JP2001017187A - Ｃ型肝炎ウイルス細胞培養系、ｃ型肝炎ウイルス−ｒｎａ−構築物、細胞培養系または構築物の使用、ｃ型肝炎ウイルス−ｒｎａ−構築物の細胞培養に適合した突然変異体を獲得する方法、ｃ型肝炎ウイルス−全長ゲノム、ｃ型肝炎ウイルス−部分ゲノム、または任意のｃ型肝炎ウイルス−構築物の突然変異体の製法、細胞培養に適合したｃ型肝炎ウイルス−構築物、その突然変異体、ｃ型肝炎ウイルス−全長ゲノムの突然変異体、ｃ型肝炎ウイルス粒子またはウイルス様粒子、およびこれで感染した細胞 - Google Patents

Ｃ型肝炎ウイルス細胞培養系、ｃ型肝炎ウイルス−ｒｎａ−構築物、細胞培養系または構築物の使用、ｃ型肝炎ウイルス−ｒｎａ−構築物の細胞培養に適合した突然変異体を獲得する方法、ｃ型肝炎ウイルス−全長ゲノム、ｃ型肝炎ウイルス−部分ゲノム、または任意のｃ型肝炎ウイルス−構築物の突然変異体の製法、細胞培養に適合したｃ型肝炎ウイルス−構築物、その突然変異体、ｃ型肝炎ウイルス−全長ゲノムの突然変異体、ｃ型肝炎ウイルス粒子またはウイルス様粒子、およびこれで感染した細胞

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Abstract

(57)【要約】 【課題】 ＨＣＶ−ＲＮＡ又はＨＣＶ−抗原を直接、信
頼できるかつ実験室で通常の簡単な方法で検出できる細
胞培養系を提供する。 【解決手段】 ＨＣＶ特異的ＲＮＡ断片である５′ＮＴ
Ｒ、ＮＳ３、ＮＳ４Ａ、ＮＳ４Ｂ、ＮＳ５Ａ、ＮＳ５Ｂ
および３′ＮＴＲならびに付加的に少なくとも１つの選
択可能なマーカー遺伝子（選択遺伝子）を有するＨＣＶ
−ＲＮＡ−構築物を感染させたヒト肝細胞からなるＣ型
肝炎ウイルス（ＨＣＶ）細胞培養系を使用する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、導入されたＨＣＶ
−特異的遺伝子材料を含有する、つまりＨＣＶ−特異的
遺伝子材料がトランスフェクションされている主に真核
細胞を包含するＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）細胞培養系
に関する。
【０００２】
【従来の技術】Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）は世界的規
模での慢性及び急性の肝疾患の主要な原因である。たい
ていのＨＣＶ感染は認識できる臨床的症状なしで進行
し、感染者の８０〜９０％が持続的なウイルスキャリア
となり、この持続的ウイルスキャリアの５０％が多様な
症状の慢性肝炎になる。この慢性感染者の約２０％が１
０〜２０年の経過において肝硬変に進行し、その結果第
１次肝細胞ガンが生じることがある。この慢性のＣ型肝
炎は今日では肝臓移植が主な感染原因である。原因療法
はまだ存在しない。現在提供可能な若干の治療法はイン
ターフェロン−アルファの又はインターフェロン−アル
ファとプリン−ヌクレオシド類似体のリバビリンとから
の組み合わせの高い用量での投与である。全治療者の約
６０％がこの治療法に効果を示すだけであり、その際
に、全ての事例の半分以上が治療の中止後に新たなウイ
ルス血症に至る。
【０００３】工業国においても、罹患率が高く、慢性感
染の深刻な結果及び原因療法がないために、ＨＣＶ−特
異的化学療法の発展が製薬学の研究及び開発の重大な目
標である。この際の主要な問題は、今まで、真核細胞中
でのウイルス−複製及び発病の研究を可能にする適当な
細胞培養系がなかったことである。
【０００４】血中及び組織中でのわずかなウイルス量の
ため、適当な細胞培養系又は動物モデル（今日までチン
パンジーが唯一可能な試験動物である）がないため、並
びにウイルス様の粒子を製造する有効な系もないため、
ＨＣＶ−粒子の分子組成は今日まで詳細には研究もしく
は解明されていない。現在存在する結果は次のようにま
とめることができる：ＨＣＶは、５０〜６０ｎｍの粒子
直径及び１．０３〜１．１ｇ／ｍｌの平均密度を有する
外被を有するプラス鎖のＲＮＡウイルスである。これは
最初に１９８９年に分子的にクローニングされ、特性決
定された（Chooet al., 1989: Science, 244, 359-36
2）。このＨＣＶ−ＲＮＡは約９．６ｋｂ（＝９６００
ヌクレオチド）の長さ及び正の極性を有し、約３０１０
個のアミノ酸の線状ポリタンパク質をコードする唯一の
オープンリーディングフレーム（ORF = open reading f
rame）を有する（Rice 1996, in Virology, B. N. Fiel
ds,D. M. Knipe, P. M. Howley, Eds. (Lippincott-Rav
en, Philadelphia, PA, 1996), vol. 1, pp. 931-960;
Clarke 1997, J. Gen. Virol. 78, 2397; and Bartensc
hlager 1997, Intervirology 40, 378 and Fig. 1 A参
照）。ウイルス複製においてこのポリタンパク質は細胞
の及びウイルスのプロテアーゼによって成熟した、機能
的に活性のタンパク質の形に分解される。
【０００５】ポリタンパク質の中で、タンパク質は次の
ように配列されている（アミノ末端からカルボキシ末端
へ）：Ｃｏｒｅ-Ｅ１-Ｅ２-ｐ７-ＮＳ２-ＮＳ３-ＮＳ４
Ａ-ＮＳ４Ｂ-ＮＳ５Ａ-ＮＳ５Ｂ。このコア−タンパク
質（Core-Protein）はヌクレオキャプシドの主成分であ
る。糖タンパク質Ｅ１及びＥ２は膜貫通タンパク質であ
り、ウイルス外被の主成分である。このタンパク質は宿
主細胞へのウイルスの付着の際におそらく重要な役割が
あると考えられる。この３種のタンパク質のコア、Ｅ１
及びＥ２はウイルス粒子を構築し、従って構造タンパク
質として表される。タンパク質ｐ７の機能は未だに明ら
かではない。タンパク質ＮＳ２はおそらくＮＳ２−３プ
ロテアーゼの接触ドメインであり、これはタンパク質Ｎ
Ｓ２とＮＳ３との間のプロセシング（Prozesierung）に
関与している。タンパク質ＮＳ３は２つの機能を有して
おり、つまり、アミノ末端のドメインにおいてポリタン
パク質プロセシングに不可欠のプロテアーゼ活性を有
し、かつカルボキシ末端のドメインにおいてはおそらく
ウイルスＲＮＡの複製の際に重要な役割があると考えら
れるＮＴＰａｓｅ／ヘリカーゼ−機能を有する。タンパ
ク質ＮＳ４ＡはＮＳ３−プロテアーゼのコファクターで
ある。タンパク質ＮＳ４Ｂの機能はわかっていない。
【０００６】このオープンリーディングフレームは、
５′末端に約３４０個のヌクレオチドの長さの翻訳され
ない領域（ＮＴＲ＝non-translated region）があり、
これは内部のリボソームエントリー位置（ＩＲＥＳ＝in
ternal ribosome entry site）として機能し、３′末端
には約２３０個のヌクレオチドの長さのＮＴＲがあり、
これは高い可能性でゲノム複製にとって重要である。こ
のような３′ＮＴＲはＰＣＴ／ＵＳ９６／１４０３３の
特許出願の対象である。ポリタンパク質のアミノ末端区
域中の構造タンパク質は、宿主細胞のシグナルペプチダ
ーゼにより分解される。非−構造タンパク質（ＮＳ）２
〜（ＮＳ）５Ｂは２つのウイルス酵素によって、つまり
ＮＳ２−３及びＮＳ３／４Ａプロテイナーゼによってプ
ロセシングされる。このＮＳ３／４Ａプロテイナーゼは
ＮＳ３のカルボキシ末端の向こう側の全ての分解にとっ
て必要である。ＮＳ４Ｂの役割は未だ明らかではない。
ＮＳ５Ａは高度にリン酸化されたタンパク質であり、イ
ンターフェロンに対する多様なＨＣＶ−遺伝子型の耐性
に関与していると考えられ（Enomoto et al. 1995, J.
Clin. Invest. 96, 224; Enomoto et al. 1996, N. Eng
l. J. Med. 334, 77;Gale Jr. et al. 1997, Virology
230, 217; Kaneko et al. 1994, Biochem. Biophys. Re
s. Commun. 205, 320; Reed et al., 1997, J. Virol.
71, 7187参照）、ＮＳ５ＢはＲＮＡ依存性のＲＮＡポリ
メラーゼとして同定された。
【０００７】この認識をもとにして、ＲＴ−ＰＣＲ（＝
逆転写ポリメラーゼ連結反応）を用いた患者の血清中で
のＨＣＶ特異的抗体の検出に基づくか又はＨＣＶ特異的
ＲＮＡの検出に基づく診断系が開発され、この診断系は
通常の及び／又は規定に従い全ての保存血液において適
用しなければならない。
【０００８】Genoms 1989の最初の記載以来、ＰＣＲ法
を用いてＨＣＶの多数の部分配列及び完全配列がクロー
ニングされ、特性決定された。この配列の比較は、ウイ
ルスゲノムの特にＮＳ５Ｂ−遺伝子の領域内での高い変
異性を示し、これは最終的に６つの遺伝子系に分類さ
れ、これらはさらにサブタイプａ、ｂ及びｃに細分化さ
れる。ゲノムの分散はゲノムにわたって均質に分布して
いない。従って、５′ＮＴＲ及び３′ＮＴＲの一部は高
い確率で維持されているが、一方で特定のコードする配
列、特にコートタンパク質Ｅ１及びＥ２は現在きわめて
著しく変化している。
【０００９】クローニングされ、特性決定されたＨＣＶ
ゲノムの部分配列及び完全配列はさらに見込みのある抗
ウイルス性治療薬のための適当な攻撃標的として研究さ
れた。この場合、このような攻撃標的として考えられる
３つのウイルス性酵素が発見された。これらは（１）Ｎ
Ｓ３／４Ａプロテアーゼ複合体、（２）ＮＳ３ヘリカー
ゼ及び（３）ＮＳ５Ｂ ＲＮＡ−依存性ＲＮＡポリメラ
ーゼである。ＮＳ３／４Ａプロテアーゼ複合体及びＮＳ
３ヘリカーゼはすでに結晶化され、その３次元的構造に
関して解明することができており（Kim et al., 1996,
Cell, 87, 343;Yem et al., 1998, Protein Science,
7, 837; Love et al., 1996, Cell, 87,311; Kim et a
l., 1998, Structure, 6, 89; Yao et al., Nature Str
ucturalBiology, 4, 463, Cho et al., 1998, J. Biol.
Chem., 273, 15045）、ＮＳ５Ｂ ＲＮＡ依存性ＲＮＡ
ポリメラーゼの解明が今日までなお成功していない。
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】この酵素を用いた重要
な攻撃標的は慢性ＨＣＶ感染の治療法の開発のために定
義されているにもかかわらず、かつ「合理的ドラックデ
ザイン」を用いて並びに「高いスループットスクリーニ
ング」を用いて世界的に適当な阻害剤を集中的に探して
いるにもかかわらず、この治療法の発展は著しい欠乏に
直面している、つまり、ＨＣＶ−ＲＮＡ又はＨＣＶ−抗
原を直接、信頼できるかつ実験室で通常の簡単な方法で
検出できる細胞培養系又は簡単な動物モデルの欠乏に直
面している。このような細胞培養系の不足は、ＨＣＶ−
複製の理解が今日までなおも不備でありかつかなりの部
分で未だ仮説であることに対する主要な原因である。
【００１１】専門分野の解釈によると、ＨＣＶとフラビ
ウイルス及びペスチウイルスとの間に狭い進化的関連が
あり、多様な細胞系において簡単に複製することができ
かつこの場合比較的高い収率が示されている自律複製Ｒ
ＮＡについて説明されているにもかかわらず（Khromykh
et al., 1997, J. Virol. 71, 1497; Behrens et al.,
1998, J. Virol. 72, 2364; Moser et al., 1998, J.
Virol. 72, 5318参照）、ＨＣＶを用いた同様な試験は
今まで成果がなかった。
【００１２】ＨＣＶ含有の高力価の（hochtitrig）患者
の血清で感染させることができる細胞系又は初代細胞培
養は多様な刊行物から公知であるが（Lanford et al. 1
994,Virology 202, 606; Shimizu et al. 1993, Proced
ings of the National Academy of Sciences, USA, 90,
6037-6041; Mizutani et al. 1996, Journal of Virol
ogy, 70, 7219-7223; M. Ikeda et al. 1998, Virus Re
s. 56, 157; Fournier et al. 1998, J. Gen. Virol. 7
9, 2376及びそこで引用された文献, Ito et al. 1996,
Journal of General Virology, 77, 1043-1054）、ウイ
ルス感染された細胞系又は細胞培養はＨＣＶ−ＲＮＡ又
はＨＣＶ−抗原は直接検出されなかった。この細胞中の
ウイルス性のＲＮＡはノーザンブロット（ＲＮＡの定量
的検出のための標準的方法）においても検出できず、ウ
ェスタンブロットにおいて又は免疫沈降を用いてもウイ
ルス性タンパク質は検出できない。著しく煩雑でかつ間
接的方法を用いて、ＨＣＶ複製を証明することができた
にすぎない。この不利な状況は、この公知のウイルス感
染した細胞系又は細胞培養中での複製が全く不十分であ
ることを明らかに示している。
【００１３】さらに、Yoo et al. (1995, Journal of V
irology, 69, 32-38)及び Dash etal., (1997, America
n Journal of Pathology, 151, 363-373）の刊行物か
ら、肝癌細胞系を、クローニングされたＨＣＶ−ゲノム
のインビトロ転写を用いて得られた合成ＨＣＶ−ＲＮＡ
でトランスフェクションできることが公知である。この
２つの文献においてこの著者は、ウイルス性ＨＣＶ−ゲ
ノムがプラス鎖−ＲＮＡであり、このＲＮＡは細胞中へ
導入した後に直接ｍＲＮＡとして機能し、これにリボソ
ームが付着し、翻訳プロセスの進行においてウイルスタ
ンパク質を形成し、このタンパク質から最終的に新規の
ＨＣＶ−粒子が形成される（できる）という基本思想か
ら出発している。このウイルス複製、つまり新規に形成
されたＨＣＶ−ウイルスもしくはそのＲＮＡは、ＲＴ−
ＰＣＲを用いて検出された。しかしながら、実施された
ＲＴ−ＰＣＲの発表された結果は、記載されたＨＣＶ−
トランスフェクションされた肝癌細胞内でＨＣＶ複製の
効率は著しくわずかであり、見込みのある抗ウイルス療
法を用いた意図的な影響による複製率における変動を質
的に、ましてや定量的に測定するためにはいずれの場合
も不十分である。さらに、先行技術において、高保存
３′ＮＴＲ（hochkonservierte 3' NTR）はウイルス複
製のために不可欠であることは公知であり（Yanagi et
al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96, 2291-95, 199
9）、このことはＨＣＶ−ゲノムの確かな３′末端を知
らずに試験したためもっぱら短縮された３′ＮＴＲを有
するＨＣＶ−ゲノムを使用したYoo et al.及びDash et
al.の主張と明らかに矛盾している。
【００１４】
【課題を解決するための手段】この課題の解決策は、冒
頭に記載した種類の細胞培養系を提供することにあり、
その際、真核細胞はヒト細胞、特に市販の肝癌細胞系か
ら由来するが、同様に相応する初代細胞培養から得るこ
とができる肝癌細胞であり、その際、導入されたＨＣＶ
−特異的遺伝子材料がＨＣＶ−ＲＮＡ−構築物であり、
この構築物は主にＨＣＶ−特異的ＲＮＡ−断片５′ＮＴ
Ｒ，ＮＳ３，ＮＳ４Ａ，ＮＳ４Ｂ，ＮＳ５Ａ，ＮＳ５Ｂ
及び３′ＮＴＲを、有利に前記の順序で、及び少なくと
も１つの選択可能なマーカー遺伝子（選択遺伝子）を包
含する。「ＮＴＲ」は本願明細書中で「非翻訳領域」を
意味し、これは当業者に概念並びに略語として公知及び
周知である。「ＨＣＶ−ＲＮＡ−構築物」の概念は本願
明細書において完全なＨＣＶ−ゲノムを含有する構築物
でも、単にそのＨＣＶ−ゲノムの一部、つまりＨＣＶ−
サブゲノムを含有する構築物でもある。
【００１５】実際に著しく有利である本発明による細胞
培養系の有利な変異形は、ＤＳＭＡＣＣ２３９４の番号
