CN103534351A - 包含来自基因型1b的丙型肝炎病毒基因组的核酸的核酸构建物、和导入有该核酸构建物的丙型肝炎病毒基因组复制细胞、以及感染性丙型肝炎病毒颗粒的制备方法 - Google Patents

包含来自基因型1b的丙型肝炎病毒基因组的核酸的核酸构建物、和导入有该核酸构建物的丙型肝炎病毒基因组复制细胞、以及感染性丙型肝炎病毒颗粒的制备方法 Download PDF

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Abstract

提供来自新型的基因型1b的HCV的、自主复制能力优异的亚基因组复制子RNA(核酸)、以及自主复制能力和感染性HCV颗粒产生能力优异的全基因组复制子RNA(核酸)。特别是，提供来自从急性重症丙型肝炎患者体内分离的新型的基因型1b的HCV即NC1株的HCV基因组的亚基因组复制子RNA(核酸)和全基因组复制子RNA(核酸)。

Description

包含来自基因型1b的丙型肝炎病毒基因组的核酸的核酸构建物、和导入有该核酸构建物的丙型肝炎病毒基因组复制细胞、以及感染性丙型肝炎病毒颗粒的制备方法
技术领域
本发明涉及包含来自基因型1b的丙型肝炎病毒基因组的核酸构建物、和导入有该核酸构建物的丙型肝炎病毒基因组复制细胞、以及感染性丙型肝炎病毒颗粒的制备方法。
背景技术
在丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus；以下记作HCV)的基础研究和抗HCV药的开发研究中，可以高效率地扩增HCV的实验系统是必要不可缺少的。具体而言，在培养细胞中扩增HCV的系统或者在培养细胞中评价HCV的增殖的系统是必需的，认为如果可以构建这些系统，则上述研究就会取得飞跃性地进步。
已知HCV是属于黄病毒科的、以单(+)链有义RNA作为基因组的病毒，其成为丙型肝炎的病因。近年来，明确了HCV根据基因型或血清型分为多种类型，根据使用HCV株的核苷酸序列的Simmonds等人的系统分析法，已知HCV的基因型分为6个类型，并进一步将它们分为亚型(非专利文献1)。目前，关于HCV的多个基因型，其基因组全长的核苷酸序列也已经确定(非专利文献2～5)。
截至到近年，都无法使培养细胞感染HCV、或者使HCV基因组在培养细胞中复制，因此关于HCV的复制机制或感染机制的研究，必需进行使用黑猩猩作为实验动物的体内实验。但是，通过由作为基因型1b的HCV的Con1株(GenBank检索号AJ238799)、HCV-N株(GenBank检索号AF139594)和HCV-O株(GenBank检索号AB191333)以及作为基因型1a的HCV的H77c株(GenBank检索号AF011751)制作亚基因组复制子RNA，关于HCV的复制机制的研究，可以进行使用培养细胞的体外实验(专利文献1和非专利文献6～9)。这里，HCV的亚基因组复制子RNA是指包含一部分HCV基因组的RNA，其虽然不具有产生感染性HCV颗粒的能力，但将其导入到培养细胞中时，其可以自主复制来自HCV基因组的RNA。
另外，由作为基因型2a的HCV的JFH-1株制作亚基因组复制子RNA或在体外产生感染性HCV颗粒的全基因组复制子RNA，关于HCV的感染机制的研究，也可以进行使用培养细胞的体外实验(非专利文献10和11)。这里，HCV的全基因组复制子RNA是指，包含HCV基因组的全长即5’UTR、结构基因、非结构基因和3’UTR的RNA，将其导入到培养细胞中时，其可以自主复制来自HCV基因组的RNA。
Pietschmann等人使用基因型1b的Con1株和具有其复制增强突变(Replication enhancing mutation)的突变体的HCV全基因组复制子RNA，进行了关于感染性HCV颗粒的产生的研究。但是，病毒基因组的复制水平极低，当检测基因型1b的HCV颗粒时，必需在细胞培养系统中添加增强HCV的复制子RNA的复制的酪蛋白激酶I抑制剂，或者，必需在使用动物的体内系统中实施感染实验，这是现状(非专利文献12)。这意味着：在使用培养细胞的体外系统中具有产生感染性HCV颗粒的能力的RNA，目前只有来自基因型2a的JFH-1株的RNA；而为了得到HCV疫苗的原料而在体外系统中可以大量制备HCV颗粒的RNA，则限于来自JFH-1株的HCV或JFH-1株的全基因组复制子。
另一方面，目前对丙型肝炎的主要治疗是通过干扰素-α或干扰素-β的单独疗法和干扰素-α与嘌呤核苷衍生物即利巴韦林的联合疗法来进行的。但是，已知即使进行上述治疗，也仅在所有治疗者的约60%中确认到疗效，即使是表现出效果的患者，当其中止治疗时，有一半以上会再次复发。另外，已知干扰素的疗效与HCV的基因型有关，其对基因型1b效果低，而对基因型2a效果更高(非专利文献13)。虽然关于干扰素的疗效根据HCV的基因型而不同的原因尚未明确，但认为其原因之一在于：HCV的复制机制或复制效率存在差异。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特开2001-17187号公报；
非专利文献
非专利文献1：Simmonds等人，Hepatology，1994年，第10卷，第1321-1324页；
非专利文献2：Choo等人，Science，1989年，第244卷，第359-362页；
非专利文献3：Kato等人，J．Med．Virol.，1992年，第64卷，第334-339页；
非专利文献4：Okamoto等人，J．Gen Virol.，1992年，第73卷，第673-679页；
非专利文献5：Yoshioka等人，Hepatology，1992年，第16卷，第293-299页；
非专利文献6：Lomann等人，Science，1999年，第285卷，第110-113页；
非专利文献7：Blight等人，Science，2000年，第290卷，第1972-1974页；
非专利文献8：Friebe等人，J．Virol.，2001年，第75卷，第12047-12057页；
非专利文献9：Ikeda等人，J．Virol.，2002年，第76卷，第2997-3006页；
非专利文献10：Kato等人，Gastroenterology，2003年，第125卷，第1808-1817页；
非专利文献11：Wakita等人，Nature Medicine，2005年，第11卷，第791-796页；
非专利文献12：Pietschmann等人，PloS Pathog.，2009年，第5卷：e1000475；
非专利文献13：Mori等人，Biochem．Biophis．Res．Commun.，1992年，第183卷，第334-342页。
发明内容
发明所要解决的课题
但是，HCV的亚基因组复制子RNA只限于来自基因型1a、1b和2a的HCV株的几种，关于产生感染性HCV颗粒的全基因组复制子RNA，则只有来自基因型2a的JFH-1株的基因组或来自由来自与JFH-1株不同的株的结构基因和JFH-1株的非结构基因的嵌合组成的基因组的全基因组复制子RNA，所以难以查明HCV的基因型与HCV的复制机制或复制效率的关系，关于作为HCV疫苗的原料的、可以人工制备的HCV颗粒的种类，也只限于基因型2a，这是现状。
另外，在使用来自相同基因型的HCV的亚基因组复制子RNA或全基因组复制子RNA的研究中，无法在不同的基因型间比较HCV的复制机制或复制效率的差异，难以实施能够成为新型抗HCV药的靶的复制所必需的因子的鉴定、或者能够不依赖于复制机制或复制效率而发挥药效的抗HCV药的筛选，所以现实状况是：尚未找到开发针对干扰素的疗效低的基因型1b的HCV的抗HCV药的线索。
即，认为在HCV的研究领域和医疗领域，为了研究依赖于HCV的基因型的干扰素的药效机制或开发针对干扰素的疗效低的基因型1b的HCV的抗HCV药，强烈希望获得复制效率优异的基因型1b的HCV株和制作能够产生感染性HCV颗粒的全基因组复制子RNA。
因此，本发明的目的在于：提供新型的来自基因型1b的HCV的、自主复制能力优异的亚基因组复制子RNA、以及自主复制能力和感染性HCV颗粒产生能力优异的全基因组复制子RNA。
用于解决课题的方法
本发明人等将由从急性重症丙型肝炎患者体内分离的新型的基因型1b的HCV即NC1株的HCV基因组制作的HCV亚基因组复制子RNA导入培养细胞中，对自主复制的HCV亚基因组复制子RNA中发生的突变进行了深入研究，结果明确了自主复制能力显著提高的突变。接下来，制作导入有该突变的HCV全基因组复制子RNA，将该HCV全基因组复制子RNA导入培养细胞中，从而明确了具有HCV颗粒产生能力的突变。进一步发现了自主复制能力显著提高的该突变的组合，成功地制作了在培养细胞中高产感染性HCV颗粒的基因型1b的HCV全基因组复制子RNA(来自基因型1b的产生感染性HCV颗粒的全基因组复制子RNA)，从而完成了本发明。
即，本发明涉及下述[1]～[24]。
[1] 核酸，其包含序列表的SEQ ID NO: 1所示核苷酸序列(其中，当该核酸为RNA时，将SEQ ID NO: 1所示核苷酸序列中的胸腺嘧啶(t)理解成尿嘧啶(u))。
[2] 核酸，其是在上述[1]的核酸的核苷酸序列中具有突变的核酸，当以序列表的SEQ ID NO: 14所示氨基酸序列(由序列表的SEQ ID NO: 1所示核苷酸编号342～9374的序列编码的氨基酸序列)为基准时，具有引起下述(i)或(ii)的取代的突变：
(i) 第2197位的丝氨酸取代成酪氨酸；
(ii) 第2204位的丝氨酸取代成甘氨酸。
[3] 核酸，其是在上述[2]的核酸的核苷酸序列中具有突变的核酸，当以序列表的SEQ ID NO: 14所示氨基酸序列(由序列表的SEQ ID NO: 1所示核苷酸编号342～9374的序列编码的氨基酸序列)为基准时，具有引起下述(iii)的取代的突变：
(iii) 第1202位的谷氨酸取代成甘氨酸。
[4] 丙型肝炎病毒，其中含有上述[2]或[3]的核酸作为病毒基因组。
[5] 核酸，其从5’侧朝着3’侧依次包含来自两种以上的丙型肝炎病毒基因组的、分别编码核心蛋白、E1蛋白、E2蛋白、p7蛋白、NS2蛋白、NS3蛋白、NS4A蛋白、NS4B蛋白、NS5A蛋白和NS5B蛋白的核苷酸序列，其中，编码NS3蛋白、NS4A蛋白、NS4B蛋白、NS5A蛋白和NS5B蛋白的各核苷酸序列来自权利要求2或3所述的核酸。
[6] 上述[5]的核酸，其中，编码NS2蛋白的核苷酸序列的至少一部分来自上述[2]或[3]的核酸。
[7] 上述[5]或[6]的核酸，其中，在编码上述核心蛋白的核苷酸序列的5’侧包含丙型肝炎病毒基因组的5’非翻译区；
在编码上述NS5B蛋白的核苷酸序列的3’侧包含来自上述[2]或[3]的核酸的3’非翻译区。
[8] 上述[5]～[7]中任一项的核酸，其中，上述两种以上的丙型肝炎病毒基因组包含JFH-1株、J6CF株或TH株的基因组。
需要说明的是，在一实施方式中，上述[5]的核酸可以是包含嵌合型丙型肝炎病毒基因组的核酸，所述嵌合型丙型肝炎病毒基因组中，编码丙型肝炎病毒的现有株的核心蛋白、E1蛋白、E2蛋白和p7蛋白、
上述[4]的丙型肝炎病毒的NS2蛋白、丙型肝炎病毒的现有株的NS2蛋白、或上述[4]的丙型肝炎病毒的一部分NS2蛋白与丙型肝炎病毒的现有株的一部分NS2蛋白连接而成的嵌合型NS2蛋白、以及
上述[4]的丙型肝炎病毒的NS3蛋白、NS4A蛋白、NS4B蛋白、NS5A蛋白和NS5B蛋白的各核苷酸序列从5’侧朝着3’侧以编码核心蛋白、E1蛋白、E2蛋白、p7蛋白、NS2蛋白、NS3蛋白、NS4A蛋白、NS4B蛋白、NS5A蛋白和NS5B蛋白的核苷酸序列的顺序配置。
该核酸还优选：在编码上述核心蛋白的核苷酸序列的5’侧包含丙型肝炎病毒的现有株的病毒基因组的5’非翻译区、
在编码上述NS5B蛋白的核苷酸序列的3’侧包含上述[4]的丙型肝炎病毒的病毒基因组的3’非翻译区。关于这样的核酸，上述丙型肝炎病毒的现有株优选为JFH-1株、J6CF株或TH株。
[9] 丙型肝炎病毒，其中含有上述[5]～[8]中任一项的核酸作为病毒基因组。
需要说明的是，还优选包含上述[1]～[3]中任一项或上述[5]～[8]中任一项的核酸的丙型肝炎病毒基因组。
[10] 丙型肝炎病毒的全基因组复制子RNA，其包含上述[2]、[3]或上述[5]～[8]中任一项的核酸。
[11] 表达载体，其包含上述[2]、[3]或上述[5]～[8]中任一项的核酸。
[12] 细胞，该细胞被导入上述[2]、[3]或上述[5]～[8]中任一项所述的核酸或上述[10]的全基因组复制子RNA，或者被感染上述[4]或[9]的丙型肝炎病毒，而产生丙型肝炎病毒颗粒。
[13] 丙型肝炎病毒疫苗，其含有上述[4]或[9]的丙型肝炎病毒或其一部分。
[14] 丙型肝炎病毒的中和抗体，其将上述[4]或[9]的丙型肝炎病毒识别为抗原。
[15] 筛选抗丙型肝炎病毒物质的方法，该方法具备下述步骤：
培养步骤：在受检物质的存在下和不存在下，培养上述[12]的细胞、或者上述[4]或[9]的丙型肝炎病毒与丙型肝炎病毒敏感性细胞的混合物；
定量步骤：定量上述培养步骤中在培养物中得到的来自丙型肝炎病毒的RNA或丙型肝炎病毒颗粒的量；以及
评价步骤：上述定量步骤的结果，当在上述受检物质的存在下培养的培养物中检测到的来自丙型肝炎病毒的RNA或丙型肝炎病毒颗粒的量较在上述受检物质的不存在下培养的培养物中检测到的来自丙型肝炎病毒的RNA或丙型肝炎病毒颗粒的量少时，评价为上述受检物质具有抗丙型肝炎病毒活性。
[16] 核酸，其中含有：序列表的SEQ ID NO: 1的、由核苷酸编号1～341的序列组成的5’非翻译区、编码由核苷酸编号3420～5312的序列组成的NS3蛋白的核苷酸序列、编码由核苷酸编号5313～5474的序列组成的NS4A蛋白的核苷酸序列、编码由核苷酸编号5475～6257的序列组成的NS4B蛋白的核苷酸序列、编码由核苷酸编号6258～7598的序列组成的NS5A蛋白的核苷酸序列、编码由核苷酸编号7599～9374的序列组成的NS5B蛋白的核苷酸序列、和由核苷酸编号9375～9607的序列组成的3’非翻译区。
[17] 核酸，其是在上述[16]的核酸的核苷酸序列中具有突变的核酸，以序列表的SEQ ID NO: 14所示氨基酸序列(由序列表的SEQ ID NO: 1所示核苷酸编号342～9374的序列编码的氨基酸序列)为基准时，具有引起下述(a)～(e)的任意一个取代的突变：
(a) 第2197位的丝氨酸取代成酪氨酸；
(b) 第2204位的丝氨酸取代成甘氨酸；
(c) 第2197位的丝氨酸取代成酪氨酸和第1202位的谷氨酸取代成甘氨酸；
(d) 第2204位的丝氨酸取代成甘氨酸和第1202位的谷氨酸取代成甘氨酸；
(e) 第2161位的脯氨酸取代成精氨酸。
[18] 丙型肝炎病毒的亚基因组复制子RNA，其中包含上述[16]或[17]的核酸。
[19] 表达载体，其中包含上述[16]或[17]的核酸。
[20] 筛选抗丙型肝炎病毒物质的方法，该方法具备下述步骤：
培养步骤：在受检物质的存在下和不存在下，培养导入有上述[18]的亚基因组复制子RNA的丙型肝炎病毒敏感性细胞；
定量步骤：定量上述培养步骤中在培养物中得到的亚基因组复制子RNA的量；以及
评价步骤：上述定量步骤的结果，当在上述受检物质的存在下培养的培养物中检测到的亚基因组复制子RNA的量较在上述受检物质的不存在下培养的培养物中检测到的亚基因组复制子RNA的量少时，评价为上述受检物质具有抗丙型肝炎病毒活性。
[21] 上述[13]的丙型肝炎病毒疫苗，该疫苗使上述丙型肝炎病毒失活或减毒。
[22] 丙型肝炎病毒感染细胞，该细胞感染了上述[4]或[9]的丙型肝炎病毒。
[23] 上述[2]的核酸，该核酸是由SEQ ID NO: 19所示的具有引起第2197位的丝氨酸取代成酪氨酸的取代的突变的核苷酸序列组成的核酸、或者由SEQ ID NO: 20所示的具有引起第2204位的丝氨酸取代成甘氨酸的取代的突变的核苷酸序列组成的核酸。
[24] 上述[3]的核酸，该核酸是由SEQ ID NO: 21所示的具有引起第2197位的丝氨酸取代成酪氨酸的取代的突变和引起第1202位的谷氨酸取代成甘氨酸的取代的突变的核苷酸序列组成的核酸、或者由SEQ ID NO: 22所示的具有引起第2204位的丝氨酸取代成甘氨酸的取代的突变和引起第1202位的谷氨酸取代成甘氨酸的取代的突变的核苷酸序列组成的核酸。
本说明书包含作为本申请的优先权基础的日本国专利申请2011-080678号的说明书和附图中记载的内容。
发明效果
根据本发明，可以提供在培养细胞中可以扩增的基因型1b的HCV亚基因组复制子RNA和产生感染性HCV颗粒的HCV全基因组复制子RNA，可以在抑制基因型1b的HCV的感染和复制的抗HCV药的筛选、或者用于解明HCV的复制机制的研究、以及使用了HCV颗粒的HCV疫苗的开发中应用。
附图说明
图1是显示HCV NC1株(野生型)的全长基因组(A)、用于合成NC1株的HCV全基因组复制子RNA的表达载体pNC1的结构(B)、用于合成NC1株的HCV亚基因组复制子RNA的表达载体pSGR-NC1的结构(C)和通过T7聚合酶由pSGR-NC1合成的NC1株的HCV亚基因组复制子RNA的结构(D)的图；
图2显示导入了野生型NC1株的HCV亚基因组复制子RNA的细胞的集落形成的结果；
图3是在pSGR-NC1上显示从野生型NC1株的HCV亚基因组复制子复制细胞中鉴定的氨基酸取代(突变)的位置的图；
图4是显示用于合成突变体NC1株的HCV亚基因组复制子RNA的表达载体的结构的图；
图5显示导入了野生型NC1株及其突变体的HCV亚基因组复制子RNA的细胞的集落形成的结果；
图6是显示用于合成突变体NC1株的HCV全基因组复制子RNA的表达载体的结构的图；
图7是显示导入了野生型NC1株的HCV全基因组复制子RNA及其突变体(P2161R、R2192L、R2192Q、S2197Y、S2204G、Y2871C突变)的Huh7细胞的培养上清中的核心蛋白量随时间的变化(HCV颗粒产生能力)的图；
