JP5816614B2 - 感染性c型肝炎ウイルス高生産hcv変異体及びその利用 - Google Patents
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Description
(b) 配列表の配列番号2に示されるアミノ酸配列を基準とした場合における第31番目のバリンがアラニンに、第74番目のリジンがスレオニンに、第451番目のグリシンがアルギニンに、第756番目のバリンがアラニンに、第786番目のバリンがアラニンに、そして第862番目のグルタミンがアルギニンに置換されている前駆体ポリプロテイン
(c) 配列表の配列番号2に示されるアミノ酸配列を基準とした場合における第74番目のリジンがスレオニンに、第451番目のグリシンがアルギニンに、第756番目のバリンがアラニンに、第786番目のバリンがアラニンに、そして第862番目のグルタミンがアルギニンに置換されている前駆体ポリプロテイン
(d) 配列表の配列番号2に示されるアミノ酸配列を基準とした場合における第31番目のバリンがアラニンに、第74番目のリジンがスレオニンに、第451番目のグリシンがアルギニンに、第786番目のバリンがアラニンに、そして第862番目のグルタミンがアルギニンに置換されている前駆体ポリプロテイン
(e) 配列表の配列番号2に示されるアミノ酸配列を基準とした場合における第31番目のバリンがアラニンに、第74番目のリジンがスレオニンに、第451番目のグリシンがアルギニンに、第756番目のバリンがアラニンに、そして第862番目のグルタミンがアルギニンに置換されている前駆体ポリプロテイン
(f) 配列表の配列番号2に示されるアミノ酸配列を基準とした場合における第862番目のグルタミンのみがアルギニンに置換されている前駆体ポリプロテイン
[3] 配列表の配列番号3、4又は5に示される塩基配列からなる、上記[2]の核酸。
本発明は、HCV JFH1の変異体であってそのウイルス粒子生産能を顕著に向上させる適応変異がゲノム中に導入された変異体ウイルスの、ゲノム配列を有する核酸に関する。本発明に係る核酸は、好ましくはHCV全長ゲノム配列を含む。
(1) 第31番目のバリンのアラニンへの置換(V31A)、
(2) 第74番目のリジンのスレオニンへの置換(K74T)、
(3) 第297番目のチロシンのヒスチジンへの置換(Y297H)、
(4) 第330番目のアラニンのスレオニンへの置換(A330T)、
(5) 第395番目のセリンのプロリンへの置換(S395P)、
(6) 第417番目のアスパラギンのセリンへの置換(N417S)、
(7) 第451番目のグリシンのアルギニンへの置換(G451R)、
(8) 第483番目のアスパラギン酸のグリシンへの置換(D483G)、
(9) 第501番目のアラニンのスレオニンへの置換(A501T)、
(10) 第756番目のバリンのアラニンへの置換(V756A)、
(11) 第786番目のバリンのアラニンへの置換(V786A)、
(12) 第931番目のグルタミンのアルギニンへの置換(Q931R)、及び
(13) 第961番目のセリンのアラニンへの置換(S961A)、
のうち1以上のアミノ酸置換を追加的に含むことも好ましい。
本発明は、(1)に記載された本発明に係る変異体核酸を用いて生産されるHCV粒子にも関する。このHCV粒子は、感染性ウイルス粒子であることが好ましい。
上記(2)により作製したHCV粒子を持続的に生産する細胞株を継代培養し続けることで、HCVゲノムに適応変異が起こり、HCV粒子生産が著しく向上することが期待された。通常、継代は十数回(1〜2ヶ月)行うが、本発明では、適応変異の導入のため、1年間、更に好ましくは2年間継代培養し続けた。
(2)で得られたHCV粒子はワクチンとしての用途、抗HCV抗体作製のための抗原としての用途に好適である。
HCV治療薬の開発を進めるにあたり、チンパンジー以外にウイルス感染を反映する有効な動物がないこと、効率的なin vitroウイルス培養系が存在しなかったことから、薬物の評価が十分に行うことができないことが障害となっていた。しかし、近年、HCV-RNAの複製を評価できるサブゲノムHCVレプリコンシステムが開発され(Lohmann, V. et al., Science, 285:110-113,1999)、ウイルス複製阻害に関するHCV阻害薬のスクリーニング系として重要な進歩を遂げた。