の元で（実験室記号ＨｕＢｌ９−１３）ＤＳＭＺ（Deut
sche Sammlung von Mikrooranismen und Zellkulturen
GmbH in Braunschwieg, Deutschland）に寄託されてい
る。
【００１６】本発明による細胞培養系を用いて初めて、
ＨＣＶ−ＲＮＡは細胞内で、自律的に及び十分に大量に
複製及び発現され、その結果、ＨＣＶ−ＲＮＡ−量並び
にＨＣＶ−特異的タンパク質の定量的測定を通常の、信
頼できる正確な生化学的測定方法を用いて実施すること
ができるインビトロ系が提供される。つまり、抗ウイル
ス性医薬の開発及び検査のために必要なほぼ信頼できる
細胞ベース（cell-based）の複製系が提供される。この
試験系は有効なＨＣＶ特異的な治療法のための潜在的攻
撃標的を同定し、かつＨＣＶ化学療法剤を開発及び評価
することを可能にする。
【００１７】本発明は、少なくとも５′及び３′非翻訳
領域（ＮＴＲ）及び非構造タンパク質（ＮＳ）３〜５Ｂ
を包含し、さらに選択可能なマーカー遺伝子（選択遺伝
子）を有するＨＣＶ−ＲＮＡ−構築物で細胞をトランス
フェクションした場合に、ＨＣＶ−ＲＮＡの有効な複製
が細胞中で行われるという意想外な認識に基づく。構造
遺伝子が複製の進行のためにあまり重要でなく、他方で
このトランスフェクションされた細胞がＨＣＶ−ＲＮＡ
と結合した選択可能なマーカー遺伝子（選択遺伝子）に
より媒介される永続的な選択圧力を被る場合にのみＨＣ
Ｖ−ＲＮＡの有効な複製が引き起こされることは明らか
である。マーカー遺伝子（選択遺伝子）は従って、一方
でＨＣＶ−ＲＮＡを生産複製する細胞の選択を誘発さ
せ、他方でＲＮＡ−複製の効率を著しく高めると考えら
れる。
【００１８】本発明の対象は、ＨＣＶ−特異的ＲＮＡ−
断片５′ＮＴＲ，ＮＳ３，ＮＳ４Ａ，ＮＳ４Ｂ，ＮＳ５
Ａ，ＮＳ５Ｂ及び３′ＮＴＲを、有利に前記の順序で包
含し、さらに選択可能なマーカー遺伝子（選択遺伝子）
を包含するセルフリーのＨＣＶ−ＲＮＡ−構築物でもあ
る。
【００１９】５′ＮＴＲもしくはＮＳ３もしくはＮＳ４
ＡもしくはＮＳ４ＢもしくはＮＳ５ＡもしくはＮＳ５Ｂ
もしくは３′ＮＴＲの概念は、本願明細書において、先
行技術においてＨＣＶゲノムのそれぞれ該当する機能的
断片についてのヌクレオチド配列として記載されている
各ヌクレオチド配列を表す。
【００２０】このようなＨＣＶ−ＲＮＡ−構築物の提供
が、初めて細胞培養中でのＨＣＶ−複製、ＨＣＶ−発病
及びＨＣＶ−進化の詳細な分析を可能にする。ＨＣＶ特
異的なウイルス性ＲＮＡは、完全なゲノムとして又はサ
ブゲノムとして、任意の量で意図的に製造でき、ＲＮＡ
−構築物を操作し、ひいてはＨＣＶ−機能を遺伝学的レ
ベルで研究及び解明する可能性が生じる。
【００２１】治療法のための主要な攻撃標的として現在
研究されている全てのＨＣＶ−酵素、つまりＮＳ３／４
Ａプロテアーゼ、ＮＳ３ヘリカーゼ及びＮＳ５Ｂポリメ
ラーゼは本発明によるＨＣＶ−ＲＮＡ−構築物中に含ま
れているため、該当する全ての研究のために使用するこ
とができる。
【００２２】実地での適用において著しく良好であるＨ
ＣＶ−ＲＮＡ−構築物の実施態様は、配列表の配列番号
１によるヌクレオチド配列を包含することを特徴とす
る。実地での使用のために同等に良好な特性を有する他
の実施態様は、配列表の配列番号２又は配列番号３又は
配列番号４又は配列番号５又は配列番号６又は配列番号
７又は配列番号８又は配列番号９又は配列番号１０又は
配列番号１１によるヌクレオチド配列を包含することを
特徴とする。
【００２３】本発明によるＨＣＶ−サブゲノム−構築物
は、先行技術において今まで未知のヌクレオチド配列、
つまり次に記載するヌクレオチド配列（ａ）〜（ｉ）の
グループから選択されるヌクレオチド配列を有する３′
ＮＴＲを備えることができる。
【００２４】
【外２】
【００２５】本発明によるＨＣＶ−ＲＮＡ−構築物中に
含まれる選択可能なマーカー遺伝子（選択遺伝子）は有
利に耐性遺伝子、特に抗生物質耐性遺伝子である。
【００２６】これは、例えば抗生物質耐性遺伝子の場合
には該当する抗生物質を細胞培地に添加することによっ
て、この構成物でトランスフェクションされた細胞が、
トランスフェクションされていない細胞から容易に選択
することができるという利点を有する。「抗生物質」と
は本願明細書中ではトランスフェクションされていない
宿主細胞又はＨＣＶ−ＲＮＡをわずかな効率でしか複製
していない細胞の生存及び成長を阻害する物質、特に細
胞毒、例えばピューロマイシン、ハイグロマイシン、ゼ
オシン（Zeocin）、ブレオマイシン又はブラストサイジ
ンであると解釈される。
【００２７】実地において著しく良好であるとされた特
に良好な選択可能なマーカー遺伝子（選択遺伝子）もし
くは耐性遺伝子は、ネオマイシンホスホトランスフェラ
ーゼ遺伝子である。
【００２８】抗生物質耐性遺伝子の他のものは、例えば
ＨＡＴ−選択を用いて実施することができるチミジン−
キナーゼ−遺伝子である。
【００２９】選択可能なマーカー遺伝子（選択遺伝子）
もしくは有利なは耐性遺伝子もしくは特に有利な抗生物
質耐性遺伝子のＨＣＶ−ＲＮＡ−構築物中の位置は、有
利にＨＣＶ５′ＮＴＲの後方に、つまり５′ＮＴＲの下
流にもしくはＨＣＶ−読み枠の上流にある。しかしなが
ら、３′ＮＴＲの領域内又はＨＣＶ−ゲノム又はＨＣＶ
−サブゲノムの他の部位、例えばポリタンパク質の範囲
内にあることも考えられる。
【００３０】本発明によるＨＣＶ−ＲＮＡ−構築物のも
う一つの実施態様において、選択可能なマーカー遺伝子
（選択遺伝子）、特に抗生物質耐性遺伝子は、リボザイ
ムを介してもしくはリボザイムに対する認識部位を介し
てＨＣＶ−ＲＮＡもしくはＨＣＶ−ゲノム配列又はサブ
ゲノム配列と結合している。
【００３１】このために、ＨＣＶ−ＲＮＡを産生複製す
るような細胞の選択を行うことにより、そこから得られ
た細胞クローンは耐性遺伝子をＨＣＶ−サブゲノム配列
のリボザイム媒介性分解により分離することができるこ
とが、つまりクローニングにより組み込まれたリボザイ
ムの活性化によるか、又はリボザイムに対する認識部位
を有する構築物の場合には細胞中へリボザイムを（例え
ばリボザイム構築物のトランスフェクション又は相応す
るリボザイムが導入されたウイルス性発現ベクターでの
感染により）導入することにより分離できることが有利
である。このように、確かな感染性ウイルス粒子の形成
が可能である耐性遺伝子を有する確かなＨＣＶ−ゲノム
−構築物が得られる。
【００３２】本発明によるＨＣＶ−ＲＮＡ−構築物のも
う一つの有利な実施態様は、構築物が少なくとも１つの
組み込まれたリポーター遺伝子を有することにより優れ
ている。
【００３３】リポーター遺伝子とは、このリポーター遺
伝子の存在で目的生物中へ導入することにより容易に及
び一般的に簡単な生化学的又は組織化学的方法で検出可
能である、つまり少量であっても実験室で通常の測定方
法を用いて簡単でかつ確実に検出及び定量化することが
できるタンパク質をコードするような遺伝子であると解
釈される。
【００３４】ＨＣＶ−ＲＮＡ−構築物のこの変異形は、
この構築物の複製の程度がリポーター遺伝子産物によっ
て簡単にかつ迅速に実験室で通常の方法により測定でき
るという利点を有する。
【００３５】このリポーター遺伝子は、ルシフェラーゼ
遺伝子のグループ、ＣＡＴ−遺伝子（クロラムフェニコ
ール−アセチル−トランスフェラーゼ−遺伝子）、ｌａ
ｃＺ−遺伝子（ベータ−ガラクトシダーゼ遺伝子）、Ｇ
ＦＰ−遺伝子（緑色−蛍光−タンパク質−遺伝子）、Ｇ
ＵＳ−遺伝子（グルクロニダーゼ遺伝子）又はＳＥＡＰ
−遺伝子（分泌−アルカリ性−ホスファターゼ−遺伝子
(Sezernerte-Alkalische-Phosphatase-Gen)）からの遺
伝子が有利である。このリポーター遺伝子もしくはその
産物、つまり相応するリポータータンパク質は、例えば
蛍光、化学ルミネッセンス、比色法又は免疫法（例えば
ＥＬＩＳＡ）を用いて測定することができる。
【００３６】リポーター遺伝子として、代理マーカー遺
伝子（Surrogatmarkergen）も挙げられる。この遺伝子
は本願明細書において、細胞タンパク質、核酸又は一般
にウイルス複製に依存するバリエーションの影響下にあ
るような機能をコードし、かつその結果ＨＣＶもしくは
ＨＣＶ−ＲＮＡ−構築物を増幅する細胞中で抑制又は活
性化される遺伝子と解釈される。つまり、この機能の低
下もしくは活性化は、ウイルス複製用のもしくはＨＣＶ
−ＲＮＡ−構築物の複製用の代用マーカーである。
【００３７】リポーター遺伝子及び選択可能なマーカー
遺伝子（選択遺伝子）の位置は、両方の遺伝子産物から
形成される融合タンパク質を発現するように選択するこ
とができる。この場合、両方の遺伝子がＨＣＶ−ＲＮＡ
−構築物中に配置されており、両方の発現されたタンパ
ク質は、プロテアーゼ（例えばユビキチン）の切断部位
又は自己切断するペプチド（例えばピコルナウイルスの
２Ａ−タンパク質）を介して融合されていて、後になっ
てタンパク質分解により再び分離されるという有利な可
能性が生じる。
【００３８】同様に、この両方の位置は、両方の遺伝子
産物が別々に発現されるように相互に隔てられていても
よい（例えば次の順序：マーカー遺伝子もしくは耐性遺
伝子−内部のリボソーム結合部位−リポーター遺伝
子）。
【００３９】リポーター遺伝子の場合には、リポーター
遺伝子がＨＣＶ−ゲノム又はＨＣＶ−サブゲノムのオー
プンリーディングフレーム中へクローニングにより導入
されていて、つまりタンパク質分解のプロセシングによ
って活性形に変換されるような実施態様が特に有利であ
る。
【００４０】全てのバリエーションにおける本発明によ
る細胞培養系は多様な目的のために使用することができ
る。これは次のことを包含する： ・ 抗ウイルス性に作用する物質の探索。これは例え
ば、直接又は間接的にウイルス増加に影響する有機化合
物（例えばウイルス性プロテアーゼ、ＮＳ３−ヘリカー
ゼ、ＮＳ５Ｂ ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの阻害
剤）、ＨＣＶ−ＲＮＡ−構築物内の任意の標的配列（例
えば５′ＮＴＲ）にハイブリダイズし、ウイルス増加に
直接又は間接的に影響するアンチセンスオリゴヌクレオ
チド（例えば任意のＨＣＶ−ＲＮＡ−配列を分解し、そ
れによりウイルス複製を妨害するＨＣＶ−ポリタンパク
質又はリボエンザイムの翻訳の減少に基づく）。
【００４１】・ 細胞培養中での抗ウイルス性に作用す
る各種の物質の評価。このような物質は例えば単離生成
された酵素に関して「合理的ドラックデザイン（ration
al drug design）」を用いて並びに「高いスループット
スクリーニング（high-throughput screening）」を用
いて見出すことができる。評価とは、特に相応する物質
の阻害特性の測定並びにその作用メカニズムの決定であ
ると解釈される。
【００４２】・ ＨＣＶ特異的抗ウイルス療法のための
ウイルス性又は細胞性の起源の新規の攻撃標的の同定。
例えば細胞タンパク質がウイルス増殖のために重要であ
る場合には、この細胞タンパク質の阻害によってウイル
ス増殖に影響を及ぼすことができる。このような補助的
因子の探索は本発明による系を用いて可能である。
【００４３】・ 耐性測定のための使用。ＨＣＶ−ゲノ
ムの高い突然変異誘発率に基づき治療法に対する耐性が
生じることがある。このような耐性は物質の臨床的認可
の際に重要であり、本発明による細胞培養系を用いて測
定できる。ＨＣＶ−ＲＮＡ−構築物もしくはＨＣＶ−ゲ
ノム又はサブゲノムを複製する細胞系は、相応する物質
の濃度を増加させながらインキュベートし、ウイルスＲ
ＮＡの複製を導入したリポーターにより又はウイルス性
の核酸又はタンパク質の定性的又は定量的測定により決
定する。ＨＣＶ−ＲＮＡの（例えばＲＴ−ＰＣＲを用い
た）再クローニング及び配列分析により治療的耐性に原
因のあるヌクレオチド−もしくはアミノ酸交換率を算出
することができる。
【００４４】・ 診断薬の開発及び／又は評価のための
確かなウイルスタンパク質（抗原）の製造。本発明によ
る細胞培養系は細胞培養中でのＨＣＶ−抗原の発現を可
能にする。この抗原は、特に診断検出法の構築のために
も使用できる。
【００４５】・ 特に治療法及びワクチンの開発及び製
造のため並びに診断目的のためのＨＣＶウイルス及びウ
イルス様粒子の製造。本発明による細胞培養系を用いて
製造することができる特に細胞培養に適合した完全なＨ
ＣＶ−ゲノムは、細胞培養中で高い効率で複製すること
ができる。このゲノムはＨＣＶの全ての機能を有してお
り、従って感染性のウイルスを製造できる。
【００４６】想定される本発明によるＨＣＶ−ＲＮＡ−
構築物は、その全てのバリエーションにおいて多方面の
目的のために使用することができる。これには特に次の
ことが属する： ・ 弱毒化Ｃ型肝炎ウイルス又はＨＣＶ様粒子の構築及
びその細胞培養中での製造：偶然又は意図的に引き起こ
された突然変異、例えば点突然変異、欠失又は挿入によ
り、弱毒化ＨＣＶ粒子又はＨＣＶ様粒子を製造すること
ができる、つまり完全に複製能力を有するが、病原性は
少ないか又は失っているウイルスもしくはウイルス様粒
子を製造することができる。このような弱毒化ＨＣＶ粒
子又はＨＣＶ様粒子は特にワクチンとして使用可能であ
る。
【００４７】・ 例えば遺伝子治療における肝細胞特異
的遺伝子輸送体として使用するための外来遺伝子を組み
込まれたＨＣＶ−ＲＮＡ−構築物の構築。ＨＣＶの優れ
た向肝細胞性及びそのゲノムの一部を異種配列に置き換
えできるという理由から、例えば構造タンパク質を治療
上有効な遺伝子に置き換えたＨＣＶ−ＲＮＡ−構築物を
製造できる。こうして得られたＨＣＶ−ＲＮＡ−構築物
は欠損するＨＣＶ機能、例えば構造タンパク質を構成的
に又は誘導可能に発現する細胞内へ有利にトランスフェ
クションによって導入される。「トランス相補性（Tran
skomplementation）」の概念のもとで当業者に公知のこ
の技術により、ＨＣＶ−ＲＮＡ−構築物が組み込まれた
ウイルス粒子を製造することができる。こうして得られ
た粒子は有利に肝細胞に感染させるために使用すること
ができる。この細胞内で治療上有効な外来遺伝子を発現
させ、それにより治療作用を発揮させる。
【００４８】・ 生産的なウイルスの増加が行われる許
容細胞の探索。この目的のために、完全な感染性ウイル
スの形成が可能である前記のＨＣＶ−ＲＮＡ−ゲノム構
築物の一つを使用するか、又はこれらの構築物は前記の
ＨＣＶ−サブゲノム−構築物の一つを使用し前記の例に
従って欠損する機能を構成的に又は誘導可能に発現する
細胞系中へトランスフェクションされる。この全ての場
合に、付加的にＨＣＶ−配列に耐性遺伝子及び／又はリ
ポーター遺伝子を有するウイルス粒子が生じる。ＨＣＶ
を複製することができる細胞を探索するために、この細
胞をこうして製造されたウイルスで感染させ、抗生物質
により選択するか又はＨＣＶ−ＲＮＡ−構築物に依存し
てリポーター遺伝子の発現の検出を調査する。ＨＣＶ−
ＲＮＡ−構築物を複製する場合、抗生物質耐性もしくは
リポーター遺伝子の発現は検出可能であるため、こうし
て見出された細胞は許容性でなければならない。このよ
うに、ほぼ任意の細胞系又は初代細胞がその許容性につ
いて試験され、探索される。
【００４９】本発明による細胞培養系は、ＨＣＶ−ＲＮ
Ａ−複製の範囲内で偶然に生じるか又はこの構築物中へ
意図的に導入される突然変異に基づき、複製効率の向上
を引き起こすＨＣＶ−ＲＮＡ−構築物の探索を可能にす
る。ＨＣＶ−ＲＮＡ−構築物の複製を変化させるこのよ
うな突然変異は、当業者には適合突然変異（adaptiveMu
tationen）として公知である。本発明は従って、細胞培
養に適した突然変異体を獲得する方法でもあり、その
際、この突然変異体はオリジナルのＨＣＶ−ＲＮＡ−構
築物と比べて高められた複製効率を有する。本発明はさ
らに、オリジナルのＨＣＶ−ＲＮＡ−全長ゲノム又はＨ
ＣＶ−ＲＮＡ−部分ゲノム又はＨＣＶ−ＲＮＡ−構築物
と比較して高められた複製効率を有するＨＣＶ−ＲＮＡ
−全長ゲノム又はＨＣＶ−ＲＮＡ−部分ゲノム又は任意
のＨＣＶ−ＲＮＡ−構築物の突然変異体の製造方法を並
びにオリジナルの構築物、部分ゲノム又は全長ゲノムと
比較して高められた複製効率を有するＨＣＶ−ＲＮＡ−
構築物、ＨＣＶ−全長ゲノム及びＨＣＶ−部分ゲノムを
