KR100471946B1

KR100471946B1 - Ｃ형 간염바이러스(ｈｃｖ)의 리플리콘, 이를 포함하는세포주, 및 상기 세포주를 이용한 ｈｃｖ 탐지방법

Info

Publication number: KR100471946B1
Application number: KR10-2002-0025292A
Authority: KR
Inventors: 장승기; 김윤기
Original assignee: (주)팬바이오넷
Priority date: 2002-05-08
Filing date: 2002-05-08
Publication date: 2005-03-08
Also published as: KR20030087290A

Abstract

본 발명은 C형 간염바이러스(Hepatitis C virus; HCV)의 리플리콘, 이를 포함하는 형질전환 세포주, 및 이를 이용한 HCV의 탐지방법에 관한 것이다. 더욱 자세하게는, 본 발명에 따른 HCV의 탐지방법은 HCV의 모든 단백질을 발현하는 리플리콘을 제조하고, 이를 포함하는 세포주와 포함하지 않는 세포주간의 시료 혈청에 대한 반응여부를 서로 비교함으로써 시료내 바이러스에 대한 항체의 존재여부를 탐지할 수 있는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 재조합된 HCV 단백질의 일부 또는 HCV 단백질의 일부 펩타이드를 이용한 기존의 바이러스 감염 진단방법에 비하여, 고등세포 내에서 발현되는 C형 간염바이러스의 모든 단백질을 이용함으로써 보다 정확성이 높은 HCV 감염의 진단 방법을 제공할 수 있다.

Description

Ｃ형 간염바이러스(ＨＣＶ)의 리플리콘, 이를 포함하는 세포주, 및 상기 세포주를 이용한 ＨＣＶ 탐지방법{HEPATITIS C VIRAL REPLICON, REPLICON-CONTAINING CELL, AND DETECTING METHOD OF HCV INFECTION USING REPLICON-CONTAINING CELL}

[발명이 속하는 기술분야]

본 발명은 C형 간염바이러스 (Hepatitis C virus; HCV)의 리플리콘, 및 이를 이용한 HCV의 감염을 진단하는 방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 HCV의 IRES, 폴리오바이러스의 IRES, 및 EMCV의 IRES를 포함하는 리플리콘 및 HCV의 모든 단백질을 발현하는 전장 리플리콘(replicon), 전장 리플리콘을 포함하는 세포주와 포함하지 않는 세포주간의 환자 혈청에 대한 반응여부를 비교함으로써 높은 정확도로 바이러스 감염 여부를 진단할 수 있는 방법에 관한 것이다.

[종래기술]

C형 간염 바이러스(Hepatitis C virus, HCV)는 비A형 및 비B형 간염을 일으키는 속에 속하는 (+) 단일가닥 RNA 바이러스로서, HCV에 감염된 환자의 절반이상이 만성간염으로 발전하고 이들은 대부분 간경화나 간암으로 이어져 치사율이 매우 높으며 전세계 인구의 3% 이상이 HCV에 감염되어 있는 것으로 알려져 있다(Miller and Purcell, 2000, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87, 2057-2061). 우리 나라에서도 2%의 사람이 감염되어있는 것으로 보고되어 있는 C형 간염 바이러스는 50-60세를 전후하여 발병하는 간암의 주요인자의 하나로 알려져 있다. 많은 연구와 노력에도 불구하고, 적당한 세포배양 시스템이 없고 생체 내에서 매우 낮은 역가로 존재하는 HCV의 특성 때문에 그 진단이 매우 어렵고 효과적인 치료법이나 백신이 없는 현실이다.

C형 간염 바이러스의 게놈은 단일가닥 RNA로서 약 3,010개의 아미노산으로 이루어진 단일복합단백질을 발현한다 (Choo et al., 1989, Science, vol.244, 359-362). HCV에 의해 발현되는 단일복합단백질은 숙주세포와 바이러스의 프로테아제에 의해 10개의 서로 다른 기능을 가지는 단백질들로 다시 절단되게 된다. HCV의 유전자 구성은 NH₂-C-E1-E2-p7-NS2-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B-COOH이다 (Steven Rosenberg, 2001, J. Mol. Biol. 313, 451-464). 상기 단백질은 크게 코어(Core), E1, E2, 및 p7을 포함하는 구조를 이루는 구조단백질들과 NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A, 및 NS5B로 이루어진 비구조단백질들로 나눌 수 있다.

최근에 고등 진핵세포 내에서 C형 간염 바이러스의 복제를 확인할 수 있는 시스템이 확립됨으로써, 이러한 기술을 이용하여 HCV 진단, 치료, 및 백신의 개발을 위한 많은 시도들이 가능하게 되었다 (Lohmann et al., 1999, Science, 285, 110-113; Krieger et al., 2001, J. Virol. 75, 4614-4624; Lohmann et al., 2001, J. Virol. 75, 1437-1449). 도 1에 나타낸 바와 같이, 기존에 보고된 HCV 리플리콘인 NK5.1의 구조는 다음과 같다. HCV IRES (HCV Internal Ribosomal Entry Site: H-I)에 의해 네오마이신 포스포트랜스퍼라제(neo)가 발현되고, 엔세팔로마이오카디티스 바이러스(Encephalomyocarditis virus, EMCV)의 IRES(E-I)에 의해 HCV의 비구조 단백질들의 발현이 조절된다. 이러한 구조의 두 개 시스트론을 갖는 RNA 리플리콘(dicistronic RNA replicon)을 사람 간암 세포주 (human hepatoma cell line; Huh-7)에 형질전환시킨 후 네오마이신 설페이트(G418) 존재하에서 HCV의 복제가 활발히 일어나는 세포주만을 선택적으로 선별하게 된다. 선택된 세포주 내에는 활발한 복제가 RNA 수준에서 일어나고, 리플리콘 RNA가 인코딩하고 있는 바이러스의 비구조단백질의 발현이 확인 및 검증되었다 (Lohmann et al., 1999, Science, 285, 110-113; Krieger et al., 2001, J. Virol. 75, 4614-4624; Lohmann et al., 2001, J. Virol. 75, 1437-1449).

