KR101154278B1 - 인간 ｃ형간염 바이러스의 전체 길이 게놈을 함유하는 핵산 구축물 및 상기 핵산 구축물을 도입한 재조합형 전체 길이 바이러스 게놈 복제세포, 및 ｃ형간염 바이러스 입자의 제조방법 - Google Patents

인간 ｃ형간염 바이러스의 전체 길이 게놈을 함유하는 핵산 구축물 및 상기 핵산 구축물을 도입한 재조합형 전체 길이 바이러스 게놈 복제세포, 및 ｃ형간염 바이러스 입자의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 HCV 전체 길이 게놈서열을 함유하는 RNA를 효율적으로 복제하는 방법, 및 전체 길이 HCV 레플리콘 RNA 또는 전체 길이 HCV 게놈 RNA를 함유하는 HCV 바이러스 입자를 세포배양계에 의해 제조하는 방법을 제공한다. 또, 본 발명은 유전자형2a의 C형간염 바이러스의 전체 길이 게놈 RNA 서열과, 적어도 1개의 선택 마커 유전자 및/또는 적어도 1개의 리포터 유전자와, 적어도 1개의 IRES 서열을 포함하는 염기서열로 이루어지는 레플리콘 RNA, 혹은 유전자형2a의 C형간염 바이러스의 전체 길이 게놈 RNA를 도입한 세포를 배양해서, 배양물 중에 바이러스 입자를 생산시키는 것을 포함하는 C형간염 바이러스 입자의 제조방법에 관한 것이다. 또한 본 발명은, C형간염 백신 및 C형간염 바이러스 입자에 대한 항체에도 관한 것이다.

Description

인간 Ｃ형간염 바이러스의 전체 길이 게놈을 함유하는 핵산 구축물 및 상기 핵산 구축물을 도입한 재조합형 전체 길이 바이러스 게놈 복제세포, 및 Ｃ형간염 바이러스 입자의 제조방법{NUCLEIC ACID CONSTRUCT CONTAINING FULL-LENGTH GENOME OF HUMAN HEPATITIS C VIRUS, RECOMBINANT FULL-LENGTH VIRUS GENOME REPLICATIVE CELL HAVING THE NUCLEIC ACID CONSTRUCT TRANSFERRED THEREINTO AND METHOD OF CONSTRUCTING HEPATITIS C VIRAL PARTICLES}
본 발명은 C형간염 바이러스의 전체 길이 게놈을 함유하는 핵산 구축물, C형간염 바이러스 입자의 in vitro에서의 제조방법, 및 제조된 C형간염 바이러스 입자의 사용에 관한 것이다.
C형간염 바이러스(Hepatitis C virus, HCV)는 플라비바이러스과에 속하는, 단일쇄의 (+)쇄 센스 RNA를 게놈으로 하는 바이러스이며, C형간염의 원인으로 되는 것이 알려져 있다.
HCV는 지속적으로 감염됨으로써 만성 간염을 일으킨다. 현재, 세계적 규모로 인정받는 만성 간염의 주된 원인이 HCV 지속감염이다. 실제, 지속감염자의 50%정도가 만성 간염이 발병하고, 그중 약 20%의 환자가 10년~20년을 거쳐서 간경변으로 이행되며, 또 그 일부는 간암이라는 치사적인 병태로 진전된다.
C형간염에 대한 현재의 주된 치료는 인터페론-α, 인터페론-β, 및 인터페론-α와 푸린-뉴클레오티드 유도체인 리바비린의 병용요법에 의해 행해지고 있다. 그러나 이들 치료를 행해도 전체 치료자의 약 60%에만 치료효과가 확인되며, 효과가 나온 후에 치료를 중지하면 절반이상의 환자가 재발한다.
공업국에 있어서 이환율이 높고, 최종적으로 심각한 결과를 초래하며, 또한 현재는 원인치료법이 존재하지 않는 C형간염에 대한 효과적인 치료약 또는 예방약의 개발은 중요한 목표이다. 그 때문에 HCV 특이적인 화학요법, 백신요법의 발전이 요망되고 있다. 항HCV약 개발의 타깃으로서는 HCV의 복제억제나 HCV의 세포감염의 억제가 고려된다.
최근이 되어서, HCV유래의 자율 복제능을 갖는 RNA로서 HCV 서브 게놈 RNA 레플리콘 시스템이 제조되었다(특허문헌1, 2 및 3, 비특허문헌1~4). HCV 서브 게놈 RNA 레플리콘 시스템은 HCV 게놈의 구조유전자를 제거해서 대신에 선택약제 마커 유전자를 삽입한 HCV 레플리콘 RNA를 제조하고, 그 레플리콘 RNA를 배양세포 내에 도입하여 세포 내에서 레플리콘 RNA를 자율적으로 복제시키는 시스템이다. 이에 따라, 배양세포를 이용하여 HCV의 복제기구를 해석할 수 있게 되었지만, 이것은 HCV 바이러스의 증식 복제과정에 있어서의 바이러스 RNA 복제만을 평가할 수 있는 실험계이며, HCV 바이러스 입자의 감염세포 내에서의 형성과 세포 밖으로의 방출, 더욱 새로운 세포로의 감염이라는 과정은 해석할 수 없다.
현재, HCV 바이러스 입자의 형성과 세포 밖으로의 방출, 더욱 새로운 세포로의 감염이라는 과정을 평가하는 방법으로서는 침팬지 등의 동물을 사용한 실험계밖 에 없다(비특허문헌5). 그러나, 동물이라는 생체를 그대로 사용한 실험계는 번잡해서 해석이 매우 곤란하다. 따라서, HCV 바이러스 입자의 감염세포 내에서의 형성과 세포 밖으로의 방출, 더욱 새로운 세포로의 감염이라는 과정을 해석 및, 이들 과정의 저해를 작용 메커니즘으로 한 항HCV약을 제조하기 위해서는 이들 과정을 재현할 수 있는 매우 단순화한 실험계, 즉, 배양실험계에서의 HCV 바이러스 입자의 제조계를 구축할 필요가 있다.
또한, 세포배양계를 이용하여 안정적으로 HCV 바이러스 입자를 공급할 수 있게 되면, 바이러스를 약독화하거나, 분자생물학적 방법을 이용하여 비감염성 HCV 바이러스를 제조하거나 해서 그것을 백신에 사용할 수 있다.
[특허문헌1 : 일본 특허공개 2001-17187호 공보]
[특허문헌2 : 국제출원PCT/JP03/15038]
[특허문헌3 : 일본 특허출원 2003-329082]
[비특허문헌1 : Lohmann et al.,Science,(1999) 285,p.110-113]
[비특허문헌2 : Blight et al.,Science,(2000) 290,p.1972-1974]
[비특허문헌3 : Friebe et al.,J.Virol.,(2001) 75(24):p.12047-12057]
[비특허문헌4 : Ikeda et al.,J.Virol.,(2002) 76(6):p.2997-3006]
[비특허문헌5 : Kolykhalov et al.,Science,(1997) 277,p.570-574]
[비특허문헌6 : Kato et al.,Gastroenterology,(2003) 125,p.1808-1817]
[비특허문헌7 : Yanagi et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.,(1997) 96(16):p.8738-8743]
[비특허문헌8 : Okamoto et al.,J.Gen.Virol.,(1991) 73,p.2697-26704]
[비특허문헌9 : Aoyagi et al.,J.Clin.Microbiol.,(1999) 37(6):p.1802-1808]
본 발명은 지금까지 성공하지 못한 HCV 전체 길이 게놈서열을 함유하는 RNA를 효율적으로 복제하는 방법, 및 전체 길이 HCV 레플리콘 RNA 또는 전체 길이 HCV 게놈 RNA를 함유하는 HCV 바이러스 입자를 세포배양계에 의해 제조하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명자들은 상기 과제를 해결하기 위해 예의연구를 행한 결과, HCV 바이러스 입자를 세포배양계로 제조하는 방법을 개발했다. 즉, 본 발명은 이하와 같다.
[1]유전자형2a의 C형간염 바이러스의 게놈 RNA의, 5'비번역영역, 코어 단백질 코드 서열, E1 단백질 코드 서열, E2 단백질 코드 서열, NS2 단백질 코드 서열, NS3 단백질 코드 서열, NS4A 단백질 코드 서열, NS4B 단백질 코드 서열, NS5A 단백질 코드 서열, NS5B 단백질 코드 서열, 및 3'비번역영역과, 적어도 1개의 선택 마커 유전자 및/또는 적어도 1개의 리포터 유전자와, 적어도 1개의 IRES 서열을 포함하는 염기서열로 이루어지는 레플리콘 RNA.
이 레플리콘 RNA에 있어서는, 바람직하게는 상기 염기서열이 상기의 5'비번역영역, 적어도 1개의 선택 마커 유전자 및/또는 적어도 1개의 리포터 유전자, 적어도 1개의 IRES 서열, 코어 단백질 코드 서열, E1 단백질 코드 서열, E2 단백질 코드 서열, NS2 단백질 코드 서열, NS3 단백질 코드 서열, NS4A 단백질 코드 서열, NS4B 단백질 코드 서열, NS5A 단백질 코드 서열, NS5B 단백질 코드 서열, 및 3'비번역영역을 5'에서 3'방향으로 이 순서로 포함한다.
이 레플리콘 RNA의 보다 바람직한 실시형태에서는 유전자형2a의 C형간염 바이러스의 게놈 RNA가 서열번호 12에 나타내는 염기서열로 이루어지는 RNA이다.
이 레플리콘 RNA의 더욱 바람직한 실시형태에서는 5'비번역영역이 서열번호 1에 나타내는 염기서열로 이루어지고, 코어 단백질 코드 서열이 서열번호 2에 나타내는 염기서열로 이루어지며, E1 단백질 코드 서열이 서열번호 3에 나타내는 염기서열로 이루어지고, E2 단백질 코드 서열이 서열번호 4에 나타내는 염기서열로 이루어지며, NS2 단백질 코드 서열이 서열번호 5에 나타내는 염기서열로 이루어지고, NS3 단백질 코드 서열이 서열번호 6에 나타내는 염기서열로 이루어지며, NS4A 단백질 코드 서열이 서열번호 7에 나타내는 염기서열로 이루어지고, NS4B 단백질 코드 서열이 서열번호 8에 나타내는 염기서열로 이루어지며, NS5A 단백질 코드 서열이 서열번호 9에 나타내는 염기서열로 이루어지고, NS5B 단백질 코드 서열이 서열번호 10에 나타내는 염기서열로 이루어지며, 3'비번역영역이 서열번호 11에 나타내는 염기서열로 이루어진다.
[2]이하의 (a) 또는 (b)의 RNA로 이루어지는 레플리콘 RNA.
(a)서열번호 13에 나타내는 염기서열로 이루어지는 RNA.
(b)서열번호 13에 나타내는 염기서열에 있어서 1~100개의 염기가 삭제, 치환 또는 부가된 염기서열로 이루어지는 RNA로서, 자율 복제능 및 바이러스 입자 생산능을 갖는 RNA.
[3]상기 [1] 또는 [2]에 기재된 것 중 어느 하나의 레플리콘 RNA를 세포에 도입하는 것을 포함하는, 상기 레플리콘 RNA를 복제하고 또한 바이러스 입자를 생산하는 세포를 제조하는 방법.
이 방법에서는 세포가 증식성 세포인 것이 바람직하다. 혹은, 이 방법에 있어서의 세포는 진핵세포인 것이 바람직하다.
이 방법에서는, 바람직하게는 진핵세포는 인간 간유래 세포, 인간 자궁경부유래 세포, 또는 인간 태아신장유래 세포이다. 더욱 바람직하게는 진핵세포가 Huh7 세포, HepG2 세포, IMY-N9 세포, HeLa 세포, 또는 293 세포이다.
[4]상기 [3]에 기재된 방법에 의해 제조되는 레플리콘 RNA를 복제하고 또한 바이러스 입자를 생산하는 세포.
[5]상기 [4]에 기재된 세포를 배양해서 바이러스 입자를 생산시키는 것을 포함하는 C형간염 바이러스 입자의 제조방법.
[6]상기 [5]에 기재된 방법에 의해 제조되는 C형간염 바이러스 입자.
[7]상기 [4]에 기재된 세포를 배양하고, 배양물 중의 바이러스 입자를 다른 세포에 감염시키는 것을 포함하는 C형간염 바이러스 감염세포를 제조하는 방법.
[8]상기 [7]에 기재된 방법에 의해 제조되는 C형간염 바이러스 감염세포.
[9]피검물질의 존재하에서 하기 (a)~(c):
(a)상기 [4]에 기재된 세포
(b)상기 [8]에 기재된 C형간염 바이러스 감염세포, 및
(c)상기 [6]에 기재된 C형간염 바이러스 입자 및 C형간염 바이러스 허용 세포,
중의 적어도 1개를 배양하고, 얻어지는 배양물 중의 레플리콘 RNA 또는 바이러스 입자를 검출하는 것을 포함하는, 항C형간염 바이러스 물질을 스크리닝하는 방법.
[10]상기 [6]에 기재된 C형간염 바이러스 입자 또는 그 일부분을 함유하는 C형간염 백신.
[11]상기 [6]에 기재된 C형간염 바이러스 입자 또는 그 일부분을 항원으로서 사용하여 C형간염 백신을 제조하는 방법.
[12]상기 [1] 또는 [2]에 기재된 것 중 어느 하나의 레플리콘 RNA를 사용해서 유전자치료를 위한 간세포지향성 바이러스 벡터를 제조하는 방법.
[13]상기 [12]에 기재된 방법에 의해 제조되는 간세포지향성 바이러스 벡터.
[14]외래유전자를 코드하는 RNA를 상기 [1] 또는 [2]에 기재된 것 중 어느 하나의 레플리콘 RNA 중에 삽입하고, 그것을 세포 중에 도입하는 것을 포함하는, 상기 세포 내에서 외래유전자를 복제 및/또는 발현시키는 방법.
[15]서열번호 12에 나타내는 염기서열로 이루어지는 RNA를 세포에 도입하는 것을 포함하는, 상기 RNA를 복제하고 또한 바이러스 입자를 생산하는 세포를 제조하는 방법.
[16]서열번호 12에 나타내는 염기서열로 이루어지는 RNA를 세포에 도입하고, 그 세포를 배양해서 바이러스 입자를 생산시키는 것을 포함하는 C형간염 바이러스 입자의 제조방법.
[17]세포가 증식성 세포인 상기 [15] 또는 [16]에 기재된 방법.
[18]서열번호 12에 나타내는 염기서열로 이루어지는 RNA에 외래유전자를 코드하는 RNA를 삽입하고, 그것을 세포에 도입하여 그 세포를 배양해서 바이러스 입자를 생산시키는 것을 포함하는, 외래유전자를 함유하는 바이러스 벡터를 제조하는 방법.
[19]상기 [6]에 기재된 C형간염 바이러스 입자에 대한 항체.
본 명세서는 본원의 우선권의 기초인 일본국 특허출원 2004-045489호의 명세서 및 도면에 기재되는 내용을 포함한다.
도 1은, 본 발명의 전체 길이 HCV 레플리콘 RNA 또는 전체 길이 HCV 게놈 RNA를 제조하기 위한 주형 DNA의 구축순서를 나타내는 개략도로서, 상단은 T7프로모터의 하류에 전체 길이 HCV 게놈을 삽입하여 제조한 플라스미드 클론 pJFH1의 구조를 나타내고, 하단은 pJFH1의 T7프로모터와 5'비번역영역의 하류에 네오마이신 내성 유전자와 EMCV IRES를 함유하는 DNA 단편을 삽입한, 전체 길이 HCV 게놈서열을 함유하는 플라스미드 클론 pFGREP-JFH1의 구조를 나타낸다. 도면 중의 기호는 이하와 같다. T7 : T7 RNA 프로모터, 5'UTR : 5'비번역영역, C : 코어 단백질, E1, E2 : 엔벨로프 단백질, NS2, NS3, NS4A, NS4B, 4A, 4B : 비구조 단백질, 3'UTR : 3'비번역영역, AgeI, PmeI, XbaI : 제한효소 AgeI, PmeI 및 XbaI의 절단부위, GDD : NS5B 단백질의 활성중심에 상당하는 아미노산 모티브 GDD의 위치, neo : 네오마이신 내성 유전자, EMCV IRES : EMCV IRES(뇌심근염 바이러스의 내부 리보솜 결합부위)
도 2는, 전체 길이 HCV 게놈 RNA인 rJFH-1을 도입한 Huh7 세포에 있어서의 rJFH-1의 복제를 나타내는 노던 블롯 해석의 결과를 나타내는 사진이다.
