JPWO2010008010A1 - Hcv/gbv−bキメラウイルス - Google Patents
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Abstract
Description
このHCV/GBV−BキメラRNAの、ヒト肝がん由来細胞株における複製効率は、親株のHCVの複製効率と比較して上昇していた。すなわち、本発明者は、得られたHCV/GBV−BキメラRNAが、HCVの複製機能を充分維持していることを見出した。
更に、このHCV/GBV−BキメラRNAをマーモセットの初代肝細胞に導入したところ、HCV/GBV−BキメラRNAは細胞内で自律的に増殖し、細胞上清中にコア蛋白を持続的に放出した。すなわち、本発明者は、HCV/GBV−BキメラRNAをマーモセットの初代肝細胞にトランスフェクションすることで、再感染可能なHCV/GBV−Bキメラウイルスを産生できることを見出した。
本発明は、こうした知見に基づくものである。
本発明のHCV/GBV−BキメラRNAの好ましい態様においては、
(A)C型肝炎ウイルスの、5’非翻訳領域のRNAを含むHCV−5’側RNA、
(B)GBウイルス−Bの、E1タンパク質及びE2タンパク質をコードするRNAを含むGBV−B−RNA、並びに
(C)C型肝炎ウイルスの、NS3タンパク質、NS4Aタンパク質、NS4Bタンパク質、NS5Aタンパク質及びNS5Bタンパク質をコードするRNA、並びに3’非翻訳領域のRNAを含むHCV−3’側RNA、
を含み、前記HCV−5’側RNA(A)及びHCV−3’側RNA(C)の間に、GBV−B−RNA(B)が挿入される。
本発明のHCV/GBV−BキメラRNAの別の好ましい態様においては、前記HCV−5’側RNA(A)が、5’非翻訳領域のRNA及びコアタンパク質の一部又は全部をコードするRNAを含み、
前記GBV−B−RNA(B)が、コアタンパク質の一部、E1タンパク質、E2タンパク質、及びp6タンパク質をコードするRNAを含み、
前記HCV−3’側RNA(C)が、p7タンパク質、NS2タンパク質、NS3タンパク質、NS4Aタンパク質、NS4Bタンパク質、NS5Aタンパク質及びNS5Bタンパク質をコードするRNA、並びに3’非翻訳領域のRNAを含み、より好ましくは、配列番号55で表される塩基配列からなるRNAである。
また、本発明は、前記HCV/GBV−BキメラRNAの相補的なHCV/GBV−Bマイナス鎖キメラRNAに関する。
また、本発明は、前記HCV/GBV−BキメラRNAを含むHCV/GBV−Bキメラウイルスに関する。
また、本発明は、前記HCV/GBV−BキメラRNAをコードする、HCV/GBV−BキメラDNAに関する。
また、本発明は、前記RNA又は請求項7に記載のDNAから翻訳されるHCV/GBV−Bキメラタンパク質に関する。
また、本発明は、前記HCV/GBV−BキメラRNAを含む、HCV/GBV−BキメラRNA複製細胞に関する。
また、本発明は、前記HCV/GBV−BキメラRNA、又は請求項6に記載のHCV/GBV−Bキメラウイルスを接種された非ヒト動物に関する。
本明細書において、HCV/GBV−Bキメラ遺伝子は、HCV/GBV−BキメラRNA及びHCV/GBV−BキメラDNAを意味する。
本発明のHCV/GBV−Bキメラウイルスを用いることにより、小型霊長類であるタマリンやマーモセットを用いたHCV動物モデルを構築することができる。そして、この動物モデルを利用することにより、HCVの基礎研究はもとより、肝炎の重症化を抑制、又は阻害する医薬品の開発や評価を行うことができ、より有効な感染の予防薬及び治療薬の開発及び評価が可能となる。
また、本発明は、このHCV/GBV−Bキメラ遺伝子が複製する細胞を提供する。このHCV/GBV−Bキメラ遺伝子が複製している細胞のHCV/GBV−Bキメラ複製系を用いて、HCVの増殖を抑制する薬剤のスクリーニングができる。また、動物モデルはスクリーニングされた薬剤の効果を評価する方法としても有効である。この場合、薬剤の評価をこの方法で行うことが重要であり、薬剤の管理に必須であれば、薬剤を製造する方法としても利用できる。
第1804番のロイシン及び第1966番のリジンのそれぞれのアミノ酸番号は、3010個のアミノ酸からなるC型肝炎ウイルスの全長のポリプロテインにおけるアミノ酸番号を示している。第1804番のロイシン及び第1966番のリジンは、NS4Bタンパク質に含まれるアミノ酸である。本発明者らは、先にこれらのアミノ酸をコードする塩基配列を含むC型肝炎ウイルスのRNAを報告した(特許文献1)が、それまで、これらのアミノ酸を含むNS4Bタンパク質は報告されていなかった。従って、これらのアミノ酸を含むHCVポリプロテイン、これらのアミノ酸をコードするポリヌクレオチドを含むRNAレプリコンも報告されていなかった。
(A)HCVの5’側RNA
HCVの5’側のRNAは、少なくともHCVの5’非翻訳領域のRNAを含む。更に、HCVのコアタンパク質の一部又は全部をコードするRNAを含むことができる。
