包膜蛋白2(称为″E2″)和p7。具体而言，E1和E2各在C末端都具有跨膜区，E1和E2通过此跨膜区锚定于HCV膜上，E1和E2与HCV颗粒的形成或感染有关(Voisset，C.& Dubuisson，Biology of theCell，96：413-420，2004；和Op De Beeck，A等，J.Gen.Virol.，82：2589-2595，2001)。

在E2蛋白的氨基酸末端有两个区域，它们在各毒株之间具有显著不同的序列，称为高变区1(称作HVR1)和高变区2(称作HVR2)(Hijikata，M.等，Biochem Biophys Res Commun.，175：220-228，1991)。HVR1含有在E2蛋白的氨基末端处的27个氨基酸残基，其暴露于E2蛋白表面，充当B细胞表位。而HVR1的氨基酸序列多样性最大为80％，有几个区域中的氨基酸是保守的。因此，据认为既定的二级结构对于病毒存活是必需的。此外，基本上不存在半胱氨酸残基或任何信号用以在HVR1中添加天冬酰胺结合糖链。同时，HVR2含有7个氨基酸，位于E2蛋白氨基末端的91-97位区域处。而HVR2仅存在于HCV 1b型基因组中，不存在于其它基因型的HCV中。

作为有表位标签插入到病毒颗粒中的HCV的实例，，已知JFH-1株(HCV2a型)中E2蛋白的HVR1被HA肽取代，并且其确定具有感染性(Wakita，T.等，Nat.Med.，11：791-796，2005)。然而，没有报道显示这种感染性的表位标记的HCV颗粒是高度纯化的。

发明公开

本发明旨在提供可以高纯度进行简单纯化的表位标记的HCV颗粒、纯化所述HCV颗粒的方法和用所述高纯度HCV颗粒制备的疫苗。

本发明人研究了表位标签类型(其在用于HCV颗粒的细胞培养时不影响产生性和感染性)，以及在添加位点处添加有表位标签的HCV蛋白的组合，由此成功实现本发明第一个目标，即制备表位标记的HCV颗粒。此外，本发明者制备了高水平产生HCV颗粒的克隆，并证实了所制备的表位标记的HCV颗粒可通过单个步骤利用抗表位标签抗体柱来进行高度纯化。这些导致了本发明的完成。

具体而言，本发明包括以下第(1)-(15)项。

(1)一种核酸，其包含以下(a)、(b)、或(c)并且包含位于(a)、(b)、或(c)的E2蛋白编码序列中的高变区1(HVR1)处的编码表位标签肽的核酸序列：

(a)丙型肝炎病毒(HCV)JFH-1株的基因组；

(b)嵌合丙型肝炎病毒(HCV)基因组，其包含：HCV J6CF株的5′-非翻译区、核心蛋白编码序列、E1蛋白编码序列、E2蛋白编码序列和p7蛋白编码序列；以及HCV JFH-1株的NS2蛋白编码序列、NS3蛋白编码序列、NS4A蛋白编码序列、NS4B蛋白编码序列、NS5A蛋白编码序列、NS5B蛋白编码序列和3′-非翻译区；或

(c)嵌合丙型肝炎病毒(HCV)基因组，其包含：JFH-1株的5′-非翻译区；HCV TH1株的核心蛋白编码序列、E1蛋白编码序列、E2蛋白编码序列和p7蛋白编码序列；以及HCV JFH-1株的NS2蛋白编码序列、NS3蛋白编码序列、NS4A蛋白编码序列、NS4B蛋白编码序列、NS5A蛋白编码序列、NS5B蛋白编码序列和3′-非翻译区。

(2)第(1)项的核酸，其中所述表位标签肽包含氨基酸序列DYKDDDDK或DYKDHDGDYKDHDIDYKDDDDK。

(3)第(1)或(2)项的核酸，其中所述表位标签肽进一步包含接头序列。

(4)第(3)项的核酸，其中所述接头序列包括：GGG序列、GGGGS序列或(GGGGS)₃序列、或含有在序列GGG、GGGGS或(GGGGS)₃的一部分中缺失、取代或添加1-10个氨基酸的序列。

(5)第(1)-(4)项中任一项的核酸，所述核酸如SEQ ID NO：11、12、30、31、41或42所示，其中当核酸是RNA时，在序列表中所示的核苷酸″T″读作″U″。

(6)第(1)-(5)项中任一项的核酸，当将位于高变区1(HVR1)序列末端之后的氨基酸指定为第1位氨基酸时，所述核酸包含第122或124位天冬酰胺取代为赖氨酸的突变。

(7)第(6)项的核酸，所述核酸如SEQ ID NO：20或21所示，其中当核酸是RNA时，在序列表中所示的核苷酸″T″读作″U″。

(8)一种载体，所述载体包含第(1)-(7)项中任一项的核酸。

(9)一种表位标记的丙型肝炎病毒(HCV)颗粒，其包含作为基因组的第(1)-(7)项中任一项的核酸。

(10)一种细胞，所述细胞包含第(9)项的表位标记的丙型肝炎病毒(HCV)颗粒。

(11)第(10)项的细胞，所述细胞是Huh7或来源于Huh7的细胞系。

(12)纯化表位标记的丙型肝炎病毒(HCV)颗粒的方法，所述方法包括以下步骤：

由第(10)或(11)项的细胞制备表位标记的HCV颗粒；

使含有表位标记的HCV颗粒的溶液与固定化抗表位标签抗体的支持体接触，然后使表位标记的HCV颗粒吸附到固定化抗表位标签抗体的支持体上；以及

从固定化抗表位标签抗体的支持体释放表位标记的HCV颗粒，以获得表位标记的HCV颗粒。

(13)第(12)项的纯化方法，其中释放步骤包括用含有表位标签肽的缓冲液、不含钙的缓冲液、0.1M甘氨酸缓冲液(pH 2.5-4.0)、1M精氨酸HCl缓冲液(pH 4.0-5.0)或0.1-1mM HCl中的任一种从固定化抗表位标签抗体的支持体释放表位标记的HCV颗粒。

(14)一种丙型肝炎病毒(HCV)疫苗，所述疫苗通过灭活第(9)项的表位标记的HCV颗粒获得。

(15)一种抗丙型肝炎病毒(HCV)抗体，所述抗体针对第(9)项的表位标记的HCV颗粒。

本说明书包括在日本专利申请第2007-184587号的说明书和/或附图中所公开的所有或部分内容，该申请是本申请的优先权文件。

附图简述

图1显示HCV E2的结构。N1-N11各自代表糖链添加位点，HVR代表高变区，TMD代表跨膜域。将J6/JFH-1的E2HVR1的部分氨基酸序列(下划线部分)移除，在该处插入FLAG标签序列(下划线部分)。

图2A、图2B和图2C各自显示了pJ6/JFH-1(1XFLAG)和pJ6/JFH-1(3XFLAG)质粒的结构。图2B是图2A的延续，图2C是图2B的延续。

图3显示了将J6/JFH-1RNA和J6/JFH-1(3XFLAG)RNA引入Huh-7细胞后在培养上清液中HCV核心蛋白量的变化。所产生的核心蛋白的量在J6/JFH-1引入时没有变化。当引入J6/JFH-1(3XFLAG)时，所产生的核心蛋白的量下降，直到引入后的22天，但其后在第35天增加到与J6/JFH-1几乎同样的水平。

图4显示了在J6/JFH-1RNA或J6/JFH-1(3XFLAG)RNA引入Huh-7细胞之后第4、17、30和43天HCV核心和E2蛋白的表达情况。当引入J6/JFH-1(3XFLAG)时，发现在第30和43天的E2蛋白的分子量低于第4天的分子量。

图5显示了在J6/JFH-1(3XFLAG)RNA引入Huh-7细胞之后第4、17、30和43天用内切糖苷酶(PNGase F)处理的HCV E2蛋白的行为。通过用内切糖苷酶处理，不再观察到如在图4中所观察到的分子量差异。

图6显示了引入J6/JFH-1(3XFLAG)RNA后8和39天HCV基因组的序列分析结果。在引入RNA后39天，E2区中的糖链添加位点天冬酰胺(N6)已经被赖氨酸(K)取代。

图7显示了在经纯化的J6/JFH-1(3XFLAG)病毒的溶液中HCV核心蛋白的量。由于洗脱1XFLAG肽或3XFLAG肽之后检测到HCV核心蛋白，证实了HCV颗粒的纯化。

图8显示了在经纯化的J6/JFH-1(3XFLAG)病毒溶液中所含蛋白的污染。经纯化的病毒的溶液中几乎不含污染蛋白。

图9显示了经纯化的J6/JFH-1(3XFLAG)病毒的感染性。在感染病毒后4天对细胞的HCV RNA进行了定量。发现纯化的病毒具有与未纯化病毒相当的感染性。

图10A、图10B和图10C各自显示了pJ6/JFH-1(1XFLAG)N→K和pJ6/JFH-1(3XFLAG)N→K质粒的结构。图10B是图10A的延续，图10C是图10B的延续。

图11显示了HCV E2的结构。N1-N11各自代表糖链添加位点，HVR代表高变区，TMD代表跨膜域。将JFH-1的E2HVR1的部分氨基酸序列(下划线部分)移除，在该处插入FLAG标签序列(下划线部分)。

图12A、图12B和图12C各自显示了pJFH-1(1XFLAG)和pJFH-1(3XFLAG)质粒的结构。图12B是图12A的延续，图12C是图12B的延续。

图13显示了HCV E2的结构。N1-N11各自代表糖链添加位点，HVR代表高变区，TMD代表跨膜域。将pTH/JFH-1的E2HVR1的部分氨基酸序列(下划线部分)移除，在该处插入FLAG标签序列(下划线部分)。

图14A、图14B和图14C分别各自了pTH/JFH-1(1XFLAG)和pTH/JFH-1(3XFLAG)质粒的结构。图14B是图14A的延续，图14C是图14B的延续。

本发明的最佳实施方式

当实施本发明时，可采用本领域技术范围内的常规分子生物学和免疫学技术。这些技术对于本领域技术人员是显而易见的，并已在公开的文献中有详细报道(参见，例如Sambrook等，Molecular Cloning：ALaboratory Manual(分子克隆：实验室手册)，第3卷，2001；Ed Harlow等，Antibodies：A Laboratory Manual(抗体：实验室手册)，1988)。

本文所引用的所有出版物、专利和专利申请全部通过引用结合到本文中。

1.表位标记的HCV颗粒

本文所用术语“表位标记的HCV颗粒”是指有表位标签肽添加到HCV结构蛋白中的HCV颗粒。这样的表位标记HCV颗粒可在细胞培养系统中进行制备，这样的颗粒优选具有感染性。

在细胞培养系统中产生HCV颗粒需要使用来源于JFH-1株的全长基因或JFH-1株与其它HCV毒株的嵌合基因。在WO 04104198 A1、WO 06022422 A1、Wakita，T.等，Nat.Med.11：791-796，2005、和Lindenbach，BD.等，Science 309：623-626，2005中描述了其基本技术。

具体而言，可产生HCV颗粒的基因的实施方案是JFH-1病毒基因组RNA，其沿着5′→3′方向依次包含：5’-非翻译区、核心蛋白编码序列、E1蛋白编码序列、E2蛋白编码序列、p7蛋白编码序列、NS2蛋白编码序列、NS3蛋白编码序列、NS4A蛋白编码序列、NS4B蛋白编码序列、NS5A蛋白编码序列、NS5B蛋白编码序列和3’-非翻译区。

可产生HCV颗粒的基因的另一个实施方案是包含2个或更多个类型HCV毒株的病毒基因组RNA的嵌合基因。这种RNA的实例是沿着5′→3′方向依次包含以下序列的RNA：非JFH-1株的HCV毒株的5’-非翻译区、核心蛋白编码序列、E1蛋白编码序列、E2蛋白编码序列、p7蛋白编码序列、NS2蛋白编码序列；以及JFH-1株的NS3蛋白编码序列、NS4A蛋白编码序列、NS4B蛋白编码序列、NS5A蛋白编码序列、NS5B蛋白编码序列和3’-非翻译区。

可产生HCV颗粒的基因的特定实例包括以下核酸(a)、(b)和(c)：

(a)JFH1株的基因组(即沿着5′→3′方向依次包含JFH-1株的5’-非翻译区、核心蛋白编码序列、E1蛋白编码序列、E2蛋白编码序列、p7蛋白编码序列、NS2蛋白编码序列、NS3蛋白编码序列、NS4A蛋白编码序列、NS4B蛋白编码序列、NS5A蛋白编码序列、NS5B蛋白编码序列和3’-非翻译区的核酸(参见SEQ ID NO：30：pJFH-1(1XFLAG)，SEQ ID NO：31：pJFH-1(3XFLAG)))；

(b)嵌合HCV基因组，其沿着5′→3′方向依次包含：J6CF株的5’-非翻译区、核心蛋白编码序列、E1蛋白编码序列、E2蛋白编码序列和p7蛋白编码序列；以及JFH-1株的NS2蛋白编码序列、NS3蛋白编码序列、NS4A蛋白编码序列、NS4B蛋白编码序列、NS5A蛋白编码序列、NS5B蛋白编码序列和3’-非翻译区(优选嵌合HCV基因组沿着5′→3′方向依次包含：5’-非翻译区、核心蛋白编码序列、E1蛋白编码序列、E2蛋白编码序列、p7蛋白编码序列和编码NS2蛋白编码区的N-端16个氨基酸的序列；以及JFH-1株的编码NS2蛋白编码区的从N-末端第17个氨基酸到C末端的区域的序列、NS3蛋白编码序列、NS4A蛋白编码序列、NS4B蛋白编码序列、NS5A蛋白编码序列、NS5B蛋白编码序列和3’-非翻译区(参见SEQ ID NO：10：pJ6/JFH-1，SEQ ID NO：11：pJ6/JFH-1(1XFLAG)，SEQ ID NO：12：pJ6/JFH-1(3XFLAG))；并且

(c)嵌合HCV基因组，其沿着5′→3′方向依次包含：JFH1株的5’-非翻译区；TH1株的核心蛋白编码序列、E1蛋白编码序列、E2蛋白编码序列和p7蛋白编码序列；以及JFH-1株的NS2蛋白编码序列、NS3蛋白编码序列、NS4A蛋白编码序列、NS4B蛋白编码序列、NS5A蛋白编码序列、NS5B蛋白编码序列和3′-非翻译区(优选嵌合HCV基因组沿着5′→3′方向依次包含：JFH-1株的5’-非翻译区；TH株的核心蛋白编码序列、E1蛋白编码序列、E2蛋白编码序列、p7蛋白编码序列和编码NS2蛋白编码区的N-末端33个氨基酸的序列；以及JFH-1株的编码NS2蛋白编码区的从N-末端第34个氨基酸到C末端的区域的序列、NS3蛋白编码序列、NS4A蛋白编码序列、NS4B蛋白编码序列、NS5A蛋白编码序列、NS5B蛋白编码序列和3′-非翻译区(参见SEQ ID NO：40：pTH/JFH1，SEQ ID NO：41：pTH/JFH1(1XFLAG)，SEQ ID NO：42：pTH/JFH1(3XFLAG))。

在本发明中，编码表位标签肽的核酸序列，即DYKDDDDKGGG(SEQ ID NO：49)或DYKDHDGDYKDHDIDYKDDDDKGGG(SEQID NO：50)，以读框内的形式插入到以上HCV基因组的E2蛋白编码序列的高变区1(HVR1)中。或者，所述区域的一部分被所述表位标签肽取代，从而产生表位标记的HCV基因组DNA。利用这样的DNA在细胞培养系统制备“表位标记的HCV颗粒”，从而获得高度纯化的表位标记的HCV颗粒。

2.表位标记的HCV颗粒的制备

(1)在HCV结构蛋白中含有表位标签的HCV基因组DNA的制备

本文所用术语“表位标签”(或简称为“标签”)没有特别限制，前提是可用来标记HCV。其实例包括：FLAG肽(可称作flag肽或Flag肽)、3XFLAG肽(可被称作3xFLAG肽、3xFlag肽或3Xflag肽)、HA肽、3XHA肽、myc肽、6XHis肽、GST多肽、MBP多肽、PDZ结构域多肽、串联亲和纯化(TAP)肽、碱性磷酸酶和抗生物素蛋白。在本发明中，FLAG肽(氨基酸序列：DYKDDDDK(SEQ ID NO：51))或3XFLAFG肽(氨基酸序列：DYKDHDGDYKDHDIDYKDDDDK(SEQID NO：52))用作表位标签肽，其中3XFLAG肽是特别优选的。

添加表位标签的位置是HCV颗粒E2蛋白的HVR1区。表位标签肽以读框内的形式(也就是，不至于使读码框错排)插入到HVR1区中的各HCV毒株之间同源性低的E2蛋白的从N-末端数起的8和19位氨基酸之间的区域，或者优选将表位标签肽插入到已移除了N-末端11-17位氨基酸的位置。

如果需要，可将合适的接头添加到表位标签肽的C-末端。用作接头的是氨基酸序列GGG(SEQ ID NO：53)、GGGGS(SEQ ID NO：54)和(GGGGS)×3(也称作(GGGGS)₃)或包含所述氨基酸序列的一部分中的大约1-10、优选1-5、更优选1-2个氨基酸缺失、取代或添加的肽。优选的实例是GGG、GGGGS(SEQ ID NO：54)和(GGGGS)×3，优选GGG。

将编码表位标签的核酸引入HCV基因组的方法的实例是以下方法：在该方法中，使用含有编码表位标签的核酸序列的合成引物和作为模板的HCV基因组的cDNA来进行聚合酶链式反应(PCR)；并且对所产生的PCR产物进行充分的限制酶处理和连接处理，以使上述cDNA与目标HCV基因组的cDNA连接。所述程序的实例在以下实施例中有所描述。

所使用的HCV毒株是(但不限于)属于6种基因型中的任一种的毒株，其通过利用HCV毒株的核苷酸序列的谱系分析来分类：基因型1a(例如H77株(GeneBank登记号AF011751))、基因型1b(例如J1株(GeneBank登记号D89815))、Con1株(GeneBank登记号AJ238799，可称作Con-1或con1株)、TH株(Wakita，T.等，J.Biol.Chem.，269，14205-14210，1994，日本专利公开(kokai)第2004-179A号))、基因型2a(例如JFH-1株(GeneBank登记号AB047639，可称作″JFH1株″)、J6CF株(GeneBank登记号AF177036)、JCH-1(GeneBank登记号AB047640)、JCH-2(GeneBank登记号AB047641)、JCH-3(GeneBank登记号AB047642)、JCH-4(GeneBank登记号AB047643)、JCH-5(GeneBank登记号AB047644)、JCH-6(GeneBank登记号AB047645))、基因型2b(例如HC-J8株(GeneBank登记号D01221))、基因型3a(例如NZL1株(GeneBank登记号No.D17763))以及基因型3b(例如Tr-Kj(GeneBank登记号D49374))。在后面的实施例中，包含来源于JFH-1的非结构蛋白编码序列和3′-非翻译区；以及来源于TH1、JFH-1或J6CF的5′-翻译区和结构蛋白编码序列的核酸序列用作本发明的优选实例。

为了将目标表位标签肽插入到HCV的HVR中，可将HCV基因组RNA的cDNA克隆到载体中，用所述载体作为模板、用编码表位标签肽的合成的DNA作为引物来进行PCR。由此可得到编码在靶位点处添加或插入了表位标签的包膜蛋白的cDNA。

此外，经过合适的限制酶消化之后，分离得到编码具有表位标签的包膜蛋白的cDNA片段，将全长HCV基因组RNA的cDNA克隆到启动子如T7启动子下游位点制得载体，随后用上述相同的限制酶消化该载体，并将编码具有所分离的表位标签序列的包膜蛋白的cDNA片段插到相同的消化位点。由此能够得到全长的HCV cDNA。

当将从载体转录的RNA引入到允许HCV的细胞(HCVpermissive cell)如Huh7细胞中时，已克隆有本文所用的全长HCV基因组RNA的cDNA的载体能够产生HCV颗粒。有关其结构和制备的详细资料参见WO 04104198 A1、WO 06022422 A1、Wakita，T.等，Nat.Med.11：791-796，2005和Lindenbach，BD.等，Science 309：623-626，2005。

(2)在细胞培养系统中表位标记的HCV颗粒的产生

在启动子的控制下，可由具有表位标签编码序列的HCV cDNA合成RNA，将该RNA引入到细胞中得到含有表位标记的HCV颗粒的细胞，随后培养所得到的细胞制等表位标记的HCV颗粒。启动子包括但不限于：T7启动子、SP6启动子和T3启动子，优选T7启动子。

为了在体外制备RNA，利用在T7启动子控制下的引入了HCVcDNA的核酸作为模板，然后可使用诸如MEGAscript T7试剂盒(Ambion)等试剂盒进行克隆。

用于引入RNA的细胞是任何能够产生HCV颗粒的细胞，如Huh7、HepG2、IMY-N9、HeLa或293细胞，或者表达CD81和/或Claudin1基因并衍生自Huh7、HepG2、IMY-N9、HeLa或293细胞的细胞。在这些细胞当中，优选使用Huh7细胞或来源于Huh7的细胞系。Huh7来源的细胞系的实例包括Huh7.5和Huh7.5.1。

用于将RNA引入细胞的方法的实例包括磷酸钙共沉淀法、DEAE-葡聚糖法、脂质转染法、显微注射法和电穿孔法。优选脂质转染法和电穿孔法，更优选电穿孔法。

cDNA可取代RNA引入到细胞中。在这种情况下，将已添加表位标签编码序列的HCV cDNA可操作地插入到含有RNA聚合酶I启动子和终止子的载体((Neumann，G.等，Virology，202：477-479，1994、WO 2007/037428 A1)上，并以与RNA的情况相同的方式将载体引入细胞中，以使cDNA在细胞中表达。

可通过使用针对释放到培养溶液中的构成HCV颗粒的蛋白的抗体来评价细胞产生病毒颗粒的能力，所述蛋白例如为核心蛋白、E1蛋白和E2蛋白。还可通过检测RNA的用特异性引物的RT-PCR来扩增培养基内HCV病毒颗粒所含HCV基因组RNA，从而来间接地评价细胞产生HCV病毒颗粒的能力。

可通过以下方法评价所制备的病毒是否具有感染性：培养已引入HCV RNA的细胞；用所述培养物的上清液处理允许HCV的细胞(例如Huh7)并且用抗核心抗体对细胞进行免疫染色，48小时之后对受感染的细胞进行计数。或者，可通过将细胞提取物进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳并通过蛋白印迹检测核心蛋白来进行评价。

(3)获得产生表位标记的HCV颗粒的细胞系

为了使HCV基因组有效复制，有必要在基因组核苷酸序列中进行突变(Lohmann，V.等，J.Virol.75：1437-1449，2001)。增强复制的突变称作“适应性突变”。可对以上(2)中所制备的已引入HCV基因组RNA的细胞进行传代培养，以获得连续产生HCV颗粒的细胞系。当连续进行这种培养时，会出现的情况是HCV基因组发生适应性突变，导致HCV颗粒的产生显著增强。

当将在核酸(a)-(c)中的HVR1序列末端之后紧接的氨基酸指定为第一位氨基酸时，第122或124位氨基酸(天冬酰胺)取代为赖氨酸的突变是产生表位标记的HCV颗粒的合适的突变。在核酸(a)或(b)的情况中，特别是第124位氨基酸(天冬酰胺)取代为赖氨酸的突变是更优选的。在核酸(c)中，第122位氨基酸(天冬酰胺)取代为赖氨酸的突变是更优选的。据认为这些位置上的天冬酰胺能被糖链修饰，并且有研究表明无糖链添加与HCV颗粒高生产力相关。

在本发明中，适应性突变可通过上文所述的传代培养或者人工诱导而获得。当进行人工诱导时，可设计诱变引物，可用这样的引物进行PCR，以合成已引入突变的DNA。也可用市售的Quick Change II XL定点诱变试剂盒(Stratagene)制备突变体。

在本发明中，难以通过杂交技术来检测对于突变一个氨基酸所需的核酸突变；然而，通过测定HCV基因序列可确认适应性突变。

(4)表位标记的HCV颗粒的纯化

利用支持体来纯化表位标记的HCV颗粒，所述支持体结合有能与表位标签结合的蛋白。最常用的蛋白是针对表位标签肽的抗体。在本发明中，优选的表位标签是FLAG或3XFLAG肽，并且可使用结合有(或固定化有)能够与所述肽结合的抗FLAG抗体(例如M2抗体或M5抗体(Sigma提供)等)的支持体。

将产生FLAG表位标记HCV颗粒的细胞的培养上清液或产生3XFLAG表位标记HCV颗粒的细胞或含有HCV颗粒的溶液置于含有抗FLAG抗体结合的支持体的柱上，然后用磷酸缓冲液洗涤所述柱，并用含有FLAG或3XFLAG肽的缓冲液洗脱结合到抗FLAG抗体结合的支持体的HCV颗粒。当使用结合有M5抗体(其以钙依赖方式与FLAG肽结合)的支持体时，用含钙缓冲液使HCV颗粒结合，并用无钙缓冲液将HCV颗粒从支持体上洗脱。

作为其它的洗脱技术，可使用用于从抗体结合的支持体上洗脱蛋白的常规技术(Antibodies：A Laboratory Manual(抗体：实验室手册)，Cold Spring Harbor Laboratory，1988)。例如可使用0.1M甘氨酸缓冲液(pH 2.5-4.0)或1M精氨酸HCl缓冲液(pH 4.0-5.0)作为洗脱溶液(Ejima，D.等，Anal.Biochem.345：250-257，2005)。此外，可使用0.1mM-1mM盐酸。为了防止洗脱的HCV颗粒变性，洗脱后的缓冲液pH优选设置在中性附近(pH 6.0-8.0)。

将如此纯化的HCV颗粒进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，并用蛋白印迹检测HCV衍生的蛋白，由此可确定HCV颗粒是否已被纯化。

3.表位标记的HCV颗粒的应用

(1)疫苗

高度纯化的表位标记的HCV颗粒优选用作疫苗或者制备抗HCV抗体的抗原。

具体而言，通过在本技术领域已知的所用方法可将所制备的表位标记的HCV颗粒灭活。可将灭活剂如甲醛、β-丙内酯或戊二醛加入或混入病毒悬浮液中，并使灭活剂与病毒反应，从而灭活病毒(Appaiahgari等，疫苗，22：3669-3675，2004)。

此外，可用紫外线辐照病毒来消除病毒的感染性，从而使其立即失活。紫外辐照导致病毒失活，但对组成蛋白的影响极小。用于灭活的紫外光源可以是市售的杀菌灯，特别是15w的杀菌灯，但不仅限于这些光源。在本发明中，使用了用上述方法纯化的HCV颗粒，灭活方法不受纯化或未纯化状态所限。优选在室温下用20mW/cm²紫外线对含有表位标记的HCV颗粒的溶液辐照至少5分钟，以灭活表位标记的HCV颗粒。

本发明疫苗呈溶液或者混悬液形式，含有10％-95％、优选25％-70％活性成分(病毒颗粒或其部分)，并配制用以给药。可以固态形式制备疫苗以便适合使其溶解或悬浮于溶液中。可将制备物乳化或者包囊在脂质体中。

常将活性免疫成分如HCV颗粒和与活性成分相容的可药用溶媒混合。合适的溶媒的实例包括水、生理盐水、葡萄糖、甘油、乙醇和它们的混合物。此外，如果需要，疫苗可含有少量的辅助剂(例如增湿剂或乳化剂)、pH缓冲剂和/或增强免疫功效的佐剂。有效的佐剂的实例包括但不限于：氢氧化铝、N-乙酰-胞壁酰-L-苏氨酰-D-异谷氨酰胺(thr-MDP)、N-乙酰-正(nor)胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺(称作CGP11637或nor-MDP)、N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺酰-L-丙氨酸-2-(1′-2′-二棕榈酰-sn-甘油基-3-羟基磷酰氧基)-乙胺(称作CGP19835A或MTP-PE)和RIBI。RIBI含有在2％角鲨烯/吐温80乳剂中的三种从细菌中提取的组分：即单磷酰脂质A、海藻糖二霉菌酸酯(trehalose dimycolate)和细胞壁骨架(HPL+TDM+CWS)。通过分析由给予含HCV颗粒的疫苗产生的抗体量可测定佐剂的功效。

本发明的疫苗通常可通过注射例如皮下注射或肌内注射经胃肠外给予。适合作为其它给药剂型的其它制剂的实例包括栓剂和任选的口服制剂。

若有需要，可将一种或多种具有佐剂活性的化合物加入到HCV疫苗中。佐剂是对免疫系统的非特异性刺激物。本领域所知的佐剂特例包括：完全和不完全弗氏佐剂、维生素E、非离子型嵌段共聚物、胞壁酰二肽、皂苷、矿物油、植物油和卡波普。特别适合粘膜施用的佐剂实例包括：大肠杆菌不耐热毒素(LT)和霍乱毒素(CT)。其它合适的佐剂实例包括：氢氧化铝、磷酸铝或氧化铝、油乳液(如

或Marcol)、皂苷、维生素E增溶剂。因此，本发明优选实施方案的疫苗含有佐剂。

例如可皮下、皮内、肌内或静脉内给予注射剂，所述注射剂包含本发明疫苗和可药用载体或稀释剂，并结合其它成分如稳定剂、糖类(如山梨醇、甘露醇、淀粉、蔗糖、葡萄糖或葡聚糖)、蛋白(如白蛋白或酪蛋白)、含蛋白的物质(如牛血清或脱脂乳)和缓冲剂(如磷酸缓冲剂)。