图8是显示作为突变体NC1株的HCV全基因组复制子RNA的表达载体的pNC1 E1202G/S2197Y、pNC1 K2040R/S2197Y和pNC1 E1202G/K2040R/S2197Y的结构的图；
图9是显示作为突变体NC1株的HCV全基因组复制子RNA的表达载体的pNC1 E1202G/S2204G、pNC1 K2040R/S2204G和pNC1 E1202G/K2040R/S2204G的结构的图；
图10是显示导入了野生型NC1株的HCV全基因组复制子RNA及其突变体(E1202G、K2040R、S2197Y和S2204G突变以及其组合突变)的Huh7细胞内的核心蛋白量随时间的变化(HCV复制能力)的图；
图11是显示导入了野生型NC1株的HCV全基因组复制子RNA及其突变体(E1202G、K2040R、S2197Y和S2204G突变以及其组合突变)的Huh7细胞的培养上清中的核心蛋白量随时间的变化(HCV颗粒产生能力)的图；
图12是显示NC1株突变体(导入了适应性突变的NC1株)、J6CF株、JFH-1株和TH株的HCV的HCV基因组的结构、以及包含NC1株突变体(导入了适应性突变的NC1株)的非结构基因和J6CF株、JFH-1株或TH株的结构基因的嵌合型HCV基因组的结构的图。
具体实施方式
本说明书中使用的科学用语、技术用语和命名法，只要没有特别定义，则具有与本领域技术人员通常所理解的意义相同的意义。另外，关于分子生物学和免疫学领域中的一般性技术和学术用语，是基于Sambrook等人的Molecular Cloning：A Laboratory Manual(第3版，2001年)和Ed Harlow等人的Antibodies：A Laboratory Manual(1988年)中记载的方法和定义。而且，本说明书中引用的所有出版物、专利和专利申请，其全体作为参考而引用到本说明书中。
(1) 本发明的核酸和HCV(丙型肝炎病毒)复制子RNA
“核酸”包含RNA和DNA。另外，本说明书中的“蛋白编码区”、“编码蛋白的核苷酸序列”、“编码蛋白的序列”和“蛋白编码序列”是指编码规定的蛋白的氨基酸序列的核苷酸序列，可以包含也可以不包含起始密码子和终止密码子。
在本说明书中，当核酸为RNA时，引用序列表的SEQ ID NO来特定RNA的核苷酸序列或核苷酸时，该SEQ ID NO所示核苷酸序列中的胸腺嘧啶(t)理解成尿嘧啶(u)。
HCV是以单(+)链有义RNA作为基因组的病毒，其基因组由5’非翻译区(以下记作5’UTR)、结构基因、非结构基因和3’非翻译区(以下记作3’UTR)组成。关于HCV，作为其实际形态，以病毒颗粒的形式存在。HCV的病毒颗粒(HCV颗粒)在形成HCV颗粒的“结构蛋白”的内部含有HCV基因组。
HCV的“结构基因”是指，编码具有构成HCV颗粒的特定结构功能的结构蛋白的核酸。“结构蛋白”是指核心蛋白、E1蛋白、E2蛋白和p7蛋白。
HCV的“非结构基因”是指，编码具有参与HCV基因组的复制、HCV蛋白的加工等的功能的非结构蛋白的核酸。“非结构蛋白”是指NS2蛋白、NS3蛋白、NS4A蛋白、NS4B蛋白、NS5A蛋白和NS5B蛋白。
HCV的5’UTR提供用于蛋白翻译的内部核糖体进入位点(以下记作IRES)和复制所必需的元件。HCV的5’UTR是指从基因组的5’末端起约340个核苷酸的区域。
HCV的3’UTR辅助HCV的复制。HCV的3’UTR包含polyU区和约100个核苷酸的追加区。
“复制子RNA”是指在HCV敏感性细胞内自主复制的RNA。复制子RNA被导入细胞中时，RNA自主复制，复制的RNA的拷贝在细胞分裂后分离成子细胞时，能够在RNA中稳定存在。HCV的复制子RNA(HCV复制子RNA)是指包含HCV基因组RNA的一部分或全长的、自主复制的RNA，包含HCV亚基因组复制子RNA和HCV全基因组复制子RNA。
“HCV全长基因组”是指从5’侧到3’侧依次由HCV的5’UTR、结构基因、非结构基因和3’UTR的全长基因组的序列组成的RNA。“HCV的亚基因组”是指包含一部分HCV全长基因组的RNA。特别是，“HCV亚基因组复制子RNA”是指包含HCV的5’UTR、一部分非结构基因和3’UTR的RNA，该RNA虽然不具有产生感染性HCV颗粒的能力，但将其导入细胞时，可以自主复制来自HCV基因组的RNA。
当HCV全长基因组具有自主复制能力时，该基因组就是复制子RNA。为了与亚基因组复制子RNA进行区别，将包含HCV全长基因组的复制子RNA称作HCV全基因组复制子RNA。因此，由HCV全长基因组序列组成的RNA(HCV全长基因组RNA)具有自主复制能力时，其就是HCV全基因组复制子RNA。即，“HCV全基因组复制子RNA”是指包含HCV的5’UTR、结构基因、非结构基因和3’UTR的RNA，优选为包含HCV的5’UTR、编码核心蛋白、E1蛋白、E2蛋白、p7蛋白、NS2蛋白、NS3蛋白、NS4A蛋白、NS4B蛋白、NS5A蛋白和NS5B蛋白的序列以及3’UTR的RNA。HCV全基因组复制子RNA进一步优选为：从5’侧到3’侧依次包含HCV的5’UTR、编码核心蛋白、E1蛋白、E2蛋白、p7蛋白、NS2蛋白、NS3蛋白、NS4A蛋白、NS4B蛋白、NS5A蛋白和NS5B蛋白的序列以及3’UTR的RNA。
HCV全基因组复制子RNA可以进一步包含抗药性基因或/和报道基因等外来基因、IRES序列。包含外来基因和IRES序列时，HCV全基因组复制子RNA优选为从5’侧到3’侧依次包含HCV的5’UTR、外来基因、IRES序列、编码HCV的核心蛋白、E1蛋白、E2蛋白、p7蛋白、NS2蛋白、NS3蛋白、NS4A蛋白、NS4B蛋白、NS5A蛋白和NS5B蛋白的序列、以及HCV的3’UTR的RNA。
HCV亚基因组复制子RNA优选为包含HCV的5’UTR、编码NS3蛋白、NS4A蛋白、NS4B蛋白、NS5A蛋白和NS5B蛋白的序列以及3’UTR的RNA。HCV亚基因组复制子RNA进一步优选为从5’侧到3’侧依次包含HCV的5’UTR、编码NS3蛋白、NS4A蛋白、NS4B蛋白、NS5A蛋白和NS5B蛋白的序列以及3’UTR的RNA。
另外，HCV亚基因组复制子RNA可以进一步包含抗药性基因或/和报道基因等外来基因、IRES序列。特别是，在抗HCV物质的筛选中使用HCV亚基因组复制子RNA时，为了容易检测复制子RNA，优选包含抗药性基因或/和报道基因和IRES序列。包含外来基因和IRES序列时，HCV亚基因组复制子RNA优选为从5’侧到3’侧依次包含HCV的5’UTR、外来基因、IRES序列、编码HCV的NS3蛋白、NS4A蛋白、NS4B蛋白、NS5A蛋白和NS5B蛋白的序列以及HCV的3’UTR的RNA。
作为HCV复制子RNA(HCV全基因组复制子RNA和HCV亚基因组复制子RNA)所能包含的抗药性基因的例子，可以列举：新霉素抗性基因、潮霉素抗性基因、胸苷激酶基因、卡那霉素抗性基因、吡啶硫胺素抗性基因、腺苷酰转移酶基因、博莱霉素抗性基因、嘌呤霉素抗性基因等，但优选新霉素抗性基因、潮霉素抗性基因，进一步优选新霉素抗性基因。
作为HCV复制子RNA所能包含的报道基因的例子，可以列举：催化发光反应或显色反应的酶的结构基因。作为优选的报道基因的例子，可以列举：来自转座子Tn9的氯霉素乙酰转移酶基因、来自大肠杆菌的β葡糖苷酸酶或β半乳糖苷酶基因、萤光素酶基因、绿色荧光蛋白基因、来自水母的水母发光蛋白基因、分泌型胎盘碱性磷酸酶(SEAP)基因等。
在HCV复制子RNA中，可以只包含抗药性基因或报道基因中的任意一种，也可以包含两者。在HCV复制子RNA中，可以包含1个、也可以包含2个以上的抗药性基因或报道基因。
HCV复制子RNA所能包含的IRES序列是指，在RNA的内部可以结合核糖体并开始翻译的内部核糖体结合位点。作为IRES序列的优选的例子，可以列举EMCV IRES(脑心肌炎病毒的内部核糖体结合位点)、FMDV IRES、HCV IRES等，更优选EMCV IRES和HCV IRES，最优选EMCV IRES。
在HCV复制子RNA中，抗药性基因和/或报道基因以从HCV复制子RNA起按照正确的读框(符合读框的)进行翻译的方式进行连接。HCV复制子RNA所编码的蛋白，优选作为一系列的多肽被翻译、表达后，通过蛋白酶切断成各蛋白，以游离的方式经由蛋白酶切位点等彼此连接。
HCV敏感性细胞是指，在细胞培养系统中接受HCV颗粒的感染或HCV复制子RNA的复制的细胞，可以列举：Huh7细胞、HepG2细胞、IMY-N9细胞、HeLa细胞、293细胞或作为Huh7细胞的衍生株的Huh7.5细胞、Huh7.5.1细胞。另外，还可以列举：使CD81基因和/或Claudin1基因在Huh7细胞、HepG2细胞、IMY-N9细胞、HeLa细胞或293细胞中表达的细胞(Lindenbach，B．D．等人，Science，2005年，第309卷，第623-626页；Evans，M．J．等人，Nature，2007年，第446卷，第801-805页；Akazawa，D．等人，J．Virol．，2007年，第81卷，第5036-5045页)。其中，特别优选使用Huh7细胞或Huh7细胞的衍生株。需要说明的是，在本发明中，“衍生株”是指由该细胞衍生的株。
将可以翻译HCV全长基因组的一系列的核心蛋白、E1蛋白、E2蛋白、p7蛋白、NS2蛋白、NS3蛋白、NS4A蛋白、NS4B蛋白、NS5A蛋白和NS5B蛋白称为HCV前体蛋白。HCV的核心蛋白、E1蛋白、E2蛋白、p7蛋白、NS2蛋白、NS3蛋白、NS4A蛋白、NS4B蛋白、NS5A蛋白和NS5B蛋白是通过用细胞内的蛋白酶和病毒的蛋白酶切断该HCV前体蛋白而生成的。
在本说明书中，SEQ ID NO所示氨基酸序列上的氨基酸的位置，是通过“以SEQ ID NO: 14所示氨基酸序列为基准时…第“X”位的(氨基酸)”的记载来表示。该记载的意思是指，该氨基酸是在SEQ ID NO: 14所示氨基酸序列中以N末端的第1个氨基酸(甲硫氨酸)作为第1位时位于第“X”位的氨基酸残基。采用“以SEQ ID NO: 14所示氨基酸序列为基准时第“X”位的(氨基酸)”的表达方式，指定SEQ ID NO: 14以外的氨基酸序列中的氨基酸时，该指定的氨基酸在该氨基酸序列中存在的实际位置可以是该第“X”位，但只要是与SEQ ID NO: 14的第“X”位的氨基酸比对的氨基酸，也可以不是第“X”位。
另外，在本说明书中，例如，氨基酸突变S2197Y是指，第2197位的氨基酸残基由S(丝氨酸)取代成Y(酪氨酸)的突变。表示其他的氨基酸突变的表记也同样理解。需要说明的是，这里，氨基酸通过生物学领域通常使用的氨基酸的单字母表记(Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual Second Edition，1989年)来记载。
在本说明书中，用生物学领域通常使用的氨基酸的单字母表记或3字母表记来记载氨基酸或氨基酸残基，其还包含接受了氢氧化、糖链添加、硫酸化等翻译后修饰的氨基酸。
另外，在本说明书中，关于SEQ ID NO所示核苷酸序列的核苷酸编号，在SEQ ID NO所示核苷酸序列中，是以5’末端的第1核苷酸作为第1位附上核苷酸编号的编号为基准。
在优选实施方式中，本发明提供：包含序列表的SEQ ID NO: 1所示核苷酸序列的核酸(其中，当该核酸为RNA时，将SEQ ID NO: 1所示核苷酸序列中的胸腺嘧啶(t)理解成尿嘧啶(u))。该核酸包含丙型肝炎病毒的全基因组(全长基因组)序列，即，从5’侧朝着3’侧依次包含：丙型肝炎病毒基因组的5’非翻译区；分别编码核心蛋白、E1蛋白、E2蛋白、p7蛋白、NS2蛋白、NS3蛋白、NS4A蛋白、NS4B蛋白、NS5A蛋白和NS5B蛋白的核苷酸序列；以及5’非翻译区。本发明还提供该核酸的突变体，即以序列表的SEQ ID NO: 14所示氨基酸序列(由序列表的SEQ ID NO: 1所示核苷酸编号342～9374的序列编码的氨基酸序列)为基准时，具有引起(i)第2197位的丝氨酸取代成酪氨酸或(ii)第2204位的丝氨酸取代成甘氨酸的取代的突变的核酸。上述的SEQ ID NO: 1的核酸或其突变体，当以序列表的SEQ ID NO: 14所示氨基酸序列(由序列表的SEQ ID NO: 1所示核苷酸编号342～9374的序列编码的氨基酸序列)为基准时，可以进一步具有引起(iii)第1202位的谷氨酸取代成甘氨酸的取代的突变。上述的核酸优选为分离的核酸。
作为这样的核酸的优选例子，并不限于下述核酸，可以列举：包含SEQ ID NO: 19、SEQ ID NO: 20、SEQ ID NO: 21或SEQ ID NO: 22所示核苷酸序列的核酸。
这些核酸可以是DNA或RNA。这些核酸可以是全基因组复制子RNA。作为DNA的这些核酸，还可以作为用于制作全基因组复制子RNA的模板来使用。
在优选的另一实施方式中，本发明还提供核酸(嵌合核酸)，该核酸从5’侧朝着3’侧依次包含来自两种以上的丙型肝炎病毒基因组的、分别编码核心蛋白、E1蛋白、E2蛋白、p7蛋白、NS2蛋白、NS3蛋白、NS4A蛋白、NS4B蛋白、NS5A蛋白和NS5B蛋白的核苷酸序列，其中，编码NS3蛋白、NS4A蛋白、NS4B蛋白、NS5A蛋白和NS5B蛋白的各核苷酸序列是来自上述的SEQ ID NO: 1的核酸或其突变体的核苷酸序列。而且，在这样的核酸中，还优选编码NS2蛋白的核苷酸序列的至少一部分来自上述的SEQ ID NO: 1的核酸或其突变体的核酸。这些核酸还优选在编码核心蛋白的核苷酸序列的5’侧包含丙型肝炎病毒(优选丙型肝炎病毒的现有株)的病毒基因组的5’非翻译区，并且，在编码NS5B蛋白的核苷酸序列的3’侧包含来自上述的SEQ ID NO: 1的核酸或其突变体(本发明的丙型肝炎病毒的基因组)的3’非翻译区。另外，上述两种以上的丙型肝炎病毒基因组优选包含：丙型肝炎病毒的现有株的基因组，例如除上述的SEQ ID NO: 1的核酸及其突变体以外的丙型肝炎病毒基因组核酸，优选JFH-1株、J6CF株或TH株的基因组。
这样的本发明的核酸的一实施方式可以是包含嵌合型丙型肝炎病毒基因组的核酸，所述嵌合型丙型肝炎病毒基因组中，
编码丙型肝炎病毒的现有株的核心蛋白、E1蛋白、E2蛋白和p7蛋白、
具有上述SEQ ID NO: 1的核酸或其突变体作为病毒基因组的丙型肝炎病毒的NS2蛋白、丙型肝炎病毒的现有株的NS2蛋白、或具有上述SEQ ID NO: 1的核酸或其突变体作为病毒基因组的丙型肝炎病毒的一部分NS2蛋白与丙型肝炎病毒的现有株的一部分NS2蛋白连接而成的嵌合型NS2蛋白、以及
具有上述SEQ ID NO: 1的核酸或其突变体作为病毒基因组的丙型肝炎病毒的NS3蛋白、NS4A蛋白、NS4B蛋白、NS5A蛋白和NS5B蛋白的各核苷酸序列，从5’侧朝着3’侧以编码核心蛋白、E1蛋白、E2蛋白、p7蛋白、NS2蛋白、NS3蛋白、NS4A蛋白、NS4B蛋白、NS5A蛋白和NS5B蛋白的核苷酸序列的顺序配置。
这些核酸可以是DNA或RNA。这些核酸可以是全基因组复制子RNA。作为DNA的这些核酸还可以作为用于制作全基因组复制子RNA的模板来使用。
在优选的一实施方式中，本发明还提供核酸，该核酸包含序列表的SEQ ID NO: 1的、由核苷酸编号1～341的序列组成的5’非翻译区、编码由核苷酸编号3420～5312的序列组成的NS3蛋白的核苷酸序列、编码由核苷酸编号5313～5474的序列组成的NS4A蛋白的核苷酸序列、编码由核苷酸编号5475～6257的序列组成的NS4B蛋白的核苷酸序列、编码由核苷酸编号6258～7598的序列组成的NS5A蛋白的核苷酸序列、编码由核苷酸编号7599～9374的序列组成的NS5B蛋白的核苷酸序列、以及由核苷酸编号9375～9607的序列组成的3’非翻译区。而且，本发明还提供核酸，其为该核酸的突变体，即以序列表的SEQ ID NO: 14所示氨基酸序列(由序列表的SEQ ID NO: 1所示核苷酸编号342～9374的序列编码的氨基酸序列)为基准时，具有引起选自下述(a)～(e)的取代的突变：(a)第2197位的丝氨酸取代成酪氨酸、(b)第2204位的丝氨酸取代成甘氨酸、(c)第2197位的丝氨酸取代成酪氨酸和第1202位的谷氨酸取代成甘氨酸、(d)第2204位的丝氨酸取代成甘氨酸和第1202位的谷氨酸取代成甘氨酸、以及(e)第2161位的脯氨酸取代成精氨酸。
作为这样的核酸的优选例子，并不限于下述核酸，可以列举：包含SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 18和SEQ ID NO: 52所示核苷酸序列的核酸。
这些核酸可以是DNA或RNA。这些核酸包含HCV亚基因组序列，例如可以是亚基因组复制子RNA。作为DNA的这些核酸还可以作为用于制作亚基因组复制子RNA的模板来使用。
(2) 在培养细胞中复制有所提高的HCV亚基因组复制子RNA的获得
由序列表的SEQ ID NO: 1的核苷酸序列组成的核酸，是从急性重症丙型肝炎患者体内分离的新型的基因型1b的HCV即NC1株的全长基因组核酸。该序列可以是野生型NC1株的全长基因组RNA的cDNA序列，但将该核苷酸序列中的胸腺嘧啶(t)理解成尿嘧啶(u)的序列是RNA序列。从患者体内分离HCV基因组的方法记载在Kato，T等人，Gastroenterology，2003年，第125卷，第1808-1817页中。
