JP6026419B2 - 遺伝子型３ａのＣ型肝炎ウイルスゲノム由来の核酸を含む核酸構築物 - Google Patents

Description

本発明は、遺伝子型３aのＣ型肝炎ウイルスゲノム由来の核酸、該核酸を含む核酸構築物及び抗Ｃ型肝炎ウイルス物質をスクリーニングする方法に関する。

Ｃ型肝炎ウイルス（Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ ｖｉｒｕｓ；以下、ＨＣＶ）の基礎研究及び抗ＨＣＶ薬の開発研究では、ＨＣＶを効率よく増幅できる実験系が必要不可欠である。具体的には、培養細胞においてＨＣＶを増幅させる系や培養細胞においてＨＣＶの増殖を評価する系が必要であり、これらの系が構築できれば上記の研究は飛躍的に進歩すると考えられる。

ＨＣＶは、フラビウイルス科に属する一本鎖の（＋）鎖センスＲＮＡをゲノムとするウイルスで、Ｃ型肝炎の原因になることが知られている。ＨＣＶは、遺伝子型又は血清型により多数の型に分類されており、ＨＣＶ株の塩基配列を用いたＳｉｍｍｏｎｄｓらによる系統解析法によると、ＨＣＶの遺伝子型は遺伝子型１〜６に分類され、さらにそれらはサブタイプに分類されている（非特許文献１）。現在では、ＨＣＶの複数の遺伝子型について、ゲノム全長の塩基配列が決定されている（非特許文献２〜５）。

ＨＣＶの感染は全世界に広がっており、日本、米国及び欧州においては、遺伝子型１のＨＣＶ感染患者の割合が多い。一方、インド、ネパール、パキスタン及びオーストラリアでは遺伝子型３のＨＣＶ感染患者の割合が多いのが特徴である（非特許文献６及び７）。

近年までは、ＨＣＶを培養細胞に感染させたり、ＨＣＶゲノムを培養細胞中で複製させたりすることはできなかったため、ＨＣＶの複製機構や感染機構についての研究は、チンパンジーを実験動物として用いたｉｎ ｖｉｖｏの実験をする必要があった。しかし、遺伝子型１ｂのＨＣＶであるＣｏｎ１株、ＨＣＶ−Ｎ株及びＨＣＶ−Ｏ株、並びに遺伝子型１ａのＨＣＶであるＨ７７ｃ株からサブゲノムレプリコンＲＮＡが作製されたことにより、ＨＣＶの複製機構の研究については、培養細胞を用いたｉｎ ｖｉｔｒｏの実験をすることが可能となった（特許文献１及び非特許文献８〜１１）。ここで、ＨＣＶのサブゲノムレプリコンＲＮＡとは、ＨＣＶゲノムの一部を含むＲＮＡで、感染性ＨＣＶ粒子の産生能はないが、培養細胞に導入した場合にＨＣＶゲノム由来のＲＮＡを自律複製できるＲＮＡのことである。

また、遺伝子型２ａのＨＣＶであるＪＦＨ−１株からは、サブゲノムレプリコンＲＮＡの作製のみならず、ｉｎ ｖｉｔｒｏで感染性ＨＣＶ粒子を産生するフルゲノムレプリコンＲＮＡが作製され、ＨＣＶの感染機構の研究についても、培養細胞を用いたｉｎ ｖｉｔｒｏの実験をすることが可能となった（非特許文献１２及び１３）。ここで、ＨＣＶのフルゲノムレプリコンＲＮＡとは、ＨＣＶゲノムの全長、すなわち、５’非翻訳領域、構造遺伝子、非構造遺伝子及び３’非翻訳領域を含むＲＮＡで、培養細胞に導入した場合にＨＣＶゲノム由来のＲＮＡを自律複製できるＲＮＡのことである。

現在のところ、培養細胞を用いたｉｎ ｖｉｔｒｏの系で感染性ＨＣＶ粒子を産生する能力を有するＲＮＡは、遺伝子型２ａのＪＦＨ−１株由来のＲＮＡだけであり、ＨＣＶワクチンの原料を得るためにｉｎ ｖｉｔｒｏの系でＨＣＶ粒子を大量調製できるのは、ＪＦＨ−１株のＨＣＶ又はＪＦＨ−１株由来のフルゲノムレプリコンに限られている。

Ｃ型肝炎に対する主な治療は、インターフェロン−αやインターフェロン−βの単独療法及びインターフェロン−αとプリン−ヌクレオシド誘導体であるリバビリンとの併用療法により行われている。しかしながら、これらの治療を行っても、全治療者の約６０％に治療効果が認められるだけであり、効果が出た患者であっても治療を中止すれば半分以上で再燃することがわかっている。また、インターフェロンの治療効果は、ＨＣＶの遺伝子型と関連し、遺伝子型１ｂに対しては効果が低く、遺伝子型２ａや３ａに対してはより効果が高いことが知られている（非特許文献１４）。インターフェロンの治療効果がＨＣＶの遺伝子型によって異なる原因については未だ明らかにされていないが、この原因の一つは、ＨＣＶの複製機構や複製効率に違いがあることによると考えられている。

近年、Ｃ型肝炎に対する新たな治療剤として、ＨＣＶ由来のプロテアーゼやポリメラーゼに対する阻害剤も開発されつつある。しかし、ＨＣＶのＮＳ３／４プロテアーゼ阻害剤であるＴＭＣ４３５は、遺伝子型３ａを除く遺伝子型１〜６に対しては阻害効果が高いが、遺伝子型３ａに対しては阻害効果が低く、遺伝子型によりＨＣＶに対する効果が異なることが報告されている（非特許文献１５）。

特開２００１−１７１８７号公報

Ｓｉｍｍｏｎｄｓら、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ、１９９４年、第１０巻、ｐ．１３２１−１３２４ Ｃｈｏｏら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９８９年、第２４４巻、ｐ．３５９−３６２ Ｋａｔｏら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、１９９２年、第６４巻、ｐ．３３４−３３９ Ｏｋａｍｏｔｏら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、１９９２年、第７３巻、ｐ．６７３−６７９ Ｙｏｓｈｉｏｋａら、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ、１９９２年、第１６巻、ｐ．２９３−２９９ ＧＲＡＶＩＴＺ、Ｎａｔｕｒｅ、２０１１年、 第４７４巻、ｐ．ｓ２−ｓ４ Ｒｅｈｍａｎら、Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｖａｃｃｉｎｅｓ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｙ、２０１１年、第９巻、ｐ．２−５ Ｌｏｍａｎｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９９９年、第２８５巻、ｐ．１１０−１１３ Ｂｌｉｇｈｔら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２０００年、第２９０巻、ｐ．１９７２−１９７４ Ｆｒｉｅｂｅら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、２００１年、第７５巻、ｐ．１２０４７−１２０５７ Ｉｋｅｄａら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、２００２年、第７６巻、ｐ．２９９７−３００６ Ｋａｔｏら、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ、２００３年、第１２５巻、ｐ．１８０８−１８１７ Ｗａｋｉｔａら、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、２００５年、第１１巻、ｐ．７９１−７９６ Ｍｏｒｉら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ、１９９２年、第１８３巻、ｐ．３３４−３４２ Ｒｅｅｓｉｎｋら、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ、２０１０年、第１３８巻、ｐ.９１３−９２１

しかしながら、現在作製されているＨＣＶのサブゲノムレプリコンＲＮＡは遺伝子型１ａ、１ｂ及び２ａのＨＣＶ株由来の数種類に限られており、また、感染性ＨＣＶ粒子を産生するフルゲノムレプリコンＲＮＡについては、作製されているのは、遺伝子型２ａのＪＦＨ−１株のゲノム由来又はＪＦＨ−１株とは異なる株由来の構造遺伝子とＪＦＨ−１株の非構造遺伝子とのキメラからなるゲノム由来のもののみである。したがって、ＨＣＶの遺伝子型と、ＨＣＶの複製機構又は複製効率との関係を解明することは困難であり、ＨＣＶワクチンの原料となる人為的に調製可能なＨＣＶ粒子の種類についても遺伝子型２ａに限定されるのが現状である。

さらに、同じ遺伝子型のＨＣＶ由来のサブゲノムレプリコンＲＮＡ又はフルゲノムレプリコンＲＮＡを用いた研究では、異なる遺伝子型間でＨＣＶの複製機構又は複製効率の差異を比較することができず、遺伝子型に依存しないで治療効果を発揮する抗ＨＣＶ薬の開発の糸口が未だ見つかっていない。

すなわち、ＨＣＶの研究分野及び医療分野において、遺伝子型に依存しない抗ＨＣＶ薬、特に、遺伝子型３ａに対する抗ＨＣＶ薬の開発のためには、遺伝子型３ａのＨＣＶの、株の取得及びレプリコンＲＮＡの作製が強く望まれている。

そこで本発明は、新規な遺伝子型３ａのＨＣＶの株、さらには、新規な遺伝子型３ａのＨＣＶ株由来の自律複製能を有するレプリコンＲＮＡを提供することを目的とする。

本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討した結果、急性Ｃ型肝炎患者から分離した新規な遺伝子型３ａのＨＣＶであるＳ３１０Ａ株を見出し、このＳ３１０Ａ株から、自律複製能を有するレプリコンＲＮＡの作製に成功し、本発明を完成させるに至った。

すなわち、本発明は、以下を包含する。

[1] 遺伝子型３ａのＣ型肝炎ウイルスゲノムの、配列番号１の塩基番号１〜３４０の塩基配列を含む５’非翻訳領域と、配列番号１４のアミノ酸番号１０３３〜１６６３のＮＳ３タンパク質のアミノ酸配列、アミノ酸番号１６６４〜１７１７のＮＳ４Ａタンパク質のアミノ酸配列、アミノ酸番号１７１８〜１９７８のＮＳ４Ｂタンパク質のアミノ酸配列、アミノ酸番号１９７９〜２４３０のＮＳ５Ａタンパク質のアミノ酸配列、及びアミノ酸番号２４３１〜３０２１のＮＳ５Ｂタンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列と、配列番号１の塩基番号９４０７〜９６５５の塩基配列を含む３’非翻訳領域とをこの順番で含む、核酸（ただし、該核酸がＲＮＡの場合は、塩基配列中のチミン（ｔ）をウラシル（ｕ）に読み替える）。

[2] 上記ＮＳ３タンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列が配列番号１の塩基番号３４３７〜５３２９の塩基配列を含み、
上記ＮＳ４Ａタンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列が配列番号１の塩基番号５３３０〜５４９１の塩基配列を含み、
上記ＮＳ４Ｂタンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列が配列番号１の塩基番号５４９２〜６２７４の塩基配列を含み、
上記ＮＳ５Ａタンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列が配列番号１の塩基番号６２７５〜７６３０の塩基配列を含み、
上記ＮＳ５Ｂタンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列が配列番号１の塩基番号７６３１〜９４０６の塩基配列を含む、
上記[1]記載の核酸。

[3] 上記５’非翻訳領域が、配列番号１の塩基番号１〜３４０の塩基配列中に、１又は複数の塩基の欠失、置換又は付加を含む、上記[1]又は[2]記載の核酸。

[4] 上記[1]〜[3]のいずれか記載の核酸の塩基配列に塩基変異を有する核酸であり、該塩基変異が配列番号１４に示されるアミノ酸配列を基準とした場合に以下の(a)〜（g）の少なくとも１つのアミノ酸置換を引き起こす塩基変異を含む、核酸。
（a） 第１２８６番目のスレオニンのイソロイシンへの置換
（b） 第２１８８番目のスレオニンのアラニンへの置換
（c） 第２１９８番目のアルギニンのヒスチジンへの置換
（d） 第２２１０番目のセリンのイソロイシンへの置換
（e） 第２４９６番目のスレオニンのイソロイシンへの置換
（f） 第２８９５番目のアルギニンのグリシンへの置換
（g） 第２８９５番目のアルギニンのリジンへの置換

[5] Ｃ型肝炎ウイルスゲノムの、Ｃｏｒｅタンパク質をコードする塩基配列、Ｅ１タンパク質をコードする塩基配列、Ｅ２タンパク質をコードする塩基配列、ｐ７タンパク質をコードする塩基配列、及びＮＳ２タンパク質をコードする塩基配列をさらに含む、上記[1]〜[4]のいずれか記載の核酸。

[6] Ｃｏｒｅタンパク質をコードする塩基配列が、配列番号１４のアミノ酸番号１〜１９１のＣｏｒｅタンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列であり、
Ｅ１タンパク質をコードする塩基配列が、配列番号１４のアミノ酸番号１９２〜３８３のＥ１タンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列であり、
Ｅ２タンパク質をコードする塩基配列が、配列番号１４のアミノ酸番号３８４〜７５２のＥ２タンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列であり、
ｐ７タンパク質をコードする塩基配列が、配列番号１４のアミノ酸番号７５３〜８１５のｐ７タンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列であり、
ＮＳ２タンパク質をコードする塩基配列が、配列番号１４のアミノ酸番号８１６〜１０３２のＮＳ２タンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列である、
上記[5]記載の核酸。

[7] 配列番号１及び４９〜５１のいずれかに示される塩基配列を含む、上記[5]記載の核酸。

[8] 配列番号１７〜２３及び５４のいずれかに示される塩基配列を含む、上記[4]記載の核酸。

上記[1]〜[8]記載の核酸は、外来遺伝子及び／又はＩＲＥＳ配列をさらに含んでもよい。

[9] 上記[1]〜[4]及び[8]のいずれか記載の核酸を含む、Ｃ型肝炎ウイルスのサブゲノムレプリコンＲＮＡ。

[10] 上記[5]〜[7]のいずれか記載の核酸を含む、Ｃ型肝炎ウイルスのフルゲノムレプリコンＲＮＡ。

[11] 上記[5]〜[7]のいずれか記載の核酸をウイルスゲノムとして含有する、Ｃ型肝炎ウイルス粒子。

上記[1]〜[8]記載の核酸は、ＤＮＡであってもよい。また上記[1]〜[8]記載の核酸、特にそのようなＤＮＡを含む、発現ベクターも、本発明の好ましい態様である。

[12] 上記[1]〜[8]のいずれか記載の核酸が導入された、細胞。

[13] 上記[11]記載のＣ型肝炎ウイルス粒子又はその一部分を含有する、Ｃ型肝炎ウイルスワクチン。

[14] 上記[11]のＣ型肝炎ウイルス粒子を抗原として認識する、Ｃ型肝炎ウイルスの抗体。

[15] 被験物質の存在下及び非存在下の双方で、上記[12]記載の細胞、又は上記[11]記載のＣ型肝炎ウイルス粒子とＣ型肝炎ウイルス感受性細胞との混合物、を培養する培養ステップと、
上記培養ステップで培養物中に得られたサブゲノムレプリコンＲＮＡ、フルゲノムレプリコンＲＮＡ又はＣ型肝炎ウイルス粒子の量を定量する定量ステップと、
上記定量ステップの結果、被験物質の存在下で培養した培養物中で定量されたサブゲノムレプリコンＲＮＡ、フルゲノムレプリコンＲＮＡ又はＣ型肝炎ウイルス粒子の量が、それぞれ上記被験物質の非存在下で培養した培養物中で定量されたサブゲノムレプリコンＲＮＡ、フルゲノムレプリコンＲＮＡ又はＣ型肝炎ウイルス粒子の量より少ない場合に、上記被験物質は抗Ｃ型肝炎ウイルス活性を有すると評価する評価ステップと、
を含む、抗Ｃ型肝炎ウイルス物質をスクリーニングする方法。

[16] 上記核酸が２以上のＣ型肝炎ウイルス株のゲノムに由来するキメラ核酸であり、配列番号１のＣ型肝炎ウイルスゲノム以外のＣ型肝炎ウイルスゲノムのＣｏｒｅタンパク質をコードする塩基配列、Ｅ１タンパク質をコードする塩基配列、Ｅ２タンパク質をコードする塩基配列及びｐ７タンパク質をコードする塩基配列と、
配列番号１の塩基番号２７８６〜３４３６の配列からなるＮＳ２タンパク質をコードする塩基配列、配列番号１のＣ型肝炎ウイルスゲノム以外のＣ型肝炎ウイルスゲノムのＮＳ２タンパク質をコードする塩基配列、又は、配列番号１の塩基番号２７８６〜３４３６の塩基配列からなるＮＳ２タンパク質をコードする塩基配列の一部と配列番号１のＣ型肝炎ウイルスゲノム以外のＣ型肝炎ウイルスゲノムのＮＳ２タンパク質をコードする塩基配列の一部とが連結されたキメラ型のＮＳ２タンパク質をコードする塩基配列と、
配列番号１における、塩基番号３４３７〜５３２９の配列からなるＮＳ３タンパク質をコードする塩基配列、塩基番号５３３０〜５４９１の配列からなるＮＳ４Ａタンパク質をコードする塩基配列、塩基番号５４９２〜６２７４の配列からなるＮＳ４Ｂタンパク質をコードする塩基配列、塩基番号６２７５〜７６３０の配列からなるＮＳ５Ａタンパク質をコードする塩基配列及び塩基番号７６３１〜９４０６の配列からなるＮＳ５Ｂタンパク質をコードする塩基配列とを、
５’側から３’側に向かって、この順で含む、上記[5]記載の核酸。

[17] 上記[16]記載の核酸の塩基配列に塩基変異を有する核酸であり、配列番号１４に示されるアミノ酸配列を基準とした場合に以下の(a)〜（g）の少なくとも１つのアミノ酸置換を引き起こす塩基変異を有する、核酸。
（a） 第１２８６番目のスレオニンのイソロイシンへの置換
（b） 第２１８８番目のスレオニンのアラニンへの置換
（c） 第２１９８番目のアルギニンのヒスチジンへの置換
（d） 第２２１０番目のセリンのイソロイシンへの置換
（e） 第２４９６番目のスレオニンのイソロイシンへの置換
（f） 第２８９５番目のアルギニンのグリシンへの置換
（g） 第２８９５番目のアルギニンのリジンへの置換

[18] 上記配列番号１の塩基番号１〜３４０の塩基配列を含む５’非翻訳領域に代えて、配列番号１のＣ型肝炎ウイルスゲノム以外のＣ型肝炎ウイルスゲノムの５’非翻訳領域を含む、上記[16]又は[17]記載の核酸。

[19] 上記[16]〜[18]記載の核酸を含む、Ｃ型肝炎ウイルスのキメラフルゲノムレプリコンＲＮＡ。

本明細書は本願の優先権主張の基礎となる日本国特許出願2011-189695号の開示内容を包含する。

本発明によれば、培養細胞において自律複製能を有する遺伝子型３ａのＨＣＶのレプリコンＲＮＡを提供できる。

ＨＣＶ Ｓ３１０Ａ株（野生型）の全長ゲノムＲＮＡの構造（Ａ）、Ｓ３１０Ａ株のＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡ発現ベクターｐＳ３１０ＡＳＧＲ−Ｎｅｏの構造（Ｂ）、及びｐＳ３１０ＡＳＧＲ−ＮｅｏからＴ７ポリメラーゼで合成されるＳ３１０Ａ株のＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡの構造（Ｃ）を示す図である。 野生型Ｓ３１０Ａ株のＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡを導入したＨｕｈ７細胞のコロニー形成の結果を示す。 Ｓ３１０Ａサブゲノムレプリコン複製細胞（クローン）中に含まれるＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡのコピー数の定量結果を示す。 Ｓ３１０Ａサブゲノムレプリコン複製細胞（クローン）におけるレプリコンＲＮＡ複製のインターフェロンに対する感受性を示す図である。 Ｓ３１０Ａサブゲノムレプリコン複製細胞（クローン）におけるレプリコンＲＮＡ複製のＮＳ３プロテアーゼ阻害剤ＶＸ−９５０に対する感受性を示す図である。 Ｓ３１０Ａサブゲノムレプリコン複製細胞（クローン）におけるレプリコンＲＮＡ複製のＮＳ３プロテアーゼ阻害剤ＢＩＬＮ−２０６１に対する感受性を示す図である。 Ｓ３１０Ａサブゲノムレプリコン複製細胞（クローン）におけるレプリコンＲＮＡ複製のＮＳ５Ｂポリメラーゼ阻害剤ＪＴＫ−１０９に対する感受性を示す図である。 Ｓ３１０Ａサブゲノムレプリコン複製細胞（クローン）におけるレプリコンＲＮＡ複製のＮＳ５Ｂポリメラーゼ阻害剤ＰＳＩ−６１３０に対する感受性を示す図である。 Ｓ３１０Ａサブゲノムレプリコン複製細胞（クローン）において同定したアミノ酸置換（変異）の位置を、ｐＳ３１０ＡＳＧＲ−Ｎｅｏの構造上に模式的に示した図である。 変異体Ｓ３１０Ａ株（適応変異が導入されたＳ３１０Ａ株）のＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡ発現ベクターの構造を示す図である。 野生型Ｓ３１０Ａ株のＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡ及びその変異体のＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡを導入した細胞のコロニー形成の結果を示す。 Ｎｅｏ遺伝子の代わりにルシフェラーゼ遺伝子（Ｌｕｃ）を挿入したＳ３１０Ａ株のＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡ及びその発現ベクターｐＳ３１０ＡＳＧＲ−Ｌｕｃの構造並びにそれらの作製過程を示す図である。 ルシフェラーゼ遺伝子を含む変異体Ｓ３１０Ａ株のＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡの複製能（発光強度）を示す図である。 変異体Ｓ３１０Ａ株（適応変異が導入されたＳ３１０Ａ株）のＨＣＶフルゲノムレプリコンＲＮＡ（ＨＣＶ全長ゲノム）の構造を示す図である。 変異体Ｓ３１０Ａ株のＨＣＶフルゲノムレプリコンＲＮＡ（ＨＣＶ全長ゲノム）のＨＣＶ粒子産生能（培養上清中のＣｏｒｅタンパク質量）を示す図である。 変異体Ｓ３１０Ａ株（適応変異が導入されたＳ３１０Ａ株）由来、Ｊ６ＣＦ株由来、ＪＦＨ−１株由来及びＴＨ株由来のＨＣＶゲノムの構造、並びに変異体Ｓ３１０Ａ株の非構造遺伝子とＪ６ＣＦ株由来、ＪＦＨ−１株由来又はＴＨ株由来の構造遺伝子とを含む、キメラＨＣＶゲノムの構造を示す図である。変異体Ｓ３１０Ａ株のＨＣＶフルゲノムレプリコンＲＮＡ（全長ゲノムＲＮＡ変異体）であるＳ３１０Ａ Ｒ２１９８Ｈ、Ｓ３１０Ａ Ｓ２２１０Ｉ、又はＳ３１０Ａ Ｒ２８９５Ｋは、それぞれＲ２１９８Ｈ、Ｓ２２１０Ｉ、又はＲ２８９５Ｋの変異を含んでおり、最上部に示すＨＣＶゲノムの構造上にはこれら変異の位置を一括して図示してある（実際は各変異を単独で含む）。

本明細書で使用される科学用語、技術用語及び命名法は、特に定義されない限り、当業者により普通に理解されるものと同じ意味を有する。また、分子生物学及び免疫学の分野における一般的技術及び学術用語については、ＳａｍｂｒｏｏｋらのＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（第３版、２００１年）及びＥｄ ＨａｒｌｏｗらのＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（１９８８年）に記載された手法及び定義に基づくものである。さらに、本明細書中に引用されている全ての刊行物、特許及び特許出願は、その全体が本明細書に参考として援用されるものである。

Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）は、一本鎖の（＋）鎖センスＲＮＡをゲノムとするウイルスである。ＨＣＶのゲノムは、５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）と、Ｃｏｒｅタンパク質、Ｅ１タンパク質、Ｅ２タンパク質、ｐ７タンパク質、ＮＳ２タンパク質、ＮＳ３タンパク質、ＮＳ４Ａタンパク質、ＮＳ４Ｂタンパク質、ＮＳ５Ａタンパク質及びＮＳ５Ｂタンパク質をコードする塩基配列（ウイルスタンパク質コード領域）と、３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）からなる。ＨＣＶゲノム（ＨＣＶ全長ゲノム）は、５’側から３’側に順番に、５’ＵＴＲと、Ｃｏｒｅタンパク質、Ｅ１タンパク質、Ｅ２タンパク質、ｐ７タンパク質、ＮＳ２タンパク質、ＮＳ３タンパク質、ＮＳ４Ａタンパク質、ＮＳ４Ｂタンパク質、ＮＳ５Ａタンパク質及びＮＳ５Ｂタンパク質をコードする塩基配列と、３’ＵＴＲを配置してなるＲＮＡである。ＨＣＶゲノムの一部からなる核酸と区別するために、その全長からなるＨＣＶゲノムを、「ＨＣＶ全長ゲノム」、「全長ＨＣＶゲノム」、「ＨＣＶ全長ゲノムＲＮＡ」、「全長ＨＣＶゲノムＲＮＡ」又は「全長ゲノムＲＮＡ」ともいう。

ＨＣＶは、その実態としては、ウイルス粒子として存在する。ＨＣＶのウイルス粒子（ＨＣＶ粒子）は、ＨＣＶの構造タンパク質から構成されるウイルスの殻の内部にＨＣＶゲノムを含有している。

ＨＣＶのＣｏｒｅタンパク質、Ｅ１タンパク質、Ｅ２タンパク質及びｐ７タンパク質は、ＨＣＶ粒子を形成する「構造タンパク質」であり、この構造タンパク質をコードする核酸を、「構造遺伝子」という。これらの構造遺伝子を含むＨＣＶゲノム上の配列は「構造領域」とも呼ばれる。ＨＣＶのＮＳ２タンパク質、ＮＳ３タンパク質、ＮＳ４Ａタンパク質、ＮＳ４Ｂタンパク質、ＮＳ５Ａタンパク質及びＮＳ５Ｂタンパク質は、ＨＣＶ粒子を形成しない「非構造タンパク質」であり、この非構造タンパク質をコードする核酸を、「非構造遺伝子」という。これらの非構造遺伝子を含むＨＣＶゲノム上の配列は「非構造領域」とも呼ばれる。非構造タンパク質は、ＨＣＶゲノムの複製、ＨＣＶタンパク質のプロセッシング等に関与する機能を有している。

