JP2005528885A - Ｇｂウイルスｂレプリコン及びレプリコン強化細胞 - Google Patents

Abstract

本発明はＧＢＶ−Ｂレプリコンとレプリコン強化細胞に関する。ＧＢＶ−Ｂレプリコンは培養細胞で自律複製し、検出可能なレベルの１種以上のＧＢＶ−Ｂ蛋白質を産生することが可能なＲＮＡ分子である。ＧＢＶ−Ｂレプリコン強化細胞はＧＢＶ−Ｂレプリコンを維持する能力を高めた細胞である。

Description

本発明はＧＢウイルスＢレプリコンとレプリコン強化細胞に関する。

本願は参考資料として本明細書に組込む２００２年６月６日付け米国仮出願第６０／３８６，６５５号と２００２年１月１５日付け米国仮出願第６０／３４８，５７３号の優先権を主張する。

本明細書全体に引用する文献は本発明の先行技術とは認められない。

世界人口の約３％がＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）に感染していると推定される（Ｗａｓｌｅｙら，Ｓｅｍｉｎ．Ｌｉｖｅｒ Ｄｉｓ．２０：１−１６，２０００．）。ＨＣＶに暴露されると、ごく一部の症例では顕在的急性疾患を発症するが、殆どの場合にウイルスは慢性感染となり、肝炎症を誘発し、ゆっくりと進行して肝不全や肝硬変に至る（Ｓｔｒａｄｅｒら，ＩＬＡＲ Ｊ．４２：１０７−１１６，２００１．）。疫学調査によると、ＨＣＶは肝細胞癌の発症に重要な役割を果たすらしい（Ｓｔｒａｄｅｒら，ＩＬＡＲ Ｊ．４２：１０７−１１６，２００１．）。

ＨＣＶと抗ウイルス化合物の効果の調査は小動物モデルの不在により困難である。ＨＣＶはヒトとチンパンジーに感染するが、マウスやラット等の小動物には感染しない。

ＧＢウイルスＢ（ＧＢＶ−Ｂ）はタマリンやヨザル等の種々の新世界ザルに感染することができる（Ｂｕｋｈら，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ６５：６９４−６９７，２００１．）。ＧＢＶ−ＢはＨＣＶと抗ウイルス化合物の効果を研究するための代理モデルとして提案されている（Ｔｒａｂｏｎｉ，国際公開第ＷＯ／７３４６６号，国際公開日：２０００年１２月７日，Ｂｕｋｈら，国際公開第ＷＯ／７５３３７号，国際公開日：２０００年１２月１４日．）。

タマリンにおけるＧＢＶ−Ｂ実験から抗ＨＣＶ薬の研究に有用な情報を得るという仮説はウイルス蛋白質の酵素活性及び未翻訳領域の役割に関するデータと、ｉｎ ｖｉｖｏ感染性ｃＤＮＡの同定及び細胞感染系の確立により裏付けられている（例えば、Ｂｅａｍｅｓら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７４：１１７６４−１１７７２，２０００，Ｔｒａｂｏｎｉら，Ｔｈｅ ＧＢ ｖｉｒｕｓｅｓ：ａ ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ ｓｕｒｖｅｙ．Ｉｎ Ｓ．Ｇ．Ｐａｎｄａｌａｉ（ｅｄ．），Ｒｅｃｅｎｔ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ ｉｎ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，ｐａｒｔ ＩＩＩ．Ｔｒａｎｓｗｏｒｌｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｎｅｔｗｏｒｋ，１９９９．参照）。

１９９５年にＧＢＶ−Ｂが発見されて以来、ＨＣＶとＧＢＶ−Ｂのゲノム機構の類似性は注目されている（Ｍｕｅｒｈｏｆｆら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６９：５６２１−５６３０，１９９５．）。まず、ＮＳ３プロテアーゼの酵素活性に基づいて機能的レベルでの類似性が実験により実証された（Ｓｃａｒｓｅｌｌｉら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１：４９８５−４９８９，１９９７．）。その後、種々のＨＣＶ及びＧＢＶ−Ｂ領域で分析が行われている。

ＨＣＶとＧＢＶ−Ｂ ＮＳ３蛋白質のポリプロテインプロセシング及び機能的関係に関する研究によると、オーバーラップする特異性とウイルス特異的ＮＳ４Ａ補因子要求性が示されている（Ｂｕｔｋｉｅｗｉｃｚら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７４：４２９１−４３０１，２０００，Ｓｂａｒｄｅｌｌａｔｉら，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．８１ Ｐｔ ９：２１８３−２１８８，２０００．）。

ＧＢＶ−Ｂ ＮＳ３蛋白質のＣ末端ドメインに結び付けられるヘリケース及びＮＴＰアーゼ活性はＨＣＶと同等であることが報告されている（Ｚｈｏｎｇら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ．２６１：２１６−２２６，１９９９．）。

ＧＢＶ−ＢＮＳ５ＢとＨＣＶＮＳ５Ｂの短縮形によりコードされるＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ活性は類似性を示した（Ｚｈｏｎｇら，Ｊ．Ｖｉｒａｌ Ｈｅｐａｔ．７：３３５−３４２，２０００．）。

ＨＣＶ及びＧＢＶ−Ｂ ５’及び３’未翻訳領域はヘリケースやＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ等のウイルス蛋白質との相互作用により複製プロセスの開始に重要な役割を果たす。ＨＣＶ及びＧＢＶ−Ｂ ５’及び３’未翻訳領域は共通特徴を含む。ＧＢＶ−Ｂの５’−ＵＴＲを含む内部リボソーム結合部位はＨＣＶと構造及び機能的類似性を示す（Ｇｒａｃｅら，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．８０：２３３７−２３４１，１９９９，Ｒｉｊｎｂｒａｎｄら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７４：７７３−７８３，２０００，Ｒｉｊｎｂｒａｎｄら，Ｒｎａ．７：５８５−５９７，２００１．）。ＧＢＶ−Ｂ ３’ＵＴＲの３’末端はＨＣＶに類似する二次構造で配置され、複製とｉｎ ｖｉｖｏ感染に重要である（Ｂｕｋｈら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２６２：４７０−４７８，１９９９，Ｓｂａｒｄｅｌｌａｔｉら，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７３：１０５４６−１０５５０，１９９９，Ｓｂａｒｄｅｌｌａｔｉら，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．８２：２４３７−２４４８，２００１．）。

本発明はＧＢＶ−Ｂレプリコンとレプリコン強化細胞に関する。ＧＢＶ−Ｂレプリコンは培養細胞で自律複製し、検出可能なレベルの１種以上のＧＢＶ−Ｂ蛋白質を産生することが可能なＲＮＡ分子である。ＧＢＶ−Ｂレプリコン強化細胞はＧＢＶ−Ｂレプリコンを維持する能力を高めた細胞である。

配列番号１や配列番号２等のＧＢＶ−Ｂ配列に基づき、機能的ＧＢＶ−Ｂゲノム及びサブゲノムレプリコンを得ることができる。配列番号１は細胞で複製可能であるとして本明細書に例証する２シストロンサブゲノムレプリコン配列を示す。配列番号２はタマリンで感染性のゲノムＧＢＶ−ＢレプリコンのｃＤＮＡ配列を示す。

ＧＢＶ−Ｂレプリコン強化細胞はＧＢＶ−Ｂレプリコンを維持することが可能な細胞を選択し、細胞からレプリコンを除去することにより作製することができる。レプリコン強化細胞は後期トランスフェクションでレプリコンを維持する能力が増加している。後期トランスフェクションで使用するレプリコンはレプリコン強化細胞を作製するために使用したレプリコンと異なるものでもよい。例えば、選択／レポーター配列を含む２シストロンＧＢＶ−Ｂレプリコンを使用して強化細胞を得ることができ、このような選択／レポーター配列を含まない第２のレプリコン（例えば全長感染性レプリコン）をレプリコン強化細胞に導入することができる。

従って、本発明の第１の側面は以下の領域：
配列番号１の塩基１−４４５に実質的に類似するＧＢＶ−Ｂ ５’ＵＴＲ；
ＧＢＶ−Ｂ ５’ ＵＴＲに機能的に連結した選択又はレポーター配列；
内部リボソーム結合部位；
内部リボソーム結合部位とＡＵＧ翻訳開始コドンに機能的に連結した配列番号１の塩基１９３８−７７０９に実質的に類似するＮＳ３−ＮＳ５Ｂ配列；及び
配列番号１の塩基７７１０−８０６９に実質的に類似するＧＢＶ−Ｂ ３’ＵＴＲを含む細胞で複製することが可能なＧＢＶ−Ｂレプリコンに関する。

「以下の領域を含む」と言う場合には、指定領域が存在するが、付加領域も存在していてもよいことを意味する。付加領域は５’ＧＢＶ−Ｂ ＵＴＲとＧＢＶ−Ｂ ３’ＵＴＲの間の位置に配置されることが好ましい。しかし、付加領域は例えば５’ＧＢＶ−Ｂ ＵＴＲの５’に配置された付加シストロンでもよい。

好ましい付加領域はＧＢＶ−Ｂ構造領域とＧＢＶ−Ｂ ＮＳ２領域である。付加領域は部分コア領域や完全構造ＧＢＶ−Ｂ領域のように種々の寸法とすることができ、１領域にまとめて配置することができる。例えば、ＮＳ２領域は構造領域の３’末端に配置することができる。

種々のレプリコン位置に付加領域が存在していてもよい。種々の位置の例としては、ＧＢＶ−Ｂ ５’ＵＴＲを含むシストロンに構造領域及び／又はＮＳ２領域を配置したり、ＮＳ３−ＮＳ５Ｂを含むシストロンに構造領域及び／又はＮＳ２領域を配置することが挙られる。

「機能的に連結」と言う場合には、第１のヌクレオチド配列が第２のヌクレオチド配列に及ぼす効果を媒介できることを意味する。機能的に連結と言う場合には、連結された配列が相互に隣接している必要はない。ＧＢＶ−Ｂ ５’−ＵＴＲと内部リボソーム結合部位はそれらを連結した配列のリボソーム結合及び／又は翻訳を助長する。ＧＢＶ−Ｂ ３’ ＵＴＲはレプリコン複製に重要である。

本発明の別の側面は本明細書に記載するＧＢＶ−Ｂレプリコンをコードするヌクレオチド配列に転写可能に連結されたプロモーターを含む発現ベクターに関する。

本発明の別の側面はＧＢＶ−Ｂレプリコンを細胞にトランスフェクトする段階と、前記レプリコンを単離する段階を含む方法により作製されたＧＢＶ−Ｂレプリコンに関する。

本発明の別の側面は第１のＧＢＶ−Ｂレプリコンから第２のＧＢＶ−Ｂレプリコンを作製する方法に関し、（ａ）第１のレプリコンを細胞にトランスフェクトする段階と、（ｂ）トランスフェクト細胞からレプリコンを単離する段階と、（ｃ）トランスフェクト細胞からのレプリコンのヌクレオチド配列を決定する段階と、（ｄ）トランスフェクト細胞レプリコン配列に対応する１カ所以上の変異を第１のレプリコン配列に加えた第２のレプリコンを作製する段階を含む。第２のレプリコンはトランスフェクト細胞レプリコン配列と同一配列をもつことが好ましい。

本発明の別の側面は化合物がＧＢＶ−Ｂレプリコン活性を変化させる能力の測定方法に関する。本方法はＧＢＶ−Ｂレプリコンを含む細胞に化合物を添加する段階と、ＧＢＶ−Ｂ活性に及ぼす効果の指標として化合物が１種以上のレプリコン活性を変化させる能力を測定する段階を含む。

本発明の別の側面はＧＢＶ−Ｂレプリコン強化細胞に関し、前記細胞はエレクトロポレーション法により配列番号１のＧＢＶ−Ｂレプリコンをトランスフェクトした場合に少なくとも２５％の維持及び活性効率をもつ。

「エレクトロポレーション法」とは下記実施例１に記載するトランスフェクション方法を意味する。レプリコン強化細胞は特定細胞型から又は特定技術により作製する必要はないが、エレクトロポレーション法を使用して配列番号１のＧＢＶ−Ｂレプリコンをトランスフェクションした場合に少なくとも２５％の維持及び活性効率を属性としてもつ。

少なくとも２５％の維持及び活性効率とは、エレクトロポレーション法で使用した細胞の少なくとも２５％が機能的レプリコンを維持することを意味する。種々の態様において、維持及び活性効率は少なくとも３５％、少なくとも５０％、又は少なくとも７５％である。

好ましいレプリコン強化細胞はＨｕｈ７又はＨｅｐ３Ｂ由来細胞である。「由来細胞」は特定細胞（例えばＨｕｈ７又はＨｅｐ３Ｂ）から出発して１種以上の表現型又は遺伝子型変異を選択、導入又は形成することにより作製された細胞である。

本発明の別の側面はＧＢＶ−Ｂレプリコン強化細胞の作製方法に関する。本方法は（ａ）ＧＢＶ−Ｂレプリコンを細胞に導入及び維持する段階と、（ｂ）細胞からレプリコンを除去する段階を含む。

本発明の別の側面は（ａ）ＧＢＶ−Ｂレプリコンを細胞に導入及び維持する段階と、（ｂ）細胞からレプリコンを除去する段階を含む方法により作製されたＧＢＶ−Ｂレプリコン強化細胞に関する。

本発明の別の側面はＧＢＶ−Ｂレプリコンを含むＧＢＶ−Ｂレプリコン強化細胞の作製方法に関する。本方法はレプリコン強化細胞を作製する段階と、ＧＢＶ−Ｂレプリコンを細胞に導入及び維持する段階を含む。

本発明の別の側面はレプリコン強化細胞を作製する段階と、ＧＢＶ−Ｂレプリコンを細胞に導入及び維持する段階を含む方法により作製されたＧＢＶ−Ｂレプリコンを含むＧＢＶ−Ｂレプリコン強化細胞に関する。

本発明の別の側面はＧＢＶ−Ｂレプリコンを含むＧＢＶ−Ｂレプリコン強化細胞を使用して化合物がＧＢＶ−Ｂレプリコン活性を変化させる能力を測定する方法に関する。本方法は化合物を細胞に添加する段階と、ＧＢＶ−Ｂレプリコン活性に及ぼす効果の指標として前記化合物が１種以上のレプリコン活性を変化させる能力を測定する段階を含む。

本発明の別の側面は感染性ＧＢＶ−Ｂビリオンの作製方法に関する。本方法はＧＢＶ−Ｂビリオンをコードするレプリコンを含むレプリコン強化細胞を増殖させてＧＢＶ−Ｂビリオンを産生させる段階を含む。

本発明の別の側面は動物にＧＢＶ−Ｂビリオンを感染させる方法に関する。本方法はビリオンを作製する段階と、ビリオンを動物に投与する段階を含む。

本発明の別の側面はキメラＧＢＶ−Ｂ／ＨＣＶレプリコンの作製方法に関する。本方法は本明細書に記載するレプリコンに存在する１個以上のＧＢＶ−Ｂ領域又はその一部を対応するＨＣＶ由来領域で置換する段階を含む。