上述的NC1株的全长HCV基因组(SEQ ID NO: 1)的5’UTR由SEQ ID NO: 1的核苷酸编号1～341的序列组成，核心蛋白编码序列由SEQ ID NO: 1的核苷酸编号342～914的序列组成，E1蛋白编码序列由SEQ ID NO: 1的核苷酸编号915～1490的序列组成，E2蛋白编码序列由SEQ ID NO: 1的核苷酸编号1491～2579的序列组成，p7蛋白编码序列由SEQ ID NO: 1的核苷酸编号2580～2768的序列组成，NS2蛋白编码序列由SEQ ID NO: 1的核苷酸编号2769～3419的序列组成，NS3蛋白编码序列由SEQ ID NO: 1的核苷酸编号3420～5312的序列组成，NS4A蛋白编码序列由SEQ ID NO: 1的核苷酸编号5313～5474的序列组成，NS4B蛋白编码序列由SEQ ID NO: 1的核苷酸编号5475～6257的序列组成，NS5A蛋白编码序列由SEQ ID NO: 1的核苷酸编号6258～7598的序列组成，NS5B蛋白编码序列由SEQ ID NO: 1的核苷酸编号7599～9374的序列组成，3’UTR由SEQ ID NO: 1的核苷酸编号9375～9607的序列组成。该NC1株的全长HCV基因组的结构见图1A。
具体而言，NC1株的全长HCV基因组(SEQ ID NO: 1)的5’UTR由SEQ ID NO: 2所示核苷酸序列组成，核心蛋白编码序列由SEQ ID NO: 3所示核苷酸序列组成，E1蛋白编码序列由SEQ ID NO: 4所示核苷酸序列组成，E2蛋白编码序列由SEQ ID NO: 5所示核苷酸序列组成，p7蛋白编码序列由SEQ ID NO: 6所示核苷酸序列组成，NS2蛋白编码序列由SEQ ID NO: 7所示核苷酸序列组成，NS3蛋白编码序列由SEQ ID NO: 8所示核苷酸序列组成，NS4A蛋白编码序列由SEQ ID NO: 9所示核苷酸序列组成，NS4B蛋白编码序列由SEQ ID NO: 10所示核苷酸序列组成，NS5A蛋白编码序列由SEQ ID NO: 11所示核苷酸序列组成，NS5B蛋白编码序列由SEQ ID NO: 12所示核苷酸序列组成，3’UTR由SEQ ID NO: 13所示核苷酸序列组成。
关于HCV亚基因组复制子RNA，可以通过由表达载体转录而获得。与HCV亚基因组复制子RNA制作用表达载体的构建有关的基本技术记载在Lohmann V等人，Science，1999年，第285卷，第110-113页和Kato，T等人，Gastroenterology，2003年，第125卷，第1808-1817页中。具体而言，例如，将从5’到3’的方向5’UTR、编码核心蛋白的区的36个核苷酸、外来基因(抗药性基因或报道基因)、EMCV IRES序列、编码NS3蛋白、NS4A蛋白、NS4B蛋白、NS5A蛋白、NS5B蛋白的核苷酸序列和3’UTR依次连接而成的cDNA插入T7启动子的下游，可以构建HCV亚基因组复制子RNA制作用表达载体。需要说明的是，在各核苷酸序列的连接中，连接位点上可以包含限制酶位点等添加序列。
上述的HCV亚基因组复制子RNA，可以通过聚合酶由所构建的HCV亚基因组复制子RNA制作用表达载体来合成。例如，作为在T7启动子的控制下，以将HCV cDNA克隆化了的核酸为模板，在体外制作RNA的方法，可以列举：利用MEGAscript T7试剂盒(Ambion公司)等进行的合成。由该载体转录的HCV亚基因组复制子RNA被导入到细胞内时进行自主复制。本发明包含导入了HCV亚基因组复制子RNA的细胞。
作为启动子，不仅使用T7启动子，还可以使用SP6启动子、T3启动子等，但优选T7启动子。
作为载体，可以使用pUC19(TaKaRa公司)、pBR322(TaKaRa公司)、pGEM-T、pGEM-T Easy、pGEM-3Z(均为Promega公司)、pSP72(Promega公司)、pCRII(Invitrogen公司)、pT7Blue(Novagen公司)等。
作为导入HCV亚基因组复制子RNA的细胞，只要是接受HCV亚基因组复制子RNA的复制的细胞即可，可以列举上述的HCV敏感性细胞。特别优选使用Huh7细胞或Huh7细胞的衍生株。
作为将HCV亚基因组复制子RNA导入到细胞中的方法，可以采用公知的任意方法。例如，可以列举：磷酸钙共沉淀法、DEAE葡聚糖法、脂质转染法、显微注射法、电穿孔法，但优选列举脂质转染法和电穿孔法，进一步优选列举电穿孔法。
作为评价导入的HCV亚基因组复制子RNA的复制能力的方法，可以列举测定与HCV亚基因组复制子RNA连接的外来基因的功能、即通过该基因的表达而表现出的功能。外来基因为抗药性基因时，通过计测在含药的选择培养基中增殖的细胞数或细胞的集落数，可以评价HCV亚基因组复制子RNA的复制能力。此时，细胞数或细胞的集落数越多，则可以评价为复制能力越高。外来基因是酶时，通过测定其酶活性，可以评价HCV亚基因组复制子RNA的复制能力。此时，酶活性越高，则可以评价为复制能力越高。另外，作为其他的方法，通过对利用定量RT-PCR复制的RNA的量进行定量，也可以直接评价HCV亚基因组复制子RNA的复制能力。
研究显示：在HCV基因组的有效率的复制中，必需在基因组的核苷酸序列中发生突变(Lohmann，V．等人，J．Virol．，2001年，第75卷，第1437-1449页)。将提高复制能力的突变称为适应性突变(adaptive mutation)。通过继代培养导入有通过上述制作的HCV亚基因组复制子RNA的细胞，有时可以得到HCV亚基因组复制子RNA的复制提高的细胞株。通过继续进行细胞培养，有时会在HCV基因组中发生适应性突变，复制显著提高。
作为适应性突变的例子，可以列举：基因型2a的JFH-1株的适应性突变和由基因型1a的H77株和JFH-1株组成的嵌合HCV颗粒的适应性突变(Zhong，J．等人，J．Virol．，2006年，第80卷，第11082-11093页；Kaul，A．等人，J．Virol．，2007年，第81卷，第2313168-2313179页；国际公开第08/147735号；国际公开第09/001975号；MinKyung，Y．等人，J．Virol．，2007年，第81卷，第629-638页)。但是，通过适应性突变的组合，显示出RNA复制的效率达到200倍以上、或者反之还达到1/5以下，并不是只增加适应性突变的数即可(Lohmann，V．等人，J．Virol．，2003年，第77卷，第3007-3019页)。另外，若HCV株不同，则适应性突变的效果也不同，所以适应性突变是通过何种理由对HCV基因组的复制效率产生影响的细节尚不清楚。
因此，认为所接受的突变根据病毒的株、HCV的基因组的设计(构建物)、实验条件而不同。因此，为了确定可接受的突变，必需对每一个所期望的构建物进行实验，获得可接受的突变体。另外，在由核酸的核苷酸突变引起的1个氨基酸的突变中，复制能力或HCV颗粒产生能力会发生大的变化。利用杂交技术无法检测1个氨基酸突变所对应的核酸的突变，所以为了检测1个氨基酸的突变，必需对HCV基因组的核苷酸序列进行测序。从HCV亚基因组复制子RNA的复制提高的细胞株中分离HCV基因组RNA，确定其核苷酸序列，由此可以明确HCV亚基因组复制子RNA的复制提高的HCV基因组序列。
为了确认HCV基因组RNA的突变与HCV复制能力有关，向野生型HCV基因组(没有突变的HCV基因组)中导入该突变，只要确认HCV复制能力的变化得以重现即可。关于HCV基因组RNA的突变对使用的HCV基因组是特异性的、或者对其他的HCV基因组也有效，也可以向野生型HCV基因组中导入该突变来进行确认。
向野生型HCV基因组中导入突变时，可以使用PCR法或市售的突变导入试剂盒(例如，东洋纺公司制的KOD-Plus-诱变试剂盒等)。作为PCR法，例如，以将野生型HCV基因组RNA的cDNA克隆化了的载体为模板，使用由该cDNA的序列设计的正向和反向引物进行PCR，从而可以扩增目标序列部分。具体而言，合成几种彼此具有重复序列的不同的PCR产物，将这些PCR产物混合，以其为模板，使用包含目标核酸的5’端的正向引物和包含该核酸的互补链的5’端的反向引物进行PCR，从而可以扩增该目标核酸。合成的核酸的各末端用限制酶切断，与将用相同的酶切断的野生型HCV基因组RNA的cDNA克隆化了的载体连接。上述操作的基本技术例如记载在国际公开第04/104198号、国际公开第06/022422号、Wakita，T．等人，2005年，Nat．Med．，第11号，第791-796页和Lindenbach，B．D．等人，2005年，Science，第309号，第623-626中。
将HCV作为10种病毒蛋白(核心蛋白、E1蛋白、E2蛋白、p7蛋白、NS2蛋白、NS3蛋白、NS4A蛋白、NS4B蛋白、NS5A蛋白和NS5B蛋白)依次连接而成的1个前体蛋白来翻译，之后，利用细胞内和病毒的蛋白酶，分别形成10种病毒蛋白(核心蛋白、E1蛋白、E2蛋白、p7蛋白、NS2蛋白、NS3蛋白、NS4A蛋白、NS4B蛋白、NS5A蛋白和NS5B蛋白)。NC1株的前体蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO: 14所示。SEQ ID NO: 14所示NC1株的前体蛋白的氨基酸序列，是通过由SEQ ID NO: 1所示野生型NC1株的全长基因组RNA的cDNA序列的核苷酸编号342～9374(包含终止密码子)的序列组成的部分的序列编码的。在本发明中，关于HCV蛋白的氨基酸的突变的位置，是以作为前体蛋白的翻译起始位点的甲硫氨酸(M)作为第1位，附上氨基酸编号的位置为基准。即，以SEQ ID NO: 14所示前体蛋白的氨基酸序列为基准，由该氨基酸序列中的位置确定显示出突变的氨基酸的编号。例如，NC1株的蛋白由从翻译起始位点的甲硫氨酸数起直至第3010位的精氨酸(R)的3010个残基的氨基酸组成(SEQ ID NO: 14)。NC1株的第2197位的氨基酸是NS5A蛋白中所含的丝氨酸(S)，当丝氨酸(S)突变成酪氨酸(Y)时，可以表示为S2197Y、2197SY或2197S→Y。S2197Y等虽然显示特定位置的氨基酸的突变，但在本说明书中，S2197Y等显示突变的记载也显示编码其突变氨基酸的核酸中的突变。例如，核酸的核苷酸发生突变，原来的核酸编码的氨基酸序列中的第2197位的丝氨酸(S)取代成酪氨酸(Y)时，将编码具有该突变的氨基酸序列的核酸称为包含S2197Y突变的核酸或导入有S2197Y突变的核酸。另外，有时还将这些核酸的突变称为引起氨基酸序列中的S2197Y突变的核酸的突变。而且，例如有时将导入有S2197Y突变的HCV复制子RNA称为S2197Y突变体HCV复制子RNA。另外，同时具有2个突变时，例如，具有E1202G突变和S2197Y突变时，表述为包含E1202G/S2197Y的突变。带来特定的氨基酸突变的核苷酸的突变可以根据遗传密码来确定。
上述的NC1株的HCV亚基因组复制子RNA的复制能力提高的适应性突变是：P2161R(第2161位的脯氨酸(P)突变成精氨酸(R))、R2192L(第2192位的精氨酸(R)突变成亮氨酸(L))、R2192Q(第2192位的精氨酸(R)突变成谷氨酰胺(Q))、S2197Y(第2197位的丝氨酸(S)突变成酪氨酸(Y))、S2204G(第2204位的丝氨酸(S)突变成甘氨酸(G))、Y2871C(第2871位的酪氨酸(Y)突变成半胱氨酸(C))。通过将上述适应性突变单独或组合后导入HCV基因组中，可以获得复制能力提高的HCV亚基因组复制子RNA。另外，还可以进一步与公知文献(Krieger等人，J．Virol．，2001年，第75卷，第4614-4624页)的突变组合后导入。作为公知文献的突变，只要是通过与本发明中发现的突变组合，HCV亚基因组复制子RNA的复制能力提高的突变即可，有E1202G(第1202位的谷氨酸(E)突变成甘氨酸(G))(Krieger等人，J．Virol．，2001年，第75卷，第4614-4624页)。在本发明中，优选的突变是S2197Y或S2204G。进一步优选的突变是E1202G与S2197Y组合得到的突变(以下记作E1202G/S2197Y)、或者E1202G与S2204G组合得到的突变(以下记作E1202G/S2204G)。需要说明的是，E1202G是HCV基因组的NS3蛋白上的突变，S2197Y、S2204G是NS5A蛋白上的突变(参照图8和图9)。
上述HCV亚基因组复制子RNA的一个实施方式涉及核酸，该核酸包含上述的NC1株的5’UTR、编码从前体蛋白中的NS3蛋白到NS5B蛋白的核苷酸序列和3’UTR；或者，身为该核酸，且包含S2197Y、S2204G、E1202G/S2197Y或E1202G/S2204G的突变的核酸。
作为上述的HCV亚基因组复制子RNA的一个优选实施方式，可以列举：包含上述NC1株的全长HCV基因组(SEQ ID NO: 1)中的5’UTR(SEQ ID NO: 2)、NS3蛋白编码序列(SEQ ID NO: 8)、NS4A蛋白编码序列(SEQ ID NO: 9)、NS4B蛋白编码序列(SEQ ID NO: 10)、NS5A蛋白编码序列(SEQ ID NO: 11)、NS5B蛋白编码序列(SEQ ID NO: 12)、3’UTR(SEQ ID NO: 13)的核酸，可以优选例示：为包含上述的NC1株的全长HCV基因组中的5’UTR、NS3蛋白编码序列、NS4A蛋白编码序列、NS4B蛋白编码序列、NS5A蛋白编码序列、NS5B蛋白编码序列、3’UTR的核酸，且为包含S2197Y或S2204G突变的核酸；或者，为包含上述的NC1株的全长HCV基因组中的5’UTR、NS3蛋白编码序列、NS4A蛋白编码序列、NS4B蛋白编码序列、NS5A蛋白编码序列、NS5B蛋白编码序列、3’UTR的核酸，且为包含E1202G/S2197Y或E1202G/S2204G突变的核酸。
另外，作为上述HCV亚基因组复制子RNA的又一个优选的实施方式，可以列举：为包含上述NC1株的全长HCV基因组中的5’UTR、NS3蛋白编码序列、NS4A蛋白编码序列、NS4B蛋白编码序列、NS5A蛋白编码序列、NS5B蛋白编码序列、3’UTR的核酸，且为包含P2161R、R2192L、R2192Q或Y2871C突变的核酸，可以优选例示：为包含上述NC1株的全长HCV基因组中的5’UTR、NS3蛋白编码序列、NS4A蛋白编码序列、NS4B蛋白编码序列、NS5A蛋白编码序列、NS5B蛋白编码序列、3’UTR的核酸，且为包含P2161R突变的核酸。
上述HCV亚基因组复制子RNA进一步优选：将5’UTR、NS3蛋白编码序列、NS4A蛋白编码序列、NS4B蛋白编码序列、NS5A蛋白编码序列、NS5B蛋白编码序列和3’UTR按照从5’到3’的顺序依次配置而成的RNA。
上述HCV亚基因组复制子RNA可以进一步包含抗药性基因和/或报道基因以及IRES序列。此时，优选在5’UTR的下游插入抗药性基因或/和报道基因，进一步在其下游插入IRES序列。
作为上述HCV亚基因组复制子RNA的进一步优选的实施方式，可以列举：由SEQ ID NO: 16所示核苷酸序列组成的核酸(野生型NC1株的HCV亚基因组复制子RNA)，或者，身为该核酸，且导入了S2197Y、S2204G、E1202G/S2197Y、E1202G/S2204G或P2161R突变的RNA，更优选可以例示：由SEQ ID NO: 17(在野生型NC1株的HCV亚基因组复制子RNA中包含S2197Y突变的序列)、SEQ ID NO: 18(在野生型NC1株的HCV亚基因组复制子RNA中包含S2204G突变的序列)或SEQ ID NO: 52(在野生型NC1株的HCV亚基因组复制子RNA中包含P2161R突变的序列)所示核苷酸序列组成的核酸。
构成上述HCV亚基因组复制子RNA的核酸还包含：在引起上述突变的核苷酸以外的核苷酸中进一步具有其他突变、且带来与包含上述突变的核酸同等的复制能力和感染性的核酸。作为上述的其他突变，可以列举1个或几个核苷酸的取代，该具有其他突变的核酸与原来的核酸具有90%以上、优选95%以上、进一步优选97%以上的核苷酸序列同源性。
(3) HCV全基因组复制子RNA的制作
HCV全基因组复制子RNA还包含HCV全长基因组RNA本身，通过将上述的HCV亚基因组复制子RNA的复制能力提高的适应性突变导入到来自野生型NC1株的HCV全长基因组RNA中，可以制作HCV全基因组复制子RNA。这里，将在野生型NC1株的HCV全长基因组RNA中导入了上述适应性突变的HCV基因组称为NC1株突变体或突变体NC1株。
作为导入突变的方法，可以利用上述方法将突变导入到野生型NC1株的HCV全长基因组中，还可以通过将野生型HCV基因组的结构基因部分连接在亚基因组复制子突变体上来导入突变。
在上述的HCV全基因组复制子RNA的制作中使用的表达载体，通过利用国际公开第05/080575号中记载的技术即可制作。具体而言，利用常规方法重构HCV的全长基因组RNA所对应的cDNA，将其插入启动子的下游，制作DNA克隆。上述启动子优选为质粒克隆中所包含的启动子。作为启动子，可以使用T7启动子、SP6启动子、T3启动子等，但优选T7启动子。作为载体，可以使用pUC19(TaKaRa公司)、pBR322(TaKaRa公司)、pGEM-T、pGEM-T Easy、pGEM-3Z(均为Promega公司)、pSP72(Promega公司)、pCRII(Invitrogen公司)、pT7Blue(Novagen公司)等。
由表达载体制作HCV全基因组复制子RNA时，以所制作的上述DNA克隆为模板，通过聚合酶合成RNA。以在T7启动子的控制下将HCV cDNA克隆化的核酸为模板，在体外制作RNA时，可以使用MEGAscript T7试剂盒(Ambion公司)等进行合成。RNA合成可以利用常规方法由5’UTR开始进行。当DNA克隆为质粒克隆时，还可以使用通过限制酶从质粒克隆中切下的DNA片段作为模板，合成RNA。需要说明的是，优选所合成的RNA的3’末端与HCV基因组RNA的3’UTR的末端一致，并且不附加或删除其他序列。
如此操作合成的RNA是HCV全基因组复制子RNA。具体而言，HCV全基因组复制子RNA是从5’到3’的方向依次将HCV的5’UTR、编码核心蛋白、E1蛋白、E2蛋白、p7蛋白、NS2蛋白、NS3蛋白、NS4A蛋白、NS4B蛋白、NS5A蛋白、NS5B蛋白的核苷酸序列和3’UTR连接而成的RNA。