ＨＣＶの５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）は、タンパク質翻訳のための内部リボソーム進入部位（以下、ＩＲＥＳ）及び複製に必要なエレメントを提供する。ＨＣＶの５’ＵＴＲは、ゲノムの５’末端から約３６０ヌクレオチドの領域である。

ＨＣＶの３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）は、ＨＣＶの複製を補助する。ＨＣＶの３’ＵＴＲは可変領域、ポリＵ領域、及び約１００ヌクレオチドの追加領域を含む。

ＨＣＶにおいては１０種類のウイルスタンパク質（Ｃｏｒｅタンパク質、Ｅ１タンパク質、Ｅ２タンパク質、ｐ７タンパク質、ＮＳ２タンパク質、ＮＳ３タンパク質、ＮＳ４Ａタンパク質、ＮＳ４Ｂタンパク質、ＮＳ５Ａタンパク質及びＮＳ５Ｂタンパク質）がこの順番で連結した１つの前駆体タンパク質（ポリプロテイン）として翻訳され、その後、細胞内及びウイルスのプロテアーゼにより、それぞれ、１０種類の成熟したウイルスタンパク質（Ｃｏｒｅタンパク質、Ｅ１タンパク質、Ｅ２タンパク質、ｐ７タンパク質、ＮＳ２タンパク質、ＮＳ３タンパク質、ＮＳ４Ａタンパク質、ＮＳ４Ｂタンパク質、ＮＳ５Ａタンパク質及びＮＳ５Ｂタンパク質）となる。

ＨＣＶには各種遺伝子型が知られているが、各種遺伝子型のＨＣＶのゲノムが同様の遺伝子構造を有することが知られている。本発明において、ＨＣＶの「遺伝子型」とはＳｉｍｍｏｎｄｓらによる国際分類に従って分類される遺伝子型を意味する。

配列表の配列番号１の塩基配列からなる核酸は、急性重症Ｃ型肝炎患者から分離された新規な遺伝子型３ａのＨＣＶであるＳ３１０Ａ株のゲノムである。配列番号１に示す配列は、Ｓ３１０Ａ株の全長ゲノムＲＮＡのｃＤＮＡ配列であるが、該塩基配列中のチミン（ｔ）をウラシル（ｕ）に読み替えたものがＲＮＡ配列である。患者からＨＣＶゲノムを分離する方法は、Ｋａｔｏら、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ、２００３年、第１２５巻、ｐ．１８０８−１８１７に記載されている。

上記のＳ３１０Ａ株の全長ＨＣＶゲノム配列（配列番号１）においては、５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）は、配列番号１の塩基番号１〜３４０の配列からなり、Ｃｏｒｅタンパク質コード配列は、配列番号１の塩基番号３４１〜９１３の配列からなり、Ｅ１タンパク質コード配列は、配列番号１の塩基番号９１４〜１４８９の配列からなり、Ｅ２タンパク質コード配列は、配列番号１の塩基番号１４９０〜２５９６の配列からなり、ｐ７タンパク質コード配列は、配列番号１の塩基番号２５９７〜２７８５の配列からなり、ＮＳ２タンパク質コード配列は、配列番号１の塩基番号２７８６〜３４３６の配列からなり、ＮＳ３タンパク質コード配列は、配列番号１の塩基番号３４３７〜５３２９の配列からなり、ＮＳ４Ａタンパク質コード配列は、配列番号１の塩基番号５３３０〜５４９１の配列からなり、ＮＳ４Ｂタンパク質コード配列は、配列番号１の塩基番号５４９２〜６２７４の配列からなり、ＮＳ５Ａタンパク質コード配列は、配列番号１の塩基番号６２７５〜７６３０の配列からなり、ＮＳ５Ｂタンパク質コード配列は、配列番号１の塩基番号７６３１〜９４０６の配列からなり、３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）は、配列番号１の塩基番号９４０７〜９６５５の配列からなる。このＳ３１０Ａ株の全長ＨＣＶゲノムの構造については、図１Ａに示す。

具体的には、Ｓ３１０Ａ株の全長ＨＣＶゲノム（配列番号１）の５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）は配列番号２に示す塩基配列からなり、Ｃｏｒｅタンパク質コード配列は配列番号３に示す塩基配列からなり、Ｅ１タンパク質コード配列は配列番号４に示す塩基配列からなり、Ｅ２タンパク質コード配列は配列番号５に示す塩基配列からなり、ｐ７タンパク質コード配列は配列番号６に示す塩基配列からなり、ＮＳ２タンパク質コード配列は配列番号７に示す塩基配列からなり、ＮＳ３タンパク質コード配列は配列番号８に示す塩基配列からなり、ＮＳ４Ａタンパク質コード配列は配列番号９に示す塩基配列からなり、ＮＳ４Ｂタンパク質コード配列は配列番号１０に示す塩基配列からなり、ＮＳ５Ａタンパク質コード配列は配列番号１１に示す塩基配列からなり、ＮＳ５Ｂタンパク質コード配列は配列番号１２に示す塩基配列からなり、３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）は配列番号１３に示す塩基配列からなる。

Ｓ３１０Ａ株の前駆体タンパク質のアミノ酸配列は配列番号１４に示されている。配列番号１４に示されるＳ３１０Ａ株の前駆体タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号１に示される野生型Ｓ３１０Ａ株の全長ゲノムＲＮＡのｃＤＮＡ配列の塩基番号３４１〜９４０６（終止コドンを含む）の配列からなる部分の塩基配列によりコードされる。

本発明は、上記の新規な遺伝子型３ａのＨＣＶであるＳ３１０Ａ株のゲノム及び、このＳ３１０Ａ株由来の自律複製能を有するレプリコンＲＮＡ又はその核酸を提供する。

「核酸」には、ＲＮＡ及びＤＮＡが含まれるものとする。また、本明細書における「タンパク質コード領域」、「タンパク質をコードする塩基配列」、「タンパク質をコードする配列」及び「タンパク質コード配列」とは、所定のタンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列のことをいい、開始コドン及び終止コドンは含んでいても含まなくてもよいものとする。

本明細書において、核酸がＲＮＡである場合に配列表の配列番号を引用してＲＮＡの塩基配列又は塩基を特定するときは、その配列番号に示される塩基配列中のチミン（ｔ）はウラシル（ｕ）に読み替えるものとする。

好ましい実施形態において、本発明は、遺伝子型３ａのＣ型肝炎ウイルス（例えば、Ｓ３１０Ａ株又はその変異体）のゲノムの、配列番号１の塩基番号１〜３４０の塩基配列を含む５’非翻訳領域と、配列番号１４（配列番号１の塩基配列によってコードされている前駆体タンパク質）のアミノ酸番号１０３３〜１６６３のＮＳ３タンパク質のアミノ酸配列、アミノ酸番号１６６４〜１７１７のＮＳ４Ａタンパク質のアミノ酸配列、アミノ酸番号１７１８〜１９７８のＮＳ４Ｂタンパク質のアミノ酸配列、アミノ酸番号１９７９〜２４３０のＮＳ５Ａタンパク質のアミノ酸配列、及びアミノ酸番号２４３１〜３０２１のＮＳ５Ｂタンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列と、配列番号１の塩基番号９４０７〜９６５５の塩基配列を含む３’非翻訳領域とをこの順番で含む、核酸を提供する。別の好ましい実施形態において、この核酸の５’非翻訳領域は、配列番号１の塩基番号１〜３４０の塩基配列中に、１又は複数（例えば２〜２０個、好ましくは２〜５個）の塩基の欠失、置換又は付加を含んでもよい。該核酸の５’非翻訳領域は、配列番号１の塩基番号１〜３４０の塩基配列と９５％以上、好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９９％以上、例えば９９．５％以上の塩基配列同一性を有することが好ましい。

一実施形態では、本発明の核酸は、配列番号１の塩基番号１〜３４０の塩基配列を含む５’非翻訳領域と、配列番号１の塩基番号３４３７〜５３２９の、ＮＳ３タンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列と、配列番号１の塩基番号５３３０〜５４９１の、ＮＳ４Ａタンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列と、配列番号１の塩基番号５４９２〜６２７４の、ＮＳ４Ｂタンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列と、配列番号１の塩基番号６２７５〜７６３０の、ＮＳ５Ａタンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列と、配列番号１の塩基番号７６３１〜９４０６の、ＮＳ５Ｂタンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列と、配列番号１の塩基番号９４０７〜９６５５の塩基配列を含む３’非翻訳領域とをこの順番で含む、核酸である。別の好ましい実施形態において、この核酸の５’非翻訳領域は、配列番号１の塩基番号１〜３４０の塩基配列中に、１又は複数（例えば２〜２０個、好ましくは２〜５個）の塩基の欠失、置換又は付加を含んでもよい。該核酸の５’非翻訳領域は、配列番号１の塩基番号１〜３４０の塩基配列と９５％以上、好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９９％以上、例えば９９．５％以上の塩基配列同一性を有することが好ましい。

本発明の核酸は、Ｃ型肝炎ウイルスゲノムの、Ｃｏｒｅタンパク質をコードする塩基配列、Ｅ１タンパク質をコードする塩基配列、Ｅ２タンパク質をコードする塩基配列、ｐ７タンパク質をコードする塩基配列、及びＮＳ２タンパク質をコードする塩基配列を含まなくてもよい。そのような本発明の核酸は、ＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡをコードしうる。

本発明の核酸は、Ｃ型肝炎ウイルスゲノムの、Ｃｏｒｅタンパク質をコードする塩基配列、Ｅ１タンパク質をコードする塩基配列、Ｅ２タンパク質をコードする塩基配列、ｐ７タンパク質をコードする塩基配列、及びＮＳ２タンパク質をコードする塩基配列をさらに含んでもよい。このような本発明の核酸は、ＨＣＶフルゲノムレプリコンＲＮＡをコードしうる。この場合、Ｃｏｒｅタンパク質をコードする塩基配列、Ｅ１タンパク質をコードする塩基配列、Ｅ２タンパク質をコードする塩基配列、ｐ７タンパク質をコードする塩基配列、及びＮＳ２タンパク質をコードする塩基配列は、遺伝子型３ａのＣ型肝炎ウイルス（例えば、Ｓ３１０Ａ株又はその変異体）のゲノム由来であってもよい。

遺伝子型３ａのＣ型肝炎ウイルスゲノム由来のものである場合、Ｃｏｒｅタンパク質をコードする塩基配列は、配列番号１４のアミノ酸番号１〜１９１のＣｏｒｅタンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列であることが好ましい。またＥ１タンパク質をコードする塩基配列は、配列番号１４のアミノ酸番号１９２〜３８３のＥ１タンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列であることが好ましい。Ｅ２タンパク質をコードする塩基配列が、配列番号１４のアミノ酸番号３８４〜７５２のＥ２タンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列であることが好ましい。ｐ７タンパク質をコードする塩基配列が、配列番号１４のアミノ酸番号７５３〜８１５のｐ７タンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列であることが好ましい。ＮＳ２タンパク質をコードする塩基配列が、配列番号１４のアミノ酸番号８１６〜１０３２のＮＳ２タンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列であることが好ましい。

Ｃｏｒｅタンパク質をコードする塩基配列、Ｅ１タンパク質をコードする塩基配列、Ｅ２タンパク質をコードする塩基配列、ｐ７タンパク質をコードする塩基配列、及びＮＳ２タンパク質をコードする塩基配列はまた、遺伝子型３ａ以外の遺伝子型（例えば、１ａ、１ｂ、２ａ、２ｂ、２ｃ、３ｂ、４、５ａ、又は６ａ）のＨＣＶ（例えばＨＣＶの既存株）のゲノム由来であってもよく、この場合はキメラ型の核酸（キメラ核酸）となる。

本発明の核酸は、上記核酸の塩基配列に１つ又は複数（好ましくは、2〜50個、例えば2〜10個）の塩基変異を含む核酸であってもよい。塩基変異は、限定するものではないが、好ましくは塩基の欠失、置換又は付加である。塩基変異は、アミノ酸置換を引き起こさない同義置換であってもよいし、自律複製能を喪失しない限り、アミノ酸置換を引き起こす非同義置換であってもよい。自律複製能を喪失しない限り、アミノ酸置換は保存的置換であっても非保存的置換であってもよい。

本発明の核酸はまた、配列番号１の塩基番号１〜３４０の塩基配列を含む５’非翻訳領域に代えて、遺伝子型３ａ以外の遺伝子型（例えば、１ａ、１ｂ、２ａ、２ｂ、２ｃ、３ｂ、４、５ａ、又は６ａ）のＨＣＶ（例えばＨＣＶの既存株）のゲノム由来の５’非翻訳領域を含んでもよい。

本発明の核酸はまた、外来遺伝子（薬剤耐性遺伝子又はレポーター遺伝子等）及びＩＲＥＳ配列を含んでもよい。

本発明の核酸は、ＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡ若しくはＨＣＶフルゲノムレプリコンＲＮＡ等のＨＣＶレプリコンＲＮＡ又はそれをコードする核酸であってよい。本発明の核酸は例えばＨＣＶレプリコンＲＮＡをコードする塩基配列を含む発現カセット等であってもよい。本発明の核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、又はＤＮＡとＲＮＡのキメラ等であってもよく、修飾塩基等を含んでいてもよい。

本発明において「レプリコンＲＮＡ」とは、培養細胞（典型的にはＨＣＶ感受性細胞）内で自律複製する能力を有するＲＮＡをいう。細胞に導入されたレプリコンＲＮＡは、自律複製し、そのＲＮＡコピーが細胞分裂後に娘細胞に分配されるため、レプリコンＲＮＡを用いれば細胞への安定的な導入が可能である。

ＨＣＶのレプリコンＲＮＡ（ＨＣＶレプリコンＲＮＡ）とは、ＨＣＶゲノムＲＮＡの一部又は全長を含む、自律複製するＲＮＡのことをいう。ＨＣＶゲノムＲＮＡの一部を含む自律複製するＲＮＡを、ＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡと呼び、ＨＣＶゲノムＲＮＡの全長を含む自律複製するＲＮＡを、ＨＣＶフルゲノムレプリコンＲＮＡと呼ぶ。「ＨＣＶレプリコンＲＮＡ」は、ＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡとＨＣＶフルゲノムレプリコンＲＮＡの両方を包含する。

本発明における「ＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡ」は、ＨＣＶの５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）と、ＮＳ３タンパク質、ＮＳ４Ａタンパク質、ＮＳ４Ｂタンパク質、ＮＳ５Ａタンパク質及びＮＳ５Ｂタンパク質をコードする塩基配列と、３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）を、５’側から３’側に向かってこの順で含むことが好ましい。また、ＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡは、その検出のために、外来遺伝子（例えば、薬剤耐性遺伝子又はレポーター遺伝子）及びＩＲＥＳ配列を含むことが好ましく、そのような場合、外来遺伝子（薬剤耐性遺伝子又はレポーター遺伝子）及びＩＲＥＳ配列は、ＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡのＮＳ３タンパク質コード領域の５’側に含むことが好ましい。

本発明の「ＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡ」は、好ましくは本発明の核酸を含む。本発明の「ＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡ」は、本発明の核酸から発現されるものが好ましい。本発明における一つの好適な「ＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡ」の例は、ＨＣＶの５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）と、Ｃｏｒｅタンパク質をコードする塩基配列の５’末端から５７ヌクレオチドの配列と、外来遺伝子（薬剤耐性遺伝子又はレポーター遺伝子）と、ＩＲＥＳ配列と、ＮＳ３タンパク質、ＮＳ４Ａタンパク質、ＮＳ４Ｂタンパク質、ＮＳ５Ａタンパク質、及びＮＳ５Ｂタンパク質をコードする塩基配列と、３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）を、５’側から３’側に向かってこの順で含むものである。

本発明における「ＨＣＶフルゲノムレプリコンＲＮＡ」は、ＨＣＶの５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）と、Ｃｏｒｅタンパク質、Ｅ１タンパク質、Ｅ２タンパク質、ｐ７タンパク質、ＮＳ２タンパク質、ＮＳ３タンパク質、ＮＳ４Ａタンパク質、ＮＳ４Ｂタンパク質、ＮＳ５Ａタンパク質及びＮＳ５Ｂタンパク質をコードする塩基配列と、３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）を、５’側から３’側に向かってこの順で配置してなるものが好ましい。ＨＣＶフルゲノムレプリコンＲＮＡは、さらに、外来遺伝子（薬剤耐性遺伝子又はレポーター遺伝子）及びＩＲＥＳ配列を含んでもよい。そのような場合、外来遺伝子（薬剤耐性遺伝子又はレポーター遺伝子）及びＩＲＥＳ配列は、ＨＣＶフルゲノムレプリコンＲＮＡのＣｏｒｅタンパク質をコードする塩基配列の５’側に含むことが好ましい。

ＨＣＶ全長ゲノム核酸が自律複製能を有する場合、該ゲノムはレプリコンＲＮＡである。ＨＣＶ全長ゲノム核酸を含むレプリコンＲＮＡを、ＨＣＶフルゲノムレプリコンＲＮＡと呼ぶ。ＨＣＶ全長ゲノム配列からなるＲＮＡ（ＨＣＶ全長ゲノムＲＮＡ）が自律複製能を有する場合、それはＨＣＶフルゲノムレプリコンＲＮＡである。

ＨＣＶレプリコンＲＮＡ（ＨＣＶフルゲノムレプリコンＲＮＡ及びＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡ）及び本発明の核酸が含み得る薬剤耐性遺伝子の例としては、例えば、ネオマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、チミジンキナーゼ遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、ピリチアミン耐性遺伝子、アデニリルトランスフェラーゼ遺伝子、ゼオシン耐性遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子、ブラストシジンＳ耐性遺伝子などが挙げられるが、ネオマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子が好ましく、ネオマイシン耐性遺伝子がさらに好ましい。

ＨＣＶレプリコンＲＮＡ及び本発明の核酸が含み得るレポーター遺伝子の例としては、例えば、発光反応や呈色反応を触媒する酵素の構造遺伝子が挙げられる。好ましいレポーター遺伝子の例としては、トランスポゾンＴｎ９由来のクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子、大腸菌由来のβグルクロニダーゼ又はβガラクトシダーゼ遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子、緑色蛍光タンパク質遺伝子、クラゲ由来のイクオリン遺伝子、分泌型胎盤アルカリフォスファターゼ（ＳＥＡＰ）遺伝子等が挙げられる。

薬剤耐性遺伝子やレポーター遺伝子は、ＨＣＶレプリコンＲＮＡ又は本発明の核酸中にどちらか一方のみが含まれていてもよいし、両方が含まれていてもよい。薬剤耐性遺伝子又はレポーター遺伝子は、ＨＣＶレプリコンＲＮＡ又は本発明の核酸に１つ含まれていてもよいし、２つ以上含まれていてもよい。薬剤耐性遺伝子やレポーター遺伝子が２つ以上含まれる場合は、それぞれの遺伝子をウイルス由来の２Ａペプチド遺伝子と正しい読み枠（インフレーム）となるように連結してもよい。２Ａペプチドとしては、Ｔｈｏｓｅａ ａｓｉｇｎａ ｖｉｒｕｓ由来の２Ａペプチド（Ｔ２Ａ）、Ｆｏｏｔ−ａｎｄ−ｍｏｕｔｈ ｄｉｓｅａｓｅ ｖｉｒｕｓ由来の２Ａペプチド（Ｆ２Ａ）、Ｅｑｕｉｎ ｒｈｉｎｉｔｉｓ Ａ ｖｉｒｕｓ由来の２Ａ ペプチド（Ｅ２Ａ）、Ｐｏｒｃｉｎｅ ｔｅｓｃｈｏｖｉｒｕｓ １由来の２Ａペプチド（Ｐ２Ａ）が挙げられる（Ｋｉｍら、ＰｏＬｏｓ Ｏｎｅ．、２０１１年、第６（４）巻、ｅ１８５５６）。

ＨＣＶレプリコンＲＮＡ及び本発明の核酸が含み得るＩＲＥＳ配列とは、上記と同様であり、例えば、ＲＮＡの内部にリボソームを結合させて翻訳を開始させることが可能な内部リボゾーム結合部位を意味する。ＩＲＥＳ配列の好ましい例としては、ＥＭＣＶ ＩＲＥＳ（脳心筋炎ウイルスの内部リボゾーム結合部位）、ＦＭＤＶ ＩＲＥＳ、ＨＣＶ ＩＲＥＳ等が挙げられるが、ＥＭＣＶ ＩＲＥＳ及びＨＣＶ ＩＲＥＳがより好ましく、ＥＭＣＶ ＩＲＥＳが最も好ましい。

ＨＣＶレプリコンＲＮＡ及び本発明の核酸においては、薬剤耐性遺伝子及び／又はレポーター遺伝子が、ＨＣＶレプリコンＲＮＡから正しい読み枠（インフレーム）で翻訳されるように連結される。ＨＣＶレプリコンＲＮＡ又は本発明の核酸にコードされるタンパク質は、一続きのポリペプチドとして翻訳され発現された後でプロテアーゼによって各タンパク質へと切断され、遊離するように、プロテアーゼ切断部位等を介して互いに連結させることが好ましい。

ＨＣＶ感受性細胞とは、細胞培養系でＨＣＶ粒子の感染やＨＣＶレプリコンＲＮＡの複製を許容する細胞を指し、Ｈｕｈ７細胞、ＨｅｐＧ２細胞、ＩＭＹ−Ｎ９細胞、ＨｅＬａ細胞、２９３細胞や、Ｈｕｈ７細胞の派生株であるＨｕｈ７．５細胞、Ｈｕｈ７．５．１細胞が挙げられる。また、Ｈｕｈ７細胞、ＨｅｐＧ２細胞、ＩＭＹ−Ｎ９細胞、ＨｅＬａ細胞又は２９３細胞にＣＤ８１遺伝子及び／又はＣｌａｕｄｉｎ１遺伝子を発現させた細胞も挙げることができる（Ｌｉｎｄｅｎｂａｃｈら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２００５年、第３０９巻、ｐ．６２３−６２６； Ｅｖａｎｓら、Ｎａｔｕｒｅ、２００７年、第４４６巻、ｐ．８０１−８０５； Ａｋａｚａｗａら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．２００７年、第８１巻、ｐ．５０３６−５０４５）。中でも、Ｈｕｈ７細胞又はＨｕｈ７細胞の派生株が特に好ましく使用される。なお、本発明において「派生株」とは、当該細胞から誘導された株をいう。

ＨＣＶゲノムの効率的な複製には、多くの場合、ゲノムの塩基配列に変異が起こることが必要であることが示されている（Ｌｏｈｍａｎｎら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、２００１年、第７５巻、ｐ．１４３７−１４４９）。複製能を向上させる変異は適応変異（ａｄａｐｔｉｖｅ ｍｕｔａｔｉｏｎ）と呼ばれている。

本発明の核酸及びＨＣＶレプリコンＲＮＡも、適応変異を含んでよい。例えば、上記のＳ３１０Ａ株の、ＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡの複製能が向上する適応変異としては、配列番号１４に示されるアミノ酸配列（Ｓ３１０Ａ株の前駆体タンパク質の全長アミノ酸配列）を基準とした場合に、Ｔ１２８６Ｉ（第１２８６番目のスレオニン（Ｔ）がイソロイシン（Ｉ）に変異）、Ｔ２１８８Ａ（第２１８８番目のスレオニン（Ｔ）がアラニン（Ａ）に変異）、Ｒ２１９８Ｈ（第２１９８番目のアルギニン（Ｒ）がヒスチジン（Ｈ）に変異）、Ｓ２２１０Ｉ（第２２１０番目のセリン（Ｓ）がイソロイシン（Ｉ）に変異）、Ｔ２４９６Ｉ（第２４９６番目のスレオニン（Ｔ）がイソロイシン（Ｉ）に変異）、Ｒ２８９５Ｇ（第２８９５番目のアルギニン（Ｒ）がグリシン（Ｇ）に変異）及びＲ２８９５Ｋ（第２８９５番目のアルギニン（Ｒ）がリジン（Ｋ）に変異）が挙げられる。これら適応変異を、単独で又は組み合わせて、本発明の核酸及びＨＣＶレプリコンＲＮＡ、例えば上記のＳ３１０Ａ株のＨＣＶゲノムに導入することにより、複製能の向上したＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡ若しくはＨＣＶフルゲノムレプリコンＲＮＡ又はそれらをコードする核酸を取得できる。本発明において、本発明の核酸及びＨＣＶレプリコンＲＮＡが有する、より好ましい塩基の変異は、アミノ酸配列のＴ１２８６Ｉの変異、Ｒ２１９８Ｈの変異、Ｓ２２１０Ｉの変異又はＲ２８９５Ｋの変異を引き起こす変異であり、さらに好ましい塩基の変異は、アミノ酸配列のＲ２１９８Ｈの変異、Ｓ２２１０Ｉの変異又はＲ２８９５Ｋの変異を引き起こす変異である。また、公知文献記載の適応変異を単独で導入、又は上記変異と組み合わせて導入することもできる。導入する変異は、上記のＳ３１０Ａ株由来のＨＣＶレプリコンＲＮＡの複製能が向上するものであればよい。なお、Ｔ１２８６ＩはＮＳ３タンパク質、Ｔ２１８８Ａ、Ｒ２１９８Ｈ及びＳ２２１０Ｉの変異はＮＳ５Ａタンパク質、Ｔ２４９６Ｉ、Ｒ２９８５Ｇ及びＲ２９８５ＫはＮＳ５Ｂタンパク質内の変異である。