HCVの遺伝子においては、例えば、一般的な遺伝子型1bのHCV遺伝子は、5’非翻訳領域のRNA(第1番〜第341番:以下、5’UTRと称することがある)と、それに続いて、前記のウイルス構造タンパク質であるコアタンパク質をコードするRNA(第342番〜第914番)、E1タンパク質をコードするRNA(第915番〜第1490番)、及びE2タンパク質をコードするRNA(第1491番〜第2579番)、並びに非構造タンパク質であるp7タンパク質をコードするRNA(第2580番〜第2768番)、NS2タンパク質をコードするRNA(第2769番〜第3419番)、NS3蛋白をコードするRNA(第3420番〜第5312番)、NS4Aタンパク質をコードするRNA(第5313番〜第5474番)、NS4Bタンパク質をコードするRNA(第5475番〜第6257番)、NS5Aタンパク質をコードするRNA(第6258番〜第7598番)、及びNS5Bタンパク質をコードするRNA(第7599番〜第9371番)と、更に3’非翻訳領域のRNA(第9372番以降:以下、3’UTRと称することがある)とからなっている。
また、コアタンパク質をコードするRNAは、第342番〜第914番の573個のヌクレオチドからなり、HCVの5’側のRNAは、その全部又は一部のヌクレオチドを含むことができる。
HCVの5’側RNAの塩基配列は、特に限定されるものではないが、配列番号55の相当する領域の塩基配列に対して、好ましくは90%以上、より好ましくは93%以上、最も好ましくは95%以上の相同性を有する。HCV/GBV−BキメラRNAは、HCVの5’側RNAを含むことにより、5’UTRのRNA又はコアタンパク質をコードするRNAの機能を阻害する薬剤をスクリーニングすることができる。
GBV−B−RNAは、少なくともE1タンパク質をコードするRNA、E2タンパク質をコードするRNAを含むことが好ましい。更に、コアタンパク質をコードするRNAの一部又は全部、及び/又はp6タンパク質をコードするRNAの一部又は全部を含むことができる。
GBV−Bの遺伝子は、5’非翻訳領域のRNA(第1番〜第445番:以下、5’UTRと称することがある)と、それに続いて、ウイルスの構造タンパク質であるコアタンパク質をコードするRNA(第446番〜第913番)、E1タンパク質をコードするRNA(第914番〜第1489番)、及びE2タンパク質をコードするRNA(第1490番〜第2284番)、並びに非構造タンパク質であるp6タンパク質をコードするRNA(第2285番〜第2452番)、p7タンパク質をコードするRNA(第2453番〜第2641番)、NS2タンパク質をコードするRNA(第2642番〜第3265番)、NS3蛋白をコードするRNA(第3266番〜第5125番)、NS4Aタンパク質をコードするRNA(第5126番〜第5290番)、NS4Bタンパク質をコードするRNA(第5291番〜第6034番)、NS5Aタンパク質をコードするRNA(第6035番〜第7267番)、及びNS5Bタンパク質をコードするRNA(第7268番〜第9037番)と、更に3’非翻訳領域のRNA(第9038番以降:以下、3’UTRと称することがある)とからなっている。HCVの遺伝子との構造上の違いは、GBV−Bがp6タンパク質をコードする領域を有していることである。
E1タンパク質をコードするRNA、E2タンパク質をコードするRNAを含むことにより、HCV/GBV−BキメラRNAは、タマリン及びマーモセットなどの実験動物、又はこれらの動物由来の細胞に感染することが可能になる。
更に、p6タンパク質は、第2285番〜第2452番の168個のヌクレオチドからなり、GBV−B−RNAは、その全部又は一部のヌクレオチドを含むことができる。
GBV−B−RNAの塩基配列は、翻訳されたGBV−Bのタンパク質としての機能、すなわち、産生されたキメラウイルスがタマリン及びマーモセットなどの実験動物への感染能を有する限り、特に限定されない。
HCVの3’側のRNAは、少なくともNS3タンパク質をコードするRNA、NS4Aタンパク質をコードするRNA、NS4Bタンパク質をコードするRNA、NS5Aタンパク質をコードするRNA、及びNS5Bタンパク質をコードするRNA、並びに3’非翻訳領域のRNAを含む。更に、HCVのp7タンパク質をコードするRNA、NS2タンパク質をコードするRNAを含むことができる。
p7タンパク質をコードするRNAは、第2580番〜第2768番の189個のヌクレオチドからなり、その全部又は一部のヌクレオチドを含むことができる。NS2タンパク質をコードするRNAは、第2769番〜第3419番の651個のヌクレオチドからなり、その全長のヌクレオチドを含むことができる。
NS3タンパク質をコードするRNAは、第3420番〜第5312番の1893個のヌクレオチドからなり、その全長のヌクレオチドを含むことが好ましい。
NS4Aタンパク質をコードするRNAは、第5313番〜第5474番の162個のヌクレオチドからなり、その全長のヌクレオチドを含むことが好ましい。
NS4Bタンパク質をコードするRNAは、第5475番〜第6257番の783個のヌクレオチドからなり、その全長のヌクレオチドを含むことが好ましい。
NS5Aタンパク質をコードするRNAは、第6258番〜第7598番の1341個のヌクレオチドからなり、その全長のヌクレオチドを含むことが好ましい。
NS5Bタンパク質をコードするRNAは、第7599番〜第9371番の1773個のヌクレオチドからなり、その全長のヌクレオチドを含むことが好ましい。
3’UTRのRNAは、第9372番以降のRNAであり、ウイルス株によってその長さは異なるが、通常41ヌクレオチドの可変領域、株により長さの異なるポリU領域、及び98ヌクレオチドの3’X領域からなる。HCVの3’側RNAは、その全長の3’UTRを含むことが好ましい。
HCV/GBV−BキメラRNAは、GBV−Bのp6タンパク質をコードするRNAの全部又は一部、HCVのp7タンパク質をコードするRNAの全部又は一部、及び/又はNS2タンパク質をコードするRNAの全部又は一部を含むことができる。