도 3은, 배지(培地) 중의 HCV 코어 단백질의 정량의 결과를 나타내고, 흰색 원은 rJFH1을 도입한 세포, 검은색 원은 rJFH1/GND를 도입한 세포를 나타내는 도면이다.
도 4는, rJFH-1을 도입한 Huh7 세포의 배양상청(上淸)을 자당밀도 구배에 의해 분획된 각 획분에 대한 HCV 코어 단백질량 및 전체 길이 HCV 게놈 RNA량, 및 비중을 나타내는 그래프로서, 검은색 원은 HCV 코어 단백질, 흰색 원은 전체 길이 HCV 게놈 RNA, 빗금선에 연결된 원은 비중을 나타낸다.
도 5는, 전체 길이 HCV 레플리콘 RNA인 rFGREP-JFH1을 트랜스펙션한 Huh7 세포의 콜로니 형성을 나타내는 사진이다.
도 6은, rFGREP-JFH1의 Huh7 세포로의 트랜스펙션에 의해 수립된 전체 길이 HCV 레플리콘 RNA 복제세포 클론에 있어서의, 전체 길이 HCV 레플리콘 RNA의 복제를 나타내는 사진이다.
도 7은, 게놈 DNA 중으로의 네오마이신 내성 유전자의 도입의 유무를 확인하기 위한, 숙주세포의 게놈 DNA를 주형으로 하고, 네오마이신 내성 유전자 특이적 프라이머를 사용하여 PCR 증폭한 결과를 나타내는 사진이다. M : DNA 사이즈 마커, P : 양성 대조, N : Huh7 세포.
도 8은, 전체 길이 HCV 레플리콘 RNA인 rFGREP-JFH1을 도입한 Huh7 세포에 있어서의 코어 단백질의 발현을 나타내는 웨스턴 블롯 해석의 결과를 나타내는 사 진이다.
도 9는, 전체 길이 HCV 레플리콘 RNA인 rFGREP-JFH1을 도입한 Huh7 세포에 있어서의 NS3 단백질의 발현을 나타내는 웨스턴 블롯 해석의 결과를 나타내는 사진이다.
도 10은, 전체 길이 HCV 레플리콘 RNA인 rFGREP-JFH1을 도입한 Huh7 세포에 있어서의 NS5A 단백질의 발현을 나타내는 웨스턴 블롯 해석의 결과를 나타내는 사진이다.
도 11은, rFGREP-JFH1을 도입한 Huh7 세포의 배양상청을 자당밀도 구배에 의해 분획된 각 획분에 대한 HCV 코어 단백질의 양 및 전체 길이 HCV 레플리콘 RNA량, 및 비중을 나타내는 그래프로서, 검은색 원은 HCV 코어(core) 단백질, 흰색 원은 전체 길이 HCV 레플리콘 RNA, 빗금선에 연결된 원은 비중을 나타낸다.
도 12는, 전체 길이 HCV 레플리콘 RNA 복제세포의 배양상청에 함유되는 바이러스 입자를 첨가한 Huh7 세포의 콜로니 형성을 나타내는 사진이다.
이하, 본 발명에 대해서 상세하게 설명한다.
1.전체 길이 HCV 레플리콘 RNA
C형간염 바이러스(HCV)의 게놈은 약 9600 뉴클레오티드로 이루어지는 (+)쇄의 단일쇄 RNA이다. 이 게놈 RNA는 5'비번역영역(5'NTR 또는 5'UTR로도 표기함), 구조영역과 비구조영역으로 구성되는 번역영역, 및 3'비번역영역(3'NTR 또는 3'UTR로도 표기함)으로 이루어진다. 그 구조영역에는 HCV의 구조 단백질이 코드되어 있 고, 비구조영역에는 복수의 비구조 단백질이 코드되어 있다.
이러한 HCV의 구조 단백질(core, E1, 및 E2)과 비구조 단백질(NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A, 및 NS5B)은 번역영역으로부터 일련의 폴리프로테인으로서 번역된 후, 프로테아제에 의한 한정분해를 받아서 유리, 생성된다. 이들 구조 단백질 및 비구조 단백질(즉, HCV의 바이러스 단백질) 중, core는 코어 단백질이며, E1 및 E2는 엔벨로프 단백질이다. 비구조 단백질은 바이러스 자신의 복제에 관여하는 단백질이며, NS2는 메탈로프로테아제 활성, NS3은 세린프로테아제 활성(N말단측의 3분의 1)과 헬리카제 활성(C말단측의 3분의 2)을 갖는 것이 알려져 있다. 또, NS4A는 NS3의 프로테아제 활성에 대한 코팩터이며, NS5B는 RNA 의존 RNA 폴리메라제 활성을 갖는 것도 보고되어 있다.
본 발명자들은 HCV 게놈 RNA를 이용해서 자율적으로 복제 가능하고, 또한 바이러스 입자 생산능을 갖는 레플리콘 RNA를 구축했다.
본 명세서에서는 자율 복제능을 갖고 있고 HCV 게놈 RNA를 개변해서 제조된 RNA를 「레플리콘 RNA」 또는 「RNA 레플리콘」이라고 칭한다. 본 명세서에 있어서 HCV유래의 레플리콘 RNA는 HCV-RNA 레플리콘이라고도 칭해진다. 본 명세서에서는 HCV 게놈 RNA의 전체 길이를 함유하는 본 발명의 레플리콘 RNA를 「전체 길이 HCV 레플리콘 RNA」라고 부른다. 본 발명의 전체 길이 HCV 레플리콘 RNA는 바이러스 입자 생산능을 갖는다.
본 발명의 전체 길이 HCV 레플리콘 RNA의 바람직한 실시형태에서는, C형간염 바이러스는 한정되는 것은 아니지만, 유전자형2a의 C형간염 바이러스인 것이 바람 직하다. 본 발명에 있어서 「유전자형2a의 C형간염 바이러스」 「유전자형2a의 HCV」란, Simmonds들(Simmonds,P.et al,Hepatology,(1994)10,p.1321-1324를 참조)에 의한 국제분류에 따라 유전자형2a로 분류되는 C형간염 바이러스를 의미한다. 본 발명에 있어서의 「유전자형2a의 C형간염 바이러스」 「유전자형2a의 HCV」에는, 천연유래의 HCV 게놈 RNA를 갖는 바이러스 뿐만 아니라, 천연유래의 HCV 게놈서열에 인위적인 개변을 가한 게놈 RNA를 갖는 바이러스도 포함된다. 유전자형2a의 HCV의 구체예로서는 JFH-1주(일본 특허공개 2002-171978호 공보를 참조)가 예시된다.
본 명세서에 있어서 「C형간염 바이러스의 게놈 RNA」란, C형간염 바이러스의 단일쇄의 (+)쇄 센스 RNA로 이루어지는 게놈의 전체 길이에 걸치는 염기서열을 갖는 RNA를 의미한다. 한정되는 것은 아니지만, 유전자형2a의 C형간염 바이러스의 게놈 RNA로서는 서열번호 12에 나타내는 염기서열로 이루어지는 RNA가 바람직하다.
본 발명에 따른 전체 길이 HCV 레플리콘 RNA의 하나의 실시형태는, C형간염 바이러스의 게놈 RNA상의 5'비번역영역, 코어 단백질 코드 서열, E1 단백질 코드 서열, E2 단백질 코드 서열, NS2 단백질 코드 서열, NS3 단백질 코드 서열, NS4A 단백질 코드 서열, NS4B 단백질 코드 서열, NS5A 단백질 코드 서열, NS5B 단백질 코드 서열, 및 3'비번역영역과, 적어도 1개의 선택 마커 유전자 또는 리포터 유전자와, 적어도 1개의 IRES 서열을 포함하는 염기서열로 이루어지는 레플리콘 RNA이다.
한정되는 것은 아니지만, 바람직하게는 본 발명의 전체 길이 HCV 레플리콘 RNA는, 5'비번역영역, 적어도 1개의 선택 마커 유전자 또는 리포터 유전자, 적어도 1개의 IRES 서열, 코어 단백질 코드 서열, E1 단백질 코드 서열, E2 단백질 코드 서열, NS2 단백질 코드 서열, NS3 단백질 코드 서열, NS4A 단백질 코드 서열, NS4B 단백질 코드 서열, NS5A 단백질 코드 서열, NS5B 단백질 코드 서열, 및 3'비번역영역을 5'에서 3'방향으로 이 순서로 함유한다.
본 명세서에 있어서 「5'비번역영역(5'NTR 또는 5'UTR)」, 「코어 단백질 코드 서열(core영역 또는 C영역)」, 「E1 단백질 코드 서열(E1영역)」, 「E2 단백질 코드 서열(E2영역)」, 「N2 단백질 코드 서열(NS2영역)」, 「NS3 단백질 코드 서열(NS3영역)」, 「NS4A 단백질 코드 서열(NS4A영역)」, 「NS4B 단백질 코드 서열(NS4B영역)」, 「NS5A 단백질 코드 서열(NS5A영역)」, 「NS5B 단백질 코드 서열(NS5B영역)」, 및 「3'비번역영역(3'NTR 또는 3'UTR)」, 및 다른 특정 영역 혹은 부위는 유전자형2a의 C형간염 바이러스인 JFH-1주(일본 특허공개 2002-171978호 공보)의 게놈의 전체 영역으로 이루어지는 전체 길이 게놈 RNA(서열번호 12)를 기준으로 해서 정할 수 있다.
혹은, 본원 발명에 있어서의 C형간염 바이러스(HCV) 게놈 중의 부분영역 또는 그 부위는 JFH-1주의 게놈 RNA(서열번호 12)의 부분 염기서열인 서열번호 1~11에 나타내는 서열을 기준으로 해서 정할 수도 있다. JFH-1주의 전체 길이 게놈 RNA(JFH-1 클론유래)(서열번호 12)의 「5'비번역영역」은 서열번호 1에 나타내는 염기서열로 이루어진다. 또, 「코어 단백질 코드 서열」은 서열번호 2에 나타내는 염기서열로 이루어진다. 「E1 단백질 코드 서열」은 서열번호 3에 나타내는 염기서열로 이루어진다. 「E2 단백질 코드 서열」은 서열번호 4에 나타내는 염기서열로 이루어진다. 「NS2 단백질 코드 서열」은 서열번호 5에 나타내는 염기서열로 이루어진다. 「NS3 단백질 코드 서열」은 서열번호 6에 나타내는 염기서열로 이루어진다. 「NS4A 단백질 코드 서열」은 서열번호 7에 나타내는 염기서열로 이루어진다. 「NS4B 단백질 코드 서열」은 서열번호 8에 나타내는 염기서열로 이루어진다. 「NS5A 단백질 코드 서열」은 서열번호 9에 나타내는 염기서열로 이루어진다. 「NS5B 단백질 코드 서열」은 서열번호 10에 나타내는 염기서열로 이루어진다. 「3'비번역영역」은 서열번호 11에 나타내는 염기서열로 이루어진다.
예를 들면, HCV유래의 RNA 서열 중의 영역 또는 부위는 그 RNA 서열을 서열번호 1~12에 나타내는 염기서열에 대하여 얼라인먼트하고, 서열번호 1~12의 서열 중의 염기번호를 기준으로 해서 정해도 된다. 이러한 얼라인먼트에 있어서는 서열사이에서 갭, 부가, 삭제, 치환 등이 존재해도 된다.
본 발명의 더욱 바람직한 실시형태에서는 본 발명의 전체 길이 HCV 레플리콘 RNA에 함유되는 5'비번역영역, 코어 단백질 코드 서열, E1 단백질 코드 서열, E2 단백질 코드 서열, NS2 단백질 코드 서열, NS3 단백질 코드 서열, NS4A 단백질 코드 서열, NS4B 단백질 코드 서열, NS5A 단백질 코드 서열, NS5B 단백질 코드 서열, 및 3'비번역영역이 각각 서열번호 1~11에 나타내는 염기서열을 갖는 것이 바람직하다.
본 발명에 따른 전체 길이 HCV 레플리콘 RNA의 바람직한 실시형태는 서열번호 1~11에 나타내는 염기서열과, 적어도 1개의 선택 마커 유전자 및/또는 리포터 유전자와, 적어도 1개의 IRES 서열로 이루어지는 레플리콘 RNA이다.
본 발명에 있어서 「선택 마커 유전자 」란, 그 유전자가 발현된 세포만이 선택되는 선택성을 세포에 부여할 수 있는 유전자를 의미한다. 선택 마커 유전자의 일반적인 예로서는 항생물질 내성 유전자가 예시된다. 본 발명에 있어서 바람직한 선택 마커 유전자의 예로서는 네오마이신 내성 유전자, 티미딘 키나제 유전자, 카나마이신 내성 유전자, 피리티아민 내성 유전자, 아데닐일트랜스페라제 유전자, 제오신 내성 유전자, 퓨로마이신 내성 유전자 등이 예시되지만, 네오마이신 내성 유전자, 티미딘 키나제 유전자가 바람직하고, 네오마이신 내성 유전자가 더욱 바람직하다. 단 본 발명에 있어서의 선택 마커 유전자는 이들에 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 발명에 있어서 「리포터 유전자 」란, 그 유전자발현의 지표가 되는 유전자산물을 코드하는 마커 유전자를 의미한다. 리포터 유전자의 일반적인 예로서는 발광반응이나 정색반응을 촉매하는 효소의 구조유전자가 예시된다. 본 발명에 있어서 바람직한 리포터 유전자의 예로서는 트랜스포슨 Tn9유래의 클로람페니콜 아세틸트랜스페라제 유전자, 대장균유래의 β글루쿠로니다제 혹은 β갈락토시다제 유전자, 루시페라제 유전자, 녹색형광 단백질 유전자, 해파리유래의 에쿼린 유전자, 분비형 태반 알칼리포스파타제(SEAP) 유전자 등이 예시된다. 단, 본 발명에 있어서의 리포터 유전자는 이들에 한정되는 것은 아니다.
상기의 선택 마커 유전자나 리포터 유전자는 전체 길이 HCV 레플리콘 RNA 속에 어느 한쪽만이 함유되어 있어도 되고, 양쪽이 함유되어 있어도 된다. 선택 마커 유전자 또는 리포터 유전자는 전체 길이 HCV 레플리콘 RNA에 1개 함유되어 있어도 되고, 2개이상 함유되어 있어도 된다.
본 발명에 있어서의 「IRES 서열 」이란, RNA의 내부에 리보솜을 결합시켜서 번역을 개시시킬 수 있는 내부 리보솜 결합부위를 의미한다. 본 발명에 있어서의 IRES 서열의 적합한 예로서는, 이하에 한정되는 것은 아니지만 EMCV IRES(뇌심근염 바이러스의 내부 리보솜 결합부위), FMDV IRES, HCV IRES 등이 예시되지만, EMCV IRES, 및 HCV IRES가 보다 바람직하고, EMCV IRES가 가장 바람직하다.