本発明の核酸及びＨＣＶレプリコンＲＮＡ、例えば単離した遺伝子型３ａの野生型ＨＣＶゲノムに変異を導入するには、ＰＣＲ法や市販の変異導入キット（例えば、東洋紡社製のＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔなど）を用いることができる。ＰＣＲ法としては、例えば、遺伝子型３ａの野生型ＨＣＶゲノムＲＮＡのｃＤＮＡをクローン化したベクターを鋳型とし、該ｃＤＮＡの配列から設計された導入する変異を含む正方向及び逆方向プライマーを用いたＰＣＲを実施することによって、目的の配列部分を増幅することができる。具体的には、互いに重複配列を有する異なるＰＣＲ産物を複数合成し、それらのＰＣＲ産物を混合し、これを鋳型として、目的核酸の５’端を含む正方向プライマーと、該核酸の相補鎖の５’端を含む逆方向プライマーを用いるＰＣＲを実施することによって該目的核酸を増幅することができる。合成した核酸の各末端を制限酵素で切断し、同じ酵素で切断した野生型のＨＣＶゲノムＲＮＡのｃＤＮＡをクローン化したベクターに連結する。このような操作の基本技術は、例えば、国際公開第０４／１０４１９８号、国際公開第０６／０２２４２２号、Ｗａｋｉｔａら、２００５年、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、第１１号、ｐ．７９１−７９６、及びＬｉｎｄｅｎｂａｃｈら、２００５年、Ｓｃｉｅｎｃｅ、第３０９号、ｐ．６２３−６２６にも記載されている。

本発明の核酸及びＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡの一つの実施形態としては、上記のＳ３１０Ａ株の全長ＨＣＶゲノム（配列番号１）中の、５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）（配列番号２）、ＮＳ３タンパク質コード配列（配列番号８）、ＮＳ４Ａタンパク質コード配列（配列番号９）、ＮＳ４Ｂタンパク質コード配列（配列番号１０）、ＮＳ５Ａタンパク質コード配列（配列番号１１）、ＮＳ５Ｂタンパク質コード配列（配列番号１２）、３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）（配列番号１３）を５’側から３’側に向かってこの順で含む核酸が挙げられる。

本発明の核酸及びＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡの別の実施形態としては、Ｓ３１０Ａ株の全長ＨＣＶゲノム（配列番号１）中の、５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）（配列番号２）、ＮＳ３タンパク質コード配列（配列番号８）、ＮＳ４Ａタンパク質コード配列（配列番号９）、ＮＳ４Ｂタンパク質コード配列（配列番号１０）、ＮＳ５Ａタンパク質コード配列（配列番号１１）、ＮＳ５Ｂタンパク質コード配列（配列番号１２）、３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）（配列番号１３）を５’側から３’側に向かってこの順で含む塩基配列において、Ｔ１２８６Ｉ、Ｔ２１８８Ａ、Ｒ２１９８Ｈ、Ｓ２２１０Ｉ、Ｔ２４９６Ｉ、Ｒ２８９５Ｇ及びＲ２８９５Ｋからなる群から選択される少なくとも１つの変異を含む核酸が挙げられる。好ましくは、本発明の核酸及びＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡとして、Ｓ３１０Ａ株の全長ＨＣＶゲノム中の、５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）、ＮＳ３タンパク質コード配列、ＮＳ４Ａタンパク質コード配列、ＮＳ４Ｂタンパク質コード配列、ＮＳ５Ａタンパク質コード配列、ＮＳ５Ｂタンパク質コード配列、３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）を５’側から３’側に向かってこの順で含む核酸であり、かつ、Ｔ１２８６Ｉ、Ｒ２１９８Ｈ又はＲ２８９５Ｋの変異を含む核酸も挙げられる。さらに好ましくは、本発明の核酸及びＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡとして、Ｓ３１０Ａ株の全長ＨＣＶゲノム中の、５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）、ＮＳ３タンパク質コード配列、ＮＳ４Ａタンパク質コード配列、ＮＳ４Ｂタンパク質コード配列、ＮＳ５Ａタンパク質コード配列、ＮＳ５Ｂタンパク質コード配列、３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）を５’側から３’側に向かってこの順で含む核酸であり、かつＲ２１９８Ｈ又はＲ２８９５Ｋの変異を含む核酸が挙げられる。

上記のＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡは、薬剤耐性遺伝子及び／又はレポーター遺伝子並びにＩＲＥＳ配列をさらに含んでいてもよい。この際、５’ＵＴＲの下流に、薬剤耐性遺伝子又は／及びレポーター遺伝子を、さらにその下流にＩＲＥＳ配列を、挿入することが好ましい。

本発明のＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡのさらに好ましい実施形態としては、配列番号１６に示される塩基配列からなる核酸（野生型Ｓ３１０Ａ株のＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡ、図１Ｃ）が挙げられる。本発明のＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡの好ましい別の実施形態としては、Ｔ１２８６Ｉ、Ｔ２１８８Ａ、Ｒ２１９８Ｈ、Ｓ２２１０Ｉ、Ｔ２４９６Ｉ、Ｒ２８９５Ｇ、及びＲ２８９５Ｋからなる群より選択される変異が配列番号１６に示される塩基配列に導入されたＲＮＡ、より好ましくはＴ１２８６Ｉ、Ｒ２１９８Ｈ若しくはＲ２８９５Ｋの変異が導入されたＲＮＡが挙げられる。例えば、配列番号１７（野生型Ｓ３１０Ａ株のＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡにおいて、Ｔ１２８６Ｉの変異を含む配列）、配列番号１８（野生型Ｓ３１０Ａ株のＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡにおいて、Ｒ２１９８Ｈの変異を含む配列）又は、配列番号１９（野生型Ｓ３１０Ａ株のＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡにおいて、Ｒ２８９５Ｋの変異を含む配列）に示される塩基配列を含む核酸を例示できる。

本発明のＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡを構成する核酸は、上記の変異を引き起こす塩基以外の塩基において、さらに他の変異を有しているが、上記の変異を含む核酸と同等の複製能をもたらす核酸であってもよい。そのような他の変異としては、１又は複数の塩基の置換が挙げられ、該他の変異を有する核酸は元の核酸の塩基配列と９０％以上、好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９７％以上の塩基配列同一性を有することが好ましい。またさらに、そのような他の変異としては、１又は複数の塩基の欠失又は付加が挙げられる。この場合、該他の変異を有する核酸は元の核酸の塩基配列と９０％以上、好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９７％以上の塩基配列同一性を有し、かつタンパク質をコードする配列内の欠失又は付加の場合は、タンパク質のアミノ酸配列に翻訳される読み枠がずれないことが好ましい。さらに、そのような他の変異としては、ＨＣＶゲノムの５’非翻訳領域内又は３’非翻訳領域内の１又は複数の塩基の欠失、置換又は付加が挙げられ、該他の変異を有する核酸は元の核酸の塩基配列と９０％以上、好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９７％以上の塩基配列同一性を有することが好ましい。またさらに、そのような他の変異としては、ＨＣＶゲノムのＨＣＶタンパク質をコードする塩基配列（ウイルスタンパク質コード領域）内の１又は複数の塩基の欠失、置換又は付加が挙げられ、該他の変異を有する核酸は元の核酸の塩基配列と９０％以上、好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９７％以上の塩基配列同一性を有し、かつ欠失又は付加の場合は、ＨＣＶタンパク質のアミノ酸配列に翻訳される読み枠がずれないことが好ましい。

本明細書において、アミノ酸又はアミノ酸残基は、生物学分野で通常用いられるアミノ酸の１文字表記又は３文字表記（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ、１９８９年）によって記載し、そのように表記されたアミノ酸は水酸化、糖鎖付加、硫酸化等の翻訳後修飾を受けたアミノ酸も包含するものとする。

本明細書においては、配列番号で示されるアミノ酸配列中の特定の位置のアミノ酸を、「配列番号“Ｘ”に示される…アミノ酸配列を基準とした場合に第“Ｙ”番目の（アミノ酸）」という表現により指定することがある。例えば「配列番号１４に示されるＳ３１０Ａ株の前駆体タンパク質のアミノ酸配列を基準とした場合に第“Ｙ”番目の（アミノ酸）」という記載は、そのアミノ酸が、配列番号１４に示されるＨＣＶのＳ３１０Ａ株の前駆体タンパク質のアミノ酸配列においてＮ末端の第１アミノ酸（メチオニン）を第１番目としたときに第“Ｙ”番目に位置するアミノ酸残基であることを意味する。「配列番号“Ｘ”に示される…アミノ酸配列を基準とした場合に第“Ｙ”番目の（アミノ酸）」という表現を用いて指定されるアミノ酸は、配列番号“Ｘ”の“Ｙ”番目のアミノ酸に配列アラインメント上で対応している限り、例えば配列番号“Ｘ”の配列変異体（末端切断配列など）中で第“Ｙ”番目に位置してもよいが、第“Ｙ”番目に位置しなくてもよい。具体的には、例えば「配列番号１４に示されるＳ３１０Ａ株の前駆体タンパク質のアミノ酸配列を基準とした場合に第２４９６番目のスレオニンがイソロイシンに置換されている、Ｓ３１０Ａ株のＮＳ３タンパク質、ＮＳ４Ａタンパク質、ＮＳ４Ｂタンパク質、ＮＳ５Ａタンパク質及びＮＳ５Ｂタンパク質のアミノ酸配列からなる前駆体タンパク質」と記載する場合、例えば、配列番号１４のアミノ酸配列のＮ末端の末端切断（tｒｕｎｃａｔｉｏｎ）により、配列番号１４では第２４９６番目に位置しているが末端切断配列上のＮ末端からの位置が第２４９６番目ではなくなったスレオニンが、タンパク質中でイソロイシンに置換されていることをも意味する。

本明細書において、Ｒ２８９５Ｋ等の表記は、特定の位置のアミノ酸の置換を示すが、文脈によりそのアミノ酸置換を引き起こす塩基変異をも意味する。例えば、核酸の塩基が変異し、元の核酸がコードするアミノ酸配列における第２８９５番目のＲ（アルギニン）がＫ（リジン）に置換された場合、該塩基変異をＲ２８９５Ｋ置換（変異）と称することがある。また、該変異を有するアミノ酸配列をコードする核酸を、Ｒ２８９５Ｋ置換（変異）を含む核酸、又はＲ２８９５Ｋ置換（変異）が導入された核酸と称する場合がある。あるいは、そのような変異を、アミノ酸配列におけるＲ２８９５Ｋ置換（変異）を引き起こす塩基変異、又はアミノ酸配列におけるＲ２８９５Ｋ置換（変異）を引き起こす変異と称することもある。例えば、Ｒ２８９５Ｋ置換（変異）が導入されたＨＣＶレプリコンＲＮＡを、Ｒ２８９５Ｋ変異体ＨＣＶレプリコンＲＮＡということがある。同時に複数の変異を有する場合には、例えば、Ｔ２４９６Ｉのアミノ酸置換とＲ２８９５Ｋのアミノ酸置換を有する場合、「Ｔ２４９６Ｉ／Ｒ２８９５Ｋの置換（変異）を含む」と表現することがある。「アミノ酸置換」を「アミノ酸変異」と表現する場合がある。

特定のアミノ酸置換を引き起こす塩基変異は、周知の遺伝暗号表に基づいて選択することができる。例えば、Ｒ２８９５Ｋ置換を引き起こす変異は、アルギニンをコードするコドン「ＣＧＵ」、「ＣＧＣ」、「ＣＧＡ」、「ＣＧＧ」、「ＡＧＡ」又は「ＡＧＧ」から、リジンをコードするコドン「ＡＡＡ」又は「ＡＡＧ」への変化をもたらす変異である。Ｓ３１０Ａ株の全長ゲノム配列（配列番号１）において、Ｒ２８９５Ｋ置換を引き起こす塩基変異は、コドン「ＡＧＡ」（配列番号１の第９０２３番目〜第９０２５番目）を「ＡＡＧ」又は「ＡＡＡ」に変化させる変異である。これはすなわち、配列番号１の第９０２４番目〜第９０２５番目の塩基配列を５’−ＧＡ−３’から５’−ＡＧ−３’に変異させるか、又は第９０２４番目の塩基をＧからＡに変異させるものである。

同様に、配列番号１４に示されるＳ３１０Ａ株の前駆体タンパク質のアミノ酸配列を基準とした場合に第２１９８番目のアルギニンのヒスチジンへのアミノ酸置換は、Ｒ２１９８Ｈと表記される。Ｓ３１０Ａ株の全長ゲノム配列（配列番号１）において、Ｒ２１９８Ｈ置換を引き起こす塩基変異は、アルギニンをコードするコドン「ＣＧＵ」（配列番号１の第６９３２番目〜第６９３４番目）を、ヒスチジンをコードするコドン「ＣＡＵ」又は「ＣＡＣ」に変化させる変異である。

同様に、配列番号１４に示されるＳ３１０Ａ株の前駆体タンパク質のアミノ酸配列を基準とした場合に第１２８６番目のスレオニンのイソロイシンへのアミノ酸置換は、Ｔ１２８６Ｉと表記される。Ｓ３１０Ａ株の全長ゲノム配列（配列番号１）において、Ｔ１２８６Ｉ置換を引き起こす塩基変異は、スレオニンをコードするコドン「ＡＣＵ」（配列番号１の第４１９６番目〜第４１９８番目）を、イソロイシンをコードするコドン「ＡＵＵ」、「ＡＵＣ」、又は「ＡＵＡ」に変化させる変異である。

また、本明細書において、配列番号に示される塩基配列の塩基番号は、配列番号に示される塩基配列において５’末端の第１塩基を第１番目として塩基番号をつけたものを基準とする。

ＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡは、発現ベクターから転写する（発現させる）ことにより取得できる。ＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡ発現ベクターの構築に関する基本技術は、Ｌｏｈｍａｎｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９９９年、第２８５巻、ｐ．１１０−１１３及びＫａｔｏら、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ、２００３年、第１２５巻、ｐ．１８０８−１８１７に記載されている。具体的には、例えば、５’側から３’側の方向に、５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）、Ｃｏｒｅタンパク質をコードする領域の５７ヌクレオチド、外来遺伝子（薬剤耐性遺伝子又はレポーター遺伝子）、ＥＭＣＶ ＩＲＥＳ配列、ＮＳ３タンパク質、ＮＳ４Ａタンパク質、ＮＳ４Ｂタンパク質、ＮＳ５Ａタンパク質及びＮＳ５Ｂタンパク質をコードする塩基配列並びに３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）の順に連結されたｃＤＮＡをＴ７プロモーターの下流に挿入することにより、ＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡ発現ベクターを構築することができる。なお、各塩基配列の連結において、連結部位には制限酵素部位などの付加配列を含みうる。

上記のＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡは、構築されたＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡ発現ベクターからポリメラーゼにより合成することができる。例えば、Ｔ７プロモーターの制御下にＨＣＶ ｃＤＮＡをクローン化した核酸を鋳型として、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＲＮＡを作製する方法として、ＭＥＧＡｓｃｒｉｐｔ Ｔ７ ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ社）などによる合成が挙げられる。このベクターから転写されたＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡは、細胞に導入されると自律複製する。本発明は、ＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡが導入された細胞を包含する。

プロモーターとしては、Ｔ７プロモーターだけでなく、ＳＰ６プロモーター、Ｔ３プロモーター、Ｔ５プロモーターなどの任意のプロモーターを用いることができるが、Ｔ７プロモーターが好ましい。

ベクターとしては、ｐＵＣ１９（ＴａＫａＲａ社）、ｐＢＲ３２２（ＴａＫａＲａ社）、ｐＧＥＭ−Ｔ、ｐＧＥＭ−Ｔ Ｅａｓｙ、ｐＧＥＭ−３Ｚ（いずれもＰｒｏｍｅｇａ社）、ｐＳＰ７２（Ｐｒｏｍｅｇａ社）、ｐＣＲＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、ｐＴ７Ｂｌｕｅ（Ｎｏｖａｇｅｎ社）などの各種ベクターを使用することができる。

ＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡを導入する細胞としては、ＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡの複製を許容する細胞であればよく、上記のＨＣＶ感受性細胞が挙げられる。Ｈｕｈ７細胞又はＨｕｈ７細胞の派生株が特に好ましく使用される。

ＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡを細胞に導入する方法としては、公知の任意の方法を用いることができる。例えば、リン酸カルシウム共沈殿法、ＤＥＡＥデキストラン法、リポフェクション法、マイクロインジェクション法、エレクトロポレーション法を挙げることができるが、好ましくはリポフェクション法及びエレクトロポレーション法が、さらに好ましくはエレクトロポレーション法が挙げられる。

導入したＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡの複製能を評価する方法としては、ＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡに連結された外来遺伝子の機能、すなわち該遺伝子の発現により表れる機能を測定することが挙げられる。外来遺伝子が薬剤耐性遺伝子の場合、薬剤を含有した選択培地で増殖する細胞数又は細胞のコロニー数を計測することにより、ＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡの複製能を評価できる。この場合、細胞数又は細胞のコロニー数が多いほど複製能が高いと評価することができる。外来遺伝子が酵素の場合は、その酵素活性を計測することにより、ＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡの複製能を評価できる。この場合、酵素活性が高いほど複製能が高いと評価することができる。また別の方法として、定量的ＲＴ−ＰＣＲにて複製したＲＮＡの量を定量することによっても、ＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡの複製能を直接評価することができる。

本発明のＨＣＶフルゲノムレプリコンＲＮＡは、ＨＣＶ全長ゲノムＲＮＡそのものも包含するものであり、上記のＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡと同様の手順で作製することができる。本発明のＨＣＶフルゲノムレプリコンＲＮＡは、上記のＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡの複製能が向上する適応変異を、上記のＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡと同様に、遺伝子型３ａの野生型のＳ３１０Ａ株等のＨＣＶ全長ゲノムＲＮＡに導入することで、ＨＣＶフルゲノムレプリコンＲＮＡを作製してもよい。ここで、野生型のＳ３１０Ａ株のＨＣＶ全長ゲノムＲＮＡに、上記の適応変異が導入されたＨＣＶゲノムを、Ｓ３１０Ａ株変異体又は変異体Ｓ３１０Ａ株と呼ぶ。

変異の導入の方法としては、野生型のＳ３１０Ａ株のＨＣＶ全長ゲノムに上記の方法を利用して変異を導入してもよく、サブゲノムレプリコン変異体に野生型のＨＣＶゲノムの構造遺伝子部分を連結させることによって変異を導入してもよい。

上記のＨＣＶフルゲノムレプリコンＲＮＡの一つの実施形態は、Ｓ３１０Ａ株の全長ゲノムＲＮＡ（配列番号１）、すなわち、５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）（配列番号２）、Ｃｏｒｅタンパク質コード配列（配列番号３）、Ｅ１タンパク質コード配列（配列番号４）、Ｅ２タンパク質コード配列（配列番号５）、ｐ７タンパク質コード配列（配列番号６）、ＮＳ２タンパク質コード配列（配列番号７）、ＮＳ３タンパク質コード配列（配列番号８）、ＮＳ４Ａタンパク質コード配列（配列番号９）、ＮＳ４Ｂタンパク質コード配列（配列番号１０）、ＮＳ５Ａタンパク質コード配列（配列番号１１）、ＮＳ５Ｂタンパク質コード配列（配列番号１２）及び３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）（配列番号１３）を５’側から３’側に向かってこの順で含むレプリコンＲＮＡである。

上記のＨＣＶフルゲノムレプリコンＲＮＡの別の実施形態は、Ｓ３１０株の全長ゲノムＲＮＡに、上記の適応変異が導入された核酸である。このＨＣＶフルゲノムレプリコンＲＮＡの好ましい実施形態としては、上記のＳ３１０Ａ株の全長ゲノムＲＮＡ（配列番号１）、すなわち、５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）（配列番号２）、Ｃｏｒｅタンパク質コード配列（配列番号３）、Ｅ１タンパク質コード配列（配列番号４）、Ｅ２タンパク質コード配列（配列番号５）、ｐ７タンパク質コード配列（配列番号６）、ＮＳ２タンパク質コード配列（配列番号７）、ＮＳ３タンパク質コード配列（配列番号８）、ＮＳ４Ａタンパク質コード配列（配列番号９）、ＮＳ４Ｂタンパク質コード配列（配列番号１０）、ＮＳ５Ａタンパク質コード配列（配列番号１１）、ＮＳ５Ｂタンパク質コード配列（配列番号１２）及び３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）（配列番号１３）を５’側から３’側に向かってこの順で含む塩基配列において、Ｔ１２８６Ｉ、Ｔ２１８８Ａ、Ｒ２１９８Ｈ、Ｓ２２１０Ｉ、Ｔ２４９６Ｉ、Ｒ２８９５Ｇ又はＲ２８９５Ｋの変異を含むＲＮＡが挙げられる。好ましくは、Ｓ３１０Ａ株の全長ゲノムＲＮＡ（配列番号１）、すなわち、５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）、Ｃｏｒｅタンパク質コード配列、Ｅ１タンパク質コード配列、Ｅ２タンパク質コード配列、ｐ７タンパク質コード配列、ＮＳ２タンパク質コード配列、ＮＳ３タンパク質コード配列、ＮＳ４Ａタンパク質コード配列、ＮＳ４Ｂタンパク質コード配列、ＮＳ５Ａタンパク質コード配列、ＮＳ５Ｂタンパク質コード配列及び３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）を５’側から３’側に向かってこの順で含む塩基配列において、Ｒ２１９８Ｈ、Ｓ２２１０Ｉ又はＲ２８９５Ｋの変異を含む核酸が挙げられる。

ＨＣＶフルゲノムレプリコンＲＮＡは、薬剤耐性遺伝子及び／又はレポーター遺伝子、並びにＩＲＥＳ配列をさらに含んでいてもよい。この際、５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）の下流に、薬剤耐性遺伝子又は／及びレポーター遺伝子を、さらにその下流にＩＲＥＳ配列を、挿入することが好ましい。

上記ＨＣＶフルゲノムレプリコンＲＮＡのさらに好ましい実施形態としては、配列番号４９（Ｓ２２１０Ｉの変異を含むフルゲノム塩基配列）、配列番号５０（Ｒ２１９８Ｈの変異を含むフルゲノム塩基配列）又は、配列番号５１（Ｒ２８９５Ｋの変異を含むフルゲノム塩基配列）に示される塩基配列を含むＲＮＡが挙げられる。具体的には、配列番号４９に示される、第２２１０位のセリンのイソロイシンへの置換を引き起こす変異を有する塩基配列からなる核酸、配列番号５０に示される、第２１９８位のアルギニンのヒスチジンへの置換を引き起こす変異を有する塩基配列からなる核酸、又は、配列番号５１に示される、第２８９５位のアルギニンのリジンへの置換を引き起こす変異を有する塩基配列からなる核酸が該当する。

本発明のＨＣＶフルゲノムレプリコンＲＮＡを構成する核酸は、上記の変異を引き起こす塩基以外の塩基において、さらに他の変異を有しているが、上記の変異を含む核酸と同等の複製能をもたらす核酸であってもよい。そのような他の変異としては、１又は複数の塩基の欠失、置換又は付加が挙げられ、該他の変異を有する核酸は元の核酸の塩基配列と９０％以上、好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９７％以上の塩基配列同一性を有することが好ましい。さらに、そのような他の変異としては、ＨＣＶゲノムの５’非翻訳領域内又は３’非翻訳領域内の１又は複数の塩基の欠失、置換又は付加が挙げられ、該他の変異を有する核酸は元の核酸の塩基配列と９０％以上、好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９７％以上の塩基配列同一性を有することが好ましい。さらに、そのような他の変異としては、ＨＣＶゲノムのＨＣＶタンパク質をコードする塩基配列（ウイルスタンパク質コード領域）内の１又は複数の塩基の欠失、置換又は付加が挙げられ、該他の変異を有する核酸は元の核酸の塩基配列と９０％以上、好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９７％以上の塩基配列同一性を有し、かつ欠失又は付加の場合は、ＨＣＶタンパク質のアミノ酸配列に翻訳される読み枠がずれないことが好ましい。

上記のＨＣＶフルゲノムレプリコンＲＮＡの作製に用いる発現ベクターは、国際公開第０５／０８０５７５号に記載された技術を使用することで作製できる。具体的には、ＨＣＶの全長ゲノムＲＮＡに対応するｃＤＮＡを、常法により再構築してプロモーターの下流に挿入して、ＤＮＡクローンを作製する。上記プロモーターは、プラスミドクローン中に含まれるものであることが好ましい。プロモーターとしては、Ｔ７プロモーター、ＳＰ６プロモーター、Ｔ３プロモーター、Ｔ５プロモーターなどを用いることができるが、Ｔ７プロモーターが好ましい。ベクターとしては、ｐＵＣ１９（ＴａＫａＲａ社）、ｐＢＲ３２２（ＴａＫａＲａ社）、ｐＧＥＭ−Ｔ、ｐＧＥＭ−Ｔ Ｅａｓｙ、ｐＧＥＭ−３Ｚ（いずれもＰｒｏｍｅｇａ社）、ｐＳＰ７２（Ｐｒｏｍｅｇａ社）、ｐＣＲＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、ｐＴ７Ｂｌｕｅ（Ｎｏｖａｇｅｎ社）などを使用することができる。

発現ベクターからＨＣＶフルゲノムレプリコンＲＮＡを作製するには、作製された上記ＤＮＡクローンを鋳型として、ポリメラーゼによりＲＮＡを合成する。Ｔ７プロモーターの制御下にＨＣＶ ｃＤＮＡをクローン化した核酸を鋳型として、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＲＮＡを作製する場合は、ＭＥＧＡｓｃｒｉｐｔ Ｔ７ ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ社）などで合成することができる。ＲＮＡ合成は、５’ＵＴＲから、常法により開始させることができる。ＤＮＡクローンがプラスミドクローンの場合には、プラスミドクローンから制限酵素によって切り出したＤＮＡ断片を鋳型として用いてＲＮＡを合成することもできる。なお、合成されるＲＮＡの３’末端がＨＣＶゲノムＲＮＡの３’ＵＴＲの末端と一致しており、他の配列が付加されたり削除されたりしないことが好ましい。

上記のＨＣＶフルゲノムレプリコンＲＮＡ又はその核酸は、培養細胞（典型的にはＨＣＶ感受性細胞）に導入されると自律複製し、ＨＣＶ粒子（Ｃ型肝炎ウイルス）が産生されることとなり、また、上記のＨＣＶフルゲノムレプリコンＲＮＡ又はその核酸をウイルスゲノムとして含有するＨＣＶ粒子を培養細胞（典型的にはＨＣＶ感受性細胞）に感染させると、ＨＣＶ粒子が産生されることとなる。すなわち、上記のＨＣＶフルゲノムレプリコンＲＮＡ若しくはその核酸が導入された培養細胞、又は、上記のＨＣＶフルゲノムレプリコンＲＮＡ若しくはその核酸をウイルスゲノムとして含有するＨＣＶ粒子に感染された培養細胞は、ＨＣＶ粒子の大量生産への利用が可能となる。