本発明の他の特徴と利点は各種実施例を含む以下の付加説明から自明である。後記実施例は本発明の実施に有用な各種要素と手法を例証する。実施例は特許請求の範囲に記載する発明を限定するものではない。本開示に基づき、当業者は本発明の実施に有用な他の要素と手法を認識し、利用することができる。

（図面の簡単な説明）
図１Ａ−１Ｆはｎｅｏ−ＲｅｐＤレプリコン配列（配列番号１）を示す。ヌクレオチド番号１は第１番目のＧＢＶ−Ｂゲノムである。コア領域は大文字で示す。ＧＢＶ−Ｂ領域の近似位置は以下の通りである。
１−４４５：ＧＢＶ−Ｂ ５’非翻訳領域であり、コア−ｎｅｏ融合蛋白質の翻訳を行う；
４４６−１３１５（停止コドンを含む）：コア−ｎｅｏ融合蛋白質、選択マーカー；
１３２４−１９３４：脳心筋炎ウイルスの内部リボソーム結合部位であり、ＧＢＶ−Ｂ ＮＳ領域の翻訳を行う；
１９３５−７７０９：非構造蛋白質３から非構造蛋白質５ＢまでのＧＢＶ−Ｂポリプロテインであり、ＡＵＧ開始コドンを含む；
１９３８−３７９７（推定）：非構造蛋白質３（ＮＳ３），ＮＳ３プロテアーゼ／ヘリケース；
３７９８（推定）−３９６２：非構造蛋白質４Ａ（ＮＳ４Ａ），ＮＳ３プロテアーゼ補因子；
３９６３−４７０６（推定）：非構造蛋白質４Ｂ（ＮＳ４Ｂ）；
４７０７（推定）−５９３９：非構造蛋白質５Ａ（ＮＳ５Ａ）；
５９４０−７７０９（停止コドンを除く）：非構造蛋白質５Ｂ（ＮＳ５Ｂ）；ＧＢＶ−Ｂ ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ；及び
７７１０−８０６９：ＧＢＶ−Ｂ ３’非翻訳領域。

図２Ａ−２Ｇはタマリンで感染性の全長ＧＢＶ−Ｂレプリコン配列のｃＤＮＡ（配列番号２）を示す（Ｓｂａｒｄｅｌｌａｔｉら，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．８２：２４３７−２４４８，２００１）。ＧＢＶ−Ｂ領域の近似位置は以下の通りである。
１−４４５：ＧＢＶ−Ｂ ５’非翻訳領域であり、ＧＢＶ−Ｂポリプロテインの翻訳を行う；
４４６−９０３７：コア蛋白質から非構造蛋白質５ＢまでのＧＢＶ−Ｂポリプロテイン；
４４６−９１９（推定）：構造蛋白質コア、ヌクレオキャプシド蛋白質；
９２０（推定）−１４８９（推定）：構造蛋白質Ｅ１，エンベロープ蛋白質；
１４９０（推定）−２６４１（推定）：構造蛋白質Ｅ２，エンベロープ蛋白質；
２６４２（推定）−３２６５：非構造蛋白質２（ＮＳ２）；
３２６６−５１２５（推定）：非構造蛋白質３（ＮＳ３），ＧＢＶ−Ｂ ＮＳ３プロテアーゼ／ヘリケース；
５１２６（推定）−５２８９：非構造蛋白質４Ａ（ＮＳ４Ａ），ＮＳ３プロテアーゼ補因子；
５２９０−６０３４（推定）：非構造蛋白質４Ｂ（ＮＳ４Ｂ）；
６０３５（推定）−７２６７：非構造蛋白質５Ａ（ＮＳ５Ａ）；
７２６８−９０３７（停止コドンを除く）：非構造蛋白質５Ｂ（ＮＳ５Ｂ）；ＧＢＶ−Ｂ ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ；及び
９０３８−９３９７：ＧＢＶ−Ｂ ３’非翻訳領域。

図３Ａ−３Ｃはタマリンで感染性の全長ＧＢＶ−Ｂレプリコン配列のアミノ酸配列（配列番号３）を示す（Ｓｂａｒｄｅｌｌａｔｉら，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．８２：２４３７−２４４８，２００１）。ＧＢＶ−Ｂ領域の近似位置は以下の通りである。
１−１５８（推定）：構造蛋白質コア、ヌクレオキャプシド蛋白質；
１５９（推定）−３４８（推定）：構造蛋白質Ｅ１，エンベロープ蛋白質；
３４９（推定）−７３２（推定）：構造蛋白質Ｅ２，エンベロープ蛋白質；
７３３（推定）−９４０：非構造蛋白質２（ＮＳ２）；
９４１−１５６０（推定）：非構造蛋白質３（ＮＳ３），ＧＢＶ−Ｂ ＮＳ３プロテアーゼ／ヘリケース；
１５６１（推定）−１６１５：非構造蛋白質４Ａ（ＮＳ４Ａ），ＮＳ３プロテアーゼ補因子；
１６１６−１８６３（推定）：非構造蛋白質４Ｂ（ＮＳ４Ｂ）；
１８６４（推定）−２２７４：非構造蛋白質５Ａ（ＮＳ５Ａ）；及び
２２７５−２８６４：非構造蛋白質５Ｂ（ＮＳ５Ｂ）；ＧＢＶ−Ｂ ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ。

図４はＧＢＶ−Ｂ ｎｅｏ−ＲｅｐＡ、ｎｅｏ−ＲｅｐＢ、ｎｅｏ−ＲｅｐＣ及びｎｅｏ−ＲｅｐＤ構築物の模式図である。図面の下段のヌクレオチド配列はＧＢＶ−Ｂ ５’ＵＴＲの３’末端、部分コアコーディング配列、制限部位を形成して部分コア配列の同一翻訳枠にその後のネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子配列を挿入するために加えたヌクレオチド、及びネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子配列の５’末端に対応する。ｎｅｏ−ＲｅｐＡ、ｎｅｏ−ＲｅｐＢ、ｎｅｏ−ＲｅｐＣ及びｎｅｏ−ＲｅｐＤ構築物に対応する上記配列を夫々配列番号４、５、６及び７として示す。ＧＢＶ−Ｂ ５’−ＵＴＲに属する配列を下線で示し、翻訳ＧＢＶ−Ｂ配列に相当する配列を太字で示し、挿入したＰｍｅＩ制限部位に対応する配列を斜体で示し、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子に対応する配列を普通文字で示す。翻訳配列はヌクレオチドトリプレットで表し、対応するアミノ酸を各同族ヌクレオチド配列の下に示す（配列番号８、９、１０及び１１）。

図５はＧＢＶ−Ｂ及びＨＣＶレプリコンの複製に及ぼすヒトα−ＩＦＮの効果を示す。Ｈｕｈ７細胞にＨＣＶレプリコンをクローニングしたクローン１０ＡとＨｕｈ７細胞にＧＢＶ−ＢレプリコンクローニングしたクローンＢ７６．１／Ｈｕｈ７を比較した。ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子を認識するプライマーセットを使用して定量的ＰＣＲを実施した。レプリコンＲＮＡ量を内部標準ＧＡＰＤＨの量に標準化して各曲線を得た。

図６はＨＣＶ適応的突然変異に相当するＨＣＶ（配列番号１２）及びＧＢＶ−Ｂ（配列番号１３）レプリコンの推定アミノ酸配列のアラインメントを示す。ＮＳ３、ＮＳ５Ａ及びＮＳ５Ｂ蛋白質配列の一部を示す。ＨＣＶ突然変異の位置を野生型配列中に下線で示し、その位置に記載されている突然変異アミノ酸（Ｂａｒｔｅｎｓｃｈｌａｇｅｒら，Ａｎｔｉｖｉｒａｌ Ｒｅｓ．５２：１−１７，２００１）を野生型配列の上部に示す。ＨＣＶＮＳ５Ａ配列の上部の線は欠失突然変異体に欠失しているアミノ酸を示す（Ｂｌｉｇｈｔら，Ｓｃｉｅｎｃｅ．２９０：１９７２−１９７４，２０００）。ＨＣＶアミノ酸のナンバリングはＢａｒｔｅｎｓｃｈｌａｇｅｒら，Ａｎｔｉｖｉｒａｌ Ｒｅｓ．５２：１−１７，２００１の記載に従う。ＮＳ５ＢのＲ２８８４Ｇ突然変異を太字で示す。

本発明はＧＢＶ−Ｂレプリコンとレプリコン強化細胞に関する。ＧＢＶ−Ｂレプリコンとレプリコン強化細胞は、ＧＢＶ−Ｂ複製、ポリプロテイン産生及びポリプロテインプロセシングの研究用ツールの提供；ＧＢＶ−Ｂを阻害する化合物の同定；ＨＣＶを阻害する化合物を同定するための代理モデルの提供；並びにＧＢＶ−Ｂ／ＨＣＶキメラレプリコンを作製するための足場の提供等の種々の用途がある。

ＧＢＶ−Ｂ又はＨＣＶを阻害する化合物は研究及び治療用途をもつ。研究用途としては、ウイルス阻害剤を使用してウイルス蛋白質、ポリプロテインプロセシング又はウイルス複製を試験することが挙げられる。治療用途としては、効力や許容不能な毒性の不在等の適切な薬理的性質をもつ化合物を使用して患者のＨＣＶ感染を治療又は抑制することが挙げられる。

ＧＢＶ−ＢとＨＣＶの類似性により、抗ＨＣＶ剤を試験するための代理モデルとしてＧＢＶ−Ｂを使用することができる。ＧＢＶ−Ｂを代理モデルとして使用する利点は、タマリンやヨザル等の動物に感染できることである。ＨＣＶ化合物の試験に一般に許容されている動物モデルはチンパンジーである。タマリンやヨザル等のＧＢＶ−Ｂ感受性動物はチンパンジーよりも小型で一般に容易に入手可能で廉価なモデルである。

ＧＢＶ−Ｂレプリコンとレプリコン強化細胞を使用すると、ＧＢＶ−Ｂ感受性動物に感染させる前に抗ウイルス化合物をスクリーニングするために使用可能なｉｎ ｖｉｔｒｏモデルが得られる。その後、動物にＧＢＶ−Ｂウイルスを感染させることができる。

ＧＢＶ−Ｂレプリコン
ＧＢＶ−Ｂレプリコンは培養細胞で自律複製し、検出可能なレベルの１種以上のＧＢＶ−Ｂ蛋白質を産生することが可能なＲＮＡ分子である。ＧＢＶ−Ｂレプリコンは全長ＧＢＶ−Ｂゲノム又はサブゲノム構築物をコードするＲＮＡ分子を含む。本発明の１態様では、レプリコンはヒト肝癌細胞、好ましくはＨｕｈ７又はＨｅｐ３Ｂで複製することができる。

ＧＢＶ−ＢレプリコンはＧＢＶ−Ｂ配列に加えて非ＧＢＶ−Ｂ配列を含んでいてもよい。付加配列は複製と発現を妨げるべきでなく、有用な機能を発揮することが好ましい。有用な機能を発揮するために使用可能な配列としては選択配列、レポーター配列、転写因子及び翻訳因子が挙げられる。

ＧＢＶ−Ｂゲノム及びサブゲノム領域
ＧＢＶ−Ｂゲノム及びサブゲノム構築物はＧＢＶ−Ｂ ５’ＵＴＲ、ＧＢＶ−Ｂ ＮＳ３−ＮＳ５Ｂポリプロテインをコードする領域及びＧＢＶ−Ｂ ３’ＵＴＲを含む。ＧＢＶ−Ｂゲノム構築物は更に構造ＧＢＶ−Ｂ蛋白質とＮＳ２をコードする領域を含み、ＧＢＶ−Ｂサブゲノム構築物は更にＮ末端コア領域及び／又はＮＳ２から開始する構造領域の全部又は一部を含むことができる。ＧＢＶ−Ｂゲノム構築物は培養中にタマリン感染性ＧＢＶ−Ｂビリオンを産生できることが好ましい。

ＮＳ３−ＮＳ５Ｂポリプロテインをコードする領域は細胞で種々の蛋白質にプロセシングすることができるポリプロテインを提供する。レプリコンの一部を構成することができる適切なＮＳ３−ＮＳ５Ｂポリプロテイン配列としてはＮＳ３−ＮＳ５Ｂのプロセシングにより機能的複製機構を生じる種々のＧＢＶ−Ｂ株とその機能的等価物が挙げられる。適正なプロセシングは例えばＮＳ５Ｂ ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ、ＮＳ３プロテアーゼ活性又はＮＳ３ヘリケース活性等をアッセイすることにより測定することができる。

ＮＳ３−ＮＳ５Ｂポリプロテイン領域は更に初期Ｍｅｔ翻訳開始コドン（ＡＵＧ）又は翻訳することが可能な上流領域を含む。このような上流領域の１例はＭｅｔ翻訳開始コドンを含むＮＳ２領域である。

ＧＢＶ−Ｂ ５’ＵＴＲ領域は蛋白質翻訳の内部リボソーム結合部位と複製に必要な因子を提供する。サブゲノムレプリコンでは、コア配列の開始点から少なくとも約２１ヌクレオチドの部分ＧＢＶ−Ｂコア配列が非レプリコン強化細胞へのレプリコントランスフェクション効率を増すと思われる。レプリコン活性の増加はレポーター又は選択遺伝子の前に挿入される部分コア配列の長さに相関することが判明した。種々の態様において、部分コア配列はＡＵＧコドンの３’であり、少なくとも約２１ヌクレオチド、少なくとも約３９ヌクレオチド、少なくとも約６３ヌクレオチド、又は約２１〜６３ヌクレオチドが存在する。

多シストロンレプリコンでは、２個以上の内部リボソーム結合部位因子が存在することができる。レプリコンの５’末端側の内部リボソーム結合部位はＧＢＶ−Ｂ ５’ＵＴＲであると思われる。存在する付加内部リボソーム結合部位因子は非ＧＢＶ−Ｂ内部リボソーム結合部位因子でもよい。使用可能な非ＧＢＶ−Ｂ内部リボソーム結合部位因子の例はＥＭＣＶ内部リボソーム結合部位、ポリオウイルス内部リボソーム結合部位、及びウシウイルス性下痢ウイルス内部リボソーム結合部位である。

ＧＢＶ−Ｂ ３’ＵＴＲはＧＢＶ−Ｂ複製を助長する。ＧＢＶ−Ｂ ３’ＵＴＲは天然ＧＢＶ−Ｂ ３’ＵＴＲとその機能的誘導体を含む。全長ＧＢＶ−Ｂ ３’ＵＴＲはＴｒａｂｏｎｉ，国際公開第ＷＯ／７３４６６号，国際公開日：２０００年１２月７日、及びＢｕｋｈら，国際公開第ＷＯ／７５３３７号，国際公開日：２０００年１２月１４日に記載されている。