HCV의 복제를 실험할 수 있는 세포배양 시스템이 개발되었음에도 불구하고, 기존의 NK5.1과 같은 바이러스의 일부분만으로 구성된 서브제놈 리플리콘 (subgenomic replicon)을 이용함에 있어서 고려해야 할 점들이 있다. 비구조 단백질만을 세포 내에서 발현하기 때문에 바이러스와 세포간의 결합, 면역체계와 구조단백질간의 상호 작용, 구조 단백질과 세포간의 연관관계에 대한 연구는 극히 제한적이라는 점이다. 즉, 실제 C형 간염 바이러스와 같이 바이러스의 모든 구조 단백질을 발현하는 리플리콘을 제작하고, 이 리플리콘을 항상 포함하는 세포주를 배양 및 유지함으로써 이러한 한계를 극복할 수 있을 것이다.

지금까지의 HCV 감염 진단은 대상환자에서 HCV 단백질에 대한 항체존재 여부를 ELISA등의 방법으로 측정하여 수행하였다. 그러나 이러한 종래의 진단방법은 재조합된 HCV 단백질의 일부를 대장균을 이용하여 순수 분리하거나 HCV 단백질의 일부에 해당하는 펩타이드 서열을 이용하였기 때문에 몇 가지 문제점을 내포하고 있다. 즉, 재조합에 사용되지 않은 HCV 단백질에 대한 항체를 가지고 있는 대상환자의 경우에는 HCV 음성으로 진단될 것이다. 또한 단백질합성 이후에 일어나는 여러 가지의 단백질 변형과정(post-translational protein modification)이 없는 대장균에서 발현한 단백질을 이용하기 때문에 실제 HCV 단백질과는 상이한 구조의 항원을 사용하고 있을 가능성이 있다. 뿐만 아니라, 많은 돌연변이를 보이는 HCV의 구조단백질을 진단에 이용하기 때문에 정확한 감염여부의 진단이 어렵다는 문제점이 있다.

상기와 같은 종래 기술의 문제점을 해결하고자, 본 발명은 HCV의 내부 라이보좀 도입 자리(Internal Ribosomal Entry site, IRES), 폴리오바이러스의 IRES, 선별 마커, 및 엔세팔로마이오카디티스 바이러스(Encephalomyocarditis:EMCV)의 IRES을 포함하는 HCV의 DNA 리플리콘(Replicon)을 제공하는데 그 목적이 있다.

본 발명의 또다른 목적은 HCV의 모든 유전자를 포함하는 HCV의 DNA 리플리콘을 제공하고자 한다.

본 발명의 또다른 목적은 상기 HCV의 DNA 리플리콘으로부터 전사된 RNA 전사체를 제공하고자 한다.

본 발명의 또다른 목적은 상기 전장 리플리콘으로부터 전사된 RNA 전사체를 포함하는 형질전환된 세포주와 상기 전사체로 형질전환되지 않는 세포주를 이용하여 시료내 HCV 항체의 존재여부를 높은 정확도와 특이도로 탐지하는 방법을 제공함에 있다.

상기와 같은 목적을 달성하고자, 본 발명은 C형 간염 바이러스(Hepatitis C virus; HCV)의 리플리콘에 있어서, 5' 쪽 말단이 HCV의 내부 라이보좀 도입 자리(Internal Ribosomal Entry site, IRES), 폴리오바이러스의 IRES, 선별 마커, 및 엔세팔로마이오카디티스 바이러스(Encephalomyocarditis:EMCV)의 IRES을 포함하는 HCV의 DNA 리플리콘(Replicon)을 제공하고자 한다.

또한, 본 발명은 상기 리플리콘은 상기 HCV IRES의 3' 말단에 연결되며, HCV의 코어 유전자, E1 유전자, E2 유전자, p7 유전자, 및 NS2 유전자로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 폴리뉴클레오타이드를 포함하며, 상기 EMCV IRES의 3' 말단에 연결된, HCV의 NS3에서부터 NS5B까지의 비구조 유전자 영역과 폴리 A 꼬리를 포함하는 HCV의 전장 DNA 리플리콘에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 상기 DNA 리플리콘의 RNA 전사체에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 상기 HCV의 RNA 전사체로 형질전환된 세포주에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 상기 HCV의 전장 RNA 전사체로 형질전환된 세포주 추출물과, 상기 RNA 전사체로 형질전환되지 않은 세포주 추출물 각각에 시료를 반응시켜 반응결과를 비교함으로써 시료내 HCV에 대한 항체의 존재여부를 탐지하는 방법에 관한 것이다.

본 발명에서 "리플리콘(replicon)"이라 함은 고등세포내에서 복제가능한 RNA 전사체 및 이 전사체를 만들 수 있는 DNA 또는 플라스미드 등을 모두 포함하는 통상의 의미로 사용된다.

이하에서, 본 발명을 더욱 자세히 설명하고자 한다.