본 발명에 따른 전체 길이 HCV 레플리콘 RNA의 더욱 바람직한 하나의 실시형태는 서열번호 13에 나타내는 염기서열로 이루어지는 RNA이다. 또, 이 서열번호 13에 나타내는 염기서열에 있어서 1~100개, 바람직하게는 1~30개, 보다 바람직하게는 1~10개, 더욱 바람직하게는 1~6개, 가장 바람직하게는 1~수개(2~5개)의 염기가 삭제, 치환 또는 부가된 염기서열로 이루어지는 RNA이고, 또한 자율 복제능 및 바이러스 입자 생산능을 갖는 RNA도 바람직한 실시형태로서 본 발명의 전체 길이 HCV 레플리콘 RNA의 범위에 포함된다.
본 발명에 따른 전체 길이 HCV 레플리콘 RNA는, 그 전체 길이 HCV 레플리콘 RNA를 도입하는 세포 내에서 발현시키고 싶은 임의의 외래유전자를 코드하는 RNA를 더 포함해도 된다. 외래유전자를 코드하는 RNA는 5'비번역영역의 하류에 연결되어도 좋고, 선택 마커 유전자 혹은 리포터 유전자의 상류 또는 하류에 연결시켜도 좋으며, 3'비번역영역의 상류에 연결해도 된다. 또, 코어 단백질 코드 서열, E1 단백질 코드 서열, E2 단백질 코드 서열, NS2 단백질 코드 서열, NS3 단백질 코드 서열, NS4A 단백질 코드 서열, NS4B 단백질 코드 서열, NS5A 단백질 코드 서열, 및 NS5B 단백질 코드 서열 중 어느 하나의 사이에 삽입해도 된다.
외래유전자를 코드하는 RNA를 포함하는 전체 길이 HCV 레플리콘 RNA는, 도입된 세포 내에서 번역될 때에 상기 외래유전자에 코드되는 유전자산물을 발현할 수 있다. 따라서 외래유전자를 코드하는 RNA를 포함하는 전체 길이 HCV 레플리콘 RNA는, 외래유전자의 유전자산물을 세포 내에서 생성시키는 것을 목적으로 하는 경우에도 적합하게 사용할 수 있다.
본 발명에 따른 전체 길이 HCV 레플리콘 RNA는 리보자임을 함유하고 있어도 된다. 전체 길이 HCV 레플리콘 RNA 중의 선택 마커 유전자 및/또는 리포터 유전자의 하류에 리보자임을 연결해 두고, 그 리보자임의 자기절단 활성에 의해 선택 마커 유전자 및/또는 리포터 유전자가 IRES 서열, 코어 단백질 코드 서열, E1 단백질 코드 서열, E2 단백질 코드 서열, NS2 단백질 코드 서열, NS3 단백질 코드 서열, NS4A 단백질 코드 서열, NS4B 단백질 코드 서열, NS5A 단백질 코드 서열, NS5B 단백질 코드 서열, 및 3'비번역영역으로부터 분리되도록 할 수도 있다.
본 발명에 따른 전체 길이 HCV 레플리콘 RNA에 있어서는, 상술한 바와 같은 선택 마커 유전자 및/또는 리포터 유전자, 바이러스 단백질을 코드하는 서열, 및 외래유전자 또는 리보자임 등이 전체 길이 HCV 레플리콘 RNA로부터 바른 해독틀에서 번역되도록 연결된다. 전체 길이 HCV 레플리콘 RNA에 코드되는 단백질은, 일련의 폴리펩티드로서 번역되어 발현된 후에 프로테아제에 의해 각 단백질로 절단되어 유리되도록 프로테아제 절단부위 등을 통해서 서로 연결시키는 것이 바람직하다.
본 발명은 또한, 본원 발명의 레플리콘 RNA를 코드하는 DNA 벡터, 바람직하게는 발현벡터에도 관한 것이다.
또한, 본 발명에 있어서 RNA가 「자율 복제능을 갖는다 」란, RNA를 세포 중에 도입했을 때에 그 RNA가 자기증식하는 것을 의미한다. 한정되는 것은 아니지만, RNA의 자율 복제능은 예를 들면 대상으로 하는 RNA를 Huh7 세포 중에 트랜스펙션하고, 그 Huh7 세포를 배양하여 얻어지는 배양물 중의 세포로부터 추출한 RNA에 대해서, 도입한 RNA를 특이적으로 검출할 수 있는 프로브를 사용한 노던 블롯 하이브리다이제이션에 의해 RNA를 검출함으로써 확인할 수 있다. 자율 복제능을 확인하기 위한 구체적인 조작은 본 명세서의 실시예에 기재된 콜로니 형성능의 측정, HCV 단백질의 발현확인, 레플리콘 RNA의 검출 등의 기재에 예시되어 있다.
또한, 본 발명에 있어서 RNA가 「바이러스 입자 생산능을 갖는다 」란, 그 RNA를 세포(예를 들면 Huh7 세포 등의 배양세포)에 도입했을 때에 상기 세포 중에서 바이러스 입자가 생산되는 것을 의미한다. 바이러스 입자 생산능은, 예를 들면 대상으로 하는 RNA를 도입한 세포의 배양상청에 대해서 그 RNA에 특이적인 프라이머를 사용한 RT-PCR법에서의 검출을 행하는 방법, 또는 그 배양상청을 자당농도 구배법에 의해 바이러스 입자를 분리하고, HCV 단백질을 검출하는 방법 등에 의해 확인할 수 있다. 이들의 구체적인 조작은 본 명세서의 실시예에 기재된 콜로니 형성능의 측정, HCV 단백질의 발현확인, 레플리콘 RNA의 검출 등의 기재에 예시되어 있다.
2.전체 길이 HCV 레플리콘 RNA의 제조
본 발명에 따른 전체 길이 HCV 레플리콘 RNA는 당업자에 공지인 임의의 유전자공학적 방법을 이용하여 제조할 수 있다. 한정되는 것은 아니지만, 전체 길이 HCV 레플리콘 RNA는, 예를 들면 유전자형2a의 C형간염 바이러스로서 JFH-1주를 사용할 경우에는 이하와 같은 방법으로 제조할 수 있다.
우선, JFH-1주의 게놈 전체 영역의 RNA(서열번호 12)에 대응하는 DNA(이 서열은 국제 DNA 데이터 뱅크에 액세션 번호 AB047639로서 등록되어 있음)를, 통상의 방법에 의해 재구축해서 RNA 프로모터의 하류에 삽입하여 DNA 클론을 제조한다. 여기서 「RNA에 대응하는 DNA」란, 상기 RNA의 염기서열의 U(우라실)를 T(티민)으로 치환한 염기서열로 이루어지는 DNA를 의미한다. 상기 RNA 프로모터는 플라스미드 클론 중에 함유되는 것이 바람직하다. 바람직한 RNA 프로모터로서는, 한정되는 것은 아니지만 T7 RNA 프로모터, SP6 RNA 프로모터, SP3 RNA 프로모터가 예시되지만, T7 RNA 프로모터가 특히 바람직하다.
다음에 선택 마커 유전자 및/또는 리포터 유전자, 및 IRES 서열을 코드하는 DNA를 상기 DNA 클론에 삽입한다. 5'비번역영역의 하류에 선택 마커 유전자 및/또는 리포터 유전자를, 또한 그 하류에 IRES 서열을 삽입하는 것이 바람직하다.
이어서, 이상과 같이 해서 제조된 DNA 클론을 주형으로 해서 RNA 폴리메라제에 의해 RNA를 합성한다. RNA 합성은 5'비번역영역으로부터 통상의 방법에 의해 개시시킬 수 있다. DNA 클론이 플라스미드 클론일 경우에는, 플라스미드 클론으로부터 제한효소에 의해 잘라진 DNA 단편을 주형으로 해서 사용하여 RNA를 합성할 수도 있다. 또, 합성되는 RNA의 3'말단이 바이러스 게놈 RNA의 3'비번역영역의 말단과 일치되어 있어 다른 서열이 부가되거나 삭제되거나 하지 않는 것이 바람직하다. 이렇게 해서 합성되는 RNA가 본 발명에 따른 전체 길이 HCV 레플리콘 RNA이다.
3.HCV 입자의 제조
상기와 같이 해서 제조되는 전체 길이 HCV 레플리콘 RNA를 세포에 도입함으로써 전체 길이 HCV 레플리콘 RNA를 복제할 수 있고, 바람직하게는 지속적으로 복제할 수 있는(즉, 레플리콘 RNA의 복제능을 갖는) 재조합형 세포를 얻을 수 있다. 본 명세서에서는 전체 길이 HCV 레플리콘 RNA를 복제하고 있는 재조합형 세포를 「전체 길이 HCV 레플리콘 RNA 복제세포」라고 칭한다.
이 전체 길이 HCV 레플리콘 RNA 복제세포는 바이러스 입자를 생산할 수 있다. 생산된 바이러스 입자는 HCV의 바이러스 단백질로 구성되는 바이러스 셸 중에 전체 길이 HCV 레플리콘 RNA를 함유한다. 따라서 본 발명의 전체 길이 HCV 레플리콘 RNA 복제세포로부터 생산되는 바이러스 입자는 HCV 입자이다. 즉 본 발명에서는, 전체 길이 HCV 레플리콘 RNA 복제세포를 배양함으로써 HCV 입자를 세포배양계에서 제조할 수 있다. 바람직하게는, 전체 길이 HCV 레플리콘 RNA 복제세포를 배양하고, 그 배양물(바람직하게는 배양상청) 중에 생산된 바이러스 입자를 채취함으로써 HCV 입자를 취득할 수 있다.
혹은, HCV 입자는 전체 길이 HCV 게놈 RNA를 도입해서 얻어지는 재조합형 세포에 의해서도 생산된다. 본 발명에 따른 전체 길이 HCV 게놈 RNA(바람직하게는 JFH-1 클론유래의 전체 길이 HCV 게놈 RNA, 보다 바람직하게는 서열번호 12에 나타내는 염기서열을 갖는 RNA)를 도입한 세포에서는, 그 전체 길이 HCV 게놈 RNA가 고효율로 복제된다. 본 명세서에서는, 전체 길이 HCV 게놈 RNA를 복제하고 있는 재조합형 세포를 「전체 길이 HCV 게놈 RNA 복제세포」라고 칭한다. 이 전체 길이 HCV 게놈 RNA 복제세포에 의해 생산되는 바이러스 입자는, HCV의 바이러스 단백질로 구성되는 바이러스 셸 중에 전체 길이 HCV 게놈 RNA를 함유한다. 즉, 본 발명의 전체 길이 HCV 게놈 RNA를 도입한 세포로부터 생산되는 바이러스 입자는 HCV 입자이다. 한정되는 것은 아니지만, 바람직하게는 JFH-1 클론유래의 전체 길이 HCV 게놈 RNA(예를 들면 서열번호 12에 나타내는 염기서열을 갖는 RNA)를 도입한 세포를 배양함으로써 HCV 입자를 세포배양계에서 제조할 수 있다. 예를 들면, 전체 길이 HCV 게놈 RNA(예를 들면 서열번호 12에 나타내는 염기서열을 갖는 RNA)를 도입한 세포를 배양하고, 그 배양물(바람직하게는 배양상청) 중에 생산된 HCV 입자를 채취함으로써 HCV 입자를 취득할 수 있다.
상기의 전체 길이 HCV 레플리콘 RNA 또는 전체 길이 HCV 게놈 RNA를 도입하는 세포로서는 계대배양할 수 있는 세포이면 임의의 세포를 사용할 수 있지만, 진핵세포인 것이 바람직하고, 인간세포인 것이 보다 바람직하며, 인간 간유래 세포, 인간 자궁경부유래 세포, 또는 인간 태아신장유래 세포인 것이 더욱 바람직하다. 이들 세포로서는 암세포주나 간세포주 등을 포함하는 증식성 세포가 바람직하고, Huh7 세포, HepG2 세포, IMY-N9 세포, HeLa 세포, 또는 293 세포 등이 더욱 바람직하다. 이들 세포는 시판되는 것을 이용해도 좋고, 세포기탁 기관으로부터 입수하여 사용해도 좋으며, 임의의 세포(예를 들면 암세포 또는 간세포)로부터 주화(株化)한 세포를 사용해도 된다.
전체 길이 HCV 레플리콘 RNA 또는 전체 길이 HCV 게놈 RNA의 세포 내로의 도입은 당업자에게는 공지의 임의의 기술을 이용해서 행할 수 있다. 그러한 도입법으 로서는, 예를 들면 일렉트로포레이션, 파티클 건법, 리포펙션법, 인산칼슘법, 현미주사법, DEAE 세파로오스법 등이 예시되지만, 일렉트로포레이션에 의한 방법이 특히 바람직하다.
전체 길이 HCV 레플리콘 RNA 또는 전체 길이 HCV 게놈 RNA는 단독으로 도입해도 되고, 다른 핵산과 혼합시킨 것을 도입해도 된다. 도입하는 RNA량을 일정하게 하면서 전체 길이 HCV 레플리콘 RNA 또는 전체 길이 HCV 게놈 RNA의 도입량을 변경하고 싶을 경우에는, 원하는 도입량의 전체 길이 HCV 레플리콘 RNA 또는 전체 길이 HCV 게놈 RNA를, 도입하는 세포로부터 추출한 토털 세포성 RNA와 혼합해서 일정한 RNA 총량으로 하여 그것을 세포내 도입에 사용하면 된다. 세포내 도입에 사용하는 레플리콘 RNA의 양은 사용하는 도입법에 따라 정하면 되지만, 바람직하게는 1피코그램~100마이크로그램, 보다 바람직하게는 10피코그램~10마이크로그램의 양을 사용한다.
전체 길이 HCV 레플리콘 RNA 복제세포는, 전체 길이 HCV 레플리콘 RNA에 함유되는 선택 마커 유전자 또는 리포터 유전자의 발현을 이용하여 선택할 수 있다. 구체적으로는, 예를 들면 그러한 전체 길이 HCV 레플리콘 RNA의 세포내 도입처리를 실시한 세포를 선택 마커 유전자의 발현에 의해 선택 가능하게 되는 배지에 있어서 배양하면 된다. 혹은, 그러한 전체 길이 HCV 레플리콘 RNA의 세포내 도입처리를 실시한 세포를 배양한 후, 리포터 유전자(예를 들면 형광 단백질)의 발현에 대해서 검출하면 된다.
일례로서, 전체 길이 HCV 레플리콘 RNA에 네오마이신 내성 유전자가 선택 마 커 유전자로서 함유될 경우에는 그 전체 길이 HCV 레플리콘 RNA를 이용하여 일렉트로포레이션 처리한 세포를 배양접시에 파종하고, 12~72시간, 바람직하게는 16~48시간 배양한 후에 배양접시에 G418(네오마이신)을 0.05밀리그램/밀리리터~3.0밀리그램/밀리리터의 농도로 첨가하고, 그 후에 1주에 2회 배양액을 교환하면서 배양을 계속하여, 파종시부터 바람직하게는 10일간~40일간, 보다 바람직하게는 14일간~28일간 배양한 후에 크리스탈 바이올렛으로 생존세포를 염색함으로써, 도입된 전체 길이 HCV 레플리콘 RNA가 복제되어 있는 세포를 콜로니로서 선택할 수 있다.
형성된 콜로니로부터는 통상의 방법에 의해 세포를 클론화할 수 있다. 이렇게 해서 얻어지는 전체 길이 HCV 레플리콘 RNA를 복제하고 있는 세포 클론을 본 명세서에서는 「전체 길이 HCV 레플리콘 RNA 복제세포 클론」이라고 칭한다. 본 발명의 전체 길이 HCV 레플리콘 RNA 복제세포는 전체 길이 HCV 레플리콘 RNA 복제세포 클론을 포함한다.
전체 길이 HCV 레플리콘 RNA 복제세포에 대해서는 복제된 전체 길이 HCV 레플리콘 RNA를 검출하여, 전체 길이 HCV 레플리콘 RNA 중의 선택 마커 유전자 또는 리포터 유전자가 세포의 숙주 게놈 DNA에 도입되어 있지 않은 것을 확인하고, 또한 HCV 단백질의 검출을 행함으로써 실제로 상기 세포 또는 세포 클론이 전체 길이 HCV 레플리콘 RNA를 복제하고 있는 것을 확인할 수 있다.