配列番号1:野生型JFH1(JFH1wt)の全長ゲノム配列
配列番号2:野生型JFH1(JFH1wt)の全長ゲノム配列によってコードされる、前駆体ポリプロテインのアミノ酸配列
配列番号3:変異体JFH1-A/WTの全長ゲノム配列。ヌクレオチド341位〜9442位までが前駆体ポリプロテインコード配列である。
配列番号10〜18:PCRプライマー
劇症肝炎の日本人患者から分離した遺伝子型2aのC型肝炎ウイルス(HCV)JFH1株(GenBank Accession No.AB047639;JP 2002-171978 A)のゲノムRNA全領域のcDNA(全ゲノムcDNA(full-genome cDNA);配列番号1)をT7プロモーターが挿入されたpUC19プラスミドベクター中のT7プロモーター配列の下流のEcoRI-XbaI部位にクローニングしたプラスミドDNAであるpJFH-1(Wakita, T. et al., Nat. Med., 11 (2005) p.791-796及び国際公開WO 2004/104198)を、DNA源として用いた。pJFH-1をXbaIで切断し、その後、Mung Bean Nuclease 20 U(トータル反応液量 50μL)を加えて30℃で30分間インキュベートすることによりXbaI切断末端を平滑化した。次いで、フェノールクロロホルム抽出、エタノール沈殿を行い、切断末端のCTAGの4塩基が除去されたXbaI切断断片を得た。このDNA断片を鋳型として、MEGAscript T7キット(Ambion社)を用いてRNAを合成した。こうして合成されたJFH1株の全長ゲノムHCV RNA(full-length genomic HCV RNA)を、以下のようにして細胞に導入した。
ウイルス感染24時間前に、24穴プレートにHuh7.5.1細胞を1穴あたり2x104個播種した。次に、実施例1で作製したJFH1wt及びJFH1aのウイルス粒子をHuh7.5.1細胞にM.O.I(multiplicity of infection)0.006で37℃、2時間感染させた。ウイルス液を除去して新しい培地を加え、37℃で、継続して7日間培養した。経時的に細胞を回収し、全RNA(total RNA)を抽出した。全RNAの抽出には、市販のRNA抽出試薬ISOGEN(ニッポンジーン社)を使い、添付のプロトコールに従って抽出を行った。RNAの定量は2ステップRT-PCRで実施し、cDNAへの変換にはReverTra Ace qPCR RT Kit(TOYOBO社)を使い、PCR反応はSYBR GreenI検出で行った。得られたPCR産物をLight Cycler(Roche社)を用いて解析することにより、細胞内のHCV RNAを定量した。JFH1aゲノムの検出に用いたプライマーの配列は、HCVのNS3領域を増幅するように設計されたプライマーであり、5’-CTTTGACTCCGTGATCGACC-3’(配列番号10)及び5’-CCCTGTCTTCCTCTACCTG-3’(配列番号11)であった。標準化用のアクチン遺伝子を増幅するプライマーとして、5’-TGGCACCCAGCACAATGAA-3’(配列番号12)及び5’-CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA-3’(配列番号13)を用いて同様に2ステップRT-PCRにより定量し、得られたデータから、全RNA 100ngあたりのHCV RNAコピー数を算出した(図2)。その結果、培養6日目で、JFH1aはJFH1wtの約1,000倍高い複製能を示すことが示された。
本実施例では、JFH1aの高いウイルス粒子生産能にとって重要な適応変異を調べる目的で、まず、JFH1aのゲノム配列の解析を行った。実施例2で得たJFH1aウイルス感染細胞から、ISOGEN-LS(ニッポンジーン社)を用いて全RNAを抽出し、逆転写反応によりcDNAを合成した。このcDNA合成の逆転写反応は特異的プライマーA9482: 5’-GGAACAGTTAGCTATGGAGTGTACC-3’(配列番号16)を使って、Transcriptor first Strand cDNA Synthesis Kit(Roche社)を用いて行った。逆転写の手順は、添付のプロトコールに従って行った。得られたcDNAを鋳型として、PCR反応によって、Coreタンパク質からNS3タンパク質までをコードする配列を増幅した。