本发明疫苗以适用于某种剂型的方式并以可发挥预防和/或治疗作用的量施用。给药量通常为0.01μg-100000μg抗原/剂。所述量随待治疗的患者、患者的免疫系统抗体合成能力以及期需的保护程度而变化。此外，所述量还随给药途径如口服、皮下、皮内、肌内或静脉内给药而变化。

本发明的疫苗可根据单一给药计划来施用，优选根据多重给药计划来施用。在多重给药计划中，在开始接种时，进行1-10次单独给药，然后以维持和/或增强免疫应答所需的时间间隔再次进行给药。例如，二次给药可在1-4个月以后进行。如果需要，可随后在几个月以后进行。给药方案(至少部分)由个体的需要决定，方案取决于医生的判断。

本发明的疫苗可与另外的免疫抑制剂(如免疫球蛋白)一起施用。

此外，可将本发明疫苗给予健康的个体，以在该健康个体内诱导对HCV的免疫应答，这样疫苗便可用于预防新的HCV感染。此外，可将疫苗给予受HCV感染的患者，从而在体内诱导出对HCV的有效免疫应答，因此疫苗可用作消除HCV的治疗性疫苗。

(2)用表位标记的HCV颗粒抗原诱导的抗HCV抗体

本发明的表位标记的HCV颗粒能够很容易地进行纯化并具有高纯度，因此，所述颗粒可用作用于制备抗体的抗原。

具体而言，动物血清中含有针对杂质的抗体。因此，当用于免疫接种动物的HCV颗粒样品含有杂质时，需要用HCV抗原色谱柱来纯化血清，以消除针对所述杂质的抗体。然而，在本发明中，因为表位标记的HCV颗粒是作为高纯度的HCV获得的，因此不需要任何纯化步骤。

通过将本发明的表位标记的HCV颗粒给予哺乳动物或鸟类，可制得抗HCV抗体。哺乳动物的实例包括：小鼠、大鼠、兔、山羊、绵羊、马、牛、豚鼠、单峰驼、双峰驼和美洲驼。单峰驼、双峰驼和美洲驼适用于制备仅由H链组成的抗体。鸟类的实例包括鸡、鹅和鸵鸟。可通过熟知的方法从给予本发明颗粒的动物中获取血清从而获得抗体。

可用免疫接种了本发明表位标记的HCV颗粒的动物细胞来制备杂交瘤，所述杂交瘤产生产单克隆抗体的细胞。用于制备杂交瘤的方法在本领域众所周知，可采用Antibodies：A Laboratory Manual(抗体：实验室手册)(Cold Spring Harbor Laboratory，1988)所述的方法。

可通过细胞融合或者通过其它方法例如(引入癌基因(DNA)或通过埃巴病毒感染使B淋巴细胞无限增殖化)来制备产生单克隆抗体的细胞。

由此获得的单克隆或多克隆抗体可用于HCV的诊断、治疗和预防。

用本发明表位标记的HCV颗粒制备的抗体用于治疗或预防丙型肝炎。此外，它们被用于预防在器官移植时受供体器官HCV感染。此外，上述抗体可与现有抗病毒剂如干扰素和三氮唑核苷联用。

抗HCV抗体的有效剂量可选自0.001mg-1000mg/kg体重。或者，给药量可以是0.01-100000mg/患者。然而，应当注意的是，含有用表位标记HCV颗粒制备的抗HCV抗体的治疗剂的量不限于以上所提及的量。

上述治疗剂的给药途径包括但不限于：优选皮下给药、皮内给药或肌内给药，更优选静脉内给药。此外，治疗剂的给药时间不受限制，可在患者出现疾病临床症状之前或者之后。

包含用本发明表位标记HCV颗粒制备的、作为一种有效成份的抗HCV抗体的治疗剂可通过传统工艺结合药物学上可接受载体或添加剂进行配制(Remington′s Pharmaceutical Science，Latest Edition，MarkPublishing Company，Easton，U.S.A.)。

这些载体和药学添加剂的实例包括：水、可药用有机溶剂、胶原、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚羧乙烯、羧甲基纤维素钠、聚丙烯酸钠、藻酸钠、水溶性葡聚糖、羧甲基淀粉钠、果胶、甲基纤维素、乙基纤维素、黄原胶、阿拉伯树胶、酪蛋白、琼脂、聚乙二醇、一缩二丙三醇、甘油、丙二醇、凡士林、石蜡、硬脂醇、硬脂酸、人血清白蛋白(HSA)、甘露醇、山梨醇、乳糖和可作为药用添加剂的表面活性剂。

实际采用的添加剂是根据本发明治疗剂的剂型从上述的添加剂中选定，这样的添加剂可单独或任选联合使用，然而，添加剂无疑不限于以上所提到的。当添加剂用于注射剂时，例如在溶剂(如生理盐水、缓冲液、或葡萄糖溶液)中溶解用纯化的表位标记HCV颗粒制备的抗HCV抗体，随后加入防吸附剂如吐温80、吐温20、明胶或人血清白蛋白。或者，可将添加剂冻干制成在使用前溶解和复溶的剂型。用于冻干的赋形剂的实例包括糖醇(如甘露醇或葡聚糖)和糖。

在下文中，将根据以下实施例更详细地描述本发明。应注意的是，这些实施例是为了说明的目的而提供，本发明技术范围不限于这些实施例。

实施例

实施例1：含有插入到HCV E2HVR1区的FLAG标签序列的J6/JFH-1质粒的构建

用作HCV基因组RNA的cDNA是J6/JFH-1嵌合体cDNA，其包含2a基因型J6CF株来源的NS2的从5’-UTR到N-末端第16位氨基酸残基的序列(GeneBank登记号AF 177036，Yanagi，M.等，Virology，262，1999，第250-263页)和2a基因型JFH-1株来源的从NS2的N-末端第17位氨基酸残基到3′-UTR的序列(GeneBank登记号AB047639，Kato，T.等，Gastroenterology，125，2003，第1808-1817页)。将包含1或3个重复FLAG序列的cDNA插入作为FLAG标签。产生的质粒分别称作pJ6/JFH-1(1XFLAG)和pJ6/JFH-1(3XFLAG)。

图1显示了由那些基因翻译的邻接FLAG标签插入位点的从E2蛋白N-端氨基酸开始的氨基酸序列。SEQ ID NO：1显示了J6/JFH1编码的E2蛋白N-末端氨基酸序列；SEQ ID NO：2显示了pJ6/JFH-1(1XFLAG)编码的E2蛋白N-末端氨基酸序列；SEQ ID NO：3显示了pJ6/JFH-1(3XFLAG)编码的E2蛋白N-末端氨基酸序列。图2(A)-(C)显示了制备质粒的方法。

具体而言，将与JFH1株来源的完整基因组RNA区相对应的cDNA克隆到pUC19质粒中来构建质粒DNA pJFH1(Wakita，T.等Nat.Med.，11，2005，第791-796页，WO 2004/104198)，用EcoRI将其消化然后用BclI部分消化，纯化移除了EcoRI位点到第一个BclI位点之间的片段(大约2,840bp)的质粒DNA片段。将已被克隆到pUC19质粒的J6CF株来源的cDNA，即pJ6CF(GeneBank登记号AF177036，Yanagi，M.，等，Virology 262：250-263，1999)分别用EcoRI和BclI部分消化，得到大约2,840bp片段，随后将其连接到上述纯化的片段得到J6/JFH1。

随后，向作为模板的J6/JFH1cDNA加入来自PhusionHigh-Fidelity DNA聚合酶试剂盒(FINNZYMES)的10μl 10×缓冲液、4μl 2mM dNTP混合物、各1μl的10μM引物E2-F(SEQ ID NO：4)和1F-R(SEQ ID NO：5)，然后加入去离子水使总体积达49.5μl。其后，加入0.5μl Phusion DNA聚合酶(FINNZYMES)，然后进行30个循环的PCR，其中一个循环由98℃10秒钟、55℃15秒钟、72℃30秒钟组成。得到的PCR产物命名为PCR产物No.1。

向作为模板的J6/JFH1 cDNA加入来自Phusion High-Fidelity DNA聚合酶试剂盒(FINNZYMES)的10μl 10×缓冲液、4μl 2mM dNTP混合物、各1μl的10μM引物E2-R(SEQ ID NO：6)和1F-F(SEQ ID NO：7)，然后加去离子水使总体积达49.5μl。其后，加入0.5μl Phusion DNA聚合酶(FINNZYMES)，然后进行30个循环的PCR，其中一个循环由98℃10秒钟、55℃15秒钟、72℃1.5分钟组成。得到的PCR产物命名为PCR产物No.2。

向作为模板的J6/JFH1 cDNA加入来自Phusion High-Fidelity DNA聚合酶试剂盒(FINNZYMES)的10μl 10×缓冲液、4μl 2mM dNTP混合物、各1μl的10μM引物E2-F(SEQ ID NO：4)和3F-R(SEQ ID NO：8)，然后加去离子水至总体积为49.5μl。其后，加入0.5μl Phusion DNA聚合酶(FINNZYMES)，然后进行30个循环的PCR，其中一个循环由98℃10秒钟、55℃15秒钟、72℃30秒钟组成。得到的PCR产物命名为PCR产物No.3。

向作为模板的J6/JFH1 cDNA加入来自Phusion High-Fidelity DNA聚合酶试剂盒(FINNZYMES)的10μl 10×缓冲液、4μl 2mM dNTP混合物、各1μl的10μM引物E2-R(SEQ ID NO：6)和3F-F(SEQ ID NO：9)，然后加去离子水至总体积为49.5μl。其后，加入0.5μl Phusion DNA聚合酶(FINNZYMES)，然后进行30个循环的PCR，其中一个循环包括98℃10秒钟、55℃15秒钟、72℃1.5分钟。得到的PCR产物命名为PCR产物No.4。

将各PCR产物纯化并溶解于15μl水中。将PCR产物No.1的DNA(1μl)与PCR产物No.2的DNA(1μl)混合。向用作模板的混合物加入来自Phusion High-Fidelity DNA聚合酶试剂盒(FINNZYMES)的10μl10×缓冲液、4μl 2mM dNTP混合物、各1μl的10μM引物E2-F(SEQID NO：4)和E2-R(SEQ ID NO：6)，加去离子水至总体积为49.5μl。其后，加入0.5μl Phusion DNA聚合酶(FINNZYMES)，然后进行30个循环的PCR，其中一个循环由98℃10秒钟、55℃15秒钟、72℃2分钟组成。得到的PCR产物命名为PCR产物No.5。

将PCR产物No.3的DNA(1μl)与PCR产物No.4的DNA(1μl)混合。向用作模板的混合物加入来自Phusion High-Fidelity DNA聚合酶试剂盒(FINNZYMES)的10μl 10×缓冲液、4μl 2mM dNTP混合物、各1μl的10μM引物E2-F(SEQ ID NO：4)和E2-R(SEQ ID NO：6)，加去离子水至总体积为49.5μl。其后，加入0.5μl Phusion DNA聚合酶(FINNZYMES)，然后进行30个循环的PCR，其中一个循环由98℃10秒钟、55℃15秒钟、72℃2分钟组成。得到的PCR产物命名为PCR产物No.6。将PCR产物纯化并溶解于30μl水中。

分别用KpnI限制性内切酶消化J6/JFH-1cDNA和纯化的PCR产物No.5，用琼脂糖凝胶电泳分离并随后纯化各HCV cDNA片段。将两个DNA片段与Ligation Mix(TAKARA BIO INC，Japan)混合，使DNA片段连接。载体命名为pJ6/JFH-1(1XFLAG)。pJ6/JFH-1(1XFLAG)包含编码嵌合基因的核苷酸序列，按照5’-3’的顺序其依次包含：J6CF株的5’-非翻译区、核心蛋白编码序列、E1蛋白编码序列、E2蛋白编码序列、p7蛋白编码序列和编码NS2蛋白区的N-末端16个氨基酸的序列；以及JFH-1株的编码从NS2蛋白区的N-末端第17位氨基酸到C-末端的区域的序列、NS3蛋白编码序列、NS4A蛋白编码序列、NS4B蛋白编码序列、NS5A蛋白编码序列、NS5B蛋白区和3’-非翻译区，其在E2HVR1区中包含编码FLAG肽序列的核苷酸序列。

用KpnI限制性内切酶消化J6/JFH-1cDNA和纯化的PCR产物No.6，用琼脂糖凝胶电泳分离并随后纯化各HCV cDNA片段。将两个DNA片段与Ligation Mix(TAKARA BIO INC，Japan)混合，使两个DNA片段连接。得到的载体命名为pJ6/JFH-1(3XFLAG)。pJ6/JFH-1(3XFLAG)包含编码嵌合基因的核苷酸序列，按照5’-3’的顺序其依次包含J6CF株的5’-非翻译区、核心蛋白编码序列、E1蛋白编码序列、E2蛋白编码序列、p7蛋白编码序列和编码NS2蛋白区N-末端16个氨基酸的序列；以及JFH-1株的编码从NS2蛋白区的N-末端第17位氨基酸到C-末端的序列、NS3蛋白编码序列、NS4A蛋白编码序列、NS4B蛋白编码序列、NS5A蛋白编码序列、NS5B蛋白编码区和3’-非翻译区，其中在E2HVR1区中其包含含有3个重复的FLAG肽序列的核苷酸序列。

在序列表中，SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12分别显示了pJ6/JFH-1、pJ6/JFH-1(1XFLAG)和pJ6/JFH-1(3XFLAG)的核苷酸序列。

实施例2：体外RNA合成和RNA引入细胞

pJ6/JFH-1、pJ6/JFH-1(1XFLAG)、和pJ6/JFH-1(3XFLAG)分别用XbaI裂解并用苯酚/氯仿抽提，然后用乙醇沉淀。以所裂解的各质粒作为模板，用MEGAscript T7试剂盒(Ambion)合成HCV RNA。

将Huh7细胞(3×10⁶个细胞)和5μgHCV RNA悬浮于400μlCytomix溶液中(120mM KCl、0.15mM CaCl₂、10mMK₂HPO₄/KH₂PO₄、25mM Hepes、2mM EGTA、5mM MgCl₂、20mMATP和50mM谷胱甘肽)，移至4-mm小杯内，用Gene Pulser(BioRad)在260V和950μF下进行电穿孔。其后，将引入HCV RNA的细胞接种于10cm²平皿中，然后进行传代培养。

实施例3：用引入J6/JFH-1(3XFLAG)RNA的细胞制备HCV颗粒

当对引入J6/JFH-1或J6/JFH-1(3XFLAG)RNA的细胞进行传代培养时，用HCV抗原ELISA试验试剂盒(Ortho)对培养上清液中所含的各HCV核心蛋白进行定量，以确定HCV颗粒产生情况。结果发现当引入J6/JFH-1RNA时，HCV颗粒的产量在基本上恒定的水平处保持不变。然而，当引入J6/JFH-1(3XFLAG)RNA时，引入后21天之前培养上清液的HCV核心蛋白的量随时间下降，然后在引入后第22天开始增加，在引入后的35天达到与J6/JFH-1几乎同样的水平(图3)。这表明，尽管当引入Huh7细胞时，J6/JFH-1(3XFLAG)RNA不具备高的产病毒能力，但在适应性突变(对于病毒制备是必需的)引入病毒基因组之后，其具有与J6/JFH-1RNA类似的产病毒能力。

实施例4：HCV蛋白在引入了J6/JFH-1(3XFLAG)RNA的细胞中的表达

在J6/JFH-1或J6/JFH-1(3XFLAG)RNA引入后第4、17、30和43天，通过蛋白印迹确证HCV蛋白在细胞中表达。在该分析中，将没有引入RNA的Huh7细胞所获得的细胞提取物样品用作阴性对照。将从细胞提取的样品进行SDS-PAGE，并印在PVDF膜上(Immobilon-P，Millipore)。其后，使用ECL Plus(GE Healthcare)，将抗核心单克隆抗体、抗FLAG单克隆抗体(M2抗体，Sigma)、抗E2单克隆抗体和识别这些抗体的HRP-标记的第二抗体用于检测在细胞中翻译的核心蛋白和E2蛋白。

结果发现，在J6/JFH-1(3XFLAG)引入后30和43天，E2蛋白的分子量比刚引入RNA时更小(图4)。在核心蛋白中没有观察到这种变化。这样，用去糖基化酶PNGase F处理这些E2蛋白，结果不再观察到分子量的差异(图5)。这说明J6/JFH-1(3XFLAG)RNA基因组的E2区可通过重复传代培养细胞引起基因突变，且突变位点可能是糖链结合位点。

实施例5：重复传代培养的受J6/JFH-1(3XFLAG)病毒感染的细胞的HCV基因组序列的分析

为了检查适应性突变(这对于J6/JFH-1(3XFLAG)病毒具有高度感染性是必需的)，在引入RNA后8和39天从受感染的细胞中提取总RNA，对其所含的HCV基因组序列进行分析。

结果发现，天冬酰胺AAU(N)(E2区的糖链添加位点)被赖氨酸AAA(K)取代；当除去在该位点的糖链修饰时，其分子量比在引入RNA时的E2蛋白的分子量小(图6)。当将位于J6CF株的核心蛋白N-末端的甲硫氨酸算作第一位氨基酸时，天冬酰胺相当于第534位氨基酸(GeneBank登记号AF177036，Yanagi，M.等，Virology，262，1999，第250-263页)。

实施例6：J6/JFH-1(3XFLAG)病毒颗粒的纯化

为了纯化J6/JFH-1(3XFLAG)病毒颗粒，使用引入J6/JFH-1(3XFLAG)RNA后56天的培养上清液。向含600μl该培养上清液的容器中加入用0.1M甘氨酸-HCl(pH 3.5)预处理的500μl M2抗体琼脂糖(Sigma)，于40℃下反复颠倒容器2小时使其混合。回收流分(flow-through fraction)，同时用TBS缓冲液洗涤M2抗体琼脂糖三次时，并用200μl 1XFLAG肽(Sigma)溶液或3XFLAG肽(Sigma)溶液洗脱三次。用HCV抗原ELISA试验试剂盒(Ortho)定量测定洗脱样品中的HCV核心蛋白。结果发现，可用任一种FLAG肽进行洗脱，纯化效率约为5％(图7)。

为了检查洗脱样品的纯度，将相当于0.1fmol HCV核心的洗脱样品和未纯化的培养上清液进行SDS-PAGE。其后，进行银染以确定各溶液中所含污染蛋白的存在情况；然而，在洗脱样品中几乎没有观察到污染蛋白(图8)。由此确定，洗脱样品中的HCV颗粒是高度纯化的。

实施例7：纯化的J6/JFH-1(3XFLAG)病毒的感染性评价

为了评价实施例6中纯化的J6/JFH-1(3XFLAG)病毒的感染性，用所培养的细胞进行感染实验。将Huh7细胞以1×10⁴细胞/孔接种于8孔玻璃槽中，培养24小时，然后用相当于1fmol HCV核心的病毒溶液感染3小时。感染后，用DMEM(Sigma)洗涤两次并再培养4天。4天后，依照Trizol Reagent(Invitrogen)所附的厂商说明书从细胞提取总RNA。通过定量RT-PCR测定总RNA中的HCV RNA量。使用正义引物S-17(SEQ ID NO：13)、反义引物R-19(SEQ ID NO：14)和靶向HCV RNA的5’-UTR的TaqMan探针。将所述引物、探针和所提取的总RNA混合在一起，依照TaqMan EZ RT-PCR Core Reagents(AppliedBiosystems)所附的厂商说明书制备RT-PCR反应溶液，接着用7500Fast Real Time PCR系统(Applied Biosystems)进行检测。结果发现，纯化的6/JFH-1(3XFLAG)病毒溶液对Huh7细胞具有感染性(图9)。这表明，可高度纯化HCV E2的HVR1区插入了FLAG标签序列的病毒，并且这种纯化病毒具有感染性。

实施例8：J6/JFH-1(1XFLAG)E2N→K和J6/JFH-1(3XFLAG)E2N→K突变质粒的构建

构建了实施例5所述的pJ6/JFH-1(1XFLAG)N→K和pJ6/JFH-1(3XFLAG)N→K质粒，其具有J6/JFH-1(3XFLAG)病毒的高度感染性所需的适应性突变(即在E2区的糖链添加位点处天冬酰胺AAT(N6)取代为赖氨酸AAA(K))。制备所述质粒的方法在图10(A)-(C)中显示。

具体而言，向作为模板的pJ6/JFH-1(1XFLAG)加入来自PhusionHigh-Fidelity DNA聚合酶试剂盒(FINNZYMES)的10μl 10×缓冲液、4μl 2mM dNTP混合物、各1μl的10μM引物1141S-2a(SEQ ID NO：16)和J6E2-K-R(SEQ ID NO：17)，然后加入去离子水至总体积为49.5μl。其后，加入0.5μl Phusion DNA聚合酶(FINNZYMES)，然后进行30个循环的PCR，其中一个循环由98℃10秒钟、55℃5秒钟、72℃1.5分钟组成。得到的PCR产物命名为PCR产物No.7。

随后，向作为模板的pJ6/JFH1(3XFLAG)加入来自PhusionHigh-Fidelity DNA聚合酶试剂盒(FINNZYMES)的10μl 10×缓冲液、4μl 2mM dNTP混合物、各1μl的10μM引物1141S-2a(SEQ ID NO：16)和J6E2-K-R(SEQ ID NO：17)，然后加入去离子水至总体积为49.5μl。其后，加入0.5μl Phusion DNA聚合酶(FINNZYMES)，然后进行30个循环的PCR，其中一个循环由98℃10秒钟、55℃15秒钟、72℃1.5分钟组成。得到的PCR产物命名为PCR产物No.8。

向作为模板的pJ6/JFH-1加入来自Phusion High-Fidelity DNA聚合酶试剂盒(FINNZYMES)的10μl 10×缓冲液、4μl 2mM dNTP混合物、各1μl的10μM引物J6E2-K-F(SEQ ID NO：18)和3189R-IH(SEQ IDNO：19)，然后加入去离子水至总体积为49.5μl。其后，加入0.5μlPhusion DNA聚合酶(FINNZYMES)，然后进行30个循环的PCR，其中一个循环由98℃10秒钟、55℃15秒钟、72℃1.5分钟组成。得到的PCR产物命名为PCR产物No.9。

将各PCR产物进行纯化并溶解于50μl水中。将PCR产物No.7DNA(1μl)与PCR产物No.9DNA(1μl)混合。向用作模板的混合物加入来自Phusion High-Fidelity DNA聚合酶试剂盒(FINNZYMES)的10μl10×缓冲液、4μl 2mM dNTP混合物、各1μl的10μM引物1141S-2a(SEQ ID NO：16)和3189R-IH(SEQ ID NO：19)，然后加入去离子水至总体积为49.5μl。其后，加入0.5μl Phusion DNA聚合酶(FINNZYMES)，然后进行30个循环的PCR，其中一个循环由98℃10秒钟、55℃ 15秒钟、72℃2分钟组成。得到的PCR产物命名为PCR产物No.10。

随后，将PCR产物No.8DNA(1μl)与PCR产物No.9DNA(1μl)混合。向用作模板的混合物加入来自Phusion High-Fidelity DNA聚合酶试剂盒(FINNZYMES)的10μl 10×缓冲液、4μl 2mM dNTP混合物、各1μl的10μM引物1141S-2a(SEQ ID NO：16)和3189R-IH(SEQ IDNO：19)，然后加入去离子水至总体积为49.5μl。其后，加入0.5μlPhusion DNA聚合酶(FINNZYMES)，然后进行30个循环的PCR，其中一个循环由98℃ 10秒钟、55℃15秒钟、72℃2分钟组成。得到的PCR产物命名为PCR产物No.11。将各PCR产物进行纯化并溶解于30μl水中。

分别用KpnI限制性内切酶消化J6/JFH-1和纯化的PCR产物No.10，用琼脂糖凝胶电泳分离并随后纯化HCV cDNA片段。将两个DNA片段与Ligation Mix(TAKARA BIO INC，Japan)混合，使两个DNA片段连接。载体命名为pJ6/JFH-1(1XFLAG)N→K。pJ6/JFH-1(1XFLAG)N→K包含编码嵌合基因的核苷酸序列，其按照5’-3’的顺序依次包含：J6CF株的5’-非翻译区、核心蛋白编码序列、E1蛋白编码序列、E2蛋白编码序列、p7蛋白编码序列、编码NS2蛋白区N-末端16个氨基酸的序列；以及JFH-1株的编码NS2蛋白区的从N-末端第17位氨基酸到C-末端的区域的序列、NS3蛋白编码序列、NS4A蛋白编码序列、NS4B蛋白编码序列、NS5A蛋白编码序列、NS5B蛋白编码区和3’-非翻译区，其中pJ6/JFH-1(1XFLAG)N→K包含：在NS2 HVR1区中的编码FLAG肽序列的核苷酸序列；以及当将位于核心蛋白N-末端的甲硫氨酸算作第一位氨基酸时在532位含有赖氨酸的核苷酸序列。

用KpnI限制性内切酶分别消化J6/JFH1和纯化的PCR产物No.11，并用琼脂糖凝胶电泳分离并随后纯化各HCV cDNA片段。将两个DNA片段与Ligation Mix(TAKAEA BIO INC，Japan)混合，使两个DNA片段连接。将载体命名为pJ6/JFH-1(3XFLAG)N→K。pJ6/JFH-1(3XFLAG)N→K含有编码嵌合基因的核苷酸序列，其按照5’-3’的顺序依次包含：J6CF株的5’-非翻译区、核心蛋白编码序列、E1蛋白编码序列、E2蛋白编码序列、p7蛋白编码序列和编码NS2蛋白区N-末端16个氨基酸的序列；以及JFH-1株的编码NS2蛋白区的从N-末端第17位氨基酸到C-末端的区域的序列、NS3蛋白编码序列、NS4A蛋白编码序列、NS4B蛋白编码序列、NS5A蛋白编码序列、NS5B蛋白编码序列和3’-非翻译区，其中pJ6/JFH-1(3XFLAG)N→K包含：在NS2 HVR1区中的编码3个重复FLAG肽序列的核苷酸序列；以及当将位于核心蛋白N-末端的甲硫氨酸算作第一位氨基酸时在532位上含有赖氨酸的核苷酸序列。

在序列表中，pJ6/JFH-1(1XFLAG)N→K和pJ6/JFH-1(3XFLAG)N→K的核苷酸序列分别如SEQ ID NO：20和SEQ ID NO：21所示。

实施例9：J6/JFH-1(1XFLAG)E2N→K和J6/JFH-1(3XFLAG)E2N→K病毒的制备

用XbaI裂解实施例8中所制备的质粒，并用苯酚/氯仿抽提，再用乙醇沉淀。使用MEGAscript T7试剂盒(Ambion)，将所裂解的质粒各自作为模板来合成HCV RNA。

将Huh7细胞(3×10⁶个细胞)和5μgHCV RNA悬浮于400μlCytomix溶液(120mM KCl，0.15mM CaCl₂，10mM K₂HPO₄/KH₂PO₄，25mM Hepes，2mM EGTA，5mM MgCl₂，20mM ATP和50mM谷胱甘肽)中，移至4-mm小杯中，然后用Gene Pulser(BioRad)于260V和950μF下进行电转化。其后，将已引入HCV RNA的细胞接种于10cm²平皿中，随后进行传代培养。

当对已引入J6/JFH-1(1XFLAG)E2N→K或J6/JFH-1(3XFLAG)E2N→K RNA的细胞进行传代培养时，用HCV抗原ELISA试剂盒(Ortho)定量测定培养上清液中所含的各HCV核心蛋白，从而确定HCV颗粒产生情况。在培养初期到培养后期期间，将引入了没有突变的RNA的细胞培养上清液所含HCV核心蛋白的量与引入了有突变的RNA的细胞培养上清液所含HCV核心蛋白的量进行比较。结果发现后者的量较高。

实施例10：含有插入HCV E2HVR1区中的FLAG-标签序列的JFH-1质粒的构建

以与实施例1同样的方式将表位标签序列引入到2a基因型JFH-1株的HVR1(GeneBank登记号AB047639，Kato，T.等，Gastroenterology，125，2003，第1808-1817页)中。将含有1或3个重复FLAG序列的cDNA作为表位插入。产生的质粒分别称作JFH-1(1XFLAG)和JFH-1(3XFLAG)。

图11显示了由所述基因翻译的邻接FLAG标签插入位点的从E2蛋白N-端氨基酸开始的氨基酸序列。

由pJFH-1(又称作“pJFH1”)编码的E2蛋白N-末端序列、由pJFH-1(1XFLAG)编码的E2蛋白N-末端序列和由pJFH-1(3XFLAG)编码的E2蛋白N-末端序列分别在SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23和SEQ IDNO：24中显示。在图12(A)-(C)显示了制备这些质粒的方法。

具体而言，向作为模板的pJFH-1cDNA中加入来自PhusionHigh-Fidelity DNA聚合酶试剂盒(FINNZYMES)的10μl 10×缓冲液、4μl 2mM dNTP混合物、各1μl的10μM引物JFH1-F(SEQ ID NO：25)和JFH1-1F-R(SEQ ID NO：26)，然后用去离子水补至总体积49.5μl。其后，加入0.5μl Phusion DNA聚合酶(FINNZYMES)，然后进行30个循环的PCR，其中一个循环由98℃10秒钟、55℃15秒钟和72℃30秒钟组成。产生的PCR产物命名为PCR产物No.12。