본 발명에 따른 HCV의 DNA 리플리콘은 5' 쪽 말단이 HCV의 내부 라이보좀 도입 자리(Internal Ribosomal Entry site, IRES), 폴리오바이러스의 IRES, 선별 마커, 및 엔세팔로마이오카디티스 바이러스(Encephalomyocarditis:EMCV)의 IRES을 포함하는 HCV의 DNA 리플리콘(Replicon)이다. 바람직하게는, 상기 리플리콘은 상기 EMCV IRES의 3' 말단에 연결된, HCV의 NS3에서부터 NS5B까지의 비구조 유전자 영역과 폴리 A 꼬리를 포함하는 HCV의 DNA 리플리콘이다. 상기 비구조 유전자영역과 폴리 A 꼬리를 포함하는 HCV의 DNA 리플리콘을 NK/H(1-389)/P로 명명하며 개략도를 도 1에 도시하였다. 기존의 HCV 리플리콘 (NK5.1)은 도 1에서와 같이 HCV IRES - 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 코딩서열-EMCV IRES-HCV 비구조 단백질의 서열로 구성되어 있다. 도 1에 나타난 기존의 NK 5.1은 neo의 발현은 HCV IRES에 의해, HCV 비구조 단백질들은 엔세팔로마이오카디티스 바이러스의 IRES에 의해 발현되는 두 종류의 시스트론을 포함하는 서브게놈 리플리콘이다. 이러한 리플리콘을 기본 골격으로 하면서 HCV의 구조단백질을 발현하기 위해서는 다른 제3의 IRES를 HCV IRES와 neo 사이에 첨가하여야 하며, 본 발명에서는 강력한 단백질 번역 효율을 가지는 폴리오바이러스의 IRES를 첨가한다. 결과적으로 선별 마커인 neo 유전자의 발현은 폴리오바이러스의 IRES에 의해 유도된다.

더욱 바람직하게는 상기 HCV의 코어 유전자, E1 유전자, E2 유전자, p7 유전자 및 NS2 유전자로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 폴리뉴클레오타이드가 상기 HCV IRES와 폴리오바이러스의 IRES사이에 추가로 삽입되는 DNA 리플리콘일 수 있다. 가장 바람직하게는 상기 리플리콘은 HCV IRES의 3' 말단에 연결된 HCV의 코어 유전자, E1 유전자, E2 유전자, p7 유전자, 및 NS2 유전자를 포함하며 EMCV IRES의 3' 말단에 NS3에서부터 NS5B까지의 비구조 유전자 영역과 폴리 A 꼬리를 포함하는 리플리콘이다. 구체적으로, (i) 5' 쪽 말단이 HCV의 내부 라이보좀 도입 자리(Internal Ribosomal Entry site, IRES), 폴리오바이러스의 IRES, 선별 마커, 및 엔세팔로마이오카디티스 바이러스(Encephalomyocarditis:EMCV)의 IRES를 포함하며,

(ii) 상기 HCV IRES의 3' 말단에 연결되며, HCV의 코어 유전자, E1 유전자, E2 유전자, p7 유전자 및 NS2 유전자로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 폴리뉴클레오타이드를 포함하며,

(iii) 상기 EMCV IRES의 3' 말단에 연결된, HCV의 NS3에서부터 NS5B까지의 비구조 유전자 영역과 폴리 A 꼬리를 포함하는 HCV의 DNA 리플리콘을 전장 리플리콘(full length replicon, FK 리플리콘)이라 명명하며, 개략도를 도 1에 도시한다.

본 발명에 따른 전장 리플리콘을 대한민국 대전광역시 유성구 어은동 52번지에 소재한 생명공학연구소 유전자은행에 2002년 4월 16일자로 기탁하여 수탁번호 KCTC 10227BP를 받았다. 본 발명에서의 HCV의 모든 단백질을 발현하는 전장 리플리콘은 상기 NK/H(1-389)/P를 이용하여 제작된다. NK/H(1-389)/P 벡터내의 HCV의 라이보좀 결합 자리(IRES)와 폴리오바이러스의 IRES 사이에 HCV의 코어, E1, E2, p7을 포함하는 구조유전자와 NS2 유전자를 첨가한다. 결과적으로 HCV의 코어, E1, E2, p7, NS2 유전자들은 HCV의 IRES에 의해, 선별 마커 유전자는 폴리오바이러스의 IRES에 의해, HCV 비구조 단백질은 엔세팔로마이오카디티스 바이러스의 IRES에 의해 단백질 발현이 이루어진다.

본 발명은 상기 HCV의 DNA 리플리콘으로부터 전사된 RNA 전사체에 관한 것이다. 상기 HCV DNA 리플리콘으로부터 RNA 전사체를 제조하는 방법은 본 기술분야의 통상의 지식을 가진 자가 적절히 선택할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 RNA 전사체로 형질전환된 세포주에 관한 것이다. 상기 세포주는 HCV의 복제가 가능한 모든 세포주일 수 있으며, 바람직하게는 사람의 간암세포주(human hepatocellular cell; Huh-7)이다. 상기 전장 리플리콘으로 형질전환된 사람 간암세포주를 대한민국 대전광역시 유성구 어은동 52번지에 소재한 생명공학연구소 유전자은행에 2002년 4월 16일자로 기탁하여 수탁번호 KCTC 10226BP를 받았다.

본 발명의 일례에서, 형질전환방법은 세포주와 상기 RNA전사체를 일렉트로포레이션시켜 제조할 수 있으며, 또한 RNA 전사체로 세포주를 형질전환시키는 모든 방법을 본 발명에 적용할 수 있다.