上述的HCV全基因组复制子RNA的一个实施方式涉及在NC1株的全长基因组RNA中导入有上述适应性突变的核酸。作为该HCV全基因组复制子RNA的优选的实施方式，可以列举：上述的NC1株的全长基因组RNA(SEQ ID NO: 1)、即包含5’UTR(SEQ ID NO: 2)、核心蛋白编码序列(SEQ ID NO: 3)、E1蛋白编码序列(SEQ ID NO: 4)、E2蛋白编码序列(SEQ ID NO: 5)、p7蛋白编码序列(SEQ ID NO: 6)、NS2蛋白编码序列(SEQ ID NO: 7)、NS3蛋白编码序列(SEQ ID NO: 8)、NS4A蛋白编码序列(SEQ ID NO: 9)、NS4B蛋白编码序列(SEQ ID NO: 10)、NS5A蛋白编码序列(SEQ ID NO: 11)、NS5B蛋白编码序列(SEQ ID NO: 12)和3’UTR(SEQ ID NO: 13)、且包含S2197Y或S2204G突变的核酸，优选可以例示：NC1株的全长基因组RNA(SEQ ID NO: 1)、即包含5’UTR、核心蛋白编码序列、E1蛋白编码序列、E2蛋白编码序列、p7蛋白编码序列、NS2蛋白编码序列、NS3蛋白编码序列、NS4A蛋白编码序列、NS4B蛋白编码序列、NS5A蛋白编码序列、NS5B蛋白编码序列和3’UTR、且包含E1202G/S2197Y或E1202G/S2204G突变的核酸；更优选可以例示：按照从5’到3’的顺序依次配置5’UTR、核心蛋白编码序列、E1蛋白编码序列、E2蛋白编码序列、p7蛋白编码序列、NS2蛋白编码序列、NS3蛋白编码序列、NS4A蛋白编码序列、NS4B蛋白编码序列、NS5A蛋白编码序列、NS5B蛋白编码序列和3’UTR而形成的核酸。
HCV全基因组复制子RNA可以进一步包含抗药性基因和/或报道基因、以及IRES序列。此时，优选在5’UTR的下游插入抗药性基因或/和报道基因，并进一步在其下游插入IRES序列。
作为上述HCV全基因组复制子RNA的进一步优选的实施方式，可以列举：包含SEQ ID NO: 19(包含S2197Y突变的全基因组核苷酸序列)、SEQ ID NO: 20(包含S2204G突变的全基因组核苷酸序列)、SEQ ID NO: 21(包含E1202G/S2197Y突变的全基因组核苷酸序列)或SEQ ID NO: 22(包含E1202G/S2204G突变的全基因组核苷酸序列)所示核苷酸序列的RNA。其中，特别优选：包含SEQ ID NO: 21(包含E1202G/S2197Y突变的全基因组核苷酸序列)或SEQ ID NO: 22(包含E1202G/S2204G突变的全基因组核苷酸序列)所示核苷酸序列的RNA。具体而言，由SEQ ID NO: 19所示具有引起第2197位的丝氨酸取代成酪氨酸的取代的突变的核苷酸序列组成的核酸、由SEQ ID NO: 20所示具有引起第2204位的丝氨酸取代成甘氨酸的取代的突变的核苷酸序列组成的核酸、由SEQ ID NO: 21所示具有引起第2197位的丝氨酸取代成酪氨酸的取代的突变和引起第1202位的谷氨酸取代成甘氨酸的取代的突变的核苷酸序列组成的核酸、以及由SEQ ID NO: 22所示具有引起第2204位的丝氨酸取代成甘氨酸的取代的突变和引起第1202位的谷氨酸取代成甘氨酸的取代的突变的核苷酸序列组成的核酸符合。
上述HCV全基因组复制子RNA或上述核酸，若被导入HCV敏感性细胞中，则进行自主复制，产生HCV颗粒；另外，若使HCV敏感性细胞感染含有上述核酸作为病毒基因组的丙型肝炎病毒，则产生HCV颗粒。即，导入有上述的HCV全基因组复制子RNA或上述核酸的细胞、或者感染了含有上述核酸作为病毒基因组的丙型肝炎病毒的细胞，可用于HCV颗粒的大量生产。
更具体而言，由导入有上述HCV全基因组复制子RNA或上述核酸的HCV敏感性细胞、或感染了含有上述核酸作为病毒基因组的丙型肝炎病毒的HCV敏感性细胞产生的HCV颗粒，其进一步感染其他HCV敏感性细胞，在细胞内复制并包装HCV的基因组RNA，可以反复产生HCV颗粒。关于HCV颗粒感染细胞，例如，可以通过向HCV敏感性细胞(例如Huh7细胞)中添加导入了HCV全基因组复制子RNA或上述核酸的细胞的培养上清来实施。
作为导入上述HCV全基因组复制子RNA或上述核酸的细胞、或者感染上述丙型肝炎病毒的细胞，优选培养细胞，其只要是接受HCV复制子RNA的复制或HCV颗粒形成的细胞即可，可以列举上述的HCV敏感性细胞。特别优选使用Huh7细胞或Huh7细胞的衍生株。
作为将HCV全基因组复制子RNA导入到细胞中的方法，可以采用公知的任意方法。例如，可以列举：磷酸钙共沉淀法、DEAE葡聚糖法、脂质转染法、显微注射法、电穿孔法，但优选列举脂质转染法和电穿孔法，进一步优选列举电穿孔法。
作为评价所导入的HCV全基因组复制子RNA的复制能力的方法，可以列举：测定与HCV全基因组复制子RNA连接的外来基因的功能、即通过该基因的表达而表现出来的功能。外来基因为抗药性基因时，通过计测在含药的选择培养基中增殖的细胞数或细胞的集落数，可以评价HCV全基因组复制子RNA的复制能力。此时，细胞数或细胞的集落数越多，则可以评价为复制能力越高。外来基因是酶时，通过计测其酶活性，可以评价HCV全基因组复制子RNA的复制能力。此时，酶活性越高，可以评价为复制能力越高。另外，作为其他的方法，通过对利用定量RT-PCR复制的RNA的量进行定量，也可以直接评价HCV全基因组复制子RNA的复制能力。
需要说明的是，本发明还包括：包含上述核酸的病毒基因组和含有上述核酸作为病毒基因组的丙型肝炎病毒。
(4) 感染性HCV颗粒的产生
上述的HCV全基因组复制子RNA在培养细胞中具有HCV颗粒产生能力。评价HCV全基因组复制子RNA是否具有HCV颗粒产生能力时，将该RNA导入细胞中，测定其细胞培养上清中的HCV颗粒的存在即可。
关于细胞的HCV颗粒产生能力，可以使用对抗构成释放到培养上清中的HCV颗粒的蛋白、例如核心蛋白、E1蛋白或E2蛋白的抗体进行检测。另外，通过利用使用了特异性引物的RT-PCR法扩增培养上清中的HCV颗粒所含有的HCV全基因组复制子RNA并进行检测，还可以间接检测HCV颗粒的存在。
作为所产生的HCV颗粒是否具有感染能力的评价方法，可以用导入了HCV全基因组复制子RNA的细胞的培养上清处理HCV敏感性细胞(例如Huh7细胞)，例如在48小时后用抗核心抗体对细胞进行免疫染色，计算感染细胞数，或者，将细胞的提取物在SDS-聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳，利用蛋白质印迹法检测核心蛋白，由此可以判断。
有报道称：当HCV颗粒的感染能力低时，通过在酪蛋白激酶I抑制剂的存在下进行评价，可以检测感染能力，但即使利用该方法可以检测感染能力，但并未实际使用(Neddermann，P．等人，J．Virol．，2004年，第78卷，第13306-13314页)。
(5) 嵌合型HCV颗粒的产生
嵌合型HCV颗粒(嵌合HCV颗粒)是指，由包含2个以上不同株的HCV的基因组序列的嵌合型HCV基因组(嵌合HCV基因组)或嵌合型HCV全基因组复制子RNA(嵌合HCV全基因组复制子RNA)产生的HCV颗粒。
上述的嵌合HCV基因组，其特征在于：是包含NC1株突变体(导入有适应性突变的NC1株)的非结构基因和除此以外的HCV株(不同于NC1株和NC1株突变体的HCV株)的结构基因的HCV的嵌合基因。上述嵌合HCV基因组中使用的NC1株突变体，具体而言，在NC1株中包含S2197Y、S2204G、E1202G/S2197Y或E1202G/S2204G突变。更具体而言，NC1株突变体是包含SEQ ID NO: 19(包含S2197Y突变的全基因组核苷酸序列)、SEQ ID NO: 20(包含S2204G突变的全基因组核苷酸序列)、SEQ ID NO: 21(包含E1202G/S2197Y突变的全基因组核苷酸序列)或SEQ ID NO: 22(包含E1202G/S2204G突变的全基因组核苷酸序列)所示核苷酸序列的RNA。
嵌合HCV基因组的制作，例如可以通过将作为NC1株突变体的基因组的结构基因的核心蛋白、E1蛋白、E2蛋白和p7蛋白的编码序列与其他HCV株的结构基因重组来制作。该基本技术例如记载在Wakita，T．等人，Nat．Med．，2005年，第11卷，第791-796页；Lindenbach，B．D．等人，Science，2005年，第309卷，第623-626页；Pietschmann，T．等人，Proc．Natl．Acad．Sci．U．S．A．，2007年，第103卷，第7408-7413页中。
在使用HCV株的核苷酸序列的系统分析法中，HCV被分成基因型1～基因型6的6个类型，进一步将上述各类型分成若干亚型。而且，关于HCV的几个基因型，其基因组全长的核苷酸序列也已确定(Simmonds，P．等人，Hepatology，1994年，第10卷，第1321-1324页；Choo，Q．L．等人，Science，1989年，第244卷，第359-362页；Okamoto，H．等人，J．Gen．Virol．，1992年，第73卷，第73-679页；Mori，S．等人，Biochem．Biophys．Res．Commun．，1992年，第183卷，第334-342页)。作为已知的HCV的现有株的例子，具体而言，作为基因型1a的HCV株，已知有H77株(GenBank检索号AF011751)，作为基因型1b型的HCV株，已知有J1株(GenBank检索号D89815)、Con1株(GenBank检索号AJ238799，有时还称作Con-1株、con1株)和TH株(Wakita，T．等人，J．Biol．Chem．，1994年，第269卷，第14205-14210页；日本特开2004-179号公报)，作为基因型2a的HCV株，已知有JFH-1株(GenBank检索号AB047639，有时还称作JFH1株)、J6CF株(GenBank检索号AF177036)、JCH-1(GenBank检索号AB047640)、JCH-2(GenBank检索号AB047641)、JCH-3(GenBank检索号AB047642)、JCH-4(GenBank检索号AB047643)、JCH-5(GenBank检索号AB047644)和JCH-6(GenBank检索号AB047645)。而且，作为基因型2b的HCV株，已知有HC-J8株(GenBank检索号D01221)等，作为基因型3a的HCV株，已知有NZL1株(GenBank检索号D17763)、S52(GenBank检索号GU814263)等，作为基因型3b的HCV株，已知有Tr-Kj(GenBank检索号D49374)等，作为基因型4a的HCV株，已知有ED43(GenBank检索号Y11604)等。关于其他株，已经报道了GenBank检索号的列表(Tokita，T．等人，J．Gen．Virol．，1998年，第79卷，第1847-1857页；Cristina，J．＆ Colina，R．、Virol．J．，2006年，第3卷，第1-8页)。
上述的嵌合HCV基因组是包含来自HCV的嵌合基因的核酸，该HCV是将编码来自不同于NC1株和NC1株突变体的HCV株的核心蛋白、E1蛋白、E2蛋白和p7蛋白、来自NC1株突变体或不同于NC1株和NC1株突变体的HCV株的NS2蛋白、以及来自NC1株突变体的NS3蛋白、NS4A蛋白、NS4B蛋白、NS5A蛋白和NS5B蛋白的各核苷酸序列从5’侧朝着3’侧以编码核心蛋白、E1蛋白、E2蛋白、p7蛋白、NS2蛋白NS3蛋白、NS4A蛋白、NS4B蛋白、NS5A蛋白和NS5B蛋白的核苷酸序列的顺序配置而成的。另外，上述的NS2蛋白可以是NC1株突变体的NS2蛋白与来自不同于NC1株和NC1株突变体的HCV株的NS2蛋白的嵌合型NS2蛋白(嵌合NS2蛋白)。这里，不同于HCV的NC1株和NC1株突变体的HCV株优选为上述的HCV的现有株。
这里，嵌合NS2蛋白是指，NC1株突变体的NS2蛋白的一部分氨基酸序列与来自不同于NC1株和NC1株突变体的HCV株的NS2蛋白的一部分氨基酸序列连接，作为全体由NS2的全长氨基酸序列组成的NS2蛋白。在上述的嵌合HCV基因组的核酸中，NS2蛋白可以来自NC1株突变体，或者，可以是由来自不同于NC1株和NC1株突变体的HCV株的NS2蛋白的一部分与来自NC1株突变体的NS2蛋白的剩余部分组成的嵌合NS2蛋白。此时，该嵌合NS2蛋白与非嵌合的NS2蛋白具有同样的功能。例如，来自不同于NC1株和NC1株突变体的HCV株的NS2蛋白的一部分由编码从NS2蛋白的N末端的氨基酸残基到第16位的氨基酸残基的核苷酸序列组成时，来自NC1株突变体的NS2蛋白的剩余部分由编码从N末端的第17位的氨基酸残基到C末端的氨基酸残基的核苷酸序列组成。
上述的嵌合HCV基因组的核酸进一步优选：在编码上述核心蛋白的核苷酸序列的5’侧包含5’UTR、以及在编码上述NS5B蛋白的区的3’侧包含3’UTR。5’UTR和/或3’UTR可以是来自任意的HCV株的序列，但优选为来自不同于NC1株和NC1株突变体的HCV株的5’UTR和来自NC1株突变体的3’UTR。
在上述的嵌合HCV基因组中，不同于NC1株和NC1株突变体的HCV株、即HCV的现有株，是属于基因型1a、1b或2a的株。属于基因型1a的株中，例如包含H77株。属于基因型1b的株中，例如包含TH株、Con1株、J1株以及它们的衍生株。属于基因型2a的株中，例如包含JFH-1株、J6CF株等。优选的株是JFH-1株、J6CF株或TH株，特别优选的是JFH-1株。需要说明的是，不同于NC1株和NC1株突变体的HCV株的基因组核苷酸序列信息可以由上述的文献或GenBank获取。
上述的嵌合HCV基因组的核酸是来自J6CF株和NC1株的嵌合核酸，并且，包含S2197Y、S2204G、E1202G/S2197Y或E1202G/S2204G的突变。上述的嵌合HCV基因组的核酸是来自JFH-1株和NC1株的嵌合核酸，并且，包含S2197Y、S2204G、E1202G/S2197Y或E1202G/S2204G的突变。上述的嵌合HCV基因组的核酸是来自TH株和NC1株的嵌合核酸，并且，包含S2197Y、S2204G、E1202G/S2197Y或E1202G/S2204G的突变。
图12中显示NC1株突变体(导入有E1202G/S2204G的适应性突变的NC1株)、J6CF株、JFH-1株和TH株的HCV的HCV基因组的结构，以及包含NC1株突变体(导入有E1202G/S2204G的适应性突变的NC1株)的非结构基因和J6CF株、JFH-1株或TH株的结构基因的嵌合HCV基因组的结构。
本发明提供：包含上述核酸(嵌合基因)的HCV病毒基因组、包含上述核酸作为病毒基因组的丙型肝炎病毒、HCV全基因组复制子RNA、表达载体或嵌合HCV颗粒。该嵌合HCV颗粒具备下述特征：在细胞培养系统中可以高效率地产生，还具有高的感染性。
嵌合HCV基因可以如下制作：以将各HCV基因组RNA的cDNA克隆化的载体为模板，以合成DNA作为引物，进行PCR，扩增各HCV基因的必要区域并进行连接，由此即可制得。
而且，将嵌合HCV基因cDNA与T7启动子等启动子的下游的适当的限制酶位点连接，可以制作用于合成HCV基因组RNA的表达载体。将由该表达载体转录的RNA导入到HCV敏感性细胞(例如Huh7细胞等)中时，进行病毒的复制和包装，可以产生感染性HCV颗粒。
包含上述嵌合HCV基因的HCV全基因组复制子RNA在细胞内具有复制能力、或者具有HCV颗粒产生能力、以及所产生的HCV颗粒的感染性，均可通过上述(3)和(4)中记载的方法来确认。
(6) HCV亚基因组复制子RNA的利用
导入了上述的HCV亚基因组复制子RNA的细胞可用于筛选抑制HCV亚基因组复制子RNA的复制的化合物。即，在受检物质的存在下，培养导入了上述的HCV亚基因组复制子RNA的细胞，检测所得培养物中的复制子RNA，从而可以筛选抗HCV物质。这里，培养物包含培养上清或细胞破碎物。这种情况下，当培养物中不存在复制子RNA、或者与受检物质的不存在下相比少时，可以判定为上述受检物质能够抑制HCV亚基因组复制子RNA的复制。
例如，将由上述NC1株或其突变体的5’UTR(SEQ ID NO: 2)、核心蛋白编码序列(SEQ ID NO: 3)的36个核苷酸、萤光素酶基因、EMCV IRES序列、NS3蛋白编码序列(SEQ ID NO: 8)、NS4A蛋白编码序列(SEQ ID NO: 9)、NS4B蛋白编码序列(SEQ ID NO: 10)、NS5A蛋白编码序列(SEQ ID NO: 11)、NS5B蛋白编码序列(SEQ ID NO: 12)和3’UTR(SEQ ID NO: 13)沿5’到3’的方向依次连接而成的RNA组成的HCV亚基因组复制子RNA导入Huh7细胞中，接着，添加受检物质，48～72小时后测定萤光素酶的活性。与未添加受检物质相比能够抑制萤光素酶活性的受检物质，可以判定其具有抑制HCV亚基因组复制子RNA的复制的作用。
(7) HCV颗粒的应用
将上述核酸或上述HCV全基因组复制子RNA导入HCV敏感性细胞中等得到的HCV颗粒(包含嵌合HCV颗粒)，除了可以用于筛选抑制HCV的感染的中和抗体或化合物以及抑制HCV的复制的化合物，还适合用于作为疫苗的用途、作为用于制作抗HCV抗体的抗原的用途。
在抑制HCV的感染或复制的物质的筛选中使用上述HCV颗粒时，可以列举下述方法：在受检物质的存在下或不存在下，培养产生上述HCV颗粒的细胞，或者，培养上述HCV颗粒和HCV敏感性细胞，即培养HCV颗粒和HCV敏感性细胞的混合物，或者，培养上述HCV颗粒所感染的HCV感染细胞，检测所得培养物中的HCV复制子RNA或HCV颗粒。这里，检测是指定量培养物中的HCV复制子RNA或HCV颗粒的量。此时，当培养物中不存在HCV复制子RNA和HCV颗粒、或者与受检物质的不存在下相比少时，可以评价为上述受检物质能够抑制HCV的感染或复制。