好ましいＧＢＶ−Ｂレプリコンは新世界ザル、好ましくはタマリン及び／又はヨザルに感染することが可能なＧＢＶ−Ｂ配列を含む。感染性ＧＢＶ−Ｂ配列の例としてはＢｕｋｈら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２６２：４７０−４７８，１９９９及びＢｕｋｈら，国際公開第ＷＯ／７５３３７号，国際公開日：２０００年１２月１４日に記載されているものや、Ｓｂａｒｄｅｌｌａｔｉら，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．８２：２４３７−２４４８，２００１及びＴｒａｂｏｎｉ，国際公開第ＷＯ／７３４６６号，国際公開日：２０００年１２月７日に記載されているものが挙げられる。

感染性ＧＢＶ−Ｂレプリコン配列の変異は標準技術を使用して作製し、例えば付加感染性ＧＢＶ−Ｂレプリコンを作製することができる。付加感染性ＧＢＶ−Ｂレプリコンの変異は１カ所以上の核酸置換、挿入、欠失又はその組み合わせを提供する。種々のＧＢＶ−Ｂ配列の核酸配列とコードされるアミノ酸配列、可変及び保存ＧＢＶ−Ｂアミノ酸及び核酸を考慮して種々の変異を設計することができ、実験的に作製することができる。

機能的レプリコン配列を得るための実験は機能的レプリコンを細胞に導入し、トランストェクト細胞からレプリコンを単離することにより実施することができる。レプリコンＲＮＡ配列の自然突然変異率は種々の突然変異を生じる。機能的レプリコンに対応する突然変異はレプリコンを発現する細胞を取得することにより選択される。突然変異の配列を同定及び使用して付加機能的レプリコンを作製することができる。

本発明の種々の態様において、ＧＢＶ−Ｂレプリコンは配列番号３の残基９４１−２８６４に実質的に類似するＧＢＶ−Ｂ ＮＳ３−ＮＳ４Ａ−ＮＳ４Ｂ−ＮＳ５Ａ−ＮＳ５Ｂ配列又は配列番号３の残基７３３−２８６４に実質的に類似するＮＳ２−ＮＳ３−ＮＳ４Ａ−ＮＳ４Ｂ−ＮＳ５Ａ−ＮＳ５Ｂ配列をコードする。実質的に類似するアミノ酸配列は少なくとも８５％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、又は１００％の配列一致度をもつか、及び／又は１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、又は２０アミノ酸が相互に異なる。

ポリペプチド間のアミノ酸変異は２種の配列間のアミノ酸変異の最小数を決定することにより計算することができる。アミノ酸変異は欠失、付加、置換又はその任意組み合わせとすることができる。

アミノ酸配列一致度は第１のポリペプチドのアミノ酸配列を第２のポリペプチドのアミノ酸配列と比較して配列アラインメントを作成する当分野で周知の方法により測定することができる。アミノ酸一致度は同一アミノ酸をもつ整列残基対数を計数することによりアラインメントから計算することができる。

配列一致度の測定方法としては、Ｓｃｈｕｌｅｒ，Ｇ．Ｄ．，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ ｔｈｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｂａｘｅｖａｎｉｓ，Ａ．Ｄ．ａｎｄ Ｏｕｅｌｅｔｔｅ，Ｂ．Ｆ．Ｆ．，ｅｄｓ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ，２００１； Ｙｏｎａら，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ：Ｓｅｑｕｅｎｃｅ，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｄａｔａｂａｎｋｓ，Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｄ．ａｎｄ Ｔａｙｌｏｒ，Ｗ．ｅｄｓ．，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，２０００；及びＢｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ：Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｍｏｕｎｔ，Ｄ．Ｗ．，ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，２００１に記載されている方法が挙げられる。アミノ酸配列一致度の測定方法はＧＡＰ（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｐａｃｋａｇｅ Ｖｅｒｓｉｏｎ １０．２，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ），Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃ．）、ＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｃｈｕｌら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５（３）：４０３−１０，１９９０）及びＦＡＳＴＡ（Ｐｅａｒｓｏｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １８３：６３−９８，１９９０，Ｒ．Ｆ．Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ，ｅｄ．）等の公共入手可能なプログラムで体系化されている。

本発明の１態様では、２種のポリペプチド間の配列一致度はＧＡＰプログラム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｐａｃｋａｇｅ Ｖｅｒｓｉｏｎ １０．２，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ），Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃ．）を使用して測定される。ＧＡＰはＮｅｅｄｌｅｍａｎとＷｕｎｓｃｈのアラインメント法を使用する（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３−４５３，１９７０．）。ＧＡＰは２種の配列間の可能な全アラインメントとギャップ位置を考慮し、マッチ残基数が最大で且つギャップ数と寸法が最小になるような総合アラインメントを作成する。スコアリングマトリックスを使用してシンボルマッチに値を割り当てる。更に、ギャップのアラインメント挿入を制限するためにギャップ生成ペナルティとギャップ延長ペナルティが必要である。ＧＡＰを使用するポリペプチド比較のデフォルトプログラムパラメーターはＢＬＯＳＵＭ６２（Ｈｅｎｉｋｏｆｆら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：１０９１５−１０９１９，１９９２）、アミノ酸スコアリングマトリックス（ＭＡＴｒｉｘ＝ｂｌｏｓｕｍ６２．ｃｍｐ）、ギャップ生成パラメーター（ＧＡＰｗｅｉｇｈｔ＝８）、及びギャップ延長パラメーター（ＬＥＮｇｔｈｗｅｉｇｈｔ＝２）である。

多シストロン構成
異なる構成をもつ多シストロンレプリコンを作製することができる。異なる構成としては例えば選択又はレポーター遺伝子の配置、非構造遺伝子の配置、構造領域の配置と存在、及び３個以上のシストロンの存在が挙げられる。

本発明の１態様において、ＧＢＶ−Ｂレプリコンはヒト肝癌細胞、好ましくはＨｕｈ７細胞等の細胞で複製することができ、以下の領域：
配列番号１の塩基１−４４５に実質的に類似するＧＢＶ−Ｂ ５’ＵＴＲ；
ＧＢＶ−Ｂ ５’ ＵＴＲに機能的に連結した選択又はレポーター配列；
内部リボソーム結合部位；
内部リボソーム結合部位とＡＵＧ翻訳開始コドンに機能的に連結した配列番号１の塩基１９３８−７７０９に実質的に類似するＮＳ３−ＮＳ５Ｂ配列；及び
配列番号１の塩基７７１０−８０６９に実質的に類似するＧＢＶ−Ｂ ３’ＵＴＲを含む。

ＧＢＶ−Ｂレプリコンに関する付加態様は以下の１種以上を含む。
（１）ＧＢＶ−Ｂ ５’ＵＴＲに隣接するＧＢＶ−Ｂ構造領域が存在する。この構造領域はＮＳ２等の付加領域を含むことができる。ＧＢＶ−Ｂ構造領域は配列番号１の塩基４４６−５１１、配列番号１の塩基４４６−４８７、配列番号１の塩基４４６−４６９、配列番号２の塩基４４６−２６４１のＲＮＡ型（コア−Ｅ２／ｐ７）、及び配列番号２の塩基４４６−３２６５のＲＮＡ型（コア−ＮＳ２）から構成される群から選択される配列に実質的に類似する配列を含む；
（２）ＮＳ３−ＮＳ５Ｂ領域の５’末端に隣接するＧＢＶ−Ｂ ＮＳ２領域又はコア領域が存在し、ＮＳ２領域が存在する場合には、配列番号２の塩基２６４２−３２６５のＲＮＡ型に実質的に類似する配列をもつことが好ましい；
（３）ＧＢＶ−Ｂ ３’ＵＴＲは配列番号１の塩基７７１０−８０６９に実質的に類似する配列をもつ；
（４）内部リボソーム結合部位は配列番号１の塩基１３２４−１９３４に実質的に類似する配列をもつ；
（５）ＧＢＶ−ＢレプリコンはＧＢＶ−Ｂ ５’ＵＴＲ、ＧＢＶ−Ｂ構造領域（ＮＳ２を含むことができる）、選択又はレポーター配列、内部リボソーム結合部位、ＮＳ３−ＮＳ５Ｂ又はＮＳ２−ＮＳ５Ｂ配列、及びＧＢＶ−Ｂ ３’ＵＴＲから構成される。

「ＲＮＡ型」なる用語はリボース骨格とチミンでなくウラシルの存在を意味する。

ＧＢＶ−Ｂ領域なる用語は天然ＧＢＶ−Ｂ領域だけでなく、このような領域の誘導体も含む。誘導体の範囲は参照配列との（実質的に類似する）関係により示される。

実質的に類似するヌクレオチド配列は少なくとも８５％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、又は１００％のヌクレオチド配列一致度をもつか、及び／又は１−２、１−３、１−４、１−５、１−６、１−７、１−８、１−９、１−１０、１−１１、１−１２、１−１３、１−１４、１−１５、１−１６、１−１７、１−１８、１−１９、１−２０、１−２５、１−３０、１−３５、１−４０、１−４５、又は１−５０ヌクレオチドが相互に異なる。２種の配列間のヌクレオチド変異は２種の配列間のヌクレオチド変異の最小数を決定することにより計算することができる。ヌクレオチド変異は欠失、付加、置換又はその任意組み合わせとすることができる。好ましい付加ヌクレオチド配列は５’ＡＵＧをもたないコーディング配列に隣接する５’ＡＵＧ配列である。

ヌクレオチド配列一致度は第１の配列のヌクレオチド配列を第２の配列のヌクレオチド配列と比較して配列アラインメントを作成する当分野で周知の方法により測定することができる。配列一致度は同一ヌクレオチドをもつ整列位置数を計数することによりアラインメントから決定することができる。

２種のポリヌクレオチド間のヌクレオチド配列一致度の測定方法としては、Ｓｃｈｕｌｅｒ，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ ｔｈｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｂａｘｅｖａｎｉｓ，Ａ．Ｄ．ａｎｄ Ｏｕｅｌｅｔｔｅ，Ｂ．Ｆ．Ｆ．，ｅｄｓ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ，２００１； Ｙｏｎａら，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ：Ｓｅｑｕｅｎｃｅ，ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ ｄａｔａｂａｎｋｓ，Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｄ．ａｎｄ Ｔａｙｌｏｒ，Ｗ．ｅｄｓ．，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，２０００；及びＢｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ：Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｍｏｕｎｔ，Ｄ．Ｗ．，ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，２００１に記載されている方法が挙げられる。ヌクレオチド配列一致度の測定方法はＧＡＰ（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｐａｃｋａｇｅ Ｖｅｒｓｉｏｎ １０．２，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ），Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃ．）、ＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｃｈｕｌら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５（３）：４０３−１０，１９９０）、及びＦＡＳＴＡ（Ｐｅａｒｓｏｎ，Ｗ．Ｒ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １８３：６３−９８，１９９０，Ｒ．Ｆ．Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ，ｅｄ．）等の公共入手可能なプログラムで体系化されている。

本発明の１態様では、２種のポリヌクレオチド間の配列一致度はＧＡＰ（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｐａｃｋａｇｅ Ｖｅｒｓｉｏｎ １０．２，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ），Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃ．）を使用して測定される。ＧＡＰはＮｅｅｄｌｅｍａｎとＷｕｎｓｃｈのアラインメント法を使用する（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３−４５３，１９７０．）。ＧＡＰは２種の配列間の可能な全アラインメントとギャップ位置を考慮し、マッチ残基数が最大で且つギャップ数と寸法が最小になるような総合アラインメントを作成する。スコアリングマトリックスを使用してシンボルマッチに値を割り当てる。更に、ギャップのアラインメント挿入を制限するためにギャップ生成ペナルティとギャップ延長ペナルティが必要である。ＧＡＰを使用するポリヌクレオチド比較のデフォルトプログラムパラメーターはｎｗｓｇａｐｄｎａ．ｃｍｐスコアリングマトリックス（ＭＡＴｒｉｘ＝ｎｗｓｇａｐｄｎａ．ｃｍｐ）、ギャップ生成パラメーター（ＧＡＰｗｅｉｇｈｔ＝５０）、及びギャップ延長パラメーター（ＬＥＮｇｔｈｗｅｉｇｈｔ＝３）である。

選択配列
ＧＢＶ−Ｂレプリコンの選択配列を使用してＧＢＶ−Ｂレプリコン強化細胞の作製とレプリコンの細胞維持を助長することができる。選択配列は一般に選択配列を含まない細胞の増殖を阻害する所定の選択圧と併用する。選択配列の例としては抗生物質耐性をコードする配列とリボザイムが挙げられる。

抗生物質耐性を抗生物質と併用してレプリコンを含む細胞を選択することができる。抗生物質耐性を提供する選択配列の例はネオマイシン、ハイグロマイシン、ピューロマイシン、又はゼオシンをコードする配列である。

選択配列として機能するリボザイムを、細胞増殖を阻止する阻害核酸分子と併用してもよい。リボザイムは阻害核酸を認識して切断する。

レポーター配列
レポーター配列を使用してレプリコン複製又は蛋白質発現を検出することができる。好ましいレポーター蛋白質は蛋白質により産生される産物を測定することによりその存在を検出することが可能な酵素蛋白質である。レポーター蛋白質の例としてはルシフェラーゼ、β−ラクタマーゼ、分泌型アルカリホスファターゼ、β−グルクロニダーゼ、及びグリーン蛍光蛋白質とその誘導体が挙げられる。更に、レポーター核酸配列を使用して、相補的核酸プローブによりターゲティングされる参照配列を提供することができる。プローブとそのターゲットのハイブリダイゼーションは標準技術により測定することができる。

付加配列構成
付加配列はＧＢＶ−Ｂゲノム又はサブゲノム領域の５’又は３’が好ましい。しかし、検出可能なレプリコン活性を妨げない限り、ＧＢＶ−Ｂゲノム内に付加配列を配置してもよい。所望により、リボザイム認識配列をリボザイムと併用することにより付加配列をレプリコンから分離してもよい。

付加配列はＧＢＶ−Ｂポリプロテインと同一シストロンの一部でもよいし、別のシストロンでもよい。同一シストロンの一部である場合には、蛋白質をコードする付加配列の結果、キメラ蛋白質として活性であるか又は細胞の内側で切断されてＧＢＶ−Ｂ蛋白質から分離される産物を生じると考えられる。

蛋白質をコードする選択及びレポーター配列が別個のシストロンとして存在する場合には、翻訳に必要な因子と結び付けられる。このような因子としては５’リボソーム結合部位が挙げられる。