HCVの3’側RNAの塩基配列は、特に限定されるものではないが、配列番号55の相当する領域の塩基配列に対して、好ましくは80%以上、より好ましくは90%以上、最も好ましくは95%以上の相同性を有する。
前記のHCV/GBV−BキメラRNAをコードするDNAを、常法によりクローニングベクターに挿入して、DNAクローンを作製する。得られたDNAをRNAプロモーターの下流に挿入して、レプリコンRNAを産生することのできるDNAクローンを作製する。より具体的には、例えば、劇症C型肝炎患者から単離されたTPF1クローン(特許文献1)のコア蛋白156番目からE2蛋白までを欠失した遺伝子を構築し、GBV−Bのコア蛋白124番目からp6蛋白までの遺伝子を化学合成し、HCVの欠失させた部分に挿入・連結し、HCV/GBV−Bキメラ遺伝子を構築することができる。前記RNAプロモーターは、プラスミドクローン中に含まれるものであることが好ましい。RNAプロモーターとしては、限定するものではないが、T7 RNAプロモーター、SP6 RNAプロモーター、SP3 RNAプロモーターが挙げられ、T7 RNAプロモーターが特に好ましい。
(A)C型肝炎ウイルスの、5’非翻訳領域のRNA並びにコアタンパク質及びE1タンパク質の一部をコードするRNAを含むHCV−5’側RNA、
(B)GBウイルス−Bの、E1タンパク質の一部及びE2タンパク質をコードするRNAを含むGBV−B−RNA、並びに
(C)C型肝炎ウイルスの、NS3タンパク質、NS4Aタンパク質、NS4Bタンパク質、NS5Aタンパク質及びNS5Bタンパク質をコードするRNA、並びに3’非翻訳領域のRNAを含み、好ましくは、p7タンパク質、NS2タンパク質、NS3タンパク質、NS4Aタンパク質、NS4Bタンパク質、NS5Aタンパク質及びNS5Bタンパク質をコードするRNA、並びに3’非翻訳領域のRNAを含むHCV−3’側RNA、
を含む。そして、前記HCV−5’側RNA(A)及びHCV−3’側RNA(C)の間に、GBV−B−RNA(B)が挿入され、前記HCV−5’側RNA(A)によりコードされるE1タンパク質の一部は、E1タンパク質のN末端側の一部分であり、前記GBV−B−RNA(B)によりコードされるE1タンパク質の一部は、E1タンパク質のC末端側の一部分であり、これらの両方の部分の融合によりE1タンパク質の全長がカバーされる。
(A)C型肝炎ウイルスの、5’非翻訳領域のRNAを含むHCV−5’側RNA、
(B)GBウイルス−Bの、E1タンパク質及びE2タンパク質をコードするRNAを含むGBV−B−RNA、並びに
(C)C型肝炎ウイルスの、NS3タンパク質、NS4Aタンパク質、NS4Bタンパク質、NS5Aタンパク質及びNS5Bタンパク質をコードするRNA、並びに3’非翻訳領域のRNAを含み、好ましくは、p7タンパク質、NS2タンパク質、NS3タンパク質、NS4Aタンパク質、NS4Bタンパク質、NS5Aタンパク質及びNS5Bタンパク質をコードするRNA、並びに3’非翻訳領域のRNAを含むHCV−3’側RNA、
を含む。
具体的には、複製細胞と試験物質を接触させ、HCV/GBV−BキメラRNAの増加度を分析することによって試験物質のスクリーニングを行うことができる。HCV/GBV−BキメラRNAの増加度とは、レプリコンRNAの複製の速度又は量の変化を意味する。具体的には、複製細胞中のHCV/GBV−BキメラRNAの量を検出又は測定し、対照の被検物質と接触しない複製細胞のHCV/GBV−BキメラRNAの量と比較することによって、被検物質をスクリーニングすることができる。また、細胞中又は上清中のC型肝炎ウイルスのタンパク質、GBV−Bのタンパク質、又はHCV/GBV−Bキメラタンパク質の量を検出又は測定し、対照の被検物質と接触しない複製細胞のそれと比較することによっても、被検物質をスクリーニングすることが可能である。スクリーニングにおいて検出又は測定することのできるC型肝炎ウイルスタンパク質は、特に限定されないが、好ましくは、コアタンパク質であり、市販のキットを用いてコアタンパク質を測定することも可能である。また、スクリーニング方法を自動化することによって、ハイスループットのスクリーニング方法に適応することも可能である。
非ヒトの実験動物としては、HCV/GBV−Bキメラウイルスが複製又は感染するものであれば、特に限定されないが、好ましくは小型霊長類であり、より好ましくはマーモセット又はタマリンである。
例えば、実験動物に試験物質を投与し、HCV/GBV−Bキメラウイルスの増加度、肝炎の発症などを分析することによって試験物質のスクリーニング又は評価を行うことができる。
本発明のHCV/GBV−BキメラRNAに用いるHCVのRNAは、C型肝炎ウイルスのポリプロテインのアミノ酸配列における第1804番のロイシン及び第1966番のリジンを含むNS4Bタンパク質をコードするRNAを含む。一般的なHCVでは、第1804番のアミノ酸はグルタミンであり、第1966番のアミノ酸はグルタミン酸であるが、第1804番のロイシン及び第1966番のリジンと置換されることにより、RNAの複製効率が驚異的に上昇する。そのため、前記RNAを含むキメラウイルスは、タマリンの細胞、若しくは生体内、又はマーモセットの細胞若しくは生体内での複製及び増殖の効率が高いと考えられる。前記のHCVのRNAは、キメラウイルスでない場合でも、タマリンやマーモセットの細胞で複製することができると考えられるが、GBV−BのRNAとのキメラRNAとすることによって、複製効率又は感染効率が上昇すると考えられる。特に、第1804番のロイシン及び第1966番のリジンを含む、HCVの遺伝子型1bのRNAにおいて、複製効率が上昇すると考えられるため、キメラRNAに用いるHCVのRNAは、遺伝子型1bが好ましい。更に、本発明のHCV/GBV−BキメラRNA、又はHCV/GBV−Bキメラウイルスは、Huh−7の細胞における複製機能を有しており、HCVとしての複製機能を維持していると考えられる。そのため、本発明の非ヒト動物は、HCVの予防薬及び治療薬の開発するために有用である。
