CN1093172C - 丙型肝炎全病毒及其体外细胞培养方法 - Google Patents

Abstract

本发明是运用分子生物学和基因重组技术建立一种可培养出完整的HCV增殖病毒的丙型肝炎全病毒体外培养系统。它是从丙型肝炎患者血清中扩增包括3′PolyA后边98个核苷酸的全长基因组；对HCV基因组中的NS5A和NS5B进行人工定点突变；在突变后的HCV基因组中的NS5B 3′末端插入标志基因IRES-GFP表达盒；转染敏感细胞，经培养获得有感染活性的HCV子代病毒。

Description

丙型肝炎全病毒及其体外细胞培养方法

技术领域

本发明涉及运用分子生物学和基因重组技术，构建完整的、经过适宜突变的丙型肝炎病毒(HCV)基因组，经转染敏感细胞，建立丙型肝炎全病毒体外培养系统。

背景技术

人类丙型肝炎是由丙型肝炎病毒(以下称HCV)引起的传染性疾病。HCV感染易感者后，不仅可引起急性感染，而且更易形成慢性感染，导致肝维化、肝硬化，甚至肝癌的发生，严重危害人类健康。更为重要的是由于目前缺乏有效的防治措施，HCV感染仍在世界流行。据不完全统计，全世界约1亿7千万人感染HCV，而且每年还增加数百万感染者。我国也有近2.5％人口(约3千万)受到感染，属HCV感染的高发区，是我国重点防治的人类疾病，也是研究的热点。

HCV、乙肝病毒(HBV)和艾滋病毒(HIV)并列为三个最危险的血液传播病毒。1978年人们就认识到在甲型、乙型肝炎病毒以外，存在一种新的致肝炎病原因子，但用常规方法不能分离培养成功，也未能鉴定出新病原的存在。直到1989年Choo等运用分子生物学技术克隆到该病原的cDNA，依据其基因组结构和核酸序列，将其划归黄病毒科，定名丙型肝炎病毒。丙型肝炎病毒的发现，是现代分子生物学技术在病原体研究中的巨大成功，但HCV是第一个没有经人工分离培养而又没有看到病毒颗粒条件下被确认的人类病毒。当前，人们能直接得到并用于分析和研究的只有HCV基因组，其分子生物学和HCV其他许多特性均基于HCV基因组分析和推测出来。

HCV的基因组是一单股正链RNA分子，全长约9400多个核苷酸，只有一个读码框架，可编码3000多个氨基酸的前体多肽，在基因组5′和3′端各有一段非编码序列(UTR或NTR)，由于HCV基因组易变异，依据基因序列HCV可分为6个基因型别和至少30个基因亚型。HCV基因组编码的前体功能蛋白在确点位点酶解后，形成近10种功能性多肽，分别为C、E1、E2/NS1、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B等。5′UTR区与病毒的复制、转录和调控有关，其序列高度保守。3′UTR区与病毒的复制和装配关系密切，但值得提出的是，目前在GenBank中的HCV基因组序列中3′未端一般在polyA为止，研究者在构建HCV基因组cDNA时，都没有考虑到后边的98个保守的核苷酸序列。本申请人认为，这是以往不能成功培养出HCV全病毒的原因之一。

HCV在感染者体内的肝脏中寄生，患者血中病毒含量低，病毒抗原量很少，并且至今没能建立起HCV病毒体外培养系统，未能得到完整的HCV全病毒，而使得对HCV生物学特性、免疫学特性、致病性、诊断与防治研究进展缓慢，成为制约HCV研究的瓶颈，也是国内外学者研究的热点和重要课题。

据本申请人所知，以往建立HCV体外培养系统，首先是选择敏感的传代细胞株或用原代肝细胞作为分离HCV的细胞，然后用含有高滴度HCV的病人血清直接分离培养，或者用克隆的HCV基因组去转染细胞获得增殖的HCV。但遗憾的是这些方法均未获得成功，没有得到增殖性的HCV。虽然有少量报道(Dash et at 1997，Am JPathology 151：363；Yoo et at 1995，J Yirol 69：32)用HCV的基因组转染人肝癌细胞株Huh-7或Hep G2后，可以检测到HCV的复制(用套式PCR检测核酸)，但均不能证实细胞中有感染性的病毒颗粒产生，也不能保证HCV在被转染细胞中长时间的存在和高水平的表达。所以，至今还未有建立稳定而有效的传代细胞HCV体外培养系统和实验模型的文献报道，也没有体外培养HCV完整病毒进行科学研究的报告和相关系统产品的出售。