レプリコンをコードするヌクレオチド配列
ＧＢＶ−Ｂレプリコンはレプリコンをコードする核酸分子から作製することができる。核酸分子は１本鎖でも２本鎖の部分でもよいし、ＲＮＡでもＤＮＡでもよい。核酸分子の構造に応じて、分子をレプリコンとして使用してもよいし、レプリコンの作製に使用してもよい。例えば、適正な領域をもつ１本鎖ＲＮＡはレプリコンとすることができ、レプリコン又はレプリコン中間体をコードする配列の補体を含む２本鎖ＤＮＡはレプリコン又はレプリコン中間体の作製に有用であると思われる。

レプリコンをコードする配列を含む核酸は発現ベクターから作製することができる。レプリコンは発現ベクターにクローニングした対応するＤＮＡからｉｎ ｖｉｔｒｏ転写したＲＮＡ分子として細胞に導入してもよいし、発現ベクターを発現する第１の細胞から単離した後に第２の細胞にトランスフェクトしてもよい。

発現ベクターは適正な転写とプロセシングのための調節因子と共に所望配列をコードする組換え核酸を含む。存在することができる調節因子としては所望配列をコードするヌクレオチド配列に天然に関連するものと、ヌクレオチド配列に天然に関連しない外来調節因子が挙げられる。発現ベクターの例はクローニングベクター、改変クローニングベクター、特殊設計プラスミド及びウイルスである。

特定アミノ酸配列と遺伝コードの既知縮重から出発し、多数の異なるコーディング核酸配列を得ることができる。遺伝コードの縮重が生じるのは、ほぼ全アミノ酸がヌクレオチドトリプレット即ち「コドン」の種々の組合せによりコードされるためである。特定コドンを特定アミノ酸に翻訳することは当分野で周知である（例えばＬｅｗｉｎ ＧＥＮＥＳ ＩＶ，ｐ．１１９，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，１９９０参照）。アミノ酸は以下のようにコドンによりコードされる。
Ａ＝Ａｌａ＝アラニン：コドンＧＣＡ，ＧＣＣ，ＧＣＧ，ＧＣＵ
Ｃ＝Ｃｙｓ＝システイン：コドンＵＧＣ，ＵＧＵ
Ｄ＝Ａｓｐ＝アスパラギン酸：コドンＧＡＣ，ＧＡＵ
Ｅ＝Ｇｌｕ＝グルタミン酸：ＧＡＡ，ＧＡＧ
Ｆ＝Ｐｈｅ＝フェニルアラニン：コドンＵＵＣ，ＵＵＵ
Ｇ＝Ｇｌｙ＝グリシン：コドンＧＧＡ，ＧＧＣ，ＧＧＧ，ＧＧＵ
Ｈ＝Ｈｉｓ＝ヒスチジン：コドンＣＡＣ，ＣＡＵ
Ｉ＝Ｉｌｅ＝イソロイシン：コドンＡＵＡ，ＡＵＣ，ＡＵＵ
Ｋ＝Ｌｙｓ＝リジン：コドンＡＡＡ，ＡＡＧ
Ｌ＝Ｌｅｕ＝ロイシン：コドンＵＵＡ，ＵＵＧ，ＣＵＡ，ＣＵＣ，ＣＵＧ，ＣＵＵ
Ｍ＝Ｍｅｔ＝メチオニン：コドンＡＵＧ
Ｎ＝Ａｓｎ＝アスパラギン：コドンＡＡＣ，ＡＡＵ
Ｐ＝Ｐｒｏ＝プロリン：コドンＣＣＡ，ＣＣＣ，ＣＣＧ，ＣＣＵ
Ｑ＝Ｇｌｎ＝グルタミン：コドンＣＡＡ，ＣＡＧ
Ｒ＝Ａｒｇ＝アルギニン：コドンＡＧＡ，ＡＧＧ，ＣＧＡ，ＣＧＣ，ＣＧＧ，ＣＧＵ
Ｓ＝Ｓｅｒ＝セリン：コドンＡＧＣ，ＡＧＵ，ＵＣＡ，ＵＣＣ，ＵＣＧ，ＵＣＵ
Ｔ＝Ｔｈｒ＝スレオニン：コドンＡＣＡ，ＡＣＣ，ＡＣＧ，ＡＣＵ
Ｖ＝Ｖａｌ＝バリン：コドンＧＵＡ，ＧＵＣ，ＧＵＧ，ＧＵＵ
Ｗ＝Ｔｒｐ＝トリプトファン：コドンＵＧＧ
Ｙ＝Ｔｙｒ＝チロシン：コドンＵＡＣ，ＵＡＵ。

検出方法
レプリコン活性の検出方法としてはレプリコンＲＮＡとコードされる蛋白質の産生又は活性の測定が挙げられる。測定は定性及び定量分析を含む。

ＲＮＡ産生の測定に適した方法としてはＲＮＡの存在又は活性を検出する方法が挙げられる。ＲＮＡの存在は例えば相補的ハイブリダイゼーションプローブ又は定量的ＰＣＲを使用して検出することができる。相補的核酸間のハイブリダイゼーションを測定する方法と定量的ＰＣＲは当分野で周知である（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ，１９８７−１９９８，Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９８９、及び米国特許第５，７３１，１４８号参照）。

リボザイム配列を使用することによりレプリコンにＲＮＡ酵素活性を付与することができる。リボザイム活性はリボザイムがターゲット配列を切断する能力を検出する方法により測定することができる。

蛋白質産生の測定方法としては、産生された蛋白質の存在又は活性を検出する方法が挙げられる。特定蛋白質の存在は例えば免疫法により測定することができる。蛋白質活性はＧＢＶ−Ｂ蛋白質又はレポーター蛋白質配列の活性に基づいて測定することができる。

ＧＢＶ−Ｂ蛋白質活性の測定方法は測定する蛋白質により異なる。ＮＳ３やＮＳ５Ｂ等の種々の非構造蛋白質の活性の測定方法は当分野で周知である（例えば、背景技術の項に引用した文献参照）。

レプリコン活性を測定するアッセイとしては更に、ビリオンを産生するレプリコンからビリオン産生を検出する方法や、細胞変性効果をもつ蛋白質を産生するレプリコンからこのような効果を検出する方法が挙げられる。細胞変性効果は細胞生死判別の測定に適したアッセイにより検出することができる。

レプリコン活性の測定アッセイを使用して化合物がＧＢＶ−Ｂ活性を変化させる能力を評価することができる。このようなアッセイはＧＢＶ−Ｂレプリコンを発現する細胞に１種以上の試験化合物を添加し、レプリコン活性に及ぼす化合物の効果を測定することにより実施することができる。２種以上の化合物を含む調製物がレプリコン活性活性を調節することが判明した場合には、個々の化合物又はより小さい群の化合物を試験してレプリコン活性化合物を同定することができる。

ＧＢＶ−Ｂ活性を阻害することが確認された化合物を使用してレプリコン強化細胞を作製し、治療又は研究用化合物とすることができる。化合物をＨＣＶの治療用化合物として使用できるか否かはＧＢＶ−Ｂに感受性の動物を使用し、その後、必要に応じてＨＣＶに感染させたチンパンジーを使用することにより確認することができる。

レプリコン強化細胞
レプリコン強化細胞はレプリコンを維持する能力が増加している。レプリコン強化細胞はＧＢＶ−Ｂレプリコンを維持することが可能な細胞を選択した後、細胞からレプリコンを除去することにより作製することができる。

初期トランスフェクションは少なくともＮＳ３−ＮＳ５Ｂ配列又はその機能的誘導体を含む野生型ＧＢＶ−Ｂ配列をもつレプリコンを使用して実施することができる。レプリコンはレプリコン維持を助長するために選択配列を含むことが好ましい。

レプリコン阻害物質の使用等の種々の技術を使用して細胞からレプリコンを除去することができる。レプリコン阻害物質はレプリコン活性を阻害するか又はレプリコンを含む細胞を選択する。このような物質の例としてはＩＦＮ−αや、ＧＢＶ−Ｂレプリコン活性を阻害することが認められている化合物が挙げられる。除去細胞がレプリコン強化細胞であるか否かはレプリコンを細胞に導入し、レプリコン維持及び活性効率を測定することにより測定することができる。

レプリコンを除去したＧＢＶ−Ｂ細胞に導入される第１のＧＢＶ−ＢレプリコンはＧＢＶ−Ｂレプリコン強化細胞に導入される第２のＧＢＶ−Ｂレプリコンと同一でも異なっていてもよい。２つのレプリコンはＧＢＶ−Ｂコーディング配列が異なっていてもよいし、存在し得る他の配列（選択配列又はレポーター配列等）が異なっていてもよい。ＧＢＶ−Ｂレプリコン強化細胞に導入される第１のＧＢＶ−Ｂレプリコンは強化細胞を作製するために使用したレプリコンと同一のＧＢＶ−Ｂ配列をもつことが好ましい。

レプリコン強化細胞の作製方法全体は（ａ）ＧＢＶ−Ｂレプリコンを細胞に導入及び維持する段階と、（ｂ）細胞からレプリコンを除去する段階を含むとして要約することができる。本発明の１態様では、本方法は更に（ｃ）段階（ａ）のレプリコンと同一でも異なっていてもよいＧＢＶ−Ｂレプリコンを細胞に導入及び維持する段階と、（ｄ）段階（ｂ）で使用した方法と同一又は異なる方法を使用して段階（ｂ）で使用したレプリコンを細胞から除去する段階を含む。ゲノムレプリコンをもつ強化細胞の作製に関する１好適態様では、段階（ａ）はサブゲノムレプリコンを使用して実施し、段階（ｃ）はゲノムレプリコンを使用して実施する。

ビリオン作製
ゲノムレプリコンを使用してビリオンを作製することができる。作製したビリオンは測定可能な活性の提供や動物感染ウイルス源等の種々の用途がある。異なる条件下のビリオン活性の測定を使用すると、ビリオン産生をよりよく理解できると共に、化合物がこのような活性を変化させる能力をアッセイすることができる。

ゲノムレプリコンを使用してレプリコン強化細胞でビリオンを作製することが好ましい。ビリオン作製に使用することができるゲノムレプリコンとしては、シストロンが１個のものと複数のものが挙げられる。

ＧＢＶ−Ｂ／ＨＣＶキメラ
ＧＢＶ−Ｂ感受性動物で感染性のキメラＧＢＶ−Ｂ／ＨＣＶレプリコンは代理モデルとしての動物の使用を更に強化することができる。キメラＧＢＶ−Ｂ／ＨＣＶレプリコン配列は１個以上のＨＣＶ蛋白質をコードする領域又はその一部をＧＢＶ−Ｂ足場に含む。５’ＵＴＲ、コア、Ｅ１、Ｅ２、ＮＳ２、ＮＳ３、ＮＳ４Ａ、ＮＳ４Ｂ、ＮＳ５Ａ、ＮＳ５Ｂ、及び３’ＵＴＲ領域に対応するＧＢＶ−Ｂ及びＨＣＶ領域は当分野で周知である（例えば、背景技術の項に引用した文献やＨｏｎｇら，米国公開番号Ｕ．Ｓ．２００１／００３４０１９，公開日２００１年１０月２５日参照）。

本明細書に記載するレプリコンに存在する１個以上のＧＢＶ−Ｂ領域又はその一部を対応するＨＣＶ由来領域で置換することができる。各種態様において、対応領域は少なくとも約５０アミノ酸、少なくとも約７５アミノ酸、又は天然ＨＣＶに存在する完全領域をコードする。

天然ＨＣＶ単離株は多数の例が当分野で周知である。ＨＣＶ単離株は１種以上のサブタイプを含む以下の６種の主要遺伝子型に分類することができる：ＨＣＶ−ｌ／（１ａ，１ｂ，１ｃ），ＨＣＶ−２／（２ａ，２ｂ，２ｃ），ＨＣＶ−３／（３ａ，３ｂ，１０ａ），ＨＣＶ−４／（４ａ），ＨＣＶ−５／（５ａ）及びＨＣＶ−６／（６ａ，６ｂ，７ｂ，８ｂ，９ａ，１ｌａ）（Ｓｉｍｍｏｎｄｓ，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．，６９３−７１２，２００１．）。ＨＣＶ−ＢＫ、ＨＣＶ−Ｊ、ＨＣＶ−Ｎ、ＨＣＶ−Ｈ等の特定ＨＣＶ配列の例はＧｅｎＢａｎｋに登録され、種々の刊行物に記載されている（例えば、Ｃｈａｍｂｅｒｌａｉｎら，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．，１３４１−１３４７，１９９７参照）。

レプリコン強化細胞は細胞でウイルスポリプロテインを複製し、プロセシングすることが可能なキメラＧＢＶ−Ｂ／ＨＣＶレプリコン配列をスクリーニングするために使用することができる。その後、機能的キメラＧＢＶ−Ｂ／ＨＣＶレプリコンがタマリンやヨザル等の動物に感染する能力を評価することができる。

以下、実施例により本発明の種々の特徴を更に例証する。以下の実施例は本発明の有用な実施方法も例証する。これらの実施例は特許請求の範囲に記載する発明を限定するものではない。

方法
本実施例はＧＢＶ−Ｂレプリコンとレプリコン強化細胞を作製及び分析するために採用可能な方法を例証する。

細胞株と培養条件
ヒト肝癌細胞株Ｈｕｈ７は２ｍＭ Ｌ−グルタミン、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン、１０％ウシ胎児血清を添加した高グルコースダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ；Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で増殖させた。細胞を分割比１：５で週２回継代培養した。Ａｏｕｔｕｓ ｔｒｉｖｉｒｇａｔｕｓ（ヨザル）腎細胞株（ＯＭＫ ６３７−６９；ＡＴＣＣ ｎｕｍｂｅｒ ＣＲＬ−１５５６）はＥａｒｌｅ’ｓ ＢＳＳで調製した非必須アミノ酸を含む最小必須培地（ＭＥＭ；Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン、１０％ウシ胎児血清を添加して増殖させた。Ｓａｇｕｉｎｕｓ ｏｅｄｉｐｕｓ（タマリン）リンパ芽球細胞株Ｂ９５−８ａ（Ｆｕｍｉｏ Ｋｏｂｕｎｅ博士から寄贈）は２ｍＭ Ｌ−グルタミン、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１．０ｍＭピルビン酸ナトリウム、１０％ウシ胎児血清を添加したＲＰＭＩ １６４０培地（ＲＰＭＩ；Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で増殖させた。ネオマイシン耐性株は終濃度０．２５０〜１ｍｇ／ｍｌのＧ４１８の存在下に増殖させた。