복제된 전체 길이 HCV 레플리콘 RNA의 검출은 당업자에는 공지의 임의의 RNA 검출법에 따라서 행하면 좋지만, 예를 들면 세포로부터 추출한 토털 RNA에 대해서, 도입된 전체 길이 HCV 레플리콘 RNA에 대하여 특이적인 DNA 단편을 프로브로서 사 용하는 노던 하이브리다이제이션법을 실시함으로써 검출할 수 있다.
또한 전체 길이 HCV 레플리콘 RNA 중의 선택 마커 유전자 또는 리포터 유전자가 세포의 숙주 게놈 DNA에 도입되어 있지 않은 것의 확인은, 한정되는 것은 아니지만, 예를 들면 세포로부터 추출한 게놈 DNA에 대해서 상기 선택 마커 유전자 또는 리포터 유전자 중 적어도 일부를 증폭하는 PCR를 행하고, 그 증폭산물의 유무를 확인함으로써 행할 수 있다. 증폭산물이 확인된 세포에서는, 숙주 게놈 중에 선택 마커 유전자 또는 리포터 유전자가 도입되어 있다고 판단되는 점에서, 전체 길이 HCV 레플리콘 RNA 자체는 복제되어 있지 않을 가능성이 있다. 이 경우, 전체 길이 HCV 레플리콘 RNA가 복제되어 있는지의 여부를 다음에 설명하는 HCV 단백질의 검출에 의해 또한 확인할 수 있다.
HCV 단백질의 검출은, 예를 들면 도입된 전체 길이 HCV 레플리콘 RNA로부터 발현되어야 하는 HCV 단백질에 대한 항체를, 세포로부터 추출한 단백질과 반응시킴으로써 행할 수 있다. 이 방법은 당업자에게는 공지의 임의의 단백질 검출법에 의해 행할 수 있지만, 구체적으로는 예를 들면 세포로부터 추출한 단백질 시료를 니트로셀루로오스막에 블롯팅하고, 그것에 대해서 항HCV 단백질 항체(예를 들면 항NS3 특이적 항체, 또는 C형간염환자로부터 채취한 항혈청)를 반응시키며, 또 그 항HCV 단백질 항체를 검출함으로써 행할 수 있다. 세포로부터 추출한 단백질 중에서 HCV 단백질이 검출되면, 그 세포는 전체 길이 HCV 레플리콘 RNA를 복제하고, HCV 단백질을 발현하고 있는 것이라고 판단할 수 있다.
본 발명의 전체 길이 HCV 레플리콘 RNA 복제세포 또는 전체 길이 HCV 게놈 RNA 복제세포의 바이러스 입자 생산능은, 당업자에게는 공지의 임의의 바이러스 검출법에 따라서 확인하면 된다. 예를 들면 바이러스 입자를 생산하고 있다고 생각되는 세포의 배양상청을 자당밀도 구배에 의해 분획하고, 각 획분의 밀도, HCV 코어 단백질 농도, 및 전체 길이 HCV 레플리콘 RNA 혹은 전체 길이 HCV 게놈 RNA의 양을 측정한 결과, HCV 코어 단백질과 전체 길이 HCV 레플리콘 RNA 혹은 전체 길이 HCV 게놈 RNA의 피크가 일치하고, 또 그 피크가 검출되는 획분의 밀도가 배양상청을 25％ NP40(폴리옥시에틸렌(9)옥틸페닐에테르[Polyoxyethylene(9)Octylphenyl Ether])으로 처리하고나서 분획된 경우의 동 획분의 밀도와 비교해서 가벼울(예를 들면 1.18~1.20㎎) 경우에는, 상기 세포는 바이러스 입자 생산능을 갖는다고 판정할 수 있다.
배양상청 중에 방출된 HCV 바이러스 입자는, 예를 들면 코어 단백질, E1 단백질, 또는 E2 단백질에 대한 항체를 이용하여 검출할 수도 있다. 또, 배양상청 중의 전체 길이 HCV 레플리콘 RNA를, 특이적 프라이머를 사용한 RT-PCR법에 의해 증폭해서 검출함으로써 HCV 바이러스 입자의 존재를 간접적으로 검출할 수도 있다.
4.본 발명의 HCV 입자의 다른 세포로의 감염
본 발명의 HCV 바이러스 입자는 세포(바람직하게는 HCV 허용 세포)로의 감염능을 갖는다. 본 발명은 전체 길이 HCV 레플리콘 RNA 복제세포 또는 전체 길이 HCV 게놈 RNA 복제세포를 배양하고, 얻어진 배양물(바람직하게는 배양상청) 중의 바이러스 입자를 다른 세포(바람직하게는 HCV 허용 세포)에 감염시키는 것을 포함하는 C형간염 바이러스 감염세포를 제조하는 방법에도 관한 것이다. 본 발명에 있어서 HCV 허용 세포란, HCV에 대하여 감염성을 갖는 세포이며, 바람직하게는 간장세포 또는 임파구계 세포이지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. 구체적으로는, 간장세포로서는 초대간장 세포나 Huh7 세포, HepG2 세포, IMY-N9 세포, HeLa 세포, 203 세포 등이 예시되고, 임파구계 세포로서는 Molt4 세포나 HPB-Ma 세포, Daudi 세포 등이 예시되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 전체 길이 HCV 레플리콘 RNA 복제세포에 있어서 생산된 HCV 입자를 세포(예를 들면 HCV 허용 세포)에 감염시키면, 그 감염세포 중에서는 전체 길이 HCV 레플리콘 RNA가 복제되고, 또한 바이러스 입자가 형성된다. 전체 길이 HCV 레플리콘 RNA 복제세포에 있어서 생산된 바이러스 입자에 감염된 세포는 선택 마커 유전자 및/또는 리포터 유전자를 발현하므로, 그 발현을 이용해서 선택 및/또는 검출하는 것이 가능하다. 본 발명의 전체 길이 HCV 레플리콘 RNA 복제세포에 있어서 생산된 바이러스 입자를 세포에 감염시킴으로써, 전체 길이 HCV 레플리콘 RNA가 세포 내에서 복제되어 바이러스 입자를 더 제조할 수 있다.
또한, 본 발명의 전체 길이 HCV 게놈 RNA 복제세포에 있어서 생산된 HCV 입자를 세포(예를 들면 HCV 허용 세포)에 감염시킴으로써, 그 감염세포 중에서 전체 길이 HCV 게놈 RNA가 복제되어 바이러스 입자가 형성된다. 본 발명의 전체 길이 HCV 게놈 RNA 복제세포에 있어서 생산된 바이러스 입자를 세포에 감염시킴으로써, 전체 길이 HCV 게놈 RNA가 세포 내에서 복제되어 바이러스 입자를 더 제조할 수 있다.
본 발명의 전체 길이 HCV 레플리콘 RNA 복제세포 또는 전체 길이 HCV 게놈 RNA 복제세포에 있어서 생산된 HCV 바이러스 입자는, 침팬지 등의 HCV 바이러스에 감염될 수 있는 동물에 감염시켜서 HCV유래의 간염을 일으킬 수 있다.
5.본 발명의 다른 실시형태
본 발명의 전체 길이 HCV 레플리콘 RNA 복제세포에서는 전체 길이 HCV 레플리콘 RNA가 고효율로 복제된다. 또, 본 발명의 전체 길이 HCV 게놈 RNA 복제세포에서도 전체 길이 HCV 게놈 RNA가 고효율로 복제된다. 따라서, 본 발명의 전체 길이 HCV 레플리콘 RNA 복제세포 또는 전체 길이 HCV 게놈 RNA 복제세포를 이용하여, 전체 길이 HCV 레플리콘 RNA 또는 전체 길이 HCV 게놈 RNA를 고효율로 제조할 수 있다.
본 발명에서는 전체 길이 HCV 레플리콘 RNA 복제세포를 배양하고, 배양물(배양세포 및/또는 배양 배지)로부터 RNA를 추출하여 그것을 전기영동법에 의해, 분리된 전체 길이 HCV 레플리콘 RNA를 단리 정제함으로써 전체 길이 HCV 레플리콘 RNA를 제조할 수 있다. 전체 길이 HCV 게놈 RNA 복제세포를 사용한 경우에도 같은 방법으로 전체 길이 HCV 게놈 RNA를 제조할 수 있다. 이렇게 해서 제조되는 RNA는 C형간염 바이러스의 전체 길이 게놈서열을 함유한다. 이 경우, C형간염 바이러스의 전체 길이 게놈서열은 선택 마커 유전자 및/또는 리포터 유전자서열에 IRES 서열에 의해 분단되어 있어도 된다. C형간염 바이러스의 전체 길이 게놈서열을 함유하는 RNA의 제조방법이 제공됨으로써 C형간염 바이러스 게놈에 관하여 보다 상세한 분석이 가능하게 된다.
또한 본 발명의 전체 길이 HCV 레플리콘 RNA 복제세포 또는 전체 길이 HCV 게놈 RNA 복제세포는, HCV 단백질을 제조하기 위해 바람직하게 사용할 수 있다. HCV 단백질의 제조는 당업자에게 주지의 임의의 방법에 의해 행하면 되지만, 예를 들면 전체 길이 HCV 레플리콘 RNA 또는 전체 길이 HCV 게놈 RNA를 세포에 도입해서 재조합형 세포를 제조하고, 상기 재조합형 세포를 배양하여 얻어지는 배양물(배양세포 및/또는 배양 배지)로부터 통상의 방법에 의해 단백질을 회수함으로써 행하면 된다.
또한 본 발명의 HCV 바이러스 입자는 간세포지향성을 가질 수 있다. 그 때문에 본 발명의 전체 길이 HCV 레플리콘 RNA를 사용하여 간세포지향성 바이러스 벡터를 제조할 수 있다. 이 바이러스 벡터는 유전자 치료용으로 바람직하게 사용된다. 본 발명에서는 외래유전자를 코드하는 RNA를 전체 길이 HCV 레플리콘 RNA 또는 전체 길이 HCV 게놈 RNA에 도입하고, 그 RNA를 세포에 도입함으로써 상기 외래유전자를 세포 중에 도입하여 세포 내에서 복제시키며, 또한 발현시킬 수 있다. 또한, 전체 길이 HCV 레플리콘 RNA 또는 전체 길이 HCV 게놈 RNA 중의 E1 단백질 코드 서열, 및/또는 E2 단백질 코드 서열을, 다른 생물종유래의 바이러스의 외각단백질로 변환한 RNA를 제조함으로써 그 RNA를 여러 가지 생물종의 세포에 감염시킬 수도 있게 된다. 이 경우에도 전체 길이 HCV 레플리콘 RNA 또는 전체 길이 HCV 게놈 RNA에 더 외래유전자를 도입해서 그것을 상기 외래유전자를 간세포에서 발현시키기 위한 간세포지향성 바이러스 벡터로서 사용할 수 있다.
본 발명은 서열번호 12에 나타내는 염기서열로 이루어지는 RNA에 외래유전자를 코드하는 RNA를 삽입하고, 그것을 세포에 도입하여 그 세포를 배양해서 바이러스 입자를 생산시키는 것을 포함하는, 외래유전자를 함유하는 바이러스 벡터를 제조하는 방법에도 관한 것이다.
본 발명은 본 발명에 따른 HCV 입자 또는 그 일부분을 백신 항원으로서 함유하는 C형간염 백신, 및 본 발명에 따른 HCV 입자 또는 그 일부분을 항원으로서 사용하여 C형간염 백신을 제조하는 방법도 제공한다.
구체적으로는, 제작된 HCV 입자를 직접 백신으로서 사용할 수도 있고, 해당 분야에서 이미 알려진 방법에 의해 약독화 또는 불활화해서 사용할 수도 있다. 예를 들면, 조제한 HCV 입자를 컬럼 크로마토그래피, 여과, 원심 등에 의해 정제함으로써 HCV 백신 원액을 얻은 후, 이러한 원액으로부터 약독생 HCV 백신 혹은 불활화 HCV 백신을 조제하면 된다. 또, 바이러스의 불활화는 포르말린, β-프로피오락톤, 글루타르디알데히드 등의 불활화제를 예를 들면 바이러스 부유액에 첨가해서 혼합하고, 바이러스와 반응시킴으로써 달성할 수 있다(Appaiahgari et al.,백신,(2004) 22(27-28),p.3669-3675).
본 발명의 백신의 제조에는, HCV 레플리콘 RNA에 공지의 기술을 이용해서 변이를 도입하여 병원성을 원약(原弱) 혹은 소실시킨 것을 사용할 수도 있다.
본 발명의 백신은 용액 또는 현탁액 중 어느 하나로서 투여 가능하게 조제된다. 액체 중의 용해 또는 현탁에 적합한 고형물의 형태로 조제할 수 있다. 조제물은 유탁되거나 또는 리포솜으로 캡슐화될 수 있다. HCV 입자 등의 활성 면역원성 성분은 의약상 허용되는 활성 성분에 적합한 부형제가 종종 혼합된다. 적절한 부형제로는, 예를 들면 물, 생리식염수, 포도당, 글리세롤, 에탄올 등 및 그들의 혼합 물이 있다. 또, 원한다면, 백신은 소량의 보조제(예를 들면 가습제 또는 유화제), pH완충제, 및/또는 백신의 효능을 높이는 애쥬번트를 함유할 수 있다. 유효할 수 있는 애쥬번트의 예는 한정되지 않지만, 이하를 포함한다. 수산화알루미늄, N-아세틸-무라밀-L-스레오닐-D-이소글루타민(thr-MDP), N-아세틸-노르-무라밀-L-아라닐-D-이소글루타민(CGP11637, nor-MDP라고 칭해짐), N-아세틸무라밀-L-아라닐-D-이소글루타미닐-L-알라닌-2-(1'-2'-디팔미토일-sn-글리세로-3-히드록시포스포릴옥시)-에틸아민(CGP19835A, MTP-PE라고 칭해짐), 및 RIBI. RIBI는 박테리아로부터 추출한 3성분, 즉 모노포스포릴리피드A, 트레할로스디미콜레이트, 및 세포벽 골격(HPL+TDM+CWS)을 2% 스쿠알렌/Tween(등록상표) 80에멀젼 중에 함유하고 있다. 애쥬번트의 효능은, HCV 입자로 구성되는 백신을 투여함으로써 생기는 이 면역원성 HCV 입자에 대한 항체의 양을 측정함으로써 결정될 수 있다.
본 백신은 통상 비경구적으로 예를 들면 피하주사 또는 근육내 주사와 같은 주사에 의해 투여된다. 다른 투여경로에 적합한 별도의 제형으로서 좌약, 및 경우에 따라 경구제제가 예시된다.
원하는 바에 따라, 애쥬번트 활성을 갖는 1이상의 화합물을 HCV 백신에 첨가할 수 있다. 애쥬번트는 상기 면역계의 비특이적 자극인자이다. 그들은 HCV 백신에 대한 숙주의 면역응답을 증강한다. 상기 기술분야에서 공지의 애쥬번트의 구체예로서는 프로인트 완전 및 불완전 애쥬번트, 비타민E, 비이온 블록 중합체, 무라밀디펩티드, 사포닌, 광유, 식물유 및 Carbopol이 예시된다. 점막적용에 특히 적합한 애쥬번트로서는, 예를 들면 대장균(E.coli) 역열성 독소(LT) 또는 콜레라(Cholera) 독소(CT)가 예시된다. 다른 적당한 애쥬번트로서는, 예를 들면 수산화알루미늄, 인산알루미늄 또는 산화알류미늄, 유성 유제(예를 들면, Bayol(등록상표) 또는 Marcol52(등록상표)의 것), 사포닌 또는 비타민E 솔루빌리세이트가 예시된다. 바람직한 형태에 있어서는 본 발명의 백신은 애쥬번트를 함유한다.