随后，向作为模板的pJFH-1cDNA中加入来自PhusionHigh-Fidelity DNA聚合酶试剂盒(FINNZYMES)的10μl 10×缓冲液、4μl 2mM dNTP混合物和各1μl的10μM引物3189R-IH(SEQ ID NO：19)和JFH1-1F-F(SEQ ID NO：27)，然后用去离子水补至总体积49.5μl。其后，加入0.5μl Phusion DNA聚合酶(FINNZYMES)，然后进行30个循环的PCR，其中一个循环由98℃ 10秒钟、55℃15秒钟和72℃1分30秒组成。产生的PCR产物命名为PCR产物No.13。

向作为模板的JFH-1 cDNA中加入来自Phusion High-FidelityDNA聚合酶试剂盒(FINNZYMES)的10μl 10×缓冲液、4μl 2mMdNTP混合物、各1μl的10μM引物JFH1-F(SEQ ID NO：25)和JFH-1-3F-R(SEQ ID NO：28)，然后用去离子水补至总体积49.5μl。其后，加入0.5μl Phusion DNA聚合酶(FINNZYMES)，然后进行30个循环的PCR，其中一个循环由98℃ 10秒钟、55℃15秒钟和72℃30秒钟组成。产生的PCR产物命名为PCR产物No.14。

向作为模板的pJFH-1 cDNA中加入来自Phusion High-FidelityDNA聚合酶试剂盒(FINNZYMES)的10μl 10×缓冲液、4μl 2mMdNTP混合物、各1μl的10μM引物3189R-IH(SEQ ID NO：19)和JFH1-3F-F(SEQ ID NO：29)，然后用去离子水补至总体积49.5μl。其后，加入0.5μl Phusion DNA聚合酶(FINNZYMES)，然后进行30个循环的PCR，其中一个循环由98℃10秒钟、55℃ 15秒钟和72℃ 1.5分钟组成。产生的PCR产物命名为PCR产物No.15。

将PCR产物纯化并溶解于15μl水中。将PCR产物No.12DNA(1μl)与PCR产物No.13DNA(1μl)混合。向用作模板的混合物中加入来自Phusion High-Fidelity DNA聚合酶试剂盒(FINNZYMES)的10μl10×缓冲液、4μl 2mM dNTP混合物以及各1μl的10μM引物JFH1-F(SEQ ID NO：25)和3189R-IH(SEQ ID NO：19)，然后用去离子水补至总体积49.5μl。其后，加入0.5μl Phusion DNA聚合酶(FINNZYMES)，然后进行30个循环的PCR，其中一个循环由98℃ 10秒钟、55℃ 15秒钟和72℃ 2分钟组成。产生的PCR产物命名为PCR产物No.16。

将PCR产物No.14 DNA(1μl)与PCR产物No.15 DNA(1μl)混合。向用作模板的混合物中加入来自Phusion High-Fidelity DNA聚合酶试剂盒(FINNZYMES)的10μl 10×缓冲液、4μl 2mM dNTP混合物以及各1μl的10μM引物JFH1-F(SEQ ID NO：25)和3189R-IH(SEQID NO：19)，然后用去离子水补至总体积49.5μl。其后，加入0.5μlPhusion DNA聚合酶(FINNZYMES)，然后进行30个循环的PCR，其中一个循环由98℃ 10秒钟、55℃ 15秒钟和72℃ 2分钟组成。产生的PCR产物命名为PCR产物No.17。将各PCR产物纯化并溶解于30μl水中。

分别用EcoRI和KpnI限制性内切酶消化pJFH-1 cDNA和纯化的PCR产物No.16，并用琼脂糖凝胶电泳分离并随后纯化HCV cDNA。将两个DNA片段与Ligation Mix(TAKARA BIO INC，Japan)混合，使两个DNA片段连接。载体命名为pJFH-1(1XFLAG)。pJFH-1(1XFLAG)含有编码JFH1株基因的核苷酸序列，其中在E2 HVR1区其包含编码FLAG肽序列的核苷酸序列。随后，分别用EcoRI和KpnI限制性内切酶消化pJFH1cDNA和纯化的PCR产物No.17，并用琼脂糖凝胶电泳分离并随后纯化HCV cDNA片段。将两个DNA片段与Ligation Mix(TAKARA BIO INC，Japan)混合，使两个DNA片段连接。载体命名为pJFH-1(3XFLAG)。pJFH-1(3XFLAG)含有编码JFH1株基因的核苷酸序列，其中在E2HVR1区中其包含由3个重复的FLAG肽序列的核苷酸序列。

在序列表中，pJFH-1(1XFLAG)和pJFH-1(3XFLAG)的核苷酸序列分别如SEQ ID NO：30和SEQ ID NO：31所示。

实施例11：含有插入HCV E2 HVR1区的FLAG标签序列的质粒TH/JFH-1的构建

用作HCV基因组RNA的cDNA是TH/JFH-1嵌合体cDNA，其包含1b基因型TH1株的从5’-UTR到NS2的N-末端第16位氨基酸的序列(Wakita，T.等，J.Biol.Chem.，269，14205-14210，1994，日本专利公开(kokai)第2004-179A号)和2a基因型JFH-1株的从NS 2的N-末端第17位氨基酸到3’-UTR的序列(GeneBank登记号AB047639，Kato，T.等，Gastroenterology，125，2003，第1808-1817页)。将表位标签序列引入TH/JFH-1的HVR1中。含有1或3个重复FLAG序列的cDNA作为表位标记插入。产生的质粒分别称作pTH/JFH-1(1XFLAG)和pTH/JFH-1(3XFLAG)。

图13显示了由所述基因翻译的邻接FLAG标签插入位点的并从E2蛋白N-端氨基酸开始的氨基酸序列。

由pTH/JFH-1编码的E2蛋白N-末端序列、由pTH/JFH-1(1XFLAG)编码的E2蛋白N-末端序列和由pTH/JFH-1(3XFLAG)编码的E2蛋白N-末端序列分别如SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：33和SEQ ID NO：34所示。在图14中显示了制备质粒的方法。

首先制备TH/JFH-1。向作为模板的pJFH-1 cDNA中加入来自Phusion High-Fidelity DNA聚合酶试剂盒(FINNZYMES)的10μl 10×缓冲液、4μl 2mM dNTP混合液、各1μl的10μM引物JFH1-A(SEQ IDNO：43)和JFH1-B(SEQ ID NO：44)，然后用去离子水补至总体积49.5μl。其后，加入0.5μl Phusion DNA聚合酶(FINNZYMES)，然后进行PCR以扩增JFH-1的5′-非翻译区和引物JFH1-B中所含的TH核心的一部分。进行30个循环的PCR，其中一个循环由98℃ 10秒钟、55℃15秒钟和72℃30秒钟组成。产生的PCR产物命名为PCR产物No.18。

随后，向作为模板的pTH中(Wakita，T.等，J.Biol.Chem.，269，14205-14210，1994和Moradpour等，Biochem.Biophys.Res.Commun.，246：920-924，1998)加入来自Phusion High-Fidelity DNA聚合酶试剂盒的10μl 10×缓冲液、4μl 2mM dNTP混合液、各1μl的10μM引物TH-C(SEQ ID NO：45)和TH-D(SEQ ID NO：46)，然后用去离子水补至总体积49.5μl。其后，加入0.5μl Phusion DNA聚合酶(FINNZYMES)，然后进行PCR以扩增TH的核心至NS2的一部分、引物TH-C所含JFH-1的5′-非翻译区的一部分和引物YH-D所含JFH-1的NS2的一部分。进行30个循环的PCR，其中一个循环由98℃ 10秒钟、55℃ 15秒钟和72℃ 30秒钟组成。产生的PCR产物命名为PCR产物No.19。

向作为模板的pJFH-1中加入来自Phusion High-Fidelity DNA聚合酶试剂盒(FINNZYMES)的10μl 10×缓冲液、4μl 2mM dNTP混合液、各1μl的10μM引物JFH1-E(SEQ ID NO：47)和JFH1-F(SEQ ID NO：48)，然后用去离子水补至总体积49.5μl。其后，加入0.5μl PhusionDNA聚合酶(FINNZYMES)，然后进行PCR以扩增JFH-1的NS2和NS3的一部分以及引物JFH1-E所含的TH的NS2的一部分。进行30个循环的PCR，其中一个循环由98℃ 10秒钟、55℃ 15秒钟和72℃ 30秒钟组成。产生的PCR产物命名为PCR产物No.20。

用PCR产物No.18、19和20以及JFH-A和JFH-E引物进行PCR，得到由JFH-1株的5′-翻译区至TH株的核心至NS2的一部分、以及JFH-1的NS2至NS3的一部分(PCR产物No.21)组成的片段。

随后，用限制性内切酶EcoRI和SpeI分别处理pJFH-1和PCR产物No.21，并连接各片段得到pTH/JFH-1。用该质粒制备pTH/JFH-1(1XFLAG)和pTH/JFH-1(3XFLAG)的方法如图14(A)-(C)所示。

具体而言，向作为模板的pTH/JFH-1cDNA中加入来自PhusionHigh-Fidelity DNA聚合酶试剂盒(FINNZYMES)的10μl 10×缓冲液、4μl 2mM dNTP混合液、各1μl的10μM引物TH-F(SEQ ID NO：35)和TH-1F-R(SEQ ID NO：36)，然后用去离子水补至总体积49.5μl。其后，加入0.5μl Phusion DNA聚合酶(FINNZYMES)，然后进行30个循环的PCR，其中一个循环由98℃ 10秒钟、55℃ 15秒钟和72℃ 30秒钟组成。产生的PCR产物命名为PCR产物No.22。

向作为模板的pTH/JFH-1 cDNA中加入来自Phusion High-FidelityDNA聚合酶试剂盒(FINNZYMES)的10μl 10×缓冲液、4μl 2mMdNTP混合液、各1μl的10μM引物3189R-IH(SEQ ID NO：19)和TH-1F-F(SEQ ID NO：37)，然后用去离子水补至总体积49.5μl。其后，加入0.5μl Phusion DNA聚合酶(FINNZYMES)，然后进行PCR。PCR进行30个循环，其中一个循环由98℃ 10秒钟、55℃ 15秒钟和72℃1.5分钟组成。产生的PCR产物命名为PCR产物No.23。

随后，在作为模板的pTH/JFH1 cDNA加入来自PhusionHigh-Fidelity DNA聚合酶试剂盒(FINNZYMES)的10μl 10×缓冲液、4μl 2mM dNTP混合液和各1μl的10μM引物TH-F(SEQ ID NO：35)和TH-3F-R(SEQ ID NO：38)，然后用去离子水补至总体积49.5μl。其后，加入0.5μl Phusion DNA聚合酶(FINNZYMES)，然后进行30个循环的PCR，其中一个循环由98℃ 10秒钟、55℃15秒钟和72℃ 30秒钟组成。产生的PCR产物命名为PCR产物No.24。

随后，向作为模板的pTH/JFH-1cDNA加入来自PhusionHigh-Fidelity DNA聚合酶试剂盒(FINNZYMES)的10μl 10×缓冲液、4μl 2mM dNTP混合液、各1μl的10μM引物3189R-IH(SEQ ID NO：19)和TH-3F-F(SEQ ID NO：39)，然后用去离子水补至总体积最终为49.5μl。其后，加入0.5μl Phusion DNA聚合酶(FINNZYMES)，然后进行30个循环的PCR，其中一个循环由98℃ 10秒钟、55℃ 15秒钟和72℃ 1.5分钟组成。产生的PCR产物命名为PCR产物No.25。

分别将PCR产物进行纯化并溶解于15μl水中。将PCR产物No.22DNA(1μl)与PCR产物No.23 DNA(1μl)混合。向用作模板的混合物中加入来自Phusion High-Fidelity DNA聚合酶试剂盒(FINNZYMES)的10μl 10×缓冲液、4μl 2mM dNTP混合物、各1μl的10μM引物TH-F(SEQ ID NO：35)和3189R-IH(SEQ ID NO：19)，然后用去离子水补至总体积为49.5μl。其后加入0.5μl Phusion DNA聚合酶(FINNZYMES)，然后进行PCR。进行30个循环的PCR，其中一个循环由98℃ 10秒钟、55℃ 15秒钟和72℃ 2分钟组成。产生的PCR产物命名为PCR产物No.26。

随后，将PCR产物No.24 DNA(1μl)与PCR产物No.25 DNA(1μl)混合。向用作模板的混合物中加入来自Phusion High-Fidelity DNA聚合酶试剂盒(FINNZYMES)的10μl 10×缓冲液、4μl 2mM dNTP混合物、各1μl的10μM引物TH-F(SEQ ID NO：35)和3189R-IH(SEQ IDNO：19)，然后用去离子水补至总体积为49.5μl。其后加入0.5μlPhusion DNA聚合酶(FINNZYMES)，然后进行30个循环的PCR，其中一个循环由98℃ 10秒钟、55℃ 15秒钟和72℃ 2分钟组成。产生的PCR产物命名为PCR产物No.27。将PCR产物进行纯化并溶解于30μl水中。

用KpnI限制性内切酶分别消化pTH/JFH-1 cDNA和纯化的PCR产物No.26，并用琼脂糖凝胶电泳分离并随后纯化HCV cDNA片段。将两个DNA片段与Ligation Mix(TAKARA BIO INC，Japan)混合，使两个DNA片段连接。将载体命名为pTH/JFH-1(1XFLAG)。pTH/JFH-1(1XFLAG)包含编码TH1株基因的核苷酸序列，并且包含在E2 HVR1区中的编码FLAG肽序列的核苷酸序列。

用KpnI限制性内切酶分别消化pTH/JFH1 cDNA和纯化的PCR产物No.27，并用琼脂糖凝胶电泳分离并随后纯化HCV cDNA片段。将两个DNA片段与Ligation Mix(TAKARA BIO INC，Japan)混合，使两个DNA片段连接。将载体命名为pTH/JFH-1(3XFLAG)。pTH/JFH-1(3XFLAG)包含编码TH1株基因的核苷酸序列，并且包含在E2 HVR1区中的含有3个重复FLAG肽序列的核苷酸序列。

在序列表中，pTH/JFH1、pTH/JFH-1(1XFLAG)和pTH/JFH-1(3XFLAG)的核苷酸序列分别如SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：41和SEQ ID NO：42所示。

当引入到培养的允许HCV的细胞(例如Huh7)中时，上述实施例中制得的载体所合成的所有RNA均能产生表位标记的HCV颗粒。使含有表位标记的HCV颗粒的培养上清液流过填有支持体(所述支持体上固定化有抗表位标记的抗体)的柱，以使表位标记的HCV颗粒特异性吸附到支持体，然后进行洗脱。由此使目标HCV颗粒纯化。

工业实用性

根据本发明的在培养细胞系统中制备和纯化HCV颗粒的方法，与传统技术相比，可更容易并以更高纯度纯化HCV颗粒。由于本发明方法所提供的HCV颗粒是高纯度的，因而它们适合用作预防或治疗HCV的疫苗。此外，本发明表位标记的HCV颗粒适合用作诱导抗HCV抗体的工具。

由于本发明方法所提供的HCV颗粒是高纯度的，因而它们适合用作预防或治疗HCV的疫苗。此外，本发明表位标记的HCV颗粒适合用作诱导抗HCV抗体的工具。

本文所引用的所有出版物、专利和专利申请通过引用全部结合到本文中。

序列表全文

SEQ ID NO：1：J6/JFH-1编码的E2蛋白N末端序列

SEQ ID NO：2：pJ6/JFH-1(1XFLAG)编码的E2蛋白N末端序列

SEQ ID NO：3：pJ6/JFH-1(3XFLAG)编码的E2蛋白N末端序列

SEQ ID NO：4：引物(E2-F)

SEQ ID NO：5：引物(1F-R)

SEQ ID NO：6：引物(E2-R)

SEQ ID NO：7：引物(1F-F)

SEQ ID NO：8：引物(E2-F)

SEQ ID NO：9：引物(3F-R)

SEQ ID NO：10：pJ6/JFH-1

SEQ ID NO：11：pJ6/JFH-1(1XFLAG)

SEQ ID NO：12：pJ6/JFH-1(3XFLAG)

SEQ ID NO：13：引物(S-17)

SEQ ID NO：14：引物(R-19)

SEQ ID NO：15：探针

SEQ ID NO：16：引物(1141S-2a)

SEQ ID NO：17：引物(J6E2-K-R)

SEQ ID NO：18：引物(J6E2-K-F)

SEQ ID NO：19：引物(3189R-1H)

SEQ ID NO：20：pJ6/JFH-1(1×FLAG)N→K

SEQ ID NO：21：pJ6/JFH-1(3×FLAG)N→K

SEQ ID NO：22：pJFH-1编码的E2蛋白N末端序列

SEQ ID NO：23：pJFH-1(1XFLAG)编码的E2蛋白N末端序列

SEQ ID NO：24：pJFH-1(3XFLAG)编码的E2蛋白N末端序列

SEQ ID NO：25：引物(JFH1-F)

SEQ ID NO：26：引物(JFH1-1F-R)

SEQ ID NO：27：引物(JFH1-1F-F)

SEQ ID NO：28：引物(JFH1-3F-R)

SEQ ID NO：29：引物(JFH1-3F-F)

SEQ ID NO：30：pJFH-1(1XFLAG)

SEQ ID NO：31：pJFH-1(3XFLAG)

SEQ ID NO：32：pTH/JFH-1编码的E2蛋白N末端序列

SEQ ID NO：33：pTH/JFH-1(1XFLAG)编码的E2蛋白N末端序列

SEQ ID NO：34：pTH/FH-1(3XFLAG)编码的E2蛋白N末端序列

SEQ ID NO：35：引物(TH-F)

SEQ ID NO：36：引物(TH-1F-R)

SEQ ID NO：37：引物(TH-1F-F)

SEQ ID NO：38：引物(TH-3F-R)

SEQ ID NO：39：引物(TH-3F-F)

SEQ ID NO：40：pTH/JFH1

SEQ ID NO：41：pTH/JFH1(1XFLAG)

SEQ ID NO：42：pTH/JFH1(3XFLAG)

SEQ ID NO：43：引物(JFH1-A)

SEQ ID NO：44：引物(JFH1-B)

SEQ ID NO：45：引物(TH-C)

SEQ ID NO：46：引物(TH-D)

SEQ ID NO：47：引物(JFH1-E)

SEQ ID NO：48：引物(JFH1-F)

SEQ ID NO：49：表位标签肽(1XFLAG+接头)

SEQ ID NO：50：表位标签肽(3XFLAG+接头)

SEQ ID NO：51：表位标签肽(1XFLAG)

SEQ ID NO：52：表位标签肽(3XFLAG)

SEQ ID NO：53：接头

SEQ ID NO：54：接头

序列表

<110>日本国立感染症研究所

     财团法人东京都医学研究机构

 

<120>表位标记的丙型肝炎病毒颗粒的制备和应用

 

<130>PH-3617-PCT

 

<140>PCT/JP2008/062977

<141>2008-07-11

 

<150>JP 2007-184587

<151>2007-07-13

 

<160>54

 

<170>PatentIn version 3.4

 

<210>1

<211>51

<212>PRT

<213>人工

 

<220>

<223>J6/JFH-1中编码的E2蛋白N末端序列

 

<400>1

Arg Thr His Thr Val Gly Gly Ser Ala Ala Gln Thr Thr Gly Arg Leu

1               5                   10                  15

Thr Ser Leu Phe Asp Met Gly Pro Arg Gln Lys Ile Gln Leu Val Asn

            20                  25                  30

Thr Asn Gly Ser Trp His Ile Asn Arg Thr Ala Asn Cys Asn Asp Ser

        35                  40                  45

Leu His Thr

    50

 

<210>2

<211>55

<212>PRT

<213>人工

 

<220>

<223>pJ6/JFH-1(1XFLAG)中编码的E2蛋白N末端序列

 

<400>2

Arg Thr His Thr Val Gly Gly Ser Ala Ala Asp Tyr Lys Asp Asp Asp

1               5                   10                  15

Asp Lys Gly Gly Gly Ser Leu Phe Asp Met Gly Pro Arg Gln Lys Ile

            20                  25                  30

Gln Leu Val Asn Thr Asn Gly Ser Trp His Ile Asn Arg Thr Ala Asn

        35                  40                  45

Cys Asn Asp Ser Leu His Thr

    50                  55

<210>3

<211>69

<212>PRT

<213>人工

 

<220>

<223>pJ6/JFH-1(3XFLAG)中编码的E2蛋白N末端序列

 

<400>3

 

Arg Thr His Thr Val Gly Gly Ser Ala Ala Asp Tyr Lys Asp His Asp

1               5                   10                  15

Gly Asp Tyr Lys Asp His Asp Ile Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys

            20                  25                  30

Gly Gly Gly Ser Leu Phe Asp Met Gly Pro Arg Gln Lys Ile Gln Leu

        35                  40                  45

Val Asn Thr Asn Gly Ser Trp His Ile Asn Arg Thr Ala Asn Cys Asn

    50                  55                  60

Asp Ser Leu His Thr

65

 

<210>4

<211>20

<212>DNA

<213>人工

 

<220>

<223>引物(E2-F)

 

<400>4

cctggtacca tcactggaca                              20

 

<210>5

<211>44

<212>DNA

<213>人工

 

<220>

<223>引物(1F-R)

 

<400>5

cccttgtcat cgtcatcctt gtaatccgcg gcagaacccc caac   44

 

<210>6

<211>20

<212>DNA

<213>人工

 

<220>

<223>引物(E2-R)

 

<400>6

tgggtggtac ccactcctga                              20

 

<210>7

<211>44

<212>DNA

<213>人工

 

<220>

<223>引物(1F-F)

<400>7

aggatgacga tgacaaggga ggcggtagct  tatttgacat gggc                    44

 

<210>8

<211>65

<212>DNA

<213>人工

 

<220>

<223>引物(3F-R)

 

<400>8

taatcgatgt catgatcttt ataatcaccg tcatggtctt tgtagtccgc ggcagaaccc    60

ccaac                                                                65

 

<210>9

<211>65

<212>DNA

<213>人工

 

<220>

<223>引物(3F-F)

 

<400>9

aagatcatga catcgattac aaggatgacg atgacaaggg aggcggtagc ttatttgaca    60

tgggc                                                                65

 

<210>10

<211>9683

<212>DNA

<213>人工

 

<220>

<223>pJ6/JFH-1

 