包含する。
【００５０】突然変異体がＨＣＶ−ＲＮＡ−構築物に比
べて高められた複製効率を有する本発明によるＨＣＶ−
ＲＮＡ−構築物の細胞培養に適合した突然変異体を獲得
するための本発明による方法は、導入されたＨＣＶ−特
異的遺伝子材料が請求項２から８までのいずれか１項記
載の選択遺伝子を有するＨＣＶ−ＲＮＡ−構築物である
請求項１記載の細胞培養系を、選択遺伝子に応じた選択
培地上／中で培養し、成長した細胞クローンを収穫し、
この細胞クローンからＨＣＶ−ＲＮＡ−構築物を単離す
ることを特徴とする。
【００５１】この製造方法の有利な実施態様において、
単離されたＨＣＶ−ＲＮＡ−構築物は新たに少なくとも
１回継代される、つまり請求項１による細胞培養系の細
胞に導入され、導入されたＨＣＶ−特異的遺伝子材料が
選択遺伝子を有する単離されたＨＣＶ−ＲＮＡ−構築物
である請求項１によるその際得られた細胞培養系を選択
遺伝子に応じた選択培地上／中で培養し、成長した細胞
クローンを収穫し、このクローンからＨＣＶ−ＲＮＡ−
構築物を単離する。
【００５２】この変更された方法を用いて適合突然変異
の程度ひいては複製効率の程度は該当するＨＣＶ−ＲＮ
Ａ−構築物中でなお高めることができる。
【００５３】オリジナルのＨＣＶ−全長ゲノム又はＨＣ
Ｖ−部分ゲノム又はＨＣＶ−ＲＮＡ−構築物と比較して
高められた複製効率を有するＨＣＶ−全長ゲノム又はＨ
ＣＶ−部分ゲノム又は任意のＨＣＶ−ＲＮＡ−構築物の
突然変異体を製造する本発明による方法は、前記の２つ
の製造方法を用いて、ＨＣＶ−ＲＮＡ−構築物の細胞培
養に適合した突然変異体を製造し、これを細胞から単離
し、先行技術において公知の方法でクローニングし、配
列決定し、オリジナルのＨＣＶ−ＲＮＡ−構築物のヌク
レオチド配列及びアミノ酸配列と比較して、突然変異の
種類、数、及び位置を決定し、かつこの突然変異を意図
的な突然変異誘発又は該当する突然変異を有する配列断
片の置換により、（単離された）ＨＣＶ−全長ゲノム又
はＨＣＶ−部分ゲノム又は任意のＨＣＶ−ＲＮＡ−構築
物中へ導入することを特徴とする。
【００５４】実際に複製を変化させる及び特に複製を向
上させる突然変異の検出もしくは照合のために、特定の
ヌクレオチド置換及び／又はアミノ酸置換をオリジナル
のＨＣＶ−ＲＮＡ−構築物内へ導入し、これを再び細胞
培養中へ導入する試験を実施することができる。導入さ
れた突然変異が実際に複製を向上させる場合には、選択
可能なマーカー遺伝子を有するＨＣＶ−ＲＮＡ−構築物
の場合に、人工的に突然変異誘発された構築物において
耐性の細胞クローンの数が未処理の構築物の際よりも明
らかに高くなる。
【００５５】高められた複製効率を有する本発明による
細胞培養に適合したＨＣＶ−ＲＮＡ−構築物は、ヌクレ
オチド置換及び／又はアミノ酸置換により請求項２から
８のいずれか１項記載のＨＣＶ−ＲＮＡ−構築物から誘
導可能であり、２つの前記製造方法を用いて得ることが
できることを特徴とする。
【００５６】この細胞培養に適合したＨＣＶ−ＲＮＡ−
構築物は、高められた複製効率を有する任意のＨＣＶ−
ＲＮＡ−構築物又はＨＣＶ−全長ゲノム又は部分ゲノム
を製造するために使用することができる。この場合、選
択可能な耐性遺伝子を有する構築物並びにこのような耐
性遺伝子なしのもしくは選択可能なリポーター遺伝子
（例えばルシフェラーゼ）を有する構築物を製造するこ
とができる、それというのも細胞培養に適合したＨＣＶ
−ＲＮＡ−構築物の高い複製効率に基づき、この複製を
選択されていない細胞中でも検出することができるため
である。
【００５７】オリジナルのＨＣＶ−ＲＮＡ−構築物又は
オリジナルのＨＣＶ−全長ゲノムと比較して高められた
複製効率を有する、ＨＣＶ−ＲＮＡ−構築物又はＨＣＶ
−全長ゲノム又はＨＣＶ−部分ゲノムの本発明による細
胞培養に適合した突然変異体は、細胞培養に適合したＨ
ＣＶ−ＲＮＡ−構築物中に、配列分析及び配列比較によ
り、突然変異の種類及び数を決定し、この突然変異をＨ
ＣＶ−ＲＮＡ−構築物中へ、特に請求項２から８までの
いずれか１項記載のＨＣＶ−ＲＮＡ−構築物中へ意図的
な突然変異誘発によるか又は該当する突然変異を有する
配列断片の置換により導入する方法により得られること
を特徴とする。
【００５８】高いか又は著しく高い複製効率及び実地の
適用のために著しく良好な適性を有する特に有利なＨＣ
Ｖ−ＲＮＡ−構築物、ＨＣＶ−全長ゲノム及びＨＣＶ−
部分ゲノムのグループは、これが表３に記載した全ての
アミノ酸置換もしくはヌクレオチド置換及び／又は次の
１以上のアミノ酸置換：１２８３ ａｒｇ −＞ ｇｌ
ｙ、 １３８３ ｇｌｕ −＞ ａｌａ、１５７７ ｌ
ｙｓ −＞ ａｒｇ、１６０９ ｌｙｓ −＞ ｇｌ
ｕ、１９３６ ｐｒｏ −＞ ｓｅｒ、２１６３ ｇｌ
ｕ −＞ ｇｌｙ、２３３０ ｌｙｓ −＞ｇｌｕ、２
４４２ ｉｌｅ −＞ｖａｌ（この数はＨＣＶ−単離体
ｃｏｎ１のポリタンパク質のアミノ酸位置に関する、表
１参照）を有することを特徴とする。
【００５９】配列表に示される配列の個々の特性 配列番号：１ 名称：Ｉ３８９／Ｃｏｒｅ−３′／ｗｔ 構造（ヌクレオチド位置）： １． １〜３４１：ＨＣＶの５′非翻訳領域 ２． ３４２〜１１９３：ＨＣＶのコアタンパク質−ネ
オマイシンホスホトランスフェラーゼ融合タンパク質；
選択可能なマーカー ３． １２０２〜１８１２：脳心筋炎ウイルスの内部の
リボソーム結合部位；その下流に位置するＨＣＶオープ
ンリーディングフレームの翻訳を可能にする ４． １８１３〜１０８４２：コアから非構造タンパク
質５ＢまでのＨＣＶポリタンパク質 ５． １８１３〜２３８５：ＨＣＶコアタンパク質；構
造タンパク質 ６． ２３８６〜２９６１：コートタンパク質１（エン
ベロープタンパク質１）；構造タンパク質 ７． ２９６２〜４０５０：コートタンパク質２（エン
ベロープタンパク質２）；構造タンパク質 ８． ４０５１〜４２３９：タンパク質ｐ７ ９． ４２４０〜４８９０：非構造タンパク質２（ＮＳ
２）；ＨＣＶのＮＳ２−３プロテアーゼ １０． ４８９１〜６７８３：非構造タンパク質３（Ｎ
Ｓ３）；ＨＣＶのＮＳ３プロテアーゼ／ヘリカーゼ １１． ６７８４〜６９４５：非構造タンパク質４Ａ
（ＮＳ４Ａ）；ＮＳ３プロテアーゼのコファクター １２． ６９４６〜７７２８：非構造タンパク質４Ｂ
（ＮＳ４Ｂ） １３． ７７２９〜９０６９：非構造タンパク質５Ａ
（ＮＳ５Ａ） １４． ９０７０〜１０８４２：非構造タンパク質５Ｂ
（ＮＳ５Ｂ）；ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ １５． １０８４６〜１１０７６：ＨＣＶの３′非翻訳
領域 配列番号：２ 名称：Ｉ３３７／ＮＳ２−３′／ｗｔ 構造（ヌクレオチド位置）： １． １〜３４１：ＨＣＶの５′非翻訳領域 ２． ３４２〜１１８１：ＨＣＶのコアタンパク質−ネ
オマイシンホスホトランスフェラーゼ融合タンパク質；
選択可能なマーカー ３． １１９０〜１８００：脳心筋炎ウイルスの内部の
リボソーム結合部位；その下流に位置するＨＣＶオープ
ンリーディングフレームの翻訳を可能にする ４． １８０１〜８４０３：非構造タンパク質２から非
構造タンパク質５ＢまでのＨＣＶポリタンパク質 ５． １８０１〜２４５１：非構造タンパク質２（ＮＳ
２）；ＨＣＶのＮＳ２−３プロテアーゼ ６． ２４５２〜４３４４：非構造タンパク質３（ＮＳ
３）；ＨＣＶのＮＳ３プロテアーゼ／ヘリカーゼ ７． ４３４５〜４５０６：非構造タンパク質４Ａ（Ｎ
Ｓ４Ａ）；ＮＳ３プロテアーゼのコファクター ８． ４５０７〜５２８９：非構造タンパク質４Ｂ（Ｎ
Ｓ４Ｂ） ９． ５２９０〜６６３０：非構造タンパク質５Ａ（Ｎ
Ｓ５Ａ） １０． ６６３１〜８４０３：非構造タンパク質５Ｂ
（ＮＳ５Ｂ）；ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ １１． ８４０７〜８６３７：ＨＣＶの３′非翻訳領域 配列番号：３ 名称：Ｉ３８９／ＮＳ３−３′／ｗｔ 構造（ヌクレオチド位置） １． １〜３４１：ＨＣＶの５′非翻訳領域 ２． ３４２〜１１９３：ＨＣＶのコアタンパク質−ネ
オマイシンホスホトランスフェラーゼ融合タンパク質；
選択可能なマーカー ３． １２０２〜１８１２：脳心筋炎ウイルスの内部の
リボソーム結合部位；その下流に位置するＨＣＶオープ
ンリーディングフレームの翻訳を可能にする ４． １８１３〜７７６７：非構造タンパク質３から非
構造タンパク質５ＢまでのＨＣＶポリタンパク質 ５． １８１３〜３７０８：非構造タンパク質３（ＮＳ
３）；ＨＣＶのＮＳ３プロテアーゼ／ヘリカーゼ ６． ３７０９〜３８７０：非構造タンパク質４Ａ（Ｎ
Ｓ４Ａ）；ＮＳ３プロテアーゼのコファクター ７． ３８７１〜４６５３：非構造タンパク質４Ｂ（Ｎ
Ｓ４Ｂ） ８． ４６５４〜５９９４：非構造タンパク質５Ａ（Ｎ
Ｓ５Ａ） ９． ５９９５〜７７６７：非構造タンパク質５Ｂ（Ｎ
Ｓ５Ｂ）；ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ １０． ７７７１〜８００１：ＨＣＶの３′非翻訳領域 配列番号：４ 名称：Ｉ３３７／ＮＳ３−３′／ｗｔ 構造（ヌクレオチド位置） １． １〜３４１：ＨＣＶの５′非翻訳領域 ２． ３４２〜１１８１：ＨＣＶのコアタンパク質−ネ
オマイシンホスホトランスフェラーゼ融合タンパク質；
選択可能なマーカー ３． １１９０〜１８００：脳心筋炎ウイルスの内部の
リボソーム結合部位；その下流に位置するＨＣＶオープ
ンリーディングフレームの翻訳を可能にする ４． １８０１〜７７５８：非構造タンパク質３から非
構造タンパク質５ＢまでのＨＣＶポリタンパク質 ５． １８０１〜３６９６：非構造タンパク質３（ＮＳ
３）；ＨＣＶのＮＳ３プロテアーゼ／ヘリカーゼ ６． ３６９７〜３８５８：非構造タンパク質４Ａ（Ｎ
Ｓ４Ａ）；ＮＳ３プロテアーゼのコファクター ７． ３８５９〜４６４１：非構造タンパク質４Ｂ（Ｎ
Ｓ４Ｂ） ８． ４６４２〜５９８２：非構造タンパク質５Ａ（Ｎ
Ｓ５Ａ） ９． ５９８３〜７７５５：非構造タンパク質５Ｂ（Ｎ
Ｓ５Ｂ）；ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ １０． ７７５９〜７９８９：ＨＣＶの３′非翻訳領域 配列番号：５ 名称：Ｉ３８９／ＮＳ２−３′／ｗｔ 構造（ヌクレオチド位置） １． １〜３４１：ＨＣＶの５′非翻訳領域 ２． ３４２〜１１９３：ＨＣＶのコアタンパク質−ネ
オマイシンホスホトランスフェラーゼ融合タンパク質；
選択可能なマーカー ３． １２０２〜１８１２：脳心筋炎ウイルスの内部の
リボソーム結合部位；その下流に位置するＨＣＶオープ
ンリーディングフレームの翻訳を可能にする ４． １８１３〜８４１８：非構造タンパク質２から非
構造タンパク質５ＢまでのＨＣＶポリタンパク質 ５． １８１３〜２４６３：非構造タンパク質２（ＮＳ
２）；ＨＣＶのＮＳ２−３プロテアーゼ ６． ２４６４〜４３５６：非構造タンパク質３（ＮＳ
３）；ＨＣＶのＮＳ３プロテアーゼ／ヘリカーゼ ７． ４３５７〜４５１８：非構造タンパク質４Ａ（Ｎ
Ｓ４Ａ）；ＮＳ３プロテアーゼのコファクター ８． ４５１９〜５３０１：非構造タンパク質４Ｂ（Ｎ
Ｓ４Ｂ） ９． ５３０２〜６６４２：非構造タンパク質５Ａ（Ｎ
Ｓ５Ａ） １０． ６６４３〜８４１５：非構造タンパク質５Ｂ
（ＮＳ５Ｂ）；ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ １１． ８４１９〜８６４９：ＨＣＶの３′非翻訳領域 配列番号：６ 名称：Ｉ３８９／ＮＳ３−３′／９−１３Ｆ 構造（ヌクレオチド位置） １． １〜３４１：ＨＣＶの５′非翻訳領域 ２． ３４２〜１１９３：ＨＣＶのコアタンパク質−ネ
オマイシンホスホトランスフェラーゼ融合タンパク質；
選択可能なマーカー ３． １２０２〜１８１２：脳心筋炎ウイルスの内部の
リボソーム結合部位；その下流に位置するＨＣＶオープ
ンリーディングフレームの翻訳を可能にする ４． １８１３〜７７６７：細胞培養に適合した突然変
異体９−１３Ｆの非構造タンパク質３から非構造タンパ
ク質５ＢまでのＨＣＶポリタンパク質 ５． １８１３〜３７０８：非構造タンパク質３（ＮＳ
３）；ＨＣＶのＮＳ３プロテアーゼ／ヘリカーゼ ６． ３７０９〜３８７０：非構造タンパク質４Ａ（Ｎ
Ｓ４Ａ）；ＮＳ３プロテアーゼのコファクター ７． ３８７１〜４６５３：非構造タンパク質４Ｂ（Ｎ
Ｓ４Ｂ） ８． ４６５４〜５９９４：非構造タンパク質５Ａ（Ｎ
Ｓ５Ａ） ９． ５９９５〜７７６７：非構造タンパク質５Ｂ（Ｎ
Ｓ５Ｂ）；ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ １０． ７７７１〜８００１：ＨＣＶの３′非翻訳領域 配列番号：７ 名称：Ｉ３８９／ｃｏｒｅ−３′／９−１３Ｆ 構造（ヌクレオチド位置） １． １〜３４１：ＨＣＶの５′非翻訳領域 ２． ３４２〜１１９３：ＨＣＶのコアタンパク質−ネ
オマイシンホスホトランスフェラーゼ融合タンパク質；
選択可能なマーカー ３． １２０２〜１８１２：脳心筋炎ウイルスの内部の
リボソーム結合部位；その下流に位置するＨＣＶオープ
ンリーディングフレームの翻訳を可能にする ４． １８１３〜１０８４２：細胞培養に適合した突然
変異体９−１３Ｆのコアから非構造タンパク質５Ｂまで
のＨＣＶポリタンパク質 ５． １８１３〜２３８５：ＨＣＶコアタンパク質；構
造タンパク質 ６． ２３８６〜２９６１：コートタンパク質１（エン
ベロープタンパク質１）；構造タンパク質 ７． ２９６２〜４０５０：コートタンパク質２（エン
ベロープタンパク質２）；構造タンパク質 ８． ４０５１〜４２３９：タンパク質ｐ７ ９． ４２４０〜４８９０：非構造タンパク質２（ＮＳ
２）；ＨＣＶのＮＳ２−３プロテアーゼ １０． ４８９１〜６７８３：非構造タンパク質３（Ｎ
Ｓ３）；ＨＣＶのＮＳ３プロテアーゼ／ヘリカーゼ １１． ６７８４〜６９４５：非構造タンパク質４Ａ
（ＮＳ４Ａ）；ＮＳ３プロテアーゼのコファクター １２． ６９４６〜７７２８：非構造タンパク質４Ｂ
（ＮＳ４Ｂ） １３． ７７２９〜９０６９：非構造タンパク質５Ａ
（ＮＳ５Ａ） １４． ９０７０〜１０８４２：非構造タンパク質５Ｂ
（ＮＳ５Ｂ）；ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ １５． １０８４６〜１１０７６：ＨＣＶの３′非翻訳
領域 配列番号：８ 名称：Ｉ３８９／ＮＳ３−３′／５．１ 構造（ヌクレオチド位置） １． １〜３４１：ＨＣＶの５′非翻訳領域 ２． ３４２〜１１９３：ＨＣＶのコアタンパク質−ネ
オマイシンホスホトランスフェラーゼ融合タンパク質；
選択可能なマーカー ３． １２０２〜１８１２：脳心筋炎ウイルスの内部の
リボソーム結合部位；その下流に位置するＨＣＶオープ
ンリーディングフレームの翻訳を可能にする ４． １８１３〜７７６７：細胞培養に適合した突然変
異体５．１の非構造タンパク質３から非構造タンパク質
５ＢまでのＨＣＶポリタンパク質 ５． １８１３〜３７０８：非構造タンパク質３（ＮＳ
３）；ＨＣＶのＮＳ３プロテアーゼ／ヘリカーゼ ６． ３７０９〜３８７０：非構造タンパク質４Ａ（Ｎ
Ｓ４Ａ）；ＮＳ３プロテアーゼのコファクター ７． ３８７１〜４６５３：非構造タンパク質４Ｂ（Ｎ
Ｓ４Ｂ） ８． ４６５４〜５９９４：非構造タンパク質５Ａ（Ｎ
Ｓ５Ａ） ９． ５９９５〜７７６７：非構造タンパク質５Ｂ（Ｎ
Ｓ５Ｂ）；ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ １０． ７７７１〜８００１：ＨＣＶの３′非翻訳領域 配列番号：９ 名称：Ｉ３８９／ｃｏｒｅ−３′／５．１ 構造（ヌクレオチド位置） １． １〜３４１：ＨＣＶの５′非翻訳領域 ２． ３４２〜１１９３：ＨＣＶのコアタンパク質−ネ
オマイシンホスホトランスフェラーゼ融合タンパク質；
選択可能なマーカー ３． １２０２〜１８１２：脳心筋炎ウイルスの内部の
リボソーム結合部位；その下流に位置するＨＣＶオープ
ンリーディングフレームの翻訳を可能にする ４． １８１３〜１０８４２：細胞培養に適合した突然
変異体５．１のコアから非構造タンパク質５ＢまでのＨ
ＣＶポリタンパク質 ５． １８１３〜２３８５：ＨＣＶコアタンパク質；構
造タンパク質 ６． ２３８６〜２９６１：コートタンパク質１（エン
ベロープタンパク質１）；構造タンパク質 ７． ２９６２〜４０５０：コートタンパク質２（エン