具体而言，例如，在受检物质的存在下和不存在下，培养上述HCV颗粒和HCV敏感性细胞，检测所得培养物中的HCV复制子RNA或HCV颗粒，判定该受检物质是否抑制HCV复制子RNA的复制或HCV颗粒的形成，从而可以筛选抗HCV物质。
关于培养物中的HCV复制子RNA的检测，可以列举：测定与HCV复制子RNA连接的外来基因的功能、即通过该基因的表达而表现出来的功能。例如，外来基因是酶时，通过计测其酶活性，可以检测HCV复制子RNA。作为其他的方法，通过对利用定量RT-PCR复制的RNA的量进行定量，也可以检测HCV复制子RNA。
检测培养物中的HCV颗粒的存在时，使用对抗构成释放到培养液中的HCV颗粒的蛋白(例如，核心蛋白、E1蛋白或E2蛋白)的抗体进行检测；或者，用对抗非结构蛋白的抗体进行免疫染色，来检测感染细胞中的非结构蛋白的存在；或者，利用使用了特异性引物的RT-PCR法扩增培养上清中的HCV颗粒所含有的HCV基因组RNA并进行检测，从而也可以间接地检测HCV颗粒的存在。
另外，作为筛选中使用的HCV全基因组复制子RNA包含外来基因的情形，具体而言，例如可以列举：由NC1株突变体的HCV的5’UTR、核心蛋白编码序列的36个核苷酸、萤光素酶基因、EMCV IRES序列、核心蛋白编码序列、E1蛋白编码序列、E2蛋白编码序列、p7蛋白编码序列、NS2蛋白编码序列、NS3蛋白编码序列、NS4A蛋白编码序列、NS4B蛋白编码序列、NS5A蛋白编码序列、NS5B蛋白编码序列和3’UTR沿5’到3’的方向依次连接而成的RNA组成的HCV全基因组复制子RNA。需要说明的是，在各核苷酸序列的连接中，连接位点上可以包含限制酶位点等添加序列。将上述HCV全基因组复制子RNA导入到Huh7细胞中，得到HCV颗粒，使该HCV颗粒感染HCV敏感性细胞，同时添加受检物质，48～72小时后测定萤光素酶的活性。与未添加受检物质相比抑制萤光素酶活性的物质，可以判定其具有抑制HCV的感染的作用。
在上述方法中，抗HCV物质被选择作为可以抑制病毒感染或复制的物质。
另外，在上述方法中，还可以使用包含上述核酸的病毒基因组和含有上述核酸作为病毒基因组的丙型肝炎病毒。
而且，上述HCV颗粒可以作为疫苗来使用。在作为疫苗的用途中，具体而言，还可以将上述HCV颗粒或其一部分直接作为疫苗来使用，但优选利用该领域中已知的方法将其减毒或失活后使用。关于病毒的失活，例如，可以通过在病毒悬浮液中添加混合福尔马林、β-丙内酯、戊二醛等灭活剂，使其与病毒反应而达成(Appaiahgari，M．B．＆Vrati，S．，Vaccine，2004年，第22卷，第3669-3675页)。
将上述HCV疫苗可以制成作为溶液或悬浮液的任一种可给药形式。或者，可以以适于溶解或悬浮于液体中的固体(例如冷冻干燥制备物)的形态进行制备，使临用前可以重新构成。这样的固体或制备物可以制成乳剂，或者可以封装在脂质体中。
HCV颗粒等的活性免疫原性成分，其中常常可以混合药学上可接受的、适合于活性成分的赋形剂。适当的赋形剂例如有：水、生理盐水、葡萄糖、甘油、乙醇等、或它们的混合物。
而且，根据需要，上述HCV疫苗可以含有少量的辅剂(例如加湿剂或乳化剂)、pH缓冲剂和/或提高疫苗效能的佐剂。
佐剂是该免疫系统的非特异性刺激因子。它们增强宿主对上述HCV疫苗的免疫应答。因此，在优选方案中，上述HCV疫苗包含佐剂。佐剂的效能可以基于测定通过给予由HCV颗粒构成的疫苗而产生的抗体的量来确定。
对能够有效的佐剂的例子没有限定，包含下述物质。氢氧化铝、N-乙酰-胞壁酰-L-苏氨酰-D-异谷氨酰胺(thr-MDP)、N-乙酰-正-胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺(被称作CGP11637、nor-MDP)、N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰-L-丙氨酸-2-(1’-2’-二棕榈酰-sn-甘油酰-3-羟基磷酰氧基)-乙胺(被称作CGP19835A、MTP-PE)和RIBI。RIBI是在2%角鲨烯/Tween(注册商标)80乳剂中含有从细菌中提取的3种成分、即单磷酰脂A、海藻糖二霉菌酸酯和细胞壁骨格(HPL+TDM+CWS)。
根据需要，可以在上述HCV疫苗中加入具有佐剂活性的1种以上的化合物。作为该技术领域中公知的佐剂的具体例子，可以列举：弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂、维生素E、非离子嵌段聚合物、胞壁酰二肽、皂苷、矿物油、植物油和Carbopol。作为特别适合粘膜用的佐剂，例如可以列举：大肠杆菌(E．coli)不耐热毒素(LT)或霍乱(Cholera)毒素(CT)。作为其他的适当的佐剂，例如可以列举：氢氧化铝、磷酸铝或氧化铝、油性乳剂(例如Bayol(注册商标)或Marcol 52(注册商标))、皂苷或维生素E增溶质。
上述HCV疫苗通常以胃肠外的形式、例如通过皮下注射或肌肉内注射等注射进行给药。作为适合于其他给药形式的其他处方，可以列举栓剂和某些场合的口服处方药。
在进行皮下、皮内、肌肉内、静脉内给药的注射剂中，作为上述HCV疫苗和药学上可接受的载体或稀释剂的具体例子，可以列举：稳定剂、碳水化合物(例如，山梨醇、甘露醇、淀粉、蔗糖、葡萄糖、葡聚糖)、白蛋白或酪蛋白等蛋白、牛血清或脱脂乳等含蛋白的物质、和缓冲液(例如磷酸缓冲液)。
作为栓剂中使用的现有的粘合剂和载体，例如可以包含聚亚烷基二醇或三甘油。这样的栓剂可以由以0.5%～50%的范围、优选1%～20%的范围含有活性成分的混合物形成。口服处方药含有通常使用的赋形剂。作为该赋形剂，例如可以列举：药用级的甘露醇、果糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。
将上述HCV疫苗制成溶液、悬浮液、片剂、丸剂、胶囊剂、缓释处方药或粉末剂的形态，含有10%～95%、优选25%～70%的活性成分(HCV颗粒或其一部分)。该HCV疫苗按照适于给药剂型的方法、并且以具有预防和/或治疗效果的量进行给药。应该给予的抗原量通常是每次给药为0.01μg～100,000μg的范围，其取决于给药的患者、该患者的免疫系统中的抗体合成能力、以及所期望的防御程度。另外，还取决于口服、皮下、皮内、肌肉内、静脉内给药途径等给药途径。
另外，上述HCV疫苗可以按照单独给药日程(single-administration schedule)或复合给药日程进行给药。优选为复合给药日程。按照复合给药日程，在接种的开始时期进行1～10的分别给药，接着以维持和/或强化免疫应答所必需的时间间隔，例如，作为第2次给药，可以在1～4个月后进行另外的给药。必要时，可以在数月后接着进行给药。给药的方案也至少部分由个体的必要性来决定，取决于医生的判断。上述HCV疫苗还有下述使用方法：将其给予健康人，在健康人体内诱导对HCV的免疫应答，对于新型的HCV感染进行预防性使用。而且，还有作为治疗性疫苗的使用方法，即对感染了HCV的患者进行给药，在体内诱导对HCV的强免疫反应，由此排除HCV。
而且，上述HCV颗粒作为用于制作抗HCV抗体的抗原是有效的。通过对哺乳类或鸟类给予上述HCV颗粒，可以制作抗体。作为哺乳类动物，可以列举：小鼠、大鼠、兔、山羊、绵羊、马、牛、豚鼠、单峰骆驼、双峰骆驼、大羊驼等。单峰骆驼、双峰骆驼和大羊驼适合制作仅由H链组成的抗体。作为鸟类动物，可以列举：鸡、鹅、鸵鸟等。采集给予了上述HCV颗粒的动物的血清，按照已知的方法可以获得抗体。
本发明还提供上述的抗HCV抗体，该抗HCV抗体可以用作能够使HCV失活的中和抗体。
使用用上述HCV颗粒进行了免疫的动物的细胞，可以制作产生单克隆抗体产生细胞的杂交瘤。制备杂交瘤的方法众所周知，可以采用Antibodies：A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Laboratory，1988年)中记载的方法。
单克隆抗体产生细胞可以通过细胞融合来制作，也可以通过利用癌基因DNA的导入或Epstein-Barr病毒的感染使B淋巴细胞不灭化的其他方法来制作。
通过上述方法得到的单克隆抗体或多克隆抗体对HCV的诊断或治疗、预防有效。
使用上述HCV颗粒作为抗原而制作的抗体，其作为药物可以和药学上可接受的溶解剂、添加剂、稳定剂、缓冲液等一同给药。给药途径可以是任意一种给药途径，但优选为皮下、皮内、肌肉内给药，更优选静脉内给药。
实施例
以下，列举实施例，以更具体地说明本发明。但这些实施例只是用于说明，并不限制本发明的技术范围。
(实施例1) 野生型NC1株的HCV亚基因组复制子RNA表达载体的构建
使用从急性重症丙型肝炎患者体内分离的新型的基因型1b的HCV、即NC1株的全长基因组RNA所对应的克隆DNA(全长基因组克隆DNA)的非结构区，构建作为HCV亚基因组复制子RNA表达载体的质粒pSGR-NC1。
具体而言，使用Isogen-LS(Nippon Gene公司)，从患者血清中提取纯化RNA，使用随机六聚体引物合成cDNA。根据已知的基因型1b的HCV基因组的保守序列(Con1株：GenBank检索号 AJ238799)设计PCR引物。使用设计的PCR引物和作为模板的上述合成的cDNA，分5个片段扩增cDNA。对于难以获得扩增产物的5’末端的序列，利用5’RACE法得到扩增产物。将各片段在作为测序用克隆载体的pGEM-T EASY(Promega公司)中进行克隆化。利用常规方法分析这些克隆的核苷酸序列，确定NC1株的全长基因组RNA序列。
NC1株的全长基因组克隆DNA的核苷酸序列见SEQ ID NO: 1。另外，NC1株的5’UTR见SEQ ID NO: 2，核心蛋白编码序列见SEQ ID NO: 3，E1蛋白编码序列见SEQ ID NO: 4，E2蛋白编码序列见SEQ ID NO: 5，p7蛋白编码序列见SEQ ID NO: 6，NS2蛋白编码序列见SEQ ID NO: 7，NS3蛋白编码序列见SEQ ID NO: 8，NS4A蛋白编码序列见SEQ ID NO: 9，NS4B蛋白编码序列见SEQ ID NO: 10，NS5A蛋白编码序列见SEQ ID NO: 11，NS5B蛋白编码序列见SEQ ID NO: 12，3’UTR见SEQ ID NO: 13。
由SEQ ID NO: 1的核苷酸序列编码的HCV前体蛋白(多肽)的氨基酸序列见SEQ ID NO: 14。SEQ ID NO: 14所示氨基酸序列是由SEQ ID NO: 1的核苷酸序列的核苷酸编号342～9374(包含终止密码子)编码的。另外，NC1株的前体蛋白中的从NS3蛋白到NS5B蛋白的区的氨基酸序列见SEQ ID NO: 15。该SEQ ID NO: 15的氨基酸序列(NS3～NS5B区)对应于SEQ ID NO: 14所示氨基酸序列的第1027位～第3010位的氨基酸。
质粒pSGR-NC1根据Kato等人的文献(Gastroenterology，2003年，第125卷，第1808-1817页)和国际公开第05/028652号中所示的步骤来构建。
具体而言，首先，在插入到质粒载体pUC19中的T7启动子的控制下，插入NC1株的全长基因组RNA(图1A)的cDNA，制作重组质粒pNC1(图1B)。然后，通过用新霉素抗性基因(neo：还称作新霉素磷酸转移酶基因)和EMCV IRES(脑心肌炎病毒的内部核糖体结合位点)取代重组质粒pNC1的结构区(核心蛋白、E1蛋白、E2蛋白和p7蛋白)和一部分非结构区，构建质粒pSGR-NC1。将其作为表达载体pSGR-NC1。
图1C显示表达载体pSGR-NC1的结构。在表达载体pSGR-NC1中，5’UTR、核心蛋白编码序列的36个核苷酸(HCV-IRES)、NS3～NS5B蛋白编码序列、3’UTR是来自NC1株的序列。图中，“T7”是指T7启动子。T7启动子是用于使用T7 RNA聚合酶由各表达载体转录HCV亚基因组复制子RNA所必需的序列元件。“neo”表示新霉素抗性基因，“EMCV IRES”表示脑心肌炎病毒的内部核糖体结合位点。“C”表示核心蛋白，“E1”表示E1蛋白，“E2”表示E2蛋白，“p7”表示p7蛋白，“NS2”表示NS2蛋白，“NS3”表示NS3蛋白，“4A”表示NS4A蛋白，“4B”表示NS4B蛋白，“NS5A”表示NS5A蛋白，“NS5B”表示NS5B蛋白。如图1D所示，由表达载体pSGR-NC1制作的HCV亚基因组复制子RNA(NC1株的HCV亚基因组复制子RNA)是转录有T7启动子的下游区的RNA。另外，图中的“XbaI”和“PmeI”表示限制酶位点。需要说明的是，在图3、4、6、8、9、12中也同样。
在表达载体pSGR-NC1的T7启动子的下游连接NC1亚基因组复制子RNA的cDNA。NC1株的HCV亚基因组复制子RNA的cDNA核苷酸序列见SEQ ID NO: 16。另外，SEQ ID NO: 15所示氨基酸序列显示NC1株的从NS3蛋白到NS5B蛋白的区，其编码在SEQ ID NO: 1的核苷酸序列的核苷酸编号3420～9374(包含终止密码子)。
(实施例2) 野生型NC1株的HCV亚基因组复制子RNA的制作
用限制酶XbaI切断实施例1中构建的表达载体pSGR-NC1。接着，在10～20μg XbaI切断片段中加入20U绿豆核酸酶(总反应液量为50μL)，在30℃下温育30分钟。绿豆核酸酶是催化选择性地分解双链DNA中的单链部分使其平滑的反应的酶。通常，将上述XbaI切断片段直接用作模板DNA，利用RNA聚合酶进行RNA转录时，在3’末端过剩地添加有作为XbaI的识别序列的一部分的CUAG的4个核苷酸的复制子RNA得以合成。因此，在本实施例中，通过用绿豆核酸酶处理XbaI切断片段，从XbaI切断片段中除去CTAG的4个核苷酸。
接着，对于包含XbaI切断片段的绿豆核酸酶处理后溶液，按照常规方法进行蛋白除去处理，由此纯化CTAG的4个核苷酸已被除去的XbaI切断片段，将其作为以下的反应中使用的模板DNA。使用Ambion公司的MEGAscript(注册商标)，通过使用了T7启动子的转录反应，由该模板DNA进行体外合成RNA。具体而言，根据制造商的使用说明书制备20μL包含0.5～1.0μg模板DNA的反应液，使其在37℃下反应3小时～16小时。
RNA合成结束后，向反应溶液中添加2U的DNase，在37℃下反应15分钟，由此除去模板DNA，再使用酸性酚进行RNA提取，由此获得由pSGR-NC1转录的NC1株的HCV亚基因组复制子RNA(图1D)。
(实施例3) NC1株的HCV亚基因组复制子复制细胞克隆的建立
将1μg实施例2中制作的野生型NC1株的HCV亚基因组复制子RNA与利用常规方法从Huh7细胞中提取的总细胞性RNA混合，进行调整使RNA总量达到10μg。接着，利用电穿孔法将该混合RNA导入Huh7细胞中。将进行了电穿孔处理的Huh7细胞接种在培养皿中，培养16小时～24小时，之后向培养皿中添加G418(新霉素)。之后，每周交换两次培养液，同时继续进行培养。
自接种时起培养21天后，用结晶紫将生存细胞染色。其结果，在导入了NC1株的HCV亚基因组复制子RNA的细胞中，可以确认到集落形成。集落形成表明在该细胞中HCV亚基因组复制子RNA得以复制(图2)。
对于确认到集落形成的上述导入了亚基因组复制子RNA的细胞，由上述的培养21天后的培养皿中进一步克隆活细胞的集落，继续培养。通过上述的集落的克隆，可以建立多株细胞克隆。将上述细胞克隆命名为NC1亚基因组复制子细胞。认为在如此建立的细胞克隆中，导入的NC1株的HCV亚基因组复制子RNA在进行自主复制。
(实施例4) NC1亚基因组复制子细胞内的HCV亚基因组复制子RNA的序列分析
进行实施例3中建立的NC1亚基因组复制子细胞内存在的HCV亚基因组复制子RNA的序列分析。首先，从建立的32个克隆的NC1亚基因组复制子细胞中提取总RNA，利用RT-PCR法扩增其中所含的HCV亚基因组复制子RNA。在该扩增中，使用5’-TAATACGACTC ACTATAG-3’(SEQ ID NO: 27)和5’-GCGGCTCACGGACCTTTCA C-3’(SEQ ID NO: 28)作为引物。将扩增产物在测序用克隆载体中进行克隆化，利用常规方法进行序列分析。
其结果，在从细胞内得到的HCV亚基因组复制子RNA中，在作为非结构区的NS5A蛋白区发现引起5处(P2161R、R2192L、R2192Q、S2197Y、S2204G)氨基酸取代的核苷酸取代，在NS5B蛋白区发现引起1处(Y2871C)氨基酸取代的核苷酸取代。如图3所示，在表达载体pSGR-NC1上记载了这些氨基酸取代的位置。需要说明的是，这些氨基酸取代的位置是根据NC1株的前体蛋白的全长氨基酸序列(SEQ ID NO: 14)来记载的。
(实施例5) 野生型NC1株的HCV亚基因组复制子RNA中的突变导入及其分析
研究实施例4中发现的核苷酸取代、即核苷酸突变是否会对细胞内的上述野生型NC1株的HCV亚基因组复制子RNA的复制产生影响。
将在NS5A蛋白区引起5处(P2161R、R2192L、R2192Q、S2197Y、S2204G)氨基酸取代的核苷酸取代和在NS5B蛋白区引起1处(Y2871C)氨基酸取代的核苷酸取代分别导入实施例1中制作的NC1株的HCV亚基因组复制子RNA表达载体pSGR-NC1中。
图4显示导入了上述氨基酸取代的HCV亚基因组复制子RNA表达质粒载体的结构。需要说明的是，将在表达载体pSGR-NC1中导入有P2161R取代的表达载体称作“pSGR-NC1 P2161R”。其他的导入了氨基酸取代的表达载体也与其同样地进行命名。需要说明的是，图中的“EcoRI”、“PmeI”、“BsrGI”和“XbaI”表示限制酶位点。
具体而言，以pSGR-NC1及其PCR产物作为模板DNA，反复进行PCR，由此向pSGR-NC1中导入核苷酸取代。PCR条件如下。首先，向PCR的模板DNA中加入Phusion(注册商标) High-Fidelity DNA聚合酶试剂盒(FINNZYMES社)中附带的10μL 5×缓冲液、4μL 2.5mM的dNTP混合液、0.25μL 100μM的引物(分别为正向引物和反向引物)，最终加入去离子水，使总量达到49.5μL。之后，加入0.5μL Phusion(注册商标) DNA聚合酶(FINNZYMES公司)，进行PCR。PCR以98℃ 10秒、55℃ 15秒和72℃ 50秒作为1个循环，进行30个循环。