PCR用プライマーとしてはS58: 5’-TGTCTTCACGCAGAAAGCGCCTAG-3’(配列番号17)及びAS4639: 5’-CTGAGCTGGTATTATGGAGACGTCC-3’(配列番号18)を使用した。PCR反応により得られたDNA断片をpGEM-T Easyベクター(Promega社)中にライゲーションし、大腸菌DH5αに形質転換し、アンピシリン含有LB寒天培地上で培養し、形質転換大腸菌を選択した。6個のコロニーを取り出しLB培地中で一晩培養し、プラスミドをWizard Plus SV Miniprep DNA Purification System(Promega社)を用いて抽出精製し、PCR増幅したDNA断片の塩基配列を確認した。
実施例3で示した、JFH1aの高いウイルス粒子生産能に必要な適応変異を持つプラスミドの構築を行った。図4に示すように6つのクローンの塩基配列に共通して見出される変異アミノ酸のパターンから、JFH1aは少なくとも2つの変異株から構成されていることが判明した。ここでは、それぞれをグループA、グループBと呼称する。グループAとしてClone5-2、グループBとしてClone5-4を選び2種類の変異体キメラの作製を行った。Clone5-2及びClone5-4を、制限酵素AgeI及びSpeIを用いて消化し、PCRで増幅した5’側の変異を含む領域のDNA断片を得た。これらのDNA断片と、同様にAgeI及びSpeIで酵素処理して得られたpJFH-1ベクターの断片とをライゲーション反応により結合させることにより、それぞれpJFH1-A/WT、pJFH1-B/WTを得た。
野生型JFH1wtとその3種類の適応変異体JFH1-A/WT、JFH1-B/WT及びJFH1-mut5の、ウイルス粒子生産能について比較した。
次に、JFH1wt、JFH1a、JFH1-A/WT、JFH1-B/WT及びJFH1-mut5の5種類のHCVの感染伝播力を解析した。ウイルス感染20〜24時間前に、6穴プレートに1穴あたり1x105個のHuh7.5.1細胞を播種した。翌日、これら5種類のウイルスを0.001のM.O.I.(100 FFU/mL, 1 mL)で37℃、2時間感染させた。2時間後にウイルス液を除去し新しい培地2mlを加え、細胞を37℃で23日間継続培養した。細胞は3〜4日おきに20%程度を採取して継代し、その都度、上清を回収し-80℃で保存した。回収した培養上清中のウイルス感染価を実施例5に記載のウイルス力価測定法(focus forming assay)により測定した。その結果、JFH1aとJFH1-B/WTは感染後に急速にウイルス感染価が上昇し、感染の伝播が速かったことから、この2種類のウイルスは高い感染伝播力を有することが示された(図7)。
ウイルス高生産能を有し、かつ感染伝播力の高いJFH1適応変異体ウイルスJFH1-B/WTの持つ6ヶ所のアミノ酸変異(アミノ酸置換)について詳細に解析した。遺伝子の点変異導入には、サイトダイレクトミュータジェネシス法を使用するのが一般的である。変異体の作製は、QuickChange II XL Site-Directed Mutagenesis Kit(Stratagene社)を用い添付のプロトコールに従って、JFH1-B/WT又はJFH1wtの全長ゲノム配列をクローン化したプラスミドを鋳型として、点変異導入用プライマーを用いて行った。このようにしてHCVゲノム配列に導入した点変異は、DNAシークエンサーを用いて配列決定することにより確認した。
HCVの感染及び増殖を容易に検出するために、レポーター遺伝子としてルシフェラーゼ遺伝子を組み込んだ全長HCVゲノム配列を含む変異体を作製した。図15に、作製した変異体の構造図を示す。
HCV感染及び増殖に対する抑制効果が公知のインターフェロンを被検薬として、全長HCVゲノム配列にレポーター遺伝子を組み込んだJFH1変異体(実施例8)を用いた抗HCV物質のスクリーニング系の有効性を確認する実験を行った。
Claims (11)
- 1〜14個のアミノ酸置換を含むC型肝炎ウイルスJFH1株の前駆体ポリプロテインをコードする配列を含む核酸であって、前記前駆体ポリプロテインは、少なくとも配列表の配列番号2に示されるアミノ酸配列を基準とした場合における第862番目のグルタミンがアルギニンに置換されている、核酸。
- C型肝炎ウイルスJFH1株のゲノムの5'非翻訳領域と3'非翻訳領域とを含む、請求項1記載の核酸。