より具体的には、上記のＨＣＶフルゲノムレプリコンＲＮＡ若しくはその核酸が導入された培養細胞（典型的にはＨＣＶ感受性細胞）、又は、上記のＨＣＶフルゲノムレプリコンＲＮＡ若しくはその核酸をウイルスゲノムとして含有するＨＣＶ粒子（Ｃ型肝炎ウイルス）に感染された培養細胞（典型的にはＨＣＶ感受性細胞）から産生されたＨＣＶ粒子は、さらに別の培養細胞（典型的にはＨＣＶ感受性細胞）に感染し、その細胞内でＨＣＶのゲノムＲＮＡが複製され、パッケージングされ、ＨＣＶ粒子を繰り返し産生することを可能にする。ＨＣＶ粒子の培養細胞への感染は、例えば、ＨＣＶフルゲノムレプリコンＲＮＡ又はその核酸を導入した培養細胞の培養上清を、ＨＣＶ感受性細胞（例えば、Ｈｕｈ７細胞）に添加することで実施できる。

上記のＨＣＶフルゲノムレプリコンＲＮＡ若しくはその核酸を導入する細胞、又は、上記ＨＣＶ粒子（Ｃ型肝炎ウイルス）を感染させる細胞としては、培養細胞が好ましく、それはＨＣＶレプリコンＲＮＡの複製やＨＣＶ粒子形成を許容する細胞であればよく、上記のＨＣＶ感受性細胞が挙げられる。Ｈｕｈ７細胞又はＨｕｈ７細胞の派生株が特に好ましく使用される。

ＨＣＶフルゲノムレプリコンＲＮＡを細胞に導入する方法としては、公知の任意の方法を用いることができる。例えば、リン酸カルシウム共沈殿法、ＤＥＡＥデキストラン法、リポフェクション法、マイクロインジェクション法、エレクトロポレーション法を挙げることができるが、好ましくはリポフェクション法及びエレクトロポレーション法が、さらに好ましくはエレクトロポレーション法が挙げられる。

導入したＨＣＶフルゲノムレプリコンＲＮＡの複製能を評価する方法としては、ＨＣＶフルゲノムレプリコンＲＮＡに連結された外来遺伝子の機能、すなわち該遺伝子の発現により表れる機能を測定することが挙げられる。外来遺伝子が薬剤耐性遺伝子の場合、薬剤を含有した選択培地で増殖する細胞数又は細胞のコロニー数を計測することにより、ＨＣＶフルゲノムレプリコンＲＮＡの複製能を評価できる。この場合、細胞数又は細胞のコロニー数が多いほど複製能が高いと評価することができる。外来遺伝子が酵素の場合は、その酵素活性を計測することにより、ＨＣＶフルゲノムレプリコンＲＮＡの複製能を評価できる。この場合、酵素活性が高いほど複製能が高いと評価することができる。また別の方法として、定量的ＲＴ−ＰＣＲにて複製したＲＮＡの量を定量することによっても、ＨＣＶフルゲノムレプリコンＲＮＡの複製能を直接評価することができる。

なお、本発明は、上記核酸を含むウイルスゲノム及び上記核酸をウイルスゲノムとして含有するＣ型肝炎ウイルス粒子（Ｃ型肝炎ウイルス）をも包含している。

上記のＨＣＶフルゲノムレプリコンＲＮＡ又はその核酸は、培養細胞においてＨＣＶ粒子産生能を有している。ＨＣＶフルゲノムレプリコンＲＮＡ又はその核酸が、ＨＣＶ粒子産生能を有しているか否かを評価するには、該ＲＮＡを細胞に導入して、その細胞培養上清中のＨＣＶ粒子の存在を測定すればよい。

細胞のＨＣＶ粒子産生能は、培養上清中に放出されたＨＣＶ粒子を構成するタンパク質、例えば、Ｃｏｒｅタンパク質、Ｅ１タンパク質、又はＥ２タンパク質に対する抗体を用いて検出することができる。また、培養上清中のＨＣＶ粒子が含有するＨＣＶフルゲノムレプリコンＲＮＡを、特異的プライマーを用いたＲＴ−ＰＣＲ法により増幅して検出することによって、ＨＣＶ粒子の存在を間接的に検出することもできる。

産生されたＨＣＶ粒子が感染能を有しているか否かの評価方法としては、ＨＣＶフルゲノムレプリコンＲＮＡ又はその核酸を導入した細胞の培養上清を、ＨＣＶ感受性細胞（例えば、Ｈｕｈ７細胞）に処理して、例えば４８時間後に細胞を抗Ｃｏｒｅ抗体で免疫染色して感染細胞数を数えるか、細胞の抽出物をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルにて電気泳動し、ウエスタンブロットにて、Ｃｏｒｅタンパク質を検出することで判断できる。

本発明はまた、遺伝子型３ａのＨＣＶ（例えばＳ３１０Ａ株）を含む２以上のＣ型肝炎ウイルス株のゲノムに由来するキメラ核酸も提供する。具体的には、遺伝子型３ａのＳ３１０Ａ株由来のゲノム配列と、Ｓ３１０Ａ株のＨＣＶゲノム（配列番号１）以外のＨＣＶゲノム、例えば各種遺伝子型（１ａ、１ｂ、２ａ、２ｂ、３ａ、３ｂなど）のＨＣＶ既存株や遺伝子型３ａ以外の遺伝子型のＨＣＶのゲノム配列とを含む、キメラ型のＨＣＶゲノム（キメラＨＣＶゲノム）、キメラ型のＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡ（キメラＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡ）、キメラ型のＨＣＶフルゲノムレプリコンＲＮＡ（キメラＨＣＶフルゲノムレプリコンＲＮＡ）及びキメラ型のＨＣＶ粒子（キメラＨＣＶ粒子）等を提供する。ここで、キメラＨＣＶゲノム及びキメラＨＣＶフルゲノムレプリコンＲＮＡとは、それぞれ、２以上の異なる株のＨＣＶのゲノム配列を含むＨＣＶゲノム及びＨＣＶフルゲノムレプリコンＲＮＡをいい、これらキメラＨＣＶゲノム又はキメラＨＣＶフルゲノムレプリコンＲＮＡから産生されるＨＣＶ粒子をキメラ型ＨＣＶ粒子という。このようなキメラＨＣＶゲノムも、本発明の核酸に含まれる。

上記のキメラＨＣＶゲノムは、Ｓ３１０Ａ株又はＳ３１０Ａ株変異体（適応変異が導入されたＳ３１０Ａ株）の非構造遺伝子と、それ以外（Ｓ３１０Ａ株及びＳ３１０Ａ株変異体以外）のＨＣＶ株の構造遺伝子とを含む、ＨＣＶのキメラゲノムであってよい。上記のキメラＨＣＶゲノムは適応変異等の変異を有してもよく、Ｓ３１０Ａ株変異体を用いて作製するものでもよい。上記のキメラＨＣＶゲノムに用いるＳ３１０Ａ株変異体は、具体的には、Ｓ３１０Ａ株にＴ１２８６Ｉ、Ｔ２１８８Ａ、Ｒ２１９８Ｈ、Ｓ２２１０Ｉ、Ｔ２４９６Ｉ、Ｒ２８９５Ｇ又はＲ２８９５Ｋの変異を含み、好ましくはＲ２１９８Ｈ、Ｓ２２１０Ｉ又はＲ２８９５Ｋの変異を含む。さらに具体的には、Ｓ３１０Ａ株変異体は、配列番号４９（Ｓ２２１０Ｉの変異を含むフルゲノム塩基配列）、配列番号５０（Ｒ２１９８Ｈの変異を含むフルゲノム塩基配列）又は、配列番号５１（Ｒ２８９５Ｋの変異を含むフルゲノム塩基配列）に示される塩基配列を含む核酸であってよい。

キメラＨＣＶゲノムは、例えば、Ｃ型肝炎ウイルスのＣｏｒｅタンパク質をコードする塩基配列、Ｅ１タンパク質をコードする塩基配列、Ｅ２タンパク質をコードする塩基配列及びｐ７タンパク質をコードする塩基配列に加えて、配列表の配列番号１における、塩基番号３４３７〜５３２９の配列からなるＮＳ３タンパク質をコードする塩基配列、塩基番号５３３０〜５４９１の配列からなるＮＳ４Ａタンパク質をコードする塩基配列、塩基番号５４９２〜６２７４の配列からなるＮＳ４Ｂタンパク質をコードする塩基配列、塩基番号６２７５〜７６３０の配列からなるＮＳ５Ａタンパク質をコードする塩基配列及び塩基番号７６３１〜９４０６の配列からなるＮＳ５Ｂタンパク質をコードする塩基配列を、５’側から３’側に向かって、この順で含んでもよい。

本発明のキメラＨＣＶゲノムはまた、例えば、Ｓ３１０Ａ株以外のＣ型肝炎ウイルスのゲノム（例えばＣ型肝炎ウイルスの既存株のゲノム又は遺伝子型３ａ以外の遺伝子型のＨＣＶのゲノム）のＣｏｒｅタンパク質をコードする塩基配列、Ｅ１タンパク質をコードする塩基配列、Ｅ２タンパク質をコードする塩基配列及びｐ７タンパク質をコードする塩基配列と、
配列表の配列番号１の塩基番号２７８６〜３４３６の配列からなるＮＳ２タンパク質をコードする塩基配列、Ｓ３１０Ａ株以外のＣ型肝炎ウイルスのゲノム（例えばＣ型肝炎ウイルスの既存株のゲノム又は遺伝子型３ａ以外の遺伝子型のＨＣＶのゲノム）のＮＳ２タンパク質をコードする塩基配列、又は、配列表の配列番号１の塩基番号２７８６〜３４３６の配列からなるＮＳ２タンパク質をコードする塩基配列の一部とＳ３１０Ａ株以外のＣ型肝炎ウイルスのゲノム（例えばＣ型肝炎ウイルスの既存株のゲノム又は遺伝子型３ａ以外の遺伝子型のＨＣＶのゲノム）のＮＳ２タンパク質をコードする塩基配列の一部とが連結されたキメラ型のＮＳ２タンパク質をコードする塩基配列と、
配列表の配列番号１における、塩基番号３４３７〜５３２９の配列からなるＮＳ３タンパク質をコードする塩基配列、塩基番号５３３０〜５４９１の配列からなるＮＳ４Ａタンパク質をコードする塩基配列、塩基番号５４９２〜６２７４の配列からなるＮＳ４Ｂタンパク質をコードする塩基配列、塩基番号６２７５〜７６３０の配列からなるＮＳ５Ａタンパク質をコードする塩基配列及び塩基番号７６３１〜９４０６の配列からなるＮＳ５Ｂタンパク質をコードする塩基配列とが、
５’側から３’側に向かって、Ｃｏｒｅタンパク質、Ｅ１タンパク質、Ｅ２タンパク質、ｐ７タンパク質、ＮＳ２タンパク質、ＮＳ３タンパク質、ＮＳ４Ａタンパク質、ＮＳ４Ｂタンパク質、ＮＳ５Ａタンパク質及びＮＳ５Ｂタンパク質、をコードする塩基配列の順で含まれている、核酸であってもよい。

本発明のキメラＨＣＶゲノムは、遺伝子型３ａのＨＣＶゲノムの５’非翻訳領域、例えば配列番号１の塩基番号１〜３４０の塩基配列を含む５’非翻訳領域を５’末端に含んでもよいし、その代わりに、Ｓ３１０Ａ株のＨＣＶゲノム（配列番号１）以外のＨＣＶゲノム、例えば各種遺伝子型のＨＣＶ既存株のゲノムや遺伝子型３ａ以外の遺伝子型のＣ型肝炎ウイルスゲノムの５’非翻訳領域を５’末端に含んでもよい。

このようなキメラＨＣＶゲノムの例は図１６に示されており、例えば、Ｊ６ＣＦ株、ＪＦＨ−１株又はＴＨ株の５’非翻訳領域、構造遺伝子（Ｃｏｒｅ〜ｐ７）とそのＮＳ２遺伝子のＮ末端側の一部（例えばＮＳ２タンパク質のＮ末端から第１〜第１６番目のアミノ酸配列をコードする配列）、及びＳ３１０Ａ株のＮＳ２遺伝子のそれに引き続くＣ末端側の配列（例えばＮＳ２タンパク質のＮ末端から第１７〜第２１７番目のアミノ酸配列をコードする配列）とＮＳ２遺伝子以外の非構造遺伝子（ＮＳ３〜ＮＳ５Ｂ）と３’非翻訳領域とを含むものが挙げられる。これらはＴ１２８６Ｉ、Ｔ２１８８Ａ、Ｒ２１９８Ｈ、Ｓ２２１０Ｉ、Ｔ２４９６Ｉ、Ｒ２８９５Ｇ又はＲ２８９５Ｋの変異を含んでもよい。

本発明は、これらのキメラＨＣＶゲノムを含むキメラフルゲノムレプリコンＲＮＡも提供する。

キメラＨＣＶゲノムの作製は、例えば、Ｓ３１０Ａ株変異体のゲノムの構造遺伝子であるＣｏｒｅタンパク質、Ｅ１タンパク質、Ｅ２タンパク質及びｐ７タンパク質のコード配列を、他のＨＣＶ株の構造遺伝子と組換えることにより作製することができる。この基本技術は、例えば、Ｗａｋｉｔａら、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、２００５年、第１１巻、ｐ．７９１−７９６； Ｌｉｎｄｅｎｂａｃｈら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２００５年、第３０９巻、ｐ．６２３−６２６； Ｐｉｅｔｓｃｈｍａｎｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、２００７年、第１０３巻、ｐ．７４０８−７４１３に記載されている。

ＨＣＶ株の塩基配列を用いた系統解析法では、ＨＣＶは遺伝子型１から遺伝子型６までの６タイプに分類され、さらにそれら各タイプがいくつかのサブタイプに分類される。既に知られているＨＣＶの既存株の例としては、具体的には、遺伝子型１ａのＨＣＶ株としては、Ｈ７７株（ＧｅｎＢａｎｋ アクセッション番号ＡＦ０１１７５１）、遺伝型１ｂ型のＨＣＶ株としては、Ｊ１株（ＧｅｎＢａｎｋ アクセッション番号Ｄ８９８１５）、Ｃｏｎ１株（ＧｅｎＢａｎｋ アクセッション番号ＡＪ２３８７９９、Ｃｏｎ−１株、ｃｏｎ１株と称することもある）、ＴＨ株（Ｗａｋｉｔａら、Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１９９４年、第２６９巻、ｐ．１４２０５−１４２１０； 特開２００４−１７９号公報）、ＨＣＶ−Ｎ株（ＧｅｎＢａｎｋ アクセッション番号ＡＦ１３９５９４）及びＨＣＶ−Ｏ株（ＧｅｎＢａｎｋ アクセッション番号ＡＢ１９１３３３）、遺伝子型２ａのＨＣＶ株としては、ＪＦＨ−１株（ＧｅｎＢａｎｋ アクセッション番号ＡＢ０４７６３９、ＪＦＨ１株と称することもある）、Ｊ６ＣＦ株（ＧｅｎＢａｎｋ アクセッション番号ＡＦ１７７０３６）、ＪＣＨ−１株（ＧｅｎＢａｎｋ アクセッション番号ＡＢ０４７６４０）、ＪＣＨ−２株（ＧｅｎＢａｎｋ アクセッション番号ＡＢ０４７６４１）、ＪＣＨ−３株（ＧｅｎＢａｎｋ アクセッション番号ＡＢ０４７６４２）、ＪＣＨ−４株（ＧｅｎＢａｎｋ アクセッション番号ＡＢ０４７６４３）、ＪＣＨ−５株（ＧｅｎＢａｎｋ アクセッション番号ＡＢ０４７６４４）及びＪＣＨ−６株（ＧｅｎＢａｎｋ アクセッション番号ＡＢ０４７６４５）が知られている。さらに遺伝子型２ｂのＨＣＶ株としては、ＨＣ−Ｊ８株（ＧｅｎＢａｎｋ アクセッション番号Ｄ０１２２１）などが、遺伝子型３ａのＨＣＶ株としてはＮＺＬ１株（ＧｅｎＢａｎｋ アクセッション番号Ｄ１７７６３）、Ｋ３ａ／６５０株（ＧｅｎＢａｎｋ アクセッション番号Ｄ２８９１７）、Ｓ５２株（ＧｅｎＢａｎｋ アクセッション番号ＧＵ８１４２６３）などが、遺伝子型３ｂのＨＣＶ株としては、Ｔｒ−Ｋｊ株（ＧｅｎＢａｎｋ アクセッション番号Ｄ４９３７４）などが、遺伝子型４ａのＨＣＶ株としては、ＥＤ４３株（ＧｅｎＢａｎｋ アクセッション番号Ｙ１１６０４）などが知られている。その他の株についても既にＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号のリストが報告されている（Ｔｏｋｉｔａら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、１９９８年、第７９巻、ｐ．１８４７−１８５７； Ｃｒｉｓｔｉｎａ，Ｊ．＆ Ｃｏｌｉｎａ，Ｒ．、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ Ｊｏｕｒｎａｌ、２００６年、第３巻、ｐ．１−８）。

上記のキメラＨＣＶゲノムは、一実施形態では、Ｓ３１０Ａ株変異体以外のＨＣＶ株由来のＣｏｒｅタンパク質、Ｅ１タンパク質、Ｅ２タンパク質及びｐ７タンパク質、Ｓ３１０Ａ株変異体又はＳ３１０Ａ株変異体以外のＨＣＶ株由来のＮＳ２タンパク質、並びに、Ｓ３１０Ａ株変異体由来のＮＳ３タンパク質、ＮＳ４Ａタンパク質、ＮＳ４Ｂタンパク質、ＮＳ５Ａタンパク質及びＮＳ５Ｂタンパク質をコードするそれぞれの塩基配列を、５’側から３’側に向かって、Ｃｏｒｅタンパク質、Ｅ１タンパク質、Ｅ２タンパク質、ｐ７タンパク質、ＮＳ２タンパク質、ＮＳ３タンパク質、ＮＳ４Ａタンパク質、ＮＳ４Ｂタンパク質、ＮＳ５Ａタンパク質及びＮＳ５Ｂタンパク質をコードする塩基配列の順序で配置してなるＨＣＶ由来のキメラ遺伝子を含む、核酸である。また、上記のＮＳ２タンパク質は、Ｓ３１０Ａ株変異体のＮＳ２タンパク質とＳ３１０Ａ株及びその変異体以外のＨＣＶ株由来のＮＳ２タンパク質とのキメラ型のＮＳ２タンパク質（キメラＮＳ２タンパク質）であってもよい。ここで、ＨＣＶのＳ３１０Ａ株以外でありＳ３１０Ａ株変異体以外でもあるＨＣＶ株は、好ましくは上記のＨＣＶの既存株である。

ここでキメラＮＳ２タンパク質は、Ｓ３１０Ａ株変異体のＮＳ２タンパク質のアミノ酸配列の一部とＳ３１０Ａ株及びＳ３１０Ａ株変異体以外のＨＣＶ株由来のＮＳ２タンパク質のアミノ酸配列の一部が連結し、全体としてＮＳ２の全長アミノ酸配列からなるＮＳ２タンパク質をいう。上記のキメラＨＣＶゲノムの核酸において、ＮＳ２タンパク質は、Ｓ３１０Ａ株変異体由来であってもよいし、又は、Ｓ３１０Ａ株変異体以外のＨＣＶ株由来のＮＳ２タンパク質の一部と、Ｓ３１０Ａ株変異体由来のＮＳ２タンパク質の残部からなるキメラＮＳ２タンパク質であってもよい。この場合、該キメラＮＳ２タンパク質はキメラではないＮＳ２タンパク質と同様の機能を有するものである。例えば、Ｓ３１０Ａ株変異体以外のＨＣＶ株由来のＮＳ２タンパク質の一部が、ＮＳ２タンパク質のＮ末端のアミノ酸残基から第１６番目のアミノ酸残基までをコードする塩基配列からなる場合、Ｓ３１０Ａ株及びその変異体由来のＮＳ２タンパク質の残部は、Ｎ末端から第１７番目のアミノ酸残基からＣ末端のアミノ酸残基までをコードする塩基配列からなる。

上記のキメラＨＣＶゲノムの核酸はさらに、上記Ｃｏｒｅタンパク質をコードする塩基配列の５’側に５’ＵＴＲ及び、上記ＮＳ５Ｂタンパク質をコードする領域の３’側に３’ＵＴＲを含むことが好ましい。５’ＵＴＲ及び／又は３’ＵＴＲは、任意のＨＣＶ株由来の配列でよいが、好ましくは、Ｓ３１０Ａ株変異体以外のＨＣＶ株由来の５’ＵＴＲと、Ｓ３１０Ａ株変異体由来の３’ＵＴＲである。

上記のキメラＨＣＶゲノムにおいて、Ｓ３１０Ａ株変異体以外のＨＣＶ株、即ちＨＣＶの既存株は、遺伝子型１ａ、１ｂ又は２ａに属する株が好ましい。遺伝子型１ａに属する株には、例えばＨ７７株が含まれる。遺伝子型１ｂに属する株には、例えばＴＨ株、Ｃｏｎ１株、Ｊ１株及びそれらの派生株が含まれる。遺伝子型２ａに属する株には、例えばＪＦＨ−１株、Ｊ６ＣＦ株などが含まれる。好ましい株は、ＪＦＨ−１株、Ｊ６ＣＦ株又はＴＨ株であり、特に好ましくは、ＪＦＨ−１株である。なお、Ｓ３１０Ａ株及びその変異体以外のＨＣＶ株のゲノム塩基配列情報は、上記の文献又はＧｅｎＢａｎｋから入手可能である。

上記のキメラＨＣＶゲノムの核酸は、例えば、Ｊ６ＣＦ株とＳ３１０Ａ株とに由来するキメラ核酸であり、かつ、Ｔ１２８６Ｉ、Ｓ２２１０Ｉ、Ｒ２１９８Ｈ及びＲ２８９５Ｋからなる群より選択される少なくとも１つの変異を含んでいる。上記のキメラＨＣＶゲノムの核酸は、例えば、ＪＦＨ−１株とＳ３１０Ａ株とに由来するキメラ核酸であり、かつ、Ｔ１２８６Ｉ、Ｓ２２１０Ｉ、Ｒ２１９８Ｈ及びＲ２８９５Ｋからなる群より選択される少なくとも１つの変異を含んでいる。上記のキメラＨＣＶゲノムの核酸は、例えば、ＴＨ株とＳ３１０Ａ株とに由来するキメラ核酸であり、かつ、Ｔ１２８６Ｉ、Ｓ２２１０Ｉ、Ｒ２１９８Ｈ及びＲ２８９５Ｋからなる群より選択される少なくとも１つの変異を含んでいる。

図１６に、Ｓ３１０Ａ株変異体（Ｒ２１９８Ｈ、Ｓ２２１０Ｉ又はＲ２８９５Ｋの適応変異が導入されたＳ３１０Ａ株）、Ｊ６ＣＦ株、ＪＦＨ−１株及びＴＨ株のＨＣＶのＨＣＶゲノムの構造、並びに、キメラ核酸の例として、Ｓ３１０Ａ株変異体（Ｒ２１９８Ｈ、Ｓ２２１０Ｉ又はＲ２８９５Ｋの適応変異が導入されたＳ３１０Ａ株）の非構造遺伝子とＪ６ＣＦ株、ＪＦＨ−１株又はＴＨ株の構造遺伝子とを含む、キメラＨＣＶゲノム（それぞれＪ６ＣＦ／Ｓ３１０Ａ、ＪＦＨ−１／Ｓ３１０Ａ、ＴＨ／Ｓ３１０Ａ）の構造を示す。図１６に示すキメラ核酸Ｊ６ＣＦ／Ｓ３１０Ａ、ＪＦＨ−１／Ｓ３１０Ａ、ＴＨ／Ｓ３１０Ａにおいては、５’非翻訳領域は構造領域と同じＨＣＶ株（それぞれＪ６ＣＦ株、ＪＦＨ−１株又はＴＨ株）由来であり、３’非翻訳領域は非構造領域と同じＳ３１０Ａ株由来であり、ＮＳ２コード配列は、構造領域と同じＨＣＶ株（それぞれＪ６ＣＦ株、ＪＦＨ−１株又はＴＨ株）由来のＮＳ２配列とＳ３１０Ａ株由来のＮＳ２配列とのキメラである。これらのキメラ核酸は、Ｒ２１９８Ｈ、Ｓ２２１０Ｉ又はＲ２８９５Ｋの適応変異を有する。

本発明は、上記のキメラＨＣＶゲノムの核酸を含むＨＣＶウイルスゲノム、上記のキメラＨＣＶゲノムの核酸をウイルスゲノムとして含むＣ型肝炎ウイルス、ＨＣＶフルゲノムレプリコンＲＮＡ、発現ベクター又はキメラＨＣＶ粒子を提供する。このキメラＨＣＶ粒子は、細胞培養系において高効率で産生可能であり、また高い感染性を有しているという特徴をもつ。

キメラＨＣＶ遺伝子は、各ＨＣＶゲノムＲＮＡのｃＤＮＡをクローン化したベクターを鋳型にして、合成ＤＮＡをプライマーとしてＰＣＲを行い、それぞれのＨＣＶ遺伝子の必要な領域を増幅し、連結することにより作製することができる。

さらに、キメラＨＣＶ遺伝子ｃＤＮＡを、Ｔ７プロモーターなどのプロモーターの下流の適切な制限酵素サイトに連結し、ＨＣＶゲノムＲＮＡを合成するための発現ベクターを作製することができる。この発現ベクターから転写されたＲＮＡをＨＣＶ感受性細胞（例えば、Ｈｕｈ７細胞など）に導入すると、ウイルスの複製及びパッケージングが起こり、感染性ＨＣＶ粒子を産生することができる。