(A)血清からのRNAの抽出
劇症肝炎患者の急性期に採取した血清250μLより、High Pure Viral Nucleic Acid Kit (Roche diagnostics corporation)を用い、メーカーの推奨する方法に従い、RNAを精製した。
精製したRNAにXR58Rプライマーを加え、SuperSucript II reverse transcriptase (Invitrogen社)により、メーカーの推奨する方法に従い、42℃、1時間逆転写反応を行わせ、cDNAを得た。得られた反応液にRNaseH(Invitrogen)を加え、37℃、30分反応させ、RNAを分解した。この反応液を、HC-LongA1プライマーと1b9405Rプライマー及びTakara LA Taq DNA polymerase (宝酒造)を用い、94℃、20秒、68℃、9分間からなる30回のサーマルサイクル反応によるポリメラーゼチェインリアクション(PCR)を行い、cDNAを増幅した。更に、得られた反応液の一部を、HC85FとHC9302Rプライマーを用いてPCRを行い、HCV cDNAを増幅した。
増幅したDNA断片は、0.7%アガロースゲルを用い電気泳動によって分離し、QIAquick gel purification kit (QIAGEN社)を用い、メーカーの推奨する方法に従って、DNA断片を回収した。回収したDNA断片は、pGEM-T easyベクター(Promega社)と連結反応させ、そのプラスミドによりDH5α株を形質転換した。アンピシリン耐性の形質転換体を選択し、2YT培地を用いて培養した。培養した菌体からWizard Plus SV Miniprep DNA Purification Systemを用いプラスミドを精製した。
HCV cDNAの塩基配列は、HCVの遺伝子型1bの塩基配列に基づいて設計したプライマーを用い、決定した。CEQ DTCS Quick Start Kit(ベックマン・コールター)を用い、メーカーの推奨する方法に従い、反応を行い、CEQ2000 XL DNA analysis system (Software version 4.0.0、ベックマン・コールター)により解析した。得られたデータをSequencher (Version 4.1.2、Gene Codes Corporation)により解析した。得られたHCVクローンをpTPF1-0193と命名した。
更に、前記の(A)の工程で得られたRNAより、5’RACE法により、5’非翻訳領域の末端のcDNAを取得した。5’RACE System for Rapid Amplification of cDNA Ends, Version2.0 (Invitrogen社)のキットを用い、添付の指示書に従って、実施した。
cDNA合成のためのアンチセンスプライマーは、Chiba-asを使用した。SuperScript II Reverse Transcriptase(Invitrogen)でcDNAを合成し、S.N.A.P columnで精製後、cDNAにTdT-tailing反応を行い、dCTPを付加した。キットに添付の5’RACE Abridged Anchorプライマー及びKY78プライマーでTakara LA Taq DNA polymerase(宝酒造)を用いて、1回目のPCRを行った。このPCR産物の一部を鋳型として、キットに添付のUTPプライマーとKM2プライマーで、Takara LA Taq DNA polymerase(宝酒造)を用いて2回目のPCRを行い、PCR産物を得た。このPCR産物をpGEM-T easyベクターにクローニングし、前記(D)の工程に従い、塩基配列を決定した。得られた配列における第1位から第709位までを含むHCV cDNAクローンをpTPF1-0007と命名した。
前記の(A)の工程で得られたRNAより、3’RACE法により、3’非翻訳領域の末端のcDNAを取得した。まず、患者のRNAにPoly(A) Tailing Kit(Ambion)を用いて、添付の指示書に従い、Poly(A)を付加した。XR58Rプライマーの代わりにdT-Adpプライマーを、1st PCRのプライマーとして3UTR-1Fプライマー及びAdpプライマーを、2nd PCRのプライマーとしてXR58F及びAdpプライマーを用いた以外は、前記工程(B)〜(D)の操作を繰り返した。得られたHCV cDNAクローンを pTPF1-8994と命名した。
C型肝炎ウイルスTPF1株の全長のポリヌクレオチドを、pBluescriptIISK(+)のT7 RNAプロモーター配列の下流に挿入した(以下、pTPF1と称する)。
レプリコンRNAの自律複製が起こっていることは、細胞中にHCV RNAの5’UTR領域のマイナス鎖が検出できるか否かで調べた。マイナス鎖の特異的な定量法は特願平08−187097号公報に記載のマイナス鎖RNAの特異的検出法と同様の方法で行った。
pRepTPF-1を鋳型にin vitroで合成したRNAをエレクトロポレーションで導入した細胞から、有意な量のマイナス鎖が検出でき、細胞内においてレプリコンRNAが自律的に複製していることが確認された。