- 前記前駆体ポリプロテインが、第862番目のグルタミンのアルギニンへの置換(Q862R)に加えて、配列表の配列番号2に示されるアミノ酸配列を基準とした場合における、以下の(1)〜(13):
(1) 第31番目のバリンのアラニンへの置換(V31A)、
(2) 第74番目のリジンのスレオニンへの置換(K74T)、
(3) 第297番目のチロシンのヒスチジンへの置換(Y297H)、
(4) 第330番目のアラニンのスレオニンへの置換(A330T)、
(5) 第395番目のセリンのプロリンへの置換(S395P)、
(6) 第417番目のアスパラギンのセリンへの置換(N417S)、
(7) 第451番目のグリシンのアルギニンへの置換(G451R)、
(8) 第483番目のアスパラギン酸のグリシンへの置換(D483G)、
(9) 第501番目のアラニンのスレオニンへの置換(A501T)、
(10) 第756番目のバリンのアラニンへの置換(V756A)、
(11) 第786番目のバリンのアラニンへの置換(V786A)、
(12) 第931番目のグルタミンのアルギニンへの置換(Q931R)、及び
(13) 第961番目のセリンのアラニンへの置換(S961A)、
のうち1以上のアミノ酸置換をさらに含む、請求項1又は2記載の核酸。 - 前記前駆体ポリプロテインは、以下の(a)〜(f)からなる群から選択される前駆体ポリプロテインである、請求項1又は2記載の核酸。
(a) 配列表の配列番号2に示されるアミノ酸配列を基準とした場合における第74番目のリジンがスレオニンに、第297番目のチロシンがヒスチジンに、第330番目のアラニンがスレオニンに、第395番目のセリンがプロリンに、第417番目のアスパラギンがセリンに、第483番目のアスパラギン酸がグリシンに、第501番目のアラニンがスレオニンに、第862番目のグルタミンがアルギニンに、第931番目のグルタミンがアルギニンに、そして第961番目のセリンがアラニンに置換されている前駆体ポリプロテイン
(b) 配列表の配列番号2に示されるアミノ酸配列を基準とした場合における第31番目のバリンがアラニンに、第74番目のリジンがスレオニンに、第451番目のグリシンがアルギニンに、第756番目のバリンがアラニンに、第786番目のバリンがアラニンに、そして第862番目のグルタミンがアルギニンに置換されている前駆体ポリプロテイン
(c) 配列表の配列番号2に示されるアミノ酸配列を基準とした場合における第74番目のリジンがスレオニンに、第451番目のグリシンがアルギニンに、第756番目のバリンがアラニンに、第786番目のバリンがアラニンに、そして第862番目のグルタミンがアルギニンに置換されている前駆体ポリプロテイン
(d) 配列表の配列番号2に示されるアミノ酸配列を基準とした場合における第31番目のバリンがアラニンに、第74番目のリジンがスレオニンに、第451番目のグリシンがアルギニンに、第786番目のバリンがアラニンに、そして第862番目のグルタミンがアルギニンに置換されている前駆体ポリプロテイン
(e) 配列表の配列番号2に示されるアミノ酸配列を基準とした場合における第31番目のバリンがアラニンに、第74番目のリジンがスレオニンに、第451番目のグリシンがアルギニンに、第756番目のバリンがアラニンに、そして第862番目のグルタミンがアルギニンに置換されている前駆体ポリプロテイン
(f) 配列表の配列番号2に示されるアミノ酸配列を基準とした場合における第862番目のグルタミンのみがアルギニンに置換されている前駆体ポリプロテイン - 配列表の配列番号3、4又は5に示される塩基配列からなる、請求項2記載の核酸。
- レポータータンパク質をコードする核酸が、前記前駆体ポリプロテインのNS5Aタンパク質をコードする領域内に挿入されている、請求項1〜4のいずれか一項記載の核酸。
- 前記レポータータンパク質は、配列表の配列番号2に示されるアミノ酸配列を基準とした場合における第2394番目〜第2397番目のアミノ酸配列中に組み込まれて融合タンパク質として翻訳される、請求項6記載の核酸。
- 配列表の配列番号6又は7に示される塩基配列からなる、請求項7記載の核酸。
- 請求項1〜5のいずれか一項記載の核酸を含む、C型肝炎ウイルス粒子。
- 請求項9記載のC型肝炎ウイルス粒子を生産する、培養細胞。
- 請求項9記載のC型肝炎ウイルス粒子を不活化して得られる、免疫原性組成物。
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