上記キメラＨＣＶ遺伝子を含むＨＣＶフルゲノムレプリコンＲＮＡが細胞内で複製能を有することや、ＨＣＶ粒子産生能を有すること、産生されたＨＣＶ粒子の感染性は、上記の方法で確認できる。

本発明は、上記のＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡ、ＨＣＶフルゲノムレプリコンＲＮＡ又はＣ型肝炎ウイルス粒子を用いた、抗Ｃ型肝炎ウイルス物質のスクリーニング方法も提供する。

上記のＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡを導入した培養細胞は、ＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡの複製を阻害する化合物のスクリーニングに使用することができる。すなわち、被験物質の存在下で、上記のＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡを導入した培養細胞を培養し、得られる培養物中のレプリコンＲＮＡを検出することにより、抗ＨＣＶ物質をスクリーニングすることができる。ここで、培養物とは培養上清や細胞破砕物を含む。この場合、培養物中にレプリコンＲＮＡが存在しないか、あるいは被験物質の非存在下に比べ少ない場合に、上記被験物質はＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡの複製を阻害し得ると判定することができる。

例えば、５’側から３’側の方向に、上記Ｓ３１０Ａ株又はその変異体の、５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）（配列番号２）、Ｃｏｒｅタンパク質コード配列（配列番号３）の５７ヌクレオチド、ルシフェラーゼ遺伝子、ＥＭＣＶ ＩＲＥＳ配列、ＮＳ３タンパク質コード配列（配列番号８）、ＮＳ４Ａタンパク質コード配列（配列番号９）、ＮＳ４Ｂタンパク質コード配列（配列番号１０）、ＮＳ５Ａタンパク質コード配列（配列番号１１）、ＮＳ５Ｂタンパク質コード配列（配列番号１２）及び３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）（配列番号１３）の順に連結されたＲＮＡからなるＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡをＨｕｈ７細胞に導入し、引き続いて、被験物質を添加し、４８〜７２時間後にルシフェラーゼの活性を測定する。被験物質未添加と比較してルシフェラーゼ活性を抑制し得る被験物質は、ＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡの複製を抑制する作用があると判定できる。

上記ＨＣＶフルゲノムレプリコンＲＮＡ又はその核酸を培養細胞（典型的にはＨＣＶ感受性細胞）に導入等して得られるＨＣＶ粒子（キメラＨＣＶ粒子を含む）は、ＨＣＶの感染を阻害する中和抗体や化合物及びＨＣＶの複製を阻害する化合物のスクリーニングに使用することができるほか、ワクチンとしての用途、抗ＨＣＶ抗体作製のための抗原としての用途に好適に用いることができる。

上記ＨＣＶ粒子を、ＨＣＶの感染や複製を阻害する物質のスクリーニングに使用するには、被験物質の存在下又は非存在下で、上記ＨＣＶ粒子を産生する細胞を培養するか、又は上記ＨＣＶ粒子をＨＣＶ感受性細胞と培養し、すなわちＨＣＶ粒子とＨＣＶ感受性細胞の混合物を培養し、あるいは、上記ＨＣＶ粒子が感染したＨＣＶ感染細胞を培養し、得られる培養物中のＨＣＶレプリコンＲＮＡ又はＨＣＶ粒子を検出する方法が挙げられる。ここで、検出とは培養物中のＨＣＶレプリコンＲＮＡ又はＨＣＶ粒子の量を定量することをいう。この場合、培養物中にＨＣＶレプリコンＲＮＡ及びＨＣＶ粒子が存在しないか、あるいは被験物質の非存在下に比べ少ない場合に、上記被験物質はＨＣＶの感染や複製を阻害し得ると評価することができる。

具体的には、例えば、被験物質の存在下及び非存在下で、上記ＨＣＶ粒子とともにＨＣＶ感受性細胞を培養し、得られる培養物中のＨＣＶレプリコンＲＮＡ又はＨＣＶ粒子を検出し、その被験物質がＨＣＶレプリコンＲＮＡの複製又はＨＣＶ粒子の形成を抑制するかどうかを判定することにより、抗ＨＣＶ物質をスクリーニングすることができる。

培養物中のＨＣＶレプリコンＲＮＡの検出は、ＨＣＶレプリコンＲＮＡに連結された外来遺伝子の機能、すなわち該遺伝子の発現により表れる機能を測定することが挙げられる。例えば、外来遺伝子が酵素の場合は、その酵素活性を計測することにより、ＨＣＶレプリコンＲＮＡを検出できる。また別の方法として、定量的ＲＴ−ＰＣＲにて複製したＲＮＡの量を定量することによっても、ＨＣＶレプリコンＲＮＡを検出することができる。

培養物中のＨＣＶ粒子の存在を検出するには、培養上清中に放出されたＨＣＶ粒子を構成するタンパク質（例えば、Ｃｏｒｅタンパク質、Ｅ１タンパク質又はＥ２タンパク質）に対する抗体を用いて検出するか、感染細胞中の非構造タンパク質の存在を非構造タンパク質に対する抗体で免疫染色を行い検出するか、又は、培養上清中のＨＣＶ粒子が含有するＨＣＶゲノムＲＮＡを、特異的プライマーを用いたＲＴ−ＰＣＲ法により増幅して検出することによって、ＨＣＶ粒子の存在を間接的に検出することもできる。

また、スクリーニングに用いるＨＣＶフルゲノムレプリコンＲＮＡが外来遺伝子を含む場合として、具体的には例えば、Ｓ３１０Ａ株変異体のＨＣＶの、５’ＵＴＲ、Ｃｏｒｅタンパク質コード配列の５７ヌクレオチド、ルシフェラーゼ遺伝子、ＥＭＣＶ ＩＲＥＳ配列、Ｃｏｒｅタンパク質コード配列、Ｅ１タンパク質コード配列、Ｅ２タンパク質コード配列、ｐ７タンパク質コード配列、ＮＳ２タンパク質コード配列、ＮＳ３タンパク質コード配列、ＮＳ４Ａタンパク質コード配列、ＮＳ４Ｂタンパク質コード配列、ＮＳ５Ａタンパク質コード配列、ＮＳ５Ｂタンパク質コード配列及び３’ＵＴＲが、５’側から３’側の方向に順に連結されたＲＮＡからなるＨＣＶフルゲノムレプリコンＲＮＡが挙げられる。なお、各塩基配列の連結において、連結部位には制限酵素部位などの付加配列を含みうる。上記ＨＣＶフルゲノムレプリコンＲＮＡをＨｕｈ７細胞に導入し、ＨＣＶ粒子を得て、該ＨＣＶ粒子をＨＣＶ感受性細胞に感染させると同時に、被験物質を添加し、４８〜７２時間後にルシフェラーゼの活性を測定する。被験物質未添加と比較してルシフェラーゼ活性を抑制する物質はＨＣＶの感染を抑制する作用があると判定できる。上記方法では、抗ＨＣＶ物質は、ウイルス感染又は複製を抑制可能なものとして選択される。

また、上記方法において、上記ＨＣＶフルゲノムレプリコンＲＮＡ又はその核酸を含むウイルスゲノム及び、上記ＨＣＶフルゲノムレプリコンＲＮＡ又はその核酸をウイルスゲノムとして含有するＣ型肝炎ウイルスを用いることもできる。

さらに、本発明は、上記Ｃ型肝炎ウイルス粒子（ＨＣＶ粒子）を含有するＣ型肝炎ウイルスワクチン（ＨＣＶワクチン）を提供する。

ワクチンとしての用途では、具体的には、上記ＨＣＶ粒子又はその一部分をそのままワクチンとして使用することもできるが、当該分野で既知の方法により弱毒化又は不活化して用いることが好ましい。ウイルスの不活化は、ホルマリン、β−プロピオラクトン、グルタルジアルデヒド等の不活化剤を、例えば、ウイルス浮遊液に添加混合し、ウイルスと反応させることにより達成することができる（Ａｐｐａｉａｈｇａｒｉ，Ｍ．Ｂ．＆Ｖｒａｔｉ，Ｓ．、Ｖａｃｃｉｎｅ、２００４年、第２２巻、ｐ．３６６９−３６７５）。

上記ＨＣＶワクチンは、溶液又は懸濁液のいずれかとして、投与可能に調製され得る。あるいは、使用直前に再構成可能なように、液体中の溶解又は懸濁に適した固形物（例えば凍結乾燥調製物）の形態で調製することができる。そのような固形物又は調製物は、乳濁されてもよいし、又はリポソームにカプセル化されてもよい。

ＨＣＶ粒子などの活性免疫原性成分は、薬学的に許容可能であって、活性成分に適合した賦形剤がしばしば混合され得る。適切な賦形剤には、例えば、水、生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなど、又はそれらの混合物がある。

さらに、所望であれば、上記ＨＣＶワクチンは、少量の補助剤（例えば、加湿剤又は乳化剤）、ｐＨ緩衝剤、及び／又はワクチンの効能を高めるアジュバントを含有し得る。

アジュバントは、該免疫系の非特異的刺激因子である。それらは、上記ＨＣＶワクチンに対する宿主の免疫応答を増強する。したがって、好ましい形態においては、上記ＨＣＶワクチンはアジュバントを含む。アジュバントの効能は、ＨＣＶ粒子から構成されるワクチンを投与することにより生じる抗体の量を測定することにより決定され得る。

有効であり得るアジュバントの例は、限定されないが、以下を包含する。水酸化アルミニウム、Ｎ−アセチル−ムラミル−Ｌ−トレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチル−ノル−ムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン（ＣＧＰ１１６３７、ｎｏｒ−ＭＤＰと称せられる）、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−（１’−２’−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミン（ＣＧＰ１９８３５Ａ、ＭＴＰ−ＰＥと称せられる）及びＲＩＢＩ。ＲＩＢＩは、バクテリアから抽出した３成分、すなわちモノホスホリルリピドＡ、トレハロースジミコレート及び細胞壁骨格（ＨＰＬ＋ＴＤＭ＋ＣＷＳ）を２％スクアレン／Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０エマルジョン中に含有している。

所望により、アジュバント活性を有する１以上の化合物を上記ＨＣＶワクチンに加えることができる。当技術分野で公知のアジュバントの具体例としては、フロイント完全アジュバント及びフロイント不完全アジュバント、ビタミンＥ、非イオンブロック重合体、ムラミルジペプチド、サポニン、鉱油、植物油及びＣａｒｂｏｐｏｌが挙げられる。粘膜適用に特に適したアジュバントとしては、例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）易熱性毒素（ＬＴ）又はコレラ（Ｃｈｏｌｅｒａ）毒素（ＣＴ）が挙げられる。他の適当なアジュバントとしては、例えば、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム又は酸化アルミニウム、油性乳剤（例えば、Ｂａｙｏｌ（登録商標）又はＭａｒｃｏｌ ５２（登録商標））、サポニン又はビタミンＥソリュビリゼートが挙げられる。

上記ＨＣＶワクチンは、通常、非経口的に、例えば皮下注射又は筋肉内注射のような、注射により投与される。他の投与態様に適切な別の処方としては、坐薬、及びある場合には経口処方薬が挙げられる。

皮下、皮内、筋肉内、静脈内に投与する注射剤において、上記ＨＣＶワクチンと医薬上許容される担体又は希釈剤の具体例としては、安定化剤、炭水化物（例えば、ソルビトール、マンニトール、デンプン、ショ糖、グルコース、デキストラン）、アルブミン又はカゼインなどのタンパク質、ウシ血清又は脱脂乳などのタンパク質含有物質、及びバッファー（例えば、リン酸バッファー）が挙げられる。

坐薬に使用される従来の結合剤及び担体としては、例えば、ポリアルキレングリコール又はトリグリセリドが含まれ得る。このような坐薬は、活性成分を０．５％〜５０％までの範囲で、好ましくは１％〜２０％までの範囲で含有する混合物から形成され得る。経口処方薬は、通常用いられる賦形剤を含有する。この賦形剤としては、例えば、薬学的なグレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどが挙げられる。

上記ＨＣＶワクチンは、溶液、懸濁液、錠剤、丸剤、カプセル剤、持続放出処方剤、又は粉末剤の形態をとり、１０％〜９５％、好ましくは２５％〜７０％の活性成分（ＨＣＶ粒子又はその一部分）を含有する。このＨＣＶワクチンは、投与剤形に適した方法で、そして予防及び／又は治療効果を有するような量で投与される。投与されるべき抗原量は、通常投与当たり０．０１μｇ〜１００，０００μｇまでの範囲であるが、これは、投与される患者、その患者の免疫系での抗体合成能、及び所望の防御の程度に依存する。また、経口、皮下、皮内、筋肉内、静脈内投与経路などの投与経路にも依存する。

また、上記ＨＣＶワクチンは、単独投与スケジュールで又は複合投与スケジュールで与えられ得る。好ましくは、複合投与スケジュールである。複合投与スケジュールでは、接種の開始時期に１〜１０の個別の投与を行い、続いて免疫応答を維持する及び／又は強化するのに必要とされる時間間隔で、例えば２回目の投与として１〜４ヵ月後に、別の投与を行い得る。必要であれば、数ヶ月後に引き続き投与を行い得る。投与のレジメもまた、少なくとも部分的には、個体の必要性により決定され、医師の判断に依存する。上記ＨＣＶワクチンは、健常人に投与し、健常人にＨＣＶに対する免疫応答を誘導し、新たなＨＣＶ感染に対して予防的に使用する方法がある。さらに、ＨＣＶに感染した患者に投与し、生体内にＨＣＶに対する強い免疫反応を誘導することにより、ＨＣＶを排除する治療的ワクチンとしての使用方法がある。

さらに、上記ＨＣＶ粒子は、抗ＨＣＶ抗体作製のための抗原として有用である。上記ＨＣＶ粒子を、哺乳類又は鳥類に投与することにより、抗体を作製することができる。哺乳類動物として、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、ウマ、ウシ、モルモット、ヒトコブラクダ、フタコブラクダ、ラマなどを挙げることができる。ヒトコブラクダ、フタコブラクダ及びラマはＨ鎖のみからなる抗体を作製するには好適である。鳥類動物としては、ニワトリ、ガチョウ、ダチョウなどを挙げることができる。上記ＨＣＶ粒子を投与された動物の血清を採取して、既知の方法に従って抗体を取得することができる。

本発明はこれらの抗ＨＣＶ抗体も提供し、好ましくはこの抗ＨＣＶ抗体は、ＨＣＶを不活化し得る中和抗体として利用できる。

上記ＨＣＶ粒子を免疫した動物の細胞を用いて、モノクローナル抗体産生細胞を産生するハイブリドーマを作製することができる。ハイブリドーマを製造する方法は周知であり、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、１９８８年）に記載された方法を用いることができる。

モノクローナル抗体産生細胞は、細胞融合により作製してもよく、また癌遺伝子ＤＮＡの導入やＥｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒウイルスの感染によりＢリンパ球を不死化させるような他の方法で作製してもよい。

これらの方法によって得られたモノクローナル抗体や、ポリクローナル抗体はＨＣＶの診断や治療、予防に有用である。

上記ＨＣＶ粒子を抗原として用いて作製された抗体は、医薬として、医薬上許容される溶解剤、添加剤、安定剤、バッファーなどとともに投与され得る。投与経路はいずれの投与経路でもよいが、好ましくは、皮下、皮内、筋肉内投与であり、より好ましくは、静脈内投与が好ましい。

本発明は上記のような本発明のワクチン又は抗体を治療が必要な被験体に投与することを含むＨＣＶの治療又は予防方法も提供する。

本発明はまた、本発明に係るワクチン又は抗体を含む医薬組成物も提供する。この医薬組成物は、溶解剤、添加剤、安定剤、バッファー等の製薬上許容される担体を含んでもよい。

以下に実施例を挙げて、本発明をより具体的に説明する。ただし、これらの実施例は説明のためのものであり、本発明の技術的範囲を制限するものではない。

（実施例１）野生型Ｓ３１０Ａ株のＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡ発現ベクターの構築
遺伝子型３ａのＨＣＶに感染した７１歳の急性Ｃ型肝炎患者からＨＣＶウイルス株を単離し、Ｓ３１０Ａ株と名付けた。この患者は、５９歳のときに遺伝子型３ａのＨＣＶに感染していると診断され、４年後に肝硬変により、肝臓移植を受けていた。具体的には、患者血清からＩｓｏｇｅｎ−ＬＳ（Ｎｉｐｐｏｎ Ｇｅｎｅ社）を用いてＲＮＡを抽出精製し、ランダムヘキサマープライマーでｃＤＮＡを合成した。既知の４種類の遺伝子型３ａのＨＣＶゲノムの保存された配列（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ０４６８６６、Ｄ２８９１７、Ｘ７６９１８、及びＤ１７７６３）を元にＰＣＲプライマーを設計し、合成したｃＤＮＡを用いて、９つのフラグメントに分けてｃＤＮＡを増幅した。増幅産物が得られにくい５’末端の配列は５’ＲＡＣＥ法を用いて増幅産物を得た。それぞれのフラグメントはシークエンス用クローニングベクター、ｐＧＥＭ−Ｔ ＥＡＳＹ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）中にクローン化した。常法により、これらのクローンの塩基配列を解析し、Ｓ３１０Ａ株の全長ゲノムＲＮＡ配列を決定した。この全長ゲノムＲＮＡに対応するｃＤＮＡ断片を常法により合成した。Ｓ３１０Ａ株の全長ゲノムＲＮＡ配列に対応するｃＤＮＡ配列を配列番号１に示す。

以上のようにして得られた急性Ｃ型肝炎の患者から分離された新規な遺伝子型３ａのＨＣＶ株であるＳ３１０Ａ株の、全長ゲノムＲＮＡに対応するｃＤＮＡ（全長ゲノムｃＤＮＡ；配列番号１）の非構造領域を用いて、以下のようにして、ＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡ発現ベクターであるプラスミドｐＳ３１０ＡＳＧＲ−Ｎｅｏを構築した。Ｓ３１０Ａ株の全長ゲノムＲＮＡ、ＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡ発現ベクターｐＳ３１０ＡＳＧＲ−Ｎｅｏ、及びその発現ベクターから発現されるＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡの構造を図１に示す。なお、アミノ酸変異を含む変異体と区別するために、本発明ではアミノ酸変異を含まないＳ３１０Ａ株を野生型Ｓ３１０Ａ株と呼ぶ。

野生型Ｓ３１０Ａ株の全長ゲノムの塩基配列を、配列番号１に示す。また、Ｓ３１０Ａ株の５’ＵＴＲの塩基配列を配列番号２、Ｃｏｒｅタンパク質コード配列を配列番号３、Ｅ１タンパク質コード配列を配列番号４、Ｅ２タンパク質コード配列を配列番号５、ｐ７タンパク質コード配列を配列番号６、ＮＳ２タンパク質コード配列を配列番号７、ＮＳ３タンパク質コード配列を配列番号８、ＮＳ４Ａタンパク質コード配列を配列番号９、ＮＳ４Ｂタンパク質コード配列を配列番号１０、ＮＳ５Ａタンパク質コード配列を配列番号１１、ＮＳ５Ｂタンパク質コード配列を配列番号１２、３’ＵＴＲの塩基配列を配列番号１３に、それぞれ示す。なお配列番号１〜１３にはＤＮＡ配列を記載しているが、ＲＮＡ配列を意図する場合には各配列番号に示される塩基配列中のチミン（ｔ）をウラシル（ｕ）に読み替える。

配列番号１の塩基配列（野生型Ｓ３１０Ａ株の全長ゲノム配列）によってコードされるＨＣＶ前駆体タンパク質（ポリプロテイン）のアミノ酸配列を配列番号１４に示す。配列番号１４に示されるアミノ酸配列は、配列番号１の塩基配列の塩基番号３４１〜９４０６（終止コドンを含む）にコードされている。また、Ｓ３１０Ａ株の前駆体タンパク質中のＮＳ３タンパク質からＮＳ５Ｂタンパク質までの領域のアミノ酸配列を配列番号１５に示す。この配列番号１５のアミノ酸配列（ＮＳ３〜ＮＳ５Ｂ領域）は、配列番号１４に示されるアミノ酸配列のアミノ酸１０３３番目〜３０２１番目に対応する。

ＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡ発現ベクターｐＳ３１０ＡＳＧＲ−Ｎｅｏの構築は、Ｋａｔｏらの文献（Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ、２００３年、第１２５巻、ｐ．１８０８−１８１７）及び国際公開第０４／１０４１９８号に示される手順に基づいて行った。

具体的には、まず、野生型Ｓ３１０Ａ株の全長ゲノムＲＮＡ（図１Ａ）のｃＤＮＡを、プラスミドベクターｐＵＣ１９中のＴ７プロモーターの制御下に挿入し、組換えプラスミドｐＳ３１０Ａを作製した。次いで、組換えプラスミドｐＳ３１０Ａの構造領域（Ｃｏｒｅタンパク質、Ｅ１タンパク質、Ｅ２タンパク質及びｐ７タンパク質をコードする）と非構造領域の一部を、ネオマイシン耐性遺伝子（ｎｅｏ：ネオマイシンホスホトランフェラーゼ遺伝子とも称する）、及びＥＭＣＶ ＩＲＥＳ（脳心筋炎ウイルスの内部リボゾーム結合部位）で置換することにより、プラスミドｐＳ３１０ＡＳＧＲ−Ｎｅｏを構築した。これを、ＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡ発現ベクターｐＳ３１０ＡＳＧＲ−Ｎｅｏと名付けた。

図１Ｂは、ＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡ発現ベクターｐＳ３１０ＡＳＧＲ−Ｎｅｏの構造を示している。発現ベクターｐＳ３１０ＡＳＧＲ−Ｎｅｏにおいて、５’ＵＴＲ、Ｃｏｒｅタンパク質コード配列のＮ末端から５７ヌクレオチド（ＨＣＶ ＩＲＥＳ）、ＮＳ３〜ＮＳ５Ｂタンパク質コード配列及び３’ＵＴＲが、Ｓ３１０Ａ株に由来する配列である。図中、「Ｔ７」はＴ７プロモーターを意味する。Ｔ７プロモーターは、それぞれの発現ベクターからＴ７ ＲＮＡポリメラーゼを用いてＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡを転写させるために必要な配列エレメントである。「ｎｅｏ」はネオマイシン耐性遺伝子、「ＥＭＣＶ ＩＲＥＳ」は脳心筋炎ウイルスの内部リボソーム結合部位を示す。「Ｃ」はＣｏｒｅタンパク質コード配列、「Ｅ１」はＥ１タンパク質コード配列、「Ｅ２」はＥ２タンパク質コード配列、「ｐ７」はｐ７タンパク質コード配列、「ＮＳ２」はＮＳ２タンパク質コード配列、「ＮＳ３」はＮＳ３タンパク質コード配列、「４Ａ」はＮＳ４Ａタンパク質コード配列、「４Ｂ」はＮＳ４Ｂタンパク質コード配列、「ＮＳ５Ａ」はＮＳ５Ａタンパク質コード配列及び「ＮＳ５Ｂ」はＮＳ５Ｂタンパク質コード配列を示す。発現ベクターｐＳ３１０ＡＳＧＲ−Ｎｅｏから作製されるＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡ（Ｓ３１０Ａ株のＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡ）は、図１Ｃに示すように、Ｔ７プロモーターより下流の領域が転写されたＲＮＡである。また、図中の「ＥｃｏＲＩ」、「ＰｍｅＩ」、「ＳｎａＢＩ」及び「ＸｂａＩ」は制限酵素サイトを示す。なお、図９、１０、１２、１４、１６においても図中の表記は同様である。

発現ベクターｐＳ３１０ＡＳＧＲ−ＮｅｏはＴ７プロモーターの下流にＳ３１０ＡサブゲノムレプリコンＲＮＡのｃＤＮＡが連結されている。Ｓ３１０Ａ株のＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡのｃＤＮＡ塩基配列を配列番号１６に示した。

（実施例２）野生型Ｓ３１０Ａ株のＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡの作製
実施例１で構築した発現ベクターｐＳ３１０ＡＳＧＲ−Ｎｅｏを、制限酵素ＸｂａＩで切断した。次いで、ＸｂａＩ切断断片 １０〜２０μｇに、Ｍｕｎｇ Ｂｅａｎ Ｎｕｃｌｅａｓｅ ２０Ｕ（トータル反応液量 ５０μＬ）を加えて３０℃で３０分間インキュベートした。Ｍｕｎｇ Ｂｅａｎ Ｎｕｃｌｅａｓｅは、二本鎖ＤＮＡ中の一本鎖部分を選択的に分解して平滑化する反応を触媒する酵素である。通常、上記ＸｂａＩ切断断片をそのまま鋳型ＤＮＡとして用いてＲＮＡポリメラーゼによるＲＮＡ転写を行うと、ＸｂａＩの認識配列の一部であるＣＵＡＧの４塩基が３’末端に余分に付加されたレプリコンＲＮＡが合成されてしまう。そこで本実施例では、ＸｂａＩ切断断片をＭｕｎｇ Ｂｅａｎ Ｎｕｃｌｅａｓｅで処理することにより、ＸｂａＩ切断断片からＣＴＡＧの４塩基を除去した。

次いで、ＸｂａＩ切断断片を含むＭｕｎｇ Ｂｅａｎ Ｎｕｃｌｅａｓｅ処理後溶液について、常法に従ったタンパク質除去処理を行うことにより、ＣＴＡＧの４塩基が除去されたＸｂａＩ切断断片を精製し、これを次の反応で用いる鋳型ＤＮＡとした。この鋳型ＤＮＡから、Ａｍｂｉｏｎ社のＭＥＧＡｓｃｒｉｐｔ（登録商標）を用いて、Ｔ７プロモーターを利用した転写反応によりＲＮＡをｉｎ ｖｉｔｒｏ合成した。具体的には、鋳型ＤＮＡを０．５〜１．０μｇ含む反応液２０μＬを製造業者の使用説明書に基づいて調製し、３７℃で３時間〜１６時間反応させた。

ＲＮＡ合成終了後、反応溶液にＤＮａｓｅ Ｉ（２Ｕ）を添加して３７℃で１５分間反応させることにより鋳型ＤＮＡを除去し、さらに酸性フェノールによるＲＮＡ抽出を行うことにより、ｐＳ３１０ＡＳＧＲ−Ｎｅｏから転写された野生型Ｓ３１０Ａ株のＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡ（図１Ｃ）（配列番号１６）を取得した。