ベロープタンパク質２）；構造タンパク質 ８． ４０５１〜４２３９：タンパク質ｐ７ ９． ４２４０〜４８９０：非構造タンパク質２（ＮＳ
２）；ＨＣＶのＮＳ２−３プロテアーゼ １０． ４８９１〜６７８３：非構造タンパク質３（Ｎ
Ｓ３）；ＨＣＶのＮＳ３プロテアーゼ／ヘリカーゼ １１． ６７８４〜６９４５：非構造タンパク質４Ａ
（ＮＳ４Ａ）；ＮＳ３プロテアーゼのコファクター １２． ６９４６〜７７２８：非構造タンパク質４Ｂ
（ＮＳ４Ｂ） １３． ７７２９〜９０６９：非構造タンパク質５Ａ
（ＮＳ５Ａ） １４． ９０７０〜１０８４２：非構造タンパク質５Ｂ
（ＮＳ５Ｂ）；ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ １５． １０８４６〜１１０７６：ＨＣＶの３′非翻訳
領域 配列番号：１０ 名称：Ｉ３８９／ＮＳ３−３′／１９ 構造（ヌクレオチド位置） １． １〜３４１：ＨＣＶの５′非翻訳領域 ２． ３４２〜１１９３：ＨＣＶのコアタンパク質−ネ
オマイシンホスホトランスフェラーゼ融合タンパク質；
選択可能なマーカー ３． １２０２〜１８１２：脳心筋炎ウイルスの内部の
リボソーム結合部位；その下流に位置するＨＣＶオープ
ンリーディングフレームの翻訳を可能にする ４． １８１３〜７７６７：細胞培養に適合した突然変
異体１９の非構造タンパク質３から非構造タンパク質５
ＢまでのＨＣＶポリタンパク質 ５． １８１３〜３７０８：非構造タンパク質３（ＮＳ
３）；ＨＣＶのＮＳ３プロテアーゼ／ヘリカーゼ ６． ３７０９〜３８７０：非構造タンパク質４Ａ（Ｎ
Ｓ４Ａ）；ＮＳ３プロテアーゼのコファクター ７． ３８７１〜４６５３：非構造タンパク質４Ｂ（Ｎ
Ｓ４Ｂ） ８． ４６５４〜５９９４：非構造タンパク質５Ａ（Ｎ
Ｓ５Ａ） ９． ５９９５〜７７６７：非構造タンパク質５Ｂ（Ｎ
Ｓ５Ｂ）；ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ １０． ７７７１〜８００１：ＨＣＶの３′非翻訳領域 配列番号：１１ 名称：Ｉ３８９／ｃｏｒｅ−３′／１９ 構造（ヌクレオチド位置） １． １〜３４１：ＨＣＶの５′非翻訳領域 ２． ３４２〜１１９３：ＨＣＶのコアタンパク質−ネ
オマイシンホスホトランスフェラーゼ融合タンパク質；
選択可能なマーカー ３． １２０２〜１８１２：脳心筋炎ウイルスの内部の
リボソーム結合部位；その下流に位置するＨＣＶオープ
ンリーディングフレームの翻訳を可能にする ４． １８１３〜１０８４２：細胞培養に適合した突然
変異体１９のコアから非構造タンパク質５ＢまでのＨＣ
Ｖポリタンパク質 ５． １８１３〜２３８５：ＨＣＶコアタンパク質；構
造タンパク質 ６． ２３８６〜２９６１：コートタンパク質１（エン
ベロープタンパク質１）；構造タンパク質 ７． ２９６２〜４０５０：コートタンパク質２（エン
ベロープタンパク質２）；構造タンパク質 ８． ４０５１〜４２３９：タンパク質ｐ７ ９． ４２４０〜４８９０：非構造タンパク質２（ＮＳ
２）；ＨＣＶのＮＳ２−３プロテアーゼ １０． ４８９１〜６７８３：非構造タンパク質３（Ｎ
Ｓ３）；ＨＣＶのＮＳ３プロテアーゼ／ヘリカーゼ １１． ６７８４〜６９４５：非構造タンパク質４Ａ
（ＮＳ４Ａ）；ＮＳ３プロテアーゼのコファクター １２． ６９４６〜７７２８：非構造タンパク質４Ｂ
（ＮＳ４Ｂ） １３． ７７２９〜９０６９：非構造タンパク質５Ａ
（ＮＳ５Ａ） １４． ９０７０〜１０８４２：非構造タンパク質５Ｂ
（ＮＳ５Ｂ）；ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ １５． １０８４６〜１１０７６：ＨＣＶの３′非翻訳
領域 本発明を以下に実施例ならびにそれに付属する表および
図に基づいて詳細に説明する。挙げられる図は以下のこ
とを示す。
【００６０】図１Ａ：本発明によるＨＣＶ−ＲＮＡ−構
築物の構造 一番上に、完全な親ＨＣＶゲノムの構造の略図をポリタ
ンパク質内の分割産物コア、Ｅ１、Ｅ２、ｐ７、ＮＳ
２、ＮＳ３、ＮＳ４Ａ、ＮＳ４Ｂ、ＮＳ５ＡおよびＮＳ
５Ｂのための遺伝子の位置、ならびに５′および３′非
翻訳領域（５′ＮＴＲおよび３′ＮＴＲ）（水平のバー
として示した）、およびサブゲノム構築物の製造のため
に選択される両方の位置、すなわちＮＳ５Ｂ ＲＮＡポ
リメラーゼの“ＧＤＤ触媒ドメイン”の位置（ＧＤＤ）
およびＨＣＶ−ＩＲＥＳの３′境界部の位置（ヌクレオ
チド位置１〜３７７もしくは１〜３８９）（ゲノム略図
の上方に示した）と一緒に与えた。ゲノム略図の下方の
数字は相当するヌクレオチド位置を示している。
【００６１】前記略図の下に、５′ＨＣＶ−ＩＲＥＳ、
ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子（Ｎｅｏ
R）、ＥＭＣＶ−ＩＲＥＳ（Ｅ−Ｉ）およびＮＳ２もし
くはＮＳ３から確かな３′末端までのＨＣＶ配列からな
る本発明による２つの改変したＨＣＶ−ＲＮＡ構築物
（サブゲノム）の略図を示している。ＮＳ５Ｂポリメラ
ーゼＧＤＤモチーフを含む１０アミノ酸の欠失位置をそ
れぞれ三角形（Δ）で印す。
【００６２】図１Ｂ：トランスフェクションして継代培
養されたＨｕｈ−７細胞クローンにおける複製されたプ
ラス鎖ＲＮＡの検出のための変性ホルムアルデヒド−ア
ガロースゲル電気泳動の結果 ＨＣＶ特異的ＲＮＡの位置（矢印）および２８Ｓ ｒＲ
ＮＡの位置をレーン１２の右側に示し、ＲＮＡマーカー
（Ｍ）のサイズ（ヌクレオチド数）をレーン１の左側に
示した。
【００６３】図１Ｃ：選択された大部分の細胞クローン
において導入されたレプリコンＤＮＡが存在しないこと
を証明するための引き続きのサザンブロットによるＰＣ
Ｒ試験の結果 レーン１およびレーン２はポジティブコントロールを示
し、レーン１３はネガティブコントロールを示してい
る。レーン１の左に示された数字はヌクレオチドマーカ
ー分子のサイズを明示している。
【００６４】図２Ａ：ＨＣＶ−ＲＮＡ構築物を有する細
胞クローン（９−１３）における導入されたレプリコン
ＤＮＡ（プラスミド分子Ｉ377／ＮＳ３−３′／ｗｔ）
の高感度の排除のための引き続きのサザンブロットによ
るＰＣＲ試験の結果 レーン７〜レーン１１は細胞クローン９−１３の全ＤＮ
Ａを添加しない構築物Ｉ377／ＮＳ３−３′／ｗｔのＤ
ＮＡ分子の検量の結果を表し、かつレーン２〜レーン６
はＰＣＲ前にその都度１μｇの９−１３ＤＮＡを添加し
た（ＤＮＡ調製におけるＰＣＲのインヒビターの排除の
ため）同一のプラスミド分子を表す。レーン１３はネガ
ティブコントロール（ＤＮＡプローブ無しでのＰＣＲ）
を表す。レーン１は細胞クローン９−１３の全ＤＮＡ１
μｇを使用して得られた結果を示している。
【００６５】図２Ｂ：ＨＣＶのプラス鎖ＲＮＡおよびマ
イナス鎖ＲＮＡの定量のためのノーザンブロット試験の
結果 矢印はレプリコンＲＮＡの位置を印している。“プラ
ス”および“マイナス”の移行はゲル上に載せられたＲ
ＮＡコントロールの正（プラス）の極性もしくは負（マ
イナス）の極性を表す。“マイナス鎖”および“プラス
鎖”は放射性ＲＮＡプローブの特異性を表す。
【００６６】図２Ｃ：ＨＣＶ−ＲＮＡ複製のダクチノマ
イシンに対する耐性を証明するための細胞内で複製され
たＨＣＶ−ＲＮＡの放射性標識後のホルムアルデヒド−
アガロースゲル電気泳動の結果 図３Ａ：代謝放射性標識後の免疫沈降による選択された
細胞クローンにおけるＨＣＶ特異抗原の検出 レーン７〜レーン９は確かなサイズマーカー（Ｈｕｈ−
７細胞中でのＨＣＶ−ＲＮＡ構築物の一過性発現後に得
られた）を表し、同定されたＨＣＶタンパク質はレーン
１の左端に印し、分子量（キロダルトン）はレーン９の
右側に示した。
【００６７】図３Ｂ：ＨＣＶ抗原の細胞内での所在の検
出のための免疫蛍光試験の結果 図４：５′ＨＣＶ−ＩＲＥＳ、ネオマイシンホスホトラ
ンスフェラーゼ遺伝子（ＮｅｏR）、異種の、例えば脳
心筋炎ウイルスのＩＲＥＳ−エレメント（Ｅ−Ｉ）、完
全なＨＣＶ読み枠および確実な３′ＮＴＲからなる、本
発明による選択可能なＨＣＶ−ＲＮＡ構築物（完全なゲ
ノム）の構造の略図 図５：ポリタンパク質をコードするヌクレオチド配列内
に挿入された抗生物質耐性遺伝子（単シストロン性ＲＮ
Ａ）（Ａ）および３′ＮＴＲ内に挿入された抗生物質耐
性遺伝子（２シストロン性ＲＮＡ）（Ｂ）を有するＨＣ
Ｖ−ＲＮＡ構築物の構造の略図 図６：ＮＳ３からＮＳ５ＢまでのＨＣＶレプリコンの一
部として挿入されたリポーター遺伝子を有するＨＣＶ−
ＲＮＡ構築物の構造（Ａ）（そのリポータータンパク質
は最終的にはウイルスまたは細胞のプロテアーゼによっ
てポリタンパク質から分離され、かつ選択可能なマーカ
ー遺伝子（選択遺伝子）もしくは耐性遺伝子は同時トラ
ンスフェクションによって細胞中に導入される）、耐性
遺伝子およびリポーター遺伝子（例えばネオマイシンホ
スホトランスフェラーゼおよび緑色蛍光タンパク質のた
めの遺伝子）からなる融合遺伝子の一部として挿入され
たリポーター遺伝子を有するＨＣＶ−ＲＮＡ構築物の構
造（Ｂ）、耐性遺伝子およびリポーター遺伝子（例えば
ネオマイシンホスホトランスフェラーゼおよび緑色蛍光
タンパク質のための遺伝子）からなるレプリコンの一部
として挿入されたリポーター遺伝子を有するＨＣＶ−Ｒ
ＮＡ構築物の構造（Ｃ）（これらはプロテアーゼによっ
て分解できるかまたは自己分解（自己触媒）活性を有す
るアミノ酸配列（斜線の範囲）をコードするヌクレオチ
ド配列中を介して結合している）、自体の内部のリボソ
ーム結合部位（ＩＲＥＳ）から発現される独立の遺伝子
（ここでは緑色蛍光タンパク質）として挿入されたリポ
ーター遺伝子を有するＨＣＶ−ＲＮＡ構築物の構造
（Ｄ）（耐性遺伝子（ここではネオマイシンホスホトラ
ンスフェラーゼ遺伝子）は自体の内部のリボソーム結合
部位（ＩＲＥＳ）から独立して同様に発現される）（複
シストロン性構築物）の略図 図７：耐性遺伝子がリボザイムもしくはリボザイムのた
めの認識部位を介してＨＣＶ−ＲＮＡ配列と結合してい
るＨＣＶ−ＲＮＡ構築物の構造の略図太い線はＨＣＶの
５′および３′のＮＴＲを意味し、Ｅ−Ｉは耐性遺伝子
の発現のために必須の異種の内部リボソーム結合部位で
あり、灰色の正方形はリボザイムもしくはリボザイムの
認識部位を意味する。
【００６８】図８：耐性遺伝子および組み込まれた外来
遺伝子を有するＨＣＶ−ＲＮＡ構築物の構造の略図 図９：全ＲＮＡとインビトロ転写物との比感染力（形成
した細胞コロニーの数として示した）の比較のための方
法プロセス ＨＣＶ−ＲＮＡを相応のＲＮＡ構築物のインビトロ転写
によって製造し、２６０ｎｍでの光学密度（ＯＤ２６０
ｎｍ）の測定によって定量した。これらの分子の規定さ
れた数をナイーヴＨｕｈ−７細胞の全ＲＮＡの一定量と
混合し、かつこれらの混合物をエレクトロポレーション
を使用してナイーヴＨｕｈ−７細胞中に導入した。それ
に並行して、図１に記載される方法によって製造された
細胞クローンの全ＲＮＡを従来の技術において公知の方
法で単離し、かつそれに含有されるＨＣＶ−ＲＮＡの量
をＨＣＶ特異的なＲＮＡプローブを使用するノーザンブ
ロットおよび引き続きのホスホイメージャー（Phosphoi
mager）による定量によって決定する。全ＲＮＡの規定
された量をインビトロ転写物と類似にネイティブなＨｕ
ｈ−７細胞中にトランスフェクションさせた。次いで両
方のバッチ中の細胞はＧ４１８選択を実施し、かつ形成
したコロニーの数を、固定およびクーマシーブリリアン
トブルーでの染色の後に計数することによって決定し
た。トランスフェクション効率の決定のために、各トラ
ンスフェクションバッチにルシフェラーゼの発現を可能
にするプラスミド１μｇを添加した。トランスフェクシ
ョンした細胞のアリコートを２４時間後に収穫し、かつ
各細胞溶解物中のルシフェラーゼ活性を決定した。コロ
ニーの数はその都度ルシフェラーゼ発現に基づいて規格
化した。
【００６９】図１０：９−１３クローンの配列分析 ＨＣＶ−ＲＮＡ構築物Ｉ３７７／ＮＳ３−３′のトラン
スフェクションによって生じる細胞クローン９−１３の
全ＲＮＡを従来の技術において公知の方法を使用して単
離し、かつヌクレオチド位置５９〜９３８６までのＨＣ
Ｖ−ＲＮＡ構築物を“長距離ＲＴ−ＰＣＲ（long-dista
nce RT-PCR）”を使用してプライマーＳ５９およびＡ９
４１３の使用下に増幅させた。ＰＣＲ断片をクローニン
グし、かつ１１個のクローン（９−１３Ａ〜Ｋと呼ぶ）
を完全に配列決定し、その際、クローンＤおよびクロー
ンＩ、クローンＥおよびクローンＧならびにクローンＨ
およびクローンＪは同一であると証明された。再クロー
ニングされたＨＣＶ−ＲＮＡと親構築物の間のＮＳ３−
５Ｂ領域におけるアミノ酸差異の位置はそれぞれのクロ
ーンにおいて太い垂線で印した。各クローンを制限酵素
ＳｆｉＩで消化し、かつそれぞれの断片を親構築物に挿
入した。これらのクローンをそれぞれのＨｕｈ−７細胞
にトランスフェクションし、該細胞を図１に記載のよう
に選択した。各構築物によって得られる細胞クローンの
数は各構築物の右隣に印した。
【００７０】図１１Ａ：リポーター遺伝子の使用による
複製アッセイの原理 この図の上方部分においては、ＨＣＶ５′ＮＴＲ（ヌク
レオチド位置１〜３８９）、ルシフェラーゼ遺伝子（ｌ
ｕｃ）、脳心筋炎ウイルスのＩＲＥＳ、ＨＣＶＮＳ３−
５Ｂおよび３′ＮＴＲからなるＨＣＶ−ＤＮＡ構築物Ｉ
389／Ｌｕｃ／ＮＳ３−３′が示されている。不活性化
するアミノ酸の交換が導入されたＮＳ５Ｂ ＲＮＡポリ
メラーゼの活性中心の位置は“ＧＮＤ”で示した。複製
能力のあるＨＣＶ−ＲＮＡ構築物もしくは欠失ＨＣＶ−
ＲＮＡ構築物をコードするプラスミドをＳｃａＩで消化
し、かつＴ７ＲＮＡポリメラーゼによるインビトロ転写
において使用した。鋳型ＤＮＡの除去後に、それぞれの
ＨＣＶ−ＲＮＡ構築物をエレクトロポレーションによっ
てナイーヴＨｕｈ−７細胞中に導入し、これらを規則的
な間隔で収穫した。
【００７１】図１１Ｂ：親ＨＣＶ−ＲＮＡ構築物Ｉ389
／Ｌｕｃ／ＮＳ３−３′／ｗｔ（ｗｔ）または以下の変
異体：不活性ＲＮＡ（３１８ＤＮ）、変異体９−１３Ｆ
もしくは変異体５．１でトランスフェクションした細胞
におけるルシフェラーゼ活性の比較 細胞を、トランスフェクション後の６時間（示されてい
ない）、２４時間、４８時間、７２時間、９６時間、１
２０時間、１４４時間および１６８時間に収穫し、かつ
ルシフェラーゼ活性を発光測定的に決定した。
【００７２】図１２：選択可能なＨＣＶ全長ゲノム（構
築物Ｉ389／ｃｏｒｅ−３′／５．１およびＩ389／ｃｏ
ｒｅ−３′／９−１３Ｆ） （Ａ）全長構築物の略図。制限酵素ＳｆｉＩのための２
つの示される認識部位間の範囲は高度に適合したＲＮＡ
変異体５．１または９−１３Ｆの配列に相当する。
【００７３】（Ｂ）Ａに示される構築物Ｉ389／ｃｏｒ
ｅ−３′／５．１のインビトロ転写されたＲＮＡ各０．
１μｇでＨＵＨ７細胞にトランスフェクションした後に
得られるコロニーの数。代表的な試験の結果を挙げてい
る。
【００７４】（Ｃ）相応のインビトロ転写物のトランス
フェクション後に得られるＧ４１８耐性細胞クローンに
おける自律的に複製されるＨＣＶ−全長ＲＮＡの検出。
図はｎｅｏ−耐性遺伝子およびＨＣＶ５′ＮＴＲに対す
るプローブとハイブリダイズしたノーザンブロットのオ
ートラジオグラムを示している。レーン１およびレーン
２に示されるコントロールは、ナイーヴＨｕｈ−７細胞
からの全ＲＮＡと混合された挙げられるインビトロ転写
物の各１０8分子に相当する。ネガティブコントロール
はナイーヴＨｕｈ−７細胞（レーン３）からの全ＲＮＡ
を専ら有している。レーン４〜９は、インビトロ転写さ
れたＩ389／ｃｏｒｅ−３′／５．１−ＲＮＡもしくは
Ｉ389／ｃｏｒｅ−３′／９−１３Ｆ−ＲＮＡでトラン
スフェクションした後に得られたＧ４１８耐性細胞クロ
ーンからの全ＲＮＡ３〜１０μｇを含有している。選択
のために使用されるＧ４１８濃度をその都度挙げてい
る。示される５個の細胞クローンは高度に適合したＲＮ
Ａ変異体５．１（レーン４〜８）を有し、１個の細胞ク
ローンは適合したＲＮＡ変異体９−１３Ｆ（レーン９）
を有している。
【００７５】図１３：１つのリポーター遺伝子を有する
ＨＣＶ−ＲＮＡ構築物。（Ａ）２シストロン性ＨＣＶ−
ＲＮＡ構築物。リポーター遺伝子を別々のＩＲＥＳを使
用して翻訳した。（Ｂ）単シストロン性ＨＣＶ−ＲＮＡ