<400>10

acccgcccct aataggggcg acactccgcc atgaatcact cccctgtgag gaactactgt     60

cttcacgcag aaagcgtcta gccatggcgt tagtatgagt gtcgtacagc ctccaggccc    120

ccccctcccg ggagagccat agtggtctgc ggaaccggtg agtacaccgg aattgccggg    180

aagactgggt cctttcttgg ataaacccac tctatgcccg gccatttggg cgtgcccccg    240

caagactgct agccgagtag cgttgggttg cgaaaggcct tgtggtactg cctgataggg     300

tgcttgcgag tgccccggga ggtctcgtag accgtgcacc atgagcacaa atcctaaacc     360

tcaaagaaaa accaaaagaa acaccaaccg tcgcccacaa gacgttaagt ttccgggcgg     420

cggccagatc gttggcggag tatacttgtt gccgcgcagg ggccccaggt tgggtgtgcg     480

cgcgacaagg aagacttcgg agcggtccca gccacgtgga aggcgccagc ccatccctaa     540

agatcggcgc tccactggca aatcctgggg aaaaccagga tacccctggc ccctatacgg     600

gaatgaggga ctcggctggg caggatggct cctgtccccc cgaggttccc gtccctcttg     660

gggccccaat gacccccggc ataggtcgcg caacgtgggt aaggtcatcg ataccctaac     720

gtgcggcttt gccgacctca tggggtacat ccctgtcgtg ggcgccccgc tcggcggcgt     780

cgccagagct ctcgcgcatg gcgtgagagt cctggaggac ggggttaatt ttgcaacagg     840

gaacttaccc ggttgctcct tttctatctt cttgctggcc ctgctgtcct gcatcaccac     900

cccggtctcc gctgccgaag tgaagaacat cagtaccggc tacatggtga ctaacgactg     960

caccaatgac agcattacct ggcagctcca ggctgctgtc ctccacgtcc ccgggtgcgt    1020

cccgtgcgag aaagtgggga atgcatctca gtgctggata ccggtctcac cgaatgtggc    1080

cgtgcagcgg cccggcgccc tcacgcaggg cttgcggacg cacatcgaca tggttgtgat    1140

gtccgccacg ctctgctctg ccctctacgt gggggacctc tgcggtgggg tgatgctcgc    1200

agcccaaatg ttcattgtct cgccgcagca ccactggttt gtccaagact gcaattgctc    1260

catctaccct ggtaccatca ctggacaccg catggcatgg gacatgatga tgaactggtc    1320

gcccacggct accatgatct tggcgtacgc gatgcgtgtc cccgaggtca ttatagacat    1380

cattagcggg gctcattggg gcgtcatgtt cggcttggcc tacttctcta tgcagggagc    1440

gtgggcgaaa gtcgttgtca tccttctgtt ggccgccggg gtggacgcgc gcacccatac    1500

tgttgggggt tctgccgcgc agaccaccgg gcgcctcacc agcttatttg acatgggccc    1560

caggcagaaa atccagctcg ttaacaccaa tggcagctgg cacatcaacc gcaccgccct    1620

gaactgcaat gactccttgc acaccggctt tatcgcgtct ctgttctaca cccacagctt    1680

caactcgtca ggatgtcccg aacgcatgtc cgcctgccgc agtatcgagg ccttccgggt    1740

gggatggggc gccttgcaat atgaggataa tgtcaccaat ccagaggata tgagacccta    1800

ttgctggcac tacccaccaa ggcagtgtgg cgtggtctcc gcgaagactg tgtgtggccc    1860

agtgtactgt ttcaccccca gcccagtggt agtgggcacg accgacaggc ttggagcgcc    1920

cacttacacg tggggggaga atgagacaga tgtcttccta ttgaacagca ctcgaccacc    1980

gctggggtca tggttcggct gcacgtggat gaactcttct ggctacacca agacttgcgg    2040

cgcaccaccc tgccgtacta gagctgactt caacgccagc acggacctgt tgtgccccac    2100

ggactgtttt aggaagcatc ctgataccac ttacctcaaa tgcggctctg ggccctggct    2160

cacgccaagg tgcctgatcg actaccccta caggctctgg cattacccct gcacagttaa    2220

ctataccatc ttcaaaataa ggatgtatgt gggaggggtt gagcacaggc tcacggctgc    2280

atgcaatttc actcgtgggg atcgttgcaa cttggaggac agagacagaa gtcaactgtc    2340

tcctttgttg cactccacca cggaatgggc cattttacct tgctcttact cggacctgcc    2400

cgccttgtcg actggtcttc tccacctcca ccaaaacatc gtggacgtac aattcatgta    2460

tggcctatca cctgccctca caaaatacat cgtccgatgg gagtgggtaa tactcttatt    2520

cctgctctta gcggacgcca gggtttgcgc ctgcttatgg atgctcatct tgttgggcca    2580

ggccgaagca gcactagaga agctggtcat cttgcacgct gcgagcgcag ctagctgcaa    2640

tggcttccta tattttgtca tctttttcgt ggctgcttgg tacatcaagg gtcgggtagt    2700

ccccttagct acctattccc tcactggcct gtggtccttt agcctactgc tcctagcatt    2760

gccccaacag gcttatgctt atgacgcatc tgtgcatggc cagataggag cggctctgct    2820

ggtaatgatc accctcttca cactcacccc ggggtataag accctcctcg gccagtgtct    2880

gtggtggttg tgctatctcc tgaccctggg ggaagccatg attcaggagt gggtaccacc    2940

catgcaggtg cgcggcggcc gcgatggcat cgcgtgggcc gtcactatat tctgcccggg    3000

tgtggtgttt gacattacca aatggctttt ggcgttgctt gggcctgctt acctcttaag    3060

ggccgctttg acacatgtgc cgtacttcgt cagagctcac gctctgataa gggtatgcgc    3120

tttggtgaag cagctcgcgg ggggtaggta tgttcaggtg gcgctattgg cccttggcag    3180

gtggactggc acctacatct atgaccacct cacacctatg tcggactggg ccgctagcgg    3240

cctgcgcgac ttagcggtcg ccgtggaacc catcatcttc agtccgatgg agaagaaggt    3300

catcgtctgg ggagcggaga cggctgcatg tggggacatt ctacatggac ttcccgtgtc    3360

cgcccgactc ggccaggaga tcctcctcgg cccagctgat ggctacacct ccaaggggtg    3420

gaagctcctt gctcccatca ctgcttatgc ccagcaaaca cgaggcctcc tgggcgccat    3480

agtggtgagt atgacggggc gtgacaggac agaacaggcc ggggaagtcc aaatcctgtc    3540

cacagtctct cagtccttcc tcggaacaac catctcgggg gttttgtgga ctgtttacca    3600

cggagctggc aacaagactc tagccggctt acggggtccg gtcacgcaga tgtactcgag    3660

tgctgagggg gacttggtag gctggcccag cccccctggg accaagtctt tggagccgtg    3720

caagtgtgga gccgtcgacc tatatctggt cacgcggaac gctgatgtca tcccggctcg    3780

gagacgcggg gacaagcggg gagcattgct ctccccgaga cccatttcga ccttgaaggg    3840

gtcctcgggg gggccggtgc tctgccctag gggccacgtc gttgggctct tccgagcagc    3900

tgtgtgctct cggggcgtgg ccaaatccat cgatttcatc cccgttgaga cactcgacgt    3960

tgttacaagg tctcccactt tcagtgacaa cagcacgcca ccggctgtgc cccagaccta    4020

tcaggtcggg tacttgcatg ctccaactgg cagtggaaag agcaccaagg tccctgtcgc    4080

gtatgccgcc caggggtaca aagtactagt gcttaacccc tcggtagctg ccaccctggg    4140

gtttggggcg tacctatcca aggcacatgg catcaatccc aacattagga ctggagtcag    4200

gaccgtgatg accggggagg ccatcacgta ctccacatat ggcaaatttc tcgccgatgg    4260

gggctgcgct agcggcgcct atgacatcat catatgcgat gaatgccacg ctgtggatgc    4320

tacctccatt ctcggcatcg gaacggtcct tgatcaagca gagacagccg gggtcagact    4380

aactgtgctg gctacggcca caccccccgg gtcagtgaca accccccatc ccgatataga    4440

agaggtaggc ctcgggcggg agggtgagat ccccttctat gggagggcga ttcccctatc    4500

ctgcatcaag ggagggagac acctgatttt ctgccactca aagaaaaagt gtgacgagct    4560

cgcggcggcc cttcggggca tgggcttgaa tgccgtggca tactatagag ggttggacgt    4620

ctccataata ccagctcagg gagatgtggt ggtcgtcgcc accgacgccc tcatgacggg    4680

gtacactgga gactttgact ccgtgatcga ctgcaatgta gcggtcaccc aagctgtcga    4740

cttcagcctg gaccccacct tcactataac cacacagact gtcccacaag acgctgtctc    4800

acgcagtcag cgccgcgggc gcacaggtag aggaagacag ggcacttata ggtatgtttc    4860

cactggtgaa cgagcctcag gaatgtttga cagtgtagtg ctttgtgagt gctacgacgc    4920

aggggctgcg tggtacgatc tcacaccagc ggagaccacc gtcaggctta gagcgtattt    4980

caacacgccc ggcctacccg tgtgtcaaga ccatcttgaa ttttgggagg cagttttcac    5040

cggcctcaca cacatagacg cccacttcct ctcccaaaca aagcaagcgg gggagaactt    5100

cgcgtaccta gtagcctacc aagctacggt gtgcgccaga gccaaggccc ctcccccgtc    5160

ctgggacgcc atgtggaagt gcctggcccg actcaagcct acgcttgcgg gccccacacc    5220

tctcctgtac cgtttgggcc ctattaccaa tgaggtcacc ctcacacacc ctgggacgaa    5280

gtacatcgcc acatgcatgc aagctgacct tgaggtcatg accagcacgt gggtcctagc    5340

tggaggagtc ctggcagccg tcgccgcata ttgcctggcg actggatgcg tttccatcat    5400

cggccgcttg cacgtcaacc agcgagtcgt cgttgcgccg gataaggagg tcctgtatga    5460

ggcttttgat gagatggagg aatgcgcctc tagggcggct ctcatcgaag aggggcagcg    5520

gatagccgag atgttgaagt ccaagatcca aggcttgctg cagcaggcct ctaagcaggc    5580

ccaggacata caacccgcta tgcaggcttc atggcccaaa gtggaacaat tttgggccag    5640

acacatgtgg aacttcatta gcggcatcca atacctcgca ggattgtcaa cactgccagg    5700

gaaccccgcg gtggcttcca tgatggcatt cagtgccgcc ctcaccagtc cgttgtcgac    5760

cagtaccacc atccttctca acatcatggg aggctggtta gcgtcccaga tcgcaccacc    5820

cgcgggggcc accggctttg tcgtcagtgg cctggtgggg gctgccgtgg gcagcatagg    5880

cctgggtaag gtgctggtgg acatcctggc aggatatggt gcgggcattt cgggggccct    5940

cgtcgcattc aagatcatgt ctggcgagaa gccctctatg gaagatgtca tcaatctact    6000

gcctgggatc ctgtctccgg gagccctggt ggtgggggtc atctgcgcgg ccattctgcg    6060

ccgccacgtg ggaccggggg agggcgcggt ccaatggatg aacaggctta ttgcctttgc    6120

ttccagagga aaccacgtcg cccctactca ctacgtgacg gagtcggatg cgtcgcagcg    6180

tgtgacccaa ctacttggct ctcttactat aaccagccta ctcagaagac tccacaattg    6240

gataactgag gactgcccca tcccatgctc cggatcctgg ctccgcgacg tgtgggactg    6300

ggtttgcacc atcttgacag acttcaaaaa ttggctgacc tctaaattgt tccccaagct    6360

gcccggcctc cccttcatct cttgtcaaaa ggggtacaag ggtgtgtggg ccggcactgg    6420

catcatgacc acgcgctgcc cttgcggcgc caacatctct ggcaatgtcc gcctgggctc    6480

tatgaggatc acagggccta aaacctgcat gaacacctgg caggggacct ttcctatcaa    6540

ttgctacacg gagggccagt gcgcgccgaa accccccacg aactacaaga ccgccatctg    6600

gagggtggcg gcctcggagt acgcggaggt gacgcagcat gggtcgtact cctatgtaac    6660

aggactgacc actgacaatc tgaaaattcc ttgccaacta ccttctccag agtttttctc    6720

ctgggtggac ggtgtgcaga tccataggtt tgcacccaca ccaaagccgt ttttccggga    6780

tgaggtctcg ttctgcgttg ggcttaattc ctatgctgtc gggtcccagc ttccctgtga    6840

acctgagccc gacgcagacg tattgaggtc catgctaaca gatccgcccc acatcacggc    6900

ggagactgcg gcgcggcgct tggcacgggg atcacctcca tctgaggcga gctcctcagt    6960

gagccagcta tcagcaccgt cgctgcgggc cacctgcacc acccacagca acacctatga    7020

cgtggacatg gtcgatgcca acctgctcat ggagggcggt gtggctcaga cagagcctga    7080

gtccagggtg cccgttctgg actttctcga gccaatggcc gaggaagaga gcgaccttga    7140

gccctcaata ccatcggagt gcatgctccc caggagcggg tttccacggg ccttaccggc    7200

ttgggcacgg cctgactaca acccgccgct cgtggaatcg tggaggaggc cagattacca    7260

accgcccacc gttgctggtt gtgctctccc cccccccaag aaggccccga cgcctccccc    7320

aaggagacgc cggacagtgg gtctgagcga gagcaccata tcagaagccc tccagcaact    7380

ggccatcaag acctttggcc agcccccctc gagcggtgat gcaggctcgt ccacgggggc    7440

gggcgccgcc gaatccggcg gtccgacgtc ccctggtgag ccggccccct cagagacagg    7500

ttccgcctcc tctatgcccc ccctcgaggg ggagcctgga gatccggacc tggagtctga    7560

tcaggtagag cttcaacctc ccccccaggg ggggggggta gctcccggtt cgggctcggg    7620

gtcttggtct acttgctccg aggaggacga taccaccgtg tgctgctcca tgtcatactc    7680

ctggaccggg gctctaataa ctccctgtag ccccgaagag gaaaagttgc caatcaaccc    7740

tttgagtaac tcgctgttgc gataccataa caaggtgtac tgtacaacat caaagagcgc    7800

ctcacagagg gctaaaaagg taacttttga caggacgcaa gtgctcgacg cccattatga    7860

ctcagtctta aaggacatca agctagcggc ttccaaggtc agcgcaaggc tcctcacctt    7920

ggaggaggcg tgccagttga ctccacccca ttctgcaaga tccaagtatg gattcggggc    7980

caaggaggtc cgcagcttgt ccgggagggc cgttaaccac atcaagtccg tgtggaagga    8040

cctcctggaa gacccacaaa caccaattcc cacaaccatc atggccaaaa atgaggtgtt    8100

ctgcgtggac cccgccaagg ggggtaagaa accagctcgc ctcatcgttt accctgacct    8160

cggcgtccgg gtctgcgaga aaatggccct ctatgacatt acacaaaagc ttcctcaggc    8220

ggtaatggga gcttcctatg gcttccagta ctcccctgcc caacgggtgg agtatctctt    8280

gaaagcatgg gcggaaaaga aggaccccat gggtttttcg tatgataccc gatgcttcga    8340

ctcaaccgtc actgagagag acatcaggac cgaggagtcc atataccagg cctgctccct    8400

gcccgaggag gcccgcactg ccatacactc gctgactgag agactttacg taggagggcc    8460

catgttcaac agcaagggtc aaacctgcgg ttacagacgt tgccgcgcca gcggggtgct    8520

aaccactagc atgggtaaca ccatcacatg ctatgtgaaa gccctagcgg cctgcaaggc    8580

tgcggggata gttgcgccca caatgctggt atgcggcgat gacctagtag tcatctcaga    8640

aagccagggg actgaggagg acgagcggaa cctgagagcc ttcacggagg ccatgaccag    8700

gtactctgcc cctcctggtg atccccccag accggaatat gacctggagc taataacatc    8760

ctgttcctca aatgtgtctg tggcgttggg cccgcggggc cgccgcagat actacctgac    8820

cagagaccca accactccac tcgcccgggc tgcctgggaa acagttagac actcccctat    8880

caattcatgg ctgggaaaca tcatccagta tgctccaacc atatgggttc gcatggtcct    8940

aatgacacac ttcttctcca ttctcatggt ccaagacacc ctggaccaga acctcaactt    9000

tgagatgtat ggatcagtat actccgtgaa tcctttggac cttccagcca taattgagag    9060

gttacacggg cttgacgcct tttctatgca cacatactct caccacgaac tgacgcgggt  9120

ggcttcagcc ctcagaaaac ttggggcgcc acccctcagg gtgtggaaga gtcgggctcg  9180

cgcagtcagg gcgtccctca tctcccgtgg agggaaagcg gccgtttgcg gccgatatct  9240

cttcaattgg gcggtgaaga ccaagctcaa actcactcca ttgccggagg cgcgcctact  9300

ggacttatcc agttggttca ccgtcggcgc cggcgggggc gacatttttc acagcgtgtc  9360

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cttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt ttttcttttt tttttttttc  9540

cctctttctt cccttctcat cttattctac tttctttctt ggtggctcca tcttagccct  9600

agtcacggct agctgtgaaa ggtccgtgag ccgcatgact gcagagagtg ccgtaactgg  9660

tctctctgca gatcatgtct aga                                          9683

 

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cgccagagct ctcgcgcatg gcgtgagagt cctggaggac ggggttaatt ttgcaacagg     840

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gcactaccca ccaaggcagt gtggcgtggt ctccgcgaag actgtgtgtg gcccagtgta    1920

ctgtttcacc cccagcccag tggtagtggg cacgaccgac aggcttggag cgcccactta    1980

cacgtggggg gagaatgaga cagatgtctt cctattgaac agcactcgac caccgctggg    2040

gtcatggttc ggctgcacgt ggatgaactc ttctggctac accaagactt gcggcgcacc    2100

accctgccgt actagagctg acttcaacgc cagcacggac ctgttgtgcc ccacggactg    2160

ttttaggaag catcctgata ccacttacct caaatgcggc tctgggccct ggctcacgcc    2220

aaggtgcctg atcgactacc cctacaggct ctggcattac ccctgcacag ttaactatac    2280

catcttcaaa ataaggatgt atgtgggagg ggttgagcac aggctcacgg ctgcatgcaa    2340

tttcactcgt ggggatcgtt gcaacttgga ggacagagac agaagtcaac tgtctccttt    2400

gttgcactcc accacggaat gggccatttt accttgctct tactcggacc tgcccgcctt    2460

gtcgactggt cttctccacc tccaccaaaa catcgtggac gtacaattca tgtatggcct    2520

atcacctgcc ctcacaaaat acatcgtccg atgggagtgg gtaatactct tattcctgct    2580

cttagcggac gccagggttt gcgcctgctt atggatgctc atcttgttgg gccaggccga    2640

agcagcacta gagaagctgg tcatcttgca cgctgcgagc gcagctagct gcaatggctt    2700

cctatatttt gtcatctttt tcgtggctgc ttggtacatc aagggtcggg tagtcccctt    2760

agctacctat tccctcactg gcctgtggtc ctttagccta ctgctcctag cattgcccca    2820

acaggcttat gcttatgacg catctgtgca tggccagata ggagcggctc tgctggtaat    2880

gatcaccctc ttcacactca ccccggggta taagaccctc ctcggccagt gtctgtggtg    2940

gttgtgctat ctcctgaccc tgggggaagc catgattcag gagtgggtac cacccatgca    3000

ggtgcgcggc ggccgcgatg gcatcgcgtg ggccgtcact atattctgcc cgggtgtggt    3060

gtttgacatt accaaatggc ttttggcgtt gcttgggcct gcttacctct taagggccgc    3120

tttgacacat gtgccgtact tcgtcagagc tcacgctctg ataagggtat gcgctttggt    3180

gaagcagctc gcggggggta ggtatgttca ggtggcgcta ttggcccttg gcaggtggac    3240

tggcacctac atctatgacc acctcacacc tatgtcggac tgggccgcta gcggcctgcg    3300

cgacttagcg gtcgccgtgg aacccatcat cttcagtccg atggagaaga aggtcatcgt    3360

ctggggagcg gagacggctg catgtgggga cattctacat ggacttcccg tgtccgcccg    3420

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ccttgctccc atcactgctt atgcccagca aacacgaggc ctcctgggcg ccatagtggt    3540

gagtatgacg gggcgtgaca ggacagaaca ggccggggaa gtccaaatcc tgtccacagt    3600

ctctcagtcc ttcctcggaa caaccatctc gggggttttg tggactgttt accacggagc    3660

tggcaacaag actctagccg gcttacgggg tccggtcacg cagatgtact cgagtgctga    3720

gggggacttg gtaggctggc ccagcccccc tgggaccaag tctttggagc cgtgcaagtg    3780

tggagccgtc gacctatatc tggtcacgcg gaacgctgat gtcatcccgg ctcggagacg    3840

cggggacaag cggggagcat tgctctcccc gagacccatt tcgaccttga aggggtcctc    3900

gggggggccg gtgctctgcc ctaggggcca cgtcgttggg ctcttccgag cagctgtgtg    3960

ctctcggggc gtggccaaat ccatcgattt catccccgtt gagacactcg acgttgttac    4020

aaggtctccc actttcagtg acaacagcac gccaccggct gtgccccaga cctatcaggt    4080

cgggtacttg catgctccaa ctggcagtgg aaagagcacc aaggtccctg tcgcgtatgc    4140

cgcccagggg tacaaagtac tagtgcttaa cccctcggta gctgccaccc tggggtttgg    4200

ggcgtaccta tccaaggcac atggcatcaa tcccaacatt aggactggag tcaggaccgt    4260

gatgaccggg gaggccatca cgtactccac atatggcaaa tttctcgccg atgggggctg    4320

cgctagcggc gcctatgaca tcatcatatg cgatgaatgc cacgctgtgg atgctacctc    4380

cattctcggc atcggaacgg tccttgatca agcagagaca gccggggtca gactaactgt    4440

gctggctacg gccacacccc ccgggtcagt gacaaccccc catcccgata tagaagaggt    4500

aggcctcggg cgggagggtg agatcccctt ctatgggagg gcgattcccc tatcctgcat    4560

caagggaggg agacacctga ttttctgcca ctcaaagaaa aagtgtgacg agctcgcggc    4620

ggcccttcgg ggcatgggct tgaatgccgt ggcatactat agagggttgg acgtctccat    4680

aataccagct cagggagatg tggtggtcgt cgccaccgac gccctcatga cggggtacac    4740

tggagacttt gactccgtga tcgactgcaa tgtagcggtc acccaagctg tcgacttcag    4800

cctggacccc accttcacta taaccacaca gactgtccca caagacgctg tctcacgcag    4860

tcagcgccgc gggcgcacag gtagaggaag acagggcact tataggtatg tttccactgg    4920

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tgcgtggtac gatctcacac cagcggagac caccgtcagg cttagagcgt atttcaacac    5040

gcccggccta cccgtgtgtc aagaccatct tgaattttgg gaggcagttt tcaccggcct    5100

cacacacata gacgcccact tcctctccca aacaaagcaa gcgggggaga acttcgcgta    5160

cctagtagcc taccaagcta cggtgtgcgc cagagccaag gcccctcccc cgtcctggga    5220

cgccatgtgg aagtgcctgg cccgactcaa gcctacgctt gcgggcccca cacctctcct    5280

gtaccgtttg ggccctatta ccaatgaggt caccctcaca caccctggga cgaagtacat    5340

cgccacatgc atgcaagctg accttgaggt catgaccagc acgtgggtcc tagctggagg    5400

agtcctggca gccgtcgccg catattgcct ggcgactgga tgcgtttcca tcatcggccg    5460

cttgcacgtc aaccagcgag tcgtcgttgc gccggataag gaggtcctgt atgaggcttt    5520

tgatgagatg gaggaatgcg cctctagggc ggctctcatc gaagaggggc agcggatagc    5580

cgagatgttg aagtccaaga tccaaggctt gctgcagcag gcctctaagc aggcccagga    5640

catacaaccc gctatgcagg cttcatggcc caaagtggaa caattttggg ccagacacat    5700

gtggaacttc attagcggca tccaatacct cgcaggattg tcaacactgc cagggaaccc    5760

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caccatcctt ctcaacatca tgggaggctg gttagcgtcc cagatcgcac cacccgcggg    5880

ggccaccggc tttgtcgtca gtggcctggt gggggctgcc gtgggcagca taggcctggg    5940

taaggtgctg gtggacatcc tggcaggata tggtgcgggc atttcggggg ccctcgtcgc    6000

attcaagatc atgtctggcg agaagccctc tatggaagat gtcatcaatc tactgcctgg    6060

gatcctgtct ccgggagccc tggtggtggg ggtcatctgc gcggccattc tgcgccgcca    6120

cgtgggaccg ggggagggcg cggtccaatg gatgaacagg cttattgcct ttgcttccag    6180

aggaaaccac gtcgccccta ctcactacgt gacggagtcg gatgcgtcgc agcgtgtgac    6240

ccaactactt ggctctctta ctataaccag cctactcaga agactccaca attggataac    6300

tgaggactgc cccatcccat gctccggatc ctggctccgc gacgtgtggg actgggtttg    6360

caccatcttg acagacttca aaaattggct gacctctaaa ttgttcccca agctgcccgg    6420

cctccccttc atctcttgtc aaaaggggta caagggtgtg tgggccggca ctggcatcat    6480

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gatcacaggg cctaaaacct gcatgaacac ctggcagggg acctttccta tcaattgcta    6600

cacggagggc cagtgcgcgc cgaaaccccc cacgaactac aagaccgcca tctggagggt    6660

ggcggcctcg gagtacgcgg aggtgacgca gcatgggtcg tactcctatg taacaggact    6720

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catggtcgat gccaacctgc tcatggaggg cggtgtggct cagacagagc ctgagtccag    7140

ggtgcccgtt ctggactttc tcgagccaat ggccgaggaa gagagcgacc ttgagccctc    7200

aataccatcg gagtgcatgc tccccaggag cgggtttcca cgggccttac cggcttgggc    7260

acggcctgac tacaacccgc cgctcgtgga atcgtggagg aggccagatt accaaccgcc    7320

caccgttgct ggttgtgctc tccccccccc caagaaggcc ccgacgcctc ccccaaggag    7380

acgccggaca gtgggtctga gcgagagcac catatcagaa gccctccagc aactggccat    7440

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ctcctctatg ccccccctcg agggggagcc tggagatccg gacctggagt ctgatcaggt    7620

agagcttcaa cctccccccc aggggggggg ggtagctccc ggttcgggct cggggtcttg    7680

gtctacttgc tccgaggagg acgataccac cgtgtgctgc tccatgtcat actcctggac    7740

cggggctcta ataactccct gtagccccga agaggaaaag ttgccaatca accctttgag    7800

taactcgctg ttgcgatacc ataacaaggt gtactgtaca acatcaaaga gcgcctcaca    7860

gagggctaaa aaggtaactt ttgacaggac gcaagtgctc gacgcccatt atgactcagt    7920

cttaaaggac atcaagctag cggcttccaa ggtcagcgca aggctcctca ccttggagga    7980

ggcgtgccag ttgactccac cccattctgc aagatccaag tatggattcg gggccaagga    8040

ggtccgcagc ttgtccggga gggccgttaa ccacatcaag tccgtgtgga aggacctcct    8100

ggaagaccca caaacaccaa ttcccacaac catcatggcc aaaaatgagg tgttctgcgt    8160

ggaccccgcc aaggggggta agaaaccagc tcgcctcatc gtttaccctg acctcggcgt    8220

ccgggtctgc gagaaaatgg ccctctatga cattacacaa aagcttcctc aggcggtaat    8280

gggagcttcc tatggcttcc agtactcccc tgcccaacgg gtggagtatc tcttgaaagc    8340

atgggcggaa aagaaggacc ccatgggttt ttcgtatgat acccgatgct tcgactcaac    8400

cgtcactgag agagacatca ggaccgagga gtccatatac caggcctgct ccctgcccga    8460

ggaggcccgc actgccatac actcgctgac tgagagactt tacgtaggag ggcccatgtt    8520

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tagcatgggt aacaccatca catgctatgt gaaagcccta gcggcctgca aggctgcggg    8640

gatagttgcg cccacaatgc tggtatgcgg cgatgaccta gtagtcatct cagaaagcca    8700

ggggactgag gaggacgagc ggaacctgag agccttcacg gaggccatga ccaggtactc    8760

tgcccctcct ggtgatcccc ccagaccgga atatgacctg gagctaataa catcctgttc    8820

ctcaaatgtg tctgtggcgt tgggcccgcg gggccgccgc agatactacc tgaccagaga    8880

cccaaccact ccactcgccc gggctgcctg ggaaacagtt agacactccc ctatcaattc    8940

atggctggga aacatcatcc agtatgctcc aaccatatgg gttcgcatgg tcctaatgac    9000

acacttcttc tccattctca tggtccaaga caccctggac cagaacctca actttgagat    9060

gtatggatca gtatactccg tgaatccttt ggaccttcca gccataattg agaggttaca    9120

cgggcttgac gccttttcta tgcacacata ctctcaccac gaactgacgc gggtggcttc    9180

agccctcaga aaacttgggg cgccacccct cagggtgtgg aagagtcggg ctcgcgcagt    9240

cagggcgtcc ctcatctccc gtggagggaa agcggccgtt tgcggccgat atctcttcaa    9300

ttgggcggtg aagaccaagc tcaaactcac tccattgccg gaggcgcgcc tactggactt    9360

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ccgaccccgc tcattactct tcggcctact cctacttttc gtaggggtag gcctcttcct    9480

actccccgct cggtagagcg gcacacacta ggtacactcc atagctaact gttccttttt    9540

tttttttttt tttttttttt tttttttttt ttttttttct tttttttttt tttccctctt    9600

tcttcccttc tcatcttatt ctactttctt  tcttggtggc tccatcttag ccctagtcac    9660

ggctagctgt gaaaggtccg tgagccgcat gactgcagag agtgccgtaa ctggtctctc     9720

tgcagatcat gtctaga                                                    9737

 

<210>13

<211>17

<212>DNA

<213>人工

 

<220>

<223>引物(S-17)

 

<400>13

cgggagagcc atagtgg                                                       17

 

<210>14

<211>19

<212>DNA

<213>人工

 

<220>

<223>引物(R-19)

 

<400>14

agtaccacaa ggcctttcg                                                     19

 

<210>15

<211>20

<212>DNA

<213>人工

 

<220>

<223>探针

 

<400>15

ctgcggaacc gtgagtacac                                                    20

 

<210>16

<211>18

<212>DNA

<213>人工

 

<220>

<223>引物(1141S-2a)

 

<400>16

tgtccgccac gctctgct        18

 

<210>17

<211>21

<212>DNA

<213>人工

 

<220>

<223>引物(J6E2-K-R)

 

<400>17

atctgtctct ttctcccccc a    21

 

<210>18

<211>21

<212>DNA

<213>人工

 

<220>

<223>引物(J6E2-K-F)

 

<400>18

tggggggaga aagagacaga t    21

 

<210>19

<211>18

<212>DNA

<213>人工

 

<220>

<223>引物(3189R-1H)

 

<400>19

ccagtccacc tgccaagg        18

 

<210>20

<211>9695

<212>DNA

<213>人工

 

<220>

<223>pJ6/JFH-1(1XFLAG)N->K

<400>20

acccgcccct aataggggcg acactccgcc atgaatcact cccctgtgag gaactactgt     60

cttcacgcag aaagcgtcta gccatggcgt tagtatgagt gtcgtacagc ctccaggccc    120

ccccctcccg ggagagccat agtggtctgc ggaaccggtg agtacaccgg aattgccggg    180

aagactgggt cctttcttgg ataaacccac tctatgcccg gccatttggg cgtgcccccg    240

caagactgct agccgagtag cgttgggttg cgaaaggcct tgtggtactg cctgataggg    300

tgcttgcgag tgccccggga ggtctcgtag accgtgcacc atgagcacaa atcctaaacc    360

tcaaagaaaa accaaaagaa acaccaaccg tcgcccacaa gacgttaagt ttccgggcgg    420

cggccagatc gttggcggag tatacttgtt gccgcgcagg ggccccaggt tgggtgtgcg    480

cgcgacaagg aagacttcgg agcggtccca gccacgtgga aggcgccagc ccatccctaa    540

agatcggcgc tccactggca aatcctgggg aaaaccagga tacccctggc ccctatacgg    600

gaatgaggga ctcggctggg caggatggct cctgtccccc cgaggttccc gtccctcttg    660

gggccccaat gacccccggc ataggtcgcg caacgtgggt aaggtcatcg ataccctaac    720

gtgcggcttt gccgacctca tggggtacat ccctgtcgtg ggcgccccgc tcggcggcgt    780

cgccagagct ctcgcgcatg gcgtgagagt cctggaggac ggggttaatt ttgcaacagg    840

gaacttaccc ggttgctcct tttctatctt cttgctggcc ctgctgtcct gcatcaccac    900

cccggtctcc gctgccgaag tgaagaacat cagtaccggc tacatggtga ctaacgactg    960

caccaatgac agcattacct ggcagctcca ggctgctgtc ctccacgtcc ccgggtgcgt   1020

cccgtgcgag aaagtgggga atgcatctca gtgctggata ccggtctcac cgaatgtggc   1080

cgtgcagcgg cccggcgccc tcacgcaggg cttgcggacg cacatcgaca tggttgtgat   1140

gtccgccacg ctctgctctg ccctctacgt gggggacctc tgcggtgggg tgatgctcgc   1200

agcccaaatg ttcattgtct cgccgcagca ccactggttt gtccaagact gcaattgctc   1260

catctaccct ggtaccatca ctggacaccg catggcatgg gacatgatga tgaactggtc   1320

gcccacggct accatgatct tggcgtacgc gatgcgtgtc cccgaggtca ttatagacat   1380

cattagcggg gctcattggg gcgtcatgtt cggcttggcc tacttctcta tgcagggagc   1440

gtgggcgaaa gtcgttgtca tccttctgtt ggccgccggg gtggacgcgc gcacccatac    1500

tgttgggggt tctgccgcgg attacaagga tgacgatgac aagggaggcg gtagcttatt    1560

tgacatgggc cccaggcaga aaatccagct cgttaacacc aatggcagct ggcacatcaa    1620

ccgcaccgcc ctgaactgca atgactcctt gcacaccggc tttatcgcgt ctctgttcta    1680

cacccacagc ttcaactcgt caggatgtcc cgaacgcatg tccgcctgcc gcagtatcga    1740

ggccttccgg gtgggatggg gcgccttgca atatgaggat aatgtcacca atccagagga    1800

tatgagaccc tattgctggc actacccacc aaggcagtgt ggcgtggtct ccgcgaagac    1860

tgtgtgtggc ccagtgtact gtttcacccc cagcccagtg gtagtgggca cgaccgacag    1920

gcttggagcg cccacttaca cgtgggggga gaaagagaca gatgtcttcc tattgaacag    1980

cactcgacca ccgctggggt catggttcgg ctgcacgtgg atgaactctt ctggctacac    2040

caagacttgc ggcgcaccac cctgccgtac tagagctgac ttcaacgcca gcacggacct    2100

gttgtgcccc acggactgtt ttaggaagca tcctgatacc acttacctca aatgcggctc    2160

tgggccctgg ctcacgccaa ggtgcctgat cgactacccc tacaggctct ggcattaccc    2220

ctgcacagtt aactatacca tcttcaaaat aaggatgtat gtgggagggg ttgagcacag    2280

gctcacggct gcatgcaatt tcactcgtgg ggatcgttgc aacttggagg acagagacag    2340

aagtcaactg tctcctttgt tgcactccac cacggaatgg gccattttac cttgctctta    2400

ctcggacctg cccgccttgt cgactggtct tctccacctc caccaaaaca tcgtggacgt    2460

acaattcatg tatggcctat cacctgccct cacaaaatac atcgtccgat gggagtgggt    2520

aatactctta ttcctgctct tagcggacgc cagggtttgc gcctgcttat ggatgctcat    2580

cttgttgggc caggccgaag cagcactaga gaagctggtc atcttgcacg ctgcgagcgc    2640

agctagctgc aatggcttcc tatattttgt catctttttc gtggctgctt ggtacatcaa    2700

gggtcgggta gtccccttag ctacctattc cctcactggc ctgtggtcct ttagcctact    2760

gctcctagca ttgccccaac aggcttatgc ttatgacgca tctgtgcatg gccagatagg    2820

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cggccagtgt ctgtggtggt tgtgctatct cctgaccctg ggggaagcca tgattcagga    2940

gtgggtacca cccatgcagg tgcgcggcgg ccgcgatggc atcgcgtggg ccgtcactat    3000

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ggccgctagc ggcctgcgcg acttagcggt cgccgtggaa cccatcatct tcagtccgat    3300