プラスミド構築
ＧＢＶ−Ｂサブゲノムレプリコン構築物はプラスミドＦＬ３／ｐＡＣＹＣ１７７（ＥＭＢＬ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ ＡＪ２７７９４７）で構造蛋白質とＮＳ２蛋白質をコードする領域をネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子（ｎｅｏ）とＥＭＣＶ内部リボソーム結合部位の配列で置換することにより得た。ＦＬ３／ｐＡＣＹＣ１７７プラスミドはＴ７ポリメラーゼプロモーターの下流のＧＢＶ−Ｂ感染性全長ｃＤＮＡをコードする。アセンブリＰＣＲとライゲーション反応によりｎｅｏとＥＭＣ内部リボソーム結合部位を段階的にＧＢＶ−Ｂ配列に結合し、ＧＢＶ−Ｂ ５’ＵＴＲとｎｅｏ遺伝子の接合部にユニークなＡｓｃＩ部位を生成した。

最終ＧＢＶ−Ｂレプリコン配列をＢａｍＨＩ−ＸｈｏＩフラグメントとしてより汎用性のｐＧＢＴ９ベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）に導入した。ランオフ転写に有用なＧＢＶ−Ｂコーディング配列の３’末端のＳａｐｌ部位を残してプライマー突然変異誘発により２個のＳａｐＩ部位をｎｅｏ遺伝子から除去した。

ＧＢＶ−Ｂ−ｎｅｏ−ＲｅｐＡ（ｎｅｏ−ＲｅｐＡ）、ＧＢＶ−Ｂ−ｎｅｏ−ＲｅｐＢ（ｎｅｏ−ＲｅｐＢ）、ＧＢＶ−Ｂ−ｎｅｏ−ＲｅｐＣ（ｎｅｏ−ＲｅｐＣ）及びＧＢＶ−Ｂ−ｎｅｏ−ＲｅｐＤ（ｎｅｏ−ＲｅｐＤ）の４種の構築物を作製した。ｎｅｏ−Ｒｅｐ ＡはＧＢＶ−Ｂ ５’ＵＴＲの後にｎｅｏ遺伝子を含む。ｎｅｏ−ＲｅｐＢ、ｎｅｏ−ｒｅｐＣ及びｎｅｏ−ｒｅｐＤはＧＢＶ−Ｂ ５’ＵＴＲ、ＡＴＧ開始コドンの後にｎｅｏ遺伝子の上流のＧＢＶ−Ｂコアコーディング配列の夫々２１、３９及び６３ヌクレオチドを含む。上記クローニングデザインにより得られたネオマイシンホスホトランスフェラーゼ蛋白質のＮ末端の前にネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子の上流のクローニング部位の付加に応じて３個のアミノ酸を挿入する。ｎｅｏ−ＲｅｐＢ、ｎｅｏ−ＲｅｐＣ及びｎｅｏ−ＲｅｐＤはＡＴＧ開始コドンの後にＧＢＶ−Ｂコアコーディング配列の夫々２１、３９及び６３ヌクレオチドを含むＢａｍＨＩ−ＡｓｃＩフラグメントでｎｅｏ−ＲｅｐＡクローンの元のＢａｍＨＩ−ＡｓｃＩフラグメントを置換することにより得た。ＲｅｐＤ配列を図１に示す。

ＧＢＶ−Ｂ対応遺伝子の代わりにＨＣＶＮＳ５Ｂ遺伝子をもつキメラレプリコンはｐＧＢＴ９ベクターで構築した。構築はＮＳ５Ｂ領域に相当するＧＢＶ−Ｂ ＲｅｐＢクローンのＳｆｉＩ−ＸｈｏＩフラグメントをＨＣＶ，遺伝子型１ａのＮＳ５Ｂを含む全長キメラクローンに由来する対応フラグメントで置換することにより行った。

ｎｅｏの代わりにβ−ラクタマーゼ遺伝子（ｂｌａ）を含むＢｌａ−ＲｅｐＡ、ｂｌａ−ＲｅｐＢ、ｂｌａ−ＲｅｐＣ、ｂｌａ−ＲｅｐＤ構築物を作製した。ｂｌａ−ＲｅｐレプリコンはＧＢＶ−Ｂ ｎｅｏ−Ｒｅｐ構築物のｎｅｏ遺伝子に相当するＡｓｃＩ−ＰｍｅＩフラグメントをβ−ラクタマーゼ遺伝子を含むＡｓｃＩ−ＰｍｅＩフラグメントで置換することにより構築した。

ポリメラーゼ活性部位ＧＤＤモチーフの突然変異体はまずプライマー突然変異誘発によりＧＤＤ→ＧＡＡ突然変異ｎｅｏ−ＲｅｐＢクローンを構築した後に突然変異に相当する制限フラグメントを他の野生型構築物に移すことにより得た。

ＲｅｐＢ７６．１／Ｈｕｈ７細胞に由来するＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ増幅産物をｐＣＲ２．１ベクターにサブクローニングして配列決定を行った。

ＧＢＶ−Ｂゲノムレプリコン構築物ｎｅｏ−ＦＬ−Ａ、ｎｅｏ−ＦＬ−Ｂ、ｎｅｏ−ＦＬ−Ｃ及びｎｅｏ−ＦＬ−Ｄ（ｎｅｏ−ＲｅｐＤ部分配列に対応するｎｅｏ−ＦＬ−Ｄ部分配列については図４参照）はネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子（ｎｅｏ）とＥＭＣＶ内部リボソーム結合部位の配列を通常の分子生物学技術によりＧＢＶ−Ｂ構造蛋白質をコードする領域の上流でプラスミドＦＬ３／ｐＡＣＹＣ１７７（ＥＭＢＬ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ ＡＪ２７７９４７）に挿入することにより得た。Ｎｅｏ−ＦＬ−ＡはＧＢＶ−Ｂ ５’ＵＴＲの後にｎｅｏ遺伝子を含む。Ｎｅｏ−ＦＬ−Ｂ、ｎｅｏ−ＦＬ−Ｃ及びｎｅｏ−ＦＬ−ＤはＧＢＶ−Ｂ ５’ＵＴＲ、ＡＴＧ開始コドンの後にｎｅｏ遺伝子の上流のＧＢＶ−Ｂコアコーディング配列の夫々２１、３９及び６３ヌクレオチドと、対応するｎｅｏ−Ｒｅｐサブゲノム構築物を含む。上記クローニングデザインにより得られたネオマイシンホスホトランスフェラーゼ蛋白質のＮ末端の前にネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子の上流のクローニング部位の付加に応じて３個のアミノ酸を挿入する。

配列分析
配列決定はＡｍｐｌｙＴａｑを含むＢｉｇ Ｄｙｅターミネーターサイクルシーケンシングキット（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）とＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓモデル３７３Ａシーケンサーを使用して実施した。

Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ転写
Ａｍｂｉｏｎ Ｍｅｇａｓｃｒｉｐｔキットをヌクレアーゼフリー条件下で製造業者の指示に従って使用してＧＢＶ−ＢレプリコンをコードするＳａｐＩ直鎖化プラスミドをＴ７ ＲＮＡポリメラーゼによりｉｎ ｖｉｔｒｏ転写した。製造業者の指示に従ってＤＮＡｓｅ Ｉと共にインキュベーションしてＬｉＣｌで沈殿させることにより反応を停止した。ＲＮＡをヌクレアーゼフリー水に再懸濁し、２６０ｎｍ吸光度により定量し、すぐに１０μｇに小分けしてドライアイスで凍結し、−８０℃で保存した。

エレクトロポレーション法と複製の監視
ヒト肝癌Ｈｕｈ７と誘導細胞株及びサル細胞株を使用してＧＢＶ−Ｂ分子構築物の複製を試験した。直径１５ｃｍのプレートからコンフルエント細胞を１：２に分けた。２４時間後に細胞を培地５ｍｌに回収し、冷ＤＥＰＣ処理ＰＢＳ４０ｍｌで２回洗浄し、Ｃｅｌｌ Ｓｔｒｉｎｅｒフィルター（Ｆａｌｃｏｎ）で濾過し、冷ＤＥＰＣ処理ＰＢＳで１０^７細胞／ｍｌ濃度に希釈した。ＢｉｏＲａｄ Ｇｅｎｅｐｕｌｓｅｒ ＩＩを使用して０．３５ＫＶ及び１０μＦで２パルスにより２ｘ１０^６細胞アリコートにｉｎ ｖｉｔｒｏ転写ＲＮＡ１０μｇをエレクトロポレーションした。

電気パルスの直後に細胞を完全ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）８ｍｌで希釈し、使用する選択／トレーサーに応じて種々のプロトコールで処理した。ｎｅｏ構築物形質転換の場合には、細胞を直径１５ｃｍのプレート３枚に分け、翌日に選択用抗生物質Ｇ４１８（Ｓｉｇｍａ Ｇ−９５１６）を濃度０．２５０、０．５又は１ｍｇ／ｍｌで加えた。２週間でネオマイシン感受性細胞は死滅し、４週目に０．２５ｍｇ／ｍｌ濃度で生存細胞クローンが観察された。生存クローンをピックアップし、個別プレートで増殖させた。ｂｌａレポーター遺伝子を使用した場合には、トランスフェクト細胞懸濁液１．５ｍｌ、１．０ｍｌ及び０．５ｍｌをマルチウェル−６ウェルプレート（Ｆａｌｃｏｎ ｃａｔ．Ｎ．３５−３０４６）にプレーティングし、夫々２４、４８及び７２時間後に染色した。

Ａｕｒｏｒａ基質システム「ＣＣＦ４」を使用してβ−ラクタマーゼ活性を測定した。定量的ＰＣＲを使用してトランジェント複製を測定した場合には、細胞を「６マルチウェルプレート」に１〜２ｘ１０^５／ウェルでプレーティングした。３日後に全ＲＮＡをＴＲＩｚｏｌプロトコール（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に記載されているように精製し、全ＲＮＡ１００μｌのうちの１０μｌを個別ＴａｑＭａｎ反応で使用した。

ＧＢＶ−Ｂ ＲＮＡのＴａｑＭａｎ定量
ＧＢＶ−Ｂ ＲＮＡはＧＢＶ−Ｂ ５’ＵＴＲの一部を認識するプライマー／プローブセットを使用してリアルタイム５’エキソヌクレアーゼＰＣＲ（ＴａｑＭａｎ）アッセイにより定量した。プライマー（ＧＢＶ−Ｂ−Ｆ３，ＧＴＡＧＧＣＧＧＣＧＧＧＡＣＴＣＡＴ（配列番号１４）及びＧＢＶ−Ｂ−Ｒ３，ＴＣＡＧＧＧＣＣＡＴＣＣＡＡＧＴＣＡＡ（配列番号１５））とプローブ（ＧＢＶ−Ｂ−Ｐ３，６−カルボキシフルオレセイン−ＴＣＧＣＧＴＧＡＴＧＡＣＡＡＧＣＧＣＣＡＡＧ（配列番号１６）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−６−カルボキシローダミン）はＰｒｉｍｅｒ Ｅｘｐｒｅｓｓソフトウェア（ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して選択した。蛍光プローブはＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから入手した。プライマーは１０ｐｍｏｌ／５０μｌ反応で使用し、プローブは反応液５０μｌ当たり５ｐｍｏｌを使用した。

ＰＣＲはＴａｑＭａｎ Ｇｏｌｄ ＲＴ−ＰＣＲキット（ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して実施した。ＰＣＲは４８℃で３０分間の逆転写段階後に１０分間９５℃と、ユニバーサルＴａｑＭａｎ標準化条件（１５秒９５℃変性段階後に１分間６０℃アニーリング／伸長段階）を使用する増幅サイクル４０サイクルを行った。

ＧＢＶ−Ｂゲノムの最初から２０００個のヌクレオチドを含むプラスミドから転写されたＲＮＡを標準として使用してゲノム等価物を設定した。Ｔ７ Ｍｅｇａｓｃｒｉｐｔキット（Ａｍｂｉｏｎ）を使用して標準ＲＮＡを転写させ、ＤＮａｓｅ処理、フェノール−クロロホルム抽出、Ｓｅｐｈａｄｅｘ−Ｇ５０濾過及びエタノール沈殿により精製した。ＲＮＡを２６０ｎｍ吸光度により定量し、−８０℃で保存した。

全反応はＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ７７００ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して２回ずつ実施した。ヒトＧＡＰＤＨｍＲＮＡ（ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）のプライマーセットを内部標準として使用した。ＮＳ５Ｂポリメラーゼの活性部位のＧＤＤモチーフをコードする配列をＧＡＡで置換した突然変異体構築物のｉｎ ｖｉｔｒｏ転写により得られたトランスフェクトＲＮＡをカリブレーターとして使用した。比較Ｃｔ法と標準曲線法の両者を使用して２回の独立した実験からの結果を分析した。

蛋白質、ゲノムＤＮＡ及び全ＲＮＡの作製
全ＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ及び全蛋白質は製造業者の指示に従ってＴＲＩｚｏｌ試薬（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）の存在下に単層増殖させた細胞から精製した。

ノーザンブロット
Ｈｕｈ７細胞及びＨｕｈ７由来ＧＢＶＢレプリコン細胞クローンから抽出した全ＲＮＡ８μｇを１％アガロース／ホルムアルデヒドゲルで電気泳動させ、Ａｍｅｒｓｈａｍ’ｓ Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ^＋メンブランにブロットし、ＧＢＶ−Ｂ ＲＮＡプローブとハイブリダイズさせた。電気泳動、ブロット及びハイブリダイゼーション手順はＡｍｅｒｓｈａｍ’ｓ Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ^＋メンブラン指示マニュアルのプロトコールを若干変更して行った。マイナス鎖転写産物を生じる向きでＴ７プロモーター下にｐＣＲ２．１ベクターにクローニングしたＧＢＶ−Ｂゲノムフラグメント（ＦＬ３ゲノム配列のｎｔ４６４１−６０６０）のｉｎ ｖｉｔｒｏ転写により［α^３２Ｐ］−ＣＴＰ標識ＲＮＡプローブを作製した。

非定量的ＲＴ−ＰＣＲ
全ＲＮＡを使用して製造業者の条件下にＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩ逆転写酵素（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）により第１鎖ｃＤＮＡを合成した。ＰＣＲ増幅はエロンガーゼ酵素ミックス（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）又はＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して実施した。プライマーはＭＷＧ（ドイツ）から購入した。

ＧＢＶ−Ｂ複製の推定阻害剤の試験
ＧＢＶ−Ｂ又はＨＣＶレプリコンをもつＨｕｈ７細胞クローンを使用してヒトインターフェロンα−２ｂの効果を試験した。マルチウェル−６ウェルプレート（Ｆａｌｃｏｎ ｃａｔ Ｎ．３５−３０４６）の一連のウェルの各ウェルでＧ４１８を加えない培地に細胞（１ｘ１０^５個）をプレーティングした。１６時間後に培地を捨て、濃度を増加しながら試験化合物を新鮮な培地に加え、各系列のウェルに添加した。適当な希釈度の特定配合溶媒を使用して対照も試験した。

化合物の存在下又は化合物を加えない配合溶媒の存在下で細胞コンフルエンスにならないように細胞を３日間増殖させ、最後にＴＲＩｚｏｌで溶解させた。全ＲＮＡをＴＲＩｚｏｌプロトコール（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に記載されているように精製した。全ＲＮＡ１００μｌのうちの１０μｌを各反応で使用した。