（実施例３）Ｓ３１０Ａ株のＨＣＶサブゲノムレプリコン複製細胞クローンの樹立
実施例２で作製した野生型Ｓ３１０Ａ株のＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡ（１μｇ、３μｇ、１０μｇ又は３０μｇ）をエレクトロポレーション法によりＨｕｈ７細胞に導入した。エレクトロポレーション処理を行ったＨｕｈ７細胞（３×１０^６個）を培養ディッシュに播種し、１６時間〜２４時間培養した後に、培養ディッシュにＧ４１８（ネオマイシン）を添加した。その後、週に２回培養液を交換しながら培養を継続した。

播種時から２１日間培養した後、クリスタルバイオレットで生存細胞を染色した。その結果、１０μｇ及び３０μｇのＳ３１０Ａ株のＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡを導入した細胞について、コロニー形成が確認できた（図２）。コロニー形成は、その細胞においてＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡが複製されていることを示している。この結果、野生型Ｓ３１０Ａ株のゲノム非構造領域を用いて作製したＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡが、培養細胞での自律複製能を有していることが示された。

コロニー形成が認められた上記ＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡ導入細胞について、上記の培養２１日後の培養ディッシュから、生存細胞のコロニーをさらにクローン化し、培養を継続した。このようなコロニーのクローニングにより、細胞クローンを１０株樹立することができた。これらの細胞クローンを、Ｓ３１０Ａサブゲノムレプリコン複製細胞と名付け、また、各クローンにクローン番号（番号：１〜１０）を付けた。こうして樹立された細胞クローンにおいては、導入されたＳ３１０Ａ株のＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡが自律複製している。

（実施例４）Ｓ３１０Ａサブゲノムレプリコン複製細胞内のＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡのコピー数の定量
樹立した１０クローン（クローン番号：１〜１０）のＳ３１０Ａサブゲノムレプリコン複製細胞を用い、細胞内のＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡのコピー数を定量した。ＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡのコピー数の定量はＴａｋｅｕｃｈｉらの文献（Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ、１９９９年、第１１６巻、ｐ．６３６−６４２）及びＫａｔｏらの文献（Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ、２００３年、第１２５巻、ｐ．１８０８−１８１７）に示された手法に基づいて行った。

当該手法はＴａｑＭａｎプローブ法（Ｐａｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いた検出系である。具体的には、まず、Ｓ３１０Ａサブゲノムレプリコン複製細胞から常法によりトータルＲＮＡを抽出した。次にｒＴｔｈ ＤＮＡポリメラーゼを用いてトータルＲＮＡからｃＤＮＡを合成し、合成されたｃＤＮＡを鋳型にしてプライマー ５’−ＣＧＧＧＡＧＡＧＣＣＡＴＡＧＴＧＧ−３’（配列番号２４）と５’−ＡＧＴＡＣＣＡＣＡＡＧＧＣＣＴＴＴＣＧ−３’（配列番号２５）を用いてＰＣＲ増幅した。その際、塩基配列５’−ＣＴＧＣＧＧＡＡＣＣＧＧＴＧＡＧＴＡＣＡＣ−３’（配列番号２６）を有し、その５’末端に蛍光色素である６’−カルボキシ−フルオレセイン（ＦＡＭ）が結合し、３’末端にクエンチャーである６’−カルボキシ−テトラメチル−ローダミン（ＴＡＭＲＡ）が結合したプローブを加えた。このプローブが存在すると、増幅過程においてＴａｑポリメラーゼの５’エキソヌクレアーゼ活性により、鋳型ｃＤＮＡにハイブリダイズしたプローブが分解され、蛍光色素がプローブから遊離し、クエンチャーによる抑制が解除されて蛍光が発せられる。そこで、この蛍光をＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ７７００（Ｐａｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）で検出し、ＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡのコピー数を定量した。

比較対照として、遺伝子型２ａのＪＦＨ−１株のＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡを導入した細胞（ＪＦＨ−１サブゲノムレプリコン複製細胞）を用いた。なお、ＪＦＨ−１株のＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡ発現ベクター（その構造は、ＪＦＨ−１株のＨＣＶの５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）と、Ｃｏｒｅタンパク質コード領域の５’末端の５７ヌクレオチドの配列と、ネオマイシン耐性遺伝子と、ＥＭＣＶ ＩＲＥＳ配列と、ＮＳ３タンパク質、ＮＳ４Ａタンパク質、ＮＳ４Ｂタンパク質、ＮＳ５Ａタンパク質、及びＮＳ５Ｂタンパク質をコードする塩基配列と、３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）を、５’側から３’側に向かってこの順序で含む）の構築及びＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡの作製は、Ｋａｔｏらの文献（Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ、２００３年、第１２５巻、ｐ．１８０８−１８１７）及び国際公開第０４／１０４１９８号に記載の方法に基づき実施した。Ｈｕｈ７細胞への導入及びコピー数定量は上記と同じ方法で行った。

定量結果を図３に示す。図の横軸の数字はＳ３１０Ａサブゲノムレプリコン複製細胞クローンのクローン番号を示す。また、縦軸は細胞のトータルＲＮＡ１μｇ当たりの細胞内のＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡのコピー数を示す。なお、棒グラフ上部の数値は、各細胞内のＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡのコピー数を示す。

その結果、樹立した１０クローンのＳ３１０Ａサブゲノムレプリコン複製細胞は、ＪＦＨ−１サブゲノムレプリコン複製細胞と同等又はそれ以上のＲＮＡコピー数が検出された。Ｓ３１０Ａ株由来のＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡは、ＪＦＨ−１株のＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡとほぼ同等又はそれ以上の複製能を有している事が示された。

（実施例５）Ｓ３１０Ａサブゲノムレプリコン複製細胞におけるレプリコンＲＮＡ複製に対する抗ウイルス剤の効果
樹立したＳ３１０Ａサブゲノムレプリコン複製細胞（クローン）におけるレプリコンＲＮＡ複製に対する抗ウイルス剤の効果を調べた。

Ｓ３１０Ａサブゲノムレプリコン複製細胞（クローン）及びＪＦＨ−１サブゲノムレプリコン複製細胞を１ウェル当たり５×１０^４個となるように２４ウェルプレートに播種し、翌日に、インターフェロン−α（ＩＦＮ−α）、ＮＳ３プロテアーゼ阻害剤であるＶＸ−９５０（ｔｅｌａｐｒｅｖｉｒ）（Ｌｉｎら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２００４年、第２７９巻、ｐ．１７５０８−１７５１４）及びＢＩＬＮ−２０６１（Ｄａｎｉｅｌら、Ｎａｔｕｒｅ、２００３年、第４２６巻、ｐ．１８６−１８９）、並びに、ＮＳ５Ｂポリメラーゼ阻害剤であるＪＴＫ−１０９（Ｈｉｒａｓｈｉｍａら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２００６年、第４９巻、ｐ．４７２１−４７３６）及びＰＳＩ−６１３０(Ｃｌａｒｋら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２００５年、第４８巻、ｐ．５５０４−５５０８）をそれぞれ、ウェルに添加して３日間作用させた。その後、細胞を回収してトータルＲＮＡを抽出し、実施例４と同じ手法で細胞内のＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡのコピー数を定量した。

その結果を図４〜８に示す。図の横軸は添加した阻害剤の濃度を示す。また、縦軸はＨＣＶ ＲＮＡ量の変化率を示し、これは、阻害剤を添加しない場合（０ ＩＵ又は０ Ｍ）の細胞のトータルＲＮＡ１μｇ当たりのサブゲノムレプリコンＲＮＡ量を１００％とした場合の、阻害剤を添加した場合のサブゲノムレプリコンＲＮＡ量の比率（％）を示す。棒グラフは、各阻害剤濃度について最も左のバー（白）がＪＦＨ−１サブゲノムレプリコン複製細胞、左から二番目のバー（明るい灰色）がＳ３１０Ａサブゲノムレプリコン複製細胞クローン６、左から三番目のバー（黒）がＳ３１０Ａサブゲノムレプリコン複製細胞クローン９、最も右のバー（暗い灰色）がＳ３１０Ａサブゲノムレプリコン複製細胞クローン１０についての結果を示している。

ＩＦＮ−αを作用させた結果、ＪＦＨ−１及びＳ３１０ＡサブゲノムレプリコンＲＮＡはＩＦＮ−αによって細胞内でのＲＮＡ複製が顕著に阻害されることが示された（図４）。

一方、ＮＳ３プロテアーゼ阻害剤であるＶＸ−９５０及びＢＩＬＮ−２０６１は、ＪＦＨ−１サブゲノムレプリコンに対する複製阻害作用が認められたが、Ｓ３１０Ａサブゲノムレプリコンの複製は阻害しなかった（図５、６）。このことから、遺伝子型３ａのＮＳ３プロテアーゼは、遺伝子型２ａのＮＳ３プロテアーゼと異なり、既存ＮＳ３プロテアーゼ阻害剤では阻害されないことが示唆された。

またＮＳ５Ｂポリメラーゼ阻害剤であるＪＴＫ−１０９及びＰＳＩ−６１３０を作用させた結果、ＪＦＨ−１サブゲノムレプリコンはＪＴＫ−１０９によるＲＮＡ複製阻害を受けないが、Ｓ３１０ＡサブゲノムレプリコンではそれぞれＪＴＫ−１０９により、著しいＲＮＡ複製阻害が認められた（図７）。一方、ＰＳＩ−６１３０を作用させた場合は、ＪＦＨ−１及びＳ３１０ＡサブゲノムレプリコンのＲＮＡ複製をいずれも濃度依存的に阻害した（図８）。

以上から、本発明の遺伝子型３ａのサブゲノムレプリコンは遺伝子型３ａの複製を阻害する薬剤を評価するツールとして好適であることが示された。

また、遺伝子型３ａのＨＣＶ株由来のサブゲノムレプリコンの複製能は、遺伝子型２ａのＨＣＶ株由来のサブゲノムレプリコンの複製能とは異なる要因により影響を受けることも示された。本発明の限定的な解釈を意図するものではないが、遺伝子型３ａと２ａではＨＣＶゲノムにコードされるポリメラーゼの構造が異なっており、その結果、薬剤化合物による効果が異なるとも考えられる。

（実施例６）Ｓ３１０Ａサブゲノムレプリコン複製細胞内のＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡの配列解析
実施例３で樹立したＳ３１０Ａサブゲノムレプリコン複製細胞（クローン）内に存在するＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡの配列解析を行った。

まず、樹立した１０クローンとさらに追加した１クローンの計１１クローンのＳ３１０Ａサブゲノムレプリコン複製細胞からトータルＲＮＡを抽出し、この中に含まれるＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡをＲＴ−ＰＣＲ法を用いて増幅した。ＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡから逆転写により合成したｃＤＮＡを鋳型としたＰＣＲ増幅には、５’−ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧ−３’（配列番号２７）と５’−ＧＣＧＧＣＴＣＡＣＧＧＡＣＣＴＴＴＣＡＣ−３’（配列番号２８）をプライマーとして使用した。ＰＣＲ増幅産物はシークエンス用クローニングベクター中にクローン化し、常法により配列解析を行った。

配列解析の結果、Ｓ３１０Ａサブゲノムレプリコン複製細胞内のＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡから同定された適応変異を表１に示す。

表１に示すように、Ｓ３１０Ａサブゲノムレプリコン複製細胞から得られたＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡに、非構造領域であるＮＳ３タンパク質領域で１箇所（Ｔ１２８６Ｉ：第１２８６番目のスレオニン（Ｔ）がイソロイシン（Ｉ）に変異）、ＮＳ５Ａタンパク質領域で３箇所（Ｔ２１８８Ａ：第２１８８番目のスレオニン（Ｔ）がアラニン（Ａ）に変異、Ｒ２１９８Ｈ：第２１９８番目のアルギニン（Ｒ）がヒスチジン（Ｈ）に変異、Ｓ２２１０Ｉ：第２２１０番目のセリン（Ｓ）がイソロイシン（Ｉ）に変異）及び、ＮＳ５Ｂタンパク質領域で３箇所（Ｔ２４９６Ｉ：第２４９６番目のスレオニン（Ｔ）がイソロイシン（Ｉ）に変異、Ｒ２８９５Ｇ：第２８９５番目のアルギニン（Ｒ）がグリシン（Ｇ）に変異、Ｒ２８９５Ｋ：第２８９５番目のアルギニン（Ｒ）がリジン（Ｋ）に変異）の、アミノ酸置換を引き起こす塩基置換が見出された。また、クローン番号９ではＮＳ５Ｂタンパク質領域内の変異であるＴ２４９６ＩとＲ２８９５Ｋが同時に検出された。図９には、これらアミノ酸置換の位置を、発現ベクターｐＳ３１０ＡＳＧＲ−Ｎｅｏの構造上に模式的に示した。なお、これらのアミノ酸置換の位置は、Ｓ３１０Ａ株の前駆体タンパク質の全長アミノ酸配列（配列番号１４）に基づいて記載されている。

（実施例７）野生型Ｓ３１０Ａ株のＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡへの変異導入及びそのレプリコン複製能への影響の解析
実施例６で見出されたアミノ酸置換を引き起こす塩基置換、すなわち塩基変異が野生型Ｓ３１０Ａ株のＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡの細胞内での複製に影響を与えるかどうかを以下のようにして調べた。

ＮＳ３タンパク質領域内のアミノ酸置換であるＴ１２８６Ｉ、ＮＳ５Ａタンパク質領域内のアミノ酸置換であるＴ２１８８Ａ、Ｒ２１９８Ｈ及びＳ２２１０Ｉ、並びに、ＮＳ５Ｂタンパク質領域内のアミノ酸置換であるＴ２４９６Ｉ、Ｒ２８９５Ｇ及びＲ２８９５Ｋ、を引き起こす塩基置換を単独でそれぞれ、実施例１で作製したＳ３１０Ａ株のＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡ発現ベクターｐＳ３１０ＡＳＧＲ−Ｎｅｏに導入した。また、ＮＳ５Ｂタンパク質領域内のアミノ酸置換であるＴ２４９６Ｉ及びＲ２８９５Ｋを引き起こす塩基置換を同時に発現ベクターｐＳ３１０ＡＳＧＲ−Ｎｅｏに導入した。

図１０に、これらアミノ酸置換をそれぞれ導入したＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡ発現ベクターの構造を示す。なお、発現ベクターｐＳ３１０ＡＳＧＲ−Ｎｅｏに、Ｔ１２８６Ｉ置換を単独で導入したものを「ｐＳ３１０ＡＳＧＲ−Ｎｅｏ Ｔ１２８６Ｉ」と名付けた。他のアミノ酸置換を単独で導入した発現ベクターもこれと同様に名付けた（図１０参照）。また、発現ベクターｐＳ３１０ＡＳＧＲ−Ｎｅｏに、Ｔ２４９６Ｉ及びＲ２８９５Ｋ置換を同時に導入したものを「ｐＳ３１０ＡＳＧＲ−Ｎｅｏ Ｔ２４９６Ｉ／Ｒ２８９５Ｋ」と名付けた。

具体的には、ｐＳ３１０ＡＳＧＲ−Ｎｅｏ及びそのＰＣＲ産物を鋳型ＤＮＡとして、導入するアミノ酸置換を引き起こす塩基変異を含んだプライマーを用い、繰り返し行うＰＣＲにより、ｐＳ３１０ＡＳＧＲ−Ｎｅｏに塩基置換を導入した。

ここで用いたＰＣＲ条件は以下のとおりである。まず、ＰＣＲの鋳型ＤＮＡに、Ｐｙｒｏｂｅｓｔ（登録商標） ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅキット（タカラバイオ社）に添付の、１０×緩衝液を５μＬ、２．５ｍＭ ｄＮＴＰ混合液を４μＬ、１００μＭのプライマー（フォワード及びリバースそれぞれ）を０．２５μＬ加え、脱イオン水を加え最終的に全量を４９．７５μＬとした。その後、Ｐｙｒｏｂｅｓｔ（登録商標） ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ社）を０．２５μＬ加え、ＰＣＲを行った。ＰＣＲは、９８℃で２分間の熱変性処理後、９８℃で２０秒、５５℃で３０秒及び７２℃で３分を１サイクルとして、２５サイクル行った後、７２℃で１０分間の最終伸長反応を行った。

Ｔ１２８６Ｉの導入のためには、まず、ｐＳ３１０ＡＳＧＲ−Ｎｅｏを鋳型ＤＮＡとし、Ｎｅｏ−Ｓ４（５’−ＴＣＣＴＣＧＴＧＣＴＴＴＡＣＧＧＴＡＴＣ−３’（配列番号２９））及び１２８６Ｒ（５’−ＧＴＴＣＣＣＡＡＴＧＣＧＧＡＣＧＴＴＧＧ−３’（配列番号３０））をプライマーとして、上記ＰＣＲ条件でＰＣＲを行った。得られたＰＣＲ産物をＰＣＲ産物ｎｏ．１とした。

次に、ｐＳ３１０ＡＳＧＲ−Ｎｅｏを鋳型ＤＮＡとし、１２８６Ｆ（５’−ＣＣＡＡＣＧＴＣＣＧＣＡＴＴＧＧＧＡＡＣ−３’（配列番号３１））及び５５４６Ｒ（５’−ＴＣＣＴＴＧＡＡＣＴＧＧＴＧＧＧＣＴＡＴＴ−３’（配列番号３２））をプライマーとして、上記ＰＣＲ条件でＰＣＲを行った。得られたＰＣＲ産物をＰＣＲ産物ｎｏ．２とした。

それぞれのＰＣＲ産物を精製し、１５μＬのＨ_２Ｏに溶解した。精製したＰＣＲ産物ｎｏ．１とＰＣＲ産物ｎｏ．２のＤＮＡを、１μＬずつ混合した。これを鋳型ＤＮＡとし、Ｎｅｏ−Ｓ４（５’−ＴＣＣＴＣＧＴＧＣＴＴＴＡＣＧＧＴＡＴＣ−３’（配列番号２９））及び５５４６Ｒ（５’−ＴＣＣＴＴＧＡＡＣＴＧＧＴＧＧＧＣＴＡＴＴ−３’（配列番号３２））をプライマーとして、上記ＰＣＲ条件でＰＣＲを行った。得られたＰＣＲ産物をＰＣＲ産物ｎｏ．３とした。このＰＣＲ産物を精製し、３０μＬのＨ_２Ｏに溶解した。

ｐＳ３１０ＡＳＧＲ−Ｎｅｏ及び精製したＰＣＲ産物ｎｏ．３をそれぞれ、制限酵素ＳｎａＢＩ及びＥｃｏＴ２２Ｉで消化し、各ＨＣＶ ｃＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動にて分画し、精製した。これら２つのＤＮＡ断片とＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（タカラバイオ社）を混合し、２つのＤＮＡ断片を連結した。こうして得られた組換え発現ベクター（アミノ酸置換Ｔ１２８６Ｉを引き起こす塩基置換を有する）をｐＳ３１０ＳＧＲ−Ｎｅｏ Ｔ１２８６Ｉと名付けた。なお、ｐＳ３１０ＡＳＧＲ−Ｎｅｏ Ｔ１２８６Ｉから合成されるＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡの配列を配列番号１７に示す。

Ｔ２１８８Ａの導入のためには、まず、ｐＳ３１０ＡＳＧＲ−Ｎｅｏを鋳型ＤＮＡとし、５２４０Ｆ（５’−ＴＧＧＧＧＣＣＴＧＴＣＣＡＡＡＡＴＧＡＡ−３’（配列番号３３））及び２１８８Ｒ（５’−ＧＣＣＴＣＡＧＣＧＧＣＡＡＴＡＴＧＧＧＡＡ−３’（配列番号３４））をプライマーとして、上記ＰＣＲ条件でＰＣＲを行った。得られたＰＣＲ産物をＰＣＲ産物ｎｏ．４とした。

次に、ｐＳ３１０ＡＳＧＲ−Ｎｅｏを鋳型ＤＮＡとし、２１８８Ｆ（５’−ＴＴＣＣＣＡＴＡＴＴＧＣＣＧＣＴＧＡＧＧＣ−３’（配列番号３５））及び７６０１Ｒ（５’−ＡＣＴＡＡＣＧＧＴＧＧＡＣＣＡＡＧＡＧＴ−３’（配列番号３６））をプライマーとして、上記ＰＣＲ条件でＰＣＲを行った。得られたＰＣＲ産物をＰＣＲ産物ｎｏ．５とした。

それぞれのＰＣＲ産物を精製し、１５μＬのＨ_２Ｏに溶解した。ＰＣＲ産物ｎｏ．４とＰＣＲ産物ｎｏ．５のＤＮＡを１μＬずつ混合した。これを鋳型ＤＮＡとし、５２４０Ｆ（５’−ＴＧＧＧＧＣＣＴＧＴＣＣＡＡＡＡＴＧＡＡ−３’（配列番号３３））及び７６０１Ｒ（５’−ＡＣＴＡＡＣＧＧＴＧＧＡＣＣＡＡＧＡＧＴ−３’（配列番号３６））をプライマーとして、上記ＰＣＲ条件でＰＣＲを行った。得られたＰＣＲ産物をＰＣＲ産物ｎｏ．６とした。ＰＣＲ産物を精製し、３０μＬのＨ_２Ｏに溶解した。

ｐＳ３１０ＡＳＧＲ−Ｎｅｏ及び精製したＰＣＲ産物ｎｏ．６をそれぞれ、制限酵素ＸｈｏＩ及びＢａｍＨＩで消化し、各ＨＣＶ ｃＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動にて分画し、精製した。これら２つのＤＮＡ断片とＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（タカラバイオ社）を混合し、２つのＤＮＡ断片を連結した。こうして得られた組換え発現ベクター（アミノ酸置換Ｔ２１８８Ａを引き起こす塩基置換を有する）をｐＳ３１０ＡＳＧＲ−Ｎｅｏ Ｔ２１８８Ａと名付けた。ｐＳ３１０ＳＡＧＲ−Ｎｅｏ Ｔ２１８８Ａから合成されるＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡの配列を配列番号２１に示す。

Ｒ２１９８Ｈの導入のためには、まず、ｐＳ３１０ＡＳＧＲ−Ｎｅｏを鋳型ＤＮＡとし、５２４０Ｆ（５’−ＴＧＧＧＧＣＣＧＴＣＣＡＡＡＡＴＧＡＡ−３’（配列番号３３））及び２１９８Ｒ（５’−ＧＡＧＧＧＧＡＣＣＣＡＴＧＣＧＣＡＡＧＧＣ−３’（配列番号３７））をプライマーとして、上記ＰＣＲ条件でＰＣＲを行った。得られたＰＣＲ産物をＰＣＲ産物ｎｏ．７とした。

次に、ｐＳ３１０ＡＳＧＲ−Ｎｅｏを鋳型ＤＮＡとし、２１９８Ｆ（５’−ＧＣＣＴＴＧＣＧＣＡＴＧＧＧＴＣＣＣＣＴＣ−３’（配列番号３８））及び７６０１Ｒ（５’−ＡＣＴＡＡＣＧＧＴＧＧＡＣＣＡＡＧＡＧＴ−３’（配列番号３６））をプライマーとして、上記ＰＣＲ条件でＰＣＲを行った。得られたＰＣＲ産物をＰＣＲ産物ｎｏ．８とした。

それぞれのＰＣＲ産物を精製し、１５μＬのＨ_２Ｏに溶解した。ＰＣＲ産物ｎｏ．７とＰＣＲ産物ｎｏ．８のＤＮＡを１μＬずつ混合した。これを鋳型ＤＮＡとし、５２４０Ｆ（５’−ＴＧＧＧＧＣＣＧＴＣＣＡＡＡＡＴＧＡＡ−３’（配列番号３３））及び７６０１Ｒ（５’−ＡＣＴＡＡＣＧＧＴＧＧＡＣＣＡＡＧＡＧＴ−３’（配列番号３６））をプライマーとして、上記ＰＣＲ条件でＰＣＲを行った。得られたＰＣＲ産物をＰＣＲ産物ｎｏ．９とした。ＰＣＲ産物を精製し、３０μＬのＨ_２Ｏに溶解した。

ｐＳ３１０ＡＳＧＲ−Ｎｅｏ及び精製したＰＣＲ産物ｎｏ．９をそれぞれ、制限酵素ＸｈｏＩ及びＢａｍＨＩで消化し、各ＨＣＶ ｃＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動にて分画し、精製した。これら２つのＤＮＡ断片とＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（タカラバイオ社）を混合し、２つのＤＮＡ断片を連結した。こうして得られた組換え発現ベクター（アミノ酸置換Ｒ２１９８Ｈを引き起こす塩基置換を有する）をｐＳ３１０ＡＳＧＲ−Ｎｅｏ Ｒ２１９８Ｈと名付けた。なお、ｐＳ３１０ＡＳＧＲ−Ｎｅｏ Ｒ２１９８Ｈから合成されるＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡの配列を配列番号１８に示す。

Ｔ２４９６Ｉの導入のためには、まず、ｐＳ３１０ＡＳＧＲ−Ｎｅｏを鋳型ＤＮＡとし、７２７６Ｆ（５’−ＧＴＡＣＣＡＣＣＡＡＣＴＧＴＣＣＡＴＧＧＡ−３’（配列番号３））及び２４９６Ｒ（５’−ＴＴＡＡＡＧＣＡＡＴＴＴＴＧＴＡＧＴＧＧＴ−３’（配列番号４０））をプライマーとして、上記ＰＣＲ条件でＰＣＲを行った。得られたＰＣＲ産物をＰＣＲ産物ｎｏ．１０とした。

次に、ｐＳ３１０ＡＳＧＲ−Ｎｅｏを鋳型ＤＮＡとし、２４９６Ｆ（５’−ＡＣＣＡＣＴＡＣＡＡＡＡＴＴＧＣＴＴＴＡＡ−３’（配列番号４１））及び８５７９Ｒ（５’−ＣＣＧＣＡＧＡＣＡＡＧＡＡＡＧＴＣＣＧＧＧＴ−３’（配列番号４２））をプライマーとして、上記ＰＣＲ条件でＰＣＲを行った。得られたＰＣＲ産物をＰＣＲ産物ｎｏ．１１とした。