ggagaagaag gtcatcgtct ggggagcgga gacggctgca tgtggggaca ttctacatgg    3360

acttcccgtg tccgcccgac tcggccagga gatcctcctc ggcccagctg atggctacac    3420

ctccaagggg tggaagctcc ttgctcccat cactgcttat gcccagcaaa cacgaggcct    3480

cctgggcgcc atagtggtga gtatgacggg gcgtgacagg acagaacagg ccggggaagt    3540

ccaaatcctg tccacagtct ctcagtcctt cctcggaaca accatctcgg gggttttgtg    3600

gactgtttac cacggagctg gcaacaagac tctagccggc ttacggggtc cggtcacgca    3660

gatgtactcg agtgctgagg gggacttggt aggctggccc agcccccctg ggaccaagtc    3720

tttggagccg tgcaagtgtg gagccgtcga cctatatctg gtcacgcgga acgctgatgt    3780

catcccggct cggagacgcg gggacaagcg gggagcattg ctctccccga gacccatttc    3840

gaccttgaag gggtcctcgg gggggccggt gctctgccct aggggccacg tcgttgggct    3900

cttccgagca gctgtgtgct ctcggggcgt ggccaaatcc atcgatttca tccccgttga    3960

gacactcgac gttgttacaa ggtctcccac tttcagtgac aacagcacgc caccggctgt    4020

gccccagacc tatcaggtcg ggtacttgca tgctccaact ggcagtggaa agagcaccaa    4080

ggtccctgtc gcgtatgccg cccaggggta caaagtacta gtgcttaacc cctcggtagc    4140

tgccaccctg gggtttgggg cgtacctatc caaggcacat ggcatcaatc ccaacattag    4200

gactggagtc aggaccgtga tgaccgggga ggccatcacg tactccacat atggcaaatt    4260

tctcgccgat gggggctgcg ctagcggcgc ctatgacatc atcatatgcg atgaatgcca    4320

cgctgtggat gctacctcca ttctcggcat cggaacggtc cttgatcaag cagagacagc    4380

cggggtcaga ctaactgtgc tggctacggc cacacccccc gggtcagtga caacccccca    4440

tcccgatata gaagaggtag gcctcgggcg ggagggtgag atccccttct atgggagggc    4500

gattccccta tcctgcatca agggagggag acacctgatt ttctgccact caaagaaaaa    4560

gtgtgacgag ctcgcggcgg cccttcgggg catgggcttg aatgccgtgg catactatag    4620

agggttggac gtctccataa taccagctca gggagatgtg gtggtcgtcg ccaccgacgc    4680

cctcatgacg gggtacactg gagactttga ctccgtgatc gactgcaatg tagcggtcac    4740

ccaagctgtc gacttcagcc tggaccccac cttcactata accacacaga ctgtcccaca    4800

agacgctgtc tcacgcagtc agcgccgcgg gcgcacaggt agaggaagac agggcactta    4860

taggtatgtt tccactggtg aacgagcctc aggaatgttt gacagtgtag tgctttgtga    4920

gtgctacgac gcaggggctg cgtggtacga tctcacacca gcggagacca ccgtcaggct    4980

tagagcgtat ttcaacacgc ccggcctacc cgtgtgtcaa gaccatcttg aattttggga    5040

ggcagttttc accggcctca cacacataga cgcccacttc ctctcccaaa caaagcaagc    5100

gggggagaac ttcgcgtacc tagtagccta ccaagctacg gtgtgcgcca gagccaaggc    5160

ccctcccccg tcctgggacg ccatgtggaa gtgcctggcc cgactcaagc ctacgcttgc    5220

gggccccaca cctctcctgt accgtttggg ccctattacc aatgaggtca ccctcacaca    5280

ccctgggacg aagtacatcg ccacatgcat gcaagctgac cttgaggtca tgaccagcac    5340

gtgggtccta gctggaggag tcctggcagc cgtcgccgca tattgcctgg cgactggatg    5400

cgtttccatc atcggccgct tgcacgtcaa ccagcgagtc gtcgttgcgc cggataagga    5460

ggtcctgtat gaggcttttg atgagatgga ggaatgcgcc tctagggcgg ctctcatcga    5520

agaggggcag cggatagccg agatgttgaa gtccaagatc caaggcttgc tgcagcaggc    5580

ctctaagcag gcccaggaca tacaacccgc tatgcaggct tcatggccca aagtggaaca    5640

attttgggcc agacacatgt ggaacttcat tagcggcatc caatacctcg caggattgtc    5700

aacactgcca gggaaccccg cggtggcttc catgatggca ttcagtgccg ccctcaccag    5760

tccgttgtcg accagtacca ccatccttct caacatcatg ggaggctggt tagcgtccca    5820

gatcgcacca cccgcggggg ccaccggctt tgtcgtcagt ggcctggtgg gggctgccgt    5880

gggcagcata ggcctgggta aggtgctggt ggacatcctg gcaggatatg gtgcgggcat    5940

ttcgggggcc ctcgtcgcat tcaagatcat gtctggcgag aagccctcta tggaagatgt    6000

catcaatcta ctgcctggga tcctgtctcc gggagccctg gtggtggggg tcatctgcgc    6060

ggccattctg cgccgccacg tgggaccggg ggagggcgcg gtccaatgga tgaacaggct    6120

tattgccttt gcttccagag gaaaccacgt cgcccctact cactacgtga cggagtcgga    6180

tgcgtcgcag cgtgtgaccc aactacttgg ctctcttact ataaccagcc tactcagaag    6240

actccacaat tggataactg aggactgccc catcccatgc tccggatcct ggctccgcga    6300

cgtgtgggac tgggtttgca ccatcttgac agacttcaaa aattggctga cctctaaatt    6360

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ggccggcact ggcatcatga ccacgcgctg cccttgcggc gccaacatct ctggcaatgt    6480

ccgcctgggc tctatgagga tcacagggcc taaaacctgc atgaacacct ggcaggggac    6540

ctttcctatc aattgctaca cggagggcca gtgcgcgccg aaacccccca cgaactacaa    6600

gaccgccatc tggagggtgg cggcctcgga gtacgcggag gtgacgcagc atgggtcgta    6660

ctcctatgta acaggactga ccactgacaa tctgaaaatt ccttgccaac taccttctcc    6720

agagtttttc tcctgggtgg acggtgtgca gatccatagg tttgcaccca caccaaagcc    6780

gtttttccgg gatgaggtct cgttctgcgt tgggcttaat tcctatgctg tcgggtccca    6840

gcttccctgt gaacctgagc ccgacgcaga cgtattgagg tccatgctaa cagatccgcc    6900

ccacatcacg gcggagactg cggcgcggcg cttggcacgg ggatcacctc catctgaggc    6960

gagctcctca gtgagccagc tatcagcacc gtcgctgcgg gccacctgca ccacccacag    7020

caacacctat gacgtggaca tggtcgatgc caacctgctc atggagggcg gtgtggctca    7080

gacagagcct gagtccaggg tgcccgttct ggactttctc gagccaatgg ccgaggaaga    7140

gagcgacctt gagccctcaa taccatcgga gtgcatgctc cccaggagcg ggtttccacg    7200

ggccttaccg gcttgggcac ggcctgacta caacccgccg ctcgtggaat cgtggaggag    7260

gccagattac caaccgccca ccgttgctgg ttgtgctctc ccccccccca agaaggcccc    7320

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ctcagagaca ggttccgcct cctctatgcc ccccctcgag ggggagcctg gagatccgga    7560

cctggagtct gatcaggtag agcttcaacc tcccccccag gggggggggg tagctcccgg    7620

ttcgggctcg gggtcttggt ctacttgctc cgaggaggac gataccaccg tgtgctgctc    7680

catgtcatac tcctggaccg gggctctaat aactccctgt agccccgaag aggaaaagtt    7740

gccaatcaac cctttgagta actcgctgtt gcgataccat aacaaggtgt actgtacaac    7800

atcaaagagc gcctcacaga gggctaaaaa ggtaactttt gacaggacgc aagtgctcga    7860

cgcccattat gactcagtct taaaggacat caagctagcg gcttccaagg tcagcgcaag    7920

gctcctcacc ttggaggagg cgtgccagtt gactccaccc cattctgcaa gatccaagta    7980

tggattcggg gccaaggagg tccgcagctt gtccgggagg gccgttaacc acatcaagtc    8040

cgtgtggaag gacctcctgg aagacccaca aacaccaatt cccacaacca tcatggccaa    8100

aaatgaggtg ttctgcgtgg accccgccaa ggggggtaag aaaccagctc gcctcatcgt    8160

ttaccctgac ctcggcgtcc gggtctgcga gaaaatggcc ctctatgaca ttacacaaaa    8220

gcttcctcag gcggtaatgg gagcttccta tggcttccag tactcccctg cccaacgggt    8280

ggagtatctc ttgaaagcat gggcggaaaa gaaggacccc atgggttttt cgtatgatac    8340

ccgatgcttc gactcaaccg tcactgagag agacatcagg accgaggagt ccatatacca    8400

ggcctgctcc ctgcccgagg aggcccgcac tgccatacac tcgctgactg agagacttta    8460

cgtaggaggg cccatgttca acagcaaggg tcaaacctgc ggttacagac gttgccgcgc    8520

cagcggggtg ctaaccacta gcatgggtaa caccatcaca tgctatgtga aagccctagc    8580

ggcctgcaag gctgcgggga tagttgcgcc cacaatgctg gtatgcggcg atgacctagt    8640

agtcatctca gaaagccagg ggactgagga ggacgagcgg aacctgagag ccttcacgga    8700

ggccatgacc aggtactctg cccctcctgg tgatcccccc agaccggaat atgacctgga    8760

gctaataaca tcctgttcct caaatgtgtc tgtggcgttg ggcccgcggg gccgccgcag  8820

atactacctg accagagacc caaccactcc actcgcccgg gctgcctggg aaacagttag  8880

acactcccct atcaattcat ggctgggaaa catcatccag tatgctccaa ccatatgggt  8940

tcgcatggtc ctaatgacac acttcttctc cattctcatg gtccaagaca ccctggacca  9000

gaacctcaac tttgagatgt atggatcagt atactccgtg aatcctttgg accttccagc  9060

cataattgag aggttacacg ggcttgacgc cttttctatg cacacatact ctcaccacga  9120

actgacgcgg gtggcttcag ccctcagaaa acttggggcg ccacccctca gggtgtggaa  9180

gagtcgggct cgcgcagtca gggcgtccct catctcccgt ggagggaaag cggccgtttg  9240

cggccgatat ctcttcaatt gggcggtgaa gaccaagctc aaactcactc cattgccgga  9300

ggcgcgccta ctggacttat ccagttggtt caccgtcggc gccggcgggg gcgacatttt  9360

tcacagcgtg tcgcgcgccc gaccccgctc attactcttc ggcctactcc tacttttcgt  9420

aggggtaggc ctcttcctac tccccgctcg gtagagcggc acacactagg tacactccat  9480

agctaactgt tccttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt ttttttcttt  9540

tttttttttt tccctctttc ttcccttctc atcttattct actttctttc ttggtggctc  9600

catcttagcc ctagtcacgg ctagctgtga aaggtccgtg agccgcatga ctgcagagag  9660

tgccgtaact ggtctctctg cagatcatgt ctaga                             9695

 

<210>21

<211>9737

<212>DNA

<213>人工

 

<220>

<223>pJ6/JFH-1(3XFLAG)N->K

 

<400>21

acccgcccct aataggggcg acactccgcc atgaatcact cccctgtgag gaactactgt   60

cttcacgcag aaagcgtcta gccatggcgt tagtatgagt gtcgtacagc ctccaggccc  120

ccccctcccg ggagagccat agtggtctgc ggaaccggtg agtacaccgg aattgccggg  180

aagactgggt cctttcttgg ataaacccac tctatgcccg gccatttggg cgtgcccccg  240

caagactgct agccgagtag cgttgggttg cgaaaggcct tgtggtactg cctgataggg    300

tgcttgcgag tgccccggga ggtctcgtag accgtgcacc atgagcacaa atcctaaacc    360

tcaaagaaaa accaaaagaa acaccaaccg tcgcccacaa gacgttaagt ttccgggcgg    420

cggccagatc gttggcggag tatacttgtt gccgcgcagg ggccccaggt tgggtgtgcg    480

cgcgacaagg aagacttcgg agcggtccca gccacgtgga aggcgccagc ccatccctaa    540

agatcggcgc tccactggca aatcctgggg aaaaccagga tacccctggc ccctatacgg    600

gaatgaggga ctcggctggg caggatggct cctgtccccc cgaggttccc gtccctcttg    660

gggccccaat gacccccggc ataggtcgcg caacgtgggt aaggtcatcg ataccctaac    720

gtgcggcttt gccgacctca tggggtacat ccctgtcgtg ggcgccccgc tcggcggcgt    780

cgccagagct ctcgcgcatg gcgtgagagt cctggaggac ggggttaatt ttgcaacagg    840

gaacttaccc ggttgctcct tttctatctt cttgctggcc ctgctgtcct gcatcaccac    900

cccggtctcc gctgccgaag tgaagaacat cagtaccggc tacatggtga ctaacgactg    960

caccaatgac agcattacct ggcagctcca ggctgctgtc ctccacgtcc ccgggtgcgt   1020

cccgtgcgag aaagtgggga atgcatctca gtgctggata ccggtctcac cgaatgtggc   1080

cgtgcagcgg cccggcgccc tcacgcaggg cttgcggacg cacatcgaca tggttgtgat   1140

gtccgccacg ctctgctctg ccctctacgt gggggacctc tgcggtgggg tgatgctcgc   1200

agcccaaatg ttcattgtct cgccgcagca ccactggttt gtccaagact gcaattgctc   1260

catctaccct ggtaccatca ctggacaccg catggcatgg gacatgatga tgaactggtc   1320

gcccacggct accatgatct tggcgtacgc gatgcgtgtc cccgaggtca ttatagacat   1380

cattagcggg gctcattggg gcgtcatgtt cggcttggcc tacttctcta tgcagggagc   1440

gtgggcgaaa gtcgttgtca tccttctgtt ggccgccggg gtggacgcgc gcacccatac   1500

tgttgggggt tctgccgcgg actacaaaga ccatgacggt gattataaag atcatgacat   1560

cgattacaag gatgacgatg acaagggagg cggtagctta tttgacatgg gccccaggca   1620

gaaaatccag ctcgttaaca ccaatggcag ctggcacatc aaccgcaccg ccctgaactg   1680

caatgactcc ttgcacaccg gctttatcgc gtctctgttc tacacccaca gcttcaactc    1740

gtcaggatgt cccgaacgca tgtccgcctg ccgcagtatc gaggccttcc gggtgggatg    1800

gggcgccttg caatatgagg ataatgtcac caatccagag gatatgagac cctattgctg    1860

gcactaccca ccaaggcagt gtggcgtggt ctccgcgaag actgtgtgtg gcccagtgta    1920

ctgtttcacc cccagcccag tggtagtggg cacgaccgac aggcttggag cgcccactta    1980

cacgtggggg gagaaagaga cagatgtctt cctattgaac agcactcgac caccgctggg    2040

gtcatggttc ggctgcacgt ggatgaactc ttctggctac accaagactt gcggcgcacc    2100

accctgccgt actagagctg acttcaacgc cagcacggac ctgttgtgcc ccacggactg    2160

ttttaggaag catcctgata ccacttacct caaatgcggc tctgggccct ggctcacgcc    2220

aaggtgcctg atcgactacc cctacaggct ctggcattac ccctgcacag ttaactatac    2280

catcttcaaa ataaggatgt atgtgggagg ggttgagcac aggctcacgg ctgcatgcaa    2340

tttcactcgt ggggatcgtt gcaacttgga ggacagagac agaagtcaac tgtctccttt    2400

gttgcactcc accacggaat gggccatttt accttgctct tactcggacc tgcccgcctt    2460

gtcgactggt cttctccacc tccaccaaaa catcgtggac gtacaattca tgtatggcct    2520

atcacctgcc ctcacaaaat acatcgtccg atgggagtgg gtaatactct tattcctgct    2580

cttagcggac gccagggttt gcgcctgctt atggatgctc atcttgttgg gccaggccga    2640

agcagcacta gagaagctgg tcatcttgca cgctgcgagc gcagctagct gcaatggctt    2700

cctatatttt gtcatctttt tcgtggctgc ttggtacatc aagggtcggg tagtcccctt    2760

agctacctat tccctcactg gcctgtggtc ctttagccta ctgctcctag cattgcccca    2820

acaggcttat gcttatgacg catctgtgca tggccagata ggagcggctc tgctggtaat    2880

gatcaccctc ttcacactca ccccggggta taagaccctc ctcggccagt gtctgtggtg    2940

gttgtgctat ctcctgaccc tgggggaagc catgattcag gagtgggtac cacccatgca    3000

ggtgcgcggc ggccgcgatg gcatcgcgtg ggccgtcact atattctgcc cgggtgtggt    3060

gtttgacatt accaaatggc ttttggcgtt gcttgggcct gcttacctct taagggccgc    3120

tttgacacat gtgccgtact tcgtcagagc tcacgctctg ataagggtat gcgctttggt    3180

gaagcagctc gcggggggta ggtatgttca ggtggcgcta ttggcccttg gcaggtggac    3240

tggcacctac atctatgacc acctcacacc tatgtcggac tgggccgcta gcggcctgcg    3300

cgacttagcg gtcgccgtgg aacccatcat cttcagtccg atggagaaga aggtcatcgt    3360

ctggggagcg gagacggctg catgtgggga cattctacat ggacttcccg tgtccgcccg    3420

actcggccag gagatcctcc tcggcccagc tgatggctac acctccaagg ggtggaagct    3480

ccttgctccc atcactgctt atgcccagca aacacgaggc ctcctgggcg ccatagtggt    3540

gagtatgacg gggcgtgaca ggacagaaca ggccggggaa gtccaaatcc tgtccacagt    3600

ctctcagtcc ttcctcggaa caaccatctc gggggttttg tggactgttt accacggagc    3660

tggcaacaag actctagccg gcttacgggg tccggtcacg cagatgtact cgagtgctga    3720

gggggacttg gtaggctggc ccagcccccc tgggaccaag tctttggagc cgtgcaagtg    3780

tggagccgtc gacctatatc tggtcacgcg gaacgctgat gtcatcccgg ctcggagacg    3840

cggggacaag cggggagcat tgctctcccc gagacccatt tcgaccttga aggggtcctc    3900

gggggggccg gtgctctgcc ctaggggcca cgtcgttggg ctcttccgag cagctgtgtg    3960

ctctcggggc gtggccaaat ccatcgattt catccccgtt gagacactcg acgttgttac    4020

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cgggtacttg catgctccaa ctggcagtgg aaagagcacc aaggtccctg tcgcgtatgc    4140

cgcccagggg tacaaagtac tagtgcttaa cccctcggta gctgccaccc tggggtttgg    4200

ggcgtaccta tccaaggcac atggcatcaa tcccaacatt aggactggag tcaggaccgt    4260

gatgaccggg gaggccatca cgtactccac atatggcaaa tttctcgccg atgggggctg    4320

cgctagcggc gcctatgaca tcatcatatg cgatgaatgc cacgctgtgg atgctacctc    4380

cattctcggc atcggaacgg tccttgatca agcagagaca gccggggtca gactaactgt    4440

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caagggaggg agacacctga ttttctgcca ctcaaagaaa aagtgtgacg agctcgcggc    4620

ggcccttcgg ggcatgggct tgaatgccgt ggcatactat agagggttgg acgtctccat    4680

aataccagct cagggagatg tggtggtcgt cgccaccgac gccctcatga cggggtacac    4740

tggagacttt gactccgtga tcgactgcaa tgtagcggtc acccaagctg tcgacttcag    4800

cctggacccc accttcacta taaccacaca gactgtccca caagacgctg tctcacgcag    4860

tcagcgccgc gggcgcacag gtagaggaag acagggcact tataggtatg tttccactgg    4920

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tgcgtggtac gatctcacac cagcggagac caccgtcagg cttagagcgt atttcaacac    5040

gcccggccta cccgtgtgtc aagaccatct tgaattttgg gaggcagttt tcaccggcct    5100

cacacacata gacgcccact tcctctccca aacaaagcaa gcgggggaga acttcgcgta    5160

cctagtagcc taccaagcta cggtgtgcgc cagagccaag gcccctcccc cgtcctggga    5220

cgccatgtgg aagtgcctgg cccgactcaa gcctacgctt gcgggcccca cacctctcct    5280

gtaccgtttg ggccctatta ccaatgaggt caccctcaca caccctggga cgaagtacat    5340

cgccacatgc atgcaagctg accttgaggt catgaccagc acgtgggtcc tagctggagg    5400

agtcctggca gccgtcgccg catattgcct ggcgactgga tgcgtttcca tcatcggccg    5460

cttgcacgtc aaccagcgag tcgtcgttgc gccggataag gaggtcctgt atgaggcttt    5520

tgatgagatg gaggaatgcg cctctagggc ggctctcatc gaagaggggc agcggatagc    5580

cgagatgttg aagtccaaga tccaaggctt gctgcagcag gcctctaagc aggcccagga    5640

catacaaccc gctatgcagg cttcatggcc caaagtggaa caattttggg ccagacacat    5700

gtggaacttc attagcggca tccaatacct cgcaggattg tcaacactgc cagggaaccc    5760

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cgtgggaccg ggggagggcg cggtccaatg gatgaacagg cttattgcct ttgcttccag    6180

aggaaaccac gtcgccccta ctcactacgt gacggagtcg gatgcgtcgc agcgtgtgac    6240

ccaactactt ggctctctta ctataaccag cctactcaga agactccaca attggataac    6300

tgaggactgc cccatcccat gctccggatc ctggctccgc gacgtgtggg actgggtttg    6360

caccatcttg acagacttca aaaattggct gacctctaaa ttgttcccca agctgcccgg    6420

cctccccttc atctcttgtc aaaaggggta caagggtgtg tgggccggca ctggcatcat    6480

gaccacgcgc tgcccttgcg gcgccaacat ctctggcaat gtccgcctgg gctctatgag    6540

gatcacaggg cctaaaacct gcatgaacac ctggcagggg acctttccta tcaattgcta    6600

cacggagggc cagtgcgcgc cgaaaccccc cacgaactac aagaccgcca tctggagggt    6660

ggcggcctcg gagtacgcgg aggtgacgca gcatgggtcg tactcctatg taacaggact    6720

gaccactgac aatctgaaaa ttccttgcca actaccttct ccagagtttt tctcctgggt    6780

ggacggtgtg cagatccata ggtttgcacc cacaccaaag ccgtttttcc gggatgaggt    6840

ctcgttctgc gttgggctta attcctatgc tgtcgggtcc cagcttccct gtgaacctga    6900

gcccgacgca gacgtattga ggtccatgct aacagatccg ccccacatca cggcggagac    6960

tgcggcgcgg cgcttggcac ggggatcacc tccatctgag gcgagctcct cagtgagcca    7020

gctatcagca ccgtcgctgc gggccacctg caccacccac agcaacacct atgacgtgga    7080

catggtcgat gccaacctgc tcatggaggg cggtgtggct cagacagagc ctgagtccag    7140

ggtgcccgtt ctggactttc tcgagccaat ggccgaggaa gagagcgacc ttgagccctc    7200

aataccatcg gagtgcatgc tccccaggag cgggtttcca cgggccttac cggcttgggc    7260

acggcctgac tacaacccgc cgctcgtgga atcgtggagg aggccagatt accaaccgcc    7320

caccgttgct ggttgtgctc tccccccccc caagaaggcc ccgacgcctc ccccaaggag    7380

acgccggaca gtgggtctga gcgagagcac catatcagaa gccctccagc aactggccat    7440

caagaccttt ggccagcccc cctcgagcgg tgatgcaggc tcgtccacgg gggcgggcgc    7500

cgccgaatcc ggcggtccga cgtcccctgg tgagccggcc ccctcagaga caggttccgc    7560

ctcctctatg ccccccctcg agggggagcc tggagatccg gacctggagt ctgatcaggt    7620

agagcttcaa cctccccccc aggggggggg ggtagctccc ggttcgggct cggggtcttg    7680

gtctacttgc tccgaggagg acgataccac cgtgtgctgc tccatgtcat actcctggac    7740

cggggctcta ataactccct gtagccccga agaggaaaag ttgccaatca accctttgag    7800

taactcgctg ttgcgatacc ataacaaggt gtactgtaca acatcaaaga gcgcctcaca    7860

gagggctaaa aaggtaactt ttgacaggac gcaagtgctc gacgcccatt atgactcagt    7920

cttaaaggac atcaagctag cggcttccaa ggtcagcgca aggctcctca ccttggagga    7980

ggcgtgccag ttgactccac cccattctgc aagatccaag tatggattcg gggccaagga    8040

ggtccgcagc ttgtccggga gggccgttaa ccacatcaag tccgtgtgga aggacctcct    8100

ggaagaccca caaacaccaa ttcccacaac catcatggcc aaaaatgagg tgttctgcgt    8160

ggaccccgcc aaggggggta agaaaccagc tcgcctcatc gtttaccctg acctcggcgt    8220

ccgggtctgc gagaaaatgg ccctctatga cattacacaa aagcttcctc aggcggtaat    8280

gggagcttcc tatggcttcc agtactcccc tgcccaacgg gtggagtatc tcttgaaagc    8340

atgggcggaa aagaaggacc ccatgggttt ttcgtatgat acccgatgct tcgactcaac    8400

cgtcactgag agagacatca ggaccgagga gtccatatac caggcctgct ccctgcccga    8460

ggaggcccgc actgccatac actcgctgac tgagagactt tacgtaggag ggcccatgtt    8520

caacagcaag ggtcaaacct gcggttacag acgttgccgc gccagcgggg tgctaaccac    8580

tagcatgggt aacaccatca catgctatgt gaaagcccta gcggcctgca aggctgcggg    8640

gatagttgcg cccacaatgc tggtatgcgg cgatgaccta gtagtcatct cagaaagcca    8700

ggggactgag gaggacgagc ggaacctgag agccttcacg gaggccatga ccaggtactc    8760

tgcccctcct ggtgatcccc ccagaccgga atatgacctg gagctaataa catcctgttc    8820

ctcaaatgtg tctgtggcgt tgggcccgcg gggccgccgc agatactacc tgaccagaga    8880

cccaaccact ccactcgccc gggctgcctg ggaaacagtt agacactccc ctatcaattc    8940

atggctggga aacatcatcc agtatgctcc aaccatatgg gttcgcatgg tcctaatgac    9000

acacttcttc tccattctca tggtccaaga caccctggac cagaacctca actttgagat    9060

gtatggatca gtatactccg tgaatccttt ggaccttcca gccataattg agaggttaca  9120

cgggcttgac gccttttcta tgcacacata ctctcaccac gaactgacgc gggtggcttc  9180

agccctcaga aaacttgggg cgccacccct cagggtgtgg aagagtcggg ctcgcgcagt  9240

cagggcgtcc ctcatctccc gtggagggaa agcggccgtt tgcggccgat atctcttcaa  9300

ttgggcggtg aagaccaagc tcaaactcac tccattgccg gaggcgcgcc tactggactt  9360

atccagttgg ttcaccgtcg gcgccggcgg gggcgacatt tttcacagcg tgtcgcgcgc  9420

ccgaccccgc tcattactct tcggcctact cctacttttc gtaggggtag gcctcttcct  9480

actccccgct cggtagagcg gcacacacta ggtacactcc atagctaact gttccttttt  9540

tttttttttt tttttttttt tttttttttt ttttttttct tttttttttt tttccctctt  9600

tcttcccttc tcatcttatt ctactttctt tcttggtggc tccatcttag ccctagtcac  9660

ggctagctgt gaaaggtccg tgagccgcat gactgcagag agtgccgtaa ctggtctctc  9720

tgcagatcat gtctaga                                                 9737

 

<210>22

<211>30

<212>PRT

<213>人工

 

<220>

<223>pJFH-1中编码的E2蛋白N末端序列

 

<400>22

 

Gly Thr Thr Thr Val Gly Gly Ala Val Ala Arg Ser Thr Asn Val Ile

1               5                   10                  15

Ala Gly Val Phe Ser His Gly Pro Gln Gln Asn Ile Gln Leu

            20                  25                  30

<210>23

<211>34

<212>PRT

<213>人工

<220>

<223>pJFH-1(1XFLAG)中编码的E2蛋白N末端序列

 

<400>23

 

Gly Thr Thr Thr Val Gly Gly Ala Val Ala Asp Tyr Lys Asp Asp Asp

1                5                  10                  15

Asp Lys Gly Gly Gly Gly Val Phe Ser His Gly Pro Gln Gln Asn Ile

            20                  25                  30

Gln Leu

 

<210>24

<211>48

<212>PRT

<213>人工

 

<220>

<223>pJFH-1(3×FLAG)中编码的E2蛋白N末端序列

 

<400>24

Gly Thr Thr Thr Val Gly Gly Ala Val Ala Asp Tyr Lys Asp His Asp

1               5                   10                  15

Gly Asp Tyr Lys Asp His Asp Ile Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys

            20                  25                  30

Gly Gly Gly Gly Val Phe Ser His Gly Pro Gln Gln Asn Ile Gln Leu

        35                  40                  45

 

<210>25

<211>23

<212>DNA

<213>人工

 

<220>

<223>引物(JFH1-F)

 

<400>25

ccggaattct aatacgactc act                      23

<210>26

<211>44

<212>DNA

<213>人工

 