参考例2に従って、pRepTPF1を鋳型にin vitroで合成したRNAをHuh7細胞へトランスフェクションすることで樹立したレプリコンRNA複製細胞株から、ISOGEN(日本ジーン)を用いて、メーカーの推奨する条件に従い細胞内RNAを抽出した。
参考例2において作成した完全長HCV DNA pTPF1を制限酵素SfiIで切断し、その切断部位に、pRep4Bを制限酵素SfiIで切断した断片を連結挿入することで、適応変異が挿入された完全長HCV DNA pTPF1/4Bを作製した。この塩基配列(RNAで 表記)を配列番号57、これがコードするアミノ酸配列を配列番号58に示す。
(1)C156キメラ遺伝子(配列番号55)
ヒト肝がん細胞株で増殖が確認されているHCV遺伝子を含む上記pTPF1/4BをAge Iプライマー5’−GGAACCGGTGAGTACACCGGAATTGCCAGG−3’(配列番号101)とSpl Iプライマーの5’−ACCCGTACGCCATGCGCCAGGGCCCTGGCAG−3’(配列番号102)の存在下で、Takara EX Taq DNA polymerase(宝酒造)を用い、94℃、20秒、68℃、30秒間からなる20回のサーマルサイクル反応によるポリメラーゼチェインリアクション(PCR)を行うことにより、TPF1ゲノムの5’UTRからコア蛋白の156番目までを増幅した。
GBBC−s1(配列番号1):5’−CGTACGCTTGCTGGAGGATGGAGTCAACTGGGCTACTGGTTGGTTCGGTGTCCACCTTTT−3’
GBBCE1−s2(配列番号2):5’−TGTGGTATGTCTGCTATCTTTGGCCTGTCCCTGTAGTGGGGCGCGGGTCACTGACCCAGA−3’
GBBE1−s3(配列番号3):5’−CACAAATACCACAATCCTGACCAATTGCTGCCAGCGTAATCAGGTTATCTATTGTTCTCC−3’
GBBE1−s4(配列番号4):5’−TTCCACTTGCCTACACGAGCCTGGTTGTGTGATCTGTGCGGACGAGTGCTGGGTTCCCGC−3’
GBBE1−s5(配列番号5):5’−CAATCCGTACATCTCACACCCTTCCAATTGGACTGGCACGGACTCCTTCTTGGCTGACCA−3’
GBBE1−s6(配列番号6):5’−CATTGATTTTGTTATGGGCGCTCTTGTGACCTGTGACGCCCTTGACATTGGTGAGTTGTG−3’
GBBE1−s7(配列番号7):5’−TGGTGCGTGTGTATTAGTCGGTGACTGGCTTGTCAGGCACTGGCTTATTCACATAGACCT−3’
GBBE1−s8(配列番号8):5’−CAATGAAACTGGTACTTGTTACCTGGAAGTGCCCACTGGAATAGATCCTGGGTTCCTAGG−3’
GBBE1−s9(配列番号9):5’−GTTTATCGGGTGGATGGCCGGCAAGGTCGAGGCTGTCATCTTCTTGACCAAACTGGCTTC−3’
GBBE1−s10(配列番号10):5’−ACAAGTACCATACGCTATTGCGACTATGTTTAGCAGTGTACACTACCTGGCGGTTGGCGC−3’
GBBE1−s11(配列番号11):5’−TCTGATCTACTATGCCTCTCGGGGCAAGTGGTATCAGTTGCTCCTAGCGCTTATGCTTTA−3’
GBBE12−s12(配列番号12):5’−CATAGAAGCGACCTCTGGAAACCCCATCAGGGTGCCCACTGGATGCTCAATAGCTGAGTT−3’
GBBE2−s13(配列番号13):5’−TTGCTCGCCTTTGATGATACCATGTCCTTGCCACTCTTATTTGAGTGAGAATGTGTCAGA−3’
GBBE2−s14(配列番号14):5’−AGTCATTTGTTACAGTCCAAAGTGGACCAGGCCTATCACTCTAGAGTATAACAACTCCAT−3’
GBBE2−s15(配列番号15):5’−ATCTTGGTACCCCTATACAATCCCTGGTGCGAGGGGATGTATGGTTAAATTCAAAAATAA−3’
GBBE2−s16(配列番号16):5’−CACATGGGGTTGCTGCCGTATTCGCAATGTGCCATCGTACTGCACTATGGGCACTGATGC−3’
GBBE2−s17(配列番号17):5’−AGTGTGGAACGACACTCGCAACACTTACGAAGCATGCGGTGTAACACCATGGCTAACAAC−3’
GBBE2−s18(配列番号18):5’−CGCATGGCACAACGGCTCAGCCCTGAAATTGGCTATATTACAATACCCTGGGTCTAAAGA−3’
GBBE2−s19(配列番号19):5’−AATGTTTAAACCTCATAATTGGATGTCAGGCCATTTGTATTTTGAGGGATCAGATACCCC−3’
GBBE2−s20(配列番号20):5’−TATAGTTTACTTTTATGACCCTGTGAATTCCACTCTCCTACCACCGGAGAGGTGGGCTAG−3’
GBBE2−s21(配列番号21):5’−GTTGCCCGGTACCCCACCTGTGGTACGTGGTTCTTGGTTACAGGTTCCGCAAGGGTTTTA−3’
GBBE2−s22(配列番号22):5’−CAGTGATGTGAAAGACCTAGCCACAGGATTGATCACCAAAGACAAAGCCTGGAAAAATTA−3’
