CN103703133B - 来自丙型肝炎病毒j6cf株基因组的突变体复制子 - Google Patents

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Abstract

本发明提供核酸，该核酸从5’侧往3’侧依次包含：丙型肝炎病毒J6CF株的基因组的5’非翻译区；包含NS3蛋白编码序列、NS4A蛋白编码序列、NS4B蛋白编码序列、NS5A蛋白编码序列和NS5B蛋白编码序列的病毒蛋白编码区；以及3’非翻译区，而且，以J6CF株的前体蛋白的氨基酸序列为基准时，上述NS4A蛋白编码序列具有第1680位的丙氨酸取代成谷氨酸的突变。

Description

来自丙型肝炎病毒J6CF株基因组的突变体复制子
技术领域
本发明涉及来自丙型肝炎病毒J6CF株基因组的突变体复制子。
背景技术
已知丙型肝炎病毒(HepatitisCvirus;以下记作HCV)是属于黄病毒科的、以单链(+)链有义RNA作为基因组的病毒，其成为丙型肝炎的病因。根据近年的研究，得知HCV根据其基因型或血清型分为多个类型。根据Simmonds等人的使用HCV株的核苷酸序列的系统分析法，将HCV的基因型分为6个类型，并进一步将它们分为若干个亚型(非专利文献1)。目前，关于HCV的多个基因型，正在确定基因组全长的核苷酸序列(非专利文献2～6)。
到近年为止，都无法使HCV感染培养细胞、或者无法使HCV基因组在培养细胞中复制，因此为了对HCV的复制机制或感染机制进行研究，需要使用黑猩猩作为实验动物来进行体内实验。但是，通过由作为基因型1b的HCV的Con1株、HCV-N株和HCV-O株、以及作为基因型1a的HCV的H77株制作了亚基因组复制子RNA，关于HCV的复制机制的研究，可以使用培养细胞进行体外实验(专利文献1和非专利文献7～10)。这里，HCV的亚基因组复制子RNA是指，包含HCV的复制所必需的基因组部分，并且当导入到培养细胞中时可以自主复制来自HCV基因组的RNA，但不具有感染性HCV颗粒的产生能力的RNA。
而且，由作为基因型2a的HCV的JFH-1株制作了亚基因组复制子RNA、以及通过在体外导入到Huh7细胞中而产生感染性HCV颗粒的全基因组复制子RNA，关于HCV的感染机制的研究，也可以使用培养细胞进行体外实验(非专利文献11和12)。这里，HCV的全基因组复制子RNA是指，包含HCV基因组的全长、即5’非翻译区、结构基因、非结构基因和3’非翻译区的RNA，是导入到培养细胞中时可以自主复制来自HCV基因组的RNA的RNA。
J6CF株是与JFH-1株相同的基因型2a的HCV。关于J6CF株和JFH-1株的同源性，在核酸水平高达约90%，在氨基酸水平高达91%。但是，J6CF株缺少作为亚基因组复制子RNA的复制能力，而且也不具有在使用Huh7细胞的培养细胞系统中产生病毒颗粒的能力。
近年来，研究显示：若将J6CF株的基因组的NS3蛋白编码区、NS5B蛋白编码区和3’非翻译区取代成JFH-1株的相同区的序列，则J6CF株可以在Huh7细胞中进行自主复制(非专利文献13)。另外，研究显示：将J6CF株的基因组的NS3蛋白编码区和3’非翻译区取代成JFH-1株的相同区的序列、并且导入NS5B蛋白编码区内的3个适应性突变而制作的亚基因组复制子RNA和全基因组复制子RNA具有自主复制能力和产生病毒颗粒的能力(非专利文献14)。
在HCV的研究和抗HCV药的研究开发中，可以高效率地扩增病毒的实验系统是必不可少的。而且，如果有使HCV在培养细胞中扩增的系统、或者在培养细胞中评价HCV的增殖的系统，则不仅可以有效率地筛选抗HCV药，还可以理解病毒增殖的细节，可以明确抗HCV药的新的靶，由此可以期待着研发出针对所发现的靶的革新的抗HCV药。关于J6CF株，也期待着制作可以在培养细胞内进行自主复制或产生病毒颗粒的复制子RNA。
但是，以往认为具有产生感染性HCV颗粒的能力的全基因组复制子RNA必需包含来自JFH-1株的序列作为病毒的复制所必需的非结构基因。迄今为止得到的在培养细胞系统中进行自主复制、并且产生HCV颗粒的来自J6CF株的全基因组复制子RNA也只是由将J6CF株基因组中的非结构基因的相当多的部分取代成来自JFH-1株的相同区的序列的嵌合核酸构成的RNA。还未得到J6CF株的研究所必需的、以J6CF株的基因组作为骨架、且具有产生感染性HCV颗粒的能力的全基因组复制子RNA。
如上所述，在来自基因型2a的HCV的亚基因组复制子RNA或全基因组复制子RNA中，迄今为止还不存在反映JFH-1株以外的HCV株的复制机制或复制效率的复制子RNA。因此，作为新的抗HCV药的靶的HCV复制所必需的因子的鉴定、或不依赖于复制机理或复制效率而能够发挥药效的抗HCV药的筛选难以进行。另外，可以人工制造的、作为HCV疫苗的原料的HCV颗粒的种类也有限定。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特开2001-17187号公报；
非专利文献
非专利文献1：Simmonds等人,Hepatology,1994年,第10卷,第1321-1324页；
非专利文献2：Choo等人,Science,1989年,第244卷,第359-362页；
非专利文献3：Kato等人,J.Med.Virol.，1992年,第64卷,第334-339页；
非专利文献4：Okamoto等人,J.GenVirol.,1992年,第73卷,第673-679页；
非专利文献5：Yoshioka等人,Hepatology,1992年,第16卷,第293-299；
非专利文献6：Mori等人,Biochem.Biophys.Res.Commun.,1992年,第183卷,第334-342页；
非专利文献7：Lohmann等人,Science,1999年,第285卷,第110-113页；
非专利文献8：Blight等人,Science,2000年,第290卷,第1972-1974页；
非专利文献9：Friebe等人,J.Virol.,2001年,第75卷,第12047-12057页；
非专利文献10：Ikeda等人,J.Virol.,2002年,第76卷,第2997-3006页；
非专利文献11：Kato等人,Gastroenterology,2003年,第125卷,第1808-1817页；
非专利文献12：Wakita等人,NatureMedicine,2005年,第11卷,第791-796页；
非专利文献13：Murayama等人,J.Virol.,2007年,第81卷,第8030-8040页；
非专利文献14：Murayama等人,PLoSPathogens.,2010年,第6卷,e1000885。
发明内容
发明所要解决的课题
本发明的课题在于：提供以丙型肝炎病毒J6CF株基因组作为骨架且具有自主复制能力的复制子RNA。
解决课题的方法
本发明人等为了解决上述课题反复进行了深入研究，结果发现：以J6CF株的前体蛋白的氨基酸序列为基准时，第1680位的丙氨酸取代成谷氨酸的氨基酸取代在赋予J6CF株基因组自主复制能力上较为重要，从而完成了本发明。
即，本发明包含以下内容。
[1]核酸，该核酸从5’侧往3’侧依次包含：丙型肝炎病毒J6CF株的基因组的5’非翻译区；包含NS3蛋白编码序列、NS4A蛋白编码序列、NS4B蛋白编码序列、NS5A蛋白编码序列和NS5B蛋白编码序列的病毒蛋白编码区；以及3’非翻译区，而且
当以SEQIDNO:30所示J6CF株的前体蛋白的氨基酸序列为基准时，上述NS4A蛋白编码序列具有第1680位的丙氨酸取代成谷氨酸的突变。
[2]上述[1]的核酸，当以SEQIDNO:30所示氨基酸序列为基准时，上述NS5B蛋白编码序列具有引起下述(i)～(iii)的氨基酸取代的突变，
当以SEQIDNO:29所示核苷酸序列为基准时，上述3’非翻译区的第9458位的胞嘧啶碱基取代成鸟嘌呤碱基，
(i)第2892位的丙氨酸取代成丝氨酸的氨基酸取代；
(ii)第2959位的精氨酸取代成赖氨酸的氨基酸取代；
(iii)第3003位的酪氨酸取代成苯丙氨酸的氨基酸取代。
[3]上述[1]的核酸，其中，上述NS5B蛋白编码序列被取代成编码由SEQIDNO:27所示氨基酸序列的第1位～第515位的氨基酸序列和SEQIDNO:28所示氨基酸序列的第516位～第591位的氨基酸序列依次连接的氨基酸序列构成的蛋白的核苷酸序列，并且
上述3’非翻译区被取代成SEQIDNO:31所示核苷酸序列。
[4]上述[1]～[3]的核酸，该核酸包含外来基因和IRES序列。
[5]上述[1]～[4]的核酸，其中，上述病毒蛋白编码区在NS3蛋白编码序列的5’侧从5’侧往3’侧进一步依次包含丙型肝炎病毒的基因组的核心蛋白编码序列、E1蛋白编码序列、E2蛋白编码序列、p7蛋白编码序列和NS2蛋白编码序列。
[6]丙型肝炎病毒的亚基因组复制子RNA，其包含上述[1]～[4]的核酸。
[7]丙型肝炎病毒的全基因组复制子RNA，其包含上述[5]的核酸。
[8]丙型肝炎病毒颗粒，其含有上述[5]的核酸作为病毒基因组。
[9]表达载体，其包含上述[1]～[5]中任一项的核酸。
[10]细胞，其中，上述[1]～[5]的核酸被导入该细胞中。
[11]丙型肝炎病毒疫苗，其含有上述[8]的丙型肝炎病毒颗粒。
[12]筛选抗丙型肝炎病毒物质的方法，该方法具备下述步骤：
培养步骤，在受检物质的存在下和不存在下，培养上述[10]的细胞、或者上述[8]的丙型肝炎病毒颗粒和丙型肝炎病毒敏感性细胞的混合物；
定量步骤，定量在上述培养步骤中得到的培养物中的亚基因组复制子RNA、全基因组复制子RNA或丙型肝炎病毒颗粒的量；以及
评价步骤，上述定量步骤的结果，当在受检物质的存在下定量的亚基因组复制子RNA、全基因组复制子RNA或丙型肝炎病毒颗粒的量分别少于在受检物质的不存在下定量的亚基因组复制子RNA、全基因组复制子RNA或丙型肝炎病毒颗粒的量时，评价为上述受检物质具有抗丙型肝炎病毒活性。
本说明书包含作为本申请的优先权主张的基础的日本国专利申请2011-122795号的公开内容。
发明效果
根据本发明，使用丙型肝炎病毒J6CF株的基因组作为骨架，可以制作在培养细胞中具有自主复制能力的复制子RNA。
附图说明
图1是来自JFH-1株的亚基因组复制子RNA表达载体、来自J6CF株的亚基因组复制子RNA表达载体、两个J6CF/JFH-1嵌合HCV亚基因组复制子RNA表达载体的结构图；
图2是来自JFH-1株的全基因组复制子RNA表达载体、来自J6CF株的全基因组复制子RNA表达载体、3个J6CF/JFH-1嵌合HCV全基因组复制子RNA表达载体的结构图；
图3中，A表示相对萤光素酶活性，该相对萤光素酶活性表示导入了作为HCV亚基因组复制子RNA的SGR-JFH1/Luc、SGR-J6CF/Luc、SGR-J6/N3H+5BSLX-JFH1/Luc或SGR-J6/5BSLX-JFH1/Luc的Huh7.5.1细胞中的HCV亚基因组复制子RNA的复制量。B表示导入了作为J6CF/JFH-1嵌合HCV全基因组复制子RNA的FGR-J6/N3H+5BSLX-JFH1或FGR-J6/5BSLX-JFH1的Huh7.5.1细胞的培养上清中的核心蛋白的量(表示产生病毒的能力)；
图4表示将导入了作为J6CF/JFH-1嵌合HCV全基因组复制子RNA的FGR-J6/5BSLX-JFH1或FGR-J6/5B-JFH1的Huh7.5.1细胞反复进行继代时培养上清中的核心蛋白量(病毒产生能力)随时间的变化；
图5表示包含A1680E突变的J6CF/JFH-1嵌合突变体HCV亚基因组复制子RNA和HCV全基因组复制子RNA表达载体的结构。pJFH1是将JFH-1株的全长基因组序列克隆到T7启动子下游的来自JFH-1株的HCV全基因组复制子RNA表达载体。pJ6CF是将J6CF株的全长基因组序列克隆到T7启动子下游的来自J6CF株的HCV全基因组复制子RNA表达载体；
图6表示导入了作为HCV亚基因组复制子RNA的SGR-J6/N3H+5BSLX-JFH1/Luc、SGR-J6/5BSLX-JFH1+4Amut/Luc或SGR-J6/5BSLX-JFH1/Luc的Huh7.5.1细胞中的相对萤光素酶活性(表示复制子RNA复制水平)；
图7表示导入了作为HCV全基因组复制子RNA的FGR-J6/N3H+5BSLX-JFH1、FGR-J6/5BSLX-JFH1+4Amut或FGR-J6/5BSLX-JFH1的Huh7.5.1细胞的培养上清中的核心蛋白量(产生病毒的能力)；
图8是来自J6CF株的突变体(导入5处突变)HCV亚基因组复制子RNA和HCV全基因组复制子RNA表达载体的结构图；
图9表示导入了作为HCV亚基因组复制子RNA的SGR-J6/N3H+5BSLX-JFH1/Luc、SGR-J6/5BSLX-JFH1+4Amut/Luc、SGR-J6/4Amut+SKF+VRm3/Luc或SGR-J6CF/Luc的Huh7.5.1细胞中的相对萤光素酶活性(表示复制子RNA复制水平)；
图10表示导入了作为HCV全基因组复制子RNA的FGR-J6/N3H+5BSLX-JFH1、FGR-J6/5BSLX-JFH1+4Amut、FGR-J6/4Amut+SKF+VRm3或FGR-J6CF的Huh7.5.1细胞的培养上清中的核心蛋白量(产生病毒的能力)；
图11是导入了“4Amut”、“SKF”和“VRm3”中的1个突变的HCV亚基因组复制子RNA表达载体的结构图；
图12是导入了“4Amut”、“SKF”和“VRm3”中的2个突变的HCV亚基因组复制子RNA表达载体的结构图；
图13是作为突变体HCV亚基因组复制子RNA表达载体的pSGR-J6/4Amut+SKF+VRm3/Luc表达载体和pSGR-J6/4Amut+Y3003F+VRm3/Luc表达载体的结构图；
图14是表示导入了作为HCV亚基因组复制子RNA的SGR-JFH1/Luc和SGR-J6CF/Luc、作为突变体HCV亚基因组复制子RNA的SGR-J6/4Amut+SKF+VRm3/Luc、SGR-J6/4Amut+Y3003F+VRm3/Luc、SGR-J6/4Amut/Luc、SGR-J6/SKF/Luc、SGR-J6/VRm3/Luc、SGR-J6/4Amut+SKF/Luc、SGR-J6/4Amut+VRm3/Luc和SGR-J6/SKF+VRm3/Luc的Huh7.5.1细胞中的相对萤光素酶活性(表示复制子RNA复制水平)的图。
具体实施方式
以下，对本发明进行详细说明。
本说明书中使用的科学用语、技术用语和命名法，只要没有特别定义，则具有与本领域技术人员通常所理解的意义相同的意义。另外，关于分子生物学和免疫学领域的普通的技术和学术用语，是指基于Sambrook等人的MolecularCloning：ALaboratoryManual(第3版、2001年)和EdHarlow等人的Antibodies：ALaboratoryManual(1988年)中记载的方法和定义的用语。而且，本说明书中引用的所有出版物、专利和专利申请，其全体作为参考而引用到本说明书中。
丙型肝炎病毒(HCV)是以单链的(+)链有义RNA作为基因组的病毒。HCV的基因组由5’非翻译区(5’UTR)、包含编码核心蛋白、E1蛋白、E2蛋白、p7蛋白、NS2蛋白、NS3蛋白、NS4A蛋白、NS4B蛋白、NS5A蛋白和NS5B蛋白的核苷酸序列的区即病毒蛋白编码区和3’非翻译区(3’UTR)构成。HCV基因组(HCV全长基因组)是将5’UTR、编码核心蛋白、E1蛋白、E2蛋白、p7蛋白、NS2蛋白、NS3蛋白、NS4A蛋白、NS4B蛋白、NS5A蛋白和NS5B蛋白的核苷酸序列以及3’UTR从5’侧到3’侧依次配置而形成的RNA。作为HCV全长基因组的例子，J6CF株的全长基因组的cDNA序列见SEQIDNO:29。为了与由HCV基因组的一部分构成的核酸进行区别，还将由其全长构成的HCV基因组称作“HCV全长基因组”、“全长HCV基因组”、“HCV全长基因组RNA”、“全长HCV基因组RNA”或“全长基因组RNA”。
作为HCV的实际状态，其以病毒颗粒的形式存在。HCV的病毒颗粒(HCV颗粒)在由HCV的结构蛋白构成的病毒壳的内部含有HCV基因组。
HCV的核心蛋白、E1蛋白、E2蛋白和p7蛋白是形成HCV颗粒的“结构蛋白”，将编码该结构蛋白的核酸称作“结构基因”。HCV的NS2蛋白、NS3蛋白、NS4A蛋白、NS4B蛋白、NS5A蛋白和NS5B蛋白是不形成HCV颗粒的“非结构蛋白”，将编码该非结构蛋白的核酸称作“非结构基因”。非结构蛋白具有参与HCV基因组的复制、HCV蛋白的加工等的功能。
HCV的5’非翻译区(5’UTR)提供用于蛋白翻译的内部核糖体进入位点(以下，记作IRES)和复制所必需的元件。HCV的5’UTR是自基因组的5’末端起约340个核苷酸的区。