構築物。リポーター遺伝子産物をＨＣＶタンパク質との
融合タンパク質として発現させた。２つの成分をウイル
スのプロテアーゼもしくは細胞のプロテアーゼのための
融合された２つのタンパク質成分のタンパク質分解によ
る分離を可能にする認識配列を介して結合させる。示さ
れる例ではリポーター遺伝子産物およびそれぞれのＨＣ
Ｖタンパク質をユビキチン（Ｕｂ）のための認識配列を
介して融合させた。
【００７６】図１４：耐性遺伝子に付加的に、挿入され
た外来遺伝子を有している３シストロン性のＨＣＶ−全
長ＲＮＡ構築物。
【００７７】図１５：耐性遺伝子がＨＣＶ成分を有する
融合タンパク質として発現する単シストロン性ＨＣＶ−
ＲＮＡ構築物。耐性遺伝子（ＲＧ）は融合タンパク質と
して活性であるか、または該遺伝子を、耐性遺伝子産物
がＨＣＶ成分の細胞性もしくはウイルス性のプロテアー
ゼによって分解されるように、ＨＣＶ成分を有するタン
パク質分解可能な配列と融合する。示される例では、耐
性遺伝子を、ユビキチン（Ｕｂ）をコードする配列を介
してそれぞれのＨＣＶ成分と融合させた。
【００７８】
【実施例】例１：ＨＣＶ−ＲＮＡ−構築物の製造（Ａ）ＲＴ−ＰＣＲを用いた完全ＨＣＶ−コンセンサス
ゲノムの合成およびクローニング 慢性に感染した患者の肝臓から、ＨＣＶ−ゲノム、つま
りＨＣＶ−ＲＮＡを以下の通りに単離した：肝臓約１０
０ｍｇからChomczynskiおよびSacci(1987, Anal. Bioch
em. 162, 15)の方法により完全ＲＮＡを単離した。単離
したこのＲＮＡ１μｇを用いて、プライマーＡ６１０３
（ＧＣＴＡＴＣＡＧＣＣＧＧＴＴＣＡＴＣＣＡＣＴＧ
Ｃ）またはＡ９４１３（ＣＡＧＧＡＴＧＧＣＣＴＡＴＴ
ＧＧＣＣＴＧＧＡＧ）を有し、かつエキスパンドリバー
ストランスクリプターゼ(expand reverse transcriptas
e)システム（Boehringer Mannheim、ドイツ）を用いた
逆転写を製造元の指示に従って実施した。この逆転写
（ＲＴ）生成物を用いて、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣ
Ｒ＝polymerase chain reaction)を、エキスパンドロン
グテンプレート(expand long template)システム（Boeh
ringer Mannheim、ドイツ）の使用下で実施し、その
際、ジメチルスルホキシド２％の含有率を有する緩衝液
を使用した。４２℃で１時間の後、この反応バッチの１
／８を、プライマーＡ６１０３およびＳ５９（ＴＧＴＣ
ＴＴＣＡＣＧＣＡＧＡＡＡＧＣＧＴＣＴＡＧ）、または
Ａ９４１３およびＳ４５４２（ＧＡＴＧＡＧＣＴＣＧＣ
ＣＧＣＧＡＡＧＣＴＧＴＣＣ）とともに第一のＰＣＲの
サイクルにおいて使用した。４０サイクル後に、この反
応バッチの１／１０を、プライマーＳ５９およびＡ４９
１９（ＡＧＣＡＣＡＧＣＣＣＧＣＧＴＣＡＴＡＧＣＡＣ
ＴＣＧ）、またはＳ４５４２およびＡ９３８６（ＴＴＡ
ＧＣＴＣＣＣＣＧＴＴＣＡＴＣＧＧＴＴＧＧ）とともに
第二のＰＣＲのサイクルにおいて使用した。３０サイク
ル後に分離用アガロースゲル電気泳動を用いてＰＣＲ生
成物を精製し、かつその際に溶離した断片をベクターｐ
ＣＲ２．１（Invitrogen）またはｐＢＳＫＩＩ（Strata
gene）中でライゲーションした。それぞれの断片からの
４つのクローンを分析し、かつ配列決定し、かつコンセ
ンサス配列を確認した。この目的のためにＤＮＡ配列を
相互に比較した。断片の１つの配列が残りのものと異な
る位置を、不所望の突然変異と見なした。配列が多義性
である場合、該当する領域の自体オーバーラップしてい
る比較的短いＰＣＲ断片を増幅し、かつ複数のクローン
を配列決定した。このようにしてそれぞれの断片中の数
多くの潜在的な突然変異を同定し、ひいては単離物−特
異的なコンセンサス配列を確定することができた。確定
されたこのコンセンサス配列もしくはこのゲノムは、世
界的に普及している遺伝子型１ｂに属する。３′末端に
おける翻訳されなかった領域（＝３′ＮＴＲ）が通常の
ＰＣＲにより得られ、その際、従来技術において公知の
「Ｘ−テール(X-tails)」（Tanaka et al., 1995, Bioc
hem.Biophys. Res. Commum. 215, 744およびRice,ＰＣ
Ｔ／ＵＳ９６／１４０３３）の最後の２４のヌクレオチ
ドを覆うアンチセンス−プライマーを使用した。ＰＣＲ
を用いてＴ７プロモーターの鎖の下流の５′−末端（＝
５′ＮＴＲ）における確立された非翻訳領域を発生さ
せ、その際、一方では短縮したＴ７プロモーター（ＴＡ
Ａ ＴＡＣ ＧＡＣ ＴＣＡ ＣＴＡ ＴＡＧ）および
ＨＣＶの第一の８８のヌクレオチドに相当するオリゴヌ
クレオチドを使用し、かつ他方ではゲノムの５′断片の
１つを有する前記のプラスミドを使用した。非コンセン
サス交換の数が極めて少ないサブゲノム断片から、完全
ＨＣＶ−コンセンサスゲノムを構成し、かつ改変したｐ
ＢＲ３２２−ベクターに挿入した。部位特異的突然変異
(site-directed mutagenesis)を用いてコンセンサス配
列からの差異を排除した。確定された３′末端を有する
「ラン−オフ(run-off)」転写を製造するために、単離
物の３′−ＮＴＲ（末端ＴＧＴを有する）をＡＧＴに変
性し（Kolykhalov etal., 1996, J. Virol. 70, 3363に
よる遺伝子型３＝クローン’ＷＳ’の配列による）、か
つさらに付加的なヌクレオチド交換を位置９５６２にお
いて行い、ＡＴ塩基対を３′ＮＴＲ（Kolyhalov et a
l., ibid.）の３′末端におけるヘアピン構造中に保持
した。酵素Ｓｃａ１のための内部の制限部位を排除する
ために、さらにいわゆる発現しない(silent)ヌクレオチ
ド交換を行った。適合した５′ＮＴＲおよび３′ＮＴＲ
を有する全長のゲノムの連結後に、完全ＨＣＶ配列を調
査した。その際、不所望のヌクレオチド交換は発見され
なかった。
【００７９】このようにして製造したＨＣＶゲノムは、
定義によれば向肝性(hepatotrop)であるべきである。
【００８０】（Ｂ）選択可能なＨＣＶ−サブゲノム構築
物の合成 （Ａ）に記載したコンセンサスゲノムの使用下に、抗生
物質耐性遺伝子のネオマイシン−ホスホトランスフェラ
ーゼ（ＮＰＴ）および内部のリボソーム結合部位（ＩＲ
ＥＳ）の２つの配列を有するＨＣＶ−サブゲノム−構築
物を製造した。このために使用した生化学的なプロセス
技術は、当業者に公知であり、かつ周知である（次の文
献を参照のこと：Sambrook, J., E.F. Fritsch, T. Man
iatis, 1989, Molecularcloning: a laboratory manua
l., 2nd ed., Cold Spring Harbour Laboratory, Cold
Spring Harbor, N.Y.; Ausubel et al. (eds.), 1994,
Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1-3,
John Willey & Sons Inc.,New York）。抗生物質耐性遺
伝子を直接５′ＮＴＲの後ろに挿入し、このことにより
２シストロンのＲＮＡが得られた（図１Ａを参照のこ
と）。しかしまた抗生物質耐性遺伝子はＨＣＶ−サブゲ
ノム−構築物の別の部位、例えばポリタンパク質をコー
ドするヌクレオチド配列の内部にもまた同様に良好に挿
入することができ、このことにより単シストロンのＲＮ
Ａが得られる（図５Ａを参照のこと）か、または３′Ｎ
ＴＲ中に挿入する（図５Ｂを参照のこと）。ＩＲＥＳ−
エレメントは一方では両方のＨＣＶ−ＩＲＥＳ−変異体
ヌクレオチド１−３７７またはヌクレオチド１−３８９
の１つであり、かつ他方ではＮＳ２またはＮＳ３に関す
る遺伝子の鎖の下流にゲノムの確かな３′末端までＨＣ
Ｖ配列の翻訳を制御するエンゼファロマイオカルディテ
ィス(Enzephalomyocarditis)ウイルスのＩＲＥＳであ
る。
【００８１】前記の両方のＨＣＶ−ＩＲＥＳ−変異体を
以下の通りに確認した：ＨＣＶ−ＩＲＥＳの３′境界部
の欠失分析法（Reynolds et al., 1995, EMBOJ. 14, 60
10）に基づいて、５′ＮＴＲの種々の断片をＮＰＴ遺伝
子と融合し、かつＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子を含
有しているプラスミドとの同時トランスフェクションに
基づいて、形成されたコロニーの最大数に関して分析し
た。１−３７７および１−３８９のＨＣＶ配列で最良の
結果が得られた。ＨＣＶポリタンパク質のＡＵＧ出発コ
ードは位置３４２に存在し、ひいてはＩＲＥＳ配列中に
含有されているので、ＨＣＶ−カプシドタンパク質（コ
アタンパク質(Core-Proeins)）の１２個もしくは１６個
のアミノ酸とネオマイシンホスホトランスフェラーゼと
が融合する（図１Ａを参照のこと）。
【００８２】従ってこの改変されたＨＣＶ−サブゲノム
−構築物は名称Ｉ377／ＮＳ２−３′（またはＩ377／Ｎ
Ｓ３−３′）およびＩ389／ＮＳ２−３′（またはＩ389
／ＮＳ３−３′）を有していた。これらは図１Ａに図示
されている。
【００８３】これらの改変された親ＨＣＶ−サブゲノム
−構築物Ｉ377／ＮＳ２−３′（またはＩ377／ＮＳ３−
３′）およびＩ389／ＮＳ２−３′（またはＩ389／ＮＳ
３−３′）のインビトロ−転写を用いて、ヒトの肝細胞
の種々の細胞系および一次細胞培養をトランスフェクシ
ョンした。
【００８４】すべてのトランスフェクション実験に並行
するネガティブコントロールとして、それぞれの改変親
ＨＣＶ−サブゲノム−構築物に対して、１つの相応して
改変したが、しかしサブゲノムは読み枠中で、ＮＳ５Ｂ
ＲＮＡポリメラーゼの活性中心を含む１０個のアミノ
酸の欠失を有していることにより親サブゲノムから区別
される欠損サブゲノムを構成した（Behrens et al., 19
96, EMBO J. 15, 12;およびLohmann et al., 1997, J.
Virol. 71, 8416）。
【００８５】（Ｃ）選択可能なＨＣＶ−ゲノム−構築物
の合成 ５′末端でルシフェラーゼ遺伝子の断片および完全ＥＭ
ＣＶ−ＩＲＥＳと結合しているＮＳ２−３′サブゲノム
構築物を、ＮｃｏＩおよびＳｐｅＩで制限し、かつ分離
用アガロースゲル電気泳動を用いて精製した。このよう
にして得られたベクターを３ファクターライゲーション
において、ＮｃｏＩ／ＮｏｔＩ−ＨＣＶ−断片を用いて
ＨＣＶ−ゲノムのヌクレオチド位置３４２〜１９６８に
相応して、およびＮｏｔＩ／ＳｐｅＩ−断片を用いてヌ
クレオチド位置１９６８〜９６０５に相応してライゲー
ションした。その後、完全ＨＣＶ−読み枠および３′Ｎ
ＴＲがルシフェラーゼ遺伝子断片およびＥＭＣＶ−ＩＲ
ＥＳの下流に存在している得られた構築物を、ＰｍｅＩ
およびＳｐｅＩで制限し、かつ同様に制限したＩ38 9／
ＮＳ３−３′／ｗｔ−サブゲノム構築物ベクターを用い
てライゲーションした。選択可能なこのＨＣＶ−ゲノム
構築物が図４に記載されている。
【００８６】（Ｄ）ＨＣＶ−ＲＮＡ−構築物に相応した
インビトロ転写物の製造 前記の精製したプラスミドＤＮＡを、ＳｃａＩを用いて
直線状にし、かつフェノール／クロロホルム−抽出およ
びイソプロパノール−沈殿後に次の成分の使用下にイン
ビトロ−転写反応で使用した：ＨＥＰＥＳ８０ｍＭ、ｐ
Ｈ７．５、ＭｇＣｌ2 １２．５ｍＭ、スペルミジン２
ｍＭ、ジチオトレイトール４０ｍＭ、それぞれのＮＴＰ
から２ｍＭ、ＲＮａｓｉｎ １ユニット／μｌ、制限Ｄ
ＮＡ５０μｇ／ｍｌおよびＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ約
２ユニット／μｌ。３７℃で２時間後にＴ７ポリメラー
ゼの半量を添加し、かつ反応バッチをさらに２時間イン
キュベーションした。ＤＮＡの除去のために、該混合物
を酸性フェノールで抽出し（U. Kedzierski, J.C. Port
e, 1991, Bio Techniques 10, 210）、イソプロパノー
ルで沈殿し、ペレットを水中に溶解し、かつＤＮａｓｅ
（ＤＮＡμｇあたり２ユニット）とともに３７℃で６０
分間インキュベーションした。酸性フェノール、酸性フ
ェノール／クロロホルムおよびクロロホルムを用いたそ
の後の抽出およびイソプロパノール−沈殿の後、溶解し
たＲＮＡを光学密度測定により定量化し、かつその不確
定性をホルムアルデヒド−アガロースゲル電気泳動によ
り調査した。
【００８７】例２：肝癌細胞系Ｈｕｈ−７を用いたトラ
ンスフェクション実験 すべてのトランスフェクション実験において、それぞれ
の鋳型ＤＮＡをあらかじめ除去して、該ＤＮＡがトラン
スフェクションした細胞に導入され、かつＨＣＶの複製
とは無関係にこれらにネオマイシン耐性を媒介すること
ができるということを回避することに慎重に注意を払っ
た。従ってインビトロ−転写（例１Ｄ）に引き続き、Ｄ
ＮＡμｇあたり、ＤＮａｓｅ２ユニットを用いて反応混
合物を３７℃で６０分間処理し、かつ酸性フェノール、
酸性フェノール／クロロホルムおよびクロロホルムを用
いて抽出した。トランスフェクションのための使用前
に、ホルムアルデヒドアガロースゲル電気泳動を用いて
沈殿したＲＮＡを分析した。
【００８８】高度に分化したヒト肝癌細胞系Ｈｕｈ−７
を用いて３つの別々のトランスフェクション実験を実施
した（Nakabayashi et al., 1982, Cancer Res. 42, 38
58）。その際、エレクトロポレーションを用いてその都
度ＲＮＡ１５μｇを８×１０ 6ＨｕＨ−７−細胞中に導
入し、かつこれらの細胞を引き続き直径１０ｃｍの培養
皿に播種した。播種の２４時間後に、ネオマイシン（＝
Ｇ４１８）を最終濃度１ｍｇ／ｍｌで添加した。培地を
週に２回交換した。３〜５週間後に小さいコロニーが認
識され、これを単離し、かつ同一の培養条件下で継代し
た。
【００８９】第一の実験の経過において得られた細胞ク
ローンを単離し、かつ継代培養した。この手順において
ほとんどのクローンが死滅し、かつ最終収率は親ＨＣＶ
サブゲノム構築物でトランスフェクションされていた細
胞クローンがわずか９および欠損ＨＣＶ−ゲノム−構築
物、つまり欠損ＮＳ２−３′ＨＣＶ−ＲＮＡでトランス
フェクションされていた細胞クローン１（クローン８−
１）であった。短縮された倍増時間および不規則に形成
された細胞が時折出現すること以外に、これらの９の細
胞クローンと１の細胞クローン（クローン８−１）又は
親Ｈｕｈ−７細胞の間には安定した形態学的な相違は見
られなかった。
【００９０】機能性ＨＣＶ−ゲノム構築物に関する主な
基準は、正確な大きさを有するウイルスＲＮＡの形成お
よびＧ４１８−耐性を転写されたか、もしくは媒介され
た可能性のある（組み込まれた）プラスミドＤＮＡの不
在である。
【００９１】Ｈｕｈ−７−細胞中でＨＣＶ−ＲＮＡを決
定するために、全ＲＮＡを単離し、かつ慣用のノーザン
ブロット法を用いてプラス鎖−特異的なリボプローブ(R
ibosonde)（ＲＮＡ−プローブ）の使用下に分析した。
このためにChomczynskiおよびSacci, 1987, Anal. Bioc
hem. 162, 156の方法によりそれぞれの細胞クローンか
ら全ＲＮＡを単離し、変性ホルムアルデヒド−アガロー
スゲル電気泳動法を用いて全ＲＮＡ含有率０．５〜１×
１０6細胞に相当するＲＮＡ１０μｇを分離した（図１
Ｂのレーン３〜１２）。確かな配列を有するサイズマー
カーとして、Ｉ38 9／ＮＳ２−３′／ｗｔまたはＩ389／
ＮＳ３−３′／ｗｔレプリコンＲＮＡに相応する１０9
のインビトロ−複写を同時に分離した（レーン１もしく
はレーン２）。分離したＲＮＡをナイロンメンブランに
移し、かつヌクレオチド３７７〜ヌクレオチド１の完全
ＮＰＴ−遺伝子およびＨＣＶ−ＩＲＥＳに対して相補性
に放射性標識したプラス鎖−特異的なＲＮＡ−プローブ
を用いてハイブリダイゼーションした。ＨＣＶ−特的な
ＲＮＡ（矢印）および２８ＳｒＲＮＡの位置は、レーン
１２の右側に記載されており、ＲＮＡマーカーの大きさ
（ヌクレオチドの数）は、レーン１の左側に記載されて
いる。ＲＮＡマーカーの断片は、ＨＣＶ配列を有してお
り、かつ従ってリボプローブとハイブリダイゼーション