GBBE2−s23(配列番号23):5’−TCAGGTCTTATATTCCGCCACGGGTGCTTTGTCTCTTACGGGAGTTACCACCAAGGCCGT−3’
GBBE2−s24(配列番号24):5’−GGTGCTAATTCTGTTGGGGTTGTGTGGCAGCAAGTATCTTATTTTAGCCTACCTCTGTTA−3’
GBBE2P6−s25(配列番号25):5’−CTTGTCCCTTTGTTTTGGGCGCGCTTCTGGTTACCCTTTGCGTCCTGTGCTCCCATCCCA−3’
GBBP6−s26(配列番号26):5’−GTCGTATCTCCAAGCTGGCTGGGATGTTTTGTCTAAAGCTCAAGTAGCTCCTTTTGCTTT−3’
GBBP6−s27(配列番号27):5’−GATTTTCTTCATCTGTTGCTATCTCCGCTGCAGGCTACGTTATGCTGCCCTTTTAGGGTT−3’
GBBP6−as1(配列番号28):5’−GCCCGCAGCCATGGGCACAAACCCTAAAAGGGCAGCATAACGTAGCCTG−3’
GBBP6−as2(配列番号29):5’−CAGCGGAGATAGCAACAGATGAAGAAAATCAAAGCAAAAGGAGCTACTTGAGCTTTAGAC−3’
GBBP6−as3(配列番号30):5’−AAAACATCCCAGCCAGCTTGGAGATACGACTGGGATGGGAGCACAGGACGCAAAGGGTAA−3’
GBBE2−as4(配列番号31):5’−CCAGAAGCGCGCCCAAAACAAAGGGACAAGTAACAGAGGTAGGCTAAAATAAGATACTTG−3’
GBBE2−as5(配列番号32):5’−CTGCCACACAACCCCAACAGAATTAGCACCACGGCCTTGGTGGTAACTCCCGTAAGAGAC−3’
GBBE2−as6(配列番号33):5’−AAAGCACCCGTGGCGGAATATAAGACCTGATAATTTTTCCAGGCTTTGTCTTTGGTGATC−3’
GBBE2−as7(配列番号34):5’−AATCCTGTGGCTAGGTCTTTCACATCACTGTAAAACCCTTGCGGAACCTGTAACCAAGAA−3’
GBBE2−as8(配列番号35):5’−CCACGTACCACAGGTGGGGTACCGGGCAACCTAGCCCACCTCTCCGGTGGTAGGAGAGTG−3’
GBBE2−as9(配列番号36):5’−GAATTCACAGGGTCATAAAAGTAAACTATAGGGGTATCTGATCCCTCAAAATACAAATGG−3’
GBBE2−as10(配列番号37):5’−CCTGACATCCAATTATGAGGTTTAAACATTTCTTTAGACCCAGGGTATTGTAATATAGCC−3’
GBBE2−as11(配列番号38):5’−AATTTCAGGGCTGAGCCGTTGTGCCATGCGGTTGTTAGCCATGGTGTTACACCGCATGCT−3’
GBBE2−as12(配列番号39):5’−TCGTAAGTGTTGCGAGTGTCGTTCCACACTGCATCAGTGCCCATAGTGCAGTACGATGGC−3’
GBBE2−as13(配列番号40):5’−ACATTGCGAATACGGCAGCAACCCCATGTGTTATTTTTGAATTTAACCATACATCCCCTC−3’
GBBE2−as14(配列番号41):5’−GCACCAGGGATTGTATAGGGGTACCAAGATATGGAGTTGTTATACTCTAGAGTGATAGGC−3’
GBBE2−as15(配列番号42):5’−CTGGTCCACTTTGGACTGTAACAAATGACTTCTGACACATTCTCACTCAAATAAGAGTGG−3’
GBBE2−as16(配列番号43):5’−CAAGGACATGGTATCATCAAAGGCGAGCAAAACTCAGCTATTGAGCATCCAGTGGGCACC−3’
GBBE21−as17(配列番号44):5’−CTGATGGGGTTTCCAGAGGTCGCTTCTATGTAAAGCATAAGCGCTAGGAGCAACTGATAC−3’
GBBE1−as18(配列番号45):5’−CACTTGCCCCGAGAGGCATAGTAGATCAGAGCGCCAACCGCCAGGTAGTGTACACTGCTA−3’
GBBE1−as19(配列番号46):5’−AACATAGTCGCAATAGCGTATGGTACTTGTGAAGCCAGTTTGGTCAAGAAGATGACAGCC−3’
GBBE1−as20(配列番号47):5’−TCGACCTTGCCGGCCATCCACCCGATAAACCCTAGGAACCCAGGATCTATTCCAGTGGGC−3’
GBBE1−as21(配列番号48):5’−ACTTCCAGGTAACAAGTACCAGTTTCATTGAGGTCTATGTGAATAAGCCAGTGCCTGACA−3’
GBBE1−as22(配列番号49):5’−AGCCAGTCACCGACTAATACACACGCACCACACAACTCACCAATGTCAAGGGCGTCACAG−3’
GBBE1−as23(配列番号50):5’−GTCACAAGAGCGCCCATAACAAAATCAATGTGGTCAGCCAAGAAGGAGTCCGTGCCAGTC−3’
GBBE1−as24(配列番号51):5’−CAATTGGAAGGGTGTGAGATGTACGGATTGGCGGGAACCCAGCACTCGTCCGCACAGATC−3’