发明内容

本发明的目的是提供一种能在体外增殖、并且有感染活性的丙型肝炎病毒，以及提供一种可培养出完整的HCV增殖病毒的丙型肝炎全病毒体外细胞培养方法，为深入研究HCV生物学、免疫学特性及致病性提供必不可少的病原材料，为丙型肝炎的诊断、药物筛选与评价和疫苗的研究提供有效的体外实验模型。

本发明所提供的丙型肝炎全病毒HVC DY株，已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通维生物中心保藏，保藏号0588。HCV DY株能在体外细胞培养，培养上清中未经浓缩的病毒滴度达10⁶-10⁷基因组拷贝/ml，病毒在-80℃冰箱保存6-8个月生物活性不变，仍能感染人肝癌细胞(Huh-7)株，在体外可连续传代到5代以上。

本发明所提供的丙型肝炎全病毒体外细胞培养方法包括：

1)从丙型肝炎患者血清中扩增包括HCV基因组3′PolyA后边98个核苷酸的全长基因组；

2)对HCV基因组中的NS5A和NS5B进行人工定点突变，把NS5A区的1979位的丝氨酸突变为异亮氨酸，把NS5B区的2884位的精氨酸突变为甘氨酸；

3)在突变后的HCV基因组中的NS5B 3′末端插入标志基因IRBS-GFP表达盒；

4)用带有定点突变、具有全长HCV基因组转染敏感细胞、体外培养获得HCV具有感染活性的子代病毒。

首先从临床确诊为丙型肝炎患者抽取血清标本，运用超速离心技术浓缩从病人血清中提取的HCV病毒，然后将病毒浓缩并重悬在小体积的不含PBS的DEME中，用标准RNA提取方法或者商售试剂盒从浓缩病毒颗粒中提取RNA，空气干燥RNA沉淀，然后用无RNA酶水溶解沉淀。依据HCV序列设计PCR引物，从患者血中扩增出HCV全长的基因组序列。由于HCV基因组长达9.6千碱基对，一次扩增难以完成，因而我们设计了多对PCR引物(如图1所示)。采用RT-PCR获得基因组的cDNA，把覆盖完整基因组全长的多个扩增片段，用限制性内切酶位点拼接在一起，成为HCV基因组全长cDNA，然后将HCV全长cDNA克隆到高效转录的pSP72表达载体质粒DNA中，使之位于高效转录启动子控制下，使其容易在体外转录出全长HCV基因组RNA。特别指出的是，本发明为了保证HCV基因组高效转录，我们特别保证3′末端polyA后边的98个核苷酸的扩增，使之在体外高效转录出HCV的RNA。

本发明为了保证HCV能在体外培养系统中有效地复制、转录和蛋白合成，我们运用人工定点突变技术，在基因组的NS5A和NS5B中造成特异突变，特异突变的氨基酸位点是NS5A区的1979位的丝氨酸和NS5B区的2884位的精氨酸。设计的突变方法如图2所示。体外扩增重组质粒DNA，用核酸限制性内切酶消化法，把HCV基因组中的NS5A和NS5B基因切下并克隆到小的克隆载体pUC19中，接着再用Quickchang TM XL定向突变试剂盒(stratagene)使NS5A或NS5B编码序列产生定向特异点突变，最后利用同源重组技术把突变序列重组到HCV全长的基因组中。

本发明为了有效筛选和鉴定HCV在细胞中复制、增殖，设计并构建了一个可选择的HCV基因组，即构楚的HCV基因组不但含有人工适宜突变的基因，而且加入了一个选择标志基因。在NS5B编码区3′末端加入绿色荧光蛋白基因(GFP)和一个内部核糖体进入位点(IRES)融合序列，通过筛选GFP阳性细胞来初步鉴定HCV的复制。

通过上述方法构建了一个含有HCV全长基因组、并有适宜点突变的和带有选择标志基因的重组高效表达质粒，用酚/氯仿抽提、乙醇沉淀法提取高效表达质粒DNA。用市售体外高效转录试剂盒(Ambion公司MEGAscript^TM试剂盒，订购号№：1334)转录出HCV基因组RNA。通过实验筛选出支持HCV复制最好的细胞系肝癌细胞株Huh-7，培养细胞接近长成单层。用基因枪将HCV RNA转入到Huh-7细胞中，培养细胞并检查培养液中HCV病毒滴度达10⁶-10⁷基因拷贝/ml时，收获病毒，低温保存。