예를 들면 피하, 피내, 근육내, 정맥내에 투여하는 주사제에 있어서, 본 발명의 HCV 백신과 함께 함유되는 의약상 허용되는 담체 또는 희석제의 다른 구체예로서는 안정화제, 탄수화물(예를 들면 소르비톨, 만니톨, 전분, 자당, 글루코오스, 덱스트란), 알부민 또는 카세인 등의 단백질, 소혈청 또는 탈지유 등의 단백질함유 물질, 및 버퍼(예를 들면 인산 버퍼) 등이 예시된다.
좌약에 사용되는 종래의 결합제 및 담체에는, 예를 들면 폴리알킬렌글리콜 또는 트리글리세리드가 함유될 수 있다. 좌약은 활성성분을 0.5%에서 50%까지의 범위에서, 바람직하게는 1%에서 20%까지의 범위에서 함유되는 혼합물로 형성할 수 있다. 경구제제는 통상 사용되는 부형제를 함유해도 된다. 이 부형제로서는, 예를 들면 제약등급의 만니톨, 락토제, 전분, 스테아린산마그네슘, 사카린나트륨, 셀룰로오스, 탄산마그네슘 등이 예시된다.
본 발명의 백신은 용액, 현탁액, 정제, 환제, 캡슐제, 지속방출제제, 또는 분제의 제형을 취할 수 있고, 10%~95%, 바람직하게는 25%~70%의 활성 성분(바이러스 입자 또는 그 일부분)을 함유한다.
본 백신은 투여제형에 적합한 방법으로, 그리고 예방 및/또는 치료효과가 있는 양으로 투여된다. 투여되어야 하는 양은 통상 1회의 투여당 항원을 0.01㎍에서 100,000㎍까지의 범위이며, 이것은 처치되는 환자, 그 환자의 면역계에서의 항체합성능, 및 원하는 방어의 정도에 의존하고, 경구, 피하, 피내, 근육내, 정맥내 경로 등의 투여경로에도 의존한다.
본 백신은 단독투여 스케줄에서, 또는 바람직하게는 복합투여 스케줄에서 주어질 수 있다. 복합투여 스케줄에서는 접종의 개시시기에 1~10회의 개별투여를 행하고, 계속해서 면역응답을 유지하는 및 또는 강화하기 위해 필요하게 되는 시간간격으로, 예를 들면 2회째의 투여로 해서 1~4개월 후에 별도의 투여를 행할 수 있다. 필요하면, 수개월 후에 계속해서 투여를 행할 수 있다. 투여계획도 또한, 적어도 부분적으로는 개개의 환자의 필요성에 따라 결정되고, 의사의 판단에 의존한다.
또한, 면역원성 HCV 입자를 함유하는 백신은 다른 면역제어제(예를 들면 면역 글로불린)와 함께 투여해도 된다.
HCV 입자 백신은 건강한 보통사람에게 투여해서, 건강한 보통사람에게 HCV에 대한 면역응답을 유도함으로써 새롭게 생길 수 있는 HCV 감염에 대하여 예방적으로 사용할 수도 있다. 또, HCV 입자 백신을 HCV에 감염된 환자에 투여하고, 생체 내에 HCV에 대한 강한 면역반응을 유도함으로써 HCV를 배제하는 치료적 백신으로서 사용할 수도 있다.
본 발명의 전체 길이 HCV 레플리콘 RNA 복제세포 또는 전체 길이 HCV 게놈 RNA 복제세포, 또는 그들의 세포에 있어서 생산되는 바이러스 입자를 감염시킨 C형간염 바이러스 감염세포를, 예를 들면 C형간염 바이러스의 복제, 바이러스 입자의 재구축, 바이러스 입자의 방출을 촉진 또는 억제하는 물질(항C형간염 바이러스 물질)을 스크리닝하기 위한 시험계로서 사용할 수도 있다. 구체적으로는, 예를 들면 피검물질의 존재 하에서 그들 세포를 배양하고, 얻어지는 배양물 중의 전체 길이 HCV 레플리콘 RNA 혹은 전체 길이 HCV 게놈 RNA 또는 바이러스 입자를 검출하며, 그 피검물질이 레플리콘 RNA 혹은 전체 길이 HCV 게놈 RNA의 복제 또는 바이러스 입자의 형성 혹은 방출을 촉진 또는 억제하는지의 여부를 판정함으로써, C형간염 바이러스의 증식을 촉진 또는 억제하는 물질을 스크리닝할 수 있다. 이 경우, 배양물 중의 전체 길이 HCV 레플리콘 RNA 혹은 전체 길이 HCV 게놈 RNA의 검출은, 상기 세포로부터 추출한 RNA 중의 전체 길이 HCV 레플리콘 RNA 혹은 전체 길이 HCV 게놈 RNA의 양, 비율 혹은 유무를 측정하는 것에 의한 것으로서 좋다. 배양물(주로 배양상청) 중의 바이러스 입자의 검출은 배양상청 중에 함유되는 HCV 단백질의 양, 비율 혹은 유무를 검출하는 것으로서 좋다.
또한 본 배양물 중의 바이러스 입자를 검출함으로써, HCV 감염환자 혈청으로부터 정제한 면역 글로불린이 본 발명에 의한 HCV 바이러스 입자의 감염을 저지하는 능력을 갖는지의 여부를 검토할 수 있다. 이 시험에 있어서는, 본 발명의 HCV 바이러스 입자에 의해 면역된 생쥐, 쥐, 토끼 등의 혈청을 사용해도 된다. HCV의 부분단백질, HCV 유전자 등에 의한 면역을 이용해도 된다. 항체분자 이외의, 감염을 저지할 수 있는 다른 물질에 대해서도 이 시험을 마찬가지로 적용할 수 있다.
본 발명의 HCV 바이러스 입자에 대하여 생산되는 본 발명의 항체에는 폴리클로날 항체 및 모노클로날 항체를 포함한다. 폴리클로날 항체가 바람직할 경우, 우선, 선택된 포유류(예를 들면 생쥐, 토끼, 염소, 양, 말 등)를 본 발명의 HCV 입자로 면역감작한다. 감작동물유래의 혈청을 채집하고, 이미 알려진 방법에 따라 처리한다. HCV 에피토프에 대한 폴리클로날 항체를 함유하는 혈청이 다른 항원에 대한 항체를 함유할 경우에는, 이 폴리클로날 항체를 면역친화 크로마토그래피에 의해 정제하면 된다. 폴리클로날 항혈청을 생산시키는 방법 및 그것을 처리하는 방법은 해당 분야에서 이미 알려져 있다. 폴리클로날 항체는 이미 HCV에 감염된 포유류로부터 단리해도 된다.
HCV 에피토프에 대한 모노클로날 항체도 또한, 당업자에 의해 용이하게 제조될 수 있다. 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마를 제조하는 일반적인 방법은 두루 알려져 있다. 예를 들면 Current Protocols in Immunology(John Wiley & Sons,Inc.)에 기재된 방법을 이용할 수 있다.
모노클로날 항체생산 세포주는 세포융합에 의해 생성해도 좋고, 또 종상유전자 DNA에 의한 B임파구의 직접 형질 전환 또는 Epstein-Barr 바이러스에서의 형질이입과 같은 다른 방법에 의해서 생성해도 된다.
이들 방법에 의해 얻어진 모노클로날 항체나 폴리클로날 항체는 HCV의 진단이나 치료, 예방에 유용하다.
본 발명의 HCV 입자를 이용하여 제조된 항체는 의약상 허용되는 용해제, 첨가제, 안정화제, 버퍼 등과 함께 투여된다. 투여경로는 어떤 투여경로라도 좋지만, 바람직하게는 피하, 피내, 근육내 투여이며, 보다 바람직하게는 정맥내 투여가 바람직하다.
본 발명의 전체 길이 HCV 레플리콘 RNA 복제세포 또는 전체 길이 HCV 게놈 RNA 복제세포에 있어서 생산된 HCV 입자와 HCV 허용 세포를, HCV의 세포로의 결합을 촉진 또는 억제하는 물질을 스크리닝하기 위한 시험계로서 사용할 수도 있다. 구체적으로는 예를 들면, 피검물질의 존재 하에서 본 발명의 전체 길이 HCV 레플리콘 RNA 복제세포에 있어서 생산된 HCV 입자와 함께 HCV 허용 배양하고, 얻어지는 배양물 중의 전체 길이 HCV 레플리콘 RNA 또는 바이러스 입자를 검출하며, 그 피검물질이 레플리콘 RNA의 복제 또는 바이러스 입자의 형성을 촉진 또는 억제하는지의 여부를 판정함으로써, C형간염 바이러스의 증식을 촉진 또는 억제하는 물질을 스크리닝할 수 있다.
이러한 전체 길이 HCV 레플리콘 RNA 혹은 전체 길이 HCV 게놈 RNA 또는 바이러스 입자의 검출은 상기의 방법 또는 후술의 실시예에 따라 행할 수 있다. 상기 시험계는 C형간염 바이러스 감염의 예방제, 치료제 혹은 진단제의 제조 또는 평가를 위해서도 사용할 수 있다.
구체적으로는, 본 발명의 상기 시험계의 이용예로서는 이하가 예시된다.
(1)HCV의 증식 및 감염을 억제하는 물질의 탐색
HCV의 증식 및 감염을 억제하는 물질로서는, 예를 들면 직접적 혹은 간접적으로 HCV의 증식 및 감염에 영향을 미치는 유기 화합물, 혹은 HCV 게놈 혹은 그 상보쇄의 표적서열에 하이브리다이즈함으로써 HCV의 증식 혹은 HCV 단백질의 번역에 직접적 또는 간접적으로 영향을 미치게 하는 안티센스 올리고뉴클레오티드 등이 예시된다.
(2)세포배양 중에서 항바이러스작용을 갖는 각종 물질의 평가
상기 각종 물질로서는 합리적 드래그 디자인 또는 하이스루풋 스크리닝을 이용하여 얻어진 물질(예를 들면 단리 정제된 효소) 등이 예시된다.
(3)HCV에 감염된 환자의 치료를 위한 신규공격 표적의 분류
예를 들면 HCV 바이러스 증식을 위해 중요한 역활을 다하는 숙주세포성 단백질을 분류하기 위해, 본 발명에 따른 전체 길이 HCV 레플리콘 RNA 복제세포 또는 전체 길이 HCV 게놈 RNA 복제세포를 사용할 수 있다.
(4)HCV 바이러스의 약제 등에 대한 내성획득능의 평가 및 상기 내성에 관한 변이의 분류
(5)C형간염 바이러스 감염의 진단약 또는 치료약의 개발, 제조 및 평가를 위해 사용 가능한 항원으로서의 바이러스 단백질의 제조
(6)C형간염 바이러스 감염의 백신의 개발, 제조 및 평가를 위해 사용 가능한 항원으로서의 바이러스 단백질 및 약독화 HCV의 제조
(7)C형간염 바이러스 감염의 진단 또는 치료용 폴리클로날 항체 혹은 모노클로날 항체 및 폴리클로날 항체의 제조.
본 발명을 이하의 실시예 및 도면에 기초하여 더욱 구체적으로 설명한다. 단, 본 발명의 기술적 범위는 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
[실시예1] 전체 길이 HCV 게놈 RNA유래의 전체 길이 HCV 레플리콘 RNA의 제조
(A)발현 벡터의 구축
극증간염 환자로부터 분리한 C형간염 바이러스인 JFH-1주(유전자형2a)의 게 놈 전체 길이 cDNA를 포함하는 DNA(JFH-1 클론)을, pUC19 플라스미드 중에서 T7 RNA 프로모터 서열의 하류에 삽입한 플라스미드 DNA를 제조했다.
구체적으로는, JFH-1주의 바이러스 RNA를 증폭한 RT-PCR 단편을 pGEM-T EASY vector(Promega)에 클로닝해서 pGEM1-258, pGEM44-486, pGEM317-849, pGEM617-1323, pGEM1141-2367, pGEM2285-3509, pGEM3471-4665, pGEM4547-5970, pGEM5883-7003, pGEM6950-8035, pGEM7984-8892, pGEM8680-9283, pGEM9231-9634 및 pGEM9594-9678의 각 플라스미드 DNA를 얻었다(비특허문헌6을 참조). 각 플라스미드에 함유되는 바이러스 게놈 RNA유래의 cDNA를 PCR법 및 제한효소를 이용하여 서로 연결시켜서 전체 길이의 바이러스 게놈 cDNA를 클로닝했다. 전체 길이의 바이러스 게놈의 상류에 T7R RNA 프로모터 서열을 삽입했다. 이렇게 해서 구축된 플라스미드 DNA를 이하 pJFH1이라고 칭한다(도 1 상단). 또, 상기 JFH-1 클론의 제조에 대해서는 특허문헌1 및 비특허문헌3에 기재되어 있다. 또한 JFH-1 클론의 전체 길이 cDNA의 염기서열은 국제 DNA 데이터 뱅크(DDBJ/EMBL/GenBank)의 액세션 번호:AB047639에 등록되어 있다.
다음에, 플라스미드 DNA인 pJFH1의 5'비번역영역과 core영역 사이에 EMCV-IRES(뇌심근염 바이러스의 내부 리보솜 결합부위) 및 네오마이신 내성 유전자(neo;네오마이신 포스포트랜스페라제 유전자라고도 칭함)를 삽입하여 플라스미드 DNA인 pFGREP-JFH1을 구축했다(도 1의 하단). 이 구축순서는 기보(비특허문헌4)를 따랐다. 또, pJFH1 및 pFGREP-JFH1 중의 NS5B 영역에 대하여, 상기 영역에 코드되는 RNA 폴리메라제의 활성중심에 상당하는 아미노산 모티브 GDD를 GND로 변이시키는 돌연변이를 도입해서, 돌연변이 플라스미드 클론 pJFH1/GND, 및 pFGREP-JFH1/GND도 제조했다. 돌연변이 클론 pJFH1/GND 및 pFGREP-JFH1/GND는, 그것에 코드되는 NS5B 단백질의 활성부위의 아미노산서열이 변이되어 있으므로 레플리콘 RNA를 복제하는데 필요한 활성 NS5B 단백질을 발현할 수 없다.
또한, 리포터 유전자 도입 발현 벡터로서 pFGREP-JFH1의 415에서 420번의 MluI사이트와 2075에서 2082번의 PmeI사이트 사이에 루시페라제 유전자를 도입하고, pFGREP-JFH1의 네오마이신 내성 유전자를 루시페라제 유전자로 치환한 pFGREP-JFH1/Luc를 제조했다. 또, pFGREP-JFH1/Luc의 10933번을 G으로부터 A로 변이시키고, NS5b의 RNA 폴리메라제의 활성중심의 GDD 모티브를 GND로 바꾼 변이체 pFGREP-JFH1/Luc/GND를 제조했다.
pFGREP-JFH1의 415에서 420번의 MluI사이트와 1142에서 1149번의 PmeI사이트 사이에 녹색형광 단백질 유전자를 도입하고, pFGREP-JFH1의 네오마이신 내성 유전자를 녹색형광 단백질 유전자로 치환한 pFGREP-JFH1/EGFP를 제조했다. 또, pFGREP-JFH1/EGFP의 10000번을 G에서 A로 변이시키고, NS5b의 RNA 폴리메라제의 활성중심의 GDD 모티브를 GND로 바꾼 변이체 pFGREP-JFH1/EGFP/GND를 제조했다.
pFGREP-JFH1의 415에서 420번의 MluI사이트와 1982에서 1989번의 PmeI사이트 사이에 분비형 태반 알칼리성 포스파타제 유전자를 도입하고, pFGREP-JFH1의 네오마이신 내성 유전자를 분비형 태반 알칼리성 포스파타제 유전자로 치환한 pFGREP-JFH1/SEAP를 제조했다. 또, pFGREP-JFH1/SEAP의 10840번을 G에서 A로 변이시키고, NS5b의 RNA 폴리메라제의 활성중심의 GDD 모티브를 GND로 바꾼 변이체 pFGREP- JFH1/SEAP/GND를 제조했다.