ネオマイシンプライマーセット（ｔａｑ ＮＥＯ １，ＧＡＴＧＧＡＴＴＧＣＡＣＧＣＡＧＧＴＴ（配列番号１７）及びｔａｑ ＮＥＯ ５，ＣＣＣＡＧＴＣＡＴＡＧＣＣＧＡＡＴＡＧＣＣ（配列番号１８））とＮＥＯプローブ（１，６−カルボキシフルオレセイン−ＴＣＣＧＧＣＣＧＣＴＴＧＧＧＴＧＧＡＧ（配列番号１９）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−６−カルボキシローダミン）を使用してＴａｑ Ｍａｎ分析を実施した。特定プライマーセット（ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で定量したヒトＧＡＰＤＨｍＲＮＡを内部標準として使用した。モック処理細胞から抽出したＧＢＶ−Ｂ ＲＮＡをカリブレーターとして使用した。比較Ｃｔ法と標準曲線法の両者を使用して２回の独立した実験からの結果を分析した。

ウェスタンブロット
ＴＲＩｚｏｌ抽出により細胞１ｘ１０^６個から蛋白質抽出物を調製し、１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（３０−１００μｇ／スロット）で分画した。ゲルを常法によりニトロセルロースフィルターにブロットした。ＧＢＶ−Ｂ抗原に対して免疫反応性であることが先に確認されている４種のタマリン血清のプール（Ｓｂａｒｄｅｌｌａｔｉら，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．８２：２４３７−２４４８，２００１）をブロッキング緩衝液（ＴＢＳ中５％脱脂粉乳，０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０）で５０倍に希釈した希釈液と共にフィルターをインキュベートした。フィルターをブロッキング緩衝液で５回洗浄した後、マウス抗サル抗体（Ｓｉｇｍａ）と共にインキュベートした。更に５回洗浄した後、フィルターをＨＲＰ標識マウス抗体と共にインキュベートし、最後にＷｅｓｔ Ｐｉｃｏ Ｓｕｐｅｒｓｉｇｎａｌ化学発光基質（ＰＩＥＲＣＥ）で製造業者の指示に従って処理し、Ｘ線フィルム露光によりシグナルを検出した。

ＧＢＶ−Ｂ ｎｅｏ耐性レプリコンのクローニングと哺乳動物細胞のトランスフェクション
ＦＬ−３プラスミドを親分子として使用してＧＢＶ−Ｂサブゲノムレプリコン構築物を構築した。ＦＬ−３プラスミドはタマリン感染性ＧＢＶ−Ｂゲノム配列をコードする（Ｓｂａｒｄｅｌｌａｔｉら，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．８２：２４３７−２４４８，２００１．）。

ＧＢＶ−Ｂ２シストロンレプリコンを図４に模式的に示すように設計した。第１のシストロンでは、ＧＢＶ−Ｂ ５’ＵＴＲ配列はネオマイシンホスホトランスフェラーゼ選択マーカーの翻訳を行い、第２のシストロンはＮＳ３からＮＳ５ＢまでのＧＢＶ−Ｂ非構造蛋白質の翻訳を行うＥＭＣＶ内部リボソーム結合部位により形成され、コーディング領域の下流は完全ＧＢＶ−Ｂ ３’ＵＴＲ配列である。

５’ＵＴＲ／ｎｅｏ遺伝子境界が異なる４種のレプリコン型ｎｅｏ−ＲｅｐＡ、ｎｅｏ−ＲｅｐＢ、ｎｅｏ−ＲｅｐＣ及びｎｅｏ−ＲｅｐＤを図４に示す。ｎｅｏ−ＲｅｐＡでは、５’ＵＴＲを含むＧＢＶ−Ｂ内部リボソーム結合部位をＡＴＧポリプロテイン開始コドンまで挿入し、上流ＧＢＶ−Ｂコアコーディング配列なしにネオマイシンホスホトランスフェラーゼの翻訳を行う。ｎｅｏ−ＲｅｐＢでは、ＡＴＧの後にコア蛋白質の最初から７個のアミノ酸をコードする２１ヌクレオチドの配列を加え、ｎｅｏ遺伝子Ｎ末端融合蛋白質を産生する。ｎｅｏ−ＲｅｐＣでは、ＡＴＧの後にコア蛋白質の最初から１３個のアミノ酸をコードする３９ヌクレオチドの配列を加え、ｎｅｏ遺伝子Ｎ末端融合蛋白質を産生する。ｎｅｏ−ＲｅｐＤでは、ＡＴＧの後にコア蛋白質の最初から２１個のアミノ酸をコードする６３ヌクレオチドの配列を加え、ｎｅｏ遺伝子Ｎ末端融合蛋白質を産生する。全ｎｅｏ−Ｒｅｐ構築物で上記クローニングデザインにより得られたネオマイシンホスホトランスフェラーゼ蛋白質のＮ末端の前にネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子の上流のクローニング部位の付加に応じて３個のアミノ酸（ＧＲＡ）を挿入した。

人工的に形成したＳａｐＩ部位の直鎖化後にｎｅｏ−Ｒｅｐプラスミドをｉｎ ｖｉｔｒｏ転写させ、ゲノム感染性分子の厳密な３’末端までのＧＢＶ−Ｂサブゲノム転写産物を生産した。ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写ＲＮＡをＨｕｈ７ヒト肝癌細胞にエレクトロポレーションによりトランスフェクトした。ＮＳ５Ｂポリメラーゼの活性部位を突然変異させたｎｅｏ−ＲｅｐＢ−ＧＡＡプラスミドに由来するＲＮＡを陰性対照として使用した。

選択の不在下に２４時間増殖後にネオマイシン（Ｇ４１８）０．２５０ｍｇ／ｍｌを培地に添加した。Ｇ４１８の存在下に３０日間培養後に耐性クローンをピックアップし、個別細胞株として増殖させた。

典型的実験では、細胞２Ｘ１０^６個にｎｅｏ−ＲｅｐＡ ＲＮＡ１０μｇをトランスフェクションした場合には６４個のｎｅｏ耐性コロニーが選択され、ｎｅｏ−ＲｅｐＢをトランスフェクションした場合には７９３個のコロニーが選択され、ｎｅｏ−ＲｅｐＣをトランスフェクションした場合には７８０個のコロニーが選択され、ｎｅｏ−ＲｅｐＤをトランスフェクションした場合には１９２０個のコロニーが選択された。Ｇ４１８濃度を上げて選択後に同様にｎｅｏ−耐性クローンを単離しようとしたが単離できかなった。しかし、一旦クローンを単離して個別に増殖させると、細胞クローンの少なくとも一部ではＧ４１８濃度を上げることができた。

個別ｎｅｏ耐性細胞株は増殖速度に多少の変動を示した。１ｍｇ／ｍｌ Ｇ４１８に維持した急増殖クローンを「Ｂ７６．１／Ｈｕｈ７」と命名した。

Ｂ７６．１／Ｈｕｈ７はブダペスト条約に従い、Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｅｎｔｅｒ（ＡＢＣ），Ｉｎｔｅｒｌａｂ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｄｅｐｔ．），Ｌａｒｇｏ Ｒｏｓｓａｎａ Ｂｅｎｚｉ，１０，１６１３２ Ｇｅｎｏｖａ，イタリーに寄託した。寄託したＢ７６．１／Ｈｕｈ７は寄託番号ＰＤ０２００２と寄託日２００２年１月２２日を付与された。

レシピエントとして霊長類（タマリンとヨザル）非肝臓由来細胞株を使用してＧＢＶ−Ｂサブゲノム複製のトランスフェクションを追試しようと試みたが、失敗した。更に、ＧＢＶ−Ｂ遺伝子の代わりにＨＣＶ ＮＳ５Ｂ遺伝子をもつキメラＨＣＶｐｏｌ／ＧＢＶ−Ｂレプリコンから転写したＲＮＡは試験した細胞で複製することができなかった。

トランスフェクトＨｕｈ７細胞におけるＧＢＶ−Ｂ ＲＮＡの検出と定量
数個の個別ｎｅｏ−ＲｅｐＢ／Ｈｕｈ７細胞クローンからＲＮＡを抽出し、種々のプライマーセットを使用して非定量的ＲＴ−ＰＣＲを実施した。逆転写段階を加えた場合にしかＰＣＲ産物は得られず、増幅が排他的にＲＮＡ依存性であり、ＲＮＡ調製物中の残留ＤＮＡの存在によるものではないことが判明した。更に、細胞クローンゲノムＤＮＡ調製物からＧＢＶ−Ｂ及びｎｅｏ遺伝子配列の両者が増幅されないため、レプリコンコピーが宿主ゲノムＤＮＡに組込まれることもなかった。

非耐性クローンでレプリコンＲＮＡ分子の定量的測定を得るために、ｎｅｏ−ＲｅｐＢ ＲＮＡのトランスフェクション後に選択された個別細胞クローンでＧＢＶ−Ｂ ５’ＵＴＲ領域に相補的なプライマーとプローブを使用してＴａｑｍａｎ ＲＴ−ＰＣＲを実施した。結果を表１に要約するが、レプリコン配列のＲＮＡ依存性増幅が確認され、ＧＢＶ−Ｂゲノム等価物（Ｇ．Ｅ．）／細胞の数は３０〜１００であることが分かった。表１に示すように、Ｇ４１８の濃度を上げるとＧ．Ｅ．／細胞はクローンＢ７６．１／Ｈｕｈ７では３倍になった。

ＧＢＶ−Ｂ蛋白質の検出
個別細胞クローンの抽出物でウェスタンブロット実験を実施することによりレプリコンクローンから産生されるＧＢＶ−Ｂ ＮＳ３蛋白質を可視化した。血清変換が既に検出されているＧＢＶ−Ｂ感染タマリン血清のプール（Ｓｂａｒｄｅｌｌａｔｉら，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．８２：２４３７−２４４８，２００１）をＧＢＶ−Ｂ蛋白質に対する免疫試薬として使用した。その結果、モックトランスフェクト細胞には存在しない特定バンドがＮＳ３の予想分子量に検出された。精製ＧＢＶ−Ｂ ＮＳ３調製物を陽性対照として使用してＮＳ３蛋白質の同定を確認した。

ＮＳ３に類似の寸法のＮＳ５Ｂに対する前記血清の反応性は精製抗原をコーティングすることによりＥＬＩＳＡにより検出可能であったが（Ｓｂａｒｄｅｌｌａｔｉら，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．８２：２４３７−２４４８，２００１）、ウェスタンブロットでは検出できなかった。これは陽性対照として使用した精製ＮＳ５Ｂに対するシグナルの不在により確認された。

ＧＢＶ−ＢＲｅｐＢ／Ｈｕｈ７クローンに及ぼす抗ウイルス化合物の効果
ヒトαインターフェロン（α−ＩＦＮ）及び他の化合物がＧＢＶ−Ｂレプリコンシステムに及ぼす効果を調べ、ＨＣＶ抗ウイルス剤に対するＧＢＶ−Ｂレプリコンの感受性を評価した。Ｂ７６．１／Ｈｕｈ７細胞を単独使用又は１０Ａ細胞と併用して種々の抗ウイルス剤の効果を調べた。

Ｂ７６．１／Ｈｕｈ７及び１０Ａの細胞１０^５個を使用して実験を実施し、６マルチウェルプレートの個別ウェルにプレーティングし、Ｇ４１８の不在下に一晩インキュベートした。翌日、試験化合物の系列希釈液を含む新鮮な培地に培地を交換した。特異的増殖阻害を避けるようにコンフルエンスに達しないように注意しながら、試験化合物又は配合溶媒の存在下に３日間まで細胞を増殖させた（Ｐｉｅｔｓｃｈｍａｎｎら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７５：１２５２−１２６４，２００１．）。ＲＮＡを抽出し、ＨＣＶ及びＧＢＶ−Ｂ ＲＮＡ分子の測定方法による差異が生じないようにネオマイシン遺伝子に特異的なプライマー−プローブセットを使用してＴａｑＭａｎ分析を実施した。

ヒトα−ＩＦＮの効果を図５に示す。ヒトα−ＩＦＮはＣ型肝炎感染の治療に承認されており、ＨＣＶレプリコンに作用することが報告されている（Ｆｒｅｓｅら，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．８２：７２３−７３３，２００１，Ｇｕｏら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７５：８５１６−８５２３，２００１．）。ヒトα−ＩＦＮはＧＢＶ−Ｂ及びＨＣＶレプリコンに同等の効果があり、ＩＣ_５０はＧＢＶ−Ｂが０．４５Ｕ／ｍｌであり、ＨＣＶが０．５８である。

ＧＢＶ−Ｂレプリコン配列変動
Ｈｕｈ７で複製することが可能なＧＢＶ−ＢレプリコンＲＮＡ分子は親全長感染性ＲＮＡに対して配列変動を示さなかった。完全レプリコンに相当するＧＢＶ−Ｂレプリコンの部分をＢ７６．１／Ｈｕｈ７細胞の全ＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲにより増幅し、サブクローニングして配列決定した。独立したＲＴ−ＰＣＲから得られた領域毎に２個のサブクローンを配列決定した。

領域毎に分析した個別サブクローンのいずれにも一貫して突然変異は認められず、適応的突然変異の不在が示唆された。各ＧＢＶ−Ｂ領域の２個のサブクローンの一方のみに存在する散発的突然変異が観察された。散発的突然変異はＰＣＲエラーによると考えられた。あるいは、各分子に突然変異が存在しないこの細胞株に混合レプリコンＲＮＡ集団が存在するためであるとも説明される。

ＨＣＶレプリコンに報告されている適応的突然変異の位置（Ｂａｒｔｅｎｓｃｈｌａｇｅｒら，Ａｎｔｉｖｉｒａｌ Ｒｅｓ．５２：１−１７，２００１）をＧＢＶ−Ｂレプリコンに推定される配列中の対応するアミノ酸残基と比較した。結果を図６に報告するが、ＧＢＶ−Ｂに「ＨＣＶ適応」アミノ酸が存在するのはＮＳ５ＢのＨＣＶ突然変異Ｒ２８８４Ｇ（Ｌｏｈｍａｎｎら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７５：１４３７−１４４９，２００１）の１例のみであり、ＧＢＶ−Ｂ複製ＲＮＡにグリシン残基が存在している。

レプリコン強化細胞
レプリコン強化細胞はＧＢＶ−Ｂレプリコンのトランスフェクション及び複製効率が増加している。Ｂ７６．１／Ｈｕｈ７細胞に由来するレプリコンＲＮＡを除去し、除去細胞ｃＢ７６．１／Ｈｕｈ７を親Ｈｕｈ７と比較することによりレプリコン強化細胞の効果を評価した。