HCV的3’非翻译区(3’UTR)辅助HCV的复制。HCV的3’UTR包含可变区、PolyU区和约100个核苷酸的附加区(X区)。
HCV作为10种病毒蛋白(核心蛋白、E1蛋白、E2蛋白、p7蛋白、NS2蛋白、NS3蛋白、NS4A蛋白、NS4B蛋白、NS5A蛋白和NS5B蛋白)依次连接的1个前体蛋白(多聚蛋白)被翻译，之后，用细胞内和病毒的蛋白酶切断，各自形成10种成熟的病毒蛋白(核心蛋白、E1蛋白、E2蛋白、p7蛋白、NS2蛋白、NS3蛋白、NS4A蛋白、NS4B蛋白、NS5A蛋白和NS5B蛋白)。作为HCV的前体蛋白的例子，J6CF株的前体蛋白的氨基酸序列见SEQIDNO:30。该前体蛋白由SEQIDNO:29所示的J6CF株的全长基因组序列编码。
已知HCV中有各种基因型，但已知各种基因型的HCV的基因组具有同样的基因结构。在本发明中，HCV的“基因型”是指，按照Simmonds等人的国际分类来进行分类的基因型。
J6CF株是属于基因型2a的HCV，J6CF株的全长HCV基因组的核苷酸序列(SEQIDNO:29)和前体蛋白的氨基酸序列(SEQIDNO:30)如GenBank检索号AF177036所示。SEQIDNO:29所表示的序列是J6CF株的全长基因组RNA的cDNA序列，但是将该核苷酸序列中的胸腺嘧啶(t)理解成尿嘧啶(u)的序列是RNA序列。
J6CF株的5’UTR由SEQIDNO:29的核苷酸编号第1位～第340位的序列构成，核心蛋白编码序列由SEQIDNO:29的核苷酸编号第341位～第913位的序列构成，E1蛋白编码序列由SEQIDNO:29的核苷酸编号第914位～第1489位的序列构成，E2蛋白编码序列由SEQIDNO:29的核苷酸编号第1490位～第2590位的序列构成，p7蛋白编码序列由SEQIDNO:29的核苷酸编号第2591位～第2779位的序列构成，NS2蛋白编码序列由SEQIDNO:29的核苷酸编号第2780位～第3430位的序列构成，NS3蛋白编码序列由SEQIDNO:29的核苷酸编号第3431位～第5323位的序列构成，NS4A蛋白编码序列由SEQIDNO:29的核苷酸编号第5324位～第5485位的序列构成，NS4B蛋白编码序列由SEQIDNO:29的核苷酸编号第5486位～第6268位的序列构成，NS5A蛋白编码序列由SEQIDNO:29的核苷酸编号第6269位～第7666位的序列构成，NS5B蛋白编码序列由SEQIDNO:29的核苷酸编号第7667位～第9442位(包括终止密码子)的序列构成，3’UTR由SEQIDNO:29的核苷酸编号第9443位～第9711位的序列构成。需要说明的是，J6CF株的NS5B蛋白的氨基酸序列见SEQIDNO:27。
JFH-1株是属于基因型2a的HCV，JFH-1株的全长HCV基因组的核苷酸序列和氨基酸序列如GenBank检索号AB047639所示。JFH-1株的NS5B蛋白氨基酸序列见SEQIDNO:28。当以GenBank检索号AB047639所示的核苷酸序列的5’末端的第1核苷酸作为核苷酸编号第1位时，JFH-1株的NS5B蛋白编码序列由其核苷酸编号第7667位～第9442位(包含终止密码子)的序列构成。JFH-1株的3’UTR由GenBank检索号AB047639所示的核苷酸序列的核苷酸编号第9443位～第9678位的序列构成。JFH-1株的3’UTR的核苷酸序列见序列表的SEQIDNO:31。
本发明利用这样的HCV基因组，提供包含导入了赋予自主复制能力的突变的基因型2a的HCV株(优选J6CF株)的亚基因组序列或全基因组序列的、以可以高效率地自主复制的复制子RNA或编码其的DNA为代表的核酸。
本发明中导入到复制子RNA中的、可以赋予基因型2a的HCV株(优选J6CF株)的亚基因组RNA或全基因组RNA自主复制能力的适应性突变，是J6CF株的前体蛋白的氨基酸序列的第1680位的丙氨酸取代成谷氨酸的氨基酸取代(A1680E)。
在本发明中，通过将该A1680E突变单独或与其他的适应性突变组合导入到J6CF株的亚基因组RNA或全基因组RNA中，可以制作在培养细胞中具有高的自主复制能力的HCV亚基因组复制子RNA或HCV全基因组复制子RNA。
对与A1680E突变一同导入的适应性突变没有限定，可以列举：引起J6CF株的前体蛋白的氨基酸序列的A2892S(第2892位的丙氨酸取代成丝氨酸)、R2959K(第2959位的精氨酸取代成赖氨酸)和Y3003F(第3003位的酪氨酸取代成苯丙氨酸)的氨基酸取代的核苷酸突变、以及nt9458(c→g)的核苷酸突变(J6CF株的全长基因组的第9458位的胞嘧啶突变成鸟嘌呤)。优选将A2892S突变、R2959K突变和Y3003F突变、以及nt9458(c→g)的核苷酸突变和A1680E突变一起全部导入到复制子RNA中。
在本发明中，通过将上述的A1680E突变导入到J6CF株基因组RNA的NS5B蛋白编码序列的一部分(相当于NS5B蛋白的第516位～第591位)和3’非翻译区取代成来自JFH-1株的相同区的序列的嵌合复制子RNA(J6CF/JFH-1嵌合复制子RNA)中，也可以制作在培养细胞中具有高的自主复制能力的HCV亚基因组复制子RNA或HCV全基因组复制子RNA。
HCV亚基因组复制子RNA或HCV全基因组复制子RNA只要与仅包含上述突变的复制子RNA具有同等的自主复制能力，可以具有上述的A1680E、A2892S、R2959K、Y3003F、nt9458(c→g)突变以外的突变。这样的其他突变可以是1个或多个(例如1～50个、优选1～20个、更优选1～5个)核苷酸的取代。具有这样的其他突变的复制子RNA与HCVJ6CF株的基因组序列相比具有92%以上、优选95%以上、更优选96%以上、进一步优选97%以上、特别优选99%以上(例如99.5%以上)的核苷酸序列同源性。或者，HCV亚基因组复制子RNA或HCV全基因组复制子RNA还优选具有只是上述的A1680E、A2892S、R2959K、Y3003F、nt9458(c→g)的突变。
在本发明中，“复制子RNA”是指具有在培养细胞(典型的是HCV敏感性细胞)内进行自主复制的能力的RNA。导入到细胞中的复制子RNA进行自主复制、且其RNA拷贝在细胞分裂后被分配到子细胞中，所以如果使用复制子RNA则可以稳定地导入到细胞中。
HCV的复制子RNA(HCV复制子RNA)是指，包含HCV基因组RNA的一部分或全长、且进行自主复制的RNA。将包含HCV基因组RNA的一部分且进行自主复制的RNA称作HCV亚基因组复制子RNA，将包含HCV基因组RNA的全长且进行自主复制的RNA称作HCV全基因组复制子RNA。“HCV复制子RNA”包含HCV亚基因组复制子RNA和HCV全基因组复制子RNA双方。
本发明中的“HCV亚基因组复制子RNA”，优选从5’往3’的顺序依次包含HCV的5’非翻译区(5’UTR)、编码NS3蛋白、NS4A蛋白、NS4B蛋白、NS5A蛋白和NS5B蛋白的核苷酸序列、以及3’非翻译区(3’UTR)。另外，HCV亚基因组复制子RNA优选包含外来基因(抗药性基因或报道基因)和IRES序列以对其进行检测，在这种情况下，优选在HCV亚基因组复制子RNA的NS3蛋白编码序列的5’侧包含外来基因(抗药性基因或报道基因)和IRES序列。本发明中优选的“HCV亚基因组复制子RNA”的例子为：从5’侧往3’侧依次包含HCV的5’非翻译区(5’UTR)、核心蛋白编码区的5’末端的36个核苷酸的序列、外来基因(抗药性基因或报道基因)、IRES序列、编码NS3蛋白、NS4A蛋白、NS4B蛋白、NS5A蛋白和NS5B蛋白的核苷酸序列、以及3’非翻译区(3’UTR)。
本发明中的“HCV全基因组复制子RNA”优选将HCV的5’非翻译区(5’UTR)、编码核心蛋白、E1蛋白、E2蛋白、p7蛋白、NS2蛋白、NS3蛋白、NS4A蛋白、NS4B蛋白、NS5A蛋白和NS5B蛋白的核苷酸序列、以及3’非翻译区(3’UTR)按照从5’往3’的顺序依次配置而形成的HCV全基因组复制子RNA。
当HCV全长基因组具有自主复制能力时，该基因组是复制子RNA。将包含HCV全长基因组的复制子RNA称作HCV全基因组复制子RNA。当由HCV全长基因组序列构成的RNA(HCV全长基因组RNA)具有自主复制能力时，其是HCV全基因组复制子RNA。
本发明的核酸基本上是以JFH-1株以外的基因型2a的HCV株(优选J6CF株)的基因组序列作为骨架、并且具有赋予在培养细胞中的自主复制能力的突变的核酸。该核酸典型的是HCV亚基因组复制子RNA或HCV全基因组复制子RNA、或编码它们的DNA。
在一实施方式中，本发明涉及核酸，该核酸是从5’侧向3’侧依次包含丙型肝炎病毒J6CF株的基因组的、5’非翻译区、包含NS3蛋白编码序列、NS4A蛋白编码序列、NS4B蛋白编码序列、NS5A蛋白编码序列和NS5B蛋白编码序列的病毒蛋白编码区、以及3’非翻译区的核酸，其中，以SEQIDNO:30所示的J6CF株的前体蛋白的氨基酸序列为基准时，在上述NS4A蛋白编码序列内具有第1680位的丙氨酸取代成谷氨酸的突变(引起该丙氨酸取代成谷氨酸的氨基酸取代的核苷酸突变)。当该核酸包含全长基因组序列作为病毒性序列(这里所说的病毒性序列是指来自HCV基因组的核苷酸序列。)时，上述病毒蛋白编码区在NS3蛋白编码序列的5’侧从5’侧往3’侧依次进一步包含核心蛋白编码序列、E1蛋白编码序列、E2蛋白编码序列、p7蛋白编码序列和NS2蛋白编码序列。
在一优选实施方式中，该核酸可以从5’侧往3’侧依次包含：丙型肝炎病毒J6CF株的基因组的5’非翻译区、包含NS3蛋白编码序列、NS4A蛋白编码序列、NS4B蛋白编码序列、NS5A蛋白编码序列和NS5B蛋白编码序列的病毒蛋白编码区、以及3’非翻译区，其中，以SEQIDNO:30所示的J6CF株的前体蛋白的氨基酸序列为基准时，上述NS4A蛋白编码序列具有第1680位的丙氨酸取代成谷氨酸的突变，并且，以SEQIDNO:30所示的氨基酸序列为基准时，上述NS5B蛋白编码序列具有引起下述氨基酸取代的突变：(i)第2892位的丙氨酸取代成丝氨酸的氨基酸取代、(ii)第2959位的精氨酸取代成赖氨酸的氨基酸取代、以及(iii)第3003位的酪氨酸取代成苯丙氨酸的氨基酸取代，当以SEQIDNO:29所示的核苷酸序列为基准时，上述3’非翻译区中第9458位的碱基胞嘧啶被取代成碱基鸟嘌呤。
该核酸可以是包含亚基因组序列(由HCV全长基因组的一部分构成的序列)作为病毒性序列(来自HCV基因组的核苷酸序列)的核酸，例如可以是亚基因组复制子RNA或编码其的DNA。该核酸包含外来基因(抗药性基因或报道基因)和IRES序列时，在外来基因的5’侧可以包含核心蛋白编码区的5’末端的部分片段(例如5’末端的36个核苷酸的序列)。此时，该核酸从5’侧往3’侧依次包含HCV的5’非翻译区(5’UTR)、核心蛋白编码区的5’末端的36个核苷酸的序列、外来基因(抗药性基因或报道基因)、IRES序列、编码NS3蛋白、NS4A蛋白、NS4B蛋白、NS5A蛋白和NS5B蛋白的核苷酸序列、以及3’非翻译区(3’UTR)。例如，该核酸可以是包含SEQIDNO:4所示核苷酸序列的亚基因组复制子RNA或编码其的DNA(当为RNA时，核苷酸序列中的胸腺嘧啶(t)理解成尿嘧啶(u))。
或者，该核酸可以是包含全(全长)基因组序列作为病毒性序列的核酸，例如可以是全基因组复制子RNA或编码其的DNA。在包含全长基因组序列作为病毒性序列的上述核酸中，上述病毒蛋白编码区在NS3蛋白编码序列的5’侧从5’侧往3’侧依次进一步包含核心蛋白编码序列、E1蛋白编码序列、E2蛋白编码序列、p7蛋白编码序列和NS2蛋白编码序列。该核酸例如可以是包含SEQIDNO:5所示核苷酸序列的全基因组复制子RNA或编码其的DNA(当为RNA时，核苷酸序列中的胸腺嘧啶(t)理解成尿嘧啶(u))。
本发明的该核酸可以是在其核苷酸序列中具有突变的核酸，该核酸包含HCV的J6CF株的基因组的5’非翻译区、编码NS3蛋白、NS4A蛋白、NS4B蛋白、NS5A蛋白和NS5B蛋白的核苷酸序列、以及3’非翻译区，并且，以HCV的J6CF株的前体蛋白的氨基酸序列为基准时，该核酸具有引起下述取代的突变：第1680位的丙氨酸取代成谷氨酸、第2892位的丙氨酸取代成丝氨酸、第2959位的精氨酸取代成赖氨酸、以及第3003位的酪氨酸取代成苯丙氨酸；以及，以J6CF株的基因组的核苷酸序列为基准时，具有第9458位的胞嘧啶突变成鸟嘌呤的突变。该核酸优选为在来自J6CF株的亚基因组的复制子RNA中导入了上述5个突变的来自J6CF株的突变体亚基因组复制子RNA或编码其的DNA。该核酸可以是包含SEQIDNO:4所示核苷酸序列的核酸。
本发明的该核酸可以是在HCV的J6CF株的全长基因组的核苷酸序列中包含具有突变的核苷酸序列的核酸，并且，以HCV的J6CF株的前体蛋白的氨基酸序列为基准时，具有引起下述取代的突变：第1680位的丙氨酸取代成谷氨酸、第2892位的丙氨酸取代成丝氨酸、第2959位的精氨酸取代成赖氨酸、以及第3003位的酪氨酸取代成苯丙氨酸；以及，以J6CF株的基因组的核苷酸序列为基准时，具有第9458位的胞嘧啶突变成鸟嘌呤的突变。该核酸优选为在来自J6CF株的全长基因组的复制子RNA中导入了上述5个突变的来自J6CF株的突变体全基因组复制子RNA或编码其的DNA。该核酸可以是包含SEQIDNO:5所示核苷酸序列的核酸。
需要说明的是，在本说明书中，来自J6CF株的突变体HCV亚基因组复制子RNA、来自J6CF株的突变体HCV全基因组复制子RNA是指，包含导入有突变的J6CF株的亚基因组序列或全基因组序列的复制子RNA。为了与该突变体进行区别，将没有导入突变的J6CF株基因组序列称作野生型。
在本发明的另一实施方式中，本发明的核酸可以是从5’侧往3’侧依次包含丙型肝炎病毒J6CF株的基因组的、5’非翻译区、包含NS3蛋白编码序列、NS4A蛋白编码序列、NS4B蛋白编码序列、NS5A蛋白编码序列和NS5B蛋白编码序列的病毒蛋白编码区、以及3’非翻译区的核酸，其中，以SEQIDNO:30所示J6CF株的前体蛋白的氨基酸序列为基准时，上述NS4A蛋白编码序列具有第1680位的丙氨酸取代成谷氨酸的突变(引起丙氨酸取代成谷氨酸的氨基酸取代的核苷酸突变)，而且
(a)上述NS5B蛋白编码序列被取代成编码由SEQIDNO:27所示氨基酸序列的第1位～第515位的氨基酸序列和SEQIDNO:28所示氨基酸序列的第516位～第591位的氨基酸序列依次连接而得到的氨基酸序列构成的蛋白的核苷酸序列；并且
(b)上述3’非翻译区被取代成SEQIDNO:31所示核苷酸序列(来自JFH-1株的3’非翻译区)。
这里，(a)中记载的由SEQIDNO:27所示氨基酸序列的第1位～第515位的氨基酸序列和SEQIDNO:28所示氨基酸序列的第516位～第591位的氨基酸序列依次连接得到的氨基酸序列构成的蛋白的氨基酸序列为SEQIDNO:33所示氨基酸序列。编码该蛋白的核苷酸序列例如可以是SEQIDNO:32所示核苷酸序列。
该核酸可以是包含亚基因组序列作为病毒性序列的核酸，例如可以是亚基因组复制子RNA或编码其的DNA。该核酸包含外来基因(抗药性基因或报道基因)和IRES序列时，在外来基因的5’侧可以包含核心蛋白编码区的5’末端的部分片段(例如5’末端的36个核苷酸的序列)。此时，该核酸从5’侧往3’侧依次包含HCV的5’非翻译区(5’UTR)、核心蛋白编码区的5’末端的36个核苷酸的序列、外来基因(抗药性基因或报道基因)、IRES序列、编码NS3蛋白、NS4A蛋白、NS4B蛋白、NS5A蛋白和NS5B蛋白的核苷酸序列、以及3’非翻译区(3’UTR)。该核酸例如可以是包含SEQIDNO:1所示核苷酸序列的亚基因组复制子RNA或编码其的DNA(当为RNA时，核苷酸序列中的胸腺嘧啶(t)理解成尿嘧啶(u))。
或者，该核酸可以是包含全长基因组序列作为病毒性序列的核酸，例如可以是全基因组复制子RNA或编码其的DNA。在包含全长基因组序列作为病毒性序列的上述核酸中，上述病毒蛋白编码区在NS3蛋白编码序列的5’侧从5’侧往3’侧依次进一步包含核心蛋白编码序列、E1蛋白编码序列、E2蛋白编码序列、p7蛋白编码序列和NS2蛋白编码序列。该核酸例如可以是包含SEQIDNO:2所示核苷酸序列的全基因组复制子RNA或编码其的DNA(当为RNA时，核苷酸序列中的胸腺嘧啶(t)理解成尿嘧啶(u))。
本发明的该核酸可以是：在包含HCV的J6CF株的基因组的5’非翻译区、编码NS3蛋白、NS4A蛋白、NS4B蛋白和NS5A蛋白的核苷酸序列、编码HCV的J6CF株的NS5B蛋白的第1位～第515位的氨基酸残基的核苷酸序列、编码HCV的JFH-1株的NS5B蛋白的第516位～第591位的氨基酸残基的核苷酸序列、以及HCV的JFH-1株的基因组的3’非翻译区的核酸的核苷酸序列中具有突变的核酸，并且，其具有引起第1680位的丙氨酸取代成谷氨酸的取代的突变。