(B)전체 길이 HCV 게놈 RNA와 전체 길이 HCV 레플리콘 RNA의 제조
전체 길이 HCV 게놈 RNA 합성 및 전체 길이 HCV 레플리콘 RNA 합성에 사용하는 주형 DNA를 제조하기 위해, 상기와 같이 구축한 발현 벡터 pJFH1, pJFH1/GND, pFGREP-JFH1, pFGREP-JFH1/GND를 각각 제한효소 XbaI로 절단했다. 이어서, 이들 XbaI 절단단편의 각각에 대해서 10~20㎍을 50μl의 반응액 중에 함유시켜, Mung Bean Nuclease 20 U를 이용하여 30℃에서 30분간 인큐베이트함으로써 더 처리했다. Mung Bean Nuclease는 이중쇄 DNA 중의 단일쇄부분을 선택적으로 분해하는 반응을 촉매하는 효소이다. 통상, 상기 XbaI 절단단편을 그대로 주형으로서 사용하여 RNA 합성을 행하면, XbaI의 인식서열의 일부인 CUAG의 4염기가 3'말단에 더 부가된 레플리콘 RNA가 합성되어버린다. 그래서 본 실시예에서는, XbaI 절단단편을 Mung Bean Nuclease로 처리함으로써 XbaI 절단단편으로부터 CTAG의 4염기를 제거했다. 이후, XbaI 절단단편을 함유하는 Mung Bean Nuclease처리 후의 용액에 대해서, 통상법에 따른 단백질 제거 처리에 의해 CTAG의 4염기가 제거된 XbaI 절단단편을 정제하여 이것을 주형 DNA로 했다.
다음에 이 주형 DNA로부터 T7 RNA 폴리메라제를 이용하여 RNA를 in vitro 합성했다. 이 RNA 합성에는 Ambion사의 MEGAscript를 사용했다. 주형 DNA를 0.5~1.0마이크로그램 함유하는 반응액 20μl를 제조업자의 사용설명서에 따라 반응시켰다.
RNA 합성종료 후, 반응용액에 DNase(2U)를 첨가하여 37℃에서 15분간 반응시킨 후, 또한 산성 페놀에 의한 RNA 추출을 행해서 주형 DNA를 제거했다. 이렇게 해 서 pJFH1, pJFH1/GND, pFGREP-JFH1, pFGREP-JFH1/GND에 유래하는 상술의 주형 DNA로부터 합성한 RNA를 각각 rJFH1, rJFH1/GND, rFGREP-JFH1, rFGREP-JFH1/GND로 명명했다. 이들 RNA의 염기서열을 rJFH-1, rFGREP-JFH1에 대해서는 서열번호 12 및 13, rJFH1/GND, rFGREP-JFH1/GND에 대해서는 서열번호 14 및 15에 각각 나타낸다. rJFH1은 JFH-1주의 전체 길이 HCV 게놈과 같은 서열구조를 갖는, 본 발명의 전체 길이 HCV 게놈 RNA의 일례이다. rFGREP-JFH1은 본 발명에 있어서의 전체 길이 HCV 레플리콘 RNA의 일례이다.
계속해서, 상술과 같이 제조한 발현 벡터 pFGREP-JFH1/Luc, pFGREP-JFH1/Luc/GND, pFGREP-JFH1/EGFP, pFGREP-JFH1/EGFP/GND, pFGREP-JFH1/SEAP, pFGREP-JFH1/SEAP/GND를 각각 주형으로서 사용하여 HCV 레플리콘 RNA인 rFGR-JFH1/Luc(서열번호 21), rFGR-JFH1/Luc/GND(서열번호 22), rFGR-JFH1/EGFP(서열번호 23), rFGR-JFH1/EGFP/GND(서열번호 24), rFGR-JFH1/SEAP(서열번호 25), rFGR-JFH1/SEAP/GND(서열번호 26)를 상기와 같은 방법으로 제조했다.
[실시예2]세포 내에 있어서의 전체 길이 HCV 게놈 RNA 복제세포와 바이러스 입자생산
(C)세포 내에 있어서의 전체 길이 HCV 게놈 RNA의 복제와 바이러스 입자의 생산
상기와 같이 합성한 전체 길이 HCV 게놈 RNA(rJFH1, rJFH1/GND)의 각각을 여러 가지 양으로 Huh7 세포로부터 추출한 토털 세포성 RNA와 혼합해서 RNA 총량이 10㎍으로 되도록 조제했다. 이어서 그 혼합 RNA를 일렉트로포레이션법에 의해 Huh7 세포에 도입했다. 일렉트로포레이션 처리를 행한 Huh7 세포를 배양접시에 파종하고, 12시간, 24시간, 48시간 및 72시간 배양한 후에 세포를 회수해서 세포로부터 RNA를 추출하여 노던 블롯으로 해석했다. 노던 블롯 해석은 Molecular Cloning,A laboratory Manual,2nd edition,J.Sambrook,E.F.Fritsch,T.Maniatis저, Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)의 기재에 따라 행했다. 구체적으로는, 배양 후의 세포로부터 추출한 RNA를 변성 아가로우스 전기영동에 제공하고, 영동종료 후에 RNA를 양전하 나일론막에 전사했다. pJFH1로부터 제조한 32P라벨한 DNA 또는 RNA 프로브를 상기와 같이 막에 전사한 RNA에 대하여 하이브리다이제이션시키고, 이어서 그 막을 세정하여 그것을 필름에 감광시킴으로써 JFH-1 클론의 전체 길이 HCV 게놈 RNA에 특이적인 RNA 밴드를 검출했다.
도 2에 나타내는 바와 같이 rJFH1/GND를 트랜스펙션한 경우, 트랜스펙션 4시간 후에 있어서 도입한 RNA 밴드는 약한 시그널로서 확인할 수 있었지만, 시간의 경과와 함께 시그널은 감약되어 24시간 후에는 밴드의 시그널을 거의 확인할 수 없었다. 한편, rJFH1을 트랜스펙션한 경우, 트랜스펙션의 4시간 후~12시간 후에는 도입한 RNA 밴드의 시그널의 강도는 rJFH1/GND를 도입한 경우와 마찬가지로 일단 감약되었지만, 24시간이후에는 뚜렷한 RNA 밴드의 시그널을 확인할 수 있었다. 확인된 시그널은 HCV 게놈 RNA에 특이적이었다. 즉 도입한 전체 길이 HCV 게놈 RNA의 일부가 복제 증식된 것으로 생각되었다. RNA 복제효소인 NS5B의 활성 모티브를 변이시킨 rJFH1/GND에서는 복제는 보여지지 않고, NS5B의 활성이 전체 길이 HCV 게놈 RNA의 복제에 중요한 것이 나타내어졌다. 한편, 지금까지 분리된 H77주(비특허문헌7), J6주(비특허문헌8)나 본 발명자들이 만성 간염으로부터 분리한 JCH1주(비특허문헌6) 등의 C형간염 바이러스주에 유래하는 전체 길이 HCV 게놈 RNA에 대해서도 같은 실험을 행했지만, 이들 주에서는 전체 길이 HCV 게놈 RNA의 복제는 전혀 확인할 수 없었다.
(D)트랜스펙션 세포배양액 중의 HCV 바이러스 입자의 검출
상기에 따라 일렉트로포레이션 처리를 행한 Huh7 세포를 배양접시에 파종하고, 12시간, 24시간, 48시간, 및 72시간 배양한 후, 배양상청 중의 HCV 코어 단백질을 측정했다. 측정은 오르소 HCV 항원 IRMA 테스트에 의해 행했다(비특허문헌9). 도 3에 나타내는 바와 같이, rJFH1을 트랜스펙션해서 48시간 후 및 72시간 후의 배양상청 중에 코어 단백질이 검출되었다. 이 코어 단백질이 바이러스 입자로서 분비되어 있는지의 여부를 확인하기 위해, rJFH1을 트랜스펙션한 72시간 후의 배양액을 자당밀도 구배에 의해 분획했다. 60%(중량/중량) 자당용액(50mM Tris pH7.5/0.1M NaCl/1mM EDTA에 용해) 2ml, 50% 자당용액 1ml, 40% 자당용액 1ml, 30% 자당용액 1ml, 20% 자당용액 1ml, 10% 자당용액 1ml를 원심 튜브에 중층하고, 또한 그 위에 샘플의 배양상청을 4ml 중층했다. 이것을 배크만 로터S W41Ti로 400,000RPM, 4℃, 16시간 원심했다. 원심종료 후 원심 튜브의 바닥으로부터 0.5ml씩 분획 회수했다. 각 분획의 밀도, HCV 코어 단백질 농도, 전체 길이 HCV 게놈 RNA량을 정량했다. 전체 길이 HCV 게놈 RNA의 정량적 RT-PCR에 의한 검출은 Takeuchi T, Katsume A, Tanaka T, Abe A, Inoue K, Tsukiyama-Kohara K, Kawaguchi R, Tanaka S, Kohara M. Real-Time detection system for quantification of Hepatitis C virus genome. Gastroenterology 116:636-642(1999)에 따라 전체 길이 HCV 게놈 RNA의 5'비번역영역의 RNA를 검출함으로써 행했다. 구체적으로는, 세포로부터 추출한 RNA에 함유되는 전체 길이 HCV 게놈 RNA를 합성 프라이머, R6-130-S17:5'-CGGGAGAGCCATAGTGG-3'(서열번호 16), R6-290-R19:5'-AGTACCACAAGGCCTTTCG-3'(서열번호 17), TaqMan Probe:R6-148-S21FT,5'-CTGCGGAACCGGTGAGTACAC-3'(서열번호 18)와 EZ rTth RNA PCR kit를 이용하여 PCR 증폭하고, 이어서 ABI Prism 7700 sequence detector system에 의해 검출했다.
도 4에 나타내는 바와 같이, 11번의 프랙션에서 코어 단백질과 전체 길이 HCV 게놈 RNA의 피크가 일치했다. 이 프랙션의 밀도는 약 1.18mg/ml이며, 지금까지 보고되어 있는 코어 단백질과 핵산의 결합물보다 가벼운 비중이었다. 또, 배양상청을 0.25% NP40으로 처리한 후에 같은 분획을 행하면, 코어 단백질과 전체 길이 HCV 게놈 RNA의 피크는 비중 약 1.28mg/ml로 시프트했다. 즉, NP40 처리에 의해 지질을 함유하는 비중의 가벼운 표면막이 바이러스 입자로부터 박리되어서 핵산과 코어 단백질만의 코어 입자로 된 결과, 비중이 무거워졌다고 생각되었다. 이상의 결과로부터, rJFH1을 Huh7 세포로 트랜스펙션함으로써 세포 내에서 전체 길이 HCV 게놈 RNA가 복제된 것, 또한 바이러스 입자가 형성되어 배양상청 중에 분비된 것이 밝혀졌다.
[실시예3]
(E)전체 길이 HCV 레플리콘 RNA 복제세포의 제조 및 세포 클론의 수립
실시예1에서 제조한 rFGREP-JFH1 및 rFGREP-JFH1/GND를 실시예2와 마찬가지로 Huh7 세포로 트랜스펙션하여 전체 길이 HCV 레플리콘 RNA 복제세포의 제조를 행하고, 또 전체 길이 HCV 레플리콘 RNA 복제세포 클론의 수립을 시험했다.
우선, rFGREP-JFH1 및 rFGREP-JFH1/GND의 각각을 Huh7 세포로 트랜스펙션한 후, 배양접시에 그 세포를 파종했다. 16시간에서 24시간 배양한 후에 G418을 여러 가지 농도로 첨가했다. 1주에 2회 배양액을 교환하면서 배양을 계속했다. 21일간 배양한 후, 크리스탈 바이올렛으로 생존세포를 염색했다. 염색되는 콜로니수를 계측하여, 트랜스펙션한 RNA 중량당 얻어진 콜로니수를 계산했다. 또, 일부의 배양접시에서는 생존세포의 콜로니를 클론화해서 배양을 계속했다. 클론화된 세포로부터 RNA, 게놈 DNA, 단백질을 각각 추출한 후, 전체 길이 HCV 레플리콘 RNA의 검출, 네오마이신 내성 유전자의 게놈 DNA로의 도입의 유무, HCV 단백질의 발현을 검토했다. 이들의 결과의 상세는 하기에 나타낸다.
(F)콜로니 형성능
상기의 트랜스펙션의 결과, 트랜스펙션한 레플리콘 RNA 1㎍당 콜로니 형성능은 rFGREP-JFH1을 트랜스펙션한 Huh7 세포에서는, G418 농도가 1.0mg/ml인 경우, 368 CFU(Colony Forming Unit;콜로니 형성단위)/㎍?RNA였다(도 5의 좌측). 이것에 대하여 rFGREP-JFH1/GND를 트랜스펙션한 Huh7 세포에서는 콜로니 형성이 확인되지 않았다(도 5의 우측). 이것은, rFGREP-JFH1 레플리콘 RNA를 트랜스펙션한 Huh7 세포의 콜로니 형성능은 rFGREP-JFH1로부터 발현되는 NS5B(RNA 폴리메라제)의 활성에 의존하는 것을 나타냈다. 즉, 콜로니를 형성한 세포에서는 rFGREP-JFH1로부터 발현 되는 NS5B의 기능에 의해 rFGREP-JFH1 레플리콘 RNA가 자율 복제함으로써 네오마이신 내성 유전자가 지속적으로 발현되어 G418 내성이 유지되는 결과, 세포증식이 가능하게 된 것으로 생각되었다.
(G)수립한 세포 클론에 있어서의 전체 길이 HCV 레플리콘 RNA의 검출
상기 (E)에 따라 rFGREP-JFH1의 Huh7 세포로의 트랜스펙션에 의해 수립된 전체 길이 HCV 레플리콘 RNA 복제세포 클론으로부터 산성페놀 추출법에 의해 토털 RNA를 추출했다. 이어서 이 토털 RNA를 노던 블롯법에 의해 해석했다. 프로브로서는 pFGREP-JFH1 특이적 프로브를 사용했다. 대조로서는 트랜스펙션을 행하고 있지 않은 Huh7 세포로부터 마찬가지로 추출한 토털 RNA(도 6 중, 「Huh7」로서 나타냄), Huh7 세포로부터 추출한 토털 RNA에 시험관 내에서 합성한 레플리콘 RNA를 10의 7승 카비하여 가한 샘플(도 6중, 「107」로서 나타냄), 및 Huh7 세포로부터 추출한 토털 RNA에 시험관 내에서 합성한 레플리콘 RNA를 10의 8승 카피하여 가한 샘플(도 6중, 「108」로서 나타냄)을 사용했다. 도 6 중, 1~4는 세포 클론의 번호이다.
이 결과, rFGREP-JFH1과 같은 정도의 크기의 RNA가 pFGREP-JFH1 특이적 프로브에 의해 검출되었다(도 6). 이에 따라 트랜스펙션한 rFGREP-JFH1 레플리콘 RNA가 세포 클론 내에서 복제 증식되어 있는 것이 확인되었다. 또, 세포 클론사이에서 레플리콘 RNA의 양에 차가 있는 것이 나타내어졌다. 도 6 중, 예를 들면 클론2는 레플리콘 RNA의 양이 다른 클론에 비해서 적었다.
(H)네오마이신 내성 유전자의 게놈 DNA로의 도입의 유무의 확인
(E)에 따라 얻어진 세포 클론 1~8(도 7 중에서는 FGR-JFH1/2-1~FGR-JFH1/2-8로 표기)에 대해서, 그 세포 클론의 G418에 대한 내성이 네오마이신 내성 유전자의 숙주세포 게놈으로의 도입에 의한 것은 아님을 확인하기 위해, 네오마이신 내성 유전자 특이적 프라이머(센스 프라이머, NEO-S3:5'-AACAAGATGGATTGCACGCA-3'(서열번호 19), 안티센스 프라이머, NEO-R:5'-CGTCAAGAAGGCGATAGAAG-3'(서열번호 20))를 사용해서 세포 클론으로부터 추출한 숙주세포의 게놈 DNA를 주형으로 하는 PCR 증폭을 행했다. 이 결과, 도 7에 나타내는 바와 같이 네오마이신 내성 유전자의 증폭이 나타내어진 양성 클론은 확인되지 않았다.
