JP2009005589A - Ｕｖによるｃ型肝炎ウイルスの不活化方法 - Google Patents

Abstract

【課題】本発明の目的は、Ｃ型肝炎ウイルスのワクチン作製に必須である、Ｃ型肝炎ウイルス粒子の不活化の方法を開発することにある。
【解決手段】本発明によれば、Ｃ型肝炎ウイルス粒子を含んだ溶液にＵＶ−Ｃを照射することで、Ｃ型肝炎ウイルスのＲＮＡを分解することにより、ウイルスの粒子構造への影響を抑えながらＣ型肝炎ウイルスの感染性を失わせることができる。よって、本発明は、Ｃ型肝炎ウイルスのワクチン製造において有用である。
【選択図】なし

Description

本発明は、Ｃ型肝炎ウイルスを不活化する技術に関する。さらに詳しくは、ＵＶを用いてＣ型肝炎ウイルスを迅速かつ簡便に不活化する方法に関する。

従来Ｃ型肝炎ウイルスは培養細胞中で複製させることができなかったが、近年Ｃ型肝炎ウイルス粒子を培養細胞により作製することが技術的に可能となった。さらにそのウイルスを精製することによりある一定の純度をもったＣ型肝炎ウイルスを得ることが可能となった（特許文献１）。したがって、培養細胞によって作製され、精製されたＣ型肝炎ウイルスをワクチンとして用いることにより、インフルエンザウイルスなどと同様に、Ｃ型肝炎ウイルス感染を阻害することができる可能性がある。

現在細胞培養により作製できるＣ型肝炎ウイルス粒子は遺伝子組換え技術により弱毒化・無毒化（以下、これらを総称して不活化という）してあるウイルスではなく、ヒト肝癌由来細胞であるＨｕｈ７への感染性を有する生ウイルスである（特許文献１）。このようなウイルスを用いてヒトにワクチン接種を行うと、ワクチンによりＣ型肝炎に感染するということになってしまう。そのため、ウイルスを不活化する方法が、ワクチン開発には必須である。

ワクチン作製に用いられているウイルスの不活化方法としては、インフルエンザウイルスに用いられているホルマリンによる化学的な処理といった方法がある（非特許文献１）。

また、紫外線（ＵＶ）照射によりＣ型肝炎ウイルスの感染性を低下させるとの報告（非特許文献２）はあるが、その条件などについての報告は全くない。また、ＵＶによる病原体滅菌方法に関する発明がある（特許文献２）。また、ポリオウイルスについてのＵＶによる不活化の報告がある（非特許文献３）が、当該特許にはＣ型肝炎ウイルスについての記載は全くない。

国際公開第０６／０２２４２２号パンフレット 国際公開第０５／１１８０００号パンフレット 「インフルエンザワクチンについて」［ｏｎｌｉｎｅ］、１９９９年５月７日、国立感染症研究所、［２００７年６月１８日検索］、インターネット＜ＵＲＬ：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｉｈ．ｇｏ．ｊｐ／ｎｉｉｄ／ｔｏｐｉｃｓ／ｉｎｆｌｕｅｎｚａ０１．ｈｔｍｌ＞ Ｋａｔｏ Ｔ． ａｎｄ Ｗａｋｉｔａ Ｔ．， Ｕｉｒｕｓｕ， ５５（２００５） ｐ．２８７−９５ ＫＮ Ｐｒｏｄｏｕｚ ｅｔ．ａｌ．， Ｂｌｏｏｄ， ７０（１９８７） ｐ．５８９−５９２

本発明が解決しようとする課題は、Ｃ型肝炎ウイルスによるワクチン作製に必須である、不活化の方法を開発することにある。

本発明者らは、Ｃ型肝炎ウイルスの不活化を検討した結果、近年開発された細胞培養により作製・精製されたＣ型肝炎ウイルスを、ＵＶを発する殺菌灯を用いて感染能力を失わせることに成功し、本発明に到達した。

すなわち本発明は、
（１）ＵＶ−Ｃを照射することによるＣ型肝炎ウイルスの不活化方法、
（２）ＵＶの強度が２０ｍＷ／ｃｍ^２である前記（１）に記載の方法、
（３）ＵＶの照射時間が１分以上である前記（１）または（２）に記載の方法、
に関する。