常在ＧＢＶ−ＢレプリコンＲＮＡ分子の複製の完全な阻害と完全な分解を達成するために十分な時間にわたって高濃度ヒトα−ＩＦＮを使用してＢ７６．１／Ｈｕｈ７細胞培養物からレプリコンＲＮＡを除去した。Ｂ７６．１／Ｈｕｈ７を１００Ｕ／ｍｌα−ＩＦＮの存在下でネオマイシンの不在下に１５日間培養した。処理の終了時に選択ＲＮＡレプリコン分子の消滅をＴａｑＭａｎ分析により検証し、「除去」クローンが選択マーカーネオマイシンの存在下で増殖できないことにより確認した。

得られた除去細胞株を「ｃＢ７６．１／Ｈｕｈ７」と命名した。ｎｅｏ−ＲｅｐＢプラスミドからｉｎ ｖｉｔｒｏ転写したＲＮＡをｃＢ７６．１／Ｈｕｈ７にトランスフェクトし、ネオマイシン選択下に維持した。トランスフェクションに使用した細胞の８０％以上が生存し、生殖細胞へのトランスフェクションは野生型Ｈｕｈ７細胞の１０００倍となることが分かった。

ｃＢ７６．１／Ｈｕｈ７はブダペスト条約に従い、Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｅｎｔｅｒ（ＡＢＣ），Ｉｎｔｅｒｌａｂ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｄｅｐｔ．），Ｌａｒｇｏ Ｒｏｓｓａｎａ Ｂｅｎｚｉ，１０，１６１３２ Ｇｅｎｏｖａ，イタリーに寄託した。寄託したｃＢ７６．１／Ｈｕｈ７は寄託番号ＰＤ０２００１と寄託日２００２年１月２２日を付与された。

ｂｌａ−ＲｅｐＢプラスミドから転写したＲＮＡのトランスフェクション後に比色アッセイを使用してｃＢ７６．１／Ｈｕｈ７細胞におけるＲｅｐＢ ＲＮＡの複製効率の増加を野生型Ｈｕｈ７細胞に比較してモニターした。ｂｌａ−ＲｅｐＢプラスミドは選択マーカーネオマイシンホスホトランスフェラーゼの代わりにβ−ラクタマーゼマーカーを発現する。システムの感受性の相違を考慮すると、β−ラクタマーゼ依存性システムで得られた結果はネオマイシン耐性を使用して得られたデータと完全に一致した。ｂｌａ−ＲｅｐＢをトランスフェクトしたｃＢ７６．１／Ｈｕｈ７細胞をα−ＩＦＮで処理すると、青色細胞数がバックグラウンドレベルまで減り、この株が実際にＲｅｐＢ複製に依存性であることが立証された。

リアルタイムＴａｑＭａｎによりトランジェント複製の定量分析を行った。トランスフェクションから３日後にｃＢ７６．１／Ｈｕｈ７細胞ではＲｅｐＢ ＲＮＡが非複製対照の２０〜３０倍となることが観察されたが、未選択Ｈｕｈ７ではＲｅｐＢ ＲＮＡは検出限界未満であった。これらのデータによると、クローンＢ７６．１／Ｈｕｈ７を生じた細胞は元のトランスフェクトＨｕｈ７集団の他の細胞の大多数よりも高度に複製を維持することができた。

最初にｎｅｏ−ＲｅｐＢ ＲＮＡをトランスフェクトしてＧ４１８の不在下に２週間維持した８個の個別細胞株にｂｌａ−ＲｅｐＢプラスミドから転写したＲＮＡをトランスフェクトした。全細胞株は元の非クローンＨｕｈ７集団（０．００５％真青色細胞，３％薄青色細胞）よりも著しく高い効率で複製を維持し、種々のクローン間にある程度の染色強度の変動があったが、青色細胞１０〜８０％であった。従って、最初に同定されたｎｅｏ耐性クローンの大半は使用した選択システムの検出閾値を下回る基線よりもＧＢＶ−ＢレプリコンＲＮＡの複製を増加することが可能な全Ｈｕｈ７集団で選択されたトランスフェクト細胞に実際に由来すると思われる。

全長ＧＢＶ−Ｂの複製における強化細胞の使用
ＧＢＶ−Ｂ全長ゲノムＦＬ３ ＲＮＡ（ＥＭＢＬ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ ＡＪ２７７９４７）を対応するＧＡＡ対照と平行してＨｕｈ７及び強化細胞ｃＢ７６．１／Ｈｕｈ７にトランスフェクトした。細胞内ＧＢＶ−Ｂ ＲＮＡをＴａｑｍａｎにより経時実験で測定した。

レプリコン強化細胞は全長ゲノム複製を維持することができた。これに対して、Ｈｕｈ７にＦＬ３をトランスフェクションしても検出可能なＦＬ３複製は得られなかった。

ｃＢ７６．１／Ｈｕｈ７強化細胞のトランスフェクションの結果、６日後に細胞約５ｘ１０^５個から抽出されたＦＬ３ ＲＮＡの量は１．１５ｘ１０^６Ｇ．Ｅ．であり、突然変異体ＧＡＡ構築物をトランスフェクトした同数の細胞から抽出されたＲＮＡは１．１５ｘ１０^５Ｇ．Ｅであった。トランスフェクト細胞をインターフェロンで処理すると、ＦＬ３ ＲＮＡ量は１０〜２０分の１になり、ＧＡＡ突然変異体ＲＮＡ量は変わらなかった。インターフェロンがＧＡＡ突然変異体に感受性でないことから、トランスフェクションから６日後に検出可能なＧＡＡ ＲＮＡは非複製入力ＲＮＡに対応すると思われた。

強化細胞のＧＢＶ−Ｂ感染
タマリンでウイルスの継代後に産生されたＧＢＶ−Ｂウイルス接種材料を使用してＨｕｈ７及びｃＢ７６．１／Ｈｕｈ７強化細胞に感染させた。０．７５ Ｇ．Ｅ．／細胞の感染多重度でプレーティングから１日後にＧＢＶ−Ｂを含むタマリン血清をマルチウェル６ウェルで細胞１０^５個に重層した。６時間吸着後にウイルス含有血清を除去し、細胞を十分に洗浄し、無血清ＤＭＥＭ中でインキュベートした。個別ウェルからの細胞を種々の時点でＴｒｉｚｏｌで溶解させ、ＧＢＶ−Ｂ ＲＮＡをＴａｑｍａｎにより定量した。

別法として、細胞１０^６個を未希釈ウイルス含有血清（１０^６Ｇ．Ｅ．）と混合し、エレクトロポレーションした。細胞を密度１０^５／ウェルでプレーティングし、ＲＮＡエレクトロポレーションの実験について記載したように処理した。インターフェロンの存在下と不在下で同時に２個ずつウェルを試験した。個別ウェルからの細胞を種々の時点でＴｒｉｚｏｌで溶解させ、ＧＢＶ−Ｂ ＲＮＡをＴａｑｍａｎにより定量した。エレクトロポレーション直後に検出可能なＧ．Ｅ．の量は１０^３Ｇ．Ｅ．であり、２４時間と４８時間では検出不能であり、３日目は１０^４Ｇ．Ｅ．であり、６日目は５ｘ１０^３（恐らく細胞密度による阻害）であり、インターフェロンで処理した対応するウェルではＲＮＡを検出できなかった。６日目にＩＦＮ処理細胞を捨て、非処理細胞を１：６に分割（＋／−インターフェロンで２回ずつ試験）すると、７日目にＲＮＡは再び１０^４Ｇ．Ｅ．に増加し、１０日目にほぼ検出不能なレベルまで低下した（阻害は細胞密度に起因すると思われる）。１０日目に非処理細胞を再び１：６に分割した。ＲＮＡを１３日と１６日に定量すると、夫々４ｘ１０^３Ｇ．Ｅ．及び１．２ｘ１０^４Ｇ．Ｅ．に対応する数値が得られた。最終点（１６日）の値は約０．１ Ｇ．Ｅ．／細胞に対応する。ＩＦＮの存在下に培養した細胞で得られた対応点はバックグラウンドシグナルを生じた。

付加レプリコン強化細胞の作製
ヒト肝癌細胞株ＨｅｐＧ２及びＨｅｐ３Ｂにｎｅｏ−ＲｅｐＢ ＲＮＡをトランスフェクトした。Ｈｅｐ３Ｂ（ＡＴＣＣから入手）では許容細胞株が観察されたが、ＨｅｐＧ２では観察されなかった。１１個のＨｅｐ３Ｂ許容細胞株を更に特性決定した。Ｈｅｐ３ＢはＡＴＣＣから入手した。

１１個の細胞株は親Ｈｅｐ３Ｂに対してＧＢＶ−Ｂ許容性の変化を示す。細胞株「ＲｅｐＢ／Ｈｅｐ３Ｂ−９」が最高である。中間の表現型をもつ細胞株は「ＲｅｐＢ／Ｈｅｐ３Ｂ−１１」である。ＲｅｐＢ／Ｈｅｐ３Ｂ−９及びＲｅｐＢ／Ｈｅｐ３Ｂ−１１に由来するレプリコンの突然変異を同定した（表２）。

ゲノムレプリコンをもつレプリコン強化細胞の作製
ｎｅｏ−ＲｅｐＤのＥＭＣＶ ＩＲＥＳとＧＢＶＢ ＮＳ３の間にコア−Ｅ１−Ｅ２−ＮＳ２をコードする遺伝子を挿入することによりＧＢＶ−Ｂ選択全長レプリコン（ｎｅｏ−ＦＬ−Ｄ）を構築した。このクローンから転写したＲＮＡをｃＢ７６／Ｈｕｈ７細胞にエレクトロポレーションした。全長レプリコンをもつ３種の細胞株を単離し、ｎｅｏ−ＦＬ−Ｄの存在と複製をｑＰＣＲと通常のＰＣＲにより確認した。

ｎｅｏ−ＦＬ−Ｄをもつ３種の異なる細胞株からの突然変異を表３に示す。

全３種の細胞株をＩＦＮで処理した。この処理により第２世代除去細胞が生じた。第２世代細胞にｎｅｏ−ＲｅｐＢ、ｎｅｏ−ＦＬ−Ｄ、ｂｌａ−ＦＬ−Ｄ（ｎｅｏ−ＦＬ−Ｄのｎｅｏに置換するβ−ラクタマーゼをコードする配列）及びＨＣＶレプリコン（Ｃｏｎｌレプリコンｗ．ｔ．配列及びＮＳ５Ａ Ａ２２７Ｔ対応突然変異体）を再トランスフェクトした。Ｃｏｎ１はＬｏｈｍａｎｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８５：１１０−１１３，１９９９に記載されている。

Ｎｅｏ−ＦＬ−Ｄとｂｌａ−ＦＬ−Ｄは第２世代除去ｃＦＬ／Ｈｕｈ７細胞株のみで効率的に複製した（ＦＬ−Ｄ／Ｈｕｈ７−１．１とＦＬ−Ｄ／Ｈｕｈ７−２．１に由来するものが最良）。第２世代除去細胞はサブゲノムｎｅｏ−ＲｅｐＢレプリコンの複製については親ｃＢ７６．１／Ｈｕｈ７よりも改善されなかった。細胞はｃＢ７６．１／Ｈｕｈ７に比較してｗ．ｔ．Ｃｏｎｌ ＨＣＶレプリコンの複製が強化され、ＮＳ５Ａ Ａ２２７Ｔ突然変異体ＨＣＶレプリコンについてはより高度に強化された。（ＦＬ−Ｄ／Ｈｕｈ７−３．１に由来するものが最良）。

他の態様も特許請求の範囲に含まれる。数種の態様について図面に示し、記載したが、本発明の精神と範囲から逸脱せずに種々の変更が可能である。

図１Ａはｎｅｏ−ＲｅｐＤレプリコン配列（配列番号１）を示す。 図１Ｂはｎｅｏ−ＲｅｐＤレプリコン配列（配列番号１）を示す。 図１Ｃはｎｅｏ−ＲｅｐＤレプリコン配列（配列番号１）を示す。 図１Ｄはｎｅｏ−ＲｅｐＤレプリコン配列（配列番号１）を示す。 図１Ｅはｎｅｏ−ＲｅｐＤレプリコン配列（配列番号１）を示す。 図１Ｆはｎｅｏ−ＲｅｐＤレプリコン配列（配列番号１）を示す。 図２Ａはタマリンで感染性の全長ＧＢＶ−Ｂレプリコン配列のｃＤＮＡ（配列番号２）を示す（Ｓｂａｒｄｅｌｌａｔｉら，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．８２：２４３７−２４４８，２００１）。 図２Ｂはタマリンで感染性の全長ＧＢＶ−Ｂレプリコン配列のｃＤＮＡ（配列番号２）を示す（Ｓｂａｒｄｅｌｌａｔｉら，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．８２：２４３７−２４４８，２００１）。 図２Ｃはタマリンで感染性の全長ＧＢＶ−Ｂレプリコン配列のｃＤＮＡ（配列番号２）を示す（Ｓｂａｒｄｅｌｌａｔｉら，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．８２：２４３７−２４４８，２００１）。 図２Ｄはタマリンで感染性の全長ＧＢＶ−Ｂレプリコン配列のｃＤＮＡ（配列番号２）を示す（Ｓｂａｒｄｅｌｌａｔｉら，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．８２：２４３７−２４４８，２００１）。 図２Ｅはタマリンで感染性の全長ＧＢＶ−Ｂレプリコン配列のｃＤＮＡ（配列番号２）を示す（Ｓｂａｒｄｅｌｌａｔｉら，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．８２：２４３７−２４４８，２００１）。 図２Ｆはタマリンで感染性の全長ＧＢＶ−Ｂレプリコン配列のｃＤＮＡ（配列番号２）を示す（Ｓｂａｒｄｅｌｌａｔｉら，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．８２：２４３７−２４４８，２００１）。 図２Ｇはタマリンで感染性の全長ＧＢＶ−Ｂレプリコン配列のｃＤＮＡ（配列番号２）を示す（Ｓｂａｒｄｅｌｌａｔｉら，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．８２：２４３７−２４４８，２００１）。 図３Ａはタマリンで感染性の全長ＧＢＶ−Ｂレプリコン配列のアミノ酸配列（配列番号３）を示す（Ｓｂａｒｄｅｌｌａｔｉら，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．８２：２４３７−２４４８，２００１）。 図３Ｂはタマリンで感染性の全長ＧＢＶ−Ｂレプリコン配列のアミノ酸配列（配列番号３）を示す（Ｓｂａｒｄｅｌｌａｔｉら，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．８２：２４３７−２４４８，２００１）。 ＧＢＶ−Ｂ ｎｅｏ−ＲｅｐＡ、ｎｅｏ−ＲｅｐＢ、ｎｅｏ−ＲｅｐＣ及びｎｅｏ−ＲｅｐＤ構築物の模式図である。 ＧＢＶ−Ｂ及びＨＣＶレプリコンの複製に及ぼすヒトα−ＩＦＮの効果を示す。 ＨＣＶ適応的突然変異に相当するＨＣＶ（配列番号１２）及びＧＢＶ−Ｂ（配列番号１３）レプリコンの推定アミノ酸配列のアラインメントを示す。