GBBE1−as25(配列番号52):5’−ACACAACCAGGCTCGTGTAGGCAAGTGGAAGGAGAACAATAGATAACCTGATTACGCTGG−3’
GBBE1C−as26(配列番号53):5’−CAGCAATTGGTCAGGATTGTGGTATTTGTGTCTGGGTCAGTGACCCGCGCCCCACTACAG−3’
GBBC−as27(配列番号54):5’−GGACAGGCCAAAGATAGCAGACATACCACAAAAAGGTGGACACCGAACCAACCAGTAGCCCA−3’
pTPF1/4Bを前述のAge IプライマーとEcoR V(v11)プライマーの5’−GATATCGTACAGCCCGGATACGTTGCGCAC−3’(配列番号103)の存在下で、Takara EX Taq DNA polymerase(宝酒造)を用い、94℃、20秒、68℃、30秒間からなる20回のサーマルサイクル反応によるPCRを行うことにより、TPF1ゲノムの5’UTRからE1蛋白の11番目までを増幅した。この増幅産物を実施例1でHCV遺伝子断片(pTPF1−AgeSpl)を取得したのと同様の手法を用いpGEM−Teasyベクターと連結反応を行い、常法に従い配列を決定した。その結果、pTPF1−AgeEcoR(v11)の塩基配列を確認した。
上記pTPF1/4Bを前述のAge IプライマーとEcoR V(v27)プライマーの5’−GATATCCGCTGCCTCATACACAATGCTTGA−3’(配列番号106)の存在下で、Takara EX Taq DNA polymerase(宝酒造)を用い、94℃、20秒、68℃、90秒間からなる20回のサーマルサイクル反応によるPCRを行うことにより、TPF1ゲノムの5’UTRからE1蛋白の27番目までを増幅した。この増幅産物を実施例1でHCV遺伝子断片(pTPF1−AgeSpl)を取得したのと同様の手法を用いpGEM−Teasyベクターと連結反応を行い、常法に従い配列を決定した。その結果、pTPF1−AgeEcoR(v27)の塩基配列を確認した。
TPF1の5‘UTRを有するGBV−Bのコア蛋白からE1の125番目までの遺伝子を以下の合成遺伝子を用いて構築した。
GBBC−s28(配列番号59):5‘−ACCGGTGAGTACACCGGAATTGCCAGGACGACCGGGTCCTTTCTTGGATCAACCCGCTCA−3’
GBBC−s29(配列番号60):5‘−ATGCCTGGAGATTTGGGCGTGCCCCCGCGAGACTGCTAGCCGAGTAGTGTTGGGTCGCGA−3’
GBBC−s30(配列番号61):5‘−AAGGCCTTGTGGTACTGCCTGATAGGGTGCTTGCGAGTGCCCCGGGAGGTCTCGTAGACC−3’
GBBC−s31(配列番号62):5‘−GTGCATCATGCCTGTTATTTCTACTCAAACAAGTCCTGTACCTGCGCCCAGAACGCGCAA−3’
GBBC−s32(配列番号63):5‘−GAACAAGCAGACGCAGGCTTCATATCCTGTGTCCATTAAAACATCTGTTGAAAGGGGACA−3’
GBBC−s33(配列番号64):5‘−ACGAGCAAAGCGCAAAGTCCAGCGCGATGCTCGGCCTCGTAATTACAAAATTGCTGGTAT−3’
GBBC−s34(配列番号65):5‘−CCATGATGGCTTGCAGACATTGGCTCAGGCTGCTTTGCCAGCTCATGGTTGGGGACGCCA−3’
GBBC−s35(配列番号66):5‘−AGACCCTCGCCATAAGTCTCGCAATCTTGGAATCCTTCTGGATTACCCTTTGGGGTGGAT−3’
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GBBC−as43(配列番号91):5‘−GTACCACAAGGCCTTTCGCGACCCAACACTACTCGGCTAGCAGTCTCGCGGGGGCACGCC−3’
GBBC−as44(配列番号92):5‘−CAAATCTCCAGGCATTGAGCGGGTTGATCCAAGAAAGGACCCGGTCGTCCTGGCAATTCC−3’
実施例1において構築したpTPF/GBB−C156E12をXhoIで切断し、それを鋳型に、Megascript T7 kit(Ambion)又はAmpliScribe T7−Flash transcription kit(Epicentre)を用いてRNAを合成した。メーカーの推奨する方法にてRNAを精製した。
実施例2においてHuh7細胞において複製可能であったHCV/GBV−Bキメラ遺伝子型が、マーモセット初代肝臓細胞において複製可能か評価を試みた。実施例2と同様の方法を用いてpTPF/GBB−C156E12のRNAを合成した。
実施例1において構築したpTPF/GBB−C156E12、pTPF1/GBB−v11E12、pTPF/GBB−v27E12およびpTPF/GBB−C6をXhoIで切断し、実施例2と同様の方法を用いてRNAを合成した。
Claims (19)
- C型肝炎ウイルスのRNA及びGBウイルス−BのRNAを含むHCV/GBV−BキメラRNAであって、前記C型肝炎ウイルスのRNAが、C型肝炎ウイルスのポリプロテインのアミノ酸配列における第1804番のロイシン及び第1966番のリジンを含むNS4Bタンパク質をコードするRNAを含むことを特徴とする、HCV/GBV−BキメラRNA。
- (A)C型肝炎ウイルスの、5’非翻訳領域のRNAを含むHCV−5’側RNA、