本発明により、Ｃ型肝炎ウイルスの不活化を迅速かつ簡便に行うことができる。また、本発明においては短時間の光学的な処理を行うのみのため、ウイルス粒子構造への影響をほとんど与えずに、不活化したＣ型肝炎ウイルスを得ることができるものと考えられる。

以下に本発明について詳細に記載する。
本発明において、Ｃ型肝炎ウイルスをＵＶ照射することによりウイルスの感染性を失わせ、迅速に不活化することができる。そのため、ウイルスを構成するタンパク質などへの影響を少なく、ウイルスの不活化を行うことができる。

本発明において使用されるＵＶは、その波長によってＵＶ−Ａ、ＵＶ−ＢまたはＵＶ−Ｃに区別され、それらのいずれかまたはそれらを組み合わせて使用することができるが、好ましくはＵＶ−Ｃが使用される。

本発明において、用いるＵＶの線源としては一般に市販されている殺菌灯、特に１５Ｗ殺菌灯を用いて行うことができるが、それに限るものではない。

後述の実施例においてＣ型肝炎ウイルスは前記特許文献１（国際公開第０６／０２２４２２号パンフレット）に記載されている方法により精製したものを用いているが、本発明においてウイルスの精製・未精製などの状態により限られるものではない。また、本発明の対象となるＣ型肝炎ウイルス株として、ＪＦＨ−１やＪＦＨ−１遺伝子を含んだキメラウイルスのほか、ＨＣＶ−１、ＨＣＶ−H、ＨＣ−Ｊ１、ＨＣＴ−１８、Ｈ７７、ＤＫ−７、ＵＳ１１、Ｓ１４、ＨＣＴ２３、ＨＣＶ−Ｔｈ、ＤＲ１、ＤＲ４、ＨＣＴ２７、Ｓ１８、ＳＷ１、ＤＫ９、Ｈ９０、ＴＤ−６Ｅ１、Ｓ９、ＨＣＶ−ＢＫ、Ｔ１０、ＤＫ１、ＨＣ−Ｊ４、ＨＣＶ−Ｊ、ＨＫ３、ＨＫ８、ＨＫ５、ＨＣＶ−Ｇ３、ＩＮＤ５、ＩＮＤ８、Ｐ１０、Ｄ１、Ｄ３、ＳＷ２、Ｔ３、Ｓ４５、ＳＡ１０、ＵＳ６、ＨＣＶ−ＪＫ１、ＨＣＶ−ＪＫ４、ＨＣＶ−ＪＫ３、ＨＣＶ−ＪＫ２、ＨＣＶ−ＪＴ、ＨＣ−Ｊ２、ＨＣＶ−Ｔ、ＨＫ４、ＨＣ−Ｇ９、Ｚ１、Ｂｉ，Ｓ．Ｉ．、Ｃｈｏ，Ｊ．Ｍ、ＨＣＶ−Ｊ６、Ｔ４、Ｔ９、ＵＳ１０、ＨＣ−Ｊ５、Ｔ２、ＨＣ−Ｊ７、ＤＫ１１、ＳＷ３、ＤＫ８、Ｔ８、ＨＣ−Ｊ８、Ｓ８３、ＨＫ２、ＨＣ−Ｊ６、ＨＣ−Ｊ８、ＢＥＢＥ１、ＨＣＶ−Ｊ６、ＨＣＶ−Ｊ８、ＨＤ１０−２、ＢＲ３６−９、Ｓ５２、Ｓ５４、Ｓ２、ＢＲ３３−１、ＨＫ１０、ＤＫ１２、ＨＣＶ−ＴＲ、ＢＡ−１、ＢＡ−２、ＤＫ１３、Ｚ１、Ｚ４、Ｚ６、Ｚ７、ＨＫ２、ＳＡ１、ＳＡ４、ＳＡ５、ＳＡ７、ＳＡ１３、ＳＡ６、ＮＺＬ１、ＳＡ３０、ＥＧ−１３、ＨＣＶ−Ｋ３ａ／６５０、ＥＤ４３、ＥＵＨ１４８０、ＥＵＨＫ２、Ｔｈ５８０、ＶＮ２３５、ＶＮ４０５、ＶＮ００４、ＪＫ０４９、ＪＫ０４６、ＪＦＨ−１、ＪＣＨ−１、ＪＣＨ−２、ＪＣＨ−３、ＪＣＨ−４、ＪＣＨ−５、ＪＣＨ−６、Ｊ６ＣＦ、Ｃｏｎ１等のＣ型肝炎ウイルス株があげられるがこれらに限定されるものではない。