상기 형질전환된 세포주의 콜로니 형성율를 비교하면, 기존의 비구조 단백질만을 발현하는 리플리콘 (NK5.1)의 경우, 단위 RNA 농도 당 약 10⁴개의 콜로니를 형성한다(도 2). 유사한 콜로니 형성 효율이 키메라 리플리콘인 NK/H(1-389)/P에서 관찰된다. HCV의 모든 단백질을 가지는 FK의 경우, 단위 RNA 농도 당 약 10²개의 콜로니를 형성한다. 이러한 콜로니 형성 효율의 감소는 전체적인 길이의 차이에 기인하는 것으로 여겨진다. FK 리플리콘은 NK5.1 리플리콘에 비해 약 1.4 배 정도 RNA의 길이가 더 길다.

도 3에 나타난 바와 같이, HCV의 구조단백질인 코어와 E2 단백질이 FK를 지니는 세포주와 Saos-2 #47 세포주에서 관찰된다. 여기서, Saos-2 #47 세포주란 HCV 타입 1a의 모든 단백질을 구성하는 DNA 유전자가 오스티오싸코마 세포주 (Osteosarcoma, Saos-2)의 유전체 내에 삽입된 형질전환 세포주를 의미한다. 반면에, HCV의 비구조 단백질의 하나인 NS5B 단백질은 NK/H(1-389)/P와 FK를 가지는 세포주의 추출물, 그리고 Saos-2 #47 세포주의 추출물에서 관찰된다. 세포주 내에서 발현되는 HCV 단백질은 모두 정상적인 가공(Processing)을 통해 예상되는 크기의 분자량을 지니고 있고, 이러한 사실은 본 발명의 전장 리플리콘을 가지고 있는 세포주는 HCV가 실제로 가지고 있는 단백질과 같은 형태의 바이러스 단백질을 발현함을 나타내고 있으며, 더 나아가 HCV 진단을 위한 효율적인 시스템을 제공할 수 있음을 나타낸다.

본 발명은 또한 상기 RNA 전사체로 형질전환된 세포주 추출물과, 상기 RNA 전사체로 형질전환되지 않은 세포주 추출물 각각에 시료를 반응시켜 반응결과를 비교함으로써 시료내 HCV에 대한 항체의 존재여부를 탐지하는 방법에 관한 것이다. 상기 형질전환된 세포주는 HCV의 전장 리플리콘으로 형질전환된 세포주가 바람직하며, 더욱 바람직하게는 HCV의 전장 리플리콘으로 형질전환된 사람 간암세포주이며, 가장 바람직하게는 KCTC 10226BP 기탁번호를 갖는 사람 간암세포주이다.

상기 형질전환 세포주와 형질전환되지 않은 세포주의 시료 반응결과를 구별하여 시료내 HCV에 대한 항체의 존재를 탐지하기 위해서는, 형질전환 세포주 추출물과 형질전환되지 않은 세포주 추출물과의 시료 반응결과를 구별하여 분석할 수 있는 분석방법은 모두 적용할 수 있으며, 예를 들면, 웨스턴 블랏 또는 ELISA 등이 있다.

본 발명의 일례에서, 상기 반응 결과 탐지는 웨스턴 블랏법(western blot)으로 수행할 수 있으며, 구체적으로는 상기 HCV 리플리콘 발현벡터의 전사체를 일렉트로포레이션 방법으로 Huh-7 세포주 내로 형질전환시킨다. Huh-7 세포주내에서 복제되는 리플리콘을 가지는 세포주만을 선별하기 위해서 3 내지 4일 간격으로 G418 (600 ㎍/ml)을 포함하는 배양액으로 배양액을 치환한다. G418의 존재 하에서 지속적인 배양을 한 후, 2 내지 3주 후에 콜로니(colony)를 형성하는 세포주를 픽킹 (picking)하여 세포주의 양을 증폭시킨다. 상기 HCV 리플리콘 전사체로 형질전환된 세포주의 추출물과 형질전환되지 않는 세포주의 추출물을 각각 SDS-PAGE를 이용하여 전기영동 후, 멤브레인(membrane)에 이동시키고, 멤브레인 위에 시료 혈청을 반응시킨다. 상기 HCV 리플리콘을 지니는 세포주에서 특이적인 결합여부를 관찰함으로써 시료내 HCV에 대한 항체의 존재여부를 탐지하는 방법을 제공한다. 즉, 상기 두 종의 세포주간의 시료 혈청 반응성을 비교했을 경우, 형질전환된 세포주에만 특이적으로 반응하는 단백질 밴드(band)가 관찰된다면 이는 시료 혈청에 HCV에 대한 항체가 존재하고 HCV에 감염되었다고 진단할 수 있다.

본 발명에 따른 전장 HCV 리플리콘의 전사체로 형질전환된 세포주를 이용한 웨스턴 블랏법(western blot) 진단법 이외에도, 상기 두 세포주간의 혈청 반응하는 정도를 ELISA등의 방법을 이용, 정량적으로 비교 및 측정하여 HCV 감염을 진단할 수 있는 방법을 제공한다.

본 발명에 따른 전장 리플리콘과 이를 포함하는 세포주를 이용한 HCV 감염 진단방법은, 단백질의 변형이 정상적으로 일어나는 고등 진핵세포 내에서 발현가능한 HCV의 모든 단백질을 검사 대상으로 피검자의 혈청내에 존재하는 항체의 반응성을 검사할 수 있는 방법을 제공한다. 이러한 이유로, 재조합된 HCV 단백질의 일부를 대장균을 이용하여 순수 분리하거나, HCV 단백질의 일부에 해당하는 펩타이드 서열을 이용하여 ELISA 방식으로 진단하는 기존의 진단방법에 비해 보다 더 정확한 HCV 진단방법을 제공할 수 있다.

이하의 실시예를 통해 본 발명을 더욱 상세히 설명할 것이나, 하기 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하는 것일 뿐, 본 발명의 보호범위를 제한하는 의도는 아니다.