이 (H)의 결과로부터, 본 발명의 전체 길이 HCV 레플리콘 RNA를 트랜스펙션하여 수립한 세포 클론에서는 전체 길이 HCV 레플리콘 RNA가 복제되어 있는 것이 확인되었다.
(I)HCV 단백질의 검출
rFGREP-JFH1을 트랜스펙션하여 수립한 세포 클론으로부터 통상의 방법에 의해 단백질을 추출해서, SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯법에 의한 해석을 행했다. 조사한 세포 클론은 상기 (G)에서 사용한 것과 같다. 합성한 전체 길이 HCV 게놈 RNA를 Huh7 세포에 일과성(一過性)으로 트랜스펙션하여 얻어진 세포추출액을 양성 대조로 했다(도 8, 도 9 및 도 10 중, JFH-1로 해서 나타냄). HCV의 서브제노믹 RNA 레플리콘(SGR-JFH1)을 트랜스펙션해서 얻어진 클론 세포추출액을 코어 단백질의 음성 대조로 하고, 및 NS3, NS5a 단백질의 양성 대조로 해서 사용했다(도 8, 도 9 및 도 10 중, SGR-JFH1로 해서 나타냄). 트랜스펙션되어 있지 않은 Huh7 세포추출액은 모든 음성 대조로 해서 사용했다(도 8, 도 9 및 도 10 중, Huh7로 해서 나타냄). 각각의 세포 클론으로부터 추출한 단백질 시료를 PVDF막(Immobilon-P, Millipore사제)에 블롯팅하고, 항core 특이적 항체 및 항NS3 특이적 항체(Dr.Moradpour에 의해 분여된 것； Wolk B, et al,J.Virology.2000;74:2293-2304)를 이용하여 전체 길이 HCV 레플리콘 RNA에 코드되어 있는 코어 단백질 및 NS3 단백질을 검출했다. 도 8 및 도 9에 나타내어지는 바와 같이, rFGREP-JFH1을 트랜스펙션하여 수립한 세포 클론 1~4에서는 각각의 단백질에 대해서 양성 대조와 같은 크기의 단백질이 검출되었다. 트랜스펙션되어 있지 않은 Huh7 세포에서는 코어 단백질, 및 NS3 단백질도 검출되지 않았으므로, 세포 클론 1~4에서는 트랜스펙션된 전체 길이 HCV 레플리콘 RNA가 자율 복제되고, 또 코어 단백질이나 NS3 단백질이 발현되어 있는 것이 확인되었다.
또한, C형간염환자의 혈청을 항체로서 사용함으로써, 상기에서 NS3 단백질의 발현이 확인된 각 세포 클론에 대하여 전체 길이 HCV 레플리콘 RNA로부터의 NS5A 단백질의 발현도 마찬가지로 확인되었다(도 10).
이상의 (H) 및 (I)의 결과로부터, 전체 길이 HCV 레플리콘 RNA를 트랜스펙션하여 수립한 세포 클론에서는 전체 길이 HCV 레플리콘 RNA가 복제되고, 또한 바이러스 단백질이 발현되어 있는 것이 확인되었다.
(J)전체 길이 HCV 레플리콘 RNA 복제세포에 있어서의 바이러스 입자 생산
상기 (E)에 따라서 rFGREP-JFH1을 Huh7 세포로 트랜스펙션하고, 수립한 전체 길이 HCV 레플리콘 RNA 복제세포 클론2 및 3(FGR-JFH1/2-3)의 배양상청을 회수해 서, 상기 (D)와 같은 방법으로 배양상청 중의 HCV 바이러스 입자를 측정했다. 이 결과를 도 11에 나타낸다. 도 11 중, 빗금선에 연결된 원은 각 프랙션(획분)의 비중(g/ml)을 나타낸다. 또 검은색 원은 코어 단백질의 양(fmol/L)을 나타낸다. 흰색 원은 전체 길이 HCV 레플리콘 RNA의 역가(×0.1카피/mL)를 나타낸다.
도 11에 나타내는 바와 같이, 비중이 약 1.18~1.20mg/ml로 되는 프랙션에서 코어 단백질과 전체 길이 HCV 레플리콘 RNA의 피크는 일치되어 있었다. 또 그것보다 가벼운 획분에도 작은 피크를 확인했다. 이상의 결과로부터, rFGREP-JFH11을 트랜스펙션한 Huh7 세포 중에서는 전체 길이 HCV 레플리콘 RNA가 복제된 것, 및 바이러스 입자가 형성되어서 배양상청 중에 분비된 것이 나타내어졌다.
[실시예4]
(K)배양상청 중의 바이러스 입자의 감염실험
(H)에서 사용한 세포 클론 1~8(FGR-JFH1/2-1, FGR-JFH1/2-2, FGR-JFH1/2-3, FGR-JFH1/2-4, FGR-JFH1/2-5, FGR-JFH1/2-6, FGR-JFH1/2-7, FGR-JFH1/2-8)의 각각의 배양상청을 Huh7 세포에 첨가해서 배양상청 중의 바이러스 입자를 Huh7 세포에 감염시켰다. 감염 다음날에 감염시킨 Huh7 세포의 배양액에 G418을 0.3mg/ml 첨가하고, 21일간 더 배양했다. 배양종료 후에 세포를 고정하고, 크리스탈 바이올렛으로 염색한 결과, FGR-JFH1/2-3, FGR-JFH1/2-5, FGR-JFH1/2-6의 배양상청을 이용하여 감염시킨 세포에 대해서 콜로니 형성이 관찰되었다. 한편, 대조에 사용한 서브제노믹 레플리콘 세포 SGR-JFH1/4-1(비특허문헌6 기재)의 배양상청을 이용하여 감염시킨 세포에서는 콜로니 형성은 보이지 않았다. 도 12에, FGR-JFH1/2-3과 SGR- JFH1/4-1의 배양상청 4ml 또는 8ml를 Huh7 세포에 첨가하고, 21일간 배양한 후에 염색한 배양접시의 사진을 나타낸다. FGR-JFH1/2-3의 배양상청 4ml를 첨가한 세포를 파종한 접시에는 3콜로니, FGR-JFH1/2-3의 배양상청 8ml를 첨가한 세포를 파종한 접시에는 9콜로니의 형성을 확인했다. 그러나, SGR-JFH1/4-1의 배양상청을 첨가한 세포를 파종한 접시에서는 콜로니 형성은 보이지 않았다.
FGR-JFH1/2-3, FGR-JFH1/2-5의 배양상청을 이용하여 C형간염 바이러스에 감염시키고, 형성된 콜로니를 이어서 클론화했다. FGR-JFH1/2-3의 배양상청을 사용한 배양접시로부터 FGR-JFH1/C2-3-11, FGR-JFH1/C2-3-12, FGR-JFH1/C2-3-13의 3클론을 수립했다. FGR-JFH1/C2-5의 배양상청을 사용한 배양접시로부터 FGR-JFH1/C2-5-11, FGR-JFH1/C2-5-12의 2클론을 수립했다.
FGR-JFH1/C2-3-11, FGR-JFH1/C2-3-12, FGR-JFH1/C2-3-13, FGR-JFH1/C2-5-11, FGR-JFH1/C2-5-12의 각 세포 클론의 배양상청을 이용하여 다시 Huh7 세포를 감염시키면, FGR-JFH1/C2-3-12, FGR-JFH1/C2-5-12의 배양상청을 사용한 배양접시에서는 콜로니의 형성이 관찰되었다. FGR-JFH1/C2-3-12의 배양상청을 이용하여 감염시킨 세포로부터 FGR-JFH1/C2-3-12-1, FGR-JFH1/C2-3-12-2의 2클론을 더 수립했다. FGR-JFH1/C2-5-12의 배양상청을 이용하여 감염시킨 세포로부터 FGR-JFH1/C2-5-12-1, FGR-JFH1/C2-5-12-2의 2클론을 더 수립했다.
이상과 같이 전체 길이 HCV 레플리콘 RNA 복제세포의 배양상청을 이용하여 감염시키고, 그 감염세포로부터 수립한 이들 세포 클론으로부터 RNA, 단백질, 게놈 DNA를 추출했다. 게놈 DNA를 주형으로 한 PCR에서 네오마이신 내성 유전자의 도입의 유무를 검토한 결과, 모두 음성이었다. 또, RNA를 주형으로 하는 정량적 PCR법에 의해, 세포 내에서 복제되어 있는 전체 길이 HCV 레플리콘 RNA를 검출할 수 있었다. 또한 배양상청 중에 코어 단백질을 검출할 수 있었다. 이 결과는, 본 발명의 전체 길이 HCV 레플리콘 RNA 복제세포로부터 생산된 전체 길이 HCV 레플리콘 RNA를 함유하는 바이러스 입자가 새로운 세포에 감염될 수 있는 것을 나타내고 있다.
<서열표 프리 텍스트>
서열번호 1의 서열은 JFH-1 클론유래의 HCV 게놈 RNA의 5'비번역영역을 나타낸다.
서열번호 2의 서열은 JFH-1 클론유래의 HCV 게놈 RNA의 코어 단백질 코드 서열을 나타낸다.
서열번호 3의 서열은 JFH-1 클론유래의 HCV 게놈 RNA의 E1 단백질 코드 서열을 나타낸다.
서열번호 4의 서열은 JFH-1 클론유래의 HCV 게놈 RNA의 E2 단백질 코드 서열을 나타낸다.
서열번호 5의 서열은 JFH-1 클론유래의 HCV 게놈 RNA의 NS2 단백질 코드 서열을 나타낸다.
서열번호 6의 서열은 JFH-1 클론유래의 HCV 게놈 RNA의 NS3 단백질 코드 서열을 나타낸다.
서열번호 7의 서열은 JFH-1 클론유래의 HCV 게놈 RNA의 NS4A 단백질 코드 서열을 나타낸다.
서열번호 8의 서열은 JFH-1 클론유래의 HCV 게놈 RNA의 NS4B 단백질 코드 서열을 나타낸다.
서열번호 9의 서열은 JFH-1 클론유래의 HCV 게놈 RNA의 NS5A 단백질 코드 서열을 나타낸다.
서열번호 10의 서열은 JFH-1 클론유래의 HCV 게놈 RNA의 NS5B 단백질 코드 서열을 나타낸다.
서열번호 11의 서열은 JFH-1 클론유래의 HCV 게놈 RNA의 3'비번역영역을 나타낸다.
서열번호 12의 서열은 JFH-1 클론유래의 전체 길이 HCV 게놈 RNA를 나타낸다.
서열번호 13의 서열은 JFH-1 클론유래의 전체 길이 HCV 게놈 RNA를 함유하는 레플리콘 RNA를 나타낸다.
서열번호 14의 서열은 아미노산 모티브 GDD를 GND로 변이시킨, JFH-1 클론유래의 전체 길이 HCV 게놈 RNA를 나타낸다.
서열번호 15의 서열은 아미노산 모티브 GDD를 GND로 변이시킨, JFH-1 클론유래의 전체 길이 HCV 게놈 RNA를 함유하는 레플리콘 RNA를 나타낸다.
서열번호 16~20의 서열은 프라이머를 나타낸다.
서열번호 21의 서열은 발현 벡터 pFGREP-JFH1/Luc유래의 레플리콘 RNA를 나타낸다.
서열번호 22의 서열은 발현 벡터 pFGREP-JFH1/Luc/GND유래의 레플리콘 RNA를 나타낸다.
서열번호 23의 서열은 발현 벡터 pFGREP-JFH1/EGFP유래의 레플리콘 RNA를 나타낸다.
서열번호 24의 서열은 발현 벡터 pFGREP-JFH1/EGFP/GND유래의 레플리콘 RNA를 나타낸다.
서열번호 25의 서열은 발현 벡터 pFGREP-JFH1/SEAP유래의 레플리콘 RNA를 나타낸다.
서열번호 26의 서열은 발현 벡터 pFGREP-JFH1/SEAP/GND유래의 레플리콘 RNA를 나타낸다.
본 발명의 방법에 의해 HCV 바이러스 입자를 세포배양계에서 제조할 수 있다. 본 발명의 레플리콘 RNA를 사용하면, 세포배양계에 있어서 HCV의 전체 길이 게놈 RNA를 함유하는 RNA를 효율적으로 제조할 수 있다. 또 본 발명에 따른 전체 길이 HCV 레플리콘 RNA 또는 전체 길이 HCV 게놈 RNA를 도입한 세포를 사용하면, 전체 길이 HCV 레플리콘 RNA 또는 전체 길이 HCV 게놈 RNA를 복제하여, 본 발명의 HCV 바이러스 입자를 세포배양계로 지속적으로 생산시킬 수 있다. 본 발명의 전체 길이 HCV 레플리콘 RNA 또는 전체 길이 HCV 게놈 RNA를 도입한 세포는 HCV의 복제과정, 바이러스 입자 형성과정, 바이러스 입자의 세포밖 방출과정에 영향을 미치는 각종 물질을 스크리닝하기 위한 시험계로서 이용할 수도 있다. 본 발명의 전체 길이 HCV 레플리콘 RNA 및 전체 길이 HCV 게놈 RNA 서열에 바이러스 입자는 외래유전자의 바이러스 벡터로서도 유용하다. 본 발명의 바이러스 입자 또는 그 일부분은 또한, C형간염 바이러스에 대한 백신 항원으로서 백신에 함유시킬 수 있다. 또, 본 발명의 바이러스 입자와 다른 세포를 함께 배양하는 계를, 바이러스 입자의 세포로의 감염에 영향을 미치는 각종 물질을 스크리닝하기 위한 시험계로서 이용할 수 있다. 본 발명의 전체 길이 HCV 레플리콘 RNA 또는 전체 길이 HCV 게놈 RNA는 또한, HCV의 전체 길이 게놈서열을 용이하게 복제할 수 있는 주형으로서도 유용하다.
본 명세서에서 인용한 모든 간행물, 특허 및 특허출원의 전체를 참조로 해서 본 명세서에 구비하는 것으로 한다.