(B)GBウイルス−Bの、E1タンパク質及びE2タンパク質をコードするRNAを含むGBV−B−RNA、並びに
(C)C型肝炎ウイルスの、NS3タンパク質、NS4Aタンパク質、NS4Bタンパク質、NS5Aタンパク質及びNS5Bタンパク質をコードするRNA、並びに3’非翻訳領域のRNAを含むHCV−3’側RNA、
を含み、前記HCV−5’側RNA(A)及びHCV−3’側RNA(C)の間に、GBV−B−RNA(B)が挿入される、請求項1に記載のHCV/GBV−BキメラRNA。 - 前記HCV−5’側RNA(A)が、5’非翻訳領域のRNA及びコアタンパク質の一部又は全部をコードするRNAを含み、
前記GBV−B−RNA(B)が、コアタンパク質の一部、E1タンパク質、E2タンパク質、及びp6タンパク質をコードするRNAを含み、
前記HCV−3’側RNA(C)が、p7タンパク質、NS2タンパク質、NS3タンパク質、NS4Aタンパク質、NS4Bタンパク質、NS5Aタンパク質及びNS5Bタンパク質をコードするRNA、並びに3’非翻訳領域のRNAを含む、
請求項2に記載のHCV/GBV−BキメラRNA。 - 前記HCV−5’側RNA(A)及び前記HCV−3’側RNA(C)が、それぞれ、配列番号57で示される塩基配列の相当する領域の塩基配列、又は該塩基配列と95%以上の相同性を有する塩基配列を有し、霊長類の肝臓細胞内で増殖可能なウイルス粒子をコードする請求項1〜3のいずれか1項に記載のHCV/GBV−BキメラRNA。
- 前記GBV−B−RNA(B)が、コアタンパク質の全部、E1タンパク質、E2タンパク質、及びp6タンパク質をコードするRNAを含み、
前記HCV−3’側RNA(C)が、NS3タンパク質、NS4Aタンパク質、NS4Bタンパク質、NS5Aタンパク質及びNS5Bタンパク質をコードするRNA、並びに3’非翻訳領域のRNAを含む、
請求項2に記載のHCV/GBV−BキメラRNA。 - (A)C型肝炎ウイルスの、5’非翻訳領域のRNA並びにコアタンパク質及びE1タンパク質の一部をコードするRNAを含むHCV−5’側RNA、
(B)GBウイルス−Bの、E1タンパク質の一部及びE2タンパク質をコードするRNAを含むGBV−B−RNA、並びに
(C)C型肝炎ウイルスの、NS3タンパク質、NS4Aタンパク質、NS4Bタンパク質、NS5Aタンパク質及びNS5Bタンパク質をコードするRNA、並びに3’非翻訳領域のRNAを含むHCV−3’側RNA、
を含み、前記HCV−5’側RNA(A)及びHCV−3’側RNA(C)の間に、GBV−B−RNA(B)が挿入され、前記HCV−5’側RNA(A)によりコードされるE1タンパク質の一部は、E1タンパク質のN末端側の一部分であり、前記GBV−B−RNA(B)によりコードされるE1タンパク質の一部は、E1タンパク質のC末端側の一部分であり、これらの両方の部分の融合によりE1タンパク質の全長がカバーされる、請求項1に記載のHCV/GBV−BキメラRNA。 - 前記HCV−5’側RNA(A)によりコードされるE1タンパク質の一部は、E1タンパク質のN末端から30アミノ酸以下の領域である請求項4記載のHCV/GBV−BキメラRNA。
- 前記HCV−3’側RNA(C)が、p7タンパク質、NS2タンパク質、NS3タンパク質、NS4Aタンパク質、NS4Bタンパク質、NS5Aタンパク質及びNS5Bタンパク質をコードするRNA、並びに3’非翻訳領域のRNAを含む、請求項5又は6記載のHCV/GBV−BキメラRNA。
- 前記HCV−5’側RNA(A)及び前記HCV−3’側RNA(C)が、それぞれ、配列番号57で示される塩基配列の相当する領域の塩基配列、又は該塩基配列と95%以上の相同性を有する塩基配列を有し、前記GBV−B−RNA(B)が、配列番号99で示される塩基配列の相当する領域の塩基配列、又は該塩基配列と95%以上の相同性を有する塩基配列を有し、霊長類の肝臓細胞内で増殖可能なウイルス粒子をコードする請求項5〜8のいずれか1項に記載のHCV/GBV−BキメラRNA。
- 配列番号55で表される塩基配列からなるRNAである、請求項3記載のHCV/GBV−BキメラRNA。
- 配列番号93、95若しくは97で表される塩基配列、又はこれらの塩基配列と95%以上の相同性を有する塩基配列を含み、霊長類の肝臓細胞内で増殖可能なウイルス粒子をコードする請求項1記載のHCV/GBV−BキメラRNA。
- 配列番号93、95又は97で表される塩基配列からなるRNAである、請求項11記載のHCV/GBV−BキメラRNA。
- 請求項1〜12のいずれか一項に記載のHCV/GBV−BキメラRNAの相補的なHCV/GBV−Bマイナス鎖キメラRNA。
- 請求項1〜12のいずれか一項に記載のHCV/GBV−BキメラRNAを含むHCV/GBV−Bキメラウイルス。
- 請求項1〜12のいずれか一項に記載のHCV/GBV−BキメラRNAをコードする、HCV/GBV−BキメラDNA。
- 請求項15に記載のDNAを含むベクター。
- 請求項1〜12のいずれか一項に記載のRNA又は請求項12に記載のDNAから翻訳されるHCV/GBV−Bキメラタンパク質。
- 請求項1〜12のいずれか一項に記載のHCV/GBV−BキメラRNAを含む、HCV/GBV−BキメラRNA複製細胞。
- 請求項1〜12のいずれか一項に記載のHCV/GBV−BキメラRNA、又は請求項11に記載のHCV/GBV−Bキメラウイルスを接種された非ヒト動物。
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