首先，以pSGR-NC1作为模板DNA，以6620S-Con.1(5’-TACGCGGGTGG GGGATTTCCACTA-3’(SEQ ID NO: 29))和3197SY-R(5’-GCTGGCCAAATAGGGG GGGGACCCTCGGG C-3’(SEQ ID NO: 30))作为引物，在上述PCR条件下进行PCR。得到的PCR产物作为PCR产物no.1。
接下来，以pSGR-NC1作为模板DNA，以3197SY-S(5’-TCCCCCCCCTAT TTGGCCAGCTCTTCAGCT-3’(SEQ ID NO: 31))和6447R -1b-rep(5’-ACGATAA GACGAGCTGGCTT-3’ (SEQ ID NO: 32))作为引物，在上述PCR条件下进行PCR。得到的PCR产物作为PCR产物no.2。
纯化各PCR产物，并溶解在15μL水中。将PCR产物no.1和PCR产物no.2的各1μL的DNA混合。以其作为模板DNA，以6620S-Con.1(5’-TACGCG GGTGGGGGATTTCCACTA-3’(SEQ ID NO: 29))和6447R-1b-rep(5’-ACGATA AGACGAGCTGGCTT-3’(SEQ ID NO: 32))作为引物，在上述PCR条件下进行PCR。得到的PCR产物作为PCR产物no.3。纯化该PCR产物，将其溶解在30μL水中。
用限制酶EcoRI和MunI消化pSGR-NC1和已纯化的PCR产物no.3，各HCV cDNA片段通过琼脂糖凝胶电泳进行分馏、纯化。将这2个DNA片段和Ligation Mix(TaKaRa Bio公司)混合，连接2个DNA片段。将如此得到的重组表达载体(具有引起氨基酸取代S2197Y的核苷酸取代)命名为pSGR-NC1 S2197Y。需要说明的是，由pSGR-NC1 S2197Y合成的HCV亚基因组复制子RNA的序列见SEQ ID NO: 17。
以pSGR-NC1作为模板DNA，以6620S-Con.1(5’-TACGCGGGTGGGGG ATTTCCACTA-3’(SEQ ID NO: 29))和2204SG-R(5’-GACAACTGACCAGCT GAAGAGCTGGCCAAA-3’(SEQ ID NO: 33))作为引物，在上述PCR条件下进行PCR。得到的PCR产物作为PCR产物no.4。
接下来，以pSGR-NC1作为模板DNA，以2204SG-S(5’-CTCTTCAGCTGGT CAGTTGTCTGCGGTCTC-3’(SEQ ID NO: 34))和6447R-1b-rep(5’-ACGATAAGAC GAGCTGGCTT-3’(SEQ ID NO: 32))作为引物，在上述PCR条件下进行PCR。得到的PCR产物作为PCR产物no.5。
纯化各PCR产物，并溶解在15μL水中。将PCR产物no.4和PCR产物no.5的各1μL的DNA混合。以其作为模板DNA，以6620S-Con.1(5’-TACGCGGGT GGGGGATTTCCACTA-3’(SEQ ID NO: 29))和6447R-1b-rep(5’-ACGATAAGACGAGCT GGCTT-3’(SEQ ID NO: 32))作为引物，在上述PCR条件下进行PCR。得到的PCR产物作为PCR产物no.6。纯化PCR产物，将其溶解在30μL水中。
用限制酶EcoRI和MunI消化pSGR-NC1和已纯化的PCR产物no.6，各HCV cDNA片段通过琼脂糖凝胶电泳进行分馏、纯化。将这2个DNA片段和Ligation Mix(TaKaRa Bio公司)混合，连接2个DNA片段。将如此得到的重组表达载体(具有引起氨基酸取代S2204G的核苷酸取代)命名为pSGR-NC1 S2204G。需要说明的是，由pSGR-NC1 S2204G合成的HCV亚基因组复制子RNA的序列见SEQ ID NO: 18。
以pSGR-NC1作为模板DNA，以6620S-Con.1(5’-TACGCGGGTGGGGG ATTTCCACTA-3’(SEQ ID NO: 29))和2161PR-R(5’-GGGTTCACATCGAAGCTGT GACCCGACC-3’(SEQ ID NO: 35))作为引物，在上述PCR条件下进行PCR。得到的PCR产物作为PCR产物no.7。
接下来，以pSGR-NC1作为模板DNA，以2161PR-S(5’-TCACAGCTTCGA TGTGAACCCGAGCCGGAT-3’(SEQ ID NO: 36))和6447R-1b-rep(5’-ACGATAAGAC GAGCTGGCTT-3’(SEQ ID NO: 32))作为引物，在上述PCR条件下进行PCR。得到的PCR产物作为PCR产物no.8。
纯化各PCR产物，并溶解在15μL水中。将PCR产物no.7和PCR产物no.8的各1μL的DNA混合。以其作为模板DNA，以6620S-Con.1(5’-TACGCGGGTG GGGGATTTCCACTA-3’(SEQ ID NO: 29))和6447R-1b-rep(5’-ACGATAAGACGA GCTGGCTT-3’(SEQ ID NO: 32))作为引物，在上述PCR条件下进行PCR。得到的PCR产物作为PCR产物no.9。纯化PCR产物，将其溶解在30μL水中。
用限制酶EcoRI和MunI消化pSGR-NC1和已纯化的PCR产物no.9，各HCV cDNA片段通过琼脂糖凝胶电泳进行分馏、纯化。将这2个DNA片段与Ligation Mix(TaKaRa Bio公司)混合，连接2个DNA片段。将如此得到的重组表达载体(具有引起氨基酸取代P2161R的核苷酸取代)命名为pSGR-NC1 P2161R。需要说明的是，由pSGR-NC1 P2161R合成的HCV亚基因组复制子RNA的序列见SEQ ID NO: 52。
以pSGR-NC1作为模板DNA，以6620S-Con.1(5’-TACGCGGGTGGGGG ATTTCCACTA-3’(SEQ ID NO: 29))和2192RL-R(5’-GGGGGACCCTAGGGCCAGC CTGCGCTTAGC-3’(SEQ ID NO: 37))作为引物，在上述PCR条件下进行PCR。得到的PCR产物作为PCR产物no.10。
接下来，以pSGR-NC1作为模板DNA，以2192RL-S(5’-AGGCTGGCCCT AGGGTCCCCCCCCTCTTT-3’(SEQ ID NO: 38))和6447R- 1b-rep(5’-ACGATAAGA CGAGCTGGCTT-3’(SEQ ID NO: 32))作为引物，在上述PCR条件下进行PCR。得到的PCR产物作为PCR产物no.11。
纯化各PCR产物，并溶解在15μL水中。将PCR产物no.10和PCR产物no.11的各1μL的DNA混合。以其作为模板DNA，以6620S-Con.1(5’-TACGCGGGT GGGGGATTTCCACTA-3’(SEQ ID NO: 29))和6447R-1b-rep(5’-ACGATAAGA CGAGCTGGCTT-3’(SEQ ID NO: 32))作为引物，在上述PCR条件下进行PCR。得到的PCR产物作为PCR产物no.12。纯化PCR产物，将其溶解在30μL水中。
用限制酶EcoRI和MunI消化pSGR-NC1和已纯化的PCR产物no.12，各HCV cDNA片段通过琼脂糖凝胶电泳进行分馏、纯化。将这2个DNA片段和Ligation Mix(TaKaRa Bio公司)混合，连接2个DNA片段。将如此得到的重组表达载体(具有引起氨基酸取代R2192L的核苷酸取代)命名为pSGR-NC1 R2192L。
以pSGR-NC1作为模板DNA，以6620S-Con.1(5’-TACGCGGGTGGG GGATTTCCACTA-3’(SEQ ID NO: 29))和2192RQ-R(5’-GGGGGACCCTTGG GCCAGCCTGCGCTTAGC-3’(SEQ ID NO: 39))作为引物，在上述PCR条件下进行PCR。得到的PCR产物作为PCR产物no.13。
接下来，以pSGR-NC1作为模板DNA，以2192RQ-S(5’-AGGCTGGCC CAAGGGTCCCCCCCCTCTTT-3’(SEQ ID NO: 40))和6447R-1b-rep(5’-ACGATAAGA CGAGCTGGCTT-3’(SEQ ID NO: 32))作为引物，在上述PCR条件下进行PCR。得到的PCR产物作为PCR产物no.14。
纯化各PCR产物，并溶解在15μL水中。将PCR产物no.13和PCR产物no.14的各1μL的DNA混合。以其作为模板DNA，以6620S-Con.1(5’-TACGCG GGTGGGGGATTTCCACTA-3’(SEQ ID NO: 29))和6447R-1b-rep(5’-ACGATAAGA CGAGCTGGCTT-3’(SEQ ID NO: 32))作为引物，在上述PCR条件下进行PCR。得到的PCR产物作为PCR产物no.15。纯化PCR产物，将其溶解在30μL水中。
用限制酶EcoRI和MunI消化pSGR-NC1和已纯化的PCR产物no.15，各HCV cDNA片段通过琼脂糖凝胶电泳进行分馏、纯化。将这2个DNA片段与Ligation Mix(TaKaRa Bio公司)混合，连接2个DNA片段。将如此得到的重组表达载体(具有引起氨基酸取代R2192Q的核苷酸取代)命名为pSGR-NC1 R2192Q。
以pSGR-NC1作为模板DNA，以7094S-1b-rep(5’-GTCGGTCGCG CACGATGCAT-3’(SEQ ID NO: 41))和2871YC-R(5’-TTCAATGGAGCAAGTGGCCCCGTAGATCT-3’(SEQ ID NO: 42))作为引物，在上述PCR条件下进行PCR。得到的PCR产物作为PCR产物no.16。
接下来，以pSGR-NC1作为模板DNA，以2871YC-S(5’-GGGGCCACT TGCTCCATTGAACCACTTGAC-3’(SEQ ID NO: 43))和6447R-1b-rep(5’-ACGATA AGACGAGCTGGCTT-3’(SEQ ID NO: 32))作为引物进行PCR。得到的PCR产物作为PCR产物no.17。
纯化各PCR产物，并溶解在15μL水中。将PCR产物no.16和PCR产物no.17的各1μL的DNA混合。以其作为模板DNA，以7094S-1b-rep(5’-GTCGGTCGC GCACGATGCAT-3’(SEQ ID NO: 41))和6447R-1b-rep(5’-ACGATAAGACGAGCTGGCTT-3’(SEQ ID NO: 32))作为引物，在上述PCR条件下进行PCR。得到的PCR产物作为PCR产物no.18。纯化PCR产物，将其溶解在30μL水中。
用限制酶EcoRI和MunI消化pSGR-NC1和已纯化的PCR产物no.18，各HCV cDNA片段通过琼脂糖凝胶电泳进行分馏、纯化。将这2个DNA片段和Ligation Mix(TaKaRa Bio公司)混合，连接2个DNA片段。将如此得到的重组表达载体(具有引起氨基酸取代Y2871C的核苷酸取代)命名为pSGR-NC1 Y2871C。
按照与实施例2相同的方法，由表达载体pSGR-NC1、pSGR-NC1 S2197Y、pSGR-NC1 S2204G、pSGR-NC1 P2161R、pSGR-NC1 R2192L、pSGR-NC1 R2192Q和pSGR-NC1 Y2871C合成HCV亚基因组复制子RNA。对于制作的合成HCV亚基因组复制子RNA，利用电穿孔法将各1μg的亚基因组复制子RNA导入Huh7细胞中。将进行了电穿孔处理的Huh7细胞接种在培养皿中，培养16小时～24小时，之后向培养皿中添加G418(新霉素)。之后，每周交换两次培养液，同时继续培养。自接种时起培养21天后，用结晶紫将活细胞染色。
其结果见图5。图中，“P2161R”、“R2192L”、“R2192Q”、“S2197Y”、“S2204G”、“野生型”、“Y2871C”分别显示导入了由pSGR-NC1 P2161R、pSGR-NC1 R2192L、pSGR-NC1 R2192Q、pSGR-NC1 S2197Y、pSGR-NC1 S2204G、pSGR-NC1、pSGR-NC1 Y2871C制作的HCV亚基因组复制子RNA的细胞的染色结果。
其结果，在任意一个导入了亚基因组复制子RNA的细胞中，均可确认到集落形成。另外，导入pSGR-NC1 P2161R、pSGR-NC1 R2192Q、pSGR-NC1 S2197Y、pSGR-NC1 S2204G的亚基因组复制子RNA时，集落形成能力高，pSGR-NC1 P2161R、pSGR-NC1 S2197Y的集落形成能力特别高(图5)。
因此，显示：即使向NC1株的HCV亚基因组复制子RNA中导入上述氨基酸突变，自主复制能力也得以维持或提高。特别是，显示：通过导入P2161R或S2197Y的氨基酸突变，NC1株的HCV亚基因组复制子RNA的自主复制能力显著提高。
(实施例6) 突变体NC1株的HCV全基因组复制子RNA(全长基因组RNA)表达载体的构建
为了评价通过将实施例4中发现的氨基酸取代导入到NC1株的HCV全基因组复制子RNA中，是否能够在培养细胞中产生HCV颗粒，构建了表达具有全长HCV基因组序列的HCV全基因组复制子RNA的质粒载体。
具体而言，用限制酶BsrGI和XbaI消化实施例1中制作的pNC1和实施例5中制作的各pSGR-NC1突变体(pSGR-NC1 S2197Y、pSGR-NC1 S2204G、pSGR-NC1 P2161R、pSGR-NC1 R2192L、pSGR-NC1 R2192Q和pSGR-NC1 Y2871C)，各HCV cDNA片段通过琼脂糖凝胶电泳进行分馏、纯化。在pNC1的DNA片段和各pSGR-NC1突变体的DNA片段中加入Ligation Mix(TaKaRa Bio公司)进行混合，连接2个DNA片段。将如此得到的具有氨基酸取代的HCV全基因组复制子RNA的表达载体命名为pNC1 S2197Y、pNC1 S2204G、pNC1 P2161R、pNC1 R2192L、pNC1 R2192Q和pNC1 Y2871C(图6)。需要说明的是，图中的“BsrGI”和“XbaI”显示限制酶位点。
(实施例7) 导入了突变体NC1株的HCV全基因组复制子RNA的细胞中的HCV颗粒产生能力的评价
用限制酶XbaI切断实施例6中得到的各表达载体，进行苯酚/氯仿提取、乙醇沉淀。接着，对XbaI切断片段进行绿豆核酸酶处理，从XbaI切断片段中除去来自XbaI识别序列的多余的3’末端的CTAG的4个核苷酸。接着，对包含XbaI切断片段的绿豆核酸酶处理后溶液进行蛋白激酶K处理、苯酚/氯仿提取、乙醇沉淀，纯化DNA片段。以其作为模板DNA，使用MEGAscript(注册商标) T7试剂盒(Ambion公司)进行RNA的合成。
RNA合成结束后，向反应溶液中添加2U的DNase，在37℃下反应15分钟，由此除去模板DNA，在使用酸性酚进行RNA提取，由此获得突变体NC1株的HCV全基因组复制子RNA。
此处得到的突变体NC1株的HCV全基因组复制子RNA也是NC1全长基因组RNA的突变体。需要说明的是，将导入有S2197Y、S2204G、P2161R、R2192L、R2192Q和Y2871C突变的NC1株的HCV全基因组复制子RNA、即NC1全长基因组RNA突变体分别称作“NC1 S2197Y”、“NC1 S2204G”、“NC1 P2161R”、“NC1 R2192L”、“NC1 R2192Q”和“NC1 Y2871C”。
利用电穿孔法，将得到的突变体NC1的10μg HCV全基因组复制子RNA导入(转染)到Huh7细胞中。将该电穿孔处理后的Huh7细胞接种在培养皿中，培养16小时～24小时，之后向培养皿中添加G418(新霉素)。之后，每周继代两次，同时继续培养。使用HCV抗原ELISA试验试剂盒(Ortho公司)，随时间定量培养上清中所含的HCV的核心蛋白，由此确认HCV颗粒的产生。
结果见图7。图中的“NC1/wt”显示导入了没有突变的野生型NC1株的HCV全基因组复制子RNA的细胞。另外，“P2161R”、“R2192L”、“R2192Q”、“S2197Y”、“S2204G”和“Y2871C”分别显示导入了各突变的突变体NC1的HCV全基因组复制子RNA的细胞。
在导入了野生型NC1株的HCV全基因组复制子RNA的细胞中，在培养上清中几乎检测不到核心蛋白。而在导入了S2197Y和S2204G的突变体HCV全基因组复制子RNA的细胞中，自导入RNA之后起在培养上清中检测到了核心蛋白，特别是，在S2197Y中核心蛋白量多。由此显示：将在野生型NC1株的HCV全基因组复制子RNA中导入了S2197Y或S2204G突变的突变体(NC1 S2197Y或NC1 S2204G)导入到培养细胞中时，向细胞外产生HCV颗粒。很有趣的是，在亚基因组复制子中集落形成能力(自主复制能力)高的P2161R，在全基因组复制子中，在其培养上清中几乎检测不到核心蛋白。
SEQ ID NO: 23显示pNC1 S2197Y编码的前体蛋白(核心蛋白～NS5B蛋白)的氨基酸序列，SEQ ID NO: 24显示pNC1 S2204G编码的前体蛋白的氨基酸序列。另外，SEQ ID NO: 19显示NC1 S2197Y的全长基因组RNA(由pNC1 S2197Y合成的突变体NC1株的HCV全基因组复制子RNA)的cDNA核苷酸序列，SEQ ID NO: 20显示NC1 S2204G的全长基因组RNA(由pNC1 S2204G合成的突变体NC1株的HCV全基因组复制子RNA)的cDNA核苷酸序列。