[실시예]

실시예 1: 리플리콘 제조

1-1: NK/H(1-389)/P의 클로닝

HCV 구조 단백질을 발현하는 리플리콘을 제조하기 위한 골격을 만들기 위해서 폴리오바이러스의 IRES(Internal Ribosomal Entry Site)를 기존의 NK5.1의 HCV IRES-네오마이신 포스포트랜스퍼라제(neo)의 오픈 리딩 프레임(open reading frame) 사이에 도입하였다.

기존의 NK5.1은 HCV IRES-네오마이신 포스포트랜스퍼라제-EMCV IRES-HCV 비구조 단백질의 서열로 구성되어 있다. 즉, neo의 발현은 HCV IRES에 의해, HCV 비구조 단백질들은 EMCV IRES에 의해 발현되는 두 개의 시스트론을 포함하는 서브게놈(dicistronic subgenomic) 리플리콘이다(도 1).

하기 두 종류의 단일가닥 DNA 올리고뉴클레오타이드 pMPS1-ECAT(Jang and Wimmer, 1990, Genes. Dev. 4, 1560-1572)을 주형으로 하여 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction; PCR)을 통해 폴리오바이러스의 IRES를 증폭시켰다.

5'-TTGGCGCGCCCCATTATGATACAATTGTCTGA-3', 및

5'-TTGGCGCGCCCTCTAGACTCCGGTATTGCGGTACC-3'

PCR 반응시 0.4 mM dNTPs, 각 1 mM의 단일가닥 DNA 올리고뉴클리오타이드, 2 ng 주형 DNA, 1.75 단위 폴리머라제(expand high fidelity PCR system; Boehringer Mannheim 사로부터 구입)를 50 ml에 넣은 후 55℃에서 어닐링시키고, 상기 증폭과정을 30회 반복하였다.

증폭된 폴리오바이러스의 IRES와 서브게놈 리플리콘 NK5.1을 제한효소 AscI을 이용하여 자른 후 서로 결합(ligation)시켰다. 결합 후 얻어진 플라스미드를 E.coli(JM109)에 일렉트로포레이션(eletroporation)방법으로 형질전환시켰다. 얻어진 E.coli를 암피실린 (amphicillin: Sigma사로부터 입수)이 포함된 아가플레이트에서 37℃, 15시간 동안 성장시켜, 아가플레이트에 성장한 각각의 콜로니 중 수십 개를 선택하여 미니-프레퍼레이션(mini-preparation)을 수행하였다. 이렇게 얻은 DNA를 AscI, BalI, KpnI, 및 NcoI 제한효소를 이용하여 삽입체(insert)가 들어간 클론들을 찾아냈다. 올바르게 제작된 DNA를 선별한 후, DNA 서열분석을 통해 재확인하였다.

1-2: 전장 리플리콘의 클로닝

HCV의 모든 구조유전자와 비구조 유전자를 포함하는 전장 리플리콘 (full-length replicon, FK)을 제작하기 위하여, 상기 실시예 1-1에서 얻어진 NK/H(1-389)/P, HCV의 코어부터 NS2의 N-말단 절반까지의 삽입체, 및 NS2의 나머지 C-말단 절반을 포함하는 삽입체를 결합시켰다.

상세히 기술하면, 상기 실시예 1-1에서 제조된 NK/H(1-389)/P를 NruI, 및 XbaI로 절단하였다. HCV의 코어부터 NS2의 N-말단 절반까지를 포함하는 삽입체 부분은 유전형 1b의 HCV (genotype 1b HCV, 이하 HCV 1b)의 전체 서열을 포함하는 벡터(Lohmann et al., 1999, Science, 285, 110-113)에서 SplI과 NruI을 이용하여 잘라서 얻었다. NS2의 나머지 C-말단 절반을 포함하는 또 다른 삽입체는, HCV 1b의 뉴클레오타이드 3153-3173bp과 어닐링하는 단일가닥 DNA 올리고뉴클레오타이드와, 뉴클레오타이드 3400-3419bp와 어닐링하고 단백질 발현 중지 코돈을 가지고 XbaI 제한효소 자리를 추가로 포함하는 하기의 두 단일가닥 DNA 올리고뉴클레오타이드, 그리고 HCV 1b의 전체 서열을 포함하는 벡터를 주형으로 하여 PCR을 통해 증폭하였다.

5'-CTCATGAAGTTGGCCGCACTG-3'

5'-TGCTCTAGAACTAGAGGAGTCGCCACCCCTGCC-3'

증폭된 삽입체는 제한효소 SplI과 XbaI을 이용하여 절단하였다.

상기 1-1에서 얻어진 NK/H(1-389)/P, HCV의 코어부터 NS2의 N-말단까지의 삽입체, 및 NS2의 나머지 C-말단을 포함하는 삽입체를 모두 결합(ligation)시켰다. 결합된 플라스미드를 E.coli(JM109)에 일렉트로포레이션 방법으로 형질전환시킨 후 암피실린이 포함된 아가플레이트에서 37℃, 15시간 동안 성장시켰다. 형질전환되어 아가플레이트에 성장한 각각의 콜로니 중 수십 개를 선택하여 미니-프레퍼레이션(mini-preparation)을 수행하였다. 이렇게 얻은 DNA를 XbaI, SplI, NruI 제한효소를 이용하여 삽입체(insert)가 제대로 들어간 클론들을 찾아냈다. 올바르게 제작된 DNA를 선별한 후, DNA 서열을 분석하여 재확인하였다.