本发明的该核酸还可以是嵌合型核酸，该嵌合型核酸是在HCV的J6CF株的基因组的5’非翻译区、编码核心蛋白、E1蛋白、E2蛋白、p7蛋白、NS2蛋白、NS3蛋白、NS4A蛋白、NS4B蛋白和NS5A蛋白的核苷酸序列、编码HCV的J6CF株的NS5B蛋白(SEQIDNO:27)的第1位～第515位的氨基酸残基的核苷酸序列、编码HCV的JFH-1株的NS5B蛋白(SEQIDNO:28)的第516位～第591位的氨基酸残基的核苷酸序列、以及HCV的JFH-1株的基因组的3’非翻译区从5’侧往3’侧以5’非翻译区、编码核心蛋白、E1蛋白、E2蛋白、p7蛋白、NS2蛋白、NS3蛋白、NS4A蛋白、NS4B蛋白、NS5A蛋白和NS5B蛋白的核苷酸序列、以及3’非翻译区的顺序配置的核酸的核苷酸序列中具有突变的核酸，并且，其具有引起第1680位的丙氨酸取代成谷氨酸的取代的突变。该嵌合型核酸可以通过将J6CF株的HCV基因组序列中NS5B蛋白编码序列的一部分和3’非翻译区取代成来自JFH-1株的基因组的相同区的序列、并且导入A1680E的氨基酸取代来制作。该J6CF/JFH-1嵌合突变体核酸中的NS5B蛋白成为来自J6CF株和来自JFH-1株的嵌合NS5B蛋白。优选该核酸可以是包含SEQIDNO:2所示核苷酸序列的核酸。这里，嵌合型核酸(嵌合核酸)或嵌合型HCV基因组(嵌合HCV基因组)是指，包含2个以上的不同株的HCV的基因组序列的核酸或基因组。
在本发明中，“核酸”包括RNA和DNA、以及其衍生物。另外，本说明书中的“蛋白编码区”、“编码蛋白的核苷酸序列”、“编码蛋白的序列”和“蛋白编码序列”是指编码规定的蛋白的氨基酸序列的核苷酸序列，可以包含也可以不包含起始密码子和终止密码子。
本说明书中，在核酸为RNA的情况下，当引用序列表的SEQIDNO来特定RNA的核苷酸序列或核苷酸时，该SEQIDNO所示核苷酸序列中的胸腺嘧啶(t)理解成尿嘧啶(u)。
在本说明书中，通过“以SEQIDNO:“X”所示的…氨基酸序列为基准时第“Y”位的(氨基酸)”的表述来指定SEQIDNO所示氨基酸序列中的特定位置的氨基酸。例如，“以SEQIDNO:30所示J6CF株的前体蛋白的氨基酸序列为基准时第“Y”位的(氨基酸)”的记载是指，在SEQIDNO:30所示HCV的J6CF株的前体蛋白的氨基酸序列中，以N末端的第1氨基酸(甲硫氨酸)作为第1位时，该氨基酸是位于第“Y”位的氨基酸残基。采用“以SEQIDNO:“X”所示的…氨基酸序列为基准时第“Y”位的(氨基酸)”的表述时，该指定的氨基酸所存在的氨基酸序列中的实际位置可以是该第“Y”位，但也可以不是第“Y”位。具体而言，例如记载为“以SEQIDNO:30所示J6CF株的前体蛋白的氨基酸序列为基准时，第1680位的丙氨酸被取代成谷氨酸、并且报道蛋白被插入N末端侧的包含SEQIDNO:30所示前体蛋白的氨基酸序列的蛋白”时，是指在SEQIDNO:30中虽然位于第1680位但由于报道蛋白的插入而使其距N末端的位置不是第1680位的丙氨酸在蛋白中被取代成谷氨酸。
J6CF株的前体蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO:30所示。SEQIDNO:30所示J6CF株的前体蛋白的氨基酸序列(由从翻译起始位点的甲硫氨酸数起到第3033位的精氨酸(R)的3033个残基的氨基酸构成)由包含SEQIDNO:29所示J6CF株的全长基因组RNA的cDNA序列的核苷酸编号第341位～第9442位(包含终止密码子)的序列的部分的序列编码。
以SEQIDNO:30所示J6CF株的前体蛋白的氨基酸序列为基准时，第1680位的氨基酸是NS4A蛋白中所含的丙氨酸(A)。由丙氨酸(A)取代成谷氨酸(E)的取代表示成A1680E，但也可以表示成1680AE或1680A→E。其他的氨基酸取代也同样书写。
需要说明的是，在本说明书中，氨基酸通过生物学领域通常使用的氨基酸的单字母符号(Sambrook等人,MolecularCloning:ALaboratoryManualSecondEdition,1989年)来记载。在本说明书中，氨基酸或氨基酸残基以生物学领域通常使用的氨基酸的单字母符号或三字母符号来记载，这也包含进行了氢氧化、糖链加成、硫酸化等翻译后修饰的氨基酸。
在本说明书中，A1680E等的书写表示特定位置的氨基酸的取代，根据文脉还表示引起该氨基酸取代的核苷酸突变。例如，核酸的核苷酸发生突变，原始核酸所编码的氨基酸序列中的第1680位的丙氨酸(A)被取代成谷氨酸(E)时，有时将该突变称作A1680E取代(突变)。另外，有时将编码具有该突变的氨基酸序列的核酸称作包含A1680E取代(突变)的核酸、或导入了A1680E取代(突变)的核酸。或者，还有时将这样的突变称作引起氨基酸序列中的A1680E取代(突变)的核苷酸突变。例如，有时将导入了A1680E取代(突变)的HCV复制子RNA称作A1680E突变体HCV复制子RNA。同时具有多个突变时，例如，具有A1680E的取代和A2892S、R2959K和Y3003F的氨基酸取代时，有时表述为“包含A1680E/A2892S/R2959K/Y3003F的取代(突变)”。“氨基酸取代”有时表述为“氨基酸突变”。
引起特定的氨基酸取代的核苷酸突变可以根据周知的遗传密码表来选择。例如，引起A1680E取代的突变是导致由编码丙氨酸的密码子“GCT”、“GCC”、“GCA”或“GCG”变成编码谷氨酸的密码子“GAA”或“GAG”的突变。在J6CF株的全长基因组序列(SEQIDNO:29)中，引起A1680E取代的核苷酸突变是使密码子“GCG”(SEQIDNO:29的第5378位～第5380位)变成“GAA”或“GAG”的突变。即，这是使SEQIDNO:29的第5379位～第5380位的核苷酸序列由5’-cg-3’变成5’-aa-3’、或者使第5379位的核苷酸由胞嘧啶(c)变成腺嘌呤(a)的突变。
同样，以序列表的SEQIDNO:30所示J6CF株的前体蛋白的氨基酸序列为基准时，第2892位的丙氨酸取代成丝氨酸的氨基酸取代记作A2892S。在J6CF株的全长基因组序列(SEQIDNO:29)中，引起A2892S取代的核苷酸突变是使编码丙氨酸的密码子“GCG”(SEQIDNO:29的第9014位～第9016位)变成编码丝氨酸的密码子“TCT”、“TCC”、“TCA”、“TCG”、“AGT”或“AGC”的突变。
同样，以序列表的SEQIDNO:30所示J6CF株的前体蛋白的氨基酸序列为基准时，第2959位的精氨酸取代成赖氨酸的氨基酸取代记作R2959K。在J6CF株的全长基因组序列(SEQIDNO:29)中，引起R2959K取代的核苷酸突变是使编码精氨酸的密码子“AGA”(SEQIDNO:29的第9215位～第9217位)变成编码赖氨酸的密码子“AAA”或“AAG”的突变。
同样，在以序列表的SEQIDNO:30所示J6CF株的前体蛋白的氨基酸序列为基准时，第3003位的酪氨酸取代成苯丙氨酸的氨基酸取代记作Y3003F。在J6CF株的全长基因组序列(SEQIDNO:29)中，引起Y3003F取代的核苷酸突变是使编码酪氨酸的密码子“TAT”(SEQIDNO:29的第9347位～第9349位)变成编码苯丙氨酸的密码子“TTT”或“TTC”的突变。
在本说明书中，通过“以SEQIDNO:“X”所示的…核苷酸序列为基准时第“Y”位的(核苷酸)”的表述来指定SEQIDNO所示核苷酸序列中的特定位置的核苷酸。例如“以SEQIDNO:29所示核苷酸序列为基准时第“Y”位的(核苷酸)”的记载是指，在SEQIDNO:29所示HCV的J6CF株的全长基因组的核苷酸序列中，以5’末端的第1核苷酸作为第1位时，该核苷酸是位于第“Y”位的核苷酸。采用“以SEQIDNO:“X”所示的…核苷酸序列为基准时第“Y”位的(核苷酸)”的表述时，该指定的核苷酸所存在的核苷酸序列中的实际位置可以是第“Y”位，但也可以不是第“Y”位。具体而言，例如记载为“以SEQIDNO:29所示核苷酸序列为基准时，第9458位的胞嘧啶(c)被取代成鸟嘌呤(g)、并且报道基因被插入5’末端侧的包含SEQIDNO:29所示全长基因组序列的复制子RNA”时，是指在SEQIDNO:29中虽然位于第9458位但由于报道基因的插入而使其距5’末端的位置不是第9458位的胞嘧啶在复制子RNA中被取代成鸟嘌呤。
书写核苷酸突变时，为了与氨基酸的取代(突变)进行区别，可以在表示核苷酸突变的位置的核苷酸编号前附上nt。核苷酸突变有时还使用小文字的αβ来书写(腺嘌呤记作a、胞嘧啶记作c、鸟嘌呤记作g、尿嘧啶记作u、胸腺嘧啶记作t)。例如，核苷酸突变nt9458(c→g)是指第9458位的核苷酸由胞嘧啶(c)突变成鸟嘌呤(g)。
本发明的核酸、例如HCV亚基因组复制子RNA或HCV全基因组复制子RNA是以J6CF株的基因组序列作为骨架的核酸。“以J6CF株的基因组作为骨架的核酸”是指，编码相对于J6CF株的前体蛋白的氨基酸序列(SEQIDNO:30)显示出97%以上的同源性(优选99%以上、更优选99.5%以上、进一步优选99.8%以上)的HCV前体蛋白的核酸。包含亚基因组序列作为病毒性序列时，与前体蛋白中的仅该亚基因组序列所对应的区的氨基酸序列进行比较，求出同源性。同源性的分析可以使用GENETYX(注册商标)等遗传信息处理软件来进行分析。例如，以k-tuple的值为2，通过GENETYX(注册商标)分析JFH-1株和J6CF株的前体蛋白的氨基酸序列的同源性时，在全部的3033个氨基酸残基中，相同的氨基酸为2765个，同源性为91%。导入了5个突变(A1680E、A2892S、R2959K和Y3003F、以及nt9458(c→g))的来自J6CF株的全基因组复制子RNA，其相对于野生型J6CF株的全长基因组序列，在前体蛋白中具有99.86%的同源性，是以J6CF株的基因组序列作为骨架的全基因组复制子RNA。以J6CF株的基因组序列作为骨架的本发明的核酸，优选为来自J6CF株的突变体HCV亚基因组复制子RNA或来自J6CF株的突变体HCV全基因组复制子RNA、或编码其的DNA。
在本发明中，来自J6CF株的突变体HCV亚基因组复制子RNA、来自J6CF株的突变体HCV全基因组复制子RNA分别是指，以J6CF株的基因组序列作为骨架、并且包含1个以上的赋予复制子RNA在培养细胞中的自主复制能力或提高其复制效率的适应性突变(氨基酸突变和/或核苷酸突变)的HCV亚基因组复制子RNA、HCV全基因组复制子RNA。
包含1个以上的赋予自主复制能力或提高其复制效率的适应性突变(氨基酸突变和/或核苷酸突变)的、作为J6CF株和其他HCV株(例如JFH-1株)的基因组的嵌合的HCV亚基因组复制子RNA或嵌合突变体HCV全基因组复制子RNA，只要根据上述基准以J6CF株的基因组序列作为骨架，也包含在来自J6CF株的突变体HCV亚基因组复制子RNA、来自J6CF株的突变体HCV全基因组复制子RNA的范围内。
本发明的核酸、例如来自J6CF株的突变体HCV亚基因组复制子RNA或来自J6CF株的突变体HCV全基因组复制子RNA，可以进一步包含选择标志物基因或报道基因等外来基因和IRES序列。
例如，突变体HCV亚基因组复制子RNA优选为从5’侧往3’侧依次包含HCV的5’非翻译区(5’UTR)、外来基因、IRES序列、编码HCV的NS3蛋白、NS4A蛋白、NS4B蛋白、NS5A蛋白和NS5B蛋白的序列、以及HCV的3’非翻译区(3’UTR)的核酸。突变体HCV亚基因组复制子RNA在5’非翻译区和外来基因之间可以包含来自J6CF株的核心蛋白编码区的5’末端的36个核苷酸的核苷酸序列(SEQIDNO:29的第341位～第376位)。
例如，突变体HCV全基因组复制子RNA优选从5’侧到3’侧依次包含HCV的5’非翻译区(5’UTR)、外来基因、IRES序列、编码HCV的核心蛋白、E1蛋白、E2蛋白、p7蛋白、NS2蛋白、NS3蛋白、NS4A蛋白、NS4B蛋白、NS5A蛋白和NS5B蛋白的序列、以及HCV的3’非翻译区(3’UTR)。
选择标志物基因是可以赋予细胞只选择表达该基因的细胞的选择性的基因，有抗药性基因等。在本发明中，对优选的选择标志物基因的例子没有限定，可以列举：新霉素抗性基因、潮霉素抗性基因、胸苷激酶基因、卡那霉素B抗性基因、吡啶硫胺素抗性基因、腺苷酰基转移酶基因、Zeocin抗性基因、嘌呤霉素抗性基因等，优选新霉素抗性基因、胸苷激酶基因，进一步优选新霉素抗性基因。
报道基因是编码作为该基因表达的指标的基因产物的基因。在本发明中，作为优选的报道基因的例子，可以列举催化发光反应或显色反应的酶的结构基因。对优选的报道基因的例子没有限定，可以列举：来自转座子Tn9的氯霉素乙酰转移酶基因、来自大肠杆菌的β葡糖醛酸酶或β半乳糖苷酶基因、萤光素酶基因、绿色萤光蛋白基因、来自水母的水母素(エクオリン，aequorin)基因、分泌型胎盘碱性磷酸酶(SEAP)基因等。
在HCV复制子RNA中，可以只包含抗药性基因和报道基因中的任意一个，也可以包含两者。在HCV复制子RNA中，可以包含1个、也可以包含2个以上的抗药性基因或报道基因等标志物基因。
在本发明中，“IRES序列”是指可以使核糖体结合在RNA内部并开始翻译的内部核糖体结合位点。作为IRES序列的优选的例子，可以列举EMCVIRES(脑心肌炎病毒的内部核糖体结合位点)、FMDVIRES、HCVIRES等，更优选EMCVIRES和HCVIRES，最优选EMCVIRES。
在本发明中，抗药性基因和/或报道基因以由HCV亚基因组复制子RNA或HCV全基因组复制子RNA按照正确的读框(框架)进行翻译的方式与5’非翻译区、病毒蛋白编码序列和3’非翻译区连接。
上述的本发明的核酸更优选为具有自主复制能力的亚基因组复制子RNA或全基因组复制子RNA。因此，本发明还提供：包含本发明的核酸的丙型肝炎病毒的亚基因组复制子RNA或全基因组复制子RNA。
在本发明的核酸的制作中，可以使用将J6CF株的基因组RNA进行逆转录而得到的cDNA(GenBank检索号AF177036)克隆化的DNA、以及将JFH-1株的基因组进行逆转录而得到的cDNA(GenBank检索号AB047639)克隆化的DNA。
包含来自J6CF株的亚基因组的核酸构建物，可以通过将J6CF株的基因组RNA进行逆转录而得到的cDNA克隆化的DNA的一部分例如用限制酶切断或者通过同源重组取代其一部分而制得。例如，可以通过将从J6CF基因组克隆pJ6CF的核心蛋白编码区的5’末端到第37位～NS2蛋白编码区取代成由外来基因和IRES序列(例如EMCVIRES序列)构成的核苷酸序列来制作。
包含不具有A1680E突变的J6CF/JFH-1嵌合HCV亚基因组或全基因组(嵌合HCV基因组)的核酸构建物，可以通过以将J6CF和JFH-1的各HCV基因组RNA的cDNA克隆化的载体为模板进行PCR，再扩增组合的各HCV基因组区并进行连接而制得。例如，可以扩增从J6CF株的5’非翻译区到NS5B蛋白氨基酸序列的第515位的区，再扩增从JFH-1株的NS5B蛋白氨基酸序列的第516位到3’UTR的区，之后连接这些扩增产物。该方法例如记载在Wakita,T.等人,Nat.Med.,2005年,第11卷,第791-796页；Lindenbach,B.D.等人,Science,2005年,第309卷,第623-626页；Pietschmann,T.等人,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,2007年,第103卷,第7408-7413页中。
向野生型HCV基因组序列或嵌合HCV基因组序列中导入突变时，可以使用PCR法或市售的突变导入试剂盒(例如，东洋纺社制的KOD-Plus-诱变试剂盒等)。作为PCR法，例如，以将野生型的HCV基因组RNA的cDNA克隆化的载体为模板，使用由该cDNA的序列设计的、包含目标突变的正向和反向引物进行PCR，从而可以扩增包含突变的目标序列部分。具体而言，合成多个彼此具有重复序列的不同的PCR产物，混合这些PCR产物，以其为模板，使用包含目标核酸的5’端的正向引物和包含该核酸的互补链的5’端的反向引物进行PCR，从而扩增该目标核酸。用限制酶切断所合成的核酸的各末端，再与将用相同的酶切断的野生型HCV基因组RNA的cDNA克隆化的载体连接，从而可以导入目标突变。这样的方法例如还记载在国际公开第04/104198号、国际公开第06/022422号、Wakita,T.等人,2005年,Nat.Med.,第11号,第791-796页和Lindenbach,B.D.等人,2005年,Science,第309号,第623-626页中。