(实施例8) 来自NC1 S2197Y的HCV全基因组复制子RNA(全长基因组RNA)的HCV颗粒的感染性评价
进行了如下确认：在实施例7中确认到产生的来自NC1 S2197Y的HCV全基因组复制子RNA(全长基因组RNA)的HCV颗粒(以下记作NC1 S2197Y HCV颗粒)是否具有感染性。
与实施例7一样，利用电穿孔法将NC1 S2197Y HCV全基因组复制子RNA(全长基因组RNA)导入(转染)到Huh7细胞中，每隔3～7天进行继代培养。采集自导入细胞起第2天或第15天的培养上清，使用HCV抗原ELISA试验试剂盒(Ortho公司)，定量培养上清中所含的HCV的核心蛋白。
另外，向另外的Huh7细胞中添加所采集的培养上清，利用转化灶法计测72小时后的HCV感染细胞数，由此算出感染效价。更具体而言，将Huh7细胞接种在培养皿中，第二天，使用培养基进行了阶段稀释的培养上清感染细胞，在37℃下培养72小时。病毒感染细胞的检测通过利用抗原抗体反应的免疫染色法来进行。使感染72小时后的细胞在室温下度过20分钟，将其在10%福尔马林-PBS(-)溶液中固定，之后，在室温下用0.5%的Triton X-PBS(-)处理10分钟。之后，加入作为一次抗体的用5%脱脂牛奶-PBS(-)稀释的抗HCV-核心(克隆CP14)单克隆抗体(300倍稀释物)，在室温下反应1小时。再用PBS(-)清洗3次，之后加入HRP标记山羊抗小鼠抗体(300倍稀释物)，在室温下反应1小时。用PBS(-)清洗3次，之后加入Konica Immunostain HRP-1000(Konica Minolta公司)，在显微镜下测定染成蓝色的病毒抗原阳性细胞集团(免疫转化灶；还称作转化灶)的数量。
其结果见表1。表中的“NC1 S2197Y(D2)”显示自导入NC1 S2197Y起第2天的培养上清，“NC1 S2197Y(D15)”显示导入后第15天的培养上清。
[表1]
在第2天的培养上清中，感染效价是3ffu/mL，在第15天的培养上清中，感染效价是16ffu/mL。用该值除以培养上清中的HCV核心蛋白量(分别为1,721 fmol/L和1,009fmol/L)得到的、每单位HCV蛋白的感染效价如下：在第2天的培养上清中达到0.002(感染效价/核心值)，在第15天的培养上清中达到0.016(感染效价/核心值)。
由此显示：通过NC1 S2197Y HCV全基因组复制子RNA(全长基因组RNA)的细胞导入而产生的HCV颗粒具有感染性。
(实施例9) 导入有E1202G/K2040R/S2197Y的突变体NC1株的HCV全基因组复制子RNA(全长基因组RNA)的表达载体构建
据公知文献报道，引起作为非结构区的NS3蛋白区的第1202位的氨基酸取代、即E1202G的核苷酸取代(Krieger等人，J Virol．，2001年，第75卷，第4614-4624页)和同样引起作为非结构区的NS5A蛋白区的第2040位的氨基酸取代、即K2040R的核苷酸取代(Yi等人，J Virol．，2004年，第78卷，第7904-7915页)是HCV复制的适应性突变。将这些公知文献记载的适应性突变和上述实施例中得到的、促进NC1株的HCV全基因组复制子RNA(全长基因组RNA)的感染性HCV颗粒分泌的适应性突变一同导入。
具体而言，与实施例5一样，突变的导入利用PCR来进行。PCR条件如下。首先，向PCR的模板DNA中加入Phusion(注册商标) High-Fidelity DNA聚合酶试剂盒(FINNZYMES社)中附带的、10μL 5×缓冲液、4μL 2.5mM的dNTP混合液、0.25μL 100μM的引物(分别为正向和反向引物)，最终加入去离子水，使总量达到49.5μL。之后，加入0.5μL Phusion(注册商标) DNA聚合酶(FINNZYMES社)，进行PCR。PCR以98℃ 10秒、55℃ 15秒和72℃ 80秒作为1个循环，进行25个循环。
首先，以pNC1 S2197Y作为模板DNA，以3751S-NC1(5’-TGTGTTGGA CCGTCTACCAT-3’(SEQ ID NO: 44))和1b-1202EG-R(5’-GCATGGTGGTTC CCATGGACTCAACGGGTA-3’(SEQ ID NO: 45))作为引物，在上述PCR条件下进行PCR。得到的PCR产物作为PCR产物no.19。
接下来，以pNC1 S2197Y作为模板DNA，以1b-1202EG-S(5’-GTCCAT GGGAACCACCATGCGGTCTCCGGT-3’(SEQ ID NO: 46))和4598R-NC1(5’-CGGTAG TACGCTACAGCATT-3’(SEQ ID NO: 47))作为引物，在上述PCR条件下进行PCR。得到的PCR产物作为PCR产物no.20。
纯化各PCR产物，并溶解在15μL水中。将PCR产物no.19和PCR产物no.20的各1μL的DNA混合。以其作为模板DNA，以3751S-NC1(5’-TGTGTTGGACCGTCTACCAT-3’(SEQ ID NO: 44))和4598R-NC1(5’-CGGTAGTACGCTACAGCATT-3’(SEQ ID NO: 47))作为引物，在上述PCR条件下进行PCR。得到的PCR产物作为PCR产物no.21。纯化PCR产物，将其溶解在30μL水中。
用限制酶BsrGI和XhoI消化pNC1 S2197Y和已纯化的PCR产物no.21，各HCV cDNA片段通过琼脂糖凝胶电泳进行分馏、纯化。将这2个DNA片段与Ligation Mix(TaKaRa Bio公司)混合，连接2个DNA片段。将如此得到的重组表达载体(具有引起氨基酸取代S2197Y和E1202G的核苷酸取代)命名为pNC1 E1202G/S2197Y。需要说明的是，由pNC1 E1202G/S2197Y合成的HCV全基因组复制子RNA(全长基因组RNA)的序列见SEQ ID NO: 21。
以pNC1 S2197Y作为模板DNA，以5292S-NC1(5’-GCCGACCTG GAGGTCGTCAC-3’(SEQ ID NO: 48))和1b-2040KR-R(5’-GAACCGTTCCTG ACATGTCCACTGATCTGT-3’(SEQ ID NO: 49))作为引物，在上述PCR条件下进行PCR。得到的PCR产物作为PCR产物no.22。
接下来，以pNC1 S2197Y作为模板DNA，以1b-2040KR-S (5’-GGACATGTC AGGAACGGTTCCATGAGGATC-3’(SEQ ID NO: 50))和6789R-NC1(5’-GACCTG GAATGTGACCTCAT-3’(SEQ ID NO: 51))作为引物，在上述PCR条件下进行PCR。得到的PCR产物作为PCR产物no.23。
纯化各PCR产物，并溶解在15μL水中。将PCR产物no.22和PCR产物no.23的各1μl的DNA混合。以其作为模板DNA，以5292S-NC1(5’-GCCGACCTG GAGGTCGTCAC-3’(SEQ ID NO: 48))和6789R-NC1(5’-GACCTGGAATGTGACCTCAT-3’(SEQ ID NO: 51))作为引物，在上述PCR条件下进行PCR。得到的PCR产物作为PCR产物no.24。纯化PCR产物，将其溶解在30μL水中。
用限制酶FseI和EcoRI消化pNC1 S2197Y和已纯化的PCR产物no.24，各HCV cDNA片段通过琼脂糖凝胶电泳进行分馏、纯化。将这2个DNA片段与Ligation Mix(TaKaRa Bio公司)混合，连接2个DNA片段。将如此得到的重组表达载体(具有引起氨基酸取代S2197Y和K2040R的核苷酸取代)命名为pNC1 K2040R/S2197Y。
进行相同的操作，制作具有引起氨基酸取代E1202G、K2040R和S2197Y的核苷酸取代的重组表达载体pNC1 E1202G/K2040R/ S2197Y。这些重组表达载体的结构见图8。
(实施例10) 导入有E1202G/K2040R/S2204G的突变体NC1株的HCV全基因组复制子RNA(全长基因组RNA)的表达载体构建
与实施例5一样，突变的导入利用PCR来进行。PCR条件如下。首先，向PCR的模板DNA中加入Phusion(注册商标) High-Fidelity DNA聚合酶试剂盒(FINNZYMES公司)中附带的、10μL 5×缓冲液、4μL 2.5mM的dNTP混合液、0.25μL 100μM的引物(分别为正向和反向引物)，最终加入去离子水，使总量达到49.5μL。之后，加入0.5μL Phusion (注册商标) DNA聚合酶(FINNZYMES公司)，进行PCR。PCR以98℃ 10秒、55℃ 15秒和72℃ 80秒作为1个循环，进行25个循环。
以pNC1 S2204G作为模板DNA，以3751S-NC1(5’-TGTGTTGG ACCGTCTACCAT-3’(SEQ ID NO: 44))和1b-1202EG-R(5’-GCATGGT GGTTCCCATGGACTCAACGGGTA-3’(SEQ ID NO: 45))作为引物，在上述PCR条件下进行PCR。得到的PCR产物作为PCR产物no.25。
接下来，以pNC1 S2204G作为模板DNA，以1b-1202EG-S(5’-GTCCATGGG AACCACCATGCGGTCTCCGGT-3’(SEQ ID NO: 46))和4598R-NC1(5’-CGGTAGTAC GCTACAGCATT-3’(SEQ ID NO: 47))作为引物，在上述PCR条件下进行PCR。得到的PCR产物作为PCR产物no.26。
纯化各PCR产物，并溶解在15μL水中。将PCR产物no.25和PCR产物no.26的各1μL的DNA混合。以其作为模板DNA，以3751S-NC1(5’-TGTGTTGGACCGTCTACCAT-3’(SEQ ID NO: 44))和4598R-NC1(5’-CGGTAGTACGCTACAGCATT-3’(SEQ ID NO: 47))作为引物，在上述PCR条件下进行PCR。得到的PCR产物作为PCR产物no.27。纯化PCR产物，将其溶解在30μL水中。
用限制酶BsrGI和XhoI消化pNC1 S2204G和已纯化的PCR产物no.27，各HCV cDNA片段通过琼脂糖凝胶电泳进行分馏、纯化。将这2个DNA片段和Ligation Mix(TaKaRa Bio公司)混合，连接2个DNA片段。将如此得到的重组表达载体(具有引起氨基酸取代S2204G和E1202G的核苷酸取代)命名为pNC1 E1202G/S2204G。需要说明的是，由pNC1 E1202G/S2204G合成的HCV全基因组复制子RNA(全长基因组RNA)的序列见SEQ ID NO: 22。
以pNC1 S2204G作为模板DNA，以5292S-NC1(5’-GCCGACCTGGA GGTCGTCAC-3’(SEQ ID NO: 48))和1b-2040KR-R(5’-GAACCGTTCCTGACA TGTCCACTGATCTGT-3’(SEQ ID NO: 49))作为引物，在上述PCR条件下进行PCR。得到的PCR产物作为PCR产物no.28。
接下来，以pNC1 S2204G作为模板DNA，以1b-2040KR-S(5’-GGACATGTC AGGAACGGTTCCATGAGGATC-3’(SEQ ID NO: 50))和6789R-NC1(5’-GACCTGGAA TGTGACCTCAT-3’(SEQ ID NO: 51))作为引物，在上述PCR条件下进行PCR。得到的PCR产物作为PCR产物no.29。
纯化各PCR产物，并溶解在15μL水中。将PCR产物no.28和PCR产物no.29的各1μL的DNA混合。以其作为模板DNA，以5292S-NC1(5’-GCCGACCTGGAG GTCGTCAC-3’(SEQ ID NO: 48))和6789R-NC1(5’-GACCTGGAATGTGACCTCAT-3’(SEQ ID NO: 51))作为引物，在上述PCR条件下进行PCR。得到的PCR产物作为PCR产物no.30。纯化PCR产物，将其溶解在30μL水中。
用限制酶FseI和EcoRI消化pNC1 S2204G和已纯化的PCR产物no.30，各HCV cDNA片段通过琼脂糖凝胶电泳进行分馏、纯化。将这2个DNA片段与Ligation Mix(TaKaRa Bio公司)混合，连接2个DNA片段。将如此得到的重组表达载体(具有引起氨基酸取代S2204G和K2040R的核苷酸取代)命名为pNC1 K2040R/S2204G。
进行相同的操作，制作具有引起氨基酸取代E1202G、K2040R和S2204G的核苷酸取代的重组表达载体pNC1 E1202G/K2040R/ S2204G。这些重组表达载体的结构见图9。
(实施例11) 导入有S2197Y、S2204G、E1202G和K2040R的组合突变体NC1株的HCV全基因组复制子RNA的细胞中的HCV复制能力的评价
使用实施例1中构建的表达载体pNC1、实施例6中构建的表达载体pNC1 S2197Y和pNC1 S2204G、实施例9中构建的表达载体pNC1 E1202G/S2197Y、pNC1 K2040R/S2197Y和pNC1 E1202G/ K2040R/S2197Y以及实施例10中构建的表达载体pNC1 E1202G/ S2204G、pNC1 K2040R/S2204G和pNC1 E1202G/K2040R/ S2204G，利用与实施例7相同的方法，制作HCV全基因组复制子RNA(全长基因组RNA)。
需要说明的是，将来自导入有E1202G/S2197Y、K2040R/S2197Y、E1202G/K2040R/S2197Y、E1202G/S2204G、K2040R/S2204G和E1202G/K2040R/S2204G突变的NC1株的HCV全基因组复制子RNA(NC1全长基因组RNA突变体)分别称为“NC1 E1202G/S2197Y”、“NC1 K2040R/S2197Y”、“NC1 E1202G/K2040R/S2197Y”、“NC1 E1202G/S2204G”、“NC1 K2040R/S2204G”和“NC1 E1202G/K2040R/ S2204G”。
利用电穿孔法，将所得的作为HCV全基因组复制子RNA(全长基因组RNA)的NC1(野生型)(SEQ ID NO: 1)、NC1 S2197Y(SEQ ID NO: 19)、NC1 S2204G(SEQ ID NO: 20)、NC1 E1202G/S2197Y(SEQ ID NO: 21)、NC1 K2040R/S2197Y、NC1 E1202G/K2040R /S2197Y、NC1 E1202G/S2204G(SEQ ID NO: 22)、NC1 K2040R/S2204G和NC1 E1202G /K2040R/S2204G分别导入(转染)到Huh7细胞中。回收自导入起4、24、48、72和96小时后的细胞，使用HCV抗原ELISA试验试剂盒(Ortho公司)，定量其细胞内所含的HCV核心蛋白，由此进行细胞内的HCV复制能力的评价。
其结果见图10。图中的“NC1/wt”显示导入了没有突变的野生型NC1株的HCV全基因组复制子RNA的细胞。另外，“S2197Y”、“S2204G”、“E1202G/S2197Y”、“E1202G/S2204G”、“K2040R/ S2197Y”、“K2040R/S2204G”、“E1202G/K2040R/S2197Y”和“E1202G/ K2040R/S2204G”分别显示导入了导入有各突变的突变体NC1株的HCV全基因组复制子RNA的细胞。
在导入了野生型NC1株的HCV全基因组复制子RNA的细胞中，几乎没有检测到细胞中的核心蛋白的表达。另一方面，在导入了突变体NC1株的HCV全基因组复制子RNA的细胞中，自导入RNA之后起细胞内核心蛋白量上升，特别是E1202G/S2197Y和E1202G/S2204G的突变体显示出高值。向这些突变中进一步导入了K2040R突变的E1202G/K2040R/S2197Y和E1202G/K2040R/S2204G的突变导入时，倒不如说其细胞内核心蛋白量减少。
由此显示：将在野生型NC1株的HCV全基因组复制子RNA中导入了E1202G/S2197Y或E1202G/S2204G突变的突变体(NC1 E1202G/S2197Y(SEQ ID NO: 21)或NC1 E1202G/S2204G(SEQ ID NO: 22))导入培养细胞中时，其在细胞内高效率地进行自主复制。
(实施例12) 导入了S2197Y、S2204G、E1202G和K2040R的组合突变体NC1株的HCV全基因组复制子RNA的细胞中的HCV颗粒产生能力的评价
通过定量在实施例11中导入(转染)了HCV全基因组复制子RNA(全长基因组RNA)的Huh7细胞的培养上清中的HCV核心蛋白，评价HCV颗粒产生量。回收自导入HCV全基因组复制子RNA起4、24、48、72和96小时后的培养上清，使用HCV抗原ELISA试验试剂盒(Ortho公司)进行其培养上清中所含的HCV核心蛋白的定量。
其结果见图11。图中的“NC1/wt”显示导入了没有突变的野生型NC1株的HCV全基因组复制子RNA的细胞。另外，“S2197Y”、“S2204G”、“E1202G/S2197Y”、“E1202G/S2204G”、“K2040R/ S2197Y”、“K2040R/S2204G”、“E1202G/K2040R/S2197Y”和“E1202G/ K2040R/S2204G”分别显示导入了导入有各突变的突变体NC1株的HCV全基因组复制子RNA的细胞。