실시예 2: 리플리콘 RNA의 제조

상기 실시예 1에서 제조하여 얻어진, 폴리오바이러스의 IRES을 포함하는 NK/H(1-389)/P와 HCV의 모든 단백질을 발현하는 전장 리플리콘(FK)을 전사하여 리플리콘 RNA를 제조하였다.

10 ㎍의 이중가닥 DNA 주형을 제한효소 ScaI로 절단하고, 페놀추출과 에탄올침전을 통하여 잘려진 DNA 주형을 분리하였다. 잘려진 이중가닥 DNA 주형, 1 X 전사완충액, 10 mM DTT(Sigma사), 1 mM ATP, CTP, GTP, UTP (Boehringer Mannheim 사), 120 U RNase 저해제 (Promega사), 150 U T7 RNA 중합효소 (Stratagen사), DEPC-H₂O를 75 ml 넣어서 혼합한 후 37℃에서 2시간 동안 반응시켰다. 120 U RNase 저해제와 150 U T7 RNA 중합효소를 추가로 첨가하여 3시간 더 반응을 진행시켰다. 상기 반응액으로부터 페놀 추출과 에탄올 침전을 통하여 RNA를 정제한 후 20 U DNaseⅠ(Ambion사)을 37℃에서 1시간 처리하여 남아있는 DNA 주형을 분해시켰다. 얻어진 반응액에 다시 페놀추출과 에탄올침전을 통하여 RNA를 정제하고, 정제된 RNA를 DEPC-H₂O에 용해시킨 후 UV 스펙트로포토미터(spectrophotometer)를 이용하여 정량하였다. 정량된 리플리콘 RNA를 1% 아가로스젤에 로딩하여 RNA의 충실성을 재확인하였다.

실시예 3: 형질전환 세포주의 제조

3-1: 형질전환

사람의 간암 세포주의 일종인 Huh-7 세포를 10% 소태아혈청(FBS; Hyclone사), 페니실린, 스트렙토마이신을 포함하는 Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM; Gibco-BRL에서 구입) 하에서 배양하여 세포주를 준비하였다.

상기 실시예 2에서 전사과정을 통해 얻어진 리플리콘 RNA를 일렉트로포레이션으로 상기 세포주 내로 형질전환시켰다. 형질전환 직후 세포주를 10% FBS를 포함하는 DMEM 배지에서 하루동안 배양한 후, G418 (600 mg/ml)을 포함하는 배양액으로 상기 배양배지를 치환하여 37℃에서 배양하였다. Huh-7 세포주내에서 복제되는 리플리콘을 가지는 세포주만을 선별하기 위해서 3일 내지 4일 간격으로 G418 (600 mg/ml)을 포함하는 배양액으로 배양 배지를 치환하였다. G418의 존재 하에서 지속적으로 배양한 후, 2 내지 3주 후에 콜로니(colony)를 형성하는 세포주를 픽킹 (picking)하여 세포주의 양을 증폭시켰다.

3-2: 콜로니 형성 효율 확인

G418의 존재 하에서 형질전환 세포주를 지속적으로 배양한 후, 2 내지 3주 후에 콜로니를 관찰한 후, 70% 메탄올에 0.5% 크리스탈 바이올렛(Crystal violet)을 용해시킨 용액을 이용하여 세포를 고정, 염색하였다. 100 ng의 전사체를 일렉트로포레이션을 하여 얻어진 콜로니의 염색 결과는 도 2와 같다.

트랜스펙션한 RNA의 단위 농도 당 생성된 콜로니 개수를 서로 비교하였다. 기존 리플리콘 (NK5.1)의 경우, 사용한 RNA 1 mg 당 약 10⁴개의 콜로니를 형성하였다. 유사한 콜로니 형성 효율이 키메라 리플리콘인 NK/H(1-389)/P를 포함하는 형질전환 세포주의 콜로니에서 관찰되었다. HCV 모든 단백질을 가지는 FK의 경우, 사용한 RNA mg 당 약 10²개의 콜로니를 형성하였다. 이러한 콜로니 형성 효율의 감소는 전체적인 길이의 차이에 기인하는 것으로 여겨진다. FK는 NK5.1에 비해 약 1.4 배 정도 길이가 더 길다. 전사체 없이 형질전환된 음성 대조군의 경우, 어떠한 콜로니도 관찰되지 않았다(도 2의 mock).

실시예 4: 형질전환 세포주로부터 HCV 단백질의 검출

종래의 NK5.1 리플리콘을 포함하는 형질전환 세포주, 실시예 1의 NK/H(1-389)/P, 및 FK를 포함하는 형질전환 세포주가 발현하는 HCV 단백질을 확인하기 위해서 웨스턴 블랏을 수행하였다(도 3).

비구조 단백질만을 가지는 리플리콘 (NK5.1)과 키메라 리플리콘 (NK/H(1-389)/P)을 가지는 각 세포주에서는 유사한 양의 NS3, NS4B, NS5A, NS5B 단백질이 발현됨을 웨스턴블랏을 통해 확인하였다. 본 발명에 따른 키메라 리플리콘(NK/H(1-389)/P)을 게재한 상기의 논문에서는, 본 발명의 NK/H(1-389)/P의 5' 말단에 존재하는 HCV IRES를 점진적으로 제거함으로써 HCV의 복제에 필수적인 RNA 서열을 찾는 연구에 사용하였다.