本発明のＣ型肝炎ウイルスの不活化の際のＵＶの強度については特に限定されないが、好ましくは２０ｍＷ／ｃｍ^２である。ここでいうＵＶ強度は紫外線強度計を用いることによって測定され、ＵＶ線源との距離を変化させることで調節される。

Ｃ型肝炎ウイルスのＵＶ照射時間は特に限定されないが、１分以上であることが好ましい。ＵＶ照射時間が１分未満の場合、Ｃ型肝炎ウイルスの不活化が不十分な場合がある。ＵＶ照射時間の上限には特に限りはないが、Ｃ型肝炎ウイルス粒子の安定性および作業の効率を考慮した場合、好ましくは２４時間以内である。より好ましいＵＶ照射時間としては１〜１５分以内、さらに好ましくは５〜１５分である。なお、Ｃ型肝炎ウイルスにＵＶを照射する際は、室温（１８℃〜２５℃の範囲）であることが好ましい。

本発明における、Ｃ型肝炎ウイルスの不活化の評価は、Ｃ型肝炎ウイルスのＨｕｈ−７細胞への感染力価により行うことができる。たとえば感染力価の測定方法はＪｉｎ Ｚｈｏｎｇ， ｅｔａｌ．， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ． （２００５） １０２ ｐ９２９４−９２９９に記載の方法に準じて行うことができるが、それに限るものではない。

以下の実施例は、本発明を例示するために提供されるが、本発明を限定するものではない。

実施例１
Ｃ型肝炎ウイルスの不活化の方法としてホルマリンとＵＶ−Ｃ照射を検討した。ＷＯ０６０２２４２２Ａ１に記載の方法に準じて精製した、感染力価１ｘ１０^６ｆｆｕ／ｍｌのＣ型肝炎ウイルス（ＪＦＨ−１株）を用いて検討をおこなった。ＵＶ−Ｃの線源としては東芝社製ＧＬ−１５を使用した。ウイルス不活化の検討条件は以下の通りとした。

ＵＶ−Ｃ照射では、シリコンコーティングされたポリエチレン製エッペンチューブ（アシスト社製）にＣ型肝炎ウイルス粒子含有溶液を入れ、ＵＶの照射強度が２０ｍＷ／ｃｍ^２となるような距離に置き、下記の条件１〜４のいずれかに従い、５分間または１５分間ＵＶの照射を行った。ホルマリン処理では和光純薬製３７%ホルマリン水溶液を用い、シリコンコーティングされたポリエチレン製エッペンチューブ（アシスト社製）にＣ型肝炎ウイルス粒子含有溶液に加え希釈して、冷蔵庫中に一晩静置した。

条件１．ＵＶ−Ｃ照射 ２０ｍＷ／ｃｍ^２ ５分間 室温
条件２．ＵＶ−Ｃ照射 ２０ｍＷ／ｃｍ^２ １５分間 室温
条件３．０．２％ ホルマリン添加 一晩 ４℃
条件４．０．１％ ホルマリン添加 一晩 ４℃

上記の処置を行った後に、ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）に５０倍、２５０倍、１２５０倍、６２５０倍、３１２５０倍、１５６２５０倍、７８１２５０倍で段階希釈した。

前日に９６ ｗｅｌｌ ｐｏｌｙ−Ｌ−ｌｙｓｉｎｅ ｃｏａｔｅｄ ｐｌａｔｅ（コーニング社製・Ｃｏｒｎｉｎｇ ９６ ｗｅｌｌ Ｃｌｅａｒ Ｆｌａｔ Ｂｏｔｔｏｍ ｐｏｌｙ−Ｄ−Ｌｙｓｉｎｅ Ｃｏａｔｅｄ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ，）にＨｕｈ−７細胞を１ｘ１０^４ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌで播いておき、段階希釈したウイルスを播種して３７℃で７２時間培養をおこなった。

培養上清を取り除いた後に、氷冷したメタノール中にプレートを入れ細胞を固定した。その後、メタノールを風乾により除き、０．３％ Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）−Ｘ １００（ＧＥヘルスケア社）を含んだブロックエース（登録商標）（大日本製薬社）で細胞の可溶化処置をした。そして、ｃｌｏｎｅ ２Ｈ９抗ＨＣＶ−ｃｏｒｅ抗体（Ｎａｔ Ｍｅｄ．（２００５） １１：ｐ７９１−６．参照）及びｇｏａｔ ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ−Ａｌｅｘａ４８８（モレキュラープローブ社）を用いてＣ型肝炎ウイルス感染細胞を蛍光顕微鏡（オリンパス社製ＩＸ−７０）下で計数した。