それぞれのＰＣＲ産物を精製し、１５μＬのＨ_２Ｏに溶解した。ＰＣＲ産物ｎｏ．１０とＰＣＲ産物ｎｏ．１１のＤＮＡを１μＬずつ混合した。これを鋳型ＤＮＡとし、７２７６Ｆ（５’−ＧＴＡＣＣＡＣＣＡＡＣＴＧＴＣＣＡＴＧＧＡ−３’（配列番号３９））及び８５７９Ｒ（５’−ＣＣＧＣＡＧＡＣＡＡＧＡＡＡＧＴＣＣＧＧＧＴ−３’（配列番号４２））をプライマーとして、上記ＰＣＲ条件でＰＣＲを行った。得られたＰＣＲ産物をＰＣＲ産物ｎｏ．１２とした。ＰＣＲ産物を精製し、３０μＬのＨ_２Ｏに溶解した。

ｐＳ３１０ＡＳＧＲ−Ｎｅｏ及び精製したＰＣＲ産物ｎｏ．１２をそれぞれ、制限酵素ＸｈｏＩ及びＥｃｏＲＶで消化し、各ＨＣＶ ｃＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動にて分画し、精製した。これら２つのＤＮＡ断片とＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（タカラバイオ社）を混合し、２つのＤＮＡ断片を連結した。こうして得られた組換え発現ベクター（アミノ酸置換Ｔ２４９６Ｉを引き起こす塩基置換を有する）をｐＳ３１０ＡＳＧＲ−Ｎｅｏ Ｔ２４９６Ｉと名付けた。なお、ｐＳ３１０ＡＳＧＲ−Ｎｅｏ Ｔ２４９６Ｉから合成されるＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡの配列を配列番号２２に示す。

Ｒ２８９５Ｇの導入のためには、まず、ｐＳ３１０ＡＳＧＲ−Ｎｅｏを鋳型ＤＮＡとし、７９８８Ｆ（５’−ＧＣＴＣＣＧＴＣＴＧＧＧＡＧＧＡＣＴＴＧＣ−３’（配列番号４３））及びＲ２８９５Ｇ−Ｒ（５’−ＡＴＧＧＡＧＴＣＣＴＴＣＡＡＴＧＡＴＴＧＣ−３’（配列番号４４））をプライマーとして、上記ＰＣＲ条件でＰＣＲを行った。得られたＰＣＲ産物をＰＣＲ産物ｎｏ．１３とした。

次に、ｐＳ３１０ＡＳＧＲ−Ｎｅｏを鋳型ＤＮＡとし、Ｒ２８９５Ｇ−Ｆ（５’−ＧＣＡＡＴＣＡＴＴＧＡＡＧＧＡＣＴＣＣＡＴ−３’（配列番号４５））及び３Ｘ−５４Ｒ−２ａ（５’−ＧＣＧＧＣＴＣＡＣＧＧＡＣＣＴＴＴＣＡＣ−３’（配列番号４６））をプライマーとして、上記ＰＣＲ条件でＰＣＲを行った。得られたＰＣＲ産物をＰＣＲ産物ｎｏ．１４とした。

それぞれのＰＣＲ産物を精製し、１５μＬのＨ_２Ｏに溶解した。ＰＣＲ産物ｎｏ．１３とＰＣＲ産物ｎｏ．１４のＤＮＡを１μＬずつ混合した。これを鋳型ＤＮＡとし、７９８８Ｆ（５’−ＧＣＴＣＣＧＴＣＴＧＧＧＡＧＧＡＣＴＴＧＣ−３’（配列番号４３））及び３Ｘ−５４Ｒ−２ａ（５’−ＧＣＧＧＣＴＣＡＣＧＧＡＣＣＴＴＴＣＡＣ−３’（配列番号４６））をプライマーとして、上記ＰＣＲ条件でＰＣＲを行った。得られたＰＣＲ産物をＰＣＲ産物ｎｏ．１５とした。ＰＣＲ産物を精製し、３０μＬのＨ_２Ｏに溶解した。

ｐＳ３１０ＡＳＧＲ−Ｎｅｏ及び精製したＰＣＲ産物ｎｏ．１５をそれぞれ、制限酵素ＥｃｏＲＶ及びＭｆｅＩで消化し、各ＨＣＶ ｃＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動にて分画し、精製した。これら２つのＤＮＡ断片とＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（タカラバイオ社）を混合し、２つのＤＮＡ断片を連結した。こうして得られた組換え発現ベクター（アミノ酸置換Ｒ２８９５Ｇを引き起こす塩基置換を有する）をｐＳ３１０ＡＳＧＲ−Ｎｅｏ Ｒ２８９５Ｇと名付けた。なお、ｐＳ３１０ＡＳＧＲ−Ｎｅｏ Ｒ２８９５Ｇから合成されるＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡの配列を配列番号２３に示す。

Ｒ２８９５Ｋの導入のためには、まず、ｐＳ３１０ＡＳＧＲ−Ｎｅｏを鋳型ＤＮＡとし、７９８８Ｆ（５’−ＧＣＴＣＣＧＴＣＴＧＧＧＡＧＧＡＣＴＴＧＣ−３’（配列番号４３））及びＲ２８９５Ｋ−Ｒ（５’−ＡＴＧＧＡＧＴＴＴＴＴＣＡＡＴＧＡＴＴＧＣ−３’（配列番号４７））をプライマーとして、上記ＰＣＲ条件でＰＣＲを行った。得られたＰＣＲ産物をＰＣＲ産物ｎｏ．１６とした。

次に、ｐＳ３１０ＡＳＧＲ−Ｎｅｏを鋳型ＤＮＡとし、Ｒ２８９５Ｋ−Ｆ（５’−ＧＣＡＡＴＣＡＴＴＧＡＡＡＡＡＣＴＣＣＡＴ−３’（配列番号４８））及び３Ｘ−５４Ｒ−２ａ（５’−ＧＣＧＧＣＴＣＡＣＧＧＡＣＣＴＴＴＣＡＣ−３’（配列番号４６））をプライマーとして、上記ＰＣＲ条件でＰＣＲを行った。得られたＰＣＲ産物をＰＣＲ産物ｎｏ．１７とした。

それぞれのＰＣＲ産物を精製し、１５μＬのＨ_２Ｏに溶解した。ＰＣＲ産物ｎｏ．１６とＰＣＲ産物ｎｏ．１７のＤＮＡを１μＬずつ混合した。これを鋳型ＤＮＡとし、７９８８Ｆ（５’−ＧＣＴＣＣＧＴＣＴＧＧＧＡＧＧＡＣＴＴＧＣ−３’（配列番号４３））及び３Ｘ−５４Ｒ−２ａ（５’−ＧＣＧＧＣＴＣＡＣＧＧＡＣＣＴＴＴＣＡＣ−３’（配列番号４６））をプライマーとして、上記ＰＣＲ条件でＰＣＲを行った。得られたＰＣＲ産物をＰＣＲ産物ｎｏ．１８とした。ＰＣＲ産物を精製し、３０μＬのＨ_２Ｏに溶解した。

ｐＳ３１０ＡＳＧＲ−Ｎｅｏ及び精製したＰＣＲ産物ｎｏ．１８をそれぞれ、制限酵素ＥｃｏＲＶ及びＭｆｅＩで消化し、各ＨＣＶ ｃＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動にて分画し、精製した。これら２つのＤＮＡ断片とＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（タカラバイオ社）を混合し、２つのＤＮＡ断片を連結した。こうして得られた組換え発現ベクター（アミノ酸置換Ｒ２８９５Ｋを引き起こす塩基置換を有する）をｐＳ３１０ＡＳＧＲ−Ｎｅｏ Ｒ２８９５Ｋと名付けた。なお、ｐＳ３１０ＡＳＧＲ−Ｎｅｏ Ｒ２８９５Ｋから合成されるＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡの配列を配列番号１９に示す。

また、ＮＳ５Ｂタンパク質領域に２つのアミノ酸置換（Ｔ２４９６Ｉ及びＲ２８９５Ｋ）を導入した。具体的には、上記のｐＳ３１０ＡＳＧＲ−Ｎｅｏ Ｔ２４９６Ｉ及び精製したＰＣＲ産物ｎｏ．１８をそれぞれ、制限酵素ＥｃｏＲＶ及びＭｆｅＩで消化し、各ＨＣＶ ｃＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動にて分画し、精製した。これら２つのＤＮＡ断片とＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（タカラバイオ社）を混合し、２つのＤＮＡ断片を連結した。こうして得られた組換え発現ベクター（アミノ酸置換Ｔ２４９６Ｉ及びＲ２８９５Ｋを引き起こす塩基置換を有する）をｐＳ３１０ＡＳＧＲ−Ｎｅｏ Ｔ２４９６Ｉ／Ｒ２８９５Ｋと名付けた。なお、ｐＳ３１０ＡＳＧＲ−Ｎｅｏ Ｔ２４９６Ｉ／Ｒ２８９５Ｋから合成されるＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡの配列を配列番号２０に示す。

Ｓ２２１０Ｉの導入のためには、ｐＳ３１０ＡＳＧＲ−Ｎｅｏを鋳型ＤＮＡとし、５２４０Ｆ（５’−ＴＧＧＧＧＣＣＧＴＣＣＡＡＡＡＴＧＡＡ−３’（配列番号３３））及び２２１０Ｒ（５’−ＣＧＡＣＡＧＴＴＧＧＡＴＧＧＣＧＧＡＴＧＡ−３’（配列番号５２））をプライマーとして、上記ＰＣＲ条件でＰＣＲを行った。得られたＰＣＲ産物をＰＣＲ産物ｎｏ．１９とした。

次に、ｐＳ３１０ＡＳＧＲ−Ｎｅｏを鋳型ＤＮＡとし、２２１０Ｆ（５’−ＴＣＡＴＣＣＧＣＣＡＴＣＣＡＡＣＴＧＴＣＧ−３’（配列番号５３））及び７６０１Ｒ（５’−ＡＣＴＡＡＣＧＧＴＧＧＡＣＣＡＡＧＡＧＴ−３’（配列番号３６））をプライマーとして、上記ＰＣＲ条件でＰＣＲを行った。得られたＰＣＲ産物をＰＣＲ産物ｎｏ．２０とした。

それぞれのＰＣＲ産物を精製し、１５μＬのＨ_２Ｏに溶解した。ＰＣＲ産物ｎｏ．１９とＰＣＲ産物ｎｏ．２０のＤＮＡを１μＬずつ混合した。これを鋳型ＤＮＡとし、５２４０Ｆ（５’−ＴＧＧＧＧＣＣＧＴＣＣＡＡＡＡＴＧＡＡ−３’（配列番号３３））及び７６０１Ｒ（５’−ＡＣＴＡＡＣＧＧＴＧＧＡＣＣＡＡＧＡＧＴ−３’（配列番号３６））をプライマーとして、上記ＰＣＲ条件でＰＣＲを行った。得られたＰＣＲ産物をＰＣＲ産物ｎｏ．２１とした。ＰＣＲ産物を精製し、３０μＬのＨ_２Ｏに溶解した。

ｐＳ３１０ＡＳＧＲ−Ｎｅｏ及び精製したＰＣＲ産物ｎｏ．２１をそれぞれ、制限酵素ＸｈｏＩ及びＢａｍＨＩで消化し、各ＨＣＶ ｃＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動にて分画し、精製した。これら２つのＤＮＡ断片とＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（タカラバイオ社）を混合し、２つのＤＮＡ断片を連結した。こうして得られた組換え発現ベクター（アミノ酸置換Ｓ２２１０Ｉを引き起こす塩基置換を有する）をｐＳ３１０ＡＳＧＲ−Ｎｅｏ Ｓ２２１０Ｉと名付けた。なお、ｐＳ３１０ＡＳＧＲ−Ｎｅｏ Ｓ２２１０Ｉから合成されるＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡの配列を配列番号５４に示す。

次いで、実施例２と同様の方法で、発現ベクターｐＳ３１０ＡＳＧＲ−Ｎｅｏ、ｐＳ３１０ＡＳＧＲ−Ｎｅｏ Ｔ１２８６Ｉ、ｐＳ３１０ＡＳＧＲ−Ｎｅｏ Ｔ２１８８Ａ、ｐＳ３１０ＡＳＧＲ−Ｎｅｏ Ｒ２１９８Ｈ、ｐＳ３１０ＡＳＧＲ−Ｎｅｏ Ｓ２２１０Ｉ、ｐＳ３１０ＡＳＧＲ−Ｎｅｏ Ｔ２４９６Ｉ、ｐＳ３１０ＡＳＧＲ−Ｎｅｏ Ｒ２８９５Ｇ、ｐＳ３１０ＡＳＧＲ−Ｎｅｏ Ｒ２８９５Ｋ、及びｐＳ３１０ＡＳＧＲ−Ｎｅｏ Ｔ２４９６Ｉ／Ｒ２８９５Ｋから、Ａｍｂｉｏｎ社のＭＥＧＡｓｃｒｉｐｔ（商標登録）を用いて、ＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡを合成した。作製したＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡについて、各サブゲノムレプリコンＲＮＡ ０．３μｇをエレクトロポレーション法によりＨｕｈ７細胞に導入した。ただし、野生型Ｓ３１０Ａ株のＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡ（ｐＳ３１０ＡＳＧＲ−Ｎｅｏより発現）とＴ２４９６Ｉ変異体ＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡ（ｐＳ３１０ＡＳＧＲ−Ｎｅｏ Ｔ２４９６Ｉより発現）については１０μｇを導入した。エレクトロポレーション処理を行ったＨｕｈ７細胞を培養ディッシュに播種し、１６時間〜２４時間培養した後に、培養ディッシュにＧ４１８（ネオマイシン）を添加した。その後、週に２回培養液を交換しながら培養を継続した。播種時から２１日間培養した後、クリスタルバイオレットで生存細胞を染色した。

その結果を図１１に示す。図中、「野生型」はｐＳ３１０ＡＳＧＲ−Ｎｅｏ、「Ｔ１２８６Ｉ」はｐＳ３１０ＡＳＧＲ−Ｎｅｏ Ｔ１２８６Ｉ、「Ｔ２１８８Ａ」はｐＳ３１０ＡＳＧＲ−Ｎｅｏ Ｔ２１８８Ａ、「Ｒ２１９８Ｈ」はｐＳ３１０ＡＳＧＲ−Ｎｅｏ Ｒ２１９８Ｈ、「Ｓ２２１０Ｉ」はｐＳ３１０ＡＳＧＲ−Ｎｅｏ Ｓ２２１０Ｉ、「Ｔ２４９６Ｉ」はｐＳ３１０ＡＳＧＲ−Ｎｅｏ Ｔ２４９６Ｉ、「Ｒ２８９５Ｇ」はｐＳ３１０ＡＳＧＲ−Ｎｅｏ Ｒ２８９５Ｇ、「Ｒ２８９５Ｋ」はｐＳ３１０ＡＳＧＲ−Ｎｅｏ Ｒ２８９５Ｋ、「Ｔ２４９６Ｉ／Ｒ２８９５Ｋ」はｐＳ３１０ＡＳＧＲ−Ｎｅｏ Ｔ２４９６Ｉ／Ｒ２８９５Ｋ、からそれぞれ作製したＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡを導入した細胞の染色結果を示す。

その結果、いずれのＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡを導入した細胞についても、コロニー形成が確認できたが、「Ｔ２４９６Ｉ」はコロニー形成能が低く、野生型と同様に１０μｇのＲＮＡを導入することでコロニーを形成した。コロニー形成能が確認されたクローンのうち、「Ｔ１２８６Ｉ」、「Ｒ２１９８Ｈ」、「Ｒ２８９５Ｋ」及び「Ｔ２４９６Ｉ／Ｒ２８９５Ｋ」については、コロニー形成能が特に高く検出された。また、「Ｔ２４９６Ｉ」は野生型と同程度のコロニー形成能であり、また、「Ｒ２８９５Ｋ」と「Ｔ２４９６Ｉ／Ｒ２８９５Ｋ」のコロニー形成能の間に差は見られないことから、アミノ酸置換Ｔ２４９６Ｉは、サブゲノムレプリコンＲＮＡの複製能に影響を与えないと考えられる（図１１）。

よって、野生型Ｓ３１０Ａ株のＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡに、上記アミノ酸置換（変異）を導入すると自律複製能は維持されるか又は高まることが示された。特に、アミノ酸置換Ｔ１２８６Ｉ、Ｒ２１９８Ｈ又はＲ２８９５Ｋのアミノ酸置換を導入することにより、野生型Ｓ３１０Ａ株のＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡの自律複製能が顕著に高まることが示された。

（実施例８）ルシフェラーゼ遺伝子を用いた変異体Ｓ３１０Ａ株のＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡ複製効率の評価
実施例７、図１１に示したレプリコン複製細胞の検出では、細胞が生存できる最低限のネオマイシン耐性を付与できるだけのレプリコン複製能があれば検出される。したがって、実施例７で用いた方法はレプリコン複製量の解析には不向きである。そこで、変異体Ｓ３１０Ａ株のＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡの複製効率をより定量的に評価するために、ｐＳ３１０ＡＳＧＲ−Ｎｅｏ中のネオマイシン耐性遺伝子をルシフェラーゼ遺伝子に組み換えた、ＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡ発現ベクターｐＳ３１０ＡＳＧＲ−Ｌｕｃを作製した。ＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡ発現ベクターｐＳ３１０ＡＳＧＲ−Ｌｕｃ及び、ｐＳ３１０ＡＳＧＲ−Ｌｕｃから合成されるＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡの構造を図１２に示す。

発現ベクターｐＳ３１０ＡＳＧＲ−Ｌｕｃの構築は、Ｋａｔｏらの文献（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、２００５年、第４３巻、ｐ．５６７９−５６８４）に示された手順に基づいて行った。具体的には、ＨＣＶサブゲノムレプリコン発現ベクターｐＳ３１０ＡＳＧＲ−Ｎｅｏのネオマイシン耐性遺伝子（ｎｅｏ）をホタルルシフェラーゼ遺伝子（Ｌｕｃ）に置換することにより、発現ベクターｐ３１０ＡＳＧＲ−Ｌｕｃを作製した（図１２）。

さらに、上記のアミノ酸変異を含むＳ３１０Ａ株のＨＣＶサブゲノムレプリコン発現ベクターについても同様に、ネオマイシン耐性遺伝子（ｎｅｏ）をホタルルシフェラーゼ遺伝子（Ｌｕｃ）に置換して、ｐ３１０ＡＳＧＲ−Ｌｕｃの変異体を作製した。ｐ３１０ＡＳＧＲ−Ｌｕｃの変異体は、それぞれ、Ｔ１２８６Ｉ変異体はｐ３１０ＡＳＧＲ−Ｌｕｃ Ｔ１２８６Ｉ、Ｔ２１８８Ａ変異体はｐ３１０ＡＳＧＲ−Ｌｕｃ Ｔ２１８８Ａ、Ｒ２１９８Ｈ変異体はｐ３１０ＡＳＧＲ−Ｌｕｃ Ｒ２１９８Ｈ、Ｓ２２１０Ｉ変異体はｐＳ３１０ＡＳＧＲ−Ｌｕｃ Ｓ２２１０Ｉ、Ｔ２４９６Ｉ変異体はｐ３１０ＡＳＧＲ−Ｌｕｃ Ｔ２４９６Ｉ、Ｒ２８９５Ｇ変異体はｐ３１０ＡＳＧＲ−Ｌｕｃ Ｒ２８９５Ｇ、Ｒ２８９５Ｋ変異体はｐ３１０ＡＳＧＲ−Ｌｕｃ Ｒ２８９５Ｋ、Ｔ２４９６Ｉ／Ｒ２８９５Ｋ変異体はｐ３１０ＡＳＧＲ−Ｌｕｃ Ｔ２４９６Ｉ／Ｒ２８９５Ｋと名付けた。

実施例２と同様の手法を用いて野生型及び変異体のｐ３１０ＡＳＧＲ−ＬｕｃからＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡを作製し、そのＲＮＡ ５μｇを２×１０^６のＨｕｈ７細胞にエレクトロポレーション法により導入し、１２ウェルプレートに播種した。播種した細胞は２４時間後及び７２時間後に回収し、そのルシフェラーゼ活性をＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ ａｓｓａｙ ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を用いて検出した。

結果を図１３に示す。図中、「野生型」はｐＳ３１０ＡＳＧＲ−Ｌｕｃ、「Ｔ１２８６Ｉ」はｐＳ３１０ＡＳＧＲ−Ｌｕｃ Ｔ１２８６Ｉ、「Ｔ２１８８Ａ」はｐＳ３１０ＡＳＧＲ−Ｌｕｃ Ｔ２１８８Ａ、「Ｒ２１９８Ｈ」はｐＳ３１０ＡＳＧＲ−Ｌｕｃ Ｒ２１９８Ｈ、「Ｓ２２１０Ｉ」はｐＳ３１０ＡＳＧＲ−Ｌｕｃ Ｓ２２１０Ｉ、「Ｔ２４９６Ｉ」はｐＳ３１０ＡＳＧＲ−Ｌｕｃ Ｔ２４９６Ｉ、「Ｒ２８９５Ｇ」はｐＳ３１０ＡＳＧＲ−Ｌｕｃ Ｒ２８９５Ｇ、「Ｒ２８９５Ｋ」はｐＳ３１０ＡＳＧＲ−Ｌｕｃ Ｒ２８９５Ｋ、「Ｔ２４９６Ｉ／Ｒ２８９５Ｋ」はｐＳ３１０ＡＳＧＲ−Ｌｕｃ Ｔ２４９６Ｉ／Ｒ２８９５Ｋからそれぞれ作製したＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡを導入した細胞における結果を示す。

また、ＪＦＨ−１株のＮＳ５Ｂポリメラーゼ中の２７６０番目のアミノ酸残基であるアスパラギン酸（Ｄ）がアスパラギン（Ｎ）に置換されたサブゲノムレプリコンＲＮＡ（ＪＦＨ１／ＧＮＤ）をネガティブコントロールとして用いた（Ｋａｔｏら、Ｊ．Ｃｌｉｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ２００５年、第４３巻、ｐ．５６７９−５６８４）。このサブゲノムレプリコンＲＮＡ（ＪＦＨ１／ＧＮＤ）は、ＮＳ５Ｂポリメラーゼの変異により、導入後７２時間では複製能を示さない。図の縦軸は、ルシフェラーゼの相対発光強度を示し、発光強度が高いほど複製能が高いことを示す。７２時間後のルシフェラーゼ遺伝子の発現がＪＦＨ１／ＧＮＤより高い値を示す場合、持続的に遺伝子増幅をしている（自律複製能を持つ）ことを示す。

その結果、「Ｒ２１９８Ｈ」、「Ｓ２２１０Ｉ」、「Ｒ２８９５Ｇ」、「Ｒ２８９５Ｋ」、及び「Ｔ２４９６Ｉ／Ｒ２８９５Ｋ」は、７２時間後のルシフェラーゼ遺伝子の発現がＪＦＨ１／ＧＮＤと比較して高値であることが示された。このことから、Ｒ２１９８Ｈ、Ｓ２２１０Ｉ、Ｒ２８９５Ｇ、Ｒ２８９５Ｋ、又はＴ２４９６Ｉ／Ｒ２８９５Ｋのアミノ酸置換を含むＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡは持続的に遺伝子増幅をしていることが示された。

（実施例９）変異体Ｓ３１０Ａ株のＨＣＶフルゲノムレプリコンＲＮＡ（全長ゲノムＲＮＡ）発現ベクターの構築
実施例６で見出された各アミノ酸置換を有するＳ３１０Ａ株のＨＣＶフルゲノムレプリコンＲＮＡの、培養細胞におけるＨＣＶ粒子産生能を評価するため、全長ＨＣＶゲノム配列を有するＨＣＶフルゲノムレプリコンＲＮＡ発現ベクターの構築を行った。

実施例１で作製した発現ベクターｐＳ３１０Ａ（野生型Ｓ３１０Ａ株の全長ゲノムＲＮＡのｃＤＮＡをｐＵＣ１９中のＴ７プロモーターの制御下に挿入した組換えプラスミド）と実施例７で作製した各ｐＳ３１０ＡＳＧＲ−Ｎｅｏ変異体を用いて、ＨＣＶフルゲノムレプリコンＲＮＡ発現ベクターを作製した。

具体的には、実施例１で作製したｐＳ３１０Ａ及び実施例７で作製したｐＳ３１０ＳＧＲ−Ｎｅｏ Ｔ１２８６Ｉを、制限酵素ＳｎａＢＩとＢａｍＨＩで消化した。各ＨＣＶ ｃＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動にて分画し精製した。ｐＳ３１０ＡのＤＮＡ断片と各ｐＳ３１０ＡＳＧＲ−Ｎｅｏ変異体のＤＮＡ断片にＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（タカラバイオ社）を加え混合し、２つのＤＮＡ断片を連結した。こうして得られたアミノ酸置換を有するＨＣＶフルゲノムレプリコンＲＮＡ発現ベクターを、ｐＳ３１０Ａ Ｔ１２８６Ｉと名付けた。