키메라 리플리콘 (NK/H(1-389)/P)과 HCV의 모든 단백질을 지니는 전장 리플리콘 (FK)을 가지고 있는 각 세포주의 추출물, 및 양성 대조군으로 HCV의 모든 단백질이 세포주의 유전체에 삽입된 세포주(Saos-2 #47)의 추출물을 12% SDS-PAGE에 로딩해서 전기영동한 후, 니트로셀룰로스 멤브레인(nitrocellulose membrane)으로 이동시켰다. 상기 멤브레인을 5% 스킴 밀크(skimmed milk)가 용해된 TBS 완충액 (20 mM Tris-HCl pH 7.5, 150 mM NaCl, 0.5% Tween-20)에 3시간 이상 블로킹 (blocking)을 하였다. 그런 후, HCV 코어 (LG 바이오텍에서 얻음), E2 (Dr. Kohara에게서 얻음) 또는 NS5B (Dr. Francesco R.에게서 얻음)를 인식하는 각각의 항체와 반응시키고, 홀스래디쉬퍼옥시데이즈 (horseradish peroxidase)가 연결된 2차 항체(Amersham사)를 이용하여 웨스턴 블랏을 수행하였으며, 그 결과를 도 3에 나타냈다.

도 3에 나타난 바와 같이, HCV의 코어와 E2 단백질이 FK를 지니는 세포주와 Saos-2 #47 세포주에서 관찰되었다. 반면에, NS5B 단백질은 NK/H(1-389)/P와 FK를 가지는 세포주의 추출물, 그리고 Saos-2 #47 세포주의 추출물에서 관찰되었다. 로딩 대조군으로 세포내에 존재하는 액틴(actin)의 양을 관찰한 결과, 로딩 양은 서로 비슷함을 알 수 있었다. 세포주 내에서 발현되는 HCV 단백질은 모두 정상적인 가공(Processing)을 통해 예상되는 크기의 분자량을 지니고 있었고, 이러한 사실은 본 발명의 리플리콘을 가지고 있는 세포주는 HCV가 실제로 가지고 있는 단백질과 같은 형태의 바이러스 단백질을 발현함을 나타내고 있으며, 더 나아가 HCV 진단을 위한 효율적인 시스템을 제공할 수 있음을 나타낸다.

실시예 5: HCV 양성, 음성, 및 HBV 양성인 사람들의 혈청을 이용하여 HCV에 대한 항체의 존재 여부 탐지

본 발명의 FK 리플리콘을 이용한 C형 간염 바이러스의 진단방법의 정확도와 특이도, 민감도를 확인하기 위하여, 기존의 HCV 항체 검진방법 중의 하나인 스트립 이뮤노블랏 어세이(Strip lmmunoblot Assay; CHIRON RIBA HCV 3.0)를 수행하여 C형 간염 바이러스, B형 간염 바이러스(HBV), 그리고 정상인 것으로 확인된 사람의 혈청을 얻어서(가톨릭의대, 대한민국, 서울) HCV 감염 여부를 웨스턴 블랏을 통해 검정하였다. 본 실시예에서 사용한 항체가 사람의 혈청이라는 점을 제외하고는 상기 실시예 4의 실험방법과 실질적으로 동일하다.

HCV 감염의 진단결과를 도 4a 내지 4g, 도 5, 및 도 6a 내지 6b에 나타냈다. 도 4a 내지 4g에 나타난 바와 같이, 17명의 HCV 감염 환자의 혈청을 이용하여 검사를 한 결과, 본 발명의 FK 리플리콘을 가지는 세포주의 추출물에서 특이적으로 반응하는 밴드(band)가 모든 혈청에서 관찰되었다. 모든 C형 간염 환자의 혈청은 HCV의 코어 단백질을 인식할 뿐만 아니라, 비구조단백질의 일부를 인식하였다.

반면에, 대조군으로 사용한 3명의 HBV에 감염된 환자와 6명의 정상 사람의 혈청을 이용한 경우, 어떠한 특이적인 반응도 관찰되지 않았다 (도 5, 도 6a 및 6b).

실시예 6: HCV 위음성인 사람의 혈청을 이용하여 HCV에 대한 항체의 탐지

상기 실시예 5에서와 같이 기존의 HCV 항체 검진방법 중의 하나인 스트립 이뮤노블랏 어세이(Strip lmmunoblot Assay; CHIRON RIBA HCV 3.0)를 수행했을 경우에는 HCV 감염 여부를 판정하지 못한 반면, RT-PCR(reverse transcription-polymerase chain reaction)을 사용한 경우에 HCV의 RNA가 관찰된 HCV 감염환자의 혈청(가톨릭의대, 대한민국, 서울)을 이용하여 상기 실시예 5와 동일한 실험을 수행하였으며, 그 결과를 도 7에 나타냈다.

그 결과 기존의 HCV 진단방법의 주요한 인지 단백질인 HCV 코어 단백질에 대한 반응성은 역시 관찰되지 않았지만 비구조단백질의 일부와 환자의 혈청이 반응하였다. 즉, 기존의 HCV 진단 방법으로는 HCV 감염 여부를 확진하지 못했던 환자의 시료혈청이, 본 발명의 세포주 추출물을 이용한 진단 방법에서는 HCV 양성으로 검진되었다. 즉, 본 발명의 전장 리플리콘과 그 세포주는 보다 더 정확하게 HCV 감염여부를 진단할 수 있는 방법을 제공한다.

본 발명의 HCV 전장 리플리콘, 및 이를 이용한 HCV에 대한 항체의 탐지방법은 단백질의 모디피케이션 (modification)이 정상적으로 일어나는 고등세포 내에서 발현한 HCV의 모든 단백질을 대상으로 피검자의 혈청내에 존재하는 항체의 반응성을 검사할 수 있는 방법을 제공하므로 재조합된 HCV 단백질의 일부를 대장균을 이용하여 순수 분리하거나 HCV 단백질의 일부에 해당하는 펩타이드 서열을 이용하여 ELISA 방식으로 진단하는 기존의 진단방법에 비해 보다 더 정확한 HCV 진단방법을 제공할 수 있다.