向野生型HCV全长基因组序列或嵌合HCV全长基因组序列中导入突变时，可以如上操作向野生型HCV全长基因组序列中导入突变，或者，还可以向野生型HCV亚基因组序列中导入突变，之后连接来自野生型HCV基因组序列的不足的序列部分(结构基因等)，制作全基因组序列。
本发明的来自J6CF株的突变体HCV亚基因组复制子RNA、或来自J6CF株的突变体HCV全基因组复制子RNA，可以通过制作将编码其的DNA克隆化的表达载体，将其导入宿主细胞中，使RNA表达而制得。
这些突变体HCV复制子RNA的制作中使用的表达载体可以利用常规方法来制作，可以利用国际公开第05/080575号中记载的技术，适当地进行制作。
具体而言，例如，利用常规方法将来自J6CF株的突变体HCV亚基因组复制子RNA或来自J6CF株的突变体HCV全基因组复制子RNA所对应的DNA片段(cDNA等)插入到表达载体中的启动子的下游，制作DNA克隆。本发明中的表达载体是指含有启动子的载体，所述启动子可以诱导在其控制下的基因或RNA编码序列的转录。作为表达载体，优选质粒载体。作为启动子，可以使用T7启动子、SP6启动子、T3启动子等，优选T7启动子。作为载体，可以使用pUC19(TaKaRa公司)、pBR322(TaKaRa公司)、pGEM-T、pGEM-TEasy、pGEM-3Z(均由Promega公司制)、pSP72(Promega公司)、pCRII(Invitrogen公司)、pT7Blue(Novagen公司)等。
本发明提供：如上操作而制作的、包含本发明的核酸的表达载体。该表达载体可以表达(转录诱导)来自J6CF株的突变体HCV亚基因组复制子RNA或来自J6CF株的突变体HCV全基因组复制子RNA，在本发明中，将这样的表达载体称作“复制子RNA表达载体”。
由克隆化表达载体制作上述突变体HCV亚基因组复制子RNA或突变体HCV全基因组复制子RNA时，只要以所制作的上述DNA克隆为模板，使用RNA聚合酶合成RNA即可。以在T7启动子的控制下将HCVcDNA克隆化的核酸为模板，在体外制作RNA时，可以使用MEGAscriptT7试剂盒(Ambion公司)等进行合成。RNA的合成可以利用常规方法从5’UTR开始。当DNA克隆为质粒克隆时，还可以使用通过限制酶从质粒克隆中切出的DNA片段作为模板，合成RNA。需要说明的是，优选所合成的RNA的3’末端与HCV基因组RNA的3’UTR的末端一致，不添加或者不删除其他的序列。
已制作的来自J6CF株的突变体HCV亚基因组复制子RNA或来自J6CF株的突变体HCV全基因组复制子RNA，可以利用本领域技术人员所周知的RNA提取法或纯化法等进行提取、纯化。
如上操作而制作的来自J6CF株的突变体HCV亚基因组复制子RNA或来自J6CF株的突变体HCV全基因组复制子RNA可以在培养细胞中高效率地进行自主复制。通过向细胞中导入来自J6CF株的突变体HCV亚基因组复制子RNA或来自J6CF株的突变体HCV全基因组复制子RNA，可以得到复制子RNA进行自主复制的细胞。本发明还提供：导入有这样的来自J6CF株的突变体HCV亚基因组复制子RNA或来自J6CF株的突变体HCV全基因组复制子RNA(或者，包含HCV亚基因组序列或全基因组序列的本发明的核酸)的细胞。
作为将这些HCV复制子RNA导入细胞中的方法，可以采用公知的任意方法。例如，可以列举磷酸钙共沉淀法、DEAE葡聚糖法、脂质转染法、显微注射法、电穿孔法，但优选列举脂质转染法和电穿孔法，进一步优选列举电穿孔法。
导入有来自J6CF株的突变体HCV亚基因组复制子RNA或来自J6CF株的突变体HCV全基因组复制子RNA的细胞中的HCV复制子RNA的自主复制能力(复制能力)，例如可以根据该HCV复制子RNA中所含的选择标志物基因或报道基因等外来基因的功能、即通过表达得到的外来基因的基因产物的活性来进行评价。
例如，当外来基因为抗药性基因时，在含有使该基因产生抗性的药物的选择培养基中培养上述细胞，计测增殖的细胞数或细胞的集落数，从而可以评价该HCV复制子RNA的复制能力。此时，细胞数或细胞的集落数越多，则可以评价为复制能力越高。
当外来基因为酶时，典型的是，培养导入有该HCV复制子RNA的细胞，计测该细胞中的酶活性，从而可以评价HCV复制子RNA的复制能力。此时，酶活性越高，则可以评价为复制能力越高。例如，当来自J6CF株的突变体HCV亚基因组复制子RNA或来自J6CF株的突变体HCV全基因组复制子RNA包含萤光素酶基因时，可以利用常规方法测定细胞中的萤光素酶活性。
作为其他的方法，还可以利用定量性的RT-PCR定量导入有该HCV复制子RNA的细胞中的HCV复制子RNA的量，从而直接评价复制子RNA的复制能力。
当来自J6CF株的突变体HCV亚基因组复制子RNA或来自J6CF株的突变体HCV全基因组复制子RNA在培养细胞中显示出经时性的增加倾向时，可以判定为该复制子RNA具有自主复制能力。需要说明的是，即使该HCV复制子RNA的复制水平暂时性地(例如直至转染到细胞中大约24小时后)有少许下降，但之后(例如30小时以后)继续增加时，可以判定为该复制子RNA具有自主复制能力。这是由于转染后直至复制的复制子RNA的量增加需要一定时间的缘故。
来自J6CF株的突变体HCV全基因组复制子RNA在培养细胞中具有产生HCV颗粒的能力。该HCV全基因组复制子RNA若被导入培养细胞中，则其在培养细胞内持续地复制，而且，复制的来自J6CF株的突变体HCV全基因组复制子RNA(或者包含HCV全基因组序列的本发明的核酸)被包装在由在细胞中表达的HCV结构蛋白(核心蛋白、E1蛋白、E2蛋白和p7蛋白)形成的病毒壳中，以HCV颗粒的形式释放到细胞外。
关于来自J6CF株的突变体HCV全基因组复制子RNA在培养细胞中产生HCV颗粒的能力，可以通过将该RNA导入细胞中进行培养，测定得到的培养上清中的HCV颗粒来进行评价。培养上清中的HCV颗粒的测定可以通过检测培养上清中的构成HCV颗粒的结构蛋白(例如核心蛋白、E1蛋白、E2蛋白或p7蛋白)来进行。培养上清中的结构蛋白的检测，例如可以使用抗核心蛋白、E1蛋白或E2蛋白的抗体来进行。
当在培养上清中测得的HCV颗粒的结构蛋白显示出经时性的增加倾向时，可以判定为该细胞产生HCV颗粒，并将HCV颗粒释放到细胞外。来自J6CF株的突变体HCV全基因组复制子RNA是否可以在导入其的培养细胞中产生HCV颗粒，这与该复制子RNA的核苷酸序列或其所编码的蛋白的氨基酸序列密切相关。因此，当可以确认HCV颗粒的产生时，可以判定为：导入到培养细胞中的来自J6CF株的突变体HCV全基因组复制子RNA在培养细胞中具有产生病毒颗粒的能力。
如此操作，由导入有来自J6CF株的突变体HCV全基因组复制子RNA(或包含HCV全基因组序列的本发明的核酸)的培养细胞产生并释放的病毒颗粒对新的培养细胞具有感染能力。本发明还提供这样的感染性HCV颗粒。该感染性HCV颗粒含有来自J6CF株的突变体HCV全基因组复制子RNA(或包含HCV全基因组序列的本发明的核酸)作为病毒基因组。
本发明的HCV颗粒的感染能力的评价可以如下进行：将导入来自J6CF株的突变体HCV全基因组复制子RNA并进行了培养的细胞的培养上清添加在培养细胞(例如Huh-7或其衍生株)中，一定时间后、例如48小时后，将该细胞用抗核心抗体进行免疫染色，计数感染细胞数，或者，使细胞提取物在SDS-聚丙烯酰胺凝胶中电泳，通过蛋白质印迹法检测核心蛋白，由此检测感染细胞，即可进行评价。
导入来自J6CF株的突变体HCV亚基因组复制子RNA或来自J6CF株的突变体HCV全基因组复制子RNA的细胞、或者感染在导入了该HCV复制子RNA的培养细胞中产生的感染性HCV颗粒的细胞，典型的是培养细胞。该培养细胞特别优选为允许HCV复制子RNA的自主复制或HCV颗粒的形成·感染的细胞(将这样的细胞称作HCV敏感性细胞)。
作为本发明中使用的HCV敏感性细胞，例如可以列举：Huh7细胞、HepG2细胞、IMY-N9细胞等来自肝脏的细胞、HeLa细胞、293细胞、或它们的衍生株。作为衍生株的例子，可以列举作为Huh7细胞的衍生株的Huh7.5细胞、Huh7.5.1细胞等。另外，作为衍生株，还可以列举使CD81基因和/或Claudin1基因在Huh7细胞、HepG2细胞、IMY-N9细胞、HeLa细胞或293细胞中表达的细胞(Lindenbach,B.D.等人,Science,2005年,第309卷,第623-626页；Evans,M.J.等人,Nature,2007年,第446卷,第801-805页；AkaZawa,D.等人,J.Virol.,2007年,第81卷,第5036-5045页)。其中，特别优选使用Huh7细胞或Huh7细胞的衍生株(Huh7.5细胞、Huh7.5.1细胞等)。需要说明的是，在本发明中，规定的细胞的“衍生株”是指由该细胞诱导的株。
使用导入了来自J6CF株的突变体HCV全基因组复制子RNA的细胞和感染了含有来自J6CF株的突变体HCV全基因组复制子RNA作为病毒基因组的HCV颗粒的细胞时，还可以通过培养生产大量的HCV颗粒。
若用由导入了来自J6CF株的突变体HCV全基因组复制子RNA的HCV敏感性细胞产生并释放到细胞外的HCV颗粒感染新的HCV敏感性细胞，则该HCV全基因组复制子RNA(基因组RNA)在细胞内被复制、包装，产生HCV颗粒，可以进一步反复进行该循环。用所产生的HCV颗粒感染细胞，这例如可以通过向HCV敏感性细胞中添加导入了上述HCV全基因组复制子RNA的细胞的培养上清来实施。
将来自J6CF株的突变体HCV全基因组复制子RNA(或者包含HCV全基因组序列的本发明的核酸)导入HCV敏感性细胞中而得到的HCV颗粒，可以在作为HCV疫苗的用途、或者作为用于制作抗HCV抗体的抗原的用途中使用。
具体而言，上述HCV颗粒可用于制造疫苗。在疫苗用途中，具体而言，还可以以上述无伤的HCV颗粒或其一部分或它们的处理物作为抗原而直接用作疫苗，但优选以利用该领域已知的方法将其减毒或灭活的HCV颗粒处理物的形式使用。病毒的灭活可以通过将福尔马林，β-丙内酯，戊二醛等灭活剂例如添加混合在病毒游离液中，使其与病毒反应而达成(Appaiahgari,M.B.＆Vrati,S.,Vaccine,2004年,第22卷,第3669-3675页)。或者，还可以通过照射UV来分解HCV的RNA，从而使之失去HCV的感染性(日本特开2009-5589)。
本发明的包含上述HCV颗粒的丙型肝炎病毒疫苗，更优选包含上述无伤的HCV颗粒或它们的减毒或灭活处理物作为抗原的疫苗。
上述疫苗可以制成溶液或悬浮液的任一种形式进行给药。或者，可以以适合溶解或悬浮在液体中的固态物(例如冷冻干燥调整物)的形态来制备，使其在临用前可以重新构成。这样的固态物或制备物可以乳浊、或者可以在脂质体中胶囊化。
在HCV颗粒等活性免疫原性成分中，经常可以混合药学上可接受的、适合于活性成分的赋形剂。在适当的赋形剂中，例如有水、生理盐水、葡萄糖、甘油、乙醇等或它们的混合物。
而且，如果需要，上述疫苗可以含有少量的助剂(例如加湿剂或乳化剂)、pH缓冲剂和/或提高疫苗效能的佐剂。
佐剂是该免疫系统的非特异性刺激因子。它们增强宿主对上述疫苗的免疫应答。因此，在优选的形态中，上述疫苗包含佐剂。佐剂的效能通过测定通过给予由HCV颗粒构成的疫苗而产生的抗体量即可确定。
对有效的佐剂的例子没有限定，包含下述佐剂：氢氧化铝、N-乙酰基-胞壁酰-L-苏氨酰-D-异谷氨酰胺(thr-MDP)、N-乙酰基-正-胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺(CGP11637、称作nor-MDP)、N-乙酰基胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺酰-L-丙氨酸-2-(1’-2’-二棕榈酰-sn-甘油基-3-羟基磷酰氧基)-乙胺(CGP19835A、称作MTP-PE)和RIBI。RIBI是在2%角鲨烯/Tween(注册商标)80乳剂中含有从细菌中提取的3种成分、即单磷脂A、海藻糖二霉菌酸酯和细胞壁骨架(HPL+TDM+CWS)的佐剂。
根据需要，可以在上述疫苗中加入具有佐剂活性的一种以上的化合物。作为该技术领域中公知的佐剂的具体例子，可以列举：弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂、维生素E、非离子嵌段聚合物、胞壁酰二肽、皂苷、矿物油、植物油和卡波普(Carbopol)。作为特别适合粘膜使用的佐剂，例如可以列举大肠杆菌(E.coli)易热性毒素(LT)或霍乱(Cholera)毒素(CT)。作为其他适当的佐剂，例如可以列举：氢氧化铝、磷酸铝或氧化铝、油性乳剂(例如Bayol(注册商标)或Marcol52(注册商标))、皂苷或维生素E增溶剂。
上述HCV疫苗通常进行胃肠外给药，例如通过皮下注射或肌肉内注射等注射进行给药。作为适合于其他给药方式的其他处方，可以列举栓剂和某种情况下的口服处方药。
在皮下、皮内、肌肉内、静脉内给药的注射剂中，作为上述HCV疫苗和药学上可接受的载体或稀释剂的具体例子，可以列举：稳定化剂、碳水化合物(例如山梨醇、甘露醇、淀粉、蔗糖、葡萄糖、葡聚糖)、白蛋白或酪蛋白等蛋白、牛血清或脱脂乳等含蛋白的物质、以及缓冲液(例如磷酸缓冲液)。
作为栓剂中使用的现有的粘合剂和载体，例如可以包含聚亚烷基二醇或三甘油。这样的栓剂可以由含有0.5%～50%的范围、优选1%～20%的范围的活性成分的混合物形成。口服处方药含有通常使用的赋形剂。作为该赋形剂，例如可以列举：药用级的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。
上述HCV疫苗制成溶液、悬浮液、片剂、丸剂、胶囊剂、缓释处方药或粉末剂的形态，含有10%～95%、优选25%～70%的活性成分(HCV颗粒或其一部分)。
上述HCV疫苗以适于给药剂型的方法、以及具有予防和/或治疗效果的量进行给药。关于应该给药的抗原量，通常每次给药为0.01μg～100,000μg的范围，但这取决于给药的患者、该患者的免疫系统中的抗体合成能力和所期望的防御程度。另外，还取决于口服、皮下、皮内、肌肉内、静脉内给药途径等给药途径。另外，上述HCV疫苗可以按照单独给药时间表或联合给药时间表进行给药。优选为联合给药时间表。按照联合给药时间表进行给药时，接种开始时进行1~10的分别给药，接着按照维持和/或强化免疫应答所必需的时间间隔进行给药，例如作为第2次给药，可在1~4个月后进行分别的给药。根据需要，几个月后可以继续进行给药。给药的方案也至少部分性地根据个体的必要性来决定，取决于医生的判断。
另外，上述HCV疫苗还有下述的使用方法：将上述HCV疫苗给予健康人，在健康人体内诱导对HCV的免疫应答，对于新的HCV感染则预防性使用。而且，还有下述的使用方法：将疫苗给予感染了HCV的患者，在生物体内诱导对HCV的强免疫反应，从而用作排除HCV的治疗性疫苗。
本发明还提供上述HCV疫苗。该HCV疫苗可用于HCV感染的预防和丙型肝炎的治疗。
而且，上述HCV颗粒作为用于制作抗HCV抗体的抗原是有效的。通过将上述HCV颗粒给予哺乳类或鸟类，可以制作抗体。作为哺乳类动物，可以列举小鼠、大鼠、兔、山羊、绵羊、马、牛、豚鼠、单峰驼、双峰驼、大洋驼等。单峰驼、双峰驼和大洋驼适合制作仅由H链构成的抗体。作为鸟类动物，可以列举鸡、鹅、鸵鸟等。可以采集给予了上述HCV颗粒的动物的血清，按照已知的方法获得抗体。
本发明还提供这些抗HCV抗体。特别优选的抗HCV抗体可以用作能够灭活HCV的中和抗体。
使用给予上述HCV颗粒并进行了免疫的动物的细胞，可以制作产生单克隆抗体产生细胞的杂交瘤。杂交瘤的制造方法众所周知，可以采用Antibodies:ALaboratoryManual(ColdSpringHarborLaboratory,1988年)中记载的方法。
单克隆抗体产生细胞可以通过细胞融合来制作，还可以利用通过导入癌基因DNA或感染Epstein-Barr病毒使B淋巴细胞不死化的其他方法来制作。
通过上述方法得到的单克隆抗体或多克隆抗体对HCV的诊断或丙型肝炎的治疗、预防有效。
使用上述HCV颗粒作为抗原而制作的抗体，其作为药物可以和药学上可接受的溶解剂、添加剂、稳定剂、缓冲剂等同时给药。给药途径可以是任一种给药途径，但优选为皮下、皮内、肌肉内给药，更优选为静脉内给药。