检测HCV在体外培养系统中增殖，用以下方法确证：①设计HCV PCR引物，检测培养液中的HCV基因组，包括基因组正链和负链RNA；②用HCV RNA探针细胞原位杂交法证实感染细胞中含有HCV基因组RNA；③用免疫荧光检测培养细胞中的HCV蛋白多肽；④测定子代病毒的滴度和感染性。

经过检测，证实了本发明构建的HCV基因组可在培养系统中复制和增殖。培养上清中的HCV的浓度可达1.9×10⁶基因拷贝/ml(参见图4)，并在-80℃中保存8个月其滴度不降低。该HCV病毒株命名为DY株(岱鹰株)，已送交中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号：0588。

本发明的HCV全病毒培养系统可进行HCV的生物学特性和免疫学特性的研究；进行抗HCV药物筛选和鉴定；用于HCV基因治疗的体外模型。该培养系统所产生的病毒可作为抗原进行HCV感染诊断；可制备多克隆或单克隆抗体；可进行疫苗制备及疫苗检测。

本发明为丙肝病毒(HCV)的体外分离培养开辟了新途径，首次建立了HCV体外细胞培养系统，成功地培养出了HCV全病毒，培养液中HCV滴度达10⁷基因拷贝/ml水平，病毒在-80℃下保存8个月仍具活性，为HCV的基础理论研究、药物开发、疫苗研制提供全病毒资源，为人类控制HCV感染打下了良好基础。

附图说明

图1是HCV基因组和多对PCR引物设计示意图。

图2是人工诱发HCV基因组特定基因产生适宜突变示意图。

图3是建立HCV全病毒体外培养系统技术路线示意图。

图4是定量RT-PCR检测培养上清HCV滴度的电泳图。图中M表示核酸分子量标志，数字0-9表示阳性对照物不同浓度(10⁰-10⁹基因拷贝/ml)，N为阴性对照，S为培养上清，箭头表示扩增的目的片段。

图5是用特异性引物检测培养细胞中HCV负链RNA中间体的存在，即RT-PCR结果电泳图。图中M表示分子量标志，S为培养细胞裂解物RNA，N为阴性对照，箭头表示扩增的负链RNA产物。

图6是RT-PCR检测培养上清HCV RNA结果电泳图。图中M表示分子量标志，1为阴性对照，2为培养上清，箭头表示扩增的HCV目的片段。

图7是用HCV探针细胞原位杂交图，表示细胞浆中有大量HCV RND。

图8是免疫荧光技术检测感染细胞中HCV蛋白多肽表达结果照片。其中8-1、8-3为相差显微镜观察照片；8-2、8-4是与8-1、8-3相对应的彩色照片，表示感染细胞浆中有大量绿色荧光蛋白。

具体的实施方式

本实施方式的技术路线如图3所示，其总体过程如前所述，其中：

HCV全长基因组扩增过程，首先依据HCV 1b的保守序列、克隆载体上及HCV基因组特定片段上酶切位点设计8条PCR扩增引物，采用重迭RT-PCR方法，逐步扩增9.6Kb长的全长基因组。人工合成的8条引物，其5′端均带有供克隆连接用的酶切位点，其位置保证将获得HCV基因组的各个片段，能按顺序连接成为完整的HCV全长基因组，特别是包含了3′PolyA后的一段核甘酸序列。

8条引物的序列如下：引物1：

引物2：

引物3：

引物4：

引物5：

引物6：引物7：

引物8：

引物：方向5′→3′，扩增时引物应用1+2；3+4；5+6；7+8

提取丙肝患者血清中总RNA，以此为扩增模板，采用常规RT-PCR技术，运用合成的8条扩增引物，分别进行4次扩增反应：①用引物1和引物2扩增出0.6Kb长的HCV基因组5′端序列片段；②用引物3和引物4扩增6.5Kb长的HCV基因组大片段；③用引物5和引物6扩增出的邻近HCV基因组中3′端的2Kb片段；④用引物7和引物8扩增出HCV基因组3′端的0.4Kb小片段。