도 1은 종래에 HCV의 비구조 단백질만을 발현하는 서브게놈 리플리콘(subgenomic replicon) NK5.1의 구조, 본 발명에 따른 키메라 리플리콘(NK/H(1-389)/P1)과 HCV의 모든 단백질을 발현하는 전장(full-length) 리플리콘(FK)의 구조를 나타내는 개략도이다.

도 2는 실시예 3에 따른 리플리콘의 단위 RNA 농도당 생성되는 세포주의 콜로니 개수를 나타내는 도면이다.

도 3은 실시예 4에 따라 키메라 리플리콘(NK/H(1-389)/P1)과 전장 리플리콘(FK)을 포함하는 세포주에서 HCV 단백질의 발현 양상을 나타내는 도면이다.

도 4a 내지 4g는 실시예 5에 따라 전장 리플리콘을 포함하는 세포주의 추출물을 이용하여 HCV 양성 환자로 밝혀진 사람의 혈청내 HCV 항체의 존재를 나타내는 도면이다.

도 5는 실시예 5에 따라 전장 리플리콘을 포함하는 세포주의 추출물을 이용하여 B형 간염바이러스(HBV) 양성 환자로 밝혀진 사람의 혈청내 HCV 항체의 부재를 나타내는 도면이다.

도 6a 및 6b는 실시예 5에 따라 전장 리플리콘을 포함하는 세포주의 추출물을 이용하여 정상인 사람의 혈청내 HCV 항체의 부재를 나타내는 도면이다.

도 7은 실시예 6에 따라 전장 리플리콘을 포함하는 세포주의 추출물을 이용하여, 스트립 이뮤노블랏어세이에 의해 음성인 것으로 검진되었으나 RT-PCR방법에 의해 양성인 것으로 판명된 환자의 혈청내 HCV 항체의 존재를 보여주는 도면이다.

Claims

C형 간염 바이러스(Hepatitis C virus; HCV)의 내부 라이보좀 도입 자리(Internal Ribosomal Entry site, IRES), HCV 구조 유전자, 폴리오바이러스의 IRES, 선별 마커, 엔세팔로마이오카디티스 바이러스(Encephalomyocarditis:EMCV)의 IRES 및 HCV 비구조 유전자를 5'에서 3' 방향의 일련의 순서로 포함하는 HCV의 DNA 리플리콘(Replicon)으로서,

상기 HCV 구조 유전자는 HCV의 코어 유전자, E1 유전자, E2 유전자, p7 유전자 및 NS2 유전자로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 폴리뉴클레오타이드이며, 및

상기 HCV 비구조 유전자는 HCV의 NS3, NS4A, NS4B, NS5A 및 NS5B로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종이상의 폴리뉴클레오타이드인 HCV의 DNA 리플리콘.
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제 1 항에 있어서, 상기 리플리콘은 수탁번호 KCTC 10226BP의 플라스미드이며,

상기 플라스미드는 C형 간염 바이러스(Hepatitis C virus; HCV)의 내부 라이보좀 도입 자리(Internal Ribosomal Entry site, IRES), HCV 구조 유전자, 폴리오바이러스의 IRES, 선별 마커, 엔세팔로마이오카디티스 바이러스(Encephalomyocarditis:EMCV)의 IRES, HCV 비구조 유전자 및 폴리 A 꼬리를 5'에서 3' 방향의 일련의 순서로 포함하며, 상기 HCV 구조 유전자는 HCV의 코어 유전자, E1 유전자, E2 유전자, p7 유전자 및 NS2 유전자를 포함하며, 상기 HCV 비구조 유전자는 HCV의 NS3, NS4A, NS4B, NS5A 및 NS5B를 포함하는 것인 DNA 리플리콘.
제 1항 또는 4항에 따른 DNA 리플리콘으로부터 전사된 RNA 전사체.
제 5항에 따른 HCV의 RNA 전사체로 형질전환된 사람 간암 세포주.
제 6 항에 있어서, 상기 세포주는

(i) 5' 쪽 말단이 HCV의 내부 라이보좀 도입 자리(Internal Ribosomal Entry site, IRES), 폴리오바이러스의 IRES, 선별 마커, 및 엔세팔로마이오카디티스 바이러스(Encephalomyocarditis:EMCV)의 IRES을 포함하며,

(ii) 상기 HCV IRES의 3' 말단에 연결되며, HCV의 코어 유전자, E1 유전자, E2 유전자, p7 유전자 및 NS2 유전자로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 폴리뉴클레오타이드를 포함하며,

(iii) 상기 EMCV IRES의 3' 말단에 연결된, HCV의 NS3에서부터 NS5B까지의 비구조 유전자 영역과 폴리 A 꼬리

를 포함하는 HCV의 RNA 전사체로 형질전환된 사람 간암 세포주.
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제 6 항에 있어서, 상기 형질전환된 사람 간암세포주는 수탁번호 KCTC 10226BP 사람 간암세포주인 세포주.
제 6 항, 제 7 항 및 제 9 항 중 어느 한항에 따른 형질전환된 사람 간암 세포주의 추출물과, 상기 RNA 전사체로 형질전환되지 않은 세포주 추출물 각각에 검사 시료를 반응시켜 반응결과를 비교함으로써 시료내 HCV에 대한 항체의 존재여부를 탐지하는 방법으로서,

상기 반응결과는 웨스턴 블랏 또는 ELISA 방법으로 분석하는 것을 포함하는 방법.
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