する。この分析の結果は図１Ｂに記載されている。
【００９２】欠損ＨＣＶ−ゲノム−構築物を用いてトラ
ンスフェクションしたクローン８−１を例外として、す
べての細胞クローンは正確な長さの均質なＨＣＶ−ＲＮ
Ａを産出した（ＮＳ２−３′の場合、約８６４０のヌク
レオチドおよびＮＳ３−３′レプリコンの場合、約７９
７０のヌクレオチド）。この調査は、機能性レプリコン
もしくは機能性ＨＣＶ−ゲノム−構築物が、Ｇ４１８耐
性を転写するということの指標である。Ｇ４１８耐性
が、Ｈｕｈ−７宿主細胞のゲノムに組み込まれており、
かつ細胞プロモーターのコントロール下で転写されるプ
ラスミドＤＮＡに起因するということを排除するため
に、ＮＰＴ遺伝子特異的なＰＣＲを用いてそれぞれのク
ローンからＤＮＡを調査した。この場合、選択されたＨ
ｕｈ−７−細胞クローンから、１０ｍＭＴｒｉｓ、ｐＨ
７．５、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５％ＳＤＳ中のプロテ
インキナーゼＫ（４０μｇ／ｍｌ、１ｈ、３７℃）を用
いた消化および引き続きフェノール、フェノール／クロ
ロホルムを用いた抽出およびイソプロパノール沈殿によ
りＤＮＡを単離した。ＤＮＡ沈殿物を１０ｍＭＴｒｉｓ
（ｐＨ７．５）および１ｍＭ ＥＤＴＡ中に溶解し、か
つＲｎａｓｅＡを用いて１時間インキュベーションし
た。フェノール／クロロホルム抽出およびエタノール沈
殿に引き続き、４〜８×１０4細胞に相応するＤＮＡ１
μｇを、ＮＰＴ−遺伝子−特異的なプライマー（５′−
ＴＣＡＡＧＡＣＣＧＡＣＣＴＧ ＴＣＣＧＧＴＧＣＣＣ
−３′および５′−ＣＴＴＧＡＧＣＣＴＧＧＣＧＡＡＣ
ＡＧＴＴＣＧＧＣ−３′）の使用下にＰＣＲを用いて分
析し、かつ３７９のヌクレオチドからなるＤＮＡ断片が
得られた。ＰＣＲ生成物の特異性をサザンブロット法を
用いて検出し、その際、ＮＰＴ遺伝子に相応するジゴキ
シゲニン標識したＤＮＡ断片を使用した。ポジティブコ
ントロールとして、１０7のプラスミド分子またはネオ
マイシン耐性遺伝子を用いて安定にトランスフェクショ
ンされたＢＨＫ細胞系からのＤＮＡ１μｇを用いてＰＣ
Ｒ法を実施し、かつネガティブコントロールとして、同
一であるがしかしＤＮＡを添加しなかった反応試薬を用
いてＰＣＲを実施した。
【００９３】この調査の結果は図１Ｃに記載されてい
る。レーン１および２は、ポジティブコントロールを表
し、レーン１３は、ネガティブコントロールを表す。レ
ーン１の左側の数の表示は、ヌクレオチド−マーカー−
分子の大きさを表している。ＮＳ２−３′レプリコン／
ＮＳ２−３′ＨＣＶ−ゲノム−構築物を用いたトランス
フェクションによる細胞に由来するクローン７−３（図
１Ｃ、レーン３）中、および欠損ＨＣＶ−ゲノム−構築
物を用いたトランスフェクションによる細胞に由来する
クローン８−１（図１Ｃ、レーン１２）中以外には、い
ずれの細胞クローンでもＮＰＴ−ＤＮＡを検出できなか
った。この調査は、ほとんどのクローンのＧ４１８耐性
が複製されたＨＣＶ−ＲＮＡにより媒介されたというこ
とのためのさらなる指標である。しかしこの結果とは無
関係に、正確な大きさを有するＨＣＶ−ＲＮＡを組み込
まれたプラスミドＤＮＡから製造することはあり得な
い。というのもインビトロ転写のために使用されるプラ
スミドは、真核生物プロモーターもポリアデニル化シグ
ナルも有していないからである。従ってクローン７−３
の場合、耐性はおそらくＨＣＶ−ＲＮＡ−構築物もしく
は複製するＨＣＶ−ＲＮＡによっても、組み込まれたＮ
ＰＴ ＤＮＡ配列によっても媒介される可能性は極めて
高く、その一方でクローン８−１の細胞の耐性はもっぱ
ら導入されたプラスミドＤＮＡに起因する。
【００９４】Ｇ４１８耐性が自律的に複製するＨＣＶ−
ＲＮＡにより媒介されていることを証明するためにクロ
ーン９−１３（図１Ｂ、レーン１１）をさらに試験し
た。ＮＰＴ−遺伝子の導入されたコピーを有するクロー
ン８−１をあらゆるところでネガティブコントロールと
して使用した。クローン９−１３中のＮＰＴ−ＤＮＡの
存在を徹底的に排除するという目的で、４００００以下
の細胞中のＮＰＴ−遺伝子−コピー１０００未満の検出
を可能にするＰＣＲを実施した。このＰＣＲの結果は図
２Ａに記載されている。このＰＣＲの場合、詳細には以
下の通りに行った：その都度１０6〜１０2のプラスミド
分子（Ｉ377／ＮＳ３−３′／ｗｔ）を、直接（レーン
７〜１１）またはその都度１μｇの９−１３ＤＮＡの添
加後（レーン２〜６）に試験で使用した。増幅したＤＮ
Ａ断片の特異性を、ＮＰＴ−特異的なプローブの使用下
にサザンブロットを用いて決定した。ＤＮＡ−プローブ
を有していないＰＣＲを、ネガティブコントロールとし
て実施した（レーン１２）。
【００９５】この高感度な方法を用いても細胞クローン
９−１３のＤＮＡμｇ中にプラスミドＤＮＡは検出され
なかった（レーン１）。これらの細胞中のＨＣＶ−プラ
ス鎖およびマイナス鎖のＲＮＡの量を評価するために、
プラス鎖およびマイナス鎖特異的な放射性標識したリボ
プローブ(Ribosonde)（＝ＲＮＡプローブ）の使用下に
ノーザンブロット法を用いて全ＲＮＡの希釈系列を分析
した。このために、その都度、細胞クローン９−１３お
よび８−１から単離された全ＲＮＡ８μｇ、４μｇまた
は２μｇを、ノーザンブロット法で公知量のプラス鎖ま
たはマイナス鎖極性（コントロールＲＮＡ）を有する類
似のインビトロ転写と並行して分析し、かつ引き続きハ
イブリダイゼーションした。ハイブリダイゼーション
は、完全ＮＰＴ遺伝子およびＨＣＶ−ＩＲＥＳを覆うプ
ラス鎖特異的リボプローブ（上部の図版の「プラス
鎖」）を用いるか、またはＮＳ３−配列に対して相補的
なマイナス鎖特異的なＲＮＡプローブ（下部の図版の
「マイナス鎖」）を用いて実施した。矢印はレプリコン
ＲＮＡの位置を標識している。この分析の結果は図２Ｂ
に記載されている。
【００９６】プラス鎖の場合、約１０8コピー／全ＲＮ
Ａμｇが検出され、これは細胞あたり１０００〜５００
０のＨＣＶ−ＲＮＡ−分子に相当するが、その一方でマ
イナス鎖ＲＮＡの量は５〜１０倍低かった。この結果
は、マイナス鎖ＲＮＡは、プラス鎖分子の合成のための
装入物として使用される複製中間体もしくは中間コピー
であるという仮定と一致する。
【００９７】反応は実質的にウイルスＲＮＡに依存した
ＲＮＡポリメラーゼにより触媒されるので、ＨＣＶ−Ｒ
ＮＡの合成は、ＤＮＡ鋳型からのＲＮＡ合成を選択的に
抑制するが、しかしＲＮＡ鋳型からのＲＮＡ合成を抑制
しない抗生物質であるダクチノマイシンに対して耐性で
あるべきである。この推測を裏付けるために、［3Ｈ］
ウリジンを用いて細胞をダクチノマイシンの存在下でイ
ンキュベーションし、放射性標識したＲＮＡを抽出し、
変性アガロースゲル電気泳動を用いて分離し、かつ［3
Ｈ］感光板の使用下に市販のバイオ−イメージャー(Bio
-Imager)を用いて分析した。このためにその都度、クロ
ーン９−１３および８−１の細胞約５×１０5をＣｉ［3
Ｈ］ウリジン１００μを用いてダクチノマイシン（Ｄａ
ｃｔ）の不在下（−）または４μｇ／ｍｌの存在下
（＋）に１６時間インキュベーションした。この標識反
応に引き続き、全ＲＮＡを調整し、かつホルムアルデヒ
ド−アガロースゲル電気泳動を用いて分析した。両方の
第一のレーン中で、全ＲＮＡの１／１０が表示されてい
るのみである。放射性標識したＲＮＡを、ＢＡＳ−２５
００バイオ−イメージャー（フジ(Fuji)社）を用いて目
視できるようにした。
【００９８】この分析の結果は図２Ｃに記載されてい
る。ＮＳ５Ｂポリメラーゼのインヒビタープロフィール
との一致において（Behrens et al., 1996, EMBOJ. 15,
12およびLohmann et al., 1997, J. Virol. 71, 841
6）、ＨＣＶ ＲＮＡの複製はダクチノマイシンにより
影響を受けることはないが、その一方で細胞ＲＮＡの合
成は抑制された。ウイルスＲＮＡの同一性を確認するた
めに、複製した配列の再クローニングのためにＲＴ−Ｐ
ＣＲを実施した。再クローニングしたＲＮＡの配列分析
は、クローン９−１３中のＲＮＡがＨＣＶ−特異的であ
り、かつＨＣＶ−構築物Ｉ377／ＮＳ３−３′／ｗｔの
転写した転写物と一致することを示した。
【００９９】ウイルスタンパク質の分析のために該当す
る細胞をまず代謝的に［35Ｓ］メチオニン／システイン
を用いて放射性に標識し、引き続き溶解し、かつその
後、免疫沈降を用いてＨＣＶ特異的なタンパク質を細胞
−溶解産物から単離した。この分析の結果は図３Ａに記
載されている。その際、詳細には以下の通りに行った：
細胞クローン９−１３（ｗｔ）および８−１（Δ）の細
胞を、当業者に公知であり、かつ市販のタンパク質標識
混合物（例えばNEN Life Science）を用いて１６時間処
理することにより代謝的に放射性標識した。非変性条件
下（例えばBartenschlager et al., 1995, J. Virol, 6
9, 7519による）または３つの異なった抗血清の使用下
（3/4, 5A, 5B、レーン１〜１２の上部の末端における
標識による）に免疫沈降（ＩＰ）を用いて、ＨＣＶ特異
タンパク質を細胞−溶解産物から分離した。トリシンＳ
ＤＳ−ＰＡＧＥを用いて免疫複合体を分析し、かつオー
トラジオグラフ法を用いて目視できるようにした。確定
された大きさのマーカーを得るために、相同レプリコン
構築物Ｉ377／ＮＳ３−３′／ｗｔをワクシニアウイル
スＴ７−ハイブリッド系を用いてＨｕｈ−７細胞中で一
過性発現させた。その際に得られた生成物をサイズマー
カー（レーン７〜９）として、クローン９−１３および
８−１の細胞と並行して処理した。同定されたＨＣＶタ
ンパク質は、レーン１の左の端に標識されており、分子
量（キロダルトン）は、レーン９の右側の端に記載され
ている。使用されるＮＳ３／４特異的な抗血清（′３／
４′）は、有利にはＮＳ４ＡおよびＮＳ４Ｂと反応し、
これはＮＳ３の下位表示(Unterrepraesentation)につな
がることがわかる。
【０１００】すべてのウイルス抗原は明確に検出可能で
あり、かつその見かけの分子量は、２シストロンのＨＣ
Ｖ−ＲＮＡ−構築物の一過性発現により本来のＨｕｈ−
７細胞中で確認された分子量に対する差異を示さなかっ
た。ウイルス抗原の細胞内分布を決定するために、ＮＳ
３およびＮＳ５Ａ特異的な抗血清の使用下に免疫蛍光法
−検出反応を実施した（例えばBartenschlager et al.,
1995, J. Vitol, 69,7519による）。このためにクロー
ン９−１３（ｗｔ）および８−１（Δ）の細胞を、播種
の２４時間後にメタノール／アセトンを用いてカバーガ
ラス上に固定し、かつポリクローナルＮＳ３またはＮＳ
５Ａ特異的な抗血清とともにインキュベーションした。
結合した抗体を市販のＦＩＴＣ−共役した抗ウサギ抗血
清を用いて目視できるようにした。非特異的な蛍光シグ
ナルの抑制のために、細胞を色素「エバンスブルー(Eva
ns Blue)」で色分けした。
【０１０１】この検出の結果は図３Ｂに記載されてい
る。両方の抗血清を用いて細胞質中の強い蛍光を検出す
ることができた。ＮＳ５Ａ特異的な抗血清はさらに弱い
細胞核の蛍光につながり、このことは、この抗原の少な
くとも少量が細胞核にも達したことを暗示している。し
かし細胞質中のウイルス抗原の一般に優勢な存在は、Ｈ
ＣＶ−ＲＮＡ複製が、多くのＲＮＡウイルスの場合に該
当するように、細胞質中で行われていることに関する著
しい指標である。
【０１０２】これらの結果は、ここに記載されている試
験バッチを用いてＨＣＶのための細胞培養系の構築が成
功しており、その効率はすべて従来公知のサイズのオー
ダーに勝っており、かつ通例の、かつ実証済みの生化学
的方法で初めてウイルス性の核酸およびタンパク質の検
出を可能にしたことを明らかに裏付けている。この効率
は初めてＨＣＶの発病学の完全に詳細な調査、種々のＨ
ＣＶ−機能の発生学的分析およびウイルス−／宿主細胞
の相互作用の精密な研究を可能にし、このことにより抗
ウイルス治療法の開発のための手がかりを定義すること
ができる。
【０１０３】例３：ＨＣＶゲノム構築物を用いたＨｕｈ
−７細胞のトランスフェクション 例２に記載したようにＨｕｈ−７細胞をトランスフェク
ションし、かつ選択したが、しかしその際、ここで完全
なウイルスゲノムを有している選択可能な構築物を使用
した。得られた細胞クローンを例２と同様にしてＨＣＶ
−ＤＮＡの不在下にＰＣＲを用いて調査し、かつその
後、ＨＣＶ−ＲＮＡの産生複製を、ダクチノマイシンの
存在下にノーザンブロット、［3Ｈ］ウリジン標識、ウ
イルスタンパク質もしくは抗原の検出を用いて、有利に
はウエスタンブロット、免疫沈降法または免疫蛍光法を
用いて検出した。例２に記載されているバッチとは対照
的に、ここに記載されている構築物を用いて、さらに完
全で、かつ極めて感染力の高いウイルスが得られるが、
これは該部位（例２中）に記載されているサブゲノム構
築物の場合、該当しない。細胞および細胞培養上清中に
存在しているこれらのウイルスは、例えば超遠心分離、
免疫沈降またはポリエチレングリコールを用いた沈殿に
より濃縮し、かつすべての外因性、つまりウイルス粒子
中に構築されていない核酸を、ヌクレアーゼ（ＲＮａｓ
ｅ、ＤＮａｓｅ、単球菌ヌクレアーゼ）を用いたインキ
ュベーションにより消化する。このようにして、保護ウ
イルス粒子中に含有されていないすべての汚染性の核酸
を除去することができる。保護されたウイルスＲＮＡを
ヌクレアーゼのインキュベーション後に、例えばプロテ
イナーゼＫを用いたインキュベーションを用いてＳＤＳ
含有緩衝液中でフェノールおよびフェノール／クロロホ
ルムを用いた抽出により単離し、かつＨＣＶ特異的なプ
ライマーの使用下にノーザンブロットまたはＲＴ−ＰＣ
Ｒを用いて検出する。この試験バッチでも前記のＨＣＶ
コンセンサスゲノムと選択マーカーとの組み合わせはウ
イルスＲＮＡ、ウイルスタンパク質ひいてはＨＣＶ粒子
の効果的な生産にとって決定的である。
【０１０４】例４：耐性遺伝子がリボザイムもしくはリ
ボザイムのための認識部位を介してＨＣＶ−サブゲノム
−配列と結合しているＨＣＶ−ＲＮＡ構築物の製造およ
び適用 例１または例３によりＨＣＶ−ＲＮＡ−構築物を製造
し、その際、抗生物質耐性遺伝子がリボザイムもしくは
リボザイムのための認識部位を介してＨＣＶ−ＲＮＡ−
配列と結合している。このような構築物は、図７に図示
されている。Ｈｕｈ−７細胞は、例えば例２に記載され
ているように、これらのＨＣＶ−ＲＮＡ−構築物でトラ
ンスフェクションされている。細胞へのトランスフェク
ション後に、まず、相応する抗生物質を用いた選択を行
う。その際に得られる細胞クローン中で、単一クローン
性リボザイムが活性化されるか、またはリボザイムのた
めの認識部位を有する構築物の場合、リボザイムが細胞
中に導入される（例えばリボザイム構築物のトランスフ
ェクションまたはその中で相応するリボザイムが使用さ
れたウイルス発現ベクターを用いた感染による）。両方
の場合においてリボザイム媒介された分解により耐性遺
伝子はＨＣＶ−ＲＮＡ配列から分離される。その結果
は、ＨＣＶ−ゲノム−構築物の場合、耐性遺伝子を有し
ていない確立されたＨＣＶ−ゲノムであり、これは確立
された感染性ウイルス粒子の形成のための能力がある。
ＨＣＶ−サブゲノム−構築物の場合、耐性遺伝子を有し
ていないＨＣＶ−レプリコンが生じる。
【０１０５】例５：別々のルシフェラーゼ−トランスフ
ェクション構築物を用いたＨＣＶ−ＲＮＡ−構築物の同
時トランスフェクション 例１（Ａ）または例３または例４によりＨＣＶ−ＲＮＡ
−構築物を製造する。これと並行して、ルシフェラーゼ
遺伝子を含むトランスフェクション構築物を製造し、そ
の際、ＨＣＶ−プロテアーゼ−（例えばＮＳ３−プロテ
アーゼ−）分割部位に関してコードする第一のヌクレオ
チド配列を用いて、このルシフェラーゼ遺伝子と、その
他のタンパク質またはその他のタンパク質の一部をコー
ドする第二のヌクレオチド配列とが結合している。ＨＣ
Ｖ−ＲＮＡ−構築物およびトランスフェクション構築物
を、任意の宿主細胞、有利には肝癌細胞、特にＨｕｈ−
７−細胞に導入する。これは例２に記載の方法で行うこ
とができる。改変されたルシフェラーゼ遺伝子の生成物
は、その中でルシフェラーゼが外来成分との融合に基づ
いて不活性化するルシフェラーゼ−融合タンパク質であ