导入了本发明的来自J6CF株的突变体HCV亚基因组复制子RNA或来自J6CF株的突变体HCV全基因组复制子RNA(或包含HCV亚基因组序列或全基因组序列的本发明的核酸)的细胞、或包含来自J6CF株的突变体HCV全基因组复制子RNA(或包含HCV全基因组序列的本发明的核酸)作为病毒基因组的HCV颗粒可以适合用于抑制HCV感染的中和抗体或抑制HCV的感染或复制的化合物等物质的筛选用途。例如可以列举下述方法：在受检物质的存在下或不存在下，培养复制导入了上述复制子RNA的复制子RNA的细胞、或者培养产生导入了上述全基因组复制子RNA的HCV颗粒的细胞、或者培养上述HCV颗粒和HCV敏感性细胞、或者培养感染了上述HCV颗粒的HCV感染细胞，检测所得培养物中的HCV复制子RNA或HCV颗粒，评价受检物质的影响。这里，培养物包括培养上清、以及细胞或细胞破碎物。检测优选定量细胞或细胞破碎物中的HCV复制子RNA或培养上清中的HCV颗粒的量。在受检物质的存在下培养物中不存在HCV复制子RNA和HCV颗粒、或者与在受检物质的不存在下相比少时，可以评价为所使用的受检物质可以抑制HCV的感染或复制。
在本发明中，例如，在受检物质的存在下和不存在下，同时培养本发明的HCV颗粒和HCV敏感性细胞，检测所得培养物中的HCV颗粒或HCV复制子RNA，判定该受检物质是否抑制HCV颗粒的产生(包括感染·形成·释放)或HCV复制子RNA的复制，从而可以筛选抗HCV物质。
例如，本发明提供抗丙型肝炎病毒物质的筛选方法，该方法具备下述步骤：(i)在受检物质的存在下和不存在下，培养导入了本发明的复制子RNA的细胞的步骤；(ii)定量步骤(i)中得到的培养物中的复制子RNA(或HCV颗粒)的量的步骤；以及(iii)将在受检物质的存在下测定的复制子RNA(或HCV颗粒)量与在受检物质的不存在下测定的复制子RNA(或HCV颗粒)进行比较，评价受检物质的复制子RNA的复制抑制活性(或HCV颗粒产生抑制活性)的步骤。
本发明的筛选方法的一实施方式涉及筛选抗丙型肝炎病毒物质的方法，该方法具备下述步骤：
培养步骤，在受检物质的存在下和不存在下，培养导入了来自J6CF株的突变体HCV亚基因组复制子RNA或来自J6CF株的突变体HCV全基因组复制子RNA(或者包含HCV亚基因组序列或全基因组序列的本发明的核酸)的细胞或含有来自J6CF株的突变体HCV全基因组复制子RNA(或包含HCV全基因组序列的本发明的核酸)作为病毒基因组的HCV颗粒与HCV敏感性细胞的混合物；
定量步骤，定量上述培养步骤中在培养物中得到的该亚基因组复制子RNA、该全基因组复制子RNA或HCV颗粒的量；以及
评价步骤，上述定量步骤的结果，当在受检物质的存在下定量的亚基因组复制子RNA、全基因组复制子RNA或HCV颗粒的量分别少于在受检物质的不存在下定量的亚基因组复制子RNA、全基因组复制子RNA或HCV颗粒的量时，评价为上述受检物质具有抗丙型肝炎病毒活性。
培养物中的HCV复制子RNA可以通过基于HCV复制子RNA中的外来基因的功能、即通过该基因的表达而表现出的功能的测定来进行检测。例如，当外来基因为酶时，通过计测其酶活性，可以检测HCV复制子RNA。另外，作为其他方法，通过在定量的RT-PCR中定量培养物中的复制的RNA的量，也可以检测HCV复制子RNA。
培养物中的HCV颗粒可以使用对抗构成释放到培养上清中的HCV颗粒的蛋白(例如核心蛋白、E1蛋白或E2蛋白)的抗体来进行检测。关于培养物中的HCV颗粒，还可以进行使用对抗非结构蛋白的抗体的免疫染色，以检测细胞中的非结构蛋白的存在。还可以通过利用使用了特异性引物的RT-PCR法扩增培养上清中的HCV颗粒所含有的HCV复制子RNA并进行检测，间接地检测HCV颗粒的存在。
在抗HCV物质的筛选中，还可以有效利用本发明的在具有上述突变的J6CF株突变体基因组或J6CF/JFH-1嵌合突变体基因组中插入了外来基因和IRES序列的HCV全基因组复制子RNA(由5’UTR、核心蛋白编码序列的5’末端的36个核苷酸、萤光素酶基因、EMCVIRES序列、核心蛋白编码序列、E1蛋白编码序列、E2蛋白编码序列、p7蛋白编码序列、NS2蛋白编码序列、NS3蛋白编码序列、NS4A蛋白编码序列、NS4B蛋白编码序列、NS5A蛋白编码序列、NS5B蛋白编码序列和3’UTR按照从5’到3’的方向依次连接的RNA构成)。需要说明的是，连接各区时，连接位点中可以包含限制酶切位点等添加序列。将该HCV全基因组复制子RNA导入Huh7细胞中，得到HCV颗粒，用该HCV颗粒感染HCV敏感性细胞，同时添加受检物质，48～72小时后测定萤光素酶的活性。与未添加受检物质时(受检物质不存在下)相比显示出抑制萤光素酶活性的效果的受检物质，可以判定为其具有抑制HCV感染的作用。
同样，将由SEQIDNO:1或SEQIDNO:4所示核酸构成的本发明的来自J6CF株的突变体HCV亚基因组复制子RNA导入Huh7细胞中，接着添加受检物质，在48～72小时后测定萤光素酶的活性。与未添加受检物质相比能够抑制萤光素酶活性的受检物质，可以判定为其具有抑制HCV亚基因组复制子RNA的复制的作用。
通过上述筛选方法得到的抗HCV物质优选为可以抑制病毒感染或复制的物质。
实施例
以下，列举实施例，以更具体地说明本发明。但是，这些实施例是用于进行说明，并不限制本发明的技术范围。
首先，本发明人等制作公知文献(Murayama等人,PLoSPathogens.,2010年,第6卷,e1000885)记载的下述的RNA：在将J6CF株的NS3解旋酶区、一部分NS5B蛋白区和3’非翻译区取代成JFH-1株的相应区而制作的HCV全基因组复制子RNA(FGR-J6/N3H+5BSLX-JFH1)的结构中将来自JFH-1株的NS3解旋酶区恢复成来自J6CF株的序列的RNA、即将J6CF株的NS5B的一部分和3’非翻译区取代成JFH-1株的相应区的HCV全基因组复制子RNA(FGR-J6/5BSLX-JFH1)，将其导入培养细胞中。虽然FGR-J6/5BSLX-JFH1不具有自主复制能力，但反复继代，得到获得了高的自主复制能力的突变体，发现在NS4A蛋白区中存在1处显著提高复制子RNA的自主复制能力的突变。该突变是J6CF株的前体蛋白(HCV前体多聚蛋白)的氨基酸序列(SEQIDNO:30)上的第1680位的丙氨酸取代成谷氨酸的突变。而且，向野生型J6CF株的基因组中导入该1处突变(NS4A蛋白区中)和公知文献(Murayama等人,PLoSPathogens.,2010年,第6卷,e1000885)记载的4处突变(NS5B蛋白区和3’非翻译区中)，共计形成5处突变，由此还成功制作了具有高的自主复制能力、并且具有感染性HCV颗粒产生能力的来自J6CF株的全基因组复制子RNA。以下，进行更具体的说明。
(实施例1)J6CF/JFH-1嵌合HCV亚基因组复制子RNA和HCV全基因组复制子RNA(全长HCV基因组RNA)表达载体的构建
在本实施例中，构建在后述实施例中在突变体复制子的制作中使用的、用于分别合成来自J6CF株和JFH-1株的基因组序列的嵌合型(J6CF/JFH-1嵌合)HCV亚基因组复制子RNA(J6CF/JFH-1嵌合HCV亚基因组复制子RNA)和HCV全基因组复制子RNA(J6CF/JFH-1嵌合HCV全基因组复制子RNA)的表达载体。
需要说明的是，以下提到的核苷酸编号是指以各HCV株的全长基因组的5’末端的第1核苷酸作为第1位时的核苷酸编号。另外，关于用限制酶消化而得到的DNA片段，以核苷酸编号表示其在原始DNA序列中的位置时，以该限制酶的识别序列的起始位置的核苷酸编号表示。例如，用ClaI和EcoT22I消化JFH-1株的全长基因组时，ClaI的识别序列从JFH-1株的全长基因组的核苷酸编号第3929位开始，在第3930位和第3931位的核苷酸之间被ClaI切断，另外，EcoT22I的识别序列从JFH-1株的全长基因组的核苷酸编号第5293位开始，在第5297位和第5298位的核苷酸之间被EcoT22I切断，但是，用ClaI和EcoT22I消化而得到的DNA片段记载成“是(相当于)JFH-1株的全长基因组的核苷酸编号第3929位～第5293位的核苷酸序列”。
pJFH1是公知文献(Wakita,T.等人,Nat.Med.,2005年,第11卷,第791-796页)记载的质粒DNA。pJFH1是通过将HCVJFH-1株的全长基因组RNA逆转录得到的基因组cDNA(GenBank检索号AB047639)克隆到插入pUC19质粒中的T7RNA启动子序列的下游而制得的。
pJ6CF是由公知文献(Yanagi,M.等人,Virology,1999年,第262卷,第250-263页)记载的质粒制作的质粒DNA。pJ6CF是将HCVJ6CF株的全长基因组RNA进行逆转录而得到的基因组cDNA(GenBank检索号AF177036)克隆到pUC19质粒的T7RNA启动子序列的下游而制得的。
作为HCV亚基因组复制子RNA表达载体的pSGR-J6/N3H+5BSLX-JFH1/Luc(图1C)是公知文献(Murayama,A.等人,PLoSPathogens.,2010年,第6卷,e1000885)中也记载的质粒DNA。在pSGR-J6/N3H+5BSLX-JFH1/Luc的制作中，利用经ClaI和EcoT22I限制消化pJFH1而得到的DNA片段(是JFH-1株的全长基因组的核苷酸编号第3929位～第5293位的核苷酸序列，相当于一部分NS3蛋白)，取代公知文献(Murayama,A.等人,J.Virology,2007年,第81卷,第8030-8040页)记载的质粒pSGR-J6CF/Luc(包含核心蛋白的5’末端的36个核苷酸、萤光素酶基因和EMCVIRES，其编码J6CF株的亚基因组复制子RNA；图1B)的相同区的序列，再用JFH-1株的全长基因组(GenBank检索号AB047639)的核苷酸编号第9212位～第9678位(JFH-1株基因组的3’末端)的核苷酸序列取代相当于该质粒的J6CF株的全长基因组(SEQIDNO:29)的核苷酸编号第9212位～第9711位(J6CF株基因组的3’末端)的核苷酸序列。
具体的pSGR-J6/N3H+5BSLX-JFH1/Luc(图1C)的制作方法如下。首先，通过PCR向pSGR-J6CF/Luc中导入ClaI(识别序列从J6CF株的全长基因组的核苷酸编号第3929位开始，通过ClaI在第3930位和第3931位的核苷酸间切断)和EcoT22I(识别序列从J6CF株的全长基因组的核苷酸编号第5293位开始，通过EcoT22I在第5297位和第5298位的核苷酸间切断)的限制酶切位点，之后，将其用ClaI和EcoT22I切断。将用ClaI和EcoT22I消化pJFH1而得到的DNA片段(JFH-1株的全长基因组的核苷酸编号第3929位～第5293位的核苷酸序列)插入到上述pSGR-J6CF/Luc切断片段中，从而取代ClaI～EcoT22I的区。其结果，J6CF株的NS3解旋酶区(J6CF株的全长基因组的核苷酸编号第3929位～第5293位)被JFH-1株的相同区的序列取代(图1C中的“N3H”区)。将如此操作而得到的质粒DNA称作pSGR-J6/N3H-JFH1/Luc。
接下来，作为第一PCR-1，以pJ6CF为模板，使用正义引物8680S-2a(5’-CCTTCACGGAGGCTATGACCA-3’(SEQIDNO:7))和反义引物9191R-2a(5’-CCACGGGAGATGAGGGACGC-3’(SEQIDNO:8))进行PCR。另外，作为第一PCR-2，以pJFH1为模板，使用正义引物9191S-2a(5’-GCGTCCCTCATCTCCCGTGG-3’(SEQIDNO:9))和反义引物9440R-IH(5’-GTGTACCTAGTGTGTGCCGCTCTA-3’(SEQIDNO:10))进行PCR。而且，作为第二PCR，以通过上述第一PCR-1和第一PCR-2扩增的两种扩增片段的混合物为模板，使用正义引物8680S-2a(SEQIDNO:7)和反义引物9440R-IH(SEQIDNO:10)进行PCR。将得到的由J6CF株和JFH-1株的嵌合构成的扩增产物经SfiI和AscI消化而得到的DNA片段(相当于J6CF株的全长基因组的核苷酸编号第8794位～第9211位的区和JFH-1株的全长基因组的核苷酸编号第9212位～第9291位的区)和用AscI和XbaI消化pJFH1而得到的DNA片段(相当于JFH-1株的全长基因组的核苷酸编号第9289位～3’末端)插入到上述的pSGR-J6/N3H-JFH1/Luc的SfiI-XbaI位点(相当于J6CF株的全长基因组的核苷酸编号第8789位～3’末端)，从而将质粒中的编码J6CF株的NS5B蛋白的第516位～第591位的氨基酸序列的区和3’非翻译区(3’UTR)的序列取代成来自JFH-1株的序列(图1C中的“5BSLX”区)。如此操作而得到的质粒DNA是pSGR-J6/N3H+5BSLX-JFH1/Luc(图1C)。即，pSGR-J6/N3H+5BSLX-JFH1/Luc是将pSGR-J6CF/Luc的NS3解旋酶区(J6CF株的全长基因组的核苷酸编号第3929位～第5293位)和由编码NS5B蛋白的第516位～第591位的氨基酸序列的区和3’非翻译区构成的5BSLX区取代成来自JFH-1株的核苷酸序列(JFH-1株的全长基因组的核苷酸编号第3931位～第5297位和第9212位～第9678位)的产物。
另外，还制作质粒pSGR-J6/5BSLX-JFH1/Luc(图1D)。pSGR-J6/5BSLX-JFH1/Luc是将pSGR-J6CF/Luc的相当于J6CF株的全长基因组的核苷酸编号第9212位～第9711位(J6CF株的3’末端)的核苷酸序列用相当于JFH-1株的全长基因组的核苷酸编号第9212位～第9678位(JFH-1株的3’末端)的核苷酸序列取代而得到的产物。
具体的pSGR-J6/5BSLX-JFH1/Luc(图1D)的制作方法如下。将在使用pSGR-J6CF/Luc的上述的pSGR-J6/N3H+5BSLX-JFH1/Luc的制作过程中制备的上述第二PCR的扩增产物的SfiI-AscI切断片段(相当于J6CF株的全长基因组的核苷酸编号第8789位～第9211位的区和JFH-1株的全长基因组的核苷酸编号第9212位～第9289位的区)和用AscI和XbaI消化pJFH1而得到的DNA片段(JFH-1株的全长基因组的核苷酸编号第9289位～3’末端)插入到pSGR-J6CF/Luc的SfiI-XbaI位点(J6CF株的全长基因组的核苷酸编号第8789位～3’末端)，从而将质粒中的编码J6CF株的NS5B蛋白的第516位～第591位的氨基酸序列的区和3’非翻译区(3’UTR)取代成来自JFH1株的相同区的序列(图1D中的“5BSLX”区)。如此操作而得到的质粒DNA是pSGR-J6/5BSLX-JFH1/Luc(图1D)。即，pSGR-J6/5BSLX-JFH1/Luc是将由pSGR-J6CF/Luc的编码NS5B蛋白的第516位～第591位的氨基酸序列的区和3’非翻译区构成的5BSLX取代成来自JFH-1株的核苷酸序列(JFH-1株的全长基因组的核苷酸编号第9212位～第9678位)而得到的产物。
这些J6CF/JFH-1嵌合HCV亚基因组复制子RNA表达载体的结构汇总表示在图1中。图中，“T7”是指T7启动子。T7启动子是使用T7RNA聚合酶由各表达载体转录HCV亚基因组复制子RNA所必需的序列元件。“Luc”表示萤光素酶基因，“EMCVIRES”表示脑心肌炎病毒的内部核糖体结合位点。“NS3”表示NS3蛋白编码区，“4A”表述NS4A蛋白编码区，“4B”表示NS4B蛋白编码区，“NS5A”表示NS5A蛋白编码区，“NS5B”表示NS5B蛋白编码区。另外，图中的“EcoRI”、“AgeI”、“ClaI”、“EcoT22I”、“BsrGI”、“StuI”和“XbaI”表示限制酶切位点。
需要说明的是，J6CF株和JFH-1株的NS5B蛋白编码区均相当于J6CF株和JFH-1株的全长基因组的核苷酸编号第7667位～第9442位(包含终止密码子)的核苷酸序列，编码由591个氨基酸残基构成的NS5B蛋白。J6CF株的全长基因组的核苷酸编号第7667位～第9211位的区编码J6CF株的NS5B蛋白的第1位～第515位的氨基酸序列。JFH-1株的全长基因组的核苷酸编号第9212位～第9442位(包含终止密码子)的区编码JFH-1株的NS5B蛋白的第516位～第591位的氨基酸序列。J6CF株的NS5B蛋白整体的氨基酸序列见SEQIDNO:27，JFH-1株的NS5B蛋白整体的氨基酸序列见SEQIDNO:28。
接着，使用pJ6CF代替pSGR-J6CF/Luc，利用与上述相同的方法，将NS3解旋酶区(图2C中的“N3H”区)(J6CF株的全长基因组的核苷酸编号第3929位～第5293位的区)和5BSLX区(图2中的“5BSLX”区)取代成来自JFH-1株的相同区的序列(JFH-1株的全长基因组的核苷酸编号第9212～第9678位的区)，从而制作作为HCV全基因组复制子RNA表达载体的pFGR-J6/N3H+5BSLX-JFH1(图2C)。