同様に、実施例７で作製したその他の各ｐＳ３１０ＡＳＧＲ−Ｎｅｏ変異体（ｐＳ３１０ＡＳＧＲ−Ｎｅｏ Ｔ２１８８Ａ、ｐＳ３１０ＡＳＧＲ−Ｎｅｏ Ｒ２１９８Ｈ、ｐＳ３１０ＡＳＧＲ−Ｌｕｃ Ｓ２２１０Ｉ、ｐＳ３１０ＡＳＧＲ−Ｎｅｏ Ｔ２４９６Ｉ、ｐＳ３１０ＡＳＧＲ−Ｎｅｏ Ｒ２８９５Ｇ、及びｐＳ３１０ＡＳＧＲ−Ｎｅｏ Ｒ２８９５Ｋ）を、各々適切な制限酵素（ｐＳ３１０ＡＳＧＲ−Ｎｅｏ Ｔ１２８６ＩはＳｎａＢＩとＢａｍＨＩ、ｐＳ３１０ＡＳＧＲ−Ｎｅｏ Ｔ２１８８Ａ及びｐＳ３１０ＡＳＧＲ−Ｎｅｏ Ｒ２１９８ＨはＢａｍＨＩとＸｈｏＩ、ｐＳ３１０ＡＳＧＲ−Ｎｅｏ Ｔ２４９６ＩはＳａｃＩＩ、ｐＳ３１０ＡＳＧＲ−Ｎｅｏ Ｒ２８９５Ｇ及びｐＳ３１０ＡＳＧＲ−Ｎｅｏ Ｒ２８９５ＫはＳｃａＩ）で消化し、また、ｐＳ３１０Ａを、組換え対象となる各ｐＳ３１０ＡＳＧＲ−Ｎｅｏ変異体を消化したのと同じ制限酵素で消化した。同じ制限酵素で消化した各ｐＳ３１０ＡＳＧＲ−Ｎｅｏ変異体とｐＳ３１０ＡのＤＮＡ断片を上記と同じ方法で連結した。こうして得られたアミノ酸置換を有するＨＣＶフルゲノムレプリコンＲＮＡの発現ベクターを、それぞれｐＳ３１０Ａ Ｔ２１８８Ａ、ｐＳ３１０Ａ Ｒ２１９８Ｈ、ｐＳ３１０Ａ Ｓ２２１０Ｉ、ｐＳ３１０Ａ Ｔ２４９６Ｉ、ｐＳ３１０Ａ Ｒ２８９５Ｇ、及びｐＳ３１０Ａ Ｒ２８９５Ｋと名付けた。

（実施例１０）変異体Ｓ３１０Ａ株のＨＣＶフルゲノムレプリコンＲＮＡ導入細胞におけるＨＣＶ粒子産生能の評価
実施例１で作製したｐＳ３１０Ａ及び実施例９で作製した各発現ベクターを、制限酵素ＸｂａＩで切断し、フェノール／クロロホルム抽出、エタノール沈殿を行った。次いで、ＸｂａＩ切断断片を、Ｍｕｎｇ Ｂｅａｎ Ｎｕｃｌｅａｓｅ処理し、ＸｂａＩ切断断片からＸｂａＩ認識配列由来の余分な３’末端のＣＴＡＧの４塩基を除去した。次いで、ＸｂａＩ切断断片を含むＭｕｎｇ Ｂｅａｎ Ｎｕｃｌｅａｓｅ処理後溶液について、ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅＫ処理、フェノール／クロロホルム抽出、エタノール沈殿を行ってＤＮＡ断片を精製した。これを鋳型ＤＮＡとして、ＭＥＧＡｓｃｒｉｐｔ（登録商標） Ｔ７ ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ社）を用いてＲＮＡの合成を行った。

ＲＮＡ合成終了後、反応溶液にＤＮａｓｅ（２Ｕ）を添加して３７℃で１５分間反応させることにより鋳型ＤＮＡを除去し、さらに酸性フェノールによるＲＮＡ抽出を行うことにより、野生型及び変異体のＳ３１０Ａ株ＨＣＶフルゲノムレプリコンＲＮＡを取得した。

ここで得られた野生型及び変異体のＳ３１０Ａ株ＨＣＶフルゲノムレプリコンＲＮＡは、それぞれ、野生型及び変異体のＳ３１０Ａ株の全長ゲノムＲＮＡと同じ塩基配列を有する。なお、野生型のＳ３１０Ａ株のＨＣＶフルゲノムレプリコンＲＮＡ（野生型のＳ３１０Ａ株全長ゲノムＲＮＡ）を「Ｓ３１０Ａ」、Ｔ１２８６Ｉ、Ｔ２１８８Ａ、Ｔ２１９８Ｈ、Ｓ２２１０Ｉ、Ｔ２４９６Ｉ、Ｒ２８９５Ｇ又はＲ２８９５Ｋのアミノ酸置換（変異）がそれぞれ導入されたＳ３１０株のＨＣＶフルゲノムレプリコンＲＮＡ（Ｓ３１０Ａ株の全長ゲノムＲＮＡ変異体）を、本実施例では、それぞれ、「Ｓ３１０Ａ Ｔ１２８６Ｉ」、「Ｓ３１０Ａ Ｔ２１８８Ａ」、「Ｓ３１０Ａ Ｒ２１９８Ｈ」、「Ｓ３１０Ａ Ｓ２２１０Ｉ」、「Ｓ３１０Ａ Ｔ２４９６Ｉ」、「Ｓ３１０Ａ Ｒ２８９５Ｇ」及び「Ｓ３１０Ａ Ｒ２８９５Ｋ」と呼ぶ。これらＳ３１０Ａ株のＨＣＶフルゲノムレプリコンＲＮＡ（ＨＣＶ全長ゲノム）の構造を図１４に示す。

得られた野生型及び変異体Ｓ３１０ＡのＨＣＶフルゲノムレプリコンＲＮＡ（１０μｇ）を、エレクトロポレーション法によりＨｕｈ７細胞に導入（トランスフェクト）した。このエレクトロポレーション処理後のＨｕｈ７細胞を培養ディッシュに播種し、１６時間〜２４時間培養した後に、培養ディッシュにＧ４１８（ネオマイシン）を添加した。その後、週に２回継代しながら培養を継続した。経時的に、培養上清中に含まれるＨＣＶのＣｏｒｅタンパク質を、ＨＣＶ抗原ＥＬＩＳＡテストキット（オーソ社）を用いて定量することにより、ＨＣＶ粒子産生の確認を行った。

結果を図１５に示す。グラフの横軸は野生型及び変異体Ｓ３１０Ａ株のＨＣＶフルゲノムレプリコンＲＮＡ（全長ＲＮＡ）を細胞に導入した後の細胞培養時間であり、縦軸は細胞培養上清中のＨＣＶコアタンパク質濃度を表す。「Ｔ１２８６Ｉ」はＳ３１０Ａ Ｔ１２８６Ｉ、「Ｔ２１８８Ａ」はＳ３１０Ａ Ｔ２１８８Ａ、「Ｒ２１９８Ｈ」はＳ３１０Ａ Ｒ２１９８Ｈ、「Ｓ２２１０Ｉ」はＳ３１０Ａ Ｓ２２１０Ｉ、「Ｔ２４９６Ｉ」はＳ３１０Ａ Ｔ２４９６Ｉ、「Ｒ２８９５Ｋ」はＳ３１０Ａ Ｒ２８９５Ｋ、「Ｒ２８９５Ｇ」はＳ３１０Ａ Ｒ２８９５ＧのＨＣＶフルゲノムレプリコンＲＮＡ（全長ＲＮＡ）を導入した細胞を表す。

ＨＣＶフルゲノムレプリコンＲＮＡ（全長ＲＮＡ）導入の９６時間後、「Ｓ２２１０Ｉ」、「Ｒ２１９８Ｈ」及び「Ｒ２８９５Ｋ」導入細胞において、細胞培養上清中のＨＣＶコアタンパク質濃度が上昇している事が確認された。この３つの変異体Ｓ３１０Ａ株のＨＣＶフルゲノムレプリコンＲＮＡのうち、「Ｓ２２１０Ｉ」導入細胞が、最も培養上清中のＨＣＶコアタンパク質濃度が高く、Ｓ２２１０Ｉの変異は、最もＨＣＶ粒子形成能が高い変異であることが示された。「Ｒ２１９８Ｈ」導入細胞も、他と比べて明らかな培養上清中のＨＣＶコアタンパク質濃度の上昇が認められた。「Ｒ２８９５Ｋ」導入細胞の培養上清中のＨＣＶコアタンパク質濃度は、「Ｓ２２１０Ｉ」や「Ｒ２１９８Ｈ」に比べて低いものの、経時的な上昇が認められた。

また、これら３つの変異体Ｓ３１０Ａ株のＨＣＶフルゲノムレプリコンＲＮＡ「Ｓ２２１０Ｉ」、「Ｒ２１９８Ｈ」又は「Ｒ２８９５Ｋ」の、遺伝子導入９６時間後の細胞培養上清を別のＨｕｈ７細胞に添加すると、Ｈｕｈ７細胞からＨＣＶコアタンパク質が検出された。したがって、変異体Ｓ３１０Ａ株のＨＣＶフルゲノムレプリコンＲＮＡ「Ｓ２２１０Ｉ」、「Ｒ２１９８Ｈ」又は「Ｒ２８９５Ｋ」を導入した細胞の培養上清中に感染性ＨＣＶ粒子が分泌されていることを確認できた。

この結果から、Ｓ２２１０Ｉ（配列番号４９）、Ｒ２１９８Ｈ（配列番号５０）又はＲ２８９５Ｋ（配列番号５１）の変異を導入した変異体Ｓ３１０Ａ株のＨＣＶフルゲノムレプリコンＲＮＡ（全長ＲＮＡ）を導入した細胞から、感染性ＨＣＶ粒子が産生されることが示された。

培養細胞において増幅が可能な、遺伝子型３ａのＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡ、遺伝子型３ａの感染性ＨＣＶ粒子を産生するＨＣＶフルゲノムレプリコンＲＮＡを提供でき、遺伝子型に依存しない抗ＨＣＶ薬、特に、効果的な治療薬のない遺伝子型３ａに対する抗ＨＣＶ薬のスクリーニングや、ＨＣＶの複製機構又は複製効率を解明するための研究、さらにはＨＣＶ粒子を用いたＨＣＶワクチンの開発などに利用できる。

本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願はその全体を参照により本明細書にとり入れるものとする。

配列番号１：野生型Ｓ３１０Ａ株の全長ゲノムＲＮＡのｃＤＮＡ配列。１〜３４０位は５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）、また３４１〜９１３位はＣｏｒｅタンパク質、９１４〜１４８９位はＥ１タンパク質、１４９０〜２５９６位はＥ２タンパク質、２５９７〜２７８５位はｐ７タンパク質、２７８６〜３４３６位はＮＳ２タンパク質、３４３７〜５３２９位はＮＳ３タンパク質、５３３０〜５４９１位はＮＳ４Ａタンパク質、５４９２〜６２７４位はＮＳ４Ｂタンパク質、６２７５〜７６３０位はＮＳ５Ａタンパク質、７６３１〜９４０６位はＮＳ５Ｂタンパク質をコードする配列、そして９４０７〜９６５５位は３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）である。

配列番号２：野生型Ｓ３１０Ａ株ゲノムＲＮＡの５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）のｃＤＮＡ配列
配列番号３：野生型Ｓ３１０Ａ株ゲノムＲＮＡのＣｏｒｅタンパク質コード配列のｃＤＮＡ配列
配列番号４：野生型Ｓ３１０Ａ株ゲノムＲＮＡのＥ１タンパク質コード配列のｃＤＮＡ配列
配列番号５：野生型Ｓ３１０Ａ株ゲノムＲＮＡのＥ２タンパク質コード配列のｃＤＮＡ配列
配列番号６：野生型Ｓ３１０Ａ株ゲノムＲＮＡのｐ７タンパク質コード配列のｃＤＮＡ配列
配列番号７：野生型Ｓ３１０Ａ株ゲノムＲＮＡのＮＳ２タンパク質コード配列のｃＤＮＡ配列
配列番号８：野生型Ｓ３１０Ａ株ゲノムＲＮＡのＮＳ３タンパク質コード配列のｃＤＮＡ配列
配列番号９：野生型Ｓ３１０Ａ株ゲノムＲＮＡのＮＳ４Ａタンパク質コード配列のｃＤＮＡ配列
配列番号１０：野生型Ｓ３１０Ａ株ゲノムＲＮＡのＮＳ４Ｂタンパク質コード配列のｃＤＮＡ配列
配列番号１１：野生型Ｓ３１０Ａ株ゲノムＲＮＡのＮＳ５Ａタンパク質コード配列のｃＤＮＡ配列
配列番号１２：野生型Ｓ３１０Ａ株ゲノムＲＮＡのＮＳ５Ｂタンパク質コード配列のｃＤＮＡ配列
配列番号１３：野生型Ｓ３１０Ａ株ゲノムＲＮＡの３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）のｃＤＮＡ配列
配列番号１４：野生型Ｓ３１０Ａ株の前駆体タンパク質のアミノ酸配列。１〜１９１位はＣｏｒｅタンパク質、１９２〜３８３位はＥ１タンパク質、３８４〜７５２位はＥ２タンパク質、７５３〜８１５位はｐ７タンパク質、８１６〜１０３２位はＮＳ２タンパク質、１０３３〜１６６３位はＮＳ３タンパク質、１６６４〜１７１７位はＮＳ４Ａタンパク質、１７１８〜１９７８位はＮＳ４Ｂタンパク質、１９７９〜２４３０位はＮＳ５Ａタンパク質、２４３１〜３０２１位はＮＳ５Ｂタンパク質のアミノ酸配列である。

配列番号１５：野生型Ｓ３１０Ａ株の前駆体タンパク質中のＮＳ３タンパク質からＮＳ５Ｂタンパク質までの領域のアミノ酸配列
配列番号１６：野生型Ｓ３１０Ａ株のＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡのｃＤＮＡ配列
配列番号１７：ｐＳ３１０ＡＳＧＲ−Ｎｅｏ Ｔ１２８６Ｉから合成される、変異体Ｓ３１０Ａ Ｔ１２８６Ｉ ＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡのｃＤＮＡ配列
配列番号１８：ｐＳ３１０ＡＳＧＲ−Ｎｅｏ Ｒ２１９８Ｈから合成される、変異体Ｓ３１０Ａ Ｒ２１９８Ｈ ＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡのｃＤＮＡ配列
配列番号１９：ｐＳ３１０ＡＳＧＲ−Ｎｅｏ Ｒ２８９５Ｋから合成される、変異体Ｓ３１０Ａ Ｒ２８９５Ｋ ＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡのｃＤＮＡ配列
配列番号２０：ｐＳ３１０ＡＳＧＲ−Ｎｅｏ Ｔ２４９６Ｉ／Ｒ２８９５Ｋから合成される、変異体Ｓ３１０Ａ Ｔ２４９６Ｉ／Ｒ２８９５Ｋ ＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡのｃＤＮＡ配列
配列番号２１：ｐＳ３１０ＡＳＧＲ−Ｎｅｏ Ｔ２１８８Ａから合成される、変異体Ｓ３１０Ａ Ｔ２１８８Ａ ＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡのｃＤＮＡ配列
配列番号２２：ｐＳ３１０ＡＳＧＲ−Ｎｅｏ Ｔ２４９６Ｉから合成される、変異体Ｓ３１０Ａ Ｔ２４９６Ｉ ＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡのｃＤＮＡ配列
配列番号２３：ｐＳ３１０ＡＳＧＲ−Ｎｅｏ Ｒ２８９５Ｇから合成される、変異体Ｓ３１０Ａ Ｒ２８９５Ｇ ＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡのｃＤＮＡ配列
配列番号２４：ＴａｑＭａｎプローブ法プライマー
配列番号２５：ＴａｑＭａｎプローブ法プライマー
配列番号２６：ＴａｑＭａｎプローブ法プローブ
配列番号２７：プライマー
配列番号２８：プライマー
配列番号２９：プライマー Ｎｅｏ−Ｓ４
配列番号３０：プライマー １２８６Ｒ
配列番号３１：プライマー １２８６F
配列番号３２：プライマー ５５４６Ｒ
配列番号３３：プライマー ５２４０Ｆ
配列番号３４：プライマー ２１８８Ｒ
配列番号３５：プライマー ２１８８Ｆ
配列番号３６：プライマー ７６０１Ｒ
配列番号３７：プライマー ２１９８Ｒ
配列番号３８：プライマー ２１９８Ｆ
配列番号３９：プライマー ７２７６Ｆ
配列番号４０：プライマー ２４９６Ｒ
配列番号４１：プライマー ２４９６Ｆ
配列番号４２：プライマー ８５７９Ｒ
配列番号４３：プライマー ７９８８Ｆ
配列番号４４：プライマー Ｒ２８９５Ｇ−Ｒ
配列番号４５：プライマー Ｒ２８９５Ｇ−Ｆ
配列番号４６：プライマー ３Ｘ−５４Ｒ−２ａ
配列番号４７：プライマー Ｒ２８９５Ｋ−Ｒ
配列番号４８：プライマー Ｒ２８９５Ｋ−Ｆ
配列番号４９：変異体Ｓ３１０Ａ Ｓ２２１０Ｉ ＨＣＶフルゲノムレプリコンＲＮＡのｃＤＮＡ配列
配列番号５０：変異体Ｓ３１０Ａ Ｒ２１９８Ｈ ＨＣＶフルゲノムレプリコンＲＮＡのｃＤＮＡ配列
配列番号５１：変異体Ｓ３１０Ａ Ｒ２８９５Ｋ ＨＣＶフルゲノムレプリコンＲＮＡのｃＤＮＡ配列
配列番号５２：プライマー ２２１０Ｒ
配列番号５３：プライマー ２２１０Ｆ
配列番号５４：ｐＳ３１０ＡＳＧＲ−Ｎｅｏ Ｓ２２１０Ｉから合成される、変異体Ｓ３１０Ａ Ｓ２２１０Ｉ ＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡのｃＤＮＡ配列

Claims (20)

1. 遺伝子型３ａのＣ型肝炎ウイルスゲノムの、配列番号１の塩基番号１〜３４０の塩基配列を含む５’非翻訳領域と、配列番号１４のアミノ酸番号１０３３〜１６６３のＮＳ３タンパク質のアミノ酸配列、アミノ酸番号１６６４〜１７１７のＮＳ４Ａタンパク質のアミノ酸配列、アミノ酸番号１７１８〜１９７８のＮＳ４Ｂタンパク質のアミノ酸配列、アミノ酸番号１９７９〜２４３０のＮＳ５Ａタンパク質のアミノ酸配列、及びアミノ酸番号２４３１〜３０２１のＮＳ５Ｂタンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列と、配列番号１の塩基番号９４０７〜９６５５の塩基配列を含む３’非翻訳領域とをこの順番で含む、核酸（ただし、該核酸がＲＮＡの場合は、塩基配列中のチミン（ｔ）をウラシル（ｕ）に読み替える）。
2. 前記ＮＳ３タンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列が配列番号１の塩基番号３４３７〜５３２９の塩基配列を含み、
   前記ＮＳ４Ａタンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列が配列番号１の塩基番号５３３０〜５４９１の塩基配列を含み、
   前記ＮＳ４Ｂタンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列が配列番号１の塩基番号５４９２〜６２７４の塩基配列を含み、
   前記ＮＳ５Ａタンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列が配列番号１の塩基番号６２７５〜７６３０の塩基配列を含み、
   前記ＮＳ５Ｂタンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列が配列番号１の塩基番号７６３１〜９４０６の塩基配列を含む、請求項１記載の核酸。
3. 前記５’非翻訳領域が、配列番号１の塩基番号１〜３４０の塩基配列中に、１〜２０個の塩基の欠失、置換又は付加を含む、請求項１又は２記載の核酸。
4. 請求項１〜３のいずれか一項記載の核酸の塩基配列に塩基変異を有する核酸であり、該塩基変異が配列番号１４に示されるアミノ酸配列を基準とした場合に以下の(a)〜（g）の少なくとも１つのアミノ酸置換を引き起こす塩基変異からなる、核酸。
   （a） 第１２８６番目のスレオニンのイソロイシンへの置換
   （b） 第２１８８番目のスレオニンのアラニンへの置換
   （c） 第２１９８番目のアルギニンのヒスチジンへの置換
   （d） 第２２１０番目のセリンのイソロイシンへの置換
   （e） 第２４９６番目のスレオニンのイソロイシンへの置換
   （f） 第２８９５番目のアルギニンのグリシンへの置換
   （g） 第２８９５番目のアルギニンのリジンへの置換
5. 薬剤耐性遺伝子及び／又はレポーター遺伝子、並びにＩＲＥＳ配列をさらに含む、請求項１〜４のいずれか一項記載の核酸。
6. Ｃ型肝炎ウイルスゲノムの、Ｃｏｒｅタンパク質をコードする塩基配列、Ｅ１タンパク質をコードする塩基配列、Ｅ２タンパク質をコードする塩基配列、ｐ７タンパク質をコードする塩基配列、及びＮＳ２タンパク質をコードする塩基配列をさらに含む、請求項１〜５のいずれか一項記載の核酸。
7. Ｃｏｒｅタンパク質をコードする塩基配列が、配列番号１４のアミノ酸番号１〜１９１のＣｏｒｅタンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列であり、
   Ｅ１タンパク質をコードする塩基配列が、配列番号１４のアミノ酸番号１９２〜３８３のＥ１タンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列であり、
   Ｅ２タンパク質をコードする塩基配列が、配列番号１４のアミノ酸番号３８４〜７５２のＥ２タンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列であり、
   ｐ７タンパク質をコードする塩基配列が、配列番号１４のアミノ酸番号７５３〜８１５のｐ７タンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列であり、
   ＮＳ２タンパク質をコードする塩基配列が、配列番号１４のアミノ酸番号８１６〜１０３２のＮＳ２タンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列である、
   請求項６記載の核酸。
8. 配列番号１及び４９〜５１のいずれかに示される塩基配列を含む、請求項６記載の核酸。
9. 配列番号１７〜２３及び５４のいずれかに示される塩基配列を含む、請求項５記載の核酸。
10. 請求項１〜５及び９のいずれか一項記載の核酸を含む、Ｃ型肝炎ウイルスのサブゲノムレプリコンＲＮＡ。
11. 請求項６〜８のいずれか一項記載の核酸を含む、Ｃ型肝炎ウイルスのフルゲノムレプリコンＲＮＡ。
12. 請求項６〜８のいずれか一項記載の核酸をウイルスゲノムとして含有する、Ｃ型肝炎ウイルス粒子。
13. 請求項１〜９のいずれか一項記載の核酸が導入された、細胞。
14. 請求項１２記載のＣ型肝炎ウイルス粒子を含有する、Ｃ型肝炎ウイルスワクチン。
15. 請求項１２記載のＣ型肝炎ウイルス粒子を抗原として非ヒト動物に投与することを特徴とする、抗Ｃ型肝炎ウイルス抗体を製造する方法。
16. 被験物質の存在下及び非存在下の双方で、請求項１３記載の細胞、又は、請求項１２記載のＣ型肝炎ウイルス粒子とＣ型肝炎ウイルス感受性細胞との混合物、を培養する培養ステップと、
    前記培養ステップで培養物中に得られたサブゲノムレプリコンＲＮＡ、フルゲノムレプリコンＲＮＡ又はＣ型肝炎ウイルス粒子の量を定量する定量ステップと、
    前記定量ステップの結果、被験物質の存在下で培養した培養物中で定量されたサブゲノムレプリコンＲＮＡ、フルゲノムレプリコンＲＮＡ又はＣ型肝炎ウイルス粒子の量が、それぞれ前記被験物質の非存在下で培養した培養物中で定量されたサブゲノムレプリコンＲＮＡ、フルゲノムレプリコンＲＮＡ又はＣ型肝炎ウイルス粒子の量より少ない場合に、前記被験物質は抗Ｃ型肝炎ウイルス活性を有すると評価する評価ステップと、
    を含む、抗Ｃ型肝炎ウイルス物質をスクリーニングする方法。
17. 前記核酸が２以上のＣ型肝炎ウイルス株のゲノムに由来するキメラ核酸であり、
    配列番号１のＣ型肝炎ウイルスゲノム以外のＣ型肝炎ウイルスゲノムのＣｏｒｅタンパク質をコードする塩基配列、Ｅ１タンパク質をコードする塩基配列、Ｅ２タンパク質をコードする塩基配列及びｐ７タンパク質をコードする塩基配列と、
    配列番号１の塩基番号２７８６〜３４３６の配列からなるＮＳ２タンパク質をコードする塩基配列、配列番号１のＣ型肝炎ウイルスゲノム以外のＣ型肝炎ウイルスゲノムのＮＳ２タンパク質をコードする塩基配列、又は、配列番号１の塩基番号２７８６〜３４３６の塩基配列からなるＮＳ２タンパク質をコードする塩基配列の一部と配列番号１のＣ型肝炎ウイルスゲノム以外のＣ型肝炎ウイルスゲノムのＮＳ２タンパク質をコードする塩基配列の一部とが連結されたキメラ型のＮＳ２タンパク質をコードする塩基配列と、
    配列番号１における、塩基番号３４３７〜５３２９の配列からなるＮＳ３タンパク質をコードする塩基配列、塩基番号５３３０〜５４９１の配列からなるＮＳ４Ａタンパク質をコードする塩基配列、塩基番号５４９２〜６２７４の配列からなるＮＳ４Ｂタンパク質をコードする塩基配列、塩基番号６２７５〜７６３０の配列からなるＮＳ５Ａタンパク質をコードする塩基配列及び塩基番号７６３１〜９４０６の配列からなるＮＳ５Ｂタンパク質をコードする塩基配列とを、
    ５’側から３’側に向かって、この順で含む、請求項６記載の核酸。
18. 請求項１７記載の核酸の塩基配列に塩基変異を有する核酸であり、該塩基変異は、配列番号１４に示されるアミノ酸配列を基準とした場合に以下の(a)〜（g）の少なくとも１つのアミノ酸置換を引き起こす塩基変異からなる、核酸。
    （a） 第１２８６番目のスレオニンのイソロイシンへの置換
    （b） 第２１８８番目のスレオニンのアラニンへの置換
    （c） 第２１９８番目のアルギニンのヒスチジンへの置換
    （d） 第２２１０番目のセリンのイソロイシンへの置換
    （e） 第２４９６番目のスレオニンのイソロイシンへの置換
    （f） 第２８９５番目のアルギニンのグリシンへの置換
    （g） 第２８９５番目のアルギニンのリジンへの置換
19. 前記配列番号１の塩基番号１〜３４０の塩基配列を含む５’非翻訳領域に代えて、配列番号１のＣ型肝炎ウイルスゲノム以外のＣ型肝炎ウイルスゲノムの５’非翻訳領域を含む、請求項１７又は１８記載の核酸。
20. 請求項１７〜１９のいずれか一項記載の核酸を含む、Ｃ型肝炎ウイルスのキメラフルゲノムレプリコンＲＮＡ。

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