る。高いＨＣＶ−複製を有するトランスフェクションし
た細胞中で、ＨＣＶ−プロテアーゼのための切断部位を
有する融合タンパク質を分離し、ひいては発光測定(lum
inometrischeMessung)により決定することができるルシ
フェラーゼの活性型を遊離する。ＨＣＶ−ＲＮＡ−構築
物の複製を抑制すると、融合タンパク質は分離せず、か
つ活性ルシフェラーゼは遊離しない。従って、ルシフェ
ラーゼの定量的な測定はＨＣＶ−サブゲノム−構築物の
複製のための尺度である。ルシフェラーゼ遺伝子の代わ
りに、同様にして修飾されているその他のリポーター遺
伝子も同様に使用することができるので、このリポータ
ー遺伝子がＨＣＶ−サブゲノム−構築物の成分ではなく
ても、その発現はウイルス複製に依存する。ＨＣＶ−タ
ンパク質または核酸により不活性化または活性化される
細胞タンパク質もまたいわゆる代理マーカー(Surrogatm
arker)として使用することができる。この場合、この代
理マーカーの発現もしくは活性化は、ウイルスＤＮＡの
複製のための尺度である。
【０１０６】例６：遺伝子治療のために肝癌細胞特異的
な遺伝子輸送体として使用するための導入された外来遺
伝子を有するＨＣＶ−サブゲノム−構築物の製造 この組み換え型および選択可能なＨＣＶ−サブゲノム−
構築物を、トランス相補性ヘルパー細胞系、つまり誘発
可能な、または構造的に欠けている機能を発現する細胞
系（例えば構造タンパク質）にトランスフェクションす
る。機能的なＨＣＶ−サブゲノム−構築物を有する細胞
クローンを相応する選択により確立することができる。
宿主細胞により発現したウイルス−構造タンパク質は、
その中へＨＣＶ−サブゲノム−構築物のＲＮＡを導入す
るウイルス粒子の形成を可能にする。その結果はつまり
単一クローンした外来遺伝子も含めて本発明によるＨＣ
Ｖ−サブゲノム−構築物を含有し、かつこれを感染によ
りその他の細胞に移すことができるウイルス様粒子であ
る。このような構築物の例は図８に記載されている。こ
こに記載した、組み込まれた外来遺伝子を有する本発明
によるＨＣＶ−サブゲノム−構築物を直接発現ベクター
として使用する可能性もまた生じる。その場合、前記の
方法と同様に行うが、しかしトランス相補性の因子を発
現する細胞系をトランスフェクションすることが異なっ
ている。この場合、ＨＣＶ−構築物は単に発現ベクター
として使用されるのみである。
【０１０７】例７：細胞培養に適合したＨＣＶ−ＲＮＡ
−構築物の製造 （Ａ）単離法 適合した突然変異の測定および細胞培養に適合したＨＣ
Ｖ−ＲＮＡ−構築物の製造のために、以下の通りに行っ
た：細胞をＨＣＶ−ＲＮＡ−構築物を用いて例１および
２に記載されているようにトランスフェクションし、か
つＧ４１８−耐性細胞クローンを製造した。複製能力
（これはこの関連において、トランスフェクションした
ＨＣＶ−ＲＮＡもしくはＨＣＶ−ＲＮＡ−構築物１μｇ
あたりに得られるＧ４１８−耐性細胞クローンの数と解
釈する）の測定のために模範的に９−１３（図１Ｂ、レ
ーン１１）と称する細胞クローンの１つからの全ＲＮＡ
を単離し、かつその中に含有されているＨＣＶ−ＲＮＡ
の量を図２Ｂに記載されているようにノーザンブロット
を用いて測定した。引き続き、ＨＣＶ−ＲＮＡを約１０
9分子含有している全ＲＮＡの１０μｇをエレクトロポ
レーションによりナイーヴＨｕｈ−７細胞に導入した
（図９）。これと並行してナイーヴＨｕｈ−７細胞から
単離した全ＲＮＡを用いて１０μｇの全ＲＮＡ量に満た
した類似のｎｅｏ−ＨＣＶ−ＲＮＡのインビトロ転写１
０9を、ナイーヴＨｕｈ−７細胞にトランスフェクショ
ンした。Ｇ４１８を用いた選択後に、両方のバッチ中の
細胞コロニーの数を測定し、これをＲＮＡμｇあたりの
コロニー形成単位(colony formingunits(cfu))で表し
た。選択媒体中、Ｇ４１８ ５００μｇ／ｍｌの濃度の
場合、単離した全ＲＮＡ中に含有されているＨＣＶ−Ｒ
ＮＡにより得られたコロニーの数はＨＣＶ−ＲＮＡμｇ
あたり約１０００００ｃｆｕであった。これに対してイ
ンビトロ転写された同量のＨＣＶ−ＲＮＡを用いてわず
か３０〜５０コロニーが得られたのみであった。この結
果は、細胞コロニーから単離されたＨＣＶ−ＲＮＡの特
異的な感染力が、類似のインビトロ転写の感染力よりも
約１０００〜１００００倍高いことを証明している。方
法論的プロセスは図９に記載されている。
【０１０８】「長距離ＲＴ−ＰＣＲ(long-distance RT-
PCR)」を用いて、９−１３細胞の全ＲＮＡからのＨＣＶ
−ＲＮＡを増幅し、ＰＣＲ−増幅物をクローニングし、
かつ数多くのクローンを配列決定した。この再クローニ
ングしたＲＮＡの配列と、本来ナイーヴＨｕｈ−７細胞
に導入されたＲＮＡの配列との比較は、再クローニング
したＲＮＡが全ＨＣＶ−配列にわたって分布している数
多くのアミノ酸交換を占有していることを明らかにした
（図１０）。この再クローニングした突然変異体のＳｆ
ｉＩ−断片を、本来のレプリコン構築物の類似のＳｆｉ
Ｉ−断片との交換でこの中に導入し、かつそれぞれの突
然変異体のＲＮＡをナイーヴＨｕｈ−７細胞に導入し
た。次いでＧ４１８を用いた選択後に、それぞれのＨＣ
Ｖ−ＲＮＡ−突然変異体に関して形成されたコロニーの
数を測定した。出発ＲＮＡではＲＮＡμｇあたりわずか
３０〜５０のコロニーが得られたのみであったが、再ク
ローニングした変異体の２つの場合にはコロニー数が明
らかにより高かった（図１０）。ＨＣＶ−ＲＮＡ−構築
物９−１３Ｉおよび９−１３Ｃの場合、特異的感染力は
ＲＮＡμｇあたり１００〜１０００ｃｆｕであり、かつ
９−１３Ｆレプリコンの場合、それどころかＲＮＡμｇ
あたり１０００〜１００００であった。この結果は、突
然変異体９−１３Ｉ、９−１３Ｃおよび特に９−１３Ｆ
が複製能力の明らかな上昇につながることを示してい
る。これに対してすべてのその他のＨＣＶ−ＲＮＡ−構
築物（９−１３Ａ、Ｂ、Ｇ、ＨおよびＫ）は、もはや複
製能力がなく、従って致命的な突然変異を有していた。
【０１０９】９−１３Ｆ−構築物中のアミノ酸交換のい
ずれが複製の増加につながるかという問いへの回答のた
めに、交換を単独で、または組み合わせて出発−ＨＣＶ
−ＲＮＡ−構築物に導入し、かつ相応するＲＮＡをナイ
ーヴＨｕｈ−７細胞に導入する。これらのＲＮＡを用い
たトランスフェクションの結果は、第１表にまとめられ
ている。ここから本実施例では高い複製能力が複数の突
然変異により制限されていることが明らかである。ＨＣ
Ｖ−ＲＮＡ−断片ＮＳ５ＡおよびＮＳ４Ｂ中のアミノ酸
交換が大いに貢献している。ＮＳ３−領域における個々
の交換もまた、おそらくこの個別交換の相助作用に基づ
いて貢献している。この調査は、ｎｅｏ−ＨＣＶ−ＲＮ
Ａ−構築物でトランスフェクションされた細胞のＧ４１
８−選択により、明らかにより高い複製能力を有するＨ
ＣＶ−ＲＮＡを富化した。ここに記載された試験バッチ
を用いて極めて異なった複製効率を有するＨＣＶ−ＲＮ
Ａ−構築物を選択することができる。その中／上でＨＣ
Ｖ−ＲＮＡ−構築物含有細胞が選択のために培養される
選択媒体中の抗生物質濃度が高いほど、細胞が成長する
ことができるためには適応突然変異の程度、ひいては該
当するＨＣＶ−ＲＮＡ−構築物中での複製効率は高くな
くてはならない。低い抗生物質濃度での選択を実施する
と、よりわずかな適合突然変異およびよりわずかな高い
複製効率を有する細胞もまた生き残り、かつ増殖するこ
とができる。
【０１１０】複数の適合突然変異を有する従来記載され
ていたＨＣＶ−ＲＮＡ−構築物９−１３Ｆは、疑う余地
なく親ＨＣＶ−ＲＮＡより高い複製効率を有していた。
さらに高い複製を有するＨＣＶ−ＲＮＡを細胞培養中で
得るために、選択された細胞クローンの全ＲＮＡ中に含
有されていたＨＣＶ−ＲＮＡを数回、ナイーヴＨｕｈ−
７細胞中で継代した。この選択された細胞クローンは、
５−１５と呼ばれ、ＨＣＶ−ＲＮＡ−構築物Ｉ389／Ｎ
Ｓ３−３′を用いたトランスフェクションにより得られ
る（図１）。これは十分に、２２のヌクレオチドの分だ
け短いＨＣＶ−ＩＲＥＳを有するＨＣＶ−ＲＮＡ−構築
物を用いたトランスフェクションにより製造された細胞
クローン９−１３に相当する（Ｉ377／ＮＳ３−３′、
図１）。細胞クローン５−１５から単離された全ＲＮＡ
１０μｇを、エレクトロポレーションを用いてナイーヴ
ＨｕＨ−７細胞に導入し、かつＧ４１８ １ｍｇ／ｍｌ
を用いて細胞を選択した。このようにして得られた細胞
クローンから、再度、全ＲＮＡを単離し、ナイーヴＨｕ
ｈ−Ｎ７細胞中にトランスフェクションし、かつ同様に
して選択した。この工程を合計して４回繰り返した。４
回目の継代の後で、細胞クローンから全ＲＮＡを単離
し、かつ「長距離ＲＴ−ＰＣＲ」を用いてｎｅｏ−ＨＣ
Ｖ−ＲＮＡを増幅した。増幅したＤＮＡ−断片を制限酵
素ＳｆｉＩで消化し、かつＳｆｉＩ制限された出発構築
物Ｉ389／ＮＳ３−３′に挿入した。合計して１００を
越えるＤＮＡ−クローンが得られ、かつまず制限消化を
用いて分析した。インビトロで転写した約８０のこれら
のクローンのＲＮＡをその都度ナイーヴＨｕｈ−７に導
入し、かつＧ４１８ ５００ｍｇ／ｍｌを用いて選択し
た。調査した８０のｎｅｏ−ＨＣＶ−ＲＮＡ−変異体か
ら、大部分が複製欠陥であることが判明した。しかし
５．１および１９と呼ばれる２つの突然変異体の場合、
ＲＮＡマイクログラムあたりの「コロニー形成単位」と
呼ばれる特異的な感染力は、極めて明らかに増大した
（第２表）。細胞培養中でのＲＮＡの複数回の継代によ
り、明らかに、その複製効率が、複数のサイズオーダー
の突然変異（いわゆる「適合突然変異」）に基づいて本
来患者からクローンしたＲＮＡのものよりも高いＨＣＶ
−ＲＮＡを製造することができる。
【０１１１】（Ｂ）改変方法。
【０１１２】（Ａ）により製造し、かつ同定された適合
突然変異を、わずかに複製能力のあるＨＣＶ−ＲＮＡ−
構築物中に移すことができ、かつこの構築物の複製の著
しい向上につながる。この向上は極めて高いので、これ
により明白に、選択可能なマーカー遺伝子をもはや有し
ていないＨＣＶ−ＲＮＡを細胞培養中で複製することが
できる。図１２は、ＨＣＶ−ＲＮＡの複製効率の比較を
示しており、これは出発配列または適応配列９−１３Ｆ
もしくは５．１に相応していた。容易な測定のために、
ｎｅｏ−遺伝子を除去し、かつルシフェラーゼのための
遺伝子により交換した。ネガティブコントロールとし
て、再び、ＮＳ５Ｂ ＲＮＡ−ポリメラーゼの不活性化
突然変異に基づいて複製欠陥のあるＨＣＶ−ＲＮＡ−構
築物を使用した。トランスフェクションの２４時間後に
すでに、欠損ＲＮＡと９−１３Ｆもしくは５．１−構築
物の間のルシフェラーゼ活性における明らかな違いが認
識される一方で、欠損ＲＮＡ（３１８ＤＮ）と、適合突
然変異を有してない出発−ＲＮＡ−構築物（ｗｔ）との
間にはほとんど違いを見ることはできない。全観察時間
の間、最も高いルシフェラーゼ活性ひいては最も高い
５．１−ＲＮＡを有する複製が得られた。この調査は、
このＲＮＡの高い複製効率を証明するのみではなく、適
応ＨＣＶ−ＲＮＡ−構築物を用いて、そのために選択可
能な遺伝子の存在がもはや必要ではない細胞培養系を構
築することが可能であることもまた示している。出発構
築物と、突然変異体９−１３Ｆ、５．１および１９の間
のヌクレオチド−およびアミノ酸の違いの包括的な概要
は、第３表に示されている。
【０１１３】例８：細胞培養に適合したＨＣＶ−ＲＮＡ
−全長ゲノムの製造 例１〜７では常に、ｐ７もしくはＮＳ２までを含むコア
の全構造タンパク質領域が欠けているサブゲノムのＨＣ
Ｖ−ＲＮＡを使用した。この例８では、適合したＮＳ３
−５Ｂ−配列を用いて細胞培養中のＨＣＶ−全長ゲノム
を複製することが可能であることを示している。この目
的のために、まず例７に従って製造され、高度に適合し
たＨＣＶ−ＲＮＡ５．１のＳｆｉＩ−断片を、選択可能
なＨＣＶ−全長ゲノムにトランスフェクションした（図
１２）。このＨＣＶ−ゲノムをナイーヴＨｕｈ−７細胞
にトランスフェクションし、かつ異なったＧ４１８−濃
度で選択した。（Ｇ４１８濃度の）選択強度に依存し
て、異なった大きさの細胞クローンの数が得られた（図
１２Ｂ）。これと比較して、適合突然変異を受けなかっ
た未変化のＨＣＶ−全長ゲノムではクローンは得られ
ず、またＮＳ５Ｂ ＲＮＡ−ポリメラーゼにおける不活
性化突然変異に基づいて複製欠陥のあるネガティブコン
トロールでも同様であった。生じた細胞クローンが実際
に自律的に複製するＨＣＶ−全長構築物を有しているこ
とに対する証明のために、全ＲＮＡを複数の細胞クロー
ンから単離し、かつノーザンブロットを用いて分析し
た。すべての細胞クローンにおいてＨＣＶ−全長ＲＮＡ
は明確に検出可能であった（図１２）。これにより細胞
培養に適合したＨＣＶ−配列を用いて、高い効率で、お
よび自律的に細胞系で複製するＨＣＶ−全長ゲノムを製
造することができる、つまり本発明による系を用いて適
合したＨＣＶ−全長ゲノムを製造することが可能である
ことが明確に証明される。さらにこのクローンは、完全
なＨＣＶ−配列、つまりウイルス粒子の形成のために必
要な構造タンパク質もまた有しているので、この系を用
いて大量の感染ウイルス粒子を細胞培養中で製造するこ
とが可能である。これらのウイルスの検出のために、細
胞不含で、複製ＨＣＶ−全長ゲノムを有する細胞の上清
をナイーヴＨｕｈ−７細胞に添加し、かつこうして感染
させた細胞をＧ４１８で選択する。前記の条件下で成長
するそれぞれの細胞クローンは、感染した細胞に起因す
る。しかし複製するＨＣＶ−全長ゲノムを有する細胞の
細胞培養上清中のウイルスは、従来技術で公知の種々の
方法、例えば超遠心分離またはマイクロ透析(Mikrodial
yse)で富化し、かつ生成し、かつ次いでナイーヴ細胞の
感染のために使用することができる。この方法で、本発
明によるＨＣＶ−細胞培養系を用いて、細胞中で高い効
率で複製し、かつ感染性のウイルスを産出する細胞培養
に適合したＨＣＶ−全長ゲノムを製造することができる
ことが明確に示されている。これらは同様に試験動物、
有利にはチンパンジーの感染により検出することができ
る。
【０１１４】例９：リポーター遺伝子を有するＨＣＶ−
全長−構築物およびＨＣＶ−サブゲノム−構築物の製造 ＨＣＶ−ＲＮＡ−構築物を製造したが、その際、抗生物
質耐性遺伝子の代わりにリポーター遺伝子を挿入する
（図１３）。その際、リポーター遺伝子もしくはリポー
ター遺伝子産物の量もしくは活性に基づいて複製を決定
することができる。リポーター遺伝子は、有利にはルシ
フェラーゼ遺伝子の群、ＣＡＴ−遺伝子（クロラムフェ
ニコール−アセチル−トランスフェラーゼ−遺伝子）、
ｌａｃＺ−遺伝子（β−ガラクトシダーゼ遺伝子）、Ｇ
ＦＰ−遺伝子（緑色蛍光タンパク質(green fluorescenc
e protein)遺伝子）、ＧＵＳ−遺伝子（グルクロニダー
ゼ遺伝子）またはＳＥＡＰ−遺伝子（分泌された(sezer
nierte)アルカリ性ホスファターゼ遺伝子）からの遺伝
子である。これらのリポーター遺伝子もしくはこれらの
産物、つまり相応するリポータータンパク質を、例えば
蛍光法、化学発光法、比色法により、または免疫学的方
法（例えば固相酵素免疫測定法、ＥＬＩＳＡ）を用いて
測定することができる。リポーター遺伝子は、固有のＩ
ＲＥＳにより発現させるか、またはそのままで活性であ
るか、もしくはタンパク質分解により分解可能なアミノ
酸配列によりＨＣＶ−タンパク質と結合している融合タ
ンパク質の形で発現させることができるので、これは細
胞性またはウイルス性（ＨＣＶ）プロテアーゼによりタ
ンパク質から分離される。
【０１１５】例１０：遺伝子治療のための肝細胞特異的
な遺伝子輸送体としてまたは発現ベクターとしての使用
のための導入された外来遺伝子を有するＨＣＶ−全長−
構築物の製造 構築物（図１４）を細胞内に導入し、かつここでその他
の細胞の感染のために使用することができるＨＣＶ−ウ
イルス粒子を形成させる。ウイルス粒子は外来遺伝子を
有するＲＮＡを包んでいてもよいので、この外来遺伝子
によりコードされたタンパク質の産生のためにこのよう
にして感染させた細胞中で外来遺伝子を使用することが
できる。構築物でトランスフェクションされた細胞は、
同様に外来遺伝子を発現する。
【０１１６】例１１：耐性遺伝子産出がＨＣＶ−割合を
有する融合タンパク質として発現する単シストロンのＨ