另外，使用pJ6CF(图2B)代替pSGR-J6CF/Luc，利用与上述相同的方法，将5BSLX区(JFH-1株的全长基因组的核苷酸编号第9212～第9678位的区)取代成来自JFH-1株的相同区的序列，从而制作pFGR-J6/5BSLX-JFH1(图2D)。
而且，将pJ6CF的BsrGI位点(识别序列从J6CF株的全长基因组的核苷酸编号第7781位开始，被BsrGI在第7781位和第7782位的核苷酸间切断)～StuI位点(识别序列从J6CF株的全长基因组的核苷酸编号第9415位开始，被StuI在第9417位和第9418位的核苷酸间切断)的序列取代成pJFH1的相同区的序列，从而制作质粒载体pFGR-J6/5B-JFH1(图2E)。
具体的pFGR-J6/5B-JFH1的具体的制作方法如下。首先，在从J6CF株的全长基因组的核苷酸编号第7781位开始的位置，通过PCR将BsrGI的限制酶切位点导入pJ6CF中。接下来，用BsrGI和StuI消化导入有BsrGI限制酶切位点的pJ6CF。使用在BsrGI位点(识别序列从JFH-1株的全长基因组的核苷酸编号第7781位开始，被BsrGI在第7781位和第7782位的核苷酸间切断)和StuI位点(识别序列从JFH-1株的全长基因组的核苷酸编号第9415位开始，被StuI在第9417位和9418位的核苷酸间切断)消化pJFH1的DNA片段(相当于JFH-1株的全长基因组的核苷酸编号第7782位～第9417位的NS5B片段)，取代上述的pJ6CF的BsrGI-StuI切断片段(相当于J6CF株的全长基因组的核苷酸编号第7782位～第9417位)。如此操作得到的质粒DNA是pFGR-J6/5B-JFH1。
将这些J6CF/JFH-1嵌合HCV全基因组复制子RNA表达载体汇总表示在图2中。图中，“T7”是指T7启动子。“C”表示核心蛋白编码区、“E1”表示E1蛋白编码区、“E2”表示E2蛋白编码区、“p7”表示p7蛋白编码区、“NS3”表示NS3蛋白编码区、“4A”表示NS4A蛋白编码区、“4B”表示NS4B蛋白编码区、“NS5A”表示NS5A蛋白编码区、以及“NS5B”表示NS5B蛋白编码区。另外，图中的“EcoRI”、“ClaI”、“EcoT22I”、“BsrGI”、“StuI”和“XbaI”表示限制酶切位点。
(实施例2)HCV亚基因组复制子RNA和HCV全基因组复制子RNA(全长HCV基因组RNA)的制作
用限制酶XbaI分别切断公知文献(Kato,T.等人,JCMNov.,2005年,第43卷,第5679-5684页)记载的表达载体pSGR-JFH1/Luc(包含萤光素酶基因和EMCVIRES，编码JFH-1株的亚基因组复制子RNA；图1A)和实施例1中公开的上述表达载体pSGR-J6CF/Luc、pSGR-J6/N3H+5BSLX-JFH1/Luc和pSGR-J6/5BSLX-JFH1/Luc。
然后，在各10～20μg的上述XbaI切断DNA片段中加入20U绿豆核酸酶(总反应液量为50μL)，在30℃下培养30分钟。绿豆核酸酶是催化选择性地分解双链DNA中的单链部分使其变得平滑的反应的酶。通常，直接使用上述XbaI切断DNA片段作为模板DNA，利用RNA聚合酶进行RNA转录时，合成在3’末端过剩地添加有作为XbaI的识别序列的一部分的CUAG这4个核苷酸的复制子RNA。因此，在本实施例中，通过用绿豆核酸酶处理XbaI切断DNA片段，从XbaI切断DNA片段中除去CTAG这4个核苷酸。
之后，对于包含绿豆核酸酶处理后的XbaI切断DNA片段的溶液，通过按照常规方法进行的蛋白除去处理，纯化除去了CTAG这4个核苷酸的XbaI切断DNA片段，将其作为之后的反应中使用的模板DNA。使用作为RNA转录试剂盒的Ambion公司的MEGAscript(注册商标)，根据制造商的使用说明书，由该模板DNA制备20μL包含0.5～1.0μg模板DNA的RNA转录反应液，使其在37℃下反应3小时～16小时。
RNA合成结束后，向反应溶液中添加2UDNaseI，在37℃下反应15分钟，之后再使用酸性苯酚进行RNA提取，除去模板DNA。如此操作，合成HCV亚基因组复制子RNA。需要说明的是，由表达载体pSGR-JFH1/Luc、pSGR-J6CF/Luc、pSGR-J6/N3H+5BSLX-JFH1/Luc和pSGR-J6/5BSLX-JFH1/Luc合成的HCV亚基因组复制子RNA分别称作SGR-JFH1/Luc、SGR-J6CF/Luc、SGR-J6/N3H+5BSLX-JFH1/Luc和SGR-J6/5BSLX-JFH1/Luc。
关于HCV全基因组复制子RNA的合成，使用实施例1中构建的表达载体pFGR-J6/N3H+5BSLX-JFH1、pFGR-J6/5BSLX-JFH1和pFGR-J6/5B-JFH1，按照与上述HCV亚基因组复制子RNA的合成相同的方法进行。需要说明的是，由表达载体pFGR-J6/N3H+5BSLX-JFH1、pFGR-J6/5BSLX-JFH1和pFGR-J6/5B-JFH1合成的HCV全基因组复制子RNA分别称作FGR-J6/N3H+5BSLX-JFH1、FGR-J6/5BSLX-JFH1和FGR-J6/5B-JFH1。
(实施例3)向细胞中导入HCV亚基因组复制子RNA和HCV全基因组复制子RNA(全长HCV基因组RNA)
利用电穿孔法(vandenHoffMJ等人,NucleicAcidsRes.,1992年,第20卷,第2902页)，将实施例2中制作的HCV亚基因组复制子RNA或HCV全基因组复制子RNA(HCV复制子RNA)分别导入(转染)到Huh7.5.1细胞(ZhongJ.等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,2005年,第102卷,第9294-9299页)中。具体如下所示。
将进行了胰蛋白酶处理的Huh7.5.1细胞用Opti-MEMI培养基(Invitrogen公司)清洗数次，之后，悬浮在400μL的Cytomix溶液(120mM的KCl、0.15mM的CaCl2、10mM的K2HPO4/KH2PO4、25mM的Hepes、2mM的EGTA、5mM的MgCl2、20mM的ATP、50mM的谷胱甘肽)中，制成3×106细胞/mL的悬浮液。将细胞悬浮液转移到4mm的透明小容器中，之后向其中添加5μgHCV亚基因组复制子RNA或HCV全基因组复制子RNA，使用GenePulserII(Bio-Rad公司)，在260V、950μF的条件下进行脉冲，进行向Huh7.5.1细胞中的HCV复制子RNA的电穿孔(转染)。将导入了HCV复制子RNA的细胞悬浮在DMEM培养基中，接种在12孔板中。
(实施例4)导入了HCV亚基因组复制子RNA的细胞内的RNA复制
将在实施例3中导入了HCV亚基因组复制子RNA的Huh7.5.1细胞接种在12孔板中，在转染4小时后、24小时后和48小时后回收细胞。回收的细胞用250μL溶解缓冲液被动裂解试剂(Promega公司)溶解，离心，以得到的上清作为样品。使用萤光素酶测定系统(Promega公司)和光度计LB9507(EG＆GBerthold公司)，测定样品中的萤光素酶活性。
其结果见图3A。图的横轴表示转染后的时间，纵轴表示以转染4小时后的萤光素酶活性值为基准时各时刻的萤光素酶活性的相对值。图3A表示HCV亚基因组复制子RNA的RNA复制水平随时间的变化。如图3A所示，在导入了HCV亚基因组复制子RNASGR-JFH1/Luc和SGR-J6/N3H+5BSLX-JFH1/Luc的细胞中，萤光素酶活性随时间上升，由此确认：SGR-JFH1/Luc和SGR-J6/N3H+5BSLX-JFH1/Luc进行了自主复制。认为导入到SGR-J6/N3H+5BSLX-JFH1/Luc中的来自JFH-1株的N3H序列赋予了来自J6CF株的亚基因组复制子RNA自主复制能力。
(实施例5)由导入了HCV全基因组复制子RNA(全长HCV基因组RNA)的细胞产生病毒(病毒颗粒)
将在实施例3中导入了HCV全基因组复制子RNA的Huh7.5.1细胞接种在12孔板中进行培养，在转染1天后、2天后和3天后回收培养上清。回收的培养上清通过0.45μm的滤器(Millipore公司)除去杂质，作为HCV核心蛋白的测定的样品。HCV核心蛋白的测定使用HCV抗原ELISA试验试剂盒(オーソ·クリニカル·ダイアグノスティックス社)来进行。
其测定结果见图3B。图3B的横轴表示转染后的天数(1天后、2天后、3天后)，纵轴表示培养上清中的核心蛋白量(fmol/L)。图3B暗示由导入了HCV全基因组复制子RNA的培养细胞产生的培养上清中的病毒水平。如图3B所示，导入了FGR-J6/N3H+5BSLX-JFH1的细胞的培养上清中的核心蛋白量随时间而增加，而导入了FGR-J6/5BSLX-JFH1的细胞的培养上清中的核心蛋白量没有增加。因此，显示出导入了FGR-J6/N3H+5BSLX-JFH1的细胞产生了病毒。认为导入到FGR-J6/N3H+5BSLX-JFH1中的来自JFH-1株的N3H序列赋予了来自J6CF株的全基因组复制子RNA病毒产生能力。
(实施例6)通过导入了J6CF/JFH-1嵌合HCV全基因组复制子RNA(全长HCV基因组RNA)的细胞的继代培养获得突变体
按照与实施例3相同的方法，将作为J6CF/JFH-1嵌合HCV全基因组复制子RNA的FGR-J6/5BSLX-JFH1和FGR-J6/5B-JFH1导入(转染)到Huh7.5.1细胞中。将导入了HCV全基因组复制子RNA的细胞以3～5天的间隔进行继代，同时进行培养，监测在此期间的培养上清中的HCV核心蛋白量。需要说明的是，HCV核心蛋白的测定按照与实施例5相同的方法来实施。
其结果见图4。图4的横轴表示转染后的天数，纵轴表示培养上清中的核心蛋白量(fmol/L)。如图4所示，就导入了FGR-J6/5BSLX-JFH1的细胞而言，从经过1个月起培养上清中的核心蛋白量增加，确认到病毒的产生，而关于FGR-J6/5B-JFH1，则没有确认到病毒的产生。
接下来，使用ISOGEN-LS(ニッポンジーン公司)，从培养上清中的核心蛋白量达到最大的导入了FGR-J6/5BSLX-JFH1的细胞的第49天的培养上清(图4)中提取病毒基因组RNA。以该病毒基因组RNA为模板，使用逆转录酶SuperscriptIIIReverseTranscriptase(Invitrogen公司)来合成cDNA，进行测序。
其结果，在FGR-J6/5BSLX-JFH1的NS4A蛋白编码区中，成功鉴定了病毒基因组突变体，该突变体具有发生J6CF株的前体蛋白(多聚蛋白)的相当于第1680位的氨基酸丙氨酸(A)被取代成谷氨酸(E)的突变(A1680E)的核苷酸突变(由编码丙氨酸的密码子“GCG”的第2核苷酸的胞嘧啶突变成腺嘌呤的突变)。
(实施例7)J6CF/JFH-1嵌合突变体HCV亚基因组复制子RNA和嵌合突变体HCV全基因组复制子RNA(全长HCV基因组RNA)的制作
作为J6CF/JFH-1嵌合突变体HCV复制子RNA表达载体，制作向表达载体pSGR-J6/5BSLX-JFH1/Luc和pFGR-J6/5BSLX-JFH1中导入了实施例6中鉴定的NS4A蛋白区中的氨基酸取代(突变)A1680E的核酸构建物。将向pSGR-J6/5BSLX-JFH1/Luc中导入了引起A1680E取代的核苷酸突变的表达载体称作pSGR-J6/5BSLX-JFH1+4Amut/Luc，将向pFGR-J6/5BSLX-JFH1中导入了引起A1680E取代的核苷酸突变的表达载体称作pFGR-J6/5BSLX-JFH1+4Amut。这里，“4Amut”是指引起氨基酸取代A1680E的突变。
具体而言，如下操作，将4Amut导入各表达载体中。首先，作为第一PCR-1，以pJ6CF为模板，使用正义引物3471S-2a(5’-TGGGCACCATAGTGGTGAG-3’(SEQIDNO:11))和反义引物A1680Eas(5’-CACCCGGTCtCCAGGCAATACGCGGCGACG-3’(SEQIDNO:12))(引物序列中的小文字的核苷酸表示导入的核苷酸突变)进行PCR。接下来，作为第一PCR-2，以pJ6CF为模板，使用正义引物A1680Es(5’-ATTGCCTGGaGACCGGGTGTGTTTGCATCA-3’(SEQIDNO:13))(引物序列中的小文字的核苷酸表示导入的核苷酸突变)和反义引物6542R-IH(5’-CGCACTGGCCCTCCGTGTA-3’(SEQIDNO:14))进行PCR。而且，作为第二PCR，以通过上述第一PCR-1和第一PCR-2扩增的两种扩增片段的混合物为模板，使用正义引物3471S-2a(SEQIDNO:11)和反义引物6542R-IH(SEQIDNO:14)进行PCR。利用通过限制酶BbvCI和EcoRI消化所得的扩增产物而得到的DNA片段(相当于J6CF株的全长基因组的核苷酸编号第3662位～第6006位的区)，取代pSGR-J6/5BSLX-JFH1/Luc和pFGR-J6/5BSLX-JFH1中的BbvCI～EcoRI的区(J6CF株的全长基因组的核苷酸编号第3662位～第6006位的区)，从而分别制作pSGR-J6/5BSLX-JFH1+4Amut/Luc和pFGR-J6/5BSLX-JFH1+4Amut。
已制作的这些突变体复制子表达载体的结构见图5C和D。图中的“A1680E”示意性地表示导入有引起下述取代的突变(4Amut)的位置：J6CF株的前体蛋白(多聚蛋白)的相当于第1680位的丙氨酸(A)取代成谷氨酸(E)的取代(A1680E)。需要说明的是，图中的其他记号是指与图1和图2相同的记号。
按照与实施例2相同的方法，进一步由这些J6CF/JFH-1嵌合突变体HCV亚基因组复制子RNA表达载体pSGR-J6/5BSLX-JFH1+4Amut/Luc和J6CF/JFH-1嵌合突变体HCV全基因组复制子RNA表达载体pFGR-J6/5BSLX-JFH1+4Amut合成各HCV复制子RNA。
由表达载体pSGR-J6/5BSLX-JFH1+4Amut/Luc和pFGR-J6/5BSLX-JFH1+4Amut合成的各HCV复制子RNA分别称作SGR-J6/5BSLX-JFH1+4Amut/Luc和FGR-J6/5BSLX-JFH1+4Amut。它们是来自J6CF株和JFH-1株的基因组的嵌合基因组，是具有A1680E突变的嵌合突变体复制子RNA。
SEQIDNO:1表示作为J6CF/JFH-1嵌合突变体HCV亚基因组复制子RNA的SGR-J6/5BSLX-JFH1+4Amut/Luc的核苷酸序列。SEQIDNO:2表示作为J6CF/JFH-1嵌合突变体HCV全基因组复制子RNA的FGR-J6/5BSLX-JFH1+4Amut的核苷酸序列，SEQIDNO:3表示由该核苷酸序列编码的HCV前体蛋白全长的氨基酸序列。需要说明的是，SEQIDNO:1和SEQIDNO:2所示的核苷酸序列虽然作为DNA序列来记载，但其是该序列中的胸腺嘧啶(t)理解成尿嘧啶(u)的序列所对应的RNA序列，因此，复制子RNA的序列也可以根据SEQIDNO:4和SEQIDNO:5来特定。
(实施例8)导入了J6CF/JFH-1嵌合突变体HCV亚基因组复制子RNA的细胞内的RNA复制
按照与实施例3相同的方法，将5μg实施例2和实施例7中制作的HCV亚基因组复制子RNA导入(转染)到Huh7.5.1细胞中。将导入了HCV亚基因组复制子RNA的细胞接种在12孔板中培养，在转染4小时后、24小时后和48小时后回收细胞。回收的细胞用250μL的溶解缓冲液被动裂解试剂(Promega公司)溶解，离心，以得到的上清作为样品。使用萤光素酶测定系统(Promega公司)和光度计LB9507(EG＆GBerthold公司)，测定样品中的萤光素酶活性。
其结果见图6。图的横轴表示转染后的时间，纵轴表示以转染4小时后的萤光素酶活性值为基准时各时刻的萤光素酶活性的相对值。如图6所示，导入了作为J6CF/JFH-1嵌合突变体HCV亚基因组复制子RNA的SGR-J6/5BSLX-JFH1+4Amut/Luc的细胞，其萤光素酶活性随时间而上升。因此，显示出SGR-J6/5BSLX-JFH1+4Amut/Luc进行了自主复制。显示出：在使J6CF的基因组在细胞内高效率地进行复制方面，NS4A蛋白区中的A1680E突变的存在较为重要。
SGR-J6/5BSLX-JFH1+4Amut/Luc的萤光素酶活性的上升与作为导入了来自JFH-1株的N3H序列的J6CF/JFH-1嵌合HCV亚基因组复制子RNA的SGR-J6/N3H+5BSLX-JFH1/Luc中的结果极为类似(图6)。可以说在来自J6CF株的复制子RNA中，A1680E突变与来自JFH-1株的N3H序列一样具有自主复制能力赋予效果。