分别采用RT-PCR扩增HCV的目的片段(如图1)结合进行逐步克隆、连接到高效转录载体的pSP72中的策略，最终获得了含有全长HCV基因组DNA的克隆。具体过程是：①以EcoRI/KpnI为工具酶，对0.6Kb长的扩增片段酶切，然后将其克隆到pSP72质粒DNA中EcoRI/KpnI位点上，构建了重组质粒pSP72-1。②把第二次扩增的6.5Kb长的HCV基因组大片段，用工具酶KpnI/XbaI把该片段酶解，克隆到pSP72-1的KpnI/XbaI位点上，把6.5Kb片段连于HCV基因组5′端0.6Kb片段之后，构建了重组质粒pSP72-2。③以XbaI/Hind III为工具酶，对第三次扩增的2Kb长HCV基因组片段酶解，将其克隆到pSP72-2上的XbaI/Hind III位点上，连接到HCV基因组0.6-6.5片段之后，构建了重组质粒pSP72-3。④以Hind III为工具酶，消化第4次扩增的HCV基因组3′末端的0.4Kb，将其克隆到pSP72-3的Hind III位点上，正向连接于HCV 2Kb片段之后，构建了重组质粒pSP72-HCV。这样，采用多次重迭RT-PCR扩增，分步克隆方法，获得了HCV全长基因组，并成功地克隆到pSP72质粒DNA的EcoRI和Hind III酶切位点之间。采用核酸限制性内切酶分析、PCR扩增以及序列分析获得一致结果，证明获得了HCV全长基因组。

运用人工定点突变技术对已克隆的HCV基因组的特定序列位点进行人工基因突变，以有利于HCV在培养细胞中的有效生化合成和培养。技术路线如图2所示，具体是选择了HCV基因组的NS5A和NS5B为靶基因进行操作。首先，制备pSP72-HCV的DNA，从所含HCV基因组序列中，分别分离出NS5A和NS5B基因，并分别将其克隆到载体质粒pUC19 DNA中，选用Quickchang^TM XL定向突变试剂盒(Stratagene公司产)使NS5A区的1979位的丝氨酸定向突变为异亮氨酸，使NS5B区的2884位的精氨酸突变为甘氨酸；从而使HCV基因组中NS5A、NS5B基因的编码序列产生了适宜的定向点突变。利用DNA重源同组技术，把突变的HCV序列重组到HCV全长基因组中，从而获得带有特定序列适宜突变的HCV全长基因组。

制备足量纯度高的含有HCV全长基因组高效表达质粒DNA，利用美国Ambion公司MEGAscript^TM体外高效转录试剂盒，获得大量的HCV基因组RNA，用基因枪将HCV基因组RNA转染到人肝癌细胞株Huh-7中，培养转细胞，检查培养上清，有高滴度HCV时收获上清，-80℃保存。也可运用常规方法把高效表达重组质粒DNA转染Huh-7细胞，获得HCV子代病毒。

对应用上述培养方法获得的HCV病毒进行以下系统鉴定：①运用RT-PCR检查培养上清中有HCV的RNA(定性)(参见图6)；②用设计特异引物RT-PCR扩增HCV复制中间体负链RNA的存在，确认HCV在细胞中复制(参见图5)；③用HCV基因组RNA探针对HCV感细胞原位杂交，证实感染细胞中有大量HCV基因组存在(参见图7)；④用标记有荧光素的NS5B抗体，对感染细胞进行免疫荧光检测，感染细胞有特异荧光呈现(参见图8)显示感染细胞中有HCV病毒蛋白合成；⑤将获得的HCV第一代病毒(培养上清)进行定量RT-PCR证明其未浓缩上清中HCV滴度高达10⁷基因组拷贝/ml；⑥将第一代HCV病毒连续在Huh-7细胞上传代，第4代培养上清病毒滴仍达10⁶基因组拷贝/ml。总之，从检测HCV基因组的扩增、复制中间体的存在，病毒蛋白表达、子代病毒生物活性及感染性等方面对培养上清的子代HCV进行了不同层次的定性和定量鉴定。

Claims (2)

1、一种丙型肝炎全病毒(HCV)，其基因型为HCV 1b，被命名为HCV 1b岱鹰株(DY株)，该HCV DY株已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心收藏保管和登记入册，保藏号0588。

2、一种如权利要求1所述丙型肝炎全病毒的体外细胞培养方法，包括：

1)从丙型肝炎患者血清中扩增包括HCV基因组3′PolyA后边98个核苷酸的全长基因组；

2)对HCV基因组中的NS5A和NS5B进行人工定点突变，把NS5A区的1979位的丝氨酸突变为异亮氨酸，把NS5B区的2884位的精氨酸突变为甘氨酸；

3)在突变后的HCV基因组中的NS5B 3′末端插入标志基因IRBS-GFP表达盒；

4)用带有定点突变、具有全长HCV基因组转染敏感细胞、体外培养获得HCV具有感染活性的子代病毒。

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