ＣＶ−ＲＮＡ−構築物の製造 特定の調査にとって、ＨＣＶ−ＲＮＡ−構築物が異種Ｉ
ＲＥＳ−エレメントを有していない場合には有利であ
る。このような調査は例えばインターフェロン耐性の決
定である。ＨＣＶ−ＲＮＡ−構築物を有する細胞をイン
ターフェロン−αまたはインターフェロン−βを用いて
インキュベーションすると、これはＨＣＶ−ＲＮＡの複
製の減少につながる。作用機構の解明のために、ＨＣＶ
−ＲＮＡ−構築物が異種ＩＲＥＳを有していないことが
必要である。というのもさもないとインターフェロン媒
介された抑制がＨＣＶ−複製の抑制により媒介されるの
か、または異種ＩＲＥＳの抑制により媒介されるのか決
定することができないからである。従って、耐性遺伝子
がＨＣＶ−タンパク質と融合する構築物を製造する。
（図１５）。融合タンパク質がそのままで活性である
か、または細胞性またはウイルス性（ＨＣＶ−）プロテ
アーゼによりここから分離するように耐性遺伝子産物が
タンパク質分解により分解可能なアミノ酸配列によりＨ
ＣＶ−タンパク質と結合している。
【０１１７】
【表１】
【０１１８】
【表２】
【０１１９】
【表３】
【０１２０】
【表４】
【０１２１】記載は、出発−ＨＣＶ−ＲＮＡ−配列Ｃｏ
ｎ１（ＥＭＢＬ−遺伝子バンク(Genbank)Ｎｏ．ＡＪ２
３８７９９）および細胞培養に適合したＨＣＶ−ＲＮＡ
の配列との間のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列の
違いである。数はＨＣＶ−単離物Ｃｏｎ１のヌクレオチ
ド位置およびアミノ酸位置に関する。
【０１２２】
【外３】
【０１２３】
【外４】
【０１２４】
【外５】
【０１２５】
【外６】
【０１２６】
【外７】
【０１２７】
【外８】
【０１２８】
【外９】
【０１２９】
【外１０】
【０１３０】
【外１１】
【０１３１】
【外１２】
【０１３２】
【外１３】
【０１３３】
【外１４】
【０１３４】
【外１５】
【０１３５】
【外１６】
【０１３６】
【外１７】
【０１３７】
【外１８】
【０１３８】
【外１９】
【０１３９】
【外２０】
【０１４０】
【外２１】
【０１４１】
【外２２】
【０１４２】
【外２３】
【０１４３】
【外２４】
【０１４４】
【外２５】
【０１４５】
【外２６】
【０１４６】
【外２７】
【０１４７】
【外２８】
【０１４８】
【外２９】
【０１４９】
【外３０】
【０１５０】
【外３１】
【０１５１】
【外３２】
【０１５２】
【外３３】
【０１５３】
【外３４】
【０１５４】
【外３５】
【０１５５】
【外３６】
【図面の簡単な説明】
【図１】Ａは本発明によるＨＣＶ−ＲＮＡ−構築物の構
造を示している。Ｂはトランスフェクションして継代培
養されたＨｕｈ−７細胞クローンにおける複製されたプ
ラス鎖ＲＮＡの検出のための変性ホルムアルデヒド−ア
ガロースゲル電気泳動の結果を示している。Ｃは選択さ
れた大部分の細胞クローンにおいて導入されたレプリコ
ンＤＮＡが存在しないことを証明するための引き続きの
サザンブロットによるＰＣＲ試験の結果を示している。
【図２】ＡはＨＣＶ−ＲＮＡ構築物を有する細胞クロー
ン（９−１３）における導入されたレプリコンＤＮＡ
（プラスミド分子Ｉ377／ＮＳ３−３′／ｗｔ）の高感
度の排除のための引き続きのサザンブロットによるＰＣ
Ｒ試験の結果を示している。ＢはＨＣＶのプラス鎖ＲＮ
Ａおよびマイナス鎖ＲＮＡの定量のためのノーザンブロ
ット試験の結果を示している。ＣはＨＣＶ−ＲＮＡ複製
のダクチノマイシンに対する耐性を証明するための細胞
内で複製されたＨＣＶ−ＲＮＡの放射性標識後のホルム
アルデヒド−アガロースゲル電気泳動の結果を示してい
る。
【図３】Ａは代謝放射性標識後の免疫沈降による選択さ
れた細胞クローンにおけるＨＣＶ特異抗原の検出を示し
ている。ＢはＨＣＶ抗原の細胞内での所在の検出のため
の免疫蛍光試験の結果を示している。
【図４】図４は５′ＨＣＶ−ＩＲＥＳ、ネオマイシンホ
スホトランスフェラーゼ遺伝子（ＮｅｏR）、異種の完
全なＨＣＶ読み枠および確実な３′ＮＴＲからなる、本
発明による選択可能なＨＣＶ−ＲＮＡ構築物（完全なゲ
ノム）の構造の略図である。
【図５】図５はポリタンパク質をコードするヌクレオチ
ド配列内に挿入された抗生物質耐性遺伝子（単シストロ
ン性ＲＮＡ）（Ａ）および３′ＮＴＲ内に挿入された抗
生物質耐性遺伝子（２シストロン性ＲＮＡ）（Ｂ）を有
するＨＣＶ−ＲＮＡ構築物の構造の略図である。
【図６】図６はＮＳ３からＮＳ５ＢまでのＨＣＶレプリ
コンの一部として挿入されたリポーター遺伝子を有する
ＨＣＶ−ＲＮＡ構築物の構造（Ａ）、耐性遺伝子および
リポーター遺伝子からなる融合遺伝子の一部として挿入
されたリポーター遺伝子を有するＨＣＶ−ＲＮＡ構築物
の構造（Ｂ）、耐性遺伝子およびリポーター遺伝子から
なるレプリコンの一部として挿入されたリポーター遺伝
子を有するＨＣＶ−ＲＮＡ構築物の構造（Ｃ）、自体の
内部のリボソーム結合部位（ＩＲＥＳ）から発現される
独立の遺伝子として挿入されたリポーター遺伝子を有す
るＨＣＶ−ＲＮＡ構築物の構造（Ｄ）の略図である
【図７】図７は耐性遺伝子がリボザイムもしくはリボザ
イムのための認識部位を介してＨＣＶ−ＲＮＡ配列と結
合しているＨＣＶ−ＲＮＡ構築物の構造の略図である。
【図８】図８は耐性遺伝子および導入された外来遺伝子
を有するＨＣＶ−ＲＮＡ構築物の構造の略図である。
【図９】図９は全ＲＮＡとインビトロ転写物との比感染
力の比較のための方法プロセスを示している。。
【図１０】図１０は９−１３クローンの配列分析を示し
ている。
【図１１】Ａはリポーター遺伝子の使用による複製アッ
セイの原理を示している。Ｂは親ＨＣＶ−ＲＮＡ構築物
Ｉ389／Ｌｕｃ／ＮＳ３−３′／ｗｔ（ｗｔ）または以
下の変異体：不活性ＲＮＡ（３１８ＤＮ）、変異体９−
１３Ｆもしくは変異体５．１でトランスフェクションし
た細胞におけるルシフェラーゼ活性の比較を示してい
る。
【図１２】図１２は選択可能なＨＣＶ全長ゲノム（構築
物Ｉ389／ｃｏｒｅ−３′／５．１およびＩ389／ｃｏｒ
ｅ−３′／９−１３Ｆ）を示しており、Ａは全長構築物
の略図であり、ＢはＡに示される構築物Ｉ389／ｃｏｒ
ｅ−３′／５．１のインビトロ転写されたＲＮＡ各０．
１μｇでＨＵＨ７細胞にトランスフェクションした後に
得られるコロニーの数を示しており、Ｃは相応のインビ
トロ転写物のトランスフェクション後に得られるＧ４１
８耐性細胞クローンにおける自律的に複製されるＨＣＶ
−全長ＲＮＡの検出を示している。
【図１３】図１３は１つのリポーター遺伝子を有するＨ
ＣＶ−ＲＮＡ構築物を示しており、Ａは２シストロン性
ＨＣＶ−ＲＮＡ構築物を示し、Ｂは単シストロン性ＨＣ
Ｖ−ＲＮＡ構築物を示している。
【図１４】図１４は耐性遺伝子に付加的に、挿入された
外来遺伝子を有している３シストロン性のＨＣＶ−全長
ＲＮＡ構築物を示している。
【図１５】図１５は耐性遺伝子がＨＣＶ成分を有する融
合タンパク質として発現する単シストロン性ＨＣＶ−Ｒ
ＮＡ構築物を示している。
フロントページの続き Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA33 CA04 CA11 DA02 EA04 GA12 HA01 4B065 AA90X AA96Y AB01 BA03 CA24 CA44 CA45 (54)【発明の名称】 Ｃ型肝炎ウイルス細胞培養系、Ｃ型肝炎ウイルス−ＲＮＡ−構築物、細胞培養系または構築物の 使用、Ｃ型肝炎ウイルス−ＲＮＡ−構築物の細胞培養に適合した突然変異体を獲得する方法、Ｃ 型肝炎ウイルス−全長ゲノム、Ｃ型肝炎ウイルス−部分ゲノム、または任意のＣ型肝炎ウイルス −構築物の突然変異体の製法、細胞培養に適合したＣ型肝炎ウイルス−構築物、その突然変異 体、Ｃ型肝炎ウイルス−全長ゲノムの突然変異体、Ｃ型肝炎ウイルス粒子またはウイルス様粒 子、およびこれで感染した細胞

Claims (19)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 導入されたＨＣＶ−特異的遺伝子材料を
    含有する、主に真核細胞を包含するＣ型肝炎ウイルス
    （ＨＣＶ）細胞培養系において、真核細胞がヒト肝癌細
    胞であり、かつ導入されたＨＣＶ−特異的遺伝子材料が
    ＨＣＶ−特異的ＲＮＡ−断片５′ＮＴＲ，ＮＳ３，ＮＳ
    ４Ａ，ＮＳ４Ｂ，ＮＳ５Ａ，ＮＳ５Ｂ及び３′ＮＴＲお
    よび付加的に選択可能なマーカー遺伝子（選択遺伝子）
    を包含するＨＣＶ−ＲＮＡ−構築物であることを特徴と
    するＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）細胞培養系。
  2. 【請求項２】 ＨＣＶ−特異的ＲＮＡ−断片５′ＮＴ
    Ｒ，ＮＳ３，ＮＳ４Ａ，ＮＳ４Ｂ，ＮＳ５Ａ，ＮＳ５Ｂ
    及び３′ＮＴＲおよび付加的に選択可能なマーカー遺伝
    子（選択遺伝子）を包含することを特徴とするＨＣＶ−
    ＲＮＡ−構築物。
  3. 【請求項３】 配列表の配列番号１から配列番号１１ま
    でのいずれか１つに記載されたヌクレオチド配列を包含
    する請求項２記載のＨＣＶ−ＲＮＡ−構築物。
  4. 【請求項４】 ３′ＮＴＲが以下に記載するヌクレオチ
    ド配列（ａ）〜（ｉ）： 【外１】 の群から選択されるヌクレオチド配列を有する請求項２
    記載のＨＣＶ−ＲＮＡ−構築物。
  5. 【請求項５】 ＨＣＶ−ＲＮＡ−構築物が請求項２から
    ４までの少なくともいずれか１項記載の構築物である請
    求項１記載の細胞培養系。
  6. 【請求項６】 ＨＣＶ−ＲＮＡ−構築物を含有する細胞
    がドイツ微生物保存機関（ＤＳＭＺ：ブラウンシュバイ
    ク、ＢＲＤ在）に寄託番号ＤＳＭ ＡＣＣ２３９４（研
    究所記号 HuBl ９−１３）として寄託されている請求項
    １記載の細胞培養系。
  7. 【請求項７】 特にＨＣＶ−感染の治療のための治療剤
    および／または診断剤の製造および／または評価および
    ／またはテストのための、請求項１または請求項５から
    ６までのいずれか１項記載の細胞培養系および／または
    請求項２から４までのいずれか１項記載のＨＣＶ−ＲＮ
    Ａ−構築物の使用。
  8. 【請求項８】 ＨＣＶ−感染に対するワクチンの製造の
    ための、請求項１または請求項５から６までのいずれか
    １項記載の細胞培養系および／または請求項２から４ま
    でのいずれか１項記載のＨＣＶ−ＲＮＡ−構築物の使
    用。
  9. 【請求項９】 遺伝子治療のための肝細胞特異的輸送体
    の製造のための、請求項２から４までのいずれか１項記
    載のＨＣＶ−ＲＮＡ−構築物の使用。
  10. 【請求項１０】 組み込まれた外来遺伝子を有し、この
    外来遺伝子の発現に好適である標的細胞中にこの外来遺
    伝子を導入するために好適である、請求項２から４まで
    のいずれか１項記載のＨＣＶ−ＲＮＡ−構築物。
  11. 【請求項１１】 請求項２から４までのいずれか１項記
    載のＨＣＶ−ＲＮＡ−構築物の細胞培養に適合した突然
    変異体であって、ＨＣＶ−ＲＮＡ−構築物に比べて高め
    られた複製効率を有する突然変異体、を獲得する方法に
    おいて、導入されたＨＣＶ−特異的遺伝子材料が請求項
    ２から４までのいずれか１項記載の選択遺伝子を有する
    ＨＣＶ−ＲＮＡ−構築物である請求項１記載の細胞培養
    系を、選択遺伝子に応じた選択培地上／中で培養し、成
    長した細胞クローンを収穫し、この細胞クローンからＨ
    ＣＶ−ＲＮＡ−構築物またはその部分を単離することを
    特徴とする、前記ＨＣＶ−ＲＮＡ−構築物の細胞培養に
    適合した突然変異体を獲得する方法。
  12. 【請求項１２】 単離されたＨＣＶ−ＲＮＡ−構築物を
    新たに少なくとも１回継代し、すなわち単離されたＨＣ
    Ｖ−ＲＮＡ−構築物を請求項１記載の細胞培養系の細胞
    に導入し、導入されたＨＣＶ−特異的遺伝子材料が選択
    遺伝子を有する単離されたＨＣＶ−ＲＮＡ−構築物であ
    る請求項１に記載のその際得られた細胞培養系を選択遺
    伝子に応じた選択培地上／中で培養し、成長した細胞ク
    ローンを収穫し、この細胞クローンからＨＣＶ−ＲＮＡ
    −構築物を単離する、請求項１１記載の方法。
  13. 【請求項１３】 オリジナルのＨＣＶ−全長ゲノム又は
    ＨＣＶ−部分ゲノム又はＨＣＶ−ＲＮＡ−構築物と比較
    して高められた複製効率を有するＨＣＶ−全長ゲノム又
    はＨＣＶ−部分ゲノム又は任意のＨＣＶ−構築物の突然
    変異体を製造する方法において、請求項１１または請求
    項１２に記載の方法を用いてＨＣＶ−ＲＮＡ−構築物の
    細胞培養に適合した突然変異体を製造し、これを単離
    し、これらの突然変異体のヌクレオチド配列およびアミ
    ノ酸配列を決定し、オリジナルのＨＣＶ−ＲＮＡ−構築
    物のヌクレオチド配列及びアミノ酸配列と比較して、核
    酸突然変異およびアミノ酸突然変異の種類、数、及び位
    置を決定し、かつこの突然変異を意図的な突然変異誘発
    により、または該当する突然変異を有する配列断片の置
    換により、（単離された）ＨＣＶ−全長ゲノムまたはＨ
    ＣＶ−部分ゲノムまたは任意のＨＣＶ−ＲＮＡ−構築物
    中へ導入する、ことを特徴とする、前記突然変異体の製
    法。
  14. 【請求項１４】 高められた複製効率を有する細胞培養
    に適合したＨＣＶ−ＲＮＡ−構築物において、ヌクレオ
    チド突然変異及び／又はアミノ酸突然変異により請求項
    ２から４までのいずれか１項記載のＨＣＶ−ＲＮＡ−構
    築物から誘導可能であり、かつ請求項１１から１３まで
    のいずれか１項記載の方法により得ることができること
    を特徴とする、高められた複製効率を有する細胞培養に
    適合したＨＣＶ−ＲＮＡ−構築物。
  15. 【請求項１５】 次に記載するアミノ酸置換、すなわ
    ち：１２８３ ａｒｇ −＞ ｇｌｙおよび／または１
    ３８３ ｇｌｕ −＞ ａｌａおよび／または１５７７
    ｌｙｓ −＞ ａｒｇおよび／または１６０９ ｌｙ
    ｓ −＞ ｇｌｕおよび／または１９３６ ｐｒｏ −
    ＞ ｓｅｒおよび／または２１６３ ｇｌｕ −＞ ｇ
    ｌｙおよび／または２３３０ ｌｙｓ −＞ｇｌｕおよ
    び／または２４４２ ｉｌｅ −＞ｖａｌを１個または
    それ以上有する、請求項１４記載の細胞培養に適合した
    ＨＣＶ−ＲＮＡ−構築物。
  16. 【請求項１６】 表３に記載されたヌクレオチド置換お
    よび／またはアミノ酸置換の１つまたはそれ以上を有
    し、この際表３は該請求項に包含される、請求項１４ま
    たは１５記載の細胞培養に適合したＨＣＶ−ＲＮＡ−構
    築物。
  17. 【請求項１７】 オリジナルのＨＣＶ−ＲＮＡ−構築物
    またはオリジナルのＨＣＶ−全長ゲノムと比較して高め
    られた複製効率を有するＨＣＶ−ＲＮＡ−構築物または
    ＨＣＶ−全長ゲノムの細胞培養に適合した突然変異体に
    おいて、請求項１３記載の細胞培養に適合したＨＣＶ−
    ＲＮＡ−構築物中で配列分析および配列比較により、こ
    れらの突然変異の種類および数を決定し、かつこれらの
    突然変異を意図的な突然変異誘発により、または該当す
    る突然変異を有する配列断片の置換により、ＨＣＶ−Ｒ
    ＮＡ−構築物中に、特に請求項２から４までのいずれか
    １項記載のＨＣＶ−ＲＮＡ−構築物中に、または（単離
    された）ＨＣＶ−ＲＮＡ−全長ゲノム中に導入すること
    を特徴とする、ＨＣＶ−ＲＮＡ−構築物またはＨＣＶ−
    全長ゲノムの細胞培養に適合した突然変異体。
  18. 【請求項１８】 請求項１１から１３までのいずれか１
    項記載の方法で得られることを特徴とする、Ｃ型肝炎ウ
    イルス粒子またはウイルス様粒子。
  19. 【請求項１９】 請求項１８記載のＣ型肝炎ウイルス粒
    子またはウイルス様粒子に感染した細胞。
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