(实施例9)由导入了J6CF/JFH-1嵌合突变体HCV全基因组复制子RNA(全长HCV基因组RNA)的细胞产生病毒
按照与实施例3相同的方法，将实施例2和实施例7中制作的5μgHCV全基因组复制子RNA导入(转染)到Huh7.5.1细胞中。将导入了HCV全基因组复制子RNA的细胞接种在12孔板中培养，在转染1天后、2天后和3天后回收培养上清。回收的培养上清通过0.45μm的滤器(Millipore公司)除去杂质，作为HCV核心蛋白测定的样品。HCV核心蛋白量的测定使用HCV抗原ELISA试验试剂盒(オーソ·クリニカル·ダイアグノスティックス公司)来进行。
其结果见图7。图7的横轴表示转染后的天数，纵轴表示培养上清中的核心蛋白量(fmol/L)。如图7所示，导入了FGR-J6/5BSLX-JFH1+4Amut的细胞的培养上清中的核心蛋白量随时间而增加。因此，显示出导入了FGR-J6/5BSLX-JFH1+4Amut的细胞产生了病毒。
(实施例10)来自J6CF株的突变体(导入5处突变)HCV亚基因组复制子RNA和HCV全基因组复制子RNA(全长HCV基因组RNA)的制作
制作用于合成来自J6CF株的突变体HCV亚基因组复制子RNA(导入5处突变；A1680E/A2892S/R2959K/Y3003F/nt9458(c→g)的取代(突变)导入)的表达载体。首先，制作向pSGR-J6CF/Luc中导入了实施例6中发现的引起NS4A蛋白区内的A1680E氨基酸取代(J6CF株的前体蛋白的第1680位的丙氨酸取代成谷氨酸的取代)的核苷酸突变、还导入了引起NS5B蛋白区内的A2892S(该第2892位的丙氨酸取代成丝氨酸的取代)、R2959K(该第2959位的精氨酸取代成赖氨酸的取代)和Y3003F(该第3003位的酪氨酸取代苯丙氨酸的取代)的氨基酸取代的核苷酸突变、以及HCV基因组的3’末端的非翻译区内存在的可变区(VR)中的nt9458(c→g)核苷酸突变(J6CF株的全长基因组序列的第9458位的胞嘧啶突变成鸟嘌呤的突变)的核酸构建物。这里，A2892S、R2959K、Y3003F、nt9458(c→g)突变是公知文献(Murayama等人,PLoSPathogns.,2010年,第6卷,e1000885)中记载的突变。
将得到的来自J6CF株的突变体HCV亚基因组复制子RNA表达载体称作pSGR-J6/4Amut+SKF+VRm3/Luc，将与实施例2一样操作而由该载体制作的突变体HCV亚基因组复制子RNA称作SGR-J6/4Amut+SKF+VRm3/Luc。需要说明的是，“SKF”是指A2892S、R2959K和Y3003F的氨基酸取代(突变)，“VRm3”是指基因组3’末端的非翻译区内的可变区的nt9458(c→g)的核苷酸突变。
同样，制作用于合成来自J6CF株的突变体(导入5处突变)HCV全基因组复制子RNA的表达载体。首先，向pJ6CF中导入分别引起NS4A蛋白区内的A1680E氨基酸取代、NS5B蛋白区内的A2892S氨基酸取代、R2959K氨基酸取代和Y3003F氨基酸取代的核苷酸取代、以及HCV基因组的3’末端的非翻译区内存在的可变区中的nt9458(c→g)核苷酸突变，制作核酸构建物。将该来自J6CF株的突变体HCV全基因组复制子RNA表达载体称作pFGR-J6/4Amut+SKF+VRm3，将与实施例2同样操作而由该载体制作的突变体HCV全基因组复制子RNA称作FGR-J6/4Amut+SKF+VRm3。
pSGR-J6CF/Luc和pJ6CF中的A1680E突变的导入与实施例7同样地进行。而且，关于导入了A1680E突变的表达载体中的引起NS5B蛋白区内的3个突变(氨基酸取代A2892S、R2959K和Y3003F；SKF)的核苷酸突变和HCV基因组的3’末端的可变区内的核苷酸突变(nt9458(c→g)核苷酸突变)的导入，利用公知文献(Murayama等人,PLoSPathogns.,2010年,第6卷,e1000885)中记载的、伴有氨基酸取代SKF的HCV亚基因组复制子RNA表达载体pSGR-J6/N3H+3’UTR-JFH1/SKF的BamHI/StuI消化DNA片段(包含NS4B编码区的一部分～NS5B编码区几乎全体)和公知文献(Murayama等人,PLoSPathogns.,2010年,第6卷,e1000885)记载的具有VRm3的HCV亚基因组复制子RNA表达载体pSGR-J6/N3H+5BSLX-JFH1/VR-J6m3的StuI/XbaI消化DNA片段(包含NS5B编码区的3’侧的一部分和3’非翻译区)，取代导入了A1680E突变的上述表达载体中的相同区的序列，从而进行制作。
图8表示表达载体pSGR-J6/4Amut+SKF+VRm3/Luc和pFGR-J6/4Amut+SKF+VRm3的结构。图中的“A1680E”、“A2892S”、“R2959K”、“Y3003F”和“nt9458(c→g)”示意性地表示导入了这些突变的位置。需要说明的是，图中的其他记号是指与图1和图2相同的记号。
需要说明的是，pSGR-J6/N3H+3’UTR-JFH1/SKF利用公知文献(Murayama等人,PLoSPathogns.,2010年,第6卷,e1000885)中记载的方法来制作。
需要说明的是，这里，作为A2892S、R2959K和Y3003F突变导入方法的例子，给出制作向pSGR-J6CF/Luc中分别导入了A2892S、R2959K和Y3003F突变的载体时的方法。该制作中使用的程序如下。
首先，关于A2892S(SKF的S)的导入，首先，作为第一PCR-1，以pJ6CF为模板，使用正义引物7244S-RI(5’-ACCGCTTGTGGAATCGTGGA-3’(SEQIDNO:15))和反义引物J65BA450Sas(5’-GGAGTACACtGaTCCGTACATCTCAAAGTTGAGG-3’(SEQIDNO:16))进行PCR。接下来，作为第一PCR-2，以pJ6CF为模板，使用正义引物J65BA450Ss(5’-TGTACGGAtCaGTGTACTCCGTGAGTCCCTTG-3’)(SEQIDNO:17))和反义引物9454R-IH(5’-GTGTGTGCCGCTCTACCGAGCGGGGAGTAG-3’(SEQIDNO:18))进行PCR。需要说明的是，引物序列中的小文字的核苷酸表示导入的核苷酸突变。而且，作为第二PCR，以通过上述第一PCR-1和第一PCR-2扩增的两种扩增片段的混合物为模板，使用正义引物7244S-RI(SEQIDNO:15)和反义引物9454R-IH(SEQIDNO:18)进行PCR。利用经限制酶XhoI和StuI消化所得的扩增产物而得到的DNA片段(相当于J6CF株的全长基因组的核苷酸编号第7523位～第9415位)和经StuI和XbaI消化pJFH1株而得到的DNA片段(JFH-1株的全长基因组的核苷酸编号第9415位～3’末端)，取代pSGR-J6CF/Luc的XhoI～XbaI区(J6CF株的全长基因组的核苷酸编号第7523位～3’末端)。关于R2959K(SKF的K)的导入，首先，作为第一PCR-1，以pJ6CF为模板，使用正义引物7244S-RI(5’-ACCGCTTGTGGAATCGTGGA-3’(SEQIDNO:15))和反义引物J65BR517Kas(5’-ACGGCCGCTtTCCCCCCACGGGAGATGAG-3’(SEQIDNO:19))进行PCR。接下来，作为第一PCR-2，以pJ6CF为模板，使用正义引物J65BR517Ks(5’-GTGGGGGGAaAGCGGCCGTTTGCGGTCGA-3’(SEQIDNO:20))和反义引物9454R-IH(5’-GTGTGTGCCGCTCTACCGAGCGGGGAGTAG-3’(SEQIDNO:18))进行PCR。需要说明的是，引物序列中的小文字的核苷酸表示导入的核苷酸突变。而且，作为第二PCR，以通过上述第一PCR-1和第一PCR-2扩增的两种扩增片段的混合物为模板，使用正义引物7244S-RI(SEQIDNO:15)和反义引物9454R-IH(SEQIDNO:18)进行PCR。使用经限制酶XhoI和StuI消化所得扩增产物而得到的DNA片段(J6CF株的全长基因组的核苷酸编号第7523位～第9415位)和用StuI和XbaI消化pJFH1而得到的DNA片段(JFH-1株的全长基因组的核苷酸编号第9415位～3’末端)，取代pSGR-J6CF/Luc的XhoI～XbaI区(J6CF株的全长基因组的核苷酸编号第7523位～3’末端)。关于Y3003F(SKF的F)的导入，首先，作为第一PCR-1，以pJ6CF为模板，使用正义引物7244S-RI(5’-ACCGCTTGTGGAATCGTGGA-3’(SEQIDNO:15))和反义引物J65BY561Fas(5’-CACGCTGTGAaAAATGTCGCCCCCGCCGG-3’(SEQIDNO:21))进行PCR，接下来，作为第一PCR-2，以pJ6CF为模板，使用正义引物J65BY561Fs(5’-GGCGACATTTtTCACAGCGTGTCGCGTGC-3’(SEQIDNO:22))和反义引物9454R-IH(5’-GTGTGTGCCGCTCTACCGAGCGGGGAGTAG-3’(SEQIDNO:18))进行PCR。需要说明的是，引物序列中的小文字的核苷酸表示导入的核苷酸突变。而且，作为第二PCR，以通过上述第一PCR-1和第一PCR-2扩增的两种扩增片段的混合物为模板，使用正义引物：7244S-RI(SEQIDNO:15)和反义引物9454R-IH(SEQIDNO:18)进行PCR。使用经限制酶XhoI和StuI消化所得扩增产物而得到的DNA片段(J6CF株的全长基因组的核苷酸编号第7523位～第9415位)和用StuI和XbaI消化pJFH1而得到的DNA片段(JFH-1株的全长基因组的核苷酸编号第9415位～3’末端)，取代pSGR-J6CF/Luc的XhoI～XbaI区(J6CF株的全长基因组的核苷酸编号第7523位～3’末端)。
pSGR-J6/N3H+5BSLX-JFH1/VR-J6m3利用公知文献(Murayama等人,PLoSPathogns.,2010年,第6卷,e1000885)中记载的方法进行制作。需要说明的是，这里，作为向3’非翻译区内的可变区中导入nt9458(c→g)突变的方法的例子，给出制作向pSGR-J6CF/Luc中导入了nt9458(c→g)突变的载体时的方法。首先，作为第一PCR-1，以pJ6CF为模板，使用正义引物9254S-IH(5’-GTGAAGACCAAGCTCAAACTCACTCC-3’(SEQIDNO:23))和反义引物J6VRm3as(5’-TATGGAGTGTAcCTAATGTGTGCCGCTCTAC-3’(SEQIDNO:24))进行PCR，接下来，作为第一PCR-2，以pJ6CF为模板，使用正义引物J6VRm3s(5’-CACACATTAGgTACACTCCATAGCTAACTGTC-3’(SEQIDNO:25))和反义引物M13R(5’-CAGGAAACAGCTATGAC-3’(SEQIDNO:26))进行PCR。需要说明的是，引物序列中的小文字的核苷酸表示导入的核苷酸突变。而且，作为第二PCR，以通过上述第一PCR-1和第一PCR-2扩增的两种扩增片段的混合物为模板，使用正义引物9254S-IH(SEQIDNO:23)和反义引物M13R(SEQIDNO:26)进行PCR。使用经限制酶SgrAI和XbaI消化所得扩增产物而得到的DNA片段(J6CF株的全长基因组的核苷酸编号第9328位～3’末端)，取代pSGR-J6CF/Luc的SgrAI～XbaI区(J6CF株的全长基因组的核苷酸编号第9328位～3’末端)。其结果，可以制作包含nt9458(c→g)突变的J6CF株突变体HCV亚基因组复制子RNA表达载体。
接着，按照与实施例2相同的方法，由上述制作的J6CF株突变体HCV复制子RNA表达载体合成J6CF株突变体HCV亚基因组复制子RNA和J6CF株突变体HCV全基因组复制子RNA。
SEQIDNO:4表示作为来自J6CF株的突变体(导入5处突变)HCV亚基因组复制子RNA的SGR-J6+4Amut+SKF+VRm3/Luc的核苷酸序列。SEQIDNO:5表示作为来自J6CF株的突变体(导入5处突变)HCV全基因组复制子RNA的FGR-J6+4Amut+SKF+VRm3的核苷酸序列，SEQIDNO:6表示由该核苷酸序列编码的突变体HCV前体蛋白全长的氨基酸序列。需要说明的是，SEQIDNO:4和SEQIDNO:5所示的核苷酸序列虽然作为DNA序列来记载，但其是将该序列中的胸腺嘧啶(t)理解成尿嘧啶(u)的序列所对应的RNA序列，因此，复制子RNA的序列还可以根据SEQIDNO:4和SEQIDNO:5来特定。
(实施例11)导入了来自J6CF株的突变体(导入5处突变)HCV亚基因组复制子RNA的细胞内的RNA复制
按照与实施例3相同的方法，将实施例10中制作的5μg来自J6CF株的突变体(导入5处突变)HCV亚基因组复制子RNA导入(转染)到Huh7.5.1细胞中。将导入了HCV亚基因组复制子RNA的细胞接种在12孔板中培养，在转染4小时后、24小时后和48小时后回收细胞。回收的细胞用250μL溶解缓冲液被动裂解试剂(Promega社)溶解，离心，以得到的上清作为样品。使用萤光素酶测定系统(Promega公司)和光度计LB9507(EG＆GBerthold公司)，测定样品中的萤光素酶活性。
其结果见图9。图的横轴表示转染后的时间，纵轴表示以转染4小时后的萤光素酶活性值为基准时各时刻的萤光素酶活性的相对值。如图9所示，导入了作为来自J6CF株的突变体(导入5处突变)HCV亚基因组复制子RNA的SGR-J6/4Amut+SKF+VRm3/Luc的细胞，其萤光素酶活性随时间而上升。因此，显示出SGR-J6/4Amut+SKF+VRm3/Luc进行了自主复制。明确了：为了使非嵌合的J6CF基因组在细胞内复制，A1680E、A2892S、R2959K、Y3003F和nt9458(c→g)这5处突变较为重要。
(实施例12)由导入了来自J6CF株的突变体(导入5处突变)HCV全基因组复制子RNA(全长HCV基因组RNA)的细胞产生病毒
按照与实施例3相同的方法，将实施例2、7和10中制作的5μgHCV全基因组复制子RNA导入(转染)到Huh7.5.1细胞中。将导入了HCV全基因组复制子RNA的细胞接种在12孔板中培养，在转染1天后、2天后和3天后回收培养基。回收的培养上清通过0.45μm的滤器(Millipore公司)除去杂质，作为HCV核心蛋白测定的样品。HCV核心蛋白量的测定使用HCV抗原ELISA试验试剂盒(オーソ·クリニカル·ダイアグノスティックス公司)来进行。
其结果见图10。图10的横轴表示转染后的天数，纵轴表示培养上清中的核心蛋白量(fmol/L)。如图10所示，导入了FGR-J6/4Amut+SKF+VRm3的细胞的培养上清中的核心蛋白量随时间而增加。因此，显示出导入了FGR-J6/4Amut+SKF+VRm3的细胞产生了病毒。
(实施例13)由导入了来自J6CF株的突变体(导入5处突变)HCV全基因组复制子RNA(全长HCV基因组RNA)的细胞产生的病毒(病毒颗粒)的感染性
认为实施例12中得到的导入了HCV全基因组复制子RNA的细胞的培养上清包含所产生的病毒(病毒颗粒)，因此测定该培养上清的感染滴度。感染滴度的测定使用转染3天后的培养上清来进行。将新的Huh7.5.1细胞接种在聚-D-赖氨酸包被的96孔板(BD公司)中，使达到1ｘ104/孔，第二天，向该细胞中添加已稀释的上述培养上清，用病毒感染细胞。感染处理3天后，用甲醇固定细胞，将已感染的细胞用抗核心抗体和AlexaFluor488-缀合抗小鼠IgG(MolecularProbes公司)进行免疫染色。在荧光显微镜下计测感染病灶数。培养上清的感染滴度用ffu/mL(每1mL培养基的感染病灶形成数(ffu；focusformingunit))表示。
其结果见表1。
[表1]
其结果，关于分别导入了作为HCV全基因组复制子RNA的FGR-J6/N3H+5BSLX-JFH1、FGR-J6/5BSLX-JFH1+4Amut和FGR-J6/4Amut+SKF+VRm3的细胞的培养上清，测到了高的感染滴度。
其结果显示出：由导入了作为来自J6CF株的突变体(导入5处突变)HCV全基因组复制子RNA的FGR-J6/4Amut+SKF+VRm3的细胞产生的病毒颗粒也具有高感染性。
另一方面，在导入了作为J6CF株HCV全基因组复制子RNA的FGR-J6CF的细胞中，培养上清的感染滴度为0，显示出：J6CF株HCV全基因组复制子RNA其单独不会产生感染性病毒颗粒。
(实施例14)导入了不同的组合的突变的HCV亚基因组复制子RNA的制作