在导入了野生型NC1株的HCV全基因组复制子RNA的细胞中，几乎没有检测到培养上清中的核心蛋白。另一方面，在突变体NC1株的HCV全基因组复制子RNA的导入中，自导入RNA之后起培养上清中的核心蛋白量上升，特别是E1202G/S2197Y和E1202G/S2204G的突变体显示出高值。当在这些突变中进一步导入了K2040R突变的E1202G/K2040R/S2197Y和E1202G/K2040R/S2204G的突变导入时，倒不如说其培养上清中的核心蛋白减少。
由此显示：将在野生型NC1株的HCV全基因组复制子RNA中导入了E1202G/S2197Y或E1202G/S2204G突变的突变体(NC1 E1202G/S2197Y(SEQ ID NO: 21)或NC1 E1202G/S2204G(SEQ ID NO: 22))导入培养细胞中时，其在培养上清中高效率地产生HCV颗粒。
SEQ ID NO: 25显示pNC1 E1202G/S2197Y编码的前体蛋白(核心蛋白～NS5B蛋白)的氨基酸序列，SEQ ID NO: 26显示pNC1 E1202G/ S2204G编码的前体蛋白的氨基酸序列。另外，SEQ ID NO: 21显示NC1 E1202G/S2197Y的全长基因组RNA(由pNC1 E1202G/S2197Y合成的突变体NC1株的HCV全基因组复制子RNA)的cDNA核苷酸序列，SEQ ID NO: 22显示NC1 E1202G/S2204G的全长基因组RNA(由pNC1 E1202G/S2204G合成的突变体NC1株的HCV全基因组复制子RNA)的cDNA的核苷酸序列。
(实施例13) 来自NC1 E1202G/S2197Y和NC1 E1202G/S2204G的HCV全基因组复制子RNA(全长基因组RNA)的HCV颗粒的感染性评价
进行了如下确认：在实施例12中确认到产生的来自NC1 S2197Y、NC1 E1202G/S2197Y、NC1 E1202G/K2040R/S2197Y、NC1 S2204G、NC1 E1202G/S2204G和NC1 E1202G/K2040R /S2204G的HCV全基因组复制子RNA(全长基因组RNA)的HCV颗粒是否具有感染性。
使用在实施例12中将HCV全基因组复制子RNA(全长基因组RNA)导入(转染)到Huh7细胞中的72小时后的培养上清，与实施例8一样，利用转化灶法计测HCV感染细胞数，由此算出感染效价。另外，与实施例8一样，使用HCV抗原ELISA试验试剂盒(Ortho公司)，定量培养上清中所含的HCV的核心蛋白。
其结果见表2。在NC1 S2197Y的培养上清中，感染效价为23.3 ffu/mL，在NC1 S2204G的培养上清中，感染效价为13.3ffu/mL，相对于此，在NC1 E1202G/S2197Y的培养上清中，感染效价显示出792.0 ffu/mL的高值，在NC1 E1202G/S2204G的培养上清中，感染效价显示出675.0ffu/mL的高值。另外，用各感染效价除以培养上清中的HCV核心蛋白量而得到的值如下：在NC1 S2197Y的培养上清中为0.009、在NC1 S2204G的培养上清中为0.008，相对于此，在NC1 E1202G/S2197Y的培养上清中为0.097、在NC1 E1202G/S2204G的培养上清中为0.097。
[表2]
Figure 37747DEST_PATH_IMAGE002
由此显示：由导入有在野生型NC1株的HCV全基因组复制子RNA中导入了E1202G/S2197Y或E1202G/S2204G突变的突变体(NC1 E1202G/S2197Y(SEQ ID NO: 21)或NC1 E1202G/S2204G(SEQ ID NO: 22))的细胞产生的HCV颗粒具有高的感染性。
序列表中记载的序列如下：
SEQ ID NO: 1是野生型NC1株的全长基因组RNA的cDNA序列(图1A)；
SEQ ID NO: 2是野生型NC1株基因组RNA的5’UTR的cDNA核苷酸序列；
SEQ ID NO: 3是野生型NC1株基因组RNA的核心蛋白编码序列的cDNA核苷酸序列
SEQ ID NO: 4是野生型NC1株基因组RNA的E1蛋白编码序列的cDNA核苷酸序列；
SEQ ID NO: 5是野生型NC1株基因组RNA的E2蛋白编码序列的cDNA核苷酸序列；
SEQ ID NO: 6是野生型NC1株基因组RNA的p7蛋白编码序列的cDNA核苷酸序列；
SEQ ID NO: 7是野生型NC1株基因组RNA的NS2蛋白编码序列的cDNA核苷酸序列；
SEQ ID NO: 8是野生型NC1株基因组RNA的NS3蛋白编码序列的cDNA核苷酸序列；
SEQ ID NO: 9是野生型NC1株基因组RNA的NS4A蛋白编码序列的cDNA核苷酸序列；
SEQ ID NO: 10是野生型NC1株基因组RNA的NS4B蛋白编码序列的cDNA核苷酸序列；
SEQ ID NO: 11是野生型NC1株基因组RNA的NS5A蛋白编码序列的cDNA核苷酸序列；
SEQ ID NO: 12是野生型NC1株基因组RNA的NS5B蛋白编码序列的cDNA核苷酸序列；
SEQ ID NO: 13是野生型NC1株基因组RNA的3’UTR的cDNA核苷酸序列；
SEQ ID NO: 14是野生型NC1株的前体蛋白的氨基酸序列；
SEQ ID NO: 15是野生型NC1株的前体蛋白中的从NS3蛋白到NS5B蛋白的区的氨基酸序列；
SEQ ID NO: 16是野生型NC1株的HCV亚基因组复制子RNA的cDNA核苷酸序列(图1D)；
SEQ ID NO: 17是由pSGR-NC1 S2197Y合成的、突变体NC1 S2197Y的HCV亚基因组复制子RNA的cDNA核苷酸序列；
SEQ ID NO: 18是由pSGR-NC1 S2204G合成的、突变体NC1 S2204G的HCV亚基因组复制子RNA的cDNA核苷酸序列；
SEQ ID NO: 19是突变体NC1 S2197Y的全长基因组RNA(由pNC1 S2197Y合成的突变体NC1株的HCV全基因组复制子RNA)的cDNA核苷酸序列；
SEQ ID NO: 20是突变体NC1 S2204G的全长基因组RNA(由pNC1 S2204G合成的突变体NC1株的HCV全基因组复制子RNA)的cDNA核苷酸序列；
SEQ ID NO: 21是突变体NC1 E1202G/S2197Y的全长基因组RNA(由pNC1 E1202G/S2197Y合成的突变体NC1株的HCV全基因组复制子RNA)的cDNA核苷酸序列；
SEQ ID NO: 22是突变体NC1 E1202G/S2204G的全长基因组RNA(由pNC1 E1202G/S2204G合成的突变体NC1株的HCV全基因组复制子RNA)的cDNA核苷酸序列；
SEQ ID NO: 23是pNC1 S2197Y编码的前体蛋白的氨基酸序列；
SEQ ID NO: 24是pNC1 S2204G编码的前体蛋白的氨基酸序列；
SEQ ID NO: 25是pNC1 E1202G/S2197Y编码的前体蛋白的氨基酸序列；
SEQ ID NO: 26是pNC1 E1202G/S2204G编码的前体蛋白的氨基酸序列；
SEQ ID NO: 27是引物
5’-TAATACGACTCACTATAG-3’；
SEQ ID NO: 28是引物
5’-GCGGCTCACGGACCTTTCAC-3’；
SEQ ID NO: 29是引物6620S-Con.1
5’-TACGCGGGTGGGGGATTTCCACTA-3’；
SEQ ID NO: 30是引物3197SY-R
5’-GCTGGCCAAATAGGGGGGGGACCCTCGGGC-3’；
SEQ ID NO: 31是引物3197SY-S
5’-TCCCCCCCCTATTTGGCCAGCTCTTCAGCT-3’；
SEQ ID NO: 32是引物6447R-1b-rep
5’-ACGATAAGACGAGCTGGCTT-3’；
SEQ ID NO: 33是引物2204SG-R
5’-GACAACTGACCAGCTGAAGAGCTGGCCAAA-3’；
SEQ ID NO: 34是引物2204SG-S
5’-CTCTTCAGCTGGTCAGTTGTCTGCGGTCTC-3’；
SEQ ID NO: 35是引物2161PR-R
5’-GGGTTCACATCGAAGCTGTGACCCGACC-3’；
SEQ ID NO: 36是引物2161PR-S
5’-TCACAGCTTCGATGTGAACCCGAGCCGGAT-3’；
SEQ ID NO: 37是引物2192RL-R
5’-GGGGGACCCTAGGGCCAGCCTGCGCTTAGC-3’；
SEQ ID NO: 38是引物2192RL-S
5’-AGGCTGGCCCTAGGGTCCCCCCCCTCTTT-3’；
SEQ ID NO: 39是引物2192RQ-R
5’-GGGGGACCCTTGGGCCAGCCTGCGCTTAGC-3’；
SEQ ID NO: 40是引物2192RQ-S
5’-AGGCTGGCCCAAGGGTCCCCCCCCTCTTT-3’；
SEQ ID NO: 41是引物7094S-1b-rep
5’-GTCGGTCGCGCACGATGCAT-3’；
SEQ ID NO: 42是引物2871YC-R
5’-TTCAATGGAGCAAGTGGCCCCGTAGATCT-3’；
SEQ ID NO: 43是引物2871YC-S
5’-GGGGCCACTTGCTCCATTGAACCACTTGAC-3’；
SEQ ID NO: 44是引物3751S-NC1
5’-TGTGTTGGACCGTCTACCAT-3’；
SEQ ID NO: 45是引物1b-1202EG-R
5’-GCATGGTGGTTCCCATGGACTCAACGGGTA-3’；
SEQ ID NO: 46是引物1b-1202EG-S
5’-GTCCATGGGAACCACCATGCGGTCTCCGGT-3’；
SEQ ID NO: 47是引物4598R-NC1
5’-CGGTAGTACGCTACAGCATT-3’；
SEQ ID NO: 48是引物5292S-NC1
5’-GCCGACCTGGAGGTCGTCAC-3’；
SEQ ID NO: 49是引物1b-2040KR-R
5’-GAACCGTTCCTGACATGTCCACTGATCTGT-3’；
SEQ ID NO: 50是引物1b-2040KR-S
5’-GGACATGTCAGGAACGGTTCCATGAGGATC-3’；
SEQ ID NO: 51是引物6789R-NC1
5’-GACCTGGAATGTGACCTCAT-3’；
SEQ ID NO: 52是由pSGR-NC1 P2161R合成的、突变体NC1 P2161R的HCV亚基因组复制子RNA的cDNA核苷酸序列。
产业实用性
可以提供在培养细胞中能够扩增、且产生基因型1b的感染性HCV颗粒的全基因组复制子RNA，可利用于抑制基因型1b的HCV的感染和复制的抗HCV药的筛选、用于解明HCV的复制机制的研究、HCV疫苗的开发等。另外，还可以提供具有高的复制能力的亚基因组复制子RNA，可利用于筛选抑制基因型1b的HCV的复制的抗HCV药。
序列表自由文本
SEQ ID NO: 27～SEQ ID NO: 51是引物。
Figure IDA0000389927240000011
Figure IDA0000389927240000021
Figure IDA0000389927240000031
Figure IDA0000389927240000041
Figure IDA0000389927240000051
Figure IDA0000389927240000071
Figure IDA0000389927240000081
Figure IDA0000389927240000091
Figure IDA0000389927240000101
Figure IDA0000389927240000111
Figure IDA0000389927240000121
Figure IDA0000389927240000131
Figure IDA0000389927240000151
Figure IDA0000389927240000161
Figure IDA0000389927240000181
Figure IDA0000389927240000191
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Claims (20)

1. 核酸，其包含序列表的SEQ ID NO: 1所示核苷酸序列，其中，当该核酸为RNA时，将SEQ ID NO: 1所示核苷酸序列中的胸腺嘧啶t理解成尿嘧啶u。
2. 核酸，其是在权利要求1所述核酸的核苷酸序列中具有突变的核酸，当以序列表的SEQ ID NO: 14所示氨基酸序列为基准时，具有引起下述(i)或(ii)的取代的突变，所述的SEQ ID NO: 14所示氨基酸序列为由序列表的SEQ ID NO: 1所示核苷酸编号342～9374的序列编码的氨基酸序列，
(i) 第2197位的丝氨酸取代成酪氨酸；
(ii) 第2204位的丝氨酸取代成甘氨酸。
3. 核酸，其是在权利要求2所述核酸的核苷酸序列中具有突变的核酸，当以序列表的SEQ ID NO: 14所示氨基酸序列为基准时，具有引起下述(iii)的取代的突变，所述的SEQ ID NO: 14所示氨基酸序列为由序列表的SEQ ID NO: 1所示核苷酸编号342～9374的序列编码的氨基酸序列，
(iii) 第1202位的谷氨酸取代成甘氨酸。
4. 丙型肝炎病毒，其中含有权利要求2或3所述的核酸作为病毒基因组。
5. 核酸，其从5’侧朝着3’侧依次包含来自两种以上的丙型肝炎病毒基因组的分别编码核心蛋白、E1蛋白、E2蛋白、p7蛋白、NS2蛋白、NS3蛋白、NS4A蛋白、NS4B蛋白、NS5A蛋白和NS5B蛋白的核苷酸序列，其中，编码NS3蛋白、NS4A蛋白、NS4B蛋白、NS5A蛋白和NS5B蛋白的各核苷酸序列来自权利要求2或3所述的核酸。
6. 权利要求5所述的核酸，其中，编码NS2蛋白的核苷酸序列的至少一部分来自权利要求2或3所述的核酸。
7. 权利要求5或6所述的核酸，其中，在编码上述核心蛋白的核苷酸序列的5’侧包含丙型肝炎病毒基因组的5’非翻译区；
在编码上述NS5B蛋白的核苷酸序列的3’侧包含来自权利要求2或3所述的核酸的3’非翻译区。
8. 权利要求5～7中任一项所述的核酸，其中，上述两种以上的丙型肝炎病毒基因组包含JFH-1株、J6CF株或TH株的基因组。
9. 丙型肝炎病毒，其含有权利要求5～8中任一项所述的核酸作为病毒基因组。
10. 丙型肝炎病毒的全基因组复制子RNA，其包含权利要求2、3或5～8中任一项所述的核酸。
11. 表达载体，其包含权利要求2、3或5～8中任一项所述的核酸。
12. 细胞，该细胞被导入权利要求2、3或5～8中任一项所述的核酸或权利要求10所述的全基因组复制子RNA，或者被感染权利要求4或9所述的丙型肝炎病毒，而产生丙型肝炎病毒颗粒。
13. 丙型肝炎病毒疫苗，其中含有权利要求4或9所述的丙型肝炎病毒或其一部分。
14. 丙型肝炎病毒的中和抗体，该中和抗体将权利要求4或9所述的丙型肝炎病毒识别为抗原。
15. 筛选抗丙型肝炎病毒物质的方法，该方法具备下述步骤：
培养步骤：在受检物质的存在下和不存在下，培养权利要求12所述的细胞、或者权利要求4或9所述的丙型肝炎病毒与丙型肝炎病毒敏感性细胞的混合物；
定量步骤：定量上述培养步骤中在培养物中得到的来自丙型肝炎病毒的RNA或丙型肝炎病毒颗粒的量；以及
评价步骤：上述定量步骤的结果，当在上述受检物质的存在下培养的培养物中检测到的来自丙型肝炎病毒的RNA或丙型肝炎病毒颗粒的量较在上述受检物质的不存在下培养的培养物中检测到的来自丙型肝炎病毒的RNA或丙型肝炎病毒颗粒的量少时，评价为上述受检物质具有抗丙型肝炎病毒活性。
16. 核酸，其中含有：序列表的SEQ ID NO: 1的、由核苷酸编号1～341的序列组成的5’非翻译区、编码由核苷酸编号3420～5312的序列组成的NS3蛋白的核苷酸序列、编码由核苷酸编号5313～5474的序列组成的NS4A蛋白的核苷酸序列、编码由核苷酸编号5475～6257的序列组成的NS4B蛋白的核苷酸序列、编码由核苷酸编号6258～7598的序列组成的NS5A蛋白的核苷酸序列、编码由核苷酸编号7599～9374的序列组成的NS5B蛋白的核苷酸序列、和由核苷酸编号9375～9607的序列组成的3’非翻译区。
17. 核酸，其是在权利要求16所述核酸的核苷酸序列中具有突变的核酸，以序列表的SEQ ID NO: 14所示的氨基酸序列为基准时，具有引起下述(a)～(e)的任意一个取代的突变，所述的SEQ ID NO: 14所示的氨基酸序列为由序列表的SEQ ID NO: 1所示核苷酸编号342～9374的序列编码的氨基酸序列，
(a) 第2197位的丝氨酸取代成酪氨酸；
(b) 第2204位的丝氨酸取代成甘氨酸；
(c) 第2197位的丝氨酸取代成酪氨酸和第1202位的谷氨酸取代成甘氨酸；
(d) 第2204位的丝氨酸取代成甘氨酸和第1202位的谷氨酸取代成甘氨酸；
(e) 第2161位的脯氨酸取代成精氨酸。
18. 丙型肝炎病毒的亚基因组复制子RNA，其中包含权利要求16或17所述的核酸。
19. 表达载体，其中包含权利要求16或17所述的核酸。
20. 筛选抗丙型肝炎病毒物质的方法，该方法具备下述步骤：
培养步骤：在受检物质的存在下和不存在下，培养导入有权利要求18所述的亚基因组复制子RNA的丙型肝炎病毒敏感性细胞；
定量步骤：定量上述培养步骤中在培养物中得到的亚基因组复制子RNA的量；以及
评价步骤：上述定量步骤的结果，当在上述受检物质的存在下培养的培养物中检测到的亚基因组复制子RNA的量较在上述受检物质的不存在下培养的培养物中检测到的亚基因组复制子RNA的量少时，评价为上述受检物质具有抗丙型肝炎病毒活性。
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