その結果、それぞれの処置をしたＣ型肝炎ウイルスの感染力価は以下の表１のようになった。

ホルマリン処理（条件３および４）によって処理前の数分の１から数十分の１まで感染力価を低減させることはできたが、感染をなくすことはできなかった。一方、５分（条件１）、１５分（条件２）のＵＶ−Ｃ ２０ｍＷ／ｃｍ^２照射によりＣ型肝炎ウイルスの感染性は完全に消失した。

実施例２
さらに、Ｃ型肝炎ウイルス粒子の粒子構造がＵＶによる不活化で破壊されていないか検討を行った。スクリューキャップチューブへ精製Ｃ型肝炎ウイルス（ＪＦＨ−１株、２．５４．ｘ１０^４ｆｆｕ／ｍＬ，１．０７ｘ１０^６ｆｍｏｌ／Ｌ） １．２ｍＬを入れ、それぞれ０（処理なし、ｃｏｎｔｒｏｌ）、０．５分間、１分間、５分間、１５分間および２４時間 ＵＶ−Ｃ ２０ｍＷ／ｃｍ^２を室温で照射した、もしくは３７℃で２４時間静置したＣ型肝炎ウイルスの感染性および粒子のプロファイルを検討した。

感染性の評価は、実施例１と同様の方法で行った。その結果は表２のようになった。

さらに、処理したサンプルのうち、０（処理なし）または５分、もしくは２４時間ＵＶ照射したサンプル及び３７℃で一晩静置したサンプルを、ショ糖密度勾配遠心により分画し、そのＨＣＶタンパク質とＲＮＡの分布の乖離が起こっているか確認することにより粒子構造の保持を検討した。

ショ糖密度勾配遠心は、６０％〜１０％の範囲のショ糖溶液を用いて検討した。遠心条件は、２００，０００ ｘ ｇ、１６時間で行った。各フラクションの密度は図１のようになった。Ｃ型肝炎ウイルスＲＮＡコピー数は図２のようになった。ＲＮＡコピー数の測定方法はＴａｋｅｕｃｈｉらの方法（Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ（１９９９）１１６：ｐ６３６−４２．）に準じて行った。Ｃ型肝炎ウイルスのコアタンパク質量は図３のようになった。コアタンパク質の量はオーソ ＨＣＶ抗原ＥＬＩＳＡテスト（オーソ・クリニカル・ダイアグノスティックス社）を用いて測定した。総タンパク質量は図４のようになった。総タンパク質量は、バイオラド社のプロテインアッセイシステム（Ｃａｔ．Ｎｏ．５００−０００１）を用いて測定をした。

ＵＶ５分間処理ではウイルスのＲＮＡが分解されているが、Ｃ型肝炎ウイルスのコア及びＲＮＡの分布はほぼ変化が見られていない。しかし、３７℃ 一晩静置した場合はコア量ＲＮＡ量ともに減少しているが、ＲＮＡの分布が変化しておりウイルス粒子が壊れていることが考えられる。

図１は、実施例においてショ糖密度勾配遠心により分画した各フラクションの密度を示す図である。 図２は、実施例においてショ糖密度勾配遠心により分画した各フラクションに含まれるＣ型肝炎ウイルスのＲＮＡコピー数を示す図である。 図３は、実施例においてショ糖密度勾配遠心により分画した各フラクションに含まれるＣ型肝炎ウイルスのコアタンパク質量を示す図である。 図４は、実施例においてショ糖密度勾配遠心により分画した各フラクションに含まれる総タンパク質量を示す図である。

符号の説明

図１〜図４において、黒丸は処理なし、黒四角はＵＶ５分照射、白丸はＵＶ２４時間照射、白四角は３７℃２４時間静置したサンプルの値を示している。

Claims (3)

1. ＵＶ−Ｃを照射することによるＣ型肝炎ウイルスの不活化方法。
2. ＵＶの強度が２０ｍＷ／ｃｍ^２である請求項１に記載の方法。
3. ＵＶの照射時間が１分以上である請求項１または２に記載の方法。

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