<220>

<223>引物(JFH1-1F-R)

 

<400>26

cccttgtcat cgtcatcctt gtaatctgca acagcgcctc caac                     44

 

<210>27

<211>44

<212>DNA

<213>人工

 

<220>

<223>引物(JFH1-1F-F)

 

<400>27

aggatgacga tgacaaggga ggcggtggcg tgttcagcca tggc                     44

 

<210>28

<211>65

<212>DNA

<213>人工

 

<220>

<223>引物(JFH1-3F-R)

 

<400>28

taatcgatgt catgatcttt ataatcaccg tcatggtctt tgtagtctgc aacagcgcct    60

ccaac                                                                65

 

<210>29

<211>65

<212>DNA

<213>人工

 

<220>

<223>引物(JFH1-3F-F)

 

<400>29

aagatcatga catcgattac aaggatgacg atgacaaggg aggcggtggc gtgttcagcc    60

atggc                                                                65

 

<210>30

<211>9690

<212>DNA

<213>人工

 

<220>

<223>pJFH-1(1XFLAG)

 

<400>30

acctgcccct aataggggcg acactccgcc atgaatcact cccctgtgag gaactactgt     60

cttcacgcag aaagcgccta gccatggcgt tagtatgagt gtcgtacagc ctccaggccc    120

ccccctcccg ggagagccat agtggtctgc ggaaccggtg agtacaccgg aattgccggg    180

aagactgggt cctttcttgg ataaacccac tctatgcccg gccatttggg cgtgcccccg    240

caagactgct agccgagtag cgttgggttg cgaaaggcct tgtggtactg cctgataggg    300

cgcttgcgag tgccccggga ggtctcgtag accgtgcacc atgagcacaa atcctaaacc    360

tcaaagaaaa accaaaagaa acaccaaccg tcgcccagaa gacgttaagt tcccgggcgg    420

cggccagatc gttggcggag tatacttgtt gccgcgcagg ggccccaggt tgggtgtgcg    480

cacgacaagg aaaacttcgg agcggtccca gccacgtggg agacgccagc ccatccccaa    540

agatcggcgc tccactggca aggcctgggg aaaaccaggt cgcccctggc ccctatatgg    600

gaatgaggga ctcggctggg caggatggct cctgtccccc cgaggctctc gcccctcctg    660

gggccccact gacccccggc ataggtcgcg caacgtgggt aaagtcatcg acaccctaac    720

gtgtggcttt gccgacctca tggggtacat ccccgtcgta ggcgccccgc ttagtggcgc    780

cgccagagct gtcgcgcacg gcgtgagagt cctggaggac ggggttaatt atgcaacagg    840

gaacctaccc ggtttcccct tttctatctt cttgctggcc ctgttgtcct gcatcaccgt    900

tccggtctct gctgcccagg tgaagaatac cagtagcagc tacatggtga ccaatgactg    960

ctccaatgac agcatcactt ggcagctcga ggctgcggtt ctccacgtcc ccgggtgcgt   1020

cccgtgcgag agagtgggga atacgtcacg gtgttgggtg ccagtctcgc caaacatggc   1080

tgtgcggcag cccggtgccc tcacgcaggg tctgcggacg cacatcgata tggttgtgat    1140

gtccgccacc ttctgctctg ctctctacgt gggggacctc tgtggcgggg tgatgctcgc    1200

ggcccaggtg ttcatcgtct cgccgcagta ccactggttt gtgcaagaat gcaattgctc    1260

catctaccct ggcaccatca ctggacaccg catggcatgg gacatgatga tgaactggtc    1320

gcccacggcc accatgatcc tggcgtacgt gatgcgcgtc cccgaggtca tcatagacat    1380

cgttagcggg gctcactggg gcgtcatgtt cggcttggcc tacttctcta tgcagggagc    1440

gtgggcgaag gtcattgtca tccttctgct ggccgctggg gtggacgcgg gcaccaccac    1500

cgttggaggc gctgttgcag attacaagga tgacgatgac aagggaggcg gtggcgtgtt    1560

cagccatggc cctcagcaga acattcagct cattaacacc aacggcagtt ggcacatcaa    1620

ccgtactgcc ttgaattgca atgactcctt gaacaccggc tttctcgcgg ccttgttcta    1680

caccaaccgc tttaactcgt cagggtgtcc agggcgcctg tccgcctgcc gcaacatcga    1740

ggctttccgg atagggtggg gcaccctaca gtacgaggat aatgtcacca atccagagga    1800

tatgaggccg tactgctggc actacccccc aaagccgtgt ggcgtagtcc ccgcgaggtc    1860

tgtgtgtggc ccagtgtact gtttcacccc cagcccggta gtagtgggca cgaccgacag    1920

acgtggagtg cccacctaca catggggaga gaatgagaca gatgtcttcc tactgaacag    1980

cacccgaccg ccgcagggct catggttcgg ctgcacgtgg atgaactcca ctggtttcac    2040

caagacttgt ggcgcgccac cttgccgcac cagagctgac ttcaacgcca gcacggactt    2100

gttgtgccct acggattgtt ttaggaagca tcctgatgcc acttatatta agtgtggttc    2160

tgggccctgg ctcacaccaa agtgcctggt ccactaccct tacagactct ggcattaccc    2220

ctgcacagtc aattttacca tcttcaagat aagaatgtat gtaggggggg ttgagcacag    2280

gctcacggcc gcatgcaact tcactcgtgg ggatcgctgc gacttggagg acagggacag    2340

gagtcagctg tctcctctgt tgcactctac cacggaatgg gccatcctgc cctgcaccta    2400

ctcagactta cccgctttgt caactggtct tctccacctt caccagaaca tcgtggacgt    2460

acaatacatg tatggcctct cacctgctat cacaaaatac gtcgttcgat gggagtgggt    2520

ggtactctta ttcctgctct tagcggacgc cagagtctgc gcctgcttgt ggatgctcat    2580

cttgttgggc caggccgaag cagcattgga gaagttggtc gtcttgcacg ctgcgagtgc    2640

ggctaactgc catggcctcc tatattttgc catcttcttc gtggcagctt ggcacatcag    2700

gggtcgggtg gtccccttga ccacctattg cctcactggc ctatggccct tctgcctact    2760

gctcatggca ctgccccggc aggcttatgc ctatgacgca cctgtgcacg gacagatagg    2820

cgtgggtttg ttgatattga tcaccctctt cacactcacc ccggggtata agaccctcct    2880

cggccagtgt ctgtggtggt tgtgctatct cctgaccctg ggggaagcca tgattcagga    2940

gtgggtacca cccatgcagg tgcgcggcgg ccgcgatggc atcgcgtggg ccgtcactat    3000

attctgcccg ggtgtggtgt ttgacattac caaatggctt ttggcgttgc ttgggcctgc    3060

ttacctctta agggccgctt tgacacatgt gccgtacttc gtcagagctc acgctctgat    3120

aagggtatgc gctttggtga agcagctcgc ggggggtagg tatgttcagg tggcgctatt    3180

ggcccttggc aggtggactg gcacctacat ctatgaccac ctcacaccta tgtcggactg    3240

ggccgctagc ggcctgcgcg acttagcggt cgccgtggaa cccatcatct tcagtccgat    3300

ggagaagaag gtcatcgtct ggggagcgga gacggctgca tgtggggaca ttctacatgg    3360

acttcccgtg tccgcccgac tcggccagga gatcctcctc ggcccagctg atggctacac    3420

ctccaagggg tggaagctcc ttgctcccat cactgcttat gcccagcaaa cacgaggcct    3480

cctgggcgcc atagtggtga gtatgacggg gcgtgacagg acagaacagg ccggggaagt    3540

ccaaatcctg tccacagtct ctcagtcctt cctcggaaca accatctcgg gggttttgtg    3600

gactgtttac cacggagctg gcaacaagac tctagccggc ttacggggtc cggtcacgca    3660

gatgtactcg agtgctgagg gggacttggt aggctggccc agcccccctg ggaccaagtc    3720

tttggagccg tgcaagtgtg gagccgtcga cctatatctg gtcacgcgga acgctgatgt    3780

catcccggct cggagacgcg gggacaagcg gggagcattg ctctccccga gacccatttc    3840

gaccttgaag gggtcctcgg gggggccggt gctctgccct aggggccacg tcgttgggct    3900

cttccgagca gctgtgtgct ctcggggcgt ggccaaatcc atcgatttca tccccgttga    3960

gacactcgac gttgttacaa ggtctcccac tttcagtgac aacagcacgc caccggctgt    4020

gccccagacc tatcaggtcg ggtacttgca tgctccaact ggcagtggaa agagcaccaa    4080

ggtccctgtc gcgtatgccg cccaggggta caaagtacta gtgcttaacc cctcggtagc    4140

tgccaccctg gggtttgggg cgtacctatc caaggcacat ggcatcaatc ccaacattag    4200

gactggagtc aggaccgtga tgaccgggga ggccatcacg tactccacat atggcaaatt    4260

tctcgccgat gggggctgcg ctagcggcgc ctatgacatc atcatatgcg atgaatgcca    4320

cgctgtggat gctacctcca ttctcggcat cggaacggtc cttgatcaag cagagacagc    4380

cggggtcaga ctaactgtgc tggctacggc cacacccccc gggtcagtga caacccccca    4440

tcccgatata gaagaggtag gcctcgggcg ggagggtgag atccccttct atgggagggc    4500

gattccccta tcctgcatca agggagggag acacctgatt ttctgccact caaagaaaaa    4560

gtgtgacgag ctcgcggcgg cccttcgggg catgggcttg aatgccgtgg catactatag    4620

agggttggac gtctccataa taccagctca gggagatgtg gtggtcgtcg ccaccgacgc    4680

cctcatgacg gggtacactg gagactttga ctccgtgatc gactgcaatg tagcggtcac    4740

ccaagctgtc gacttcagcc tggaccccac cttcactata accacacaga ctgtcccaca    4800

agacgctgtc tcacgcagtc agcgccgcgg gcgcacaggt agaggaagac agggcactta    4860

taggtatgtt tccactggtg aacgagcctc aggaatgttt gacagtgtag tgctttgtga    4920

gtgctacgac gcaggggctg cgtggtacga tctcacacca gcggagacca ccgtcaggct    4980

tagagcgtat ttcaacacgc ccggcctacc cgtgtgtcaa gaccatcttg aattttggga    5040

ggcagttttc accggcctca cacacataga cgcccacttc ctctcccaaa caaagcaagc    5100

gggggagaac ttcgcgtacc tagtagccta ccaagctacg gtgtgcgcca gagccaaggc    5160

ccctcccccg tcctgggacg ccatgtggaa gtgcctggcc cgactcaagc ctacgcttgc    5220

gggccccaca cctctcctgt accgtttggg ccctattacc aatgaggtca ccctcacaca    5280

ccctgggacg aagtacatcg ccacatgcat gcaagctgac cttgaggtca tgaccagcac    5340

gtgggtccta gctggaggag tcctggcagc cgtcgccgca tattgcctgg cgactggatg    5400

cgtttccatc atcggccgct tgcacgtcaa ccagcgagtc gtcgttgcgc cggataagga    5460

ggtcctgtat gaggcttttg atgagatgga ggaatgcgcc tctagggcgg ctctcatcga    5520

agaggggcag cggatagccg agatgttgaa gtccaagatc caaggcttgc tgcagcaggc    5580

ctctaagcag gcccaggaca tacaacccgc tatgcaggct tcatggccca aagtggaaca    5640

attttgggcc agacacatgt ggaacttcat tagcggcatc caatacctcg caggattgtc    5700

aacactgcca gggaaccccg cggtggcttc catgatggca ttcagtgccg ccctcaccag    5760

tccgttgtcg accagtacca ccatccttct caacatcatg ggaggctggt tagcgtccca    5820

gatcgcacca cccgcggggg ccaccggctt tgtcgtcagt ggcctggtgg gggctgccgt    5880

gggcagcata ggcctgggta aggtgctggt ggacatcctg gcaggatatg gtgcgggcat    5940

ttcgggggcc ctcgtcgcat tcaagatcat gtctggcgag aagccctcta tggaagatgt    6000

catcaatcta ctgcctggga tcctgtctcc gggagccctg gtggtggggg tcatctgcgc    6060

ggccattctg cgccgccacg tgggaccggg ggagggcgcg gtccaatgga tgaacaggct    6120

tattgccttt gcttccagag gaaaccacgt cgcccctact cactacgtga cggagtcgga    6180

tgcgtcgcag cgtgtgaccc aactacttgg ctctcttact ataaccagcc tactcagaag    6240

actccacaat tggataactg aggactgccc catcccatgc tccggatcct ggctccgcga    6300

cgtgtgggac tgggtttgca ccatcttgac agacttcaaa aattggctga cctctaaatt    6360

gttccccaag ctgcccggcc tccccttcat ctcttgtcaa aaggggtaca agggtgtgtg    6420

ggccggcact ggcatcatga ccacgcgctg cccttgcggc gccaacatct ctggcaatgt    6480

ccgcctgggc tctatgagga tcacagggcc taaaacctgc atgaacacct ggcaggggac    6540

ctttcctatc aattgctaca cggagggcca gtgcgcgccg aaacccccca cgaactacaa    6600

gaccgccatc tggagggtgg cggcctcgga gtacgcggag gtgacgcagc atgggtcgta    6660

ctcctatgta acaggactga ccactgacaa tctgaaaatt ccttgccaac taccttctcc    6720

agagtttttc tcctgggtgg acggtgtgca gatccatagg tttgcaccca caccaaagcc    6780

gtttttccgg gatgaggtct cgttctgcgt tgggcttaat tcctatgctg tcgggtccca    6840

gcttccctgt gaacctgagc ccgacgcaga cgtattgagg tccatgctaa cagatccgcc    6900

ccacatcacg gcggagactg cggcgcggcg cttggcacgg ggatcacctc catctgaggc    6960

gagctcctca gtgagccagc tatcagcacc gtcgctgcgg gccacctgca ccacccacag    7020

caacacctat gacgtggaca tggtcgatgc caacctgctc atggagggcg gtgtggctca    7080

gacagagcct gagtccaggg tgcccgttct ggactttctc gagccaatgg ccgaggaaga    7140

gagcgacctt gagccctcaa taccatcgga gtgcatgctc cccaggagcg ggtttccacg    7200

ggccttaccg gcttgggcac ggcctgacta caacccgccg ctcgtggaat cgtggaggag    7260

gccagattac caaccgccca ccgttgctgg ttgtgctctc ccccccccca agaaggcccc    7320

gacgcctccc ccaaggagac gccggacagt gggtctgagc gagagcacca tatcagaagc    7380

cctccagcaa ctggccatca agacctttgg ccagcccccc tcgagcggtg atgcaggctc    7440

gtccacgggg gcgggcgccg ccgaatccgg cggtccgacg tcccctggtg agccggcccc    7500

ctcagagaca ggttccgcct cctctatgcc ccccctcgag ggggagcctg gagatccgga    7560

cctggagtct gatcaggtag agcttcaacc tcccccccag gggggggggg tagctcccgg    7620

ttcgggctcg gggtcttggt ctacttgctc cgaggaggac gataccaccg tgtgctgctc    7680

catgtcatac tcctggaccg gggctctaat aactccctgt agccccgaag aggaaaagtt    7740

gccaatcaac cctttgagta actcgctgtt gcgataccat aacaaggtgt actgtacaac    7800

atcaaagagc gcctcacaga gggctaaaaa ggtaactttt gacaggacgc aagtgctcga    7860

cgcccattat gactcagtct taaaggacat caagctagcg gcttccaagg tcagcgcaag    7920

gctcctcacc ttggaggagg cgtgccagtt gactccaccc cattctgcaa gatccaagta    7980

tggattcggg gccaaggagg tccgcagctt gtccgggagg gccgttaacc acatcaagtc    8040

cgtgtggaag gacctcctgg aagacccaca aacaccaatt cccacaacca tcatggccaa    8100

aaatgaggtg ttctgcgtgg accccgccaa ggggggtaag aaaccagctc gcctcatcgt    8160

ttaccctgac ctcggcgtcc gggtctgcga gaaaatggcc ctctatgaca ttacacaaaa    8220

gcttcctcag gcggtaatgg gagcttccta tggcttccag tactcccctg cccaacgggt    8280

ggagtatctc ttgaaagcat gggcggaaaa gaaggacccc atgggttttt cgtatgatac    8340

ccgatgcttc gactcaaccg tcactgagag agacatcagg accgaggagt ccatatacca    8400

ggcctgctcc ctgcccgagg aggcccgcac tgccatacac tcgctgactg agagacttta  8460

cgtaggaggg cccatgttca acagcaaggg tcaaacctgc ggttacagac gttgccgcgc  8520

cagcggggtg ctaaccacta gcatgggtaa caccatcaca tgctatgtga aagccctagc  8580

ggcctgcaag gctgcgggga tagttgcgcc cacaatgctg gtatgcggcg atgacctagt  8640

agtcatctca gaaagccagg ggactgagga ggacgagcgg aacctgagag ccttcacgga  8700

ggccatgacc aggtactctg cccctcctgg tgatcccccc agaccggaat atgacctgga  8760

gctaataaca tcctgttcct caaatgtgtc tgtggcgttg ggcccgcggg gccgccgcag  8820

atactacctg accagagacc caaccactcc actcgcccgg gctgcctggg aaacagttag  8880

acactcccct atcaattcat ggctgggaaa catcatccag tatgctccaa ccatatgggt  8940

tcgcatggtc ctaatgacac acttcttctc cattctcatg gtccaagaca ccctggacca  9000

gaacctcaac tttgagatgt atggatcagt atactccgtg aatcctttgg accttccagc  9060

cataattgag aggttacacg ggcttgacgc cttttctatg cacacatact ctcaccacga  9120

actgacgcgg gtggcttcag ccctcagaaa acttggggcg ccacccctca gggtgtggaa  9180

gagtcgggct cgcgcagtca gggcgtccct catctcccgt ggagggaaag cggccgtttg  9240

cggccgatat ctcttcaatt gggcggtgaa gaccaagctc aaactcactc cattgccgga  9300

ggcgcgccta ctggacttat ccagttggtt caccgtcggc gccggcgggg gcgacatttt  9360

tcacagcgtg tcgcgcgccc gaccccgctc attactcttc ggcctactcc tacttttcgt  9420

aggggtaggc ctcttcctac tccccgctcg gtagagcggc acacactagg tacactccat  9480

agctaactgt tccttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt ttttttcttt  9540

tttttttttt tccctctttc ttcccttctc atcttattct actttctttc ttggtggctc  9600

catcttagcc ctagtcacgg ctagctgtga aaggtccgtg agccgcatga ctgcagagag  9660

tgccgtaact ggtctctctg cagatcatgt                                   9690

 

<210>31

<211>9732

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>pJFH-1(3XFLAG)

 

<400>31

acctgcccct aataggggcg acactccgcc atgaatcact cccctgtgag gaactactgt     60

cttcacgcag aaagcgccta gccatggcgt tagtatgagt gtcgtacagc ctccaggccc    120

ccccctcccg ggagagccat agtggtctgc ggaaccggtg agtacaccgg aattgccggg    180

aagactgggt cctttcttgg ataaacccac tctatgcccg gccatttggg cgtgcccccg    240

caagactgct agccgagtag cgttgggttg cgaaaggcct tgtggtactg cctgataggg    300

cgcttgcgag tgccccggga ggtctcgtag accgtgcacc atgagcacaa atcctaaacc    360

tcaaagaaaa accaaaagaa acaccaaccg tcgcccagaa gacgttaagt tcccgggcgg    420

cggccagatc gttggcggag tatacttgtt gccgcgcagg ggccccaggt tgggtgtgcg    480

cacgacaagg aaaacttcgg agcggtccca gccacgtggg agacgccagc ccatccccaa    540

agatcggcgc tccactggca aggcctgggg aaaaccaggt cgcccctggc ccctatatgg    600

gaatgaggga ctcggctggg caggatggct cctgtccccc cgaggctctc gcccctcctg    660

gggccccact gacccccggc ataggtcgcg caacgtgggt aaagtcatcg acaccctaac    720

gtgtggcttt gccgacctca tggggtacat ccccgtcgta ggcgccccgc ttagtggcgc    780

cgccagagct gtcgcgcacg gcgtgagagt cctggaggac ggggttaatt atgcaacagg    840

gaacctaccc ggtttcccct tttctatctt cttgctggcc ctgttgtcct gcatcaccgt    900

tccggtctct gctgcccagg tgaagaatac cagtagcagc tacatggtga ccaatgactg    960

ctccaatgac agcatcactt ggcagctcga ggctgcggtt ctccacgtcc ccgggtgcgt   1020

cccgtgcgag agagtgggga atacgtcacg gtgttgggtg ccagtctcgc caaacatggc   1080

tgtgcggcag cccggtgccc tcacgcaggg tctgcggacg cacatcgata tggttgtgat   1140

gtccgccacc ttctgctctg ctctctacgt gggggacctc tgtggcgggg tgatgctcgc   1200

ggcccaggtg ttcatcgtct cgccgcagta ccactggttt gtgcaagaat gcaattgctc   1260

catctaccct ggcaccatca ctggacaccg catggcatgg gacatgatga tgaactggtc   1320

gcccacggcc accatgatcc tggcgtacgt gatgcgcgtc cccgaggtca tcatagacat    1380

cgttagcggg gctcactggg gcgtcatgtt cggcttggcc tacttctcta tgcagggagc    1440

gtgggcgaag gtcattgtca tccttctgct ggccgctggg gtggacgcgg gcaccaccac    1500

cgttggaggc gctgttgcag actacaaaga ccatgacggt gattataaag atcatgacat    1560

cgattacaag gatgacgatg acaagggagg cggtggcgtg ttcagccatg gccctcagca    1620

gaacattcag ctcattaaca ccaacggcag ttggcacatc aaccgtactg ccttgaattg    1680

caatgactcc ttgaacaccg gctttctcgc ggccttgttc tacaccaacc gctttaactc    1740

gtcagggtgt ccagggcgcc tgtccgcctg ccgcaacatc gaggctttcc ggatagggtg    1800

gggcacccta cagtacgagg ataatgtcac caatccagag gatatgaggc cgtactgctg    1860

gcactacccc ccaaagccgt gtggcgtagt ccccgcgagg tctgtgtgtg gcccagtgta    1920

ctgtttcacc cccagcccgg tagtagtggg cacgaccgac agacgtggag tgcccaccta    1980

cacatgggga gagaatgaga cagatgtctt cctactgaac agcacccgac cgccgcaggg    2040

ctcatggttc ggctgcacgt ggatgaactc cactggtttc accaagactt gtggcgcgcc    2100

accttgccgc accagagctg acttcaacgc cagcacggac ttgttgtgcc ctacggattg    2160

ttttaggaag catcctgatg ccacttatat taagtgtggt tctgggccct ggctcacacc    2220

aaagtgcctg gtccactacc cttacagact ctggcattac ccctgcacag tcaattttac    2280

catcttcaag ataagaatgt atgtaggggg ggttgagcac aggctcacgg ccgcatgcaa    2340

cttcactcgt ggggatcgct gcgacttgga ggacagggac aggagtcagc tgtctcctct    2400

gttgcactct accacggaat gggccatcct gccctgcacc tactcagact tacccgcttt    2460

gtcaactggt cttctccacc ttcaccagaa catcgtggac gtacaataca tgtatggcct    2520

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cttagcggac gccagagtct gcgcctgctt gtggatgctc atcttgttgg gccaggccga    2640

agcagcattg gagaagttgg tcgtcttgca cgctgcgagt gcggctaact gccatggcct    2700

cctatatttt gccatcttct tcgtggcagc ttggcacatc aggggtcggg tggtcccctt    2760

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gtttgacatt accaaatggc ttttggcgtt gcttgggcct gcttacctct taagggccgc    3120

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ctggggagcg gagacggctg catgtgggga cattctacat ggacttcccg tgtccgcccg    3420

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ccttgctccc atcactgctt atgcccagca aacacgaggc ctcctgggcg ccatagtggt    3540

gagtatgacg gggcgtgaca ggacagaaca ggccggggaa gtccaaatcc tgtccacagt    3600

ctctcagtcc ttcctcggaa caaccatctc gggggttttg tggactgttt accacggagc    3660

tggcaacaag actctagccg gcttacgggg tccggtcacg cagatgtact cgagtgctga    3720

gggggacttg gtaggctggc ccagcccccc tgggaccaag tctttggagc cgtgcaagtg    3780

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cggggacaag cggggagcat tgctctcccc gagacccatt tcgaccttga aggggtcctc    3900

gggggggccg gtgctctgcc ctaggggcca cgtcgttggg ctcttccgag cagctgtgtg    3960

ctctcggggc gtggccaaat ccatcgattt catccccgtt gagacactcg acgttgttac    4020

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caagggaggg agacacctga ttttctgcca ctcaaagaaa aagtgtgacg agctcgcggc    4620

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gcccggccta cccgtgtgtc aagaccatct tgaattttgg gaggcagttt tcaccggcct    5100

cacacacata gacgcccact tcctctccca aacaaagcaa gcgggggaga acttcgcgta    5160

cctagtagcc taccaagcta cggtgtgcgc cagagccaag gcccctcccc cgtcctggga    5220

cgccatgtgg aagtgcctgg cccgactcaa gcctacgctt gcgggcccca cacctctcct    5280

gtaccgtttg ggccctatta ccaatgaggt caccctcaca caccctggga cgaagtacat    5340

cgccacatgc atgcaagctg accttgaggt catgaccagc acgtgggtcc tagctggagg    5400

agtcctggca gccgtcgccg catattgcct ggcgactgga tgcgtttcca tcatcggccg    5460

cttgcacgtc aaccagcgag tcgtcgttgc gccggataag gaggtcctgt atgaggcttt    5520

tgatgagatg gaggaatgcg cctctagggc ggctctcatc gaagaggggc agcggatagc    5580

cgagatgttg aagtccaaga tccaaggctt gctgcagcag gcctctaagc aggcccagga    5640

catacaaccc gctatgcagg cttcatggcc caaagtggaa caattttggg ccagacacat    5700

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attcaagatc atgtctggcg agaagccctc tatggaagat gtcatcaatc tactgcctgg    6060

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ccaactactt ggctctctta ctataaccag cctactcaga agactccaca attggataac    6300

tgaggactgc cccatcccat gctccggatc ctggctccgc gacgtgtggg actgggtttg    6360

caccatcttg acagacttca aaaattggct gacctctaaa ttgttcccca agctgcccgg    6420

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aataccatcg gagtgcatgc tccccaggag cgggtttcca cgggccttac cggcttgggc    7260

acggcctgac tacaacccgc cgctcgtgga atcgtggagg aggccagatt accaaccgcc    7320

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tgcagatcat gt                                                      9732

 

<210>32

<211>30

<212>PRT

<213>人工

 

<220>

<223>pTH/JFH1中编码的E2蛋白N末端序列

 

<400>32

 

Ala Thr Tyr Val Thr Gly Gly Ser Glu Ala Arg Gly Ala Ser Gly Leu

1               5                   10                    15

Ala Asn Leu Phe Ser Phe Gly Ala Ser Gln Lys Ile Gln Leu

            20                  25                  30

 

<210>33

<211>34

<212>PRT

<213>人工

 

<220>

<223>pTH/JFH-1(1XFLAG)中编码的E2蛋白N末端序列

 

<400>33

 

Ala Thr Tyr Val Thr Gly Gly Ser Glu Ala Asp Tyr Lys Asp Asp Asp

1               5                   10                  15

Asp Lys Gly Gly Gly Asn Leu Phe Ser Phe Gly Ala Ser Gln Lys Ile

            20                  25                  30

Gln Leu

 

<210>34

<211>48

<212>PRT

<213>人工

 

<220>

<223>pTH/JFH-1(3XFLAG)中编码的E2蛋白N末端序列

 

<400>34

 

Ala Thr Tyr Val Thr Gly Gly Ser Glu Ala Asp Tyr Lys Asp His Asp

1               5                   10                  15

Gly Asp Tyr Lys Asp His Asp Ile Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys

            20                  25                  30

Gly Gly Gly Asn Leu Phe Ser Phe Gly Ala Ser Gln Lys Ile Gln Leu

        35                  40                  45

<210>35

<211>20

<212>DNA

<213>人工

 

<220>

<223>引物(TH-F)

 

<400>35

aggcgacaac ctatccccaa                                                20

 

<210>36

<211>44

<212>DNA

<213>人工

 

<220>

<223>引物(TH-1F-R)

 

<400>36

cccttgtcat cgtcatcctt gtaatcggct  tccgaccccc ccgt                    44

 

<210>37

<211>44

<212>DNA

<213>人工

 

<220>

<223>引物(TH-1F-F)

 

<400>37

aggatgacga tgacaaggga ggcggtaacc tcttttcatt tggg                     44

 

<210>38

<211>65

<212>DNA

<213>人工

 

<220>

<223>引物(TH-3F-R)

 

<400>38

taatcgatgt catgatcttt ataatcaccg tcatggtctt tgtagtcggc ttccgacccc    60

cccgt                                                                 65

 

<210>39

<211>65

<212>DNA

<213>人工

 

<220>

<223>引物(TH-3F-F)

 

<400>39

aagatcatga catcgattac aaggatgacg atgacaaggg aggcggtaac ctcttttcat    60

ttggg                                                                65

 

<210>40

<211>9669

<212>DNA

<213>人工

 

<220>

<223>pTH/JFH1

 