将实施例10中导入到突变体中的5处突变以不同的组合导入到HCV亚基因组复制子RNA中，研究其效果。具体而言，首先，制作将NS4A蛋白区内的A1680E突变(4Amut突变)、NS5B蛋白区内的A2892S、R2959K和Y3003F这3个取代(SKF突变)、3’非翻译区的可变区内的nt9458(c→g)的突变(VRm3突变)这3种突变中的一种或两种组合起来导入的HCV亚基因组复制子RNA。
关于用于合成这些HCV亚基因组复制子RNA的表达载体，按照实施例10记载的方法，通过向载体pSGR-J6CF/Luc中导入各突变来制作(图11和12)。图11表示导入了1种突变的HCV亚基因组复制子RNA表达载体的结构，图12表示导入了两种突变的HCV亚基因组复制子RNA表达载体的结构。图11和12中的记号是指与图1、2和8相同的记号。
而且，进行相同的操作，还制作了除导入4Amut突变和VRm3外、还将Y3003F突变单独导入pSGR-J6CF/Luc中的核酸构建物。将此处得到的表达载体称作pSGR-J6/4Amut+Y3003F+VRm3/Luc。该HCV亚基因组复制子RNA表达载体的结构见图13。图中的记号是指与图1、2和8相同的记号。
接着，按照与实施例2相同的方法，由上述HCV亚基因组复制子RNA表达载体制作HCV亚基因组复制子RNA。需要说明的是，将由HCV亚基因组复制子RNA表达载体pSGR-J6/4Amut/Luc制作的HCV亚基因组复制子RNA称作SGR-J6/4Amut/Luc，对于其他的HCV亚基因组复制子RNA也同样命名。
(实施例15)导入了包含不同组合的突变的各种突变体HCV亚基因组复制子RNA的细胞内的RNA复制
按照与实施例3相同的方法，将实施例10和实施例14中制作的各5μg来自J6CF株的突变体HCV亚基因组复制子RNA导入(转染)到Huh7.5.1细胞中。将导入了HCV亚基因组复制子RNA的细胞接种在12孔板中培养，在转染4小时后、24小时后和48小时后回收细胞。回收的细胞用250μL的溶解缓冲液被动裂解试剂(Promega公司)溶解，离心，以得到的培养上清作为样品。使用萤光素酶测定系统(Promega公司)和光度计LB9507(EG＆GBerthold公司)，测定样品中的萤光素酶活性。作为对照，将不具有突变的HCV亚基因组复制子RNASGR-JFH1/Luc和SGR-J6CF/Luc同样地导入细胞中进行培养，测定培养上清的萤光素酶活性。
其结果见图14。图的横轴表示各HCV亚基因组复制子RNA，纵轴表示以转染4小时后的萤光素酶活性值为基准时各时刻(24小时后、48小时后)的萤光素酶活性的相对值。如图14所示，与阳性对照SGR-JFH1/Luc一样，在导入了作为来自J6CF株的突变体(导入5处突变)HCV亚基因组复制子RNA的SGR-J6/4Amut+SKF+VRm3/Luc的细胞中，萤光素酶活性随时间而上升。另一方面，在导入了具有其他组合的突变的HCV亚基因组复制子RNA的细胞中，萤光素酶活性随时间而减少。因此，显示出只有SGR-J6/4Amut+SKF+VRm3/Luc进行了自主复制。为了使来自J6CF株基因组的复制子在细胞内高效率地进行复制，上述5处突变均重要。
产业实用性
根据本发明，可以提供可在培养细胞中自主扩增、且产生作为基因型2a的J6CF株的感染性HCV颗粒的全基因组复制子RNA。这例如可有效用于抑制作为基因型2a的J6CF株的HCV的感染和复制的抗HCV药的筛选、用于解明HCV的复制机制的研究、HCV疫苗的开发等。另外，本发明还可以提供在培养细胞中具有高的复制能力的来自J6CF株的亚基因组复制子RNA，这例如可用于筛选抑制J6CF株的HCV的复制的抗HCV药。
另外，在本发明中，使用以J6CF株的基因组为骨架、且具有自主复制能力和感染性HCV颗粒产生能力的全基因组复制子RNA，可以在培养细胞系统中制作感染性HCV颗粒。由此，除了提供只是JFH-1株及其嵌合株的感染性HCV颗粒，还提供新的HCV株的感染性HCV颗粒。本发明的该感染性HCV颗粒可用于解明因HCV株的不同而引起的干扰素的疗效的不同、或者分析HCV感染后的突变的发生，进而，可用于解明抗药性的机制。而且，本发明的使用HCV颗粒的抗HCV药的筛选可用于开发疗效更高的治疗药。
本说明书中引用的所有出版物、专利和专利申请，其全体通过参照而纳入本说明书中。
[序列表自由文本]
SEQIDNO:1是指作为J6CF/JFH-1嵌合突变体HCV亚基因组复制子RNA的SGR-J6/5BSLX-JFH1+4Amut/Luc的cDNA序列；
SEQIDNO:2是指作为J6CF/JFH-1嵌合突变体HCV全基因组复制子RNA的FGR-J6/5BSLX-JFH1+4Amut的cDNA序列；
SEQIDNO:3是指由作为J6CF/JFH-1嵌合突变体HCV全基因组复制子RNA的FGR-J6/5BSLX-JFH1+4Amut编码的前体蛋白；
SEQIDNO:4是指作为来自J6CF株的突变体(导入5处突变)HCV亚基因组复制子RNA的SGR-J6/4Amut+SKF+VRm3/Luc的cDNA序列；
SEQIDNO:5是指作为来自J6CF株的突变体(导入5处突变)HCV全基因组复制子RNA的FGR-J6/4Amut+SKF+VRm3的cDNA序列；
SEQIDNO:6是指由作为来自J6CF株的突变体(导入5处突变)HCV全基因组复制子RNA的FGR-J6/4Amut+SKF+VRm3编码的前体蛋白；
SEQIDNO:7是指正义引物8680S-2a；
SEQIDNO:8是指反义引物9191R-2a；
SEQIDNO:9是指正义引物9191S-2a；
SEQIDNO:10是指反义引物9440R-IH；
SEQIDNO:11是指正义引物3471S-2a；
SEQIDNO:12是指反义引物A1680Eas；
SEQIDNO:13是指正义引物A1680Es；
SEQIDNO:14是指反义引物6542R-IH；
SEQIDNO:15是指正义引物7244S-RI；
SEQIDNO:16是指反义引物J65BA450Sas；
SEQIDNO:17是指正义引物J65BA450Ss；
SEQIDNO:18是指反义引物9454R-IH；
SEQIDNO:19是指反义引物J65BR517Kas；
SEQIDNO:20是指正义引物J65BR517Ks；
SEQIDNO:21是指反义引物J65BY561Fas；
SEQIDNO:22是指正义引物J65BY561Fs；
SEQIDNO:23是指正义引物9254S-IH；
SEQIDNO:24是指反义引物J6VRm3as；
SEQIDNO:25是指正义引物J6VRm3s；
SEQIDNO:26是指反义引物M13R；
SEQIDNO:27是指丙型肝炎病毒J6CF株的NS5B蛋白；
SEQIDNO:28是指丙型肝炎病毒JFH-1株的NS5B蛋白；
SEQIDNO:29是指丙型肝炎病毒J6CF株的全长基因组RNA的cDNA序列；
SEQIDNO:30是指由丙型肝炎病毒J6CF株的全长基因组RNA编码的前体蛋白；
SEQIDNO:31是指丙型肝炎病毒JFH-1株的基因组RNA的3’非翻译区(3’UTR)的cDNA序列；
SEQIDNO:32是指编码由J6CF株的NS5B蛋白的第1位～第515位的氨基酸残基和JFH-1株的NS5B蛋白的第516位～第591位的氨基酸残基构成的嵌合NS5B蛋白的DNA序列；
SEQIDNO:33是指由J6CF株的NS5B蛋白的第1位～第515位的氨基酸残基和JFH-1株的NS5B蛋白的第516位～第591位的氨基酸残基构成的嵌合NS5B蛋白。

Claims (23)

1.核酸，该核酸由丙型肝炎病毒J6CF株的基因组的5’非翻译区；由丙型肝炎病毒J6CF株的基因组的NS3蛋白编码序列、丙型肝炎病毒J6CF株的基因组的NS4A蛋白编码序列、丙型肝炎病毒J6CF株的基因组的NS4B蛋白编码序列、丙型肝炎病毒J6CF株的基因组的NS5A蛋白编码序列和丙型肝炎病毒J6CF株的基因组的NS5B蛋白编码序列构成的病毒蛋白编码区；以及丙型肝炎病毒J6CF株的基因组的3’非翻译区按照从5’侧往3’侧依次连接而得到的核苷酸序列构成，其中，
以SEQIDNO:30所示J6CF株的前体蛋白的氨基酸序列为基准时，上述NS4A蛋白编码序列编码第1680位的丙氨酸被取代成谷氨酸的NS4A蛋白。
2.权利要求1所述的核酸，其中，以SEQIDNO:30所示氨基酸序列为基准时，上述NS5B蛋白编码序列编码发生了下述(i)～(iii)的氨基酸取代的NS5B蛋白，
以SEQIDNO:29所示核苷酸序列为基准时，上述3’非翻译区的第9458位的胞嘧啶碱基被取代成鸟嘌呤碱基，
(i)第2892位的丙氨酸取代成丝氨酸的氨基酸取代；
(ii)第2959位的精氨酸取代成赖氨酸的氨基酸取代；
(iii)第3003位的酪氨酸取代成苯丙氨酸的氨基酸取代。
3.权利要求1所述的核酸，其中，上述NS5B蛋白编码序列被取代成编码由SEQIDNO:27所示氨基酸序列的第1位～第515位的氨基酸序列和SEQIDNO:28所示氨基酸序列的第516位～第591位的氨基酸序列依次连接而得到的氨基酸序列构成的蛋白的核苷酸序列，并且
上述3’非翻译区被取代成SEQIDNO:31所示核苷酸序列。
4.核酸，该核酸由丙型肝炎病毒J6CF株的基因组的5’非翻译区；抗药性基因或报道基因；IRES序列；由丙型肝炎病毒J6CF株的基因组的NS3蛋白编码序列、丙型肝炎病毒J6CF株的基因组的NS4A蛋白编码序列、丙型肝炎病毒J6CF株的基因组的NS4B蛋白编码序列、丙型肝炎病毒J6CF株的基因组的NS5A蛋白编码序列和丙型肝炎病毒J6CF株的基因组的NS5B蛋白编码序列构成的病毒蛋白编码区；以及丙型肝炎病毒J6CF株的基因组的3’非翻译区按照从5’侧往3’侧依次连接而得到的核苷酸序列构成，其中，
以SEQIDNO:30所示J6CF株的前体蛋白的氨基酸序列为基准时，上述NS4A蛋白编码序列编码第1680位的丙氨酸被取代成谷氨酸的NS4A蛋白。
5.权利要求4所述的核酸，其中，以SEQIDNO:30所示氨基酸序列为基准时，上述NS5B蛋白编码序列编码发生了下述(i)～(iii)的氨基酸取代的NS5B蛋白，
以SEQIDNO:29所示核苷酸序列为基准时，上述3’非翻译区的第9458位的胞嘧啶碱基被取代成鸟嘌呤碱基，
(i)第2892位的丙氨酸取代成丝氨酸的氨基酸取代；
(ii)第2959位的精氨酸取代成赖氨酸的氨基酸取代；
(iii)第3003位的酪氨酸取代成苯丙氨酸的氨基酸取代。
6.权利要求4所述的核酸，其中，上述NS5B蛋白编码序列被取代成编码由SEQIDNO:27所示氨基酸序列的第1位～第515位的氨基酸序列和SEQIDNO:28所示氨基酸序列的第516位～第591位的氨基酸序列依次连接而得到的氨基酸序列构成的蛋白的核苷酸序列，并且
上述3’非翻译区被取代成SEQIDNO:31所示核苷酸序列。
7.核酸，该核酸由丙型肝炎病毒J6CF株的基因组的5’非翻译区；丙型肝炎病毒J6CF株的基因组的核心蛋白编码序列、丙型肝炎病毒J6CF株的基因组的E1蛋白编码序列、丙型肝炎病毒J6CF株的基因组的E2蛋白编码序列、丙型肝炎病毒J6CF株的基因组的p7蛋白编码序列和丙型肝炎病毒J6CF株的基因组的NS2蛋白编码序列；丙型肝炎病毒J6CF株的基因组的NS3蛋白编码序列、丙型肝炎病毒J6CF株的基因组的NS4A蛋白编码序列、丙型肝炎病毒J6CF株的基因组的NS4B蛋白编码序列、丙型肝炎病毒J6CF株的基因组的NS5A蛋白编码序列和丙型肝炎病毒J6CF株的基因组的NS5B蛋白编码序列；以及丙型肝炎病毒J6CF株的基因组的3’非翻译区按照从5’侧往3’侧依次连接而得到的核苷酸序列构成，其中，
以SEQIDNO:30所示J6CF株的前体蛋白的氨基酸序列为基准时，上述NS4A蛋白编码序列编码第1680位的丙氨酸被取代成谷氨酸的NS4A蛋白。
8.权利要求7所述的核酸，其中，以SEQIDNO:30所示氨基酸序列为基准时，上述NS5B蛋白编码序列编码发生了下述(i)～(iii)的氨基酸取代的NS5B蛋白，
以SEQIDNO:29所示核苷酸序列为基准时，上述3’非翻译区的第9458位的胞嘧啶碱基被取代成鸟嘌呤碱基，
(i)第2892位的丙氨酸取代成丝氨酸的氨基酸取代；
(ii)第2959位的精氨酸取代成赖氨酸的氨基酸取代；
(iii)第3003位的酪氨酸取代成苯丙氨酸的氨基酸取代。
9.权利要求7所述的核酸，其中，上述NS5B蛋白编码序列被取代成编码由SEQIDNO:27所示氨基酸序列的第1位～第515位的氨基酸序列和SEQIDNO:28所示氨基酸序列的第516位～第591位的氨基酸序列依次连接而得到的氨基酸序列构成的蛋白的核苷酸序列，并且
上述3’非翻译区被取代成SEQIDNO:31所示核苷酸序列。
10.核酸，该核酸由丙型肝炎病毒J6CF株的基因组的5’非翻译区；抗药性基因或报道基因；IRES序列；丙型肝炎病毒J6CF株的基因组的核心蛋白编码序列、丙型肝炎病毒J6CF株的基因组的E1蛋白编码序列、丙型肝炎病毒J6CF株的基因组的E2蛋白编码序列、丙型肝炎病毒J6CF株的基因组的p7蛋白编码序列和丙型肝炎病毒J6CF株的基因组的NS2蛋白编码序列；丙型肝炎病毒J6CF株的基因组的NS3蛋白编码序列、丙型肝炎病毒J6CF株的基因组的NS4A蛋白编码序列、丙型肝炎病毒J6CF株的基因组的NS4B蛋白编码序列、丙型肝炎病毒J6CF株的基因组的NS5A蛋白编码序列和丙型肝炎病毒J6CF株的基因组的NS5B蛋白编码序列；以及丙型肝炎病毒J6CF株的基因组的3’非翻译区按照从5’侧往3’侧依次连接而得到的核苷酸序列构成，其中，
以SEQIDNO:30所示J6CF株的前体蛋白的氨基酸序列为基准时，上述NS4A蛋白编码序列编码第1680位的丙氨酸被取代成谷氨酸的NS4A蛋白。
11.权利要求10所述的核酸，其中，以SEQIDNO:30所示氨基酸序列为基准时，上述NS5B蛋白编码序列编码发生了下述(i)～(iii)的氨基酸取代的NS5B蛋白，
以SEQIDNO:29所示核苷酸序列为基准时，上述3’非翻译区的第9458位的胞嘧啶碱基被取代成鸟嘌呤碱基，
(i)第2892位的丙氨酸取代成丝氨酸的氨基酸取代；
(ii)第2959位的精氨酸取代成赖氨酸的氨基酸取代；
(iii)第3003位的酪氨酸取代成苯丙氨酸的氨基酸取代。
12.权利要求10所述的核酸，其中，上述NS5B蛋白编码序列被取代成编码由SEQIDNO:27所示氨基酸序列的第1位～第515位的氨基酸序列和SEQIDNO:28所示氨基酸序列的第516位～第591位的氨基酸序列依次连接而得到的氨基酸序列构成的蛋白的核苷酸序列，并且
上述3’非翻译区被取代成SEQIDNO:31所示核苷酸序列。
13.丙型肝炎病毒的亚基因组复制子RNA，其包含权利要求1～6中任一项所述的核酸。
14.丙型肝炎病毒的全基因组复制子RNA，其包含权利要求7～12中任一项所述的核酸。
15.丙型肝炎病毒颗粒，其含有权利要求7～12中任一项所述的核酸作为病毒基因组。
16.表达载体，其包含权利要求1～12中任一项所述的核酸。
17.细胞，该细胞中导入有权利要求1～12中任一项所述的核酸。
18.丙型肝炎病毒疫苗，其含有权利要求15所述的丙型肝炎病毒颗粒。
19.筛选抗丙型肝炎病毒物质的方法，该方法具备下述步骤：
培养步骤，在受检物质的存在下和不存在下，培养权利要求17所述的细胞、或权利要求15所述的丙型肝炎病毒颗粒和丙型肝炎病毒敏感性细胞的混合物；
定量步骤，定量在上述培养步骤中得到的培养物中的亚基因组复制子RNA、全基因组复制子RNA或丙型肝炎病毒颗粒的量；以及
评价步骤，上述定量步骤的结果，当在受检物质的存在下定量的亚基因组复制子RNA、全基因组复制子RNA或丙型肝炎病毒颗粒的量分别少于在受检物质的不存在下定量的亚基因组复制子RNA、全基因组复制子RNA或丙型肝炎病毒颗粒的量时，评价为上述受检物质具有抗丙型肝炎病毒活性。
20.权利要求5所述的核酸，该核酸由SEQIDNO:4所示核苷酸序列构成，其中该核酸为RNA时，将SEQIDNO:4所示核苷酸序列中的胸腺嘧啶(t)理解成尿嘧啶(u)。
21.权利要求6所述的核酸，该核酸由SEQIDNO:1所示核苷酸序列构成，其中该核酸为RNA时，将SEQIDNO:1所示核苷酸序列中的胸腺嘧啶(t)理解成尿嘧啶(u)。
22.权利要求8所述的核酸，该核酸由SEQIDNO:5所示核苷酸序列构成，其中该核酸为RNA时，将SEQIDNO:5所示核苷酸序列中的胸腺嘧啶(t)理解成尿嘧啶(u)。
23.权利要求9所述的核酸，该核酸由SEQIDNO:2所示核苷酸序列构成，其中该核酸为RNA时，将SEQIDNO:2所示核苷酸序列中的胸腺嘧啶(t)理解成尿嘧啶(u)。
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