【配列表】

Claims (47)

1. 以下の領域：
   配列番号１の塩基１−４４５に実質的に類似するＧＢＶ−Ｂ ５’ＵＴＲ；
   前記ＧＢＶ−Ｂ ５’ＵＴＲに機能的に連結した選択又はレポーター配列；
   内部リボソーム結合部位；
   前記内部リボソーム結合部位とＡＵＧ翻訳開始コドンに機能的に連結した配列番号１の塩基１９３８−７７０９に実質的に類似するＮＳ３−ＮＳ５Ｂ配列；及び
   配列番号１の塩基７７１０−８０６９に実質的に類似するＧＢＶ−Ｂ ３’ＵＴＲを含み細胞中で複製することが可能であるＧＢＶ−Ｂレプリコン。
2. ＧＢＶ−Ｂ構造領域を更に含み、前記ＧＢＶ−Ｂ構造領域が前記ＧＢＶ−Ｂ ５’ＵＴＲに機能的に連結されている請求項１に記載のＧＢＶ−Ｂレプリコン。
3. 前記ＧＢＶ−Ｂ構造領域が配列番号１の塩基４４６−５１１、配列番号１の塩基４４６−４８７、配列番号１の塩基４４６−４６９、配列番号２の塩基４４６−２６４１のＲＮＡ型、及び配列番号２の塩基４４６−３２６５のＲＮＡ型からなる群から選択される配列に実質的に類似する配列を含む請求項２に記載のＧＢＶ−Ｂレプリコン。
4. 前記レプリコンが前記ＧＢＶ−Ｂ ５’ＵＴＲ；前記ＧＢＶ−Ｂ構造領域；前記選択又はレポーター配列；前記内部リボソーム結合部位；前記ＮＳ３−ＮＳ５Ｂ配列；及び前記ＧＢＶ−Ｂ ３’ＵＴＲから構成される請求項３に記載のＧＢＶ−Ｂレプリコン。
5. 前記内部リボソーム結合部位が配列番号１の塩基１３２４−１９３４の配列をもち；
   前記ＧＢＶ−Ｂ構造領域が配列番号１の塩基４４６−５１１、配列番号１の塩基４４６−４８７、配列番号１の塩基４４６−４６９、配列番号２の塩基４４６−２６４２のＲＮＡ型及び配列番号２の塩基４４６−３２６５のＲＮＡ型からなる群から選択される配列から構成され；
   前記ＮＳ３−ＮＳ５Ｂ領域が配列番号１の塩基１９３５−７７０９から構成されるＭｅｔ−ＮＳ３−ＮＳ５Ｂ領域であり；
   前記ＧＢＶ−Ｂ ３’ＵＴＲが配列番号１の塩基７７１０−８０６９である請求項４に記載のＧＢＶ−Ｂレプリコン。
6. 前記ＧＢＶ−Ｂ構造領域が配列番号２の塩基４４６−２６４２のＲＮＡ型又は配列番号２の塩基４４６−３２６５のＲＮＡ型から構成される請求項５に記載のＧＢＶ−Ｂレプリコン。
7. 前記レプリコンが配列番号１から構成される請求項１に記載のＧＢＶ−Ｂレプリコン。
8. 前記ＧＢＶ−Ｂ構造領域が配列番号１の塩基４４６−５１１、配列番号１の塩基４４６−４８７、配列番号１の塩基４４６−４６９、及び配列番号２の塩基４４６−２６４１のＲＮＡ型からなる群から選択される配列に実質的に類似する配列を含む請求項２に記載のＧＢＶ−Ｂレプリコン。
9. 前記レプリコンが前記ＧＢＶ−Ｂ ５’ＵＴＲ；前記選択又はレポーター配列；前記内部リボソーム結合部位；前記ＧＢＶ−Ｂ構造領域；前記ＮＳ３−ＮＳ５Ｂ領域の５’末端に結合した配列番号２の塩基２６４２−３２６５のＲＮＡ型に実質的に類似するＮＳ２領域を含むＮＳ２−ＮＳ５Ｂ領域；及び前記ＧＢＶ−Ｂ ３’ＵＴＲからなる請求項３に記載のＧＢＶ−Ｂレプリコン。
10. 前記内部リボソーム結合部位が配列番号１の１３２４−１９３４の配列をもち；
    前記ＧＢＶ−Ｂ構造領域が配列番号１の塩基４４６−５１１、配列番号１の塩基４４６−４８７、配列番号１の塩基４４６−４６９、及び配列番号２の塩基４４６−２６４１のＲＮＡ型からなる群から選択される配列を含み；
    前記ＮＳ２−ＮＳ５Ｂが前記５’ＡＵＧ翻訳開始コドン、前記ＮＳ２領域、及び前記ＮＳ３−ＮＳ５Ｂ領域から構成されるＭｅｔ−ＮＳ２−ＮＳ５Ｂ領域であり、前記ＮＳ２領域は配列番号２の塩基２６４２−３２６５のＲＮＡ型から構成され、前記ＮＳ３−ＮＳ５Ｂは配列番号１の塩基１９３８−７７０９から構成され；
    前記ＧＢＶ−Ｂ ３’ＵＴＲが配列番号１の塩基７７１０−８０６９である請求項９に記載のＧＢＶ−Ｂレプリコン。
11. 前記レプリコンが感染性ビリオンを産生する請求項１０に記載のＧＢＶ−Ｂレプリコン。
12. 請求項１から１１のいずれか一項に記載のＧＢＶ−Ｂレプリコンをコードするヌクレオチド配列に転写可能に結合したプロモーターを含む発現ベクター。
13. 請求項１から１１のいずれか一項に記載のレプリコンを細胞にトランスフェクトする段階と、前記レプリコンを単離する段階を含む方法により作製されたＧＢＶ−Ｂレプリコン。
14. 前記細胞がＨｕｈ７細胞、Ｈｅｐ３Ｂ細胞、Ｈｕｈ７細胞由来、又はＨｅｐ３Ｂ細胞由来である請求項１３に記載のＧＢＶ−Ｂレプリコン。
15. 第１のＧＢＶ−Ｂレプリコンから第２のＧＢＶ−Ｂレプリコンを作製する方法であって、
    ａ）請求項１から１１のいずれか一項に記載のレプリコンである第１のレプリコンを細胞にトランスフェクトする段階と、
    ｂ）前記トランスフェクト細胞からレプリコンを単離する段階と、
    ｃ）前記トランスフェクト細胞からの前記レプリコンのヌクレオチド配列を決定する段階と、
    ｄ）前記トランスフェクト細胞からの前記レプリコンに対応する１カ所以上の変異を第１のレプリコン配列に加えた第２のレプリコンを作製する段階を含む前記方法。
16. 前記細胞がＨｕｈ７細胞、Ｈｅｐ３Ｂ細胞、Ｈｕｈ７細胞由来、又はＨｅｐ３Ｂ細胞由来である請求項１５に記載の方法。
17. 化合物がＧＢＶ−Ｂレプリコン活性を変化させる能力の測定方法であって、
    ａ）請求項１から１１のいずれか一項に記載のＧＢＶ−Ｂレプリコンを含む細胞に前記化合物を添加する段階と、
    ｂ）ＧＢＶ−Ｂレプリコン活性に及ぼす効果の指標として前記化合物が１種以上のレプリコン活性を変化させる能力を測定する段階を含む前記方法。
18. 前記細胞がヒト肝癌細胞である請求項１７に記載の方法。
19. 前記細胞がＨｕｈ７細胞、Ｈｅｐ３Ｂ細胞、Ｈｕｈ７細胞由来、又はＨｅｐ３Ｂ細胞由来である請求項１８に記載の方法。
20. エレクトロポレーション法により配列番号１のＧＢＶ−Ｂレプリコンをトランスフェクトした場合に少なくとも２５％の維持及び活性効率をもつＧＢＶ−Ｂレプリコン強化細胞。
21. 前記細胞がヒト肝癌細胞に由来する請求項２０に記載の細胞。
22. 前記細胞がＨｕｈ７細胞又はＨｅｐ３Ｂ細胞に由来する請求項２１に記載の細胞。
23. 前記細胞がそのレプリコンを除去したＢ７６．１／Ｈｕｈ７細胞（ＡＢＣ寄託番号ＰＤ０２００２）である請求項２０に記載の細胞。
24. ＧＢＶ−Ｂレプリコン強化細胞の作製方法であって、
    ａ）請求項１から１１のいずれか一項に記載のＧＢＶ−Ｂレプリコンを細胞に導入及び維持する段階と、
    ｂ）前記細胞から前記ＧＢＶ−Ｂレプリコンを除去して前記レプリコン強化細胞を作製する段階を含む前記方法。
25. ｃ）ゲノムレプリコンである第２のＧＢＶ−Ｂレプリコンを前記レプリコン強化細胞に導入及び維持する段階と、
    ｄ）段階（ｃ）で作製された前記細胞から前記ゲノムレプリコンを除去する段階を更に含む請求項２４に記載の方法。
26. 前記細胞がＨｕｈ７細胞、Ｈｅｐ３Ｂ細胞、Ｈｕｈ７細胞由来、又はＨｅｐ３Ｂ細胞由来である請求項２４に記載の方法。
27. 機能的ＧＢＶ−Ｂレプリコンを含むＧＢＶ−Ｂレプリコン強化細胞の作製方法であって、
    ａ）請求項１から１１のいずれか一項に記載のレプリコンである第１のＧＢＶ−Ｂレプリコンを細胞に導入及び維持する段階と、
    ｂ）前記細胞から前記第１のレプリコンを除去して除去細胞を作製する段階と、
    ｃ）前記第１のＧＢＶ−Ｂレプリコンと同一でも異なっていてもよい第２のＧＢＶ−Ｂレプリコンを前記除去細胞に導入及び維持する段階を含む前記方法。。
28. 前記細胞がＨｕｈ７細胞、Ｈｅｐ３Ｂ細胞、Ｈｕｈ７細胞由来、又はＨｅｐ３Ｂ細胞由来である請求項２７に記載の方法。
29. 前記第１及び第２のＧＢＶ−ＢレプリコンにおけるＧＢＶ−Ｂコーディング配列が同一である請求項２８に記載の方法。
30. 前記第２のレプリコンが配列番号２のＲＮＡ型から構成される全長レプリコンである請求項２８に記載の方法。
31. 前記第２のレプリコンが第１のシストロンと第２のシストロンから構成されるレプリコンであり、前記第１のシストロンがＧＢＶ−Ｂ ５’ＵＴＲと配列番号２の塩基４４６−２６４２のＲＮＡ型又は配列番号２の塩基４４６−３２６５のＲＮＡ型を含み；前記第２のシストロンが配列番号１の塩基１９３５−７７０９に機能的に連結した内部リボソーム結合部位を含む請求項２８に記載の方法。
32. 請求項２４に記載の方法により作製されたＧＢＶ−Ｂレプリコン強化細胞。
33. ＧＢＶ−Ｂレプリコンを含むＧＢＶ−Ｂレプリコン強化細胞であって、請求項２０から２２のいずれか一項に記載の細胞と、請求項１から１１のいずれか一項に記載のレプリコン又は全長モノシストロンＧＢＶ−Ｂレプリコンを含む前記細胞。
34. 請求項３３に記載のＧＢＶ−Ｂレプリコンを含むＧＢＶ−Ｂレプリコン強化細胞であって、前記レプリコンが請求項１から１１のいずれか一項に記載のレプリコンである前記細胞。
35. 請求項３３に記載のＧＢＶ−Ｂレプリコンを含むＧＢＶ−Ｂレプリコン強化細胞であって、前記レプリコンが前記全長モノシストロンＧＢＶ−Ｂレプリコンであり、前記全長ＧＢＶ−Ｂレプリコンが配列番号２のＲＮＡ型から構成される前記細胞。
36. 請求項２７に記載の方法により作製されたＧＢＶ−Ｂレプリコンを含むＧＢＶ−Ｂレプリコン強化細胞。
37. 化合物がＧＢＶ−Ｂ活性を変化させる能力の測定方法であって、
    ａ）請求項３３に記載のレプリコンを含むＧＢＶ−Ｂレプリコン強化細胞に前記化合物を添加する段階と、
    ｂ）ＧＢＶ−Ｂ活性に及ぼす効果の指標として前記化合物が１種以上のレプリコン活性を変化させる能力を測定する段階を含む前記方法。
38. 前記段階（ｂ）がＧＢＶＢ蛋白質産生を測定する請求項３７に記載の方法。
39. 前記段階（ｂ）がＲＮＡ転写産物の産生を測定する請求項３７に記載の方法。
40. 化合物がＧＢＶ−Ｂ活性を変化させる能力の測定方法であって、
    ａ）請求項３６に記載のレプリコンを含むＧＢＶ−Ｂレプリコン強化細胞に前記化合物を添加する段階と、
    ｂ）ＧＢＶ−Ｂ活性に及ぼす効果の指標として前記化合物が１種以上のレプリコン活性を変化させる能力を測定する段階を含む前記方法。
41. 感染性ＧＢＶ−Ｂビリオンの作製方法であって、前記ＧＢＶ−Ｂビリオンを作製するのに適した条件下で請求項３３に記載のレプリコンを含むレプリコン強化細胞を培養する段階を含み、前記レプリコンが前記全長モノシストロンＧＢＶ−Ｂレプリコンである前記方法。
42. 動物にＧＢＶ−Ｂビリオンを感染させる方法であって、（ａ）請求項４１に記載の方法を使用して前記ビリオンを作製する段階と；（ｂ）前記ビリオンを前記動物に投与する段階を含む前記方法。
43. 前記動物がタマリン又はヨザル（Ａｏｔｕｓ種）である請求項４２に記載の方法。
44. 感染性ＧＢＶ−Ｂビリオンの作製方法であって、請求項３６に記載のレプリコンを含むレプリコン強化細胞を培養して前記ＧＢＶ−Ｂビリオンを作製する段階を含み、前記第２のレプリコンが全長ＧＢＶ−Ｂレプリコンである前記方法。
45. 動物にＧＢＶ−Ｂビリオンを感染させる方法であって、（ａ）請求項４４に記載の方法を使用して前記ビリオンを作製する段階と；（ｂ）前記ビリオンを前記動物に投与する段階を含む前記方法。
46. 前記動物がタマリン又はヨザル（Ａｏｔｕｓ種）である請求項４５に記載の方法。
47. 請求項１から１１のいずれか一項に記載のレプリコンに存在する１個以上のＧＢＶ−Ｂ領域又はその一部をＨＣＶに由来する対応領域で置換する段階を含むキメラＧＢＶ−Ｂ／ＨＣＶレプリコンの作製方法。

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