<400>40

acctgcccct aataggggcg acactccgcc atgaatcact cccctgtgag gaactactgt   60

cttcacgcag aaagcgccta gccatggcgt tagtatgagt gtcgtacagc ctccaggccc  120

ccccctcccg ggagagccat agtggtctgc ggaaccggtg agtacaccgg aattgccggg  180

aagactgggt cctttcttgg ataaacccac tctatgcccg gccatttggg cgtgcccccg  240

caagactgct agccgagtag cgttgggttg cgaaaggcct tgtggtactg cctgataggg  300

cgcttgcgag tgccccggga ggtctcgtag accgtgcacc atgagcacga atcctaaacc  360

tcaaagaaaa accaaacgta acaccaaccg ccgcccacag gacgtcaagt tcccgggcgg  420

tggccagatc gttggtggag tttacctgtt gccgcgcagg ggccccaggt tgggtgtgcg  480

cgcgactagg aagacttccg agcggtcgca acctcgtgga aggcgacaac ctatccccaa  540

ggatcgccga cccgagggca gggcctgggc tcagcctggg tacccttggc ccctctatgg  600

caacgagggc atggggtggg caggatggct cctgtcaccc cgtggctccc ggcctagttg  660

gggccccaat gacccccggc gcaggtcgcg taatttgggt aaagtcatcg atacccttac  720

atgcggcttc gccgacctca tggggtacat tccgctcgtc ggcgctccct tggggggcgc     780

tgccagggcc ttggcgcatg gcgtccgggt tctggaggac ggcgtgaact atgcaacagg     840

gaatctgccc ggttgctctt tctctatctt cctcttggct ctgctgtcct gtctaaccat     900

cccagcttcc gcttatgaag tgcgcaacgt gtccggggtg taccatgtca cgaacgactg     960

ctccaactcg agcattgtgt acgagacagg ggacatgatt atgcacaccc ctgggtgcgt    1020

gccctgtgtt cgggagaaca actcctcccg ctgctgggca gcgctcactc ccacgctcgc    1080

ggccaggaac gccagcgtcc ccaccacgac aatacggcgc cacgtcgatt tgctcgttgg    1140

ggcggctgct ttctgctccg ctatgtacgt gggggatctc tgcggatctg ttttcctcgt    1200

ctcccagttg ttcaccttct cgcctcgccg gcatgagaca gtgcaggact gcaattgttc    1260

aatctatccc ggccacgtat caggtcaccg catggcttgg gatatgatga tgaactggtc    1320

acctacaaca gccctactgg tatcgcagtt actccggatc ccacaagccg tcgtggacat    1380

ggtggcgggg gcccactggg gagtcctggc gggccttgcc tactattcca tggcggggaa    1440

ctgggctaag gttttgattg tgctgctact ctttgccggc gttgatgggg cgacctacgt    1500

gacggggggg tcggaagcca gaggggcctc tggcttagca aacctctttt catttggggc    1560

gtctcagaag atccagctca taaataccaa cggcagttgg cacatcaata gaactgccct    1620

gaactgcaat gactccctcc acactgggtt tcttgccgcg ctattctaca cacacaaatt    1680

caacgcgtcc ggatgtccag agcgcatggc cagctgccgc cccattgaag agttcgctca    1740

ggggtatggt cccatcactt atgctgagcc ctccccctcg gaccagaggc cctattgctg    1800

gcactacgcg cctcgaccgt gtggtatcat acccgcgtcg caggtgtgtg gtccagtgta    1860

ctgcttcacc ccaagccctg ttgtggtggg gacgaccgat cgctccggtg cccccacgta    1920

taattggggg gcgaatgaga cggacgtgct gtatctcaac aacacgcggc cgccgcaagg    1980

caactggttc ggctgcacat ggatgaatgg caccgggttc accaagacgt gcgggggccc    2040

cccgtgcaac atcggggggg gcggcaacaa caacaccttg acctgcccca cggactgttt    2100

ccggaaacac cccgaggcca cctacaccaa atgtggttcg ggaccttggt tgacacctag    2160

gtgcatggtc gactacccat acaggctctg gcactacccc tgcaccgtta actttaccat    2220

ctttaaggtt aggatgtacg tgggaggtgt ggagcacagg ctcaacgccg catgcaattg    2280

gacccgagga gagcgttgta acttagagga cagggataga tcagagctta gcccgctgct    2340

gctgtcaaca acagagtggc aggtgctacc ttgttccttc accaccctac cggctctgtc    2400

cactggtttg atccatctcc accagaacat cgtggacgtg caatacctgt acggtatagg    2460

gtcggcggtt gtctcctatg caatcaaatg ggaatatgtc ttgttgctct tcctcctcct    2520

ggcagacgcg cgcgtctgcg cctgcttgtg gatgatgctg ctgatagctc aagctgaggc    2580

cgccttagag aacctggtgg tcctcaatgc ggcgtccctg gctggagcgc atggccttct    2640

ctctttcctt gtgttcttct gtgccgcttg gtacatcaag ggcaggttga tccccggggc    2700

ggcgtatgct ttttacggcg tatggccgct gctcctactc ctgctggcgt taccaccacg    2760

agcatacgcc atggaccggg agatggctgc atcgtgcgga ggcgcggttt ttgtaggtct    2820

ggcattcctg accttgtcac cacactataa ggcattcctc gccaagctcc tgtggtggtt    2880

gtgctatctc ctgaccctgg gggaagccat gattcaggag tgggtaccac ccatgcaggt    2940

gcgcggcggc cgcgatggca tcgcgtgggc cgtcactata ttctgcccgg gtgtggtgtt    3000

tgacattacc aaatggcttt tggcgttgct tgggcctgct tacctcttaa gggccgcttt    3060

gacacatgtg ccgtacttcg tcagagctca cgctctgata agggtatgcg ctttggtgaa    3120

gcagctcgcg gggggtaggt atgttcaggt ggcgctattg gcccttggca ggtggactgg    3180

cacctacatc tatgaccacc tcacacctat gtcggactgg gccgctagcg gcctgcgcga    3240

cttagcggtc gccgtggaac ccatcatctt cagtccgatg gagaagaagg tcatcgtctg    3300

gggagcggag acggctgcat gtggggacat tctacatgga cttcccgtgt ccgcccgact    3360

cggccaggag atcctcctcg gcccagctga tggctacacc tccaaggggt ggaagctcct    3420

tgctcccatc actgcttatg cccagcaaac acgaggcctc ctgggcgcca tagtggtgag    3480

tatgacgggg cgtgacagga cagaacaggc cggggaagtc caaatcctgt ccacagtctc    3540

tcagtccttc ctcggaacaa ccatctcggg ggttttgtgg actgtttacc acggagctgg    3600

caacaagact ctagccggct tacggggtcc ggtcacgcag atgtactcga gtgctgaggg    3660

ggacttggta ggctggccca gcccccctgg gaccaagtct ttggagccgt gcaagtgtgg    3720

agccgtcgac ctatatctgg tcacgcggaa cgctgatgtc atcccggctc ggagacgcgg    3780

ggacaagcgg ggagcattgc tctccccgag acccatttcg accttgaagg ggtcctcggg    3840

ggggccggtg ctctgcccta ggggccacgt cgttgggctc ttccgagcag ctgtgtgctc    3900

tcggggcgtg gccaaatcca tcgatttcat ccccgttgag acactcgacg ttgttacaag    3960

gtctcccact ttcagtgaca acagcacgcc accggctgtg ccccagacct atcaggtcgg    4020

gtacttgcat gctccaactg gcagtggaaa gagcaccaag gtccctgtcg cgtatgccgc    4080

ccaggggtac aaagtactag tgcttaaccc ctcggtagct gccaccctgg ggtttggggc    4140

gtacctatcc aaggcacatg gcatcaatcc caacattagg actggagtca ggaccgtgat    4200

gaccggggag gccatcacgt actccacata tggcaaattt ctcgccgatg ggggctgcgc    4260

tagcggcgcc tatgacatca tcatatgcga tgaatgccac gctgtggatg ctacctccat    4320

tctcggcatc ggaacggtcc ttgatcaagc agagacagcc ggggtcagac taactgtgct    4380

ggctacggcc acaccccccg ggtcagtgac aaccccccat cccgatatag aagaggtagg    4440

cctcgggcgg gagggtgaga tccccttcta tgggagggcg attcccctat cctgcatcaa    4500

gggagggaga cacctgattt tctgccactc aaagaaaaag tgtgacgagc tcgcggcggc    4560

ccttcggggc atgggcttga atgccgtggc atactataga gggttggacg tctccataat    4620

accagctcag ggagatgtgg tggtcgtcgc caccgacgcc ctcatgacgg ggtacactgg    4680

agactttgac tccgtgatcg actgcaatgt agcggtcacc caagctgtcg acttcagcct    4740

ggaccccacc ttcactataa ccacacagac tgtcccacaa gacgctgtct cacgcagtca    4800

gcgccgcggg cgcacaggta gaggaagaca gggcacttat aggtatgttt ccactggtga    4860

acgagcctca ggaatgtttg acagtgtagt gctttgtgag tgctacgacg caggggctgc    4920

gtggtacgat ctcacaccag cggagaccac cgtcaggctt agagcgtatt tcaacacgcc    4980

cggcctaccc gtgtgtcaag accatcttga attttgggag gcagttttca ccggcctcac    5040

acacatagac gcccacttcc tctcccaaac aaagcaagcg ggggagaact tcgcgtacct    5100

agtagcctac caagctacgg tgtgcgccag agccaaggcc cctcccccgt cctgggacgc    5160

catgtggaag tgcctggccc gactcaagcc tacgcttgcg ggccccacac ctctcctgta    5220

ccgtttgggc cctattacca atgaggtcac cctcacacac cctgggacga agtacatcgc    5280

cacatgcatg caagctgacc ttgaggtcat gaccagcacg tgggtcctag ctggaggagt    5340

cctggcagcc gtcgccgcat attgcctggc gactggatgc gtttccatca tcggccgctt    5400

gcacgtcaac cagcgagtcg tcgttgcgcc ggataaggag gtcctgtatg aggcttttga    5460

tgagatggag gaatgcgcct ctagggcggc tctcatcgaa gaggggcagc ggatagccga    5520

gatgttgaag tccaagatcc aaggcttgct gcagcaggcc tctaagcagg cccaggacat    5580

acaacccgct atgcaggctt catggcccaa agtggaacaa ttttgggcca gacacatgtg    5640

gaacttcatt agcggcatcc aatacctcgc aggattgtca acactgccag ggaaccccgc    5700

ggtggcttcc atgatggcat tcagtgccgc cctcaccagt ccgttgtcga ccagtaccac    5760

catccttctc aacatcatgg gaggctggtt agcgtcccag atcgcaccac ccgcgggggc    5820

caccggcttt gtcgtcagtg gcctggtggg ggctgccgtg ggcagcatag gcctgggtaa    5880

ggtgctggtg gacatcctgg caggatatgg tgcgggcatt tcgggggccc tcgtcgcatt    5940

caagatcatg tctggcgaga agccctctat ggaagatgtc atcaatctac tgcctgggat    6000

cctgtctccg ggagccctgg tggtgggggt catctgcgcg gccattctgc gccgccacgt    6060

gggaccgggg gagggcgcgg tccaatggat gaacaggctt attgcctttg cttccagagg    6120

aaaccacgtc gcccctactc actacgtgac ggagtcggat gcgtcgcagc gtgtgaccca    6180

actacttggc tctcttacta taaccagcct actcagaaga ctccacaatt ggataactga    6240

ggactgcccc atcccatgct ccggatcctg gctccgcgac gtgtgggact gggtttgcac    6300

catcttgaca gacttcaaaa attggctgac ctctaaattg ttccccaagc tgcccggcct    6360

ccccttcatc tcttgtcaaa aggggtacaa gggtgtgtgg gccggcactg gcatcatgac    6420

cacgcgctgc ccttgcggcg ccaacatctc tggcaatgtc cgcctgggct ctatgaggat    6480

cacagggcct aaaacctgca tgaacacctg gcaggggacc tttcctatca attgctacac    6540

ggagggccag tgcgcgccga aaccccccac gaactacaag accgccatct ggagggtggc    6600

ggcctcggag tacgcggagg tgacgcagca tgggtcgtac tcctatgtaa caggactgac    6660

cactgacaat ctgaaaattc cttgccaact accttctcca gagtttttct cctgggtgga    6720

cggtgtgcag atccataggt ttgcacccac accaaagccg tttttccggg atgaggtctc    6780

gttctgcgtt gggcttaatt cctatgctgt cgggtcccag cttccctgtg aacctgagcc    6840

cgacgcagac gtattgaggt ccatgctaac agatccgccc cacatcacgg cggagactgc    6900

ggcgcggcgc ttggcacggg gatcacctcc atctgaggcg agctcctcag tgagccagct    6960

atcagcaccg tcgctgcggg ccacctgcac cacccacagc aacacctatg acgtggacat    7020

ggtcgatgcc aacctgctca tggagggcgg tgtggctcag acagagcctg agtccagggt    7080

gcccgttctg gactttctcg agccaatggc cgaggaagag agcgaccttg agccctcaat    7140

accatcggag tgcatgctcc ccaggagcgg gtttccacgg gccttaccgg cttgggcacg    7200

gcctgactac aacccgccgc tcgtggaatc gtggaggagg ccagattacc aaccgcccac    7260

cgttgctggt tgtgctctcc ccccccccaa gaaggccccg acgcctcccc caaggagacg    7320

ccggacagtg ggtctgagcg agagcaccat atcagaagcc ctccagcaac tggccatcaa    7380

gacctttggc cagcccccct cgagcggtga tgcaggctcg tccacggggg cgggcgccgc    7440

cgaatccggc ggtccgacgt cccctggtga gccggccccc tcagagacag gttccgcctc    7500

ctctatgccc cccctcgagg gggagcctgg agatccggac ctggagtctg atcaggtaga    7560

gcttcaacct cccccccagg gggggggggt agctcccggt tcgggctcgg ggtcttggtc    7620

tacttgctcc gaggaggacg ataccaccgt gtgctgctcc atgtcatact cctggaccgg    7680

ggctctaata actccctgta gccccgaaga ggaaaagttg ccaatcaacc ctttgagtaa    7740

ctcgctgttg cgataccata acaaggtgta ctgtacaaca tcaaagagcg cctcacagag    7800

ggctaaaaag gtaacttttg acaggacgca agtgctcgac gcccattatg actcagtctt    7860

aaaggacatc aagctagcgg cttccaaggt cagcgcaagg ctcctcacct tggaggaggc    7920

gtgccagttg actccacccc attctgcaag atccaagtat ggattcgggg ccaaggaggt    7980

ccgcagcttg tccgggaggg ccgttaacca catcaagtcc gtgtggaagg acctcctgga    8040

agacccacaa acaccaattc ccacaaccat catggccaaa aatgaggtgt tctgcgtgga    8100

ccccgccaag gggggtaaga aaccagctcg cctcatcgtt taccctgacc tcggcgtccg    8160

ggtctgcgag aaaatggccc tctatgacat tacacaaaag cttcctcagg cggtaatggg    8220

agcttcctat ggcttccagt actcccctgc ccaacgggtg gagtatctct tgaaagcatg    8280

ggcggaaaag aaggacccca tgggtttttc gtatgatacc cgatgcttcg actcaaccgt    8340

cactgagaga gacatcagga ccgaggagtc catataccag gcctgctccc tgcccgagga    8400

ggcccgcact gccatacact cgctgactga gagactttac gtaggagggc ccatgttcaa    8460

cagcaagggt caaacctgcg gttacagacg ttgccgcgcc agcggggtgc taaccactag    8520

catgggtaac accatcacat gctatgtgaa agccctagcg gcctgcaagg ctgcggggat    8580

agttgcgccc acaatgctgg tatgcggcga tgacctagta gtcatctcag aaagccaggg    8640

gactgaggag gacgagcgga acctgagagc cttcacggag gccatgacca ggtactctgc    8700

ccctcctggt gatcccccca gaccggaata tgacctggag ctaataacat cctgttcctc    8760

aaatgtgtct gtggcgttgg gcccgcgggg ccgccgcaga tactacctga ccagagaccc    8820

aaccactcca ctcgcccggg ctgcctggga aacagttaga cactccccta tcaattcatg    8880

gctgggaaac atcatccagt atgctccaac catatgggtt cgcatggtcc taatgacaca    8940

cttcttctcc attctcatgg tccaagacac cctggaccag aacctcaact ttgagatgta    9000

tggatcagta tactccgtga atcctttgga ccttccagcc ataattgaga ggttacacgg    9060

gcttgacgcc ttttctatgc acacatactc tcaccacgaa ctgacgcggg tggcttcagc    9120

cctcagaaaa cttggggcgc cacccctcag ggtgtggaag agtcgggctc gcgcagtcag    9180

ggcgtccctc atctcccgtg gagggaaagc ggccgtttgc ggccgatatc tcttcaattg    9240

ggcggtgaag accaagctca aactcactcc attgccggag gcgcgcctac tggacttatc    9300

cagttggttc accgtcggcg ccggcggggg cgacattttt cacagcgtgt cgcgcgcccg    9360

accccgctca ttactcttcg gcctactcct acttttcgta ggggtaggcc tcttcctact    9420

ccccgctcgg tagagcggca cacactaggt acactccata gctaactgtt cctttttttt    9480

tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttctttt tttttttttt ccctctttct    9540

tcccttctca tcttattcta ctttctttct tggtggctcc atcttagccc tagtcacggc  9600

tagctgtgaa aggtccgtga gccgcatgac tgcagagagt gccgtaactg gtctctctgc  9660

agatcatgt                                                          9669

 

<210>41

<211>9681

<212>DNA

<213>人工

 

<220>

<223>pTH/JFH1(1XFLAG)

 

<400>41

acctgcccct aataggggcg acactccgcc atgaatcact cccctgtgag gaactactgt   60

cttcacgcag aaagcgccta gccatggcgt tagtatgagt gtcgtacagc ctccaggccc  120

ccccctcccg ggagagccat agtggtctgc ggaaccggtg agtacaccgg aattgccggg  180

aagactgggt cctttcttgg ataaacccac tctatgcccg gccatttggg cgtgcccccg  240

caagactgct agccgagtag cgttgggttg cgaaaggcct tgtggtactg cctgataggg  300

cgcttgcgag tgccccggga ggtctcgtag accgtgcacc atgagcacga atcctaaacc  360

tcaaagaaaa accaaacgta acaccaaccg ccgcccacag gacgtcaagt tcccgggcgg  420

tggccagatc gttggtggag tttacctgtt gccgcgcagg ggccccaggt tgggtgtgcg  480

cgcgactagg aagacttccg agcggtcgca acctcgtgga aggcgacaac ctatccccaa  540

ggatcgccga cccgagggca gggcctgggc tcagcctggg tacccttggc ccctctatgg  600

caacgagggc atggggtggg caggatggct cctgtcaccc cgtggctccc ggcctagttg  660

gggccccaat gacccccggc gcaggtcgcg taatttgggt aaagtcatcg atacccttac  720

atgcggcttc gccgacctca tggggtacat tccgctcgtc ggcgctccct tggggggcgc  780

tgccagggcc ttggcgcatg gcgtccgggt tctggaggac ggcgtgaact atgcaacagg  840

gaatctgccc ggttgctctt tctctatctt cctcttggct ctgctgtcct gtctaaccat  900

cccagcttcc gcttatgaag tgcgcaacgt gtccggggtg taccatgtca cgaacgactg  960

ctccaactcg agcattgtgt acgagacagg ggacatgatt atgcacaccc ctgggtgcgt    1020

gccctgtgtt cgggagaaca actcctcccg ctgctgggca gcgctcactc ccacgctcgc    1080

ggccaggaac gccagcgtcc ccaccacgac aatacggcgc cacgtcgatt tgctcgttgg    1140

ggcggctgct ttctgctccg ctatgtacgt gggggatctc tgcggatctg ttttcctcgt    1200

ctcccagttg ttcaccttct cgcctcgccg gcatgagaca gtgcaggact gcaattgttc    1260

aatctatccc ggccacgtat caggtcaccg catggcttgg gatatgatga tgaactggtc    1320

acctacaaca gccctactgg tatcgcagtt actccggatc ccacaagccg tcgtggacat    1380

ggtggcgggg gcccactggg gagtcctggc gggccttgcc tactattcca tggcggggaa    1440

ctgggctaag gttttgattg tgctgctact ctttgccggc gttgatgggg cgacctacgt    1500

gacggggggg tcggaagccg attacaagga tgacgatgac aagggaggcg gtaacctctt    1560

ttcatttggg gcgtctcaga agatccagct cataaatacc aacggcagtt ggcacatcaa    1620

tagaactgcc ctgaactgca atgactccct ccacactggg tttcttgccg cgctattcta    1680

cacacacaaa ttcaacgcgt ccggatgtcc agagcgcatg gccagctgcc gccccattga    1740

agagttcgct caggggtatg gtcccatcac ttatgctgag ccctccccct cggaccagag    1800

gccctattgc tggcactacg cgcctcgacc gtgtggtatc atacccgcgt cgcaggtgtg    1860

tggtccagtg tactgcttca ccccaagccc tgttgtggtg gggacgaccg atcgctccgg    1920

tgcccccacg tataattggg gggcgaatga gacggacgtg ctgtatctca acaacacgcg    1980

gccgccgcaa ggcaactggt tcggctgcac atggatgaat ggcaccgggt tcaccaagac    2040

gtgcgggggc cccccgtgca acatcggggg gggcggcaac aacaacacct tgacctgccc    2100

cacggactgt ttccggaaac accccgaggc cacctacacc aaatgtggtt cgggaccttg    2160

gttgacacct aggtgcatgg tcgactaccc atacaggctc tggcactacc cctgcaccgt    2220

taactttacc atctttaagg ttaggatgta cgtgggaggt gtggagcaca ggctcaacgc    2280

cgcatgcaat tggacccgag gagagcgttg taacttagag gacagggata gatcagagct    2340

tagcccgctg ctgctgtcaa caacagagtg gcaggtgcta ccttgttcct tcaccaccct    2400

accggctctg tccactggtt tgatccatct ccaccagaac atcgtggacg tgcaatacct    2460

gtacggtata gggtcggcgg ttgtctccta tgcaatcaaa tgggaatatg tcttgttgct    2520

cttcctcctc ctggcagacg cgcgcgtctg cgcctgcttg tggatgatgc tgctgatagc    2580

tcaagctgag gccgccttag agaacctggt ggtcctcaat gcggcgtccc tggctggagc    2640

gcatggcctt ctctctttcc ttgtgttctt ctgtgccgct tggtacatca agggcaggtt    2700

gatccccggg gcggcgtatg ctttttacgg cgtatggccg ctgctcctac tcctgctggc    2760

gttaccacca cgagcatacg ccatggaccg ggagatggct gcatcgtgcg gaggcgcggt    2820

ttttgtaggt ctggcattcc tgaccttgtc accacactat aaggcattcc tcgccaagct    2880

cctgtggtgg ttgtgctatc tcctgaccct gggggaagcc atgattcagg agtgggtacc    2940

acccatgcag gtgcgcggcg gccgcgatgg catcgcgtgg gccgtcacta tattctgccc    3000

gggtgtggtg tttgacatta ccaaatggct tttggcgttg cttgggcctg cttacctctt    3060

aagggccgct ttgacacatg tgccgtactt cgtcagagct cacgctctga taagggtatg    3120

cgctttggtg aagcagctcg cggggggtag gtatgttcag gtggcgctat tggcccttgg    3180

caggtggact ggcacctaca tctatgacca cctcacacct atgtcggact gggccgctag    3240

cggcctgcgc gacttagcgg tcgccgtgga acccatcatc ttcagtccga tggagaagaa    3300

ggtcatcgtc tggggagcgg agacggctgc atgtggggac attctacatg gacttcccgt    3360

gtccgcccga ctcggccagg agatcctcct cggcccagct gatggctaca cctccaaggg    3420

gtggaagctc cttgctccca tcactgctta tgcccagcaa acacgaggcc tcctgggcgc    3480

catagtggtg agtatgacgg ggcgtgacag gacagaacag gccggggaag tccaaatcct    3540

gtccacagtc tctcagtcct tcctcggaac aaccatctcg ggggttttgt ggactgttta    3600

ccacggagct ggcaacaaga ctctagccgg cttacggggt ccggtcacgc agatgtactc    3660

gagtgctgag ggggacttgg taggctggcc cagcccccct gggaccaagt ctttggagcc    3720

gtgcaagtgt ggagccgtcg acctatatct ggtcacgcgg aacgctgatg tcatcccggc    3780

tcggagacgc ggggacaagc ggggagcatt gctctccccg agacccattt cgaccttgaa    3840

ggggtcctcg ggggggccgg tgctctgccc taggggccac gtcgttgggc tcttccgagc    3900

agctgtgtgc tctcggggcg tggccaaatc catcgatttc atccccgttg agacactcga    3960

cgttgttaca aggtctccca ctttcagtga caacagcacg ccaccggctg tgccccagac    4020

ctatcaggtc gggtacttgc atgctccaac tggcagtgga aagagcacca aggtccctgt    4080

cgcgtatgcc gcccaggggt acaaagtact agtgcttaac ccctcggtag ctgccaccct    4140

ggggtttggg gcgtacctat ccaaggcaca tggcatcaat cccaacatta ggactggagt    4200

caggaccgtg atgaccgggg aggccatcac gtactccaca tatggcaaat ttctcgccga    4260

tgggggctgc gctagcggcg cctatgacat catcatatgc gatgaatgcc acgctgtgga    4320

tgctacctcc attctcggca tcggaacggt ccttgatcaa gcagagacag ccggggtcag    4380

actaactgtg ctggctacgg ccacaccccc cgggtcagtg acaacccccc atcccgatat    4440

agaagaggta ggcctcgggc gggagggtga gatccccttc tatgggaggg cgattcccct    4500

atcctgcatc aagggaggga gacacctgat tttctgccac tcaaagaaaa agtgtgacga    4560

gctcgcggcg gcccttcggg gcatgggctt gaatgccgtg gcatactata gagggttgga    4620

cgtctccata ataccagctc agggagatgt ggtggtcgtc gccaccgacg ccctcatgac    4680

ggggtacact ggagactttg actccgtgat cgactgcaat gtagcggtca cccaagctgt    4740

cgacttcagc ctggacccca ccttcactat aaccacacag actgtcccac aagacgctgt    4800

ctcacgcagt cagcgccgcg ggcgcacagg tagaggaaga cagggcactt ataggtatgt    4860

ttccactggt gaacgagcct caggaatgtt tgacagtgta gtgctttgtg agtgctacga    4920

cgcaggggct gcgtggtacg atctcacacc agcggagacc accgtcaggc ttagagcgta    4980

tttcaacacg cccggcctac ccgtgtgtca agaccatctt gaattttggg aggcagtttt    5040

caccggcctc acacacatag acgcccactt cctctcccaa acaaagcaag cgggggagaa    5100

cttcgcgtac ctagtagcct accaagctac ggtgtgcgcc agagccaagg cccctccccc    5160

gtcctgggac gccatgtgga agtgcctggc ccgactcaag cctacgcttg cgggccccac    5220

acctctcctg taccgtttgg gccctattac caatgaggtc accctcacac accctgggac    5280

gaagtacatc gccacatgca tgcaagctga ccttgaggtc atgaccagca cgtgggtcct    5340

agctggagga gtcctggcag ccgtcgccgc atattgcctg gcgactggat gcgtttccat    5400

catcggccgc ttgcacgtca accagcgagt cgtcgttgcg ccggataagg aggtcctgta    5460

tgaggctttt gatgagatgg aggaatgcgc ctctagggcg gctctcatcg aagaggggca    5520

gcggatagcc gagatgttga agtccaagat ccaaggcttg ctgcagcagg cctctaagca    5580

ggcccaggac atacaacccg ctatgcaggc ttcatggccc aaagtggaac aattttgggc    5640

cagacacatg tggaacttca ttagcggcat ccaatacctc gcaggattgt caacactgcc    5700

agggaacccc gcggtggctt ccatgatggc attcagtgcc gccctcacca gtccgttgtc    5760

gaccagtacc accatccttc tcaacatcat gggaggctgg ttagcgtccc agatcgcacc    5820

acccgcgggg gccaccggct ttgtcgtcag tggcctggtg ggggctgccg tgggcagcat    5880

aggcctgggt aaggtgctgg tggacatcct ggcaggatat ggtgcgggca tttcgggggc    5940

cctcgtcgca ttcaagatca tgtctggcga gaagccctct atggaagatg tcatcaatct    6000

actgcctggg atcctgtctc cgggagccct ggtggtgggg gtcatctgcg cggccattct    6060

gcgccgccac gtgggaccgg gggagggcgc ggtccaatgg atgaacaggc ttattgcctt    6120

tgcttccaga ggaaaccacg tcgcccctac tcactacgtg acggagtcgg atgcgtcgca    6180

gcgtgtgacc caactacttg gctctcttac tataaccagc ctactcagaa gactccacaa    6240

ttggataact gaggactgcc ccatcccatg ctccggatcc tggctccgcg acgtgtggga    6300

ctgggtttgc accatcttga cagacttcaa aaattggctg acctctaaat tgttccccaa    6360

gctgcccggc ctccccttca tctcttgtca aaaggggtac aagggtgtgt gggccggcac    6420

tggcatcatg accacgcgct gcccttgcgg cgccaacatc tctggcaatg tccgcctggg    6480

ctctatgagg atcacagggc ctaaaacctg catgaacacc tggcagggga cctttcctat    6540

caattgctac acggagggcc agtgcgcgcc gaaacccccc acgaactaca agaccgccat    6600

ctggagggtg gcggcctcgg agtacgcgga ggtgacgcag catgggtcgt actcctatgt    6660

aacaggactg accactgaca atctgaaaat tccttgccaa ctaccttctc cagagttttt    6720

ctcctgggtg gacggtgtgc agatccatag gtttgcaccc acaccaaagc cgtttttccg    6780

ggatgaggtc tcgttctgcg ttgggcttaa ttcctatgct gtcgggtccc agcttccctg    6840

tgaacctgag cccgacgcag acgtattgag gtccatgcta acagatccgc cccacatcac    6900

ggcggagact gcggcgcggc gcttggcacg gggatcacct ccatctgagg cgagctcctc    6960

agtgagccag ctatcagcac cgtcgctgcg ggccacctgc accacccaca gcaacaccta    7020

tgacgtggac atggtcgatg ccaacctgct catggagggc ggtgtggctc agacagagcc    7080

tgagtccagg gtgcccgttc tggactttct cgagccaatg gccgaggaag agagcgacct    7140

tgagccctca ataccatcgg agtgcatgct ccccaggagc gggtttccac gggccttacc    7200

ggcttgggca cggcctgact acaacccgcc gctcgtggaa tcgtggagga ggccagatta    7260

ccaaccgccc accgttgctg gttgtgctct cccccccccc aagaaggccc cgacgcctcc    7320

cccaaggaga cgccggacag tgggtctgag cgagagcacc atatcagaag ccctccagca    7380

actggccatc aagacctttg gccagccccc ctcgagcggt gatgcaggct cgtccacggg    7440

ggcgggcgcc gccgaatccg gcggtccgac gtcccctggt gagccggccc cctcagagac    7500

aggttccgcc tcctctatgc cccccctcga gggggagcct ggagatccgg acctggagtc    7560

tgatcaggta gagcttcaac ctccccccca gggggggggg gtagctcccg gttcgggctc    7620

ggggtcttgg tctacttgct ccgaggagga cgataccacc gtgtgctgct ccatgtcata    7680

ctcctggacc ggggctctaa taactccctg tagccccgaa gaggaaaagt tgccaatcaa    7740

ccctttgagt aactcgctgt tgcgatacca taacaaggtg tactgtacaa catcaaagag    7800

cgcctcacag agggctaaaa aggtaacttt tgacaggacg caagtgctcg acgcccatta    7860

tgactcagtc ttaaaggaca tcaagctagc ggcttccaag gtcagcgcaa ggctcctcac    7920

cttggaggag gcgtgccagt tgactccacc ccattctgca agatccaagt atggattcgg    7980

ggccaaggag gtccgcagct tgtccgggag ggccgttaac cacatcaagt ccgtgtggaa    8040

ggacctcctg gaagacccac aaacaccaat tcccacaacc atcatggcca aaaatgaggt    8100

gttctgcgtg gaccccgcca aggggggtaa gaaaccagct cgcctcatcg tttaccctga    8160

cctcggcgtc cgggtctgcg agaaaatggc cctctatgac attacacaaa agcttcctca    8220

ggcggtaatg ggagcttcct atggcttcca gtactcccct gcccaacggg tggagtatct    8280

cttgaaagca tgggcggaaa agaaggaccc catgggtttt tcgtatgata cccgatgctt    8340

cgactcaacc gtcactgaga gagacatcag gaccgaggag tccatatacc aggcctgctc    8400

cctgcccgag gaggcccgca ctgccataca ctcgctgact gagagacttt acgtaggagg    8460

gcccatgttc aacagcaagg gtcaaacctg cggttacaga cgttgccgcg ccagcggggt    8520

gctaaccact agcatgggta acaccatcac atgctatgtg aaagccctag cggcctgcaa    8580

ggctgcgggg atagttgcgc ccacaatgct ggtatgcggc gatgacctag tagtcatctc    8640

agaaagccag gggactgagg aggacgagcg gaacctgaga gccttcacgg aggccatgac    8700

caggtactct gcccctcctg gtgatccccc cagaccggaa tatgacctgg agctaataac    8760

atcctgttcc tcaaatgtgt ctgtggcgtt gggcccgcgg ggccgccgca gatactacct    8820

gaccagagac ccaaccactc cactcgcccg ggctgcctgg gaaacagtta gacactcccc    8880

tatcaattca tggctgggaa acatcatcca gtatgctcca accatatggg ttcgcatggt    8940

cctaatgaca cacttcttct ccattctcat ggtccaagac accctggacc agaacctcaa    9000

ctttgagatg tatggatcag tatactccgt gaatcctttg gaccttccag ccataattga    9060

gaggttacac gggcttgacg ccttttctat gcacacatac tctcaccacg aactgacgcg    9120

ggtggcttca gccctcagaa aacttggggc gccacccctc agggtgtgga agagtcgggc    9180

tcgcgcagtc agggcgtccc tcatctcccg tggagggaaa gcggccgttt gcggccgata    9240

tctcttcaat tgggcggtga agaccaagct caaactcact ccattgccgg aggcgcgcct    9300

actggactta tccagttggt tcaccgtcgg cgccggcggg ggcgacattt ttcacagcgt    9360

gtcgcgcgcc cgaccccgct cattactctt cggcctactc ctacttttcg taggggtagg    9420

cctcttccta ctccccgctc ggtagagcgg cacacactag gtacactcca tagctaactg    9480

ttcctttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttctt tttttttttt    9540

ttccctcttt cttcccttct catcttattc tactttcttt cttggtggct ccatcttagc    9600

cctagtcacg gctagctgtg aaaggtccgt gagccgcatg actgcagaga gtgccgtaac    9660

tggtctctct gcagatcatg t                                              9681

 

<210>42

<211>9723

<212>DNA

<213>人工

 

<220>

<223>pTH/JFH 1(3XFLAG)

 

<400>42

acctgcccct aataggggcg acactccgcc atgaatcact cccctgtgag gaactactgt   60

cttcacgcag aaagcgccta gccatggcgt tagtatgagt gtcgtacagc ctccaggccc  120

ccccctcccg ggagagccat agtggtctgc ggaaccggtg agtacaccgg aattgccggg  180

aagactgggt cctttcttgg ataaacccac tctatgcccg gccatttggg cgtgcccccg  240

caagactgct agccgagtag cgttgggttg cgaaaggcct tgtggtactg cctgataggg  300

cgcttgcgag tgccccggga ggtctcgtag accgtgcacc atgagcacga atcctaaacc  360

tcaaagaaaa accaaacgta acaccaaccg ccgcccacag gacgtcaagt tcccgggcgg  420

tggccagatc gttggtggag tttacctgtt gccgcgcagg ggccccaggt tgggtgtgcg  480

cgcgactagg aagacttccg agcggtcgca acctcgtgga aggcgacaac ctatccccaa  540

ggatcgccga cccgagggca gggcctgggc tcagcctggg tacccttggc ccctctatgg  600

caacgagggc atggggtggg caggatggct cctgtcaccc cgtggctccc ggcctagttg  660

gggccccaat gacccccggc gcaggtcgcg taatttgggt aaagtcatcg atacccttac  720

atgcggcttc gccgacctca tggggtacat tccgctcgtc ggcgctccct tggggggcgc  780

tgccagggcc ttggcgcatg gcgtccgggt tctggaggac ggcgtgaact atgcaacagg  840

gaatctgccc ggttgctctt tctctatctt cctcttggct ctgctgtcct gtctaaccat  900

cccagcttcc gcttatgaag tgcgcaacgt gtccggggtg taccatgtca cgaacgactg  960

ctccaactcg agcattgtgt acgagacagg ggacatgatt atgcacaccc ctgggtgcgt 1020

gccctgtgtt cgggagaaca actcctcccg ctgctgggca gcgctcactc ccacgctcgc 1080

ggccaggaac gccagcgtcc ccaccacgac aatacggcgc cacgtcgatt tgctcgttgg 1140

ggcggctgct ttctgctccg ctatgtacgt gggggatctc tgcggatctg ttttcctcgt 1200

ctcccagttg ttcaccttct cgcctcgccg gcatgagaca gtgcaggact gcaattgttc 1260

aatctatccc ggccacgtat caggtcaccg catggcttgg gatatgatga tgaactggtc    1320

acctacaaca gccctactgg tatcgcagtt actccggatc ccacaagccg tcgtggacat    1380

ggtggcgggg gcccactggg gagtcctggc gggccttgcc tactattcca tggcggggaa    1440

ctgggctaag gttttgattg tgctgctact ctttgccggc gttgatgggg cgacctacgt    1500

gacggggggg tcggaagccg actacaaaga ccatgacggt gattataaag atcatgacat    1560

cgattacaag gatgacgatg acaagggagg cggtaacctc ttttcatttg gggcgtctca    1620

gaagatccag ctcataaata ccaacggcag ttggcacatc aatagaactg ccctgaactg    1680

caatgactcc ctccacactg ggtttcttgc cgcgctattc tacacacaca aattcaacgc    1740

gtccggatgt ccagagcgca tggccagctg ccgccccatt gaagagttcg ctcaggggta    1800

tggtcccatc acttatgctg agccctcccc ctcggaccag aggccctatt gctggcacta    1860

cgcgcctcga ccgtgtggta tcatacccgc gtcgcaggtg tgtggtccag tgtactgctt    1920

caccccaagc cctgttgtgg tggggacgac cgatcgctcc ggtgccccca cgtataattg    1980

gggggcgaat gagacggacg tgctgtatct caacaacacg cggccgccgc aaggcaactg    2040

gttcggctgc acatggatga atggcaccgg gttcaccaag acgtgcgggg gccccccgtg    2100

caacatcggg gggggcggca acaacaacac cttgacctgc cccacggact gtttccggaa    2160

acaccccgag gccacctaca ccaaatgtgg ttcgggacct tggttgacac ctaggtgcat    2220

ggtcgactac ccatacaggc tctggcacta cccctgcacc gttaacttta ccatctttaa    2280

ggttaggatg tacgtgggag gtgtggagca caggctcaac gccgcatgca attggacccg    2340

aggagagcgt tgtaacttag aggacaggga tagatcagag cttagcccgc tgctgctgtc    2400

aacaacagag tggcaggtgc taccttgttc cttcaccacc ctaccggctc tgtccactgg    2460

tttgatccat ctccaccaga acatcgtgga cgtgcaatac ctgtacggta tagggtcggc    2520

ggttgtctcc tatgcaatca aatgggaata tgtcttgttg ctcttcctcc tcctggcaga    2580

cgcgcgcgtc tgcgcctgct tgtggatgat gctgctgata gctcaagctg aggccgcctt    2640

agagaacctg gtggtcctca atgcggcgtc cctggctgga gcgcatggcc ttctctcttt    2700

ccttgtgttc ttctgtgccg cttggtacat caagggcagg ttgatccccg gggcggcgta    2760

tgctttttac ggcgtatggc cgctgctcct actcctgctg gcgttaccac cacgagcata    2820

cgccatggac cgggagatgg ctgcatcgtg cggaggcgcg gtttttgtag gtctggcatt    2880

cctgaccttg tcaccacact ataaggcatt cctcgccaag ctcctgtggt ggttgtgcta    2940

tctcctgacc ctgggggaag ccatgattca ggagtgggta ccacccatgc aggtgcgcgg    3000

cggccgcgat ggcatcgcgt gggccgtcac tatattctgc ccgggtgtgg tgtttgacat    3060

taccaaatgg cttttggcgt tgcttgggcc tgcttacctc ttaagggccg ctttgacaca    3120

tgtgccgtac ttcgtcagag ctcacgctct gataagggta tgcgctttgg tgaagcagct    3180

cgcggggggt aggtatgttc aggtggcgct attggccctt ggcaggtgga ctggcaccta    3240

catctatgac cacctcacac ctatgtcgga ctgggccgct agcggcctgc gcgacttagc    3300

ggtcgccgtg gaacccatca tcttcagtcc gatggagaag aaggtcatcg tctggggagc    3360

ggagacggct gcatgtgggg acattctaca tggacttccc gtgtccgccc gactcggcca    3420

ggagatcctc ctcggcccag ctgatggcta cacctccaag gggtggaagc tccttgctcc    3480

catcactgct tatgcccagc aaacacgagg cctcctgggc gccatagtgg tgagtatgac    3540

ggggcgtgac aggacagaac aggccgggga agtccaaatc ctgtccacag tctctcagtc    3600

cttcctcgga acaaccatct cgggggtttt gtggactgtt taccacggag ctggcaacaa    3660

gactctagcc ggcttacggg gtccggtcac gcagatgtac tcgagtgctg agggggactt    3720

ggtaggctgg cccagccccc ctgggaccaa gtctttggag ccgtgcaagt gtggagccgt    3780

cgacctatat ctggtcacgc ggaacgctga tgtcatcccg gctcggagac gcggggacaa    3840

gcggggagca ttgctctccc cgagacccat ttcgaccttg aaggggtcct cgggggggcc    3900

ggtgctctgc cctaggggcc acgtcgttgg gctcttccga gcagctgtgt gctctcgggg    3960

cgtggccaaa tccatcgatt tcatccccgt tgagacactc gacgttgtta caaggtctcc    4020

cactttcagt gacaacagca cgccaccggc tgtgccccag acctatcagg tcgggtactt    4080

gcatgctcca actggcagtg gaaagagcac caaggtccct gtcgcgtatg ccgcccaggg    4140

gtacaaagta ctagtgctta acccctcggt agctgccacc ctggggtttg gggcgtacct    4200

atccaaggca catggcatca atcccaacat taggactgga gtcaggaccg tgatgaccgg    4260

ggaggccatc acgtactcca catatggcaa atttctcgcc gatgggggct gcgctagcgg    4320

cgcctatgac atcatcatat gcgatgaatg ccacgctgtg gatgctacct ccattctcgg    4380

catcggaacg gtccttgatc aagcagagac agccggggtc agactaactg tgctggctac    4440

ggccacaccc cccgggtcag tgacaacccc ccatcccgat atagaagagg taggcctcgg    4500

gcgggagggt gagatcccct tctatgggag ggcgattccc ctatcctgca tcaagggagg    4560

gagacacctg attttctgcc actcaaagaa aaagtgtgac gagctcgcgg cggcccttcg    4620

gggcatgggc ttgaatgccg tggcatacta tagagggttg gacgtctcca taataccagc    4680

tcagggagat gtggtggtcg tcgccaccga cgccctcatg acggggtaca ctggagactt    4740

tgactccgtg atcgactgca atgtagcggt cacccaagct gtcgacttca gcctggaccc    4800

caccttcact ataaccacac agactgtccc acaagacgct gtctcacgca gtcagcgccg    4860

cgggcgcaca ggtagaggaa gacagggcac ttataggtat gtttccactg gtgaacgagc    4920

ctcaggaatg tttgacagtg tagtgctttg tgagtgctac gacgcagggg ctgcgtggta    4980

cgatctcaca ccagcggaga ccaccgtcag gcttagagcg tatttcaaca cgcccggcct    5040

acccgtgtgt caagaccatc ttgaattttg ggaggcagtt ttcaccggcc tcacacacat    5100

agacgcccac ttcctctccc aaacaaagca agcgggggag aacttcgcgt acctagtagc    5160

ctaccaagct acggtgtgcg ccagagccaa ggcccctccc ccgtcctggg acgccatgtg    5220

gaagtgcctg gcccgactca agcctacgct tgcgggcccc acacctctcc tgtaccgttt    5280

gggccctatt accaatgagg tcaccctcac acaccctggg acgaagtaca tcgccacatg    5340

catgcaagct gaccttgagg tcatgaccag cacgtgggtc ctagctggag gagtcctggc    5400

agccgtcgcc gcatattgcc tggcgactgg atgcgtttcc atcatcggcc gcttgcacgt    5460

caaccagcga gtcgtcgttg cgccggataa ggaggtcctg tatgaggctt ttgatgagat    5520

ggaggaatgc gcctctaggg cggctctcat cgaagagggg cagcggatag ccgagatgtt    5580

gaagtccaag atccaaggct tgctgcagca ggcctctaag caggcccagg acatacaacc    5640

cgctatgcag gcttcatggc ccaaagtgga acaattttgg gccagacaca tgtggaactt    5700

cattagcggc atccaatacc tcgcaggatt gtcaacactg ccagggaacc ccgcggtggc    5760

ttccatgatg gcattcagtg ccgccctcac cagtccgttg tcgaccagta ccaccatcct    5820

tctcaacatc atgggaggct ggttagcgtc ccagatcgca ccacccgcgg gggccaccgg    5880

ctttgtcgtc agtggcctgg tgggggctgc cgtgggcagc ataggcctgg gtaaggtgct    5940

ggtggacatc ctggcaggat atggtgcggg catttcgggg gccctcgtcg cattcaagat    6000

catgtctggc gagaagccct ctatggaaga tgtcatcaat ctactgcctg ggatcctgtc    6060

tccgggagcc ctggtggtgg gggtcatctg cgcggccatt ctgcgccgcc acgtgggacc    6120

gggggagggc gcggtccaat ggatgaacag gcttattgcc tttgcttcca gaggaaacca    6180

cgtcgcccct actcactacg tgacggagtc ggatgcgtcg cagcgtgtga cccaactact    6240

tggctctctt actataacca gcctactcag aagactccac aattggataa ctgaggactg    6300

ccccatccca tgctccggat cctggctccg cgacgtgtgg gactgggttt gcaccatctt    6360

gacagacttc aaaaattggc tgacctctaa attgttcccc aagctgcccg gcctcccctt    6420

catctcttgt caaaaggggt acaagggtgt gtgggccggc actggcatca tgaccacgcg    6480

ctgcccttgc ggcgccaaca tctctggcaa tgtccgcctg ggctctatga ggatcacagg    6540

gcctaaaacc tgcatgaaca cctggcaggg gacctttcct atcaattgct acacggaggg    6600

ccagtgcgcg ccgaaacccc ccacgaacta caagaccgcc atctggaggg tggcggcctc    6660

ggagtacgcg gaggtgacgc agcatgggtc gtactcctat gtaacaggac tgaccactga    6720

caatctgaaa attccttgcc aactaccttc tccagagttt ttctcctggg tggacggtgt    6780

gcagatccat aggtttgcac ccacaccaaa gccgtttttc cgggatgagg tctcgttctg    6840

cgttgggctt aattcctatg ctgtcgggtc ccagcttccc tgtgaacctg agcccgacgc    6900

agacgtattg aggtccatgc taacagatcc gccccacatc acggcggaga ctgcggcgcg    6960

gcgcttggca cggggatcac ctccatctga ggcgagctcc tcagtgagcc agctatcagc    7020

accgtcgctg cgggccacct gcaccaccca cagcaacacc tatgacgtgg acatggtcga    7080

tgccaacctg ctcatggagg gcggtgtggc tcagacagag cctgagtcca gggtgcccgt    7140

tctggacttt ctcgagccaa tggccgagga agagagcgac cttgagccct caataccatc    7200

ggagtgcatg ctccccagga gcgggtttcc acgggcctta ccggcttggg cacggcctga    7260

ctacaacccg ccgctcgtgg aatcgtggag gaggccagat taccaaccgc ccaccgttgc    7320

tggttgtgct ctcccccccc ccaagaaggc cccgacgcct cccccaagga gacgccggac    7380

agtgggtctg agcgagagca ccatatcaga agccctccag caactggcca tcaagacctt    7440

tggccagccc ccctcgagcg gtgatgcagg ctcgtccacg ggggcgggcg ccgccgaatc    7500

cggcggtccg acgtcccctg gtgagccggc cccctcagag acaggttccg cctcctctat    7560

gccccccctc gagggggagc ctggagatcc ggacctggag tctgatcagg tagagcttca    7620

acctcccccc cagggggggg gggtagctcc cggttcgggc tcggggtctt ggtctacttg    7680

ctccgaggag gacgatacca ccgtgtgctg ctccatgtca tactcctgga ccggggctct    7740

aataactccc tgtagccccg aagaggaaaa gttgccaatc aaccctttga gtaactcgct    7800

gttgcgatac cataacaagg tgtactgtac aacatcaaag agcgcctcac agagggctaa    7860

aaaggtaact tttgacagga cgcaagtgct cgacgcccat tatgactcag tcttaaagga    7920

catcaagcta gcggcttcca aggtcagcgc aaggctcctc accttggagg aggcgtgcca    7980

gttgactcca ccccattctg caagatccaa gtatggattc ggggccaagg aggtccgcag    8040

cttgtccggg agggccgtta accacatcaa gtccgtgtgg aaggacctcc tggaagaccc    8100

acaaacacca attcccacaa ccatcatggc caaaaatgag gtgttctgcg tggaccccgc    8160

caaggggggt aagaaaccag ctcgcctcat cgtttaccct gacctcggcg tccgggtctg    8220

cgagaaaatg gccctctatg acattacaca aaagcttcct caggcggtaa tgggagcttc    8280

ctatggcttc cagtactccc ctgcccaacg ggtggagtat ctcttgaaag catgggcgga    8340

aaagaaggac cccatgggtt tttcgtatga tacccgatgc ttcgactcaa ccgtcactga    8400

gagagacatc aggaccgagg agtccatata ccaggcctgc tccctgcccg aggaggcccg    8460

cactgccata cactcgctga ctgagagact ttacgtagga gggcccatgt tcaacagcaa    8520

gggtcaaacc tgcggttaca gacgttgccg cgccagcggg gtgctaacca ctagcatggg    8580

taacaccatc acatgctatg tgaaagccct agcggcctgc aaggctgcgg ggatagttgc  8640

gcccacaatg ctggtatgcg gcgatgacct agtagtcatc tcagaaagcc aggggactga  8700

ggaggacgag cggaacctga gagccttcac ggaggccatg accaggtact ctgcccctcc  8760

tggtgatccc cccagaccgg aatatgacct ggagctaata acatcctgtt cctcaaatgt  8820

gtctgtggcg ttgggcccgc ggggccgccg cagatactac ctgaccagag acccaaccac  8880

tccactcgcc cgggctgcct gggaaacagt tagacactcc cctatcaatt catggctggg  8940

aaacatcatc cagtatgctc caaccatatg ggttcgcatg gtcctaatga cacacttctt  9000

ctccattctc atggtccaag acaccctgga ccagaacctc aactttgaga tgtatggatc  9060

agtatactcc gtgaatcctt tggaccttcc agccataatt gagaggttac acgggcttga  9120

cgccttttct atgcacacat actctcacca cgaactgacg cgggtggctt cagccctcag  9180

aaaacttggg gcgccacccc tcagggtgtg gaagagtcgg gctcgcgcag tcagggcgtc  9240

cctcatctcc cgtggaggga aagcggccgt ttgcggccga tatctcttca attgggcggt  9300

gaagaccaag ctcaaactca ctccattgcc ggaggcgcgc ctactggact tatccagttg  9360

gttcaccgtc ggcgccggcg ggggcgacat ttttcacagc gtgtcgcgcg cccgaccccg  9420

ctcattactc ttcggcctac tcctactttt cgtaggggta ggcctcttcc tactccccgc  9480

tcggtagagc ggcacacact aggtacactc catagctaac tgttcctttt tttttttttt  9540

tttttttttt tttttttttt tttttttttc tttttttttt ttttccctct ttcttccctt  9600

ctcatcttat tctactttct ttcttggtgg ctccatctta gccctagtca cggctagctg  9660

tgaaaggtcc gtgagccgca tgactgcaga gagtgccgta actggtctct ctgcagatca  9720

tgt                                                                9723

 

<210>43

<211>18

<212>DNA

<213>人工

 

<220>

<223>引物(JFH1-A)

<400>43

tgtaaaacga cggccagt                            18

 

<210>44

<211>40

<212>DNA

<213>人工

 

<220>

<223>引物(JFH1-B)

 

<400>44

ggtttaggat tcgtgctcat ggtgcacggt ctacgagacc    40

<210>45

<211>40

<212>DNA

<213>人工

 

<220>

<223>引物(TH-C)

 

<400>45

ggtctcgtag accgtgcacc atgagcacga atcctaaacc    40

 

<210>46

<211>40

<212>DNA

<213>人工

 

<220>

<223>引物(TH-D)

 

<400>46

agatagcaca accaccacag gagcttggcg aggaatgcct    40

 

<210>47

<211>40

<212>DNA

<213>人工

 

<220>

<223>引物(JFH1-E)

 

<400>47

aggcattcct cgccaagctc ctgtggtggt tgtgctatct 40

 

<210>48

<211>20

<212>DNA

<213>人工

 

<220>

<223>引物(JFH1-F)

 

<400>48

cagctaccga ggggttaagc                        20

 

<210>49

<211>11

<212>PRT

<213>人工

 

<220>

<223>表位标签肽(1XFLAG+接头)

 

<400>49

Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Gly Gly Gly

1           5              10

 

<210>50

<211>25

<212>PRT

<213>人工

 

<220>

<223>表位标签肽(3XFLAG+接头)

 

<400>50

Asp Tyr Lys Asp His Asp Gly Asp Tyr Lys Asp His Asp Ile Asp Tyr

1               5                   10                  15

Lys Asp Asp Asp Asp Lys Gly Gly Gly

            20                  25

 

<210>51

<211>8

<212>PRT

<213>人工

<220>

<223>表位标签肽(1XFLAG)

 

<400>51

Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys

1               5

 

<210>52

<211>22

<212>PRT

<213>人工

 

<220>

<223>表位标签肽(3XFLAG)

 

<400>52

Asp Tyr Lys Asp His Asp Gly Asp Tyr Lys Asp His Asp Ile Asp Tyr

1               5                   10                  15

Lys Asp Asp Asp Asp Lys

            20

 

<210>53

<211>3

<212>PRT

<213>人工

 

<220>

<223>接头

 

<400>53

Gly Gly Gly

1

 

<210>54

<211>25

<212>PRT

<213>人工

 

<220>

<223>接头

 

<400>54

Gly Gly Gly Gly Ser

1               5

Claims (15)

1.一种核酸，其包含以下(a)、(b)或(c)，并且包含位于(a)、(b)、或(c)的E2蛋白编码序列中的高变区1(HVR1)处的编码表位标签肽的核酸序列：

(a)丙型肝炎病毒(HCV)JFH-1株的基因组；

(b)嵌合丙型肝炎病毒(HCV)基因组，其包含：HCV J6CF株的5′-非翻译区、核心蛋白编码序列、E1蛋白编码序列、E2蛋白编码序列和p7蛋白编码序列；以及HCV JFH-1株的NS2蛋白编码序列、NS3蛋白编码序列、NS4A蛋白编码序列、NS4B蛋白编码序列、NS5A蛋白编码序列、NS5B蛋白编码序列和3′-非翻译区；或

(c)嵌合丙型肝炎病毒(HCV)基因组，其包含：JFH-1株的5′-非翻译区；HCV TH1株的核心蛋白编码序列、E1蛋白编码序列、E2蛋白编码序列和p7蛋白编码序列；以及HCV JFH-1株的NS2蛋白编码序列、NS3蛋白编码序列、NS4A蛋白编码序列、NS4B蛋白编码序列、NS5A蛋白编码序列、NS5B蛋白编码序列和3′-非翻译区。

2.权利要求1的核酸，其中所述表位标签肽包含氨基酸序列DYKDDDDK或DYKDHDGDYKDHDIDYKDDDDK。

3.权利要求1或2的核酸，其中所述表位标签肽进一步包含接头序列。

4.权利要求3的核酸，其中所述接头序列包括：GGG序列、GGGGS序列或(GGGGS)₃序列、或含有在序列GGG、GGGGS或(GGGGS)3的一部分中缺失、取代或添加1-10个氨基酸的序列。

5.权利要求1-4中任一项的核酸，所述核酸如SEQ ID NO：11、12、30、31、41或42所示，其中当核酸是RNA时，在序列表中所示的核苷酸″T″读作″U″。

6.权利要求1-5中任一项的核酸，当将位于高变区1(HVR1)序列末端之后的氨基酸指定为第1位氨基酸时，所述核酸包含第122或124位的天冬酰胺取代为赖氨酸的突变。

7.权利要求6的核酸，所述核酸如SEQ ID NO：20或21所示，其中当核酸是RNA时，在序列表中所示的核苷酸″T″读作″U″。

8.一种载体，所述载体包含权利要求1-7中任一项的核酸。

9.一种表位标记的丙型肝炎病毒(HCV)颗粒，其包含作为基因组的权利要求1-7中任一项的核酸。

10.一种细胞，所述细胞包含权利要求9的表位标记的丙型肝炎病毒(HCV)颗粒。

11.权利要求10的细胞，所述细胞是Huh7或来源于Huh7的细胞系。

12.纯化表位标记的丙型肝炎病毒(HCV)颗粒的方法，所述方法包括以下步骤：

由权利要求10或11的细胞制备表位标记的HCV颗粒；

使含有表位标记的HCV颗粒的溶液与固定化抗表位标签抗体的支持体接触，然后使表位标记的HCV颗粒吸附到固定化抗表位标签抗体的支持体上；以及

从固定化抗表位标签抗体的支持体释放表位标记的HCV颗粒，以获得表位标记的HCV颗粒。

13.权利要求12的纯化方法，其中释放步骤包括用含有表位标签肽的缓冲液、不含钙的缓冲液、0.1M甘氨酸缓冲液(pH 2.5-4.0)、1M精氨酸HCl缓冲液(pH 4.0-5.0)或0.1-1mM HCl中的任一种从固定化抗表位标签抗体的支持体释放表位标记的HCV颗粒。

14.一种丙型肝炎病毒(HCV)疫苗，所述疫苗通过灭活权利要求9的表位标记的HCV颗粒获得。

15.一种抗丙型肝炎病毒(HCV)抗体，所述抗体针对权利要求9的表位标记的HCV颗粒。

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