<110> TOKYO METROPOLITAN INSTITUTE OF MEDICAL SCIENCE Toray Industries, Inc. <120> NUCLEIC ACID CONSTRUCT CONTAINING FULL-LENGTH GENOME OF HUMAN HEPATITIS C VIRUS, RECOMBINANT FULL-LENGTH VIRUS GENOME REPLICATIVE CELL HAVING THE NUCLEIC ACID CONSTRUCT TRANSFERRED THEREINTO AND METHOD OF CONSTRUCTING HEPATITIS C VIRAL PARTICLES <130> PB9703 <140> 10-2006-7018856 <141> 2006-09-14 <150> 2004-045489 <151> 2004-02-20 <160> 1 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 9678 <212> RNA <213> Hepatitis C virus <400> 1 accugccccu aauaggggcg acacuccgcc augaaucacu ccccugugag gaacuacugu 60 cuucacgcag aaagcgccua gccauggcgu uaguaugagu gucguacagc cuccaggccc 120 cccccucccg ggagagccau aguggucugc ggaaccggug aguacaccgg aauugccggg 180 aagacugggu ccuuucuugg auaaacccac ucuaugcccg gccauuuggg cgugcccccg 240 caagacugcu agccgaguag cguuggguug cgaaaggccu ugugguacug ccugauaggg 300 cgcuugcgag ugccccggga ggucucguag accgugcacc augagcacaa auccuaaacc 360 ucaaagaaaa accaaaagaa acaccaaccg ucgcccagaa gacguuaagu ucccgggcgg 420 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ggcaccauca cuggacaccg cauggcaugg gacaugauga ugaacugguc 1320 gcccacggcc accaugaucc uggcguacgu gaugcgcguc cccgagguca ucauagacau 1380 cguuagcggg gcucacuggg gcgucauguu cggcuuggcc uacuucucua ugcagggagc 1440 gugggcgaag gucauuguca uccuucugcu ggccgcuggg guggacgcgg gcaccaccac 1500 cguuggaggc gcuguugcac guuccaccaa cgugauugcc ggcguguuca gccauggccc 1560 ucagcagaac auucagcuca uuaacaccaa cggcaguugg cacaucaacc guacugccuu 1620 gaauugcaau gacuccuuga acaccggcuu ucucgcggcc uuguucuaca ccaaccgcuu 1680 uaacucguca ggguguccag ggcgccuguc cgccugccgc aacaucgagg cuuuccggau 1740 aggguggggc acccuacagu acgaggauaa ugucaccaau ccagaggaua ugaggccgua 1800 cugcuggcac uaccccccaa agccgugugg cguagucccc gcgaggucug uguguggccc 1860 aguguacugu uucaccccca gcccgguagu agugggcacg accgacagac guggagugcc 1920 caccuacaca uggggagaga augagacaga ugucuuccua cugaacagca cccgaccgcc 1980 gcagggcuca ugguucggcu gcacguggau gaacuccacu gguuucacca agacuugugg 2040 cgcgccaccu ugccgcacca gagcugacuu caacgccagc acggacuugu ugugcccuac 2100 ggauuguuuu aggaagcauc cugaugccac uuauauuaag ugugguucug ggcccuggcu 2160 cacaccaaag ugccuggucc acuacccuua cagacucugg cauuaccccu gcacagucaa 2220 uuuuaccauc uucaagauaa gaauguaugu aggggggguu gagcacaggc ucacggccgc 2280 augcaacuuc acucgugggg aucgcugcga cuuggaggac agggacagga gucagcuguc 2340 uccucuguug cacucuacca cggaaugggc cauccugccc ugcaccuacu cagacuuacc 2400 cgcuuuguca acuggucuuc uccaccuuca ccagaacauc guggacguac aauacaugua 2460 uggccucuca ccugcuauca caaaauacgu cguucgaugg gagugggugg uacucuuauu 2520 ccugcucuua gcggacgcca gagucugcgc cugcuugugg augcucaucu uguugggcca 2580 ggccgaagca gcauuggaga aguuggucgu cuugcacgcu gcgagugcgg cuaacugcca 2640 uggccuccua uauuuugcca ucuucuucgu ggcagcuugg cacaucaggg gucggguggu 2700 ccccuugacc accuauugcc ucacuggccu auggcccuuc ugccuacugc ucauggcacu 2760 gccccggcag gcuuaugccu augacgcacc ugugcacgga cagauaggcg uggguuuguu 2820 gauauugauc acccucuuca cacucacccc gggguauaag acccuccucg gccagugucu 2880 guggugguug ugcuaucucc ugacccuggg ggaagccaug auucaggagu ggguaccacc 2940 caugcaggug cgcggcggcc gcgauggcau cgcgugggcc gucacuauau ucugcccggg 3000 ugugguguuu gacauuacca aauggcuuuu ggcguugcuu gggccugcuu accucuuaag 3060 ggccgcuuug acacaugugc cguacuucgu cagagcucac gcucugauaa ggguaugcgc 3120 uuuggugaag cagcucgcgg gggguaggua uguucaggug gcgcuauugg cccuuggcag 3180 guggacuggc accuacaucu augaccaccu cacaccuaug ucggacuggg ccgcuagcgg 3240 ccugcgcgac uuagcggucg ccguggaacc caucaucuuc aguccgaugg agaagaaggu 3300 caucgucugg ggagcggaga cggcugcaug uggggacauu cuacauggac uucccguguc 3360 cgcccgacuc ggccaggaga uccuccucgg cccagcugau ggcuacaccu ccaaggggug 3420 gaagcuccuu gcucccauca cugcuuaugc ccagcaaaca cgaggccucc ugggcgccau 3480 aguggugagu augacggggc gugacaggac agaacaggcc ggggaagucc aaauccuguc 3540 cacagucucu caguccuucc ucggaacaac caucucgggg guuuugugga cuguuuacca 3600 cggagcuggc aacaagacuc uagccggcuu acgggguccg gucacgcaga uguacucgag 3660 ugcugagggg gacuugguag gcuggcccag ccccccuggg accaagucuu uggagccgug 3720 caagugugga gccgucgacc uauaucuggu cacgcggaac gcugauguca ucccggcucg 3780 gagacgcggg gacaagcggg gagcauugcu cuccccgaga cccauuucga ccuugaaggg 3840 guccucgggg gggccggugc ucugcccuag gggccacguc guugggcucu uccgagcagc 3900 ugugugcucu cggggcgugg ccaaauccau cgauuucauc cccguugaga cacucgacgu 3960 uguuacaagg ucucccacuu ucagugacaa cagcacgcca ccggcugugc cccagaccua 4020 ucaggucggg uacuugcaug cuccaacugg caguggaaag agcaccaagg ucccugucgc 4080 guaugccgcc cagggguaca aaguacuagu gcuuaacccc ucgguagcug ccacccuggg 4140 guuuggggcg uaccuaucca aggcacaugg caucaauccc aacauuagga cuggagucag 4200 gaccgugaug accggggagg ccaucacgua cuccacauau ggcaaauuuc ucgccgaugg 4260 gggcugcgcu agcggcgccu augacaucau cauaugcgau gaaugccacg cuguggaugc 4320 uaccuccauu cucggcaucg gaacgguccu ugaucaagca gagacagccg gggucagacu 4380 aacugugcug gcuacggcca caccccccgg gucagugaca accccccauc ccgauauaga 4440 agagguaggc cucgggcggg agggugagau ccccuucuau gggagggcga uuccccuauc 4500 cugcaucaag ggagggagac accugauuuu cugccacuca aagaaaaagu gugacgagcu 4560 cgcggcggcc cuucggggca ugggcuugaa ugccguggca uacuauagag gguuggacgu 4620 cuccauaaua ccagcucagg gagauguggu ggucgucgcc accgacgccc ucaugacggg 4680 guacacugga gacuuugacu ccgugaucga cugcaaugua gcggucaccc aagcugucga 4740 cuucagccug gaccccaccu ucacuauaac cacacagacu gucccacaag acgcugucuc 4800 acgcagucag cgccgcgggc gcacagguag aggaagacag ggcacuuaua gguauguuuc 4860 cacuggugaa cgagccucag gaauguuuga caguguagug cuuugugagu gcuacgacgc 4920 aggggcugcg ugguacgauc ucacaccagc ggagaccacc gucaggcuua gagcguauuu 4980 caacacgccc ggccuacccg ugugucaaga ccaucuugaa uuuugggagg caguuuucac 5040 cggccucaca cacauagacg cccacuuccu cucccaaaca aagcaagcgg gggagaacuu 5100 cgcguaccua guagccuacc aagcuacggu gugcgccaga gccaaggccc cucccccguc 5160 cugggacgcc auguggaagu gccuggcccg acucaagccu acgcuugcgg gccccacacc 5220 ucuccuguac cguuugggcc cuauuaccaa ugaggucacc cucacacacc cugggacgaa 5280 guacaucgcc acaugcaugc aagcugaccu ugaggucaug accagcacgu ggguccuagc 5340 uggaggaguc cuggcagccg ucgccgcaua uugccuggcg acuggaugcg uuuccaucau 5400 cggccgcuug cacgucaacc agcgagucgu cguugcgccg gauaaggagg uccuguauga 5460 ggcuuuugau gagauggagg aaugcgccuc uagggcggcu cucaucgaag aggggcagcg 5520 gauagccgag auguugaagu ccaagaucca aggcuugcug cagcaggccu cuaagcaggc 5580 ccaggacaua caacccgcua ugcaggcuuc auggcccaaa guggaacaau uuugggccag 5640 acacaugugg aacuucauua gcggcaucca auaccucgca ggauugucaa cacugccagg 5700 gaaccccgcg guggcuucca ugauggcauu cagugccgcc cucaccaguc cguugucgac 5760 caguaccacc auccuucuca acaucauggg aggcugguua gcgucccaga ucgcaccacc 5820 cgcgggggcc accggcuuug ucgucagugg ccuggugggg gcugccgugg gcagcauagg 5880 ccuggguaag gugcuggugg acauccuggc aggauauggu gcgggcauuu cgggggcccu 5940 cgucgcauuc aagaucaugu cuggcgagaa gcccucuaug gaagauguca ucaaucuacu 6000 gccugggauc cugucuccgg gagcccuggu gguggggguc aucugcgcgg ccauucugcg 6060 ccgccacgug ggaccggggg agggcgcggu ccaauggaug aacaggcuua uugccuuugc 6120 uuccagagga aaccacgucg ccccuacuca cuacgugacg gagucggaug cgucgcagcg 6180 ugugacccaa cuacuuggcu cucuuacuau aaccagccua cucagaagac uccacaauug 6240 gauaacugag gacugcccca ucccaugcuc cggauccugg cuccgcgacg ugugggacug 6300 gguuugcacc aucuugacag acuucaaaaa uuggcugacc ucuaaauugu uccccaagcu 6360 gcccggccuc cccuucaucu cuugucaaaa gggguacaag gguguguggg ccggcacugg 6420 caucaugacc acgcgcugcc cuugcggcgc caacaucucu ggcaaugucc gccugggcuc 6480 uaugaggauc acagggccua aaaccugcau gaacaccugg caggggaccu uuccuaucaa 6540 uugcuacacg gagggccagu gcgcgccgaa accccccacg aacuacaaga ccgccaucug 6600 gaggguggcg gccucggagu acgcggaggu gacgcagcau gggucguacu ccuauguaac 6660 aggacugacc acugacaauc ugaaaauucc uugccaacua ccuucuccag aguuuuucuc 6720 cuggguggac ggugugcaga uccauagguu ugcacccaca ccaaagccgu uuuuccggga 6780 ugaggucucg uucugcguug ggcuuaauuc cuaugcuguc gggucccagc uucccuguga 6840 accugagccc gacgcagacg uauugagguc caugcuaaca gauccgcccc acaucacggc 6900 ggagacugcg gcgcggcgcu uggcacgggg aucaccucca ucugaggcga gcuccucagu 6960 gagccagcua ucagcaccgu cgcugcgggc caccugcacc acccacagca acaccuauga 7020 cguggacaug gucgaugcca accugcucau ggagggcggu guggcucaga cagagccuga 7080 guccagggug cccguucugg acuuucucga gccaauggcc gaggaagaga gcgaccuuga 7140 gcccucaaua ccaucggagu gcaugcuccc caggagcggg uuuccacggg ccuuaccggc 7200 uugggcacgg ccugacuaca acccgccgcu cguggaaucg uggaggaggc cagauuacca 7260 accgcccacc guugcugguu gugcucuccc cccccccaag aaggccccga cgccuccccc 7320 aaggagacgc cggacagugg gucugagcga gagcaccaua ucagaagccc uccagcaacu 7380 ggccaucaag accuuuggcc agccccccuc gagcggugau gcaggcucgu ccacgggggc 7440 gggcgccgcc gaauccggcg guccgacguc cccuggugag ccggcccccu cagagacagg 7500 uuccgccucc ucuaugcccc cccucgaggg ggagccugga gauccggacc uggagucuga 7560 ucagguagag cuucaaccuc ccccccaggg ggggggggua gcucccgguu cgggcucggg 7620 gucuuggucu acuugcuccg aggaggacga uaccaccgug ugcugcucca ugucauacuc 7680 cuggaccggg gcucuaauaa cucccuguag ccccgaagag gaaaaguugc caaucaaccc 7740 uuugaguaac ucgcuguugc gauaccauaa caagguguac uguacaacau caaagagcgc 7800 cucacagagg gcuaaaaagg uaacuuuuga caggacgcaa gugcucgacg cccauuauga 7860 cucagucuua aaggacauca agcuagcggc uuccaagguc agcgcaaggc uccucaccuu 7920 ggaggaggcg ugccaguuga cuccacccca uucugcaaga uccaaguaug gauucggggc 7980 caaggagguc cgcagcuugu ccgggagggc cguuaaccac aucaaguccg uguggaagga 8040 ccuccuggaa gacccacaaa caccaauucc cacaaccauc auggccaaaa augagguguu 8100 cugcguggac cccgccaagg gggguaagaa accagcucgc cucaucguuu acccugaccu 8160 cggcguccgg gucugcgaga aaauggcccu cuaugacauu acacaaaagc uuccucaggc 8220 gguaauggga gcuuccuaug gcuuccagua cuccccugcc caacgggugg aguaucucuu 8280 gaaagcaugg gcggaaaaga aggaccccau ggguuuuucg uaugauaccc gaugcuucga 8340 cucaaccguc acugagagag acaucaggac cgaggagucc auauaccagg ccugcucccu 8400 gcccgaggag gcccgcacug ccauacacuc gcugacugag agacuuuacg uaggagggcc 8460 cauguucaac agcaaggguc aaaccugcgg uuacagacgu ugccgcgcca gcggggugcu 8520 aaccacuagc auggguaaca ccaucacaug cuaugugaaa gcccuagcgg ccugcaaggc 8580 ugcggggaua guugcgccca caaugcuggu augcggcgau gaccuaguag ucaucucaga 8640 aagccagggg acugaggagg acgagcggaa ccugagagcc uucacggagg ccaugaccag 8700 guacucugcc ccuccuggug auccccccag accggaauau gaccuggagc uaauaacauc 8760 cuguuccuca aaugugucug uggcguuggg cccgcggggc cgccgcagau acuaccugac 8820 cagagaccca accacuccac ucgcccgggc ugccugggaa acaguuagac acuccccuau 8880 caauucaugg cugggaaaca ucauccagua ugcuccaacc auauggguuc gcaugguccu 8940 aaugacacac uucuucucca uucucauggu ccaagacacc cuggaccaga accucaacuu 9000 ugagauguau ggaucaguau acuccgugaa uccuuuggac cuuccagcca uaauugagag 9060 guuacacggg cuugacgccu uuucuaugca cacauacucu caccacgaac ugacgcgggu 9120 ggcuucagcc cucagaaaac uuggggcgcc accccucagg guguggaaga gucgggcucg 9180 cgcagucagg gcgucccuca ucucccgugg agggaaagcg gccguuugcg gccgauaucu 9240 cuucaauugg gcggugaaga ccaagcucaa acucacucca uugccggagg cgcgccuacu 9300 ggacuuaucc aguugguuca ccgucggcgc cggcgggggc gacauuuuuc acagcguguc 9360 gcgcgcccga ccccgcucau uacucuucgg ccuacuccua cuuuucguag ggguaggccu 9420 cuuccuacuc cccgcucggu agagcggcac acacuaggua cacuccauag cuaacuguuc 9480 cuuuuuuuuu uuuuuuuuuu uuuuuuuuuu uuuuuuuuuu uuuucuuuuu uuuuuuuuuc 9540 ccucuuucuu cccuucucau cuuauucuac uuucuuucuu gguggcucca ucuuagcccu 9600 agucacggcu agcugugaaa gguccgugag ccgcaugacu gcagagagug ccguaacugg 9660 ucucucugca gaucaugu 9678

Claims (27)

  1. 유전자형2a의 C형간염 바이러스의 게놈 RNA의 서열번호 1에 나타내는 염기서열로 이루어지는 5'비번역영역, 서열번호 2에 나타내는 염기서열로 이루어지는 코어(core) 단백질 코드 서열, 서열번호 3에 나타내는 염기서열로 이루어지는 E1 단백질 코드 서열, 서열번호 4에 나타내는 염기서열로 이루어지는 E2 단백질 코드 서열, 서열번호 5에 나타내는 염기서열로 이루어지는 NS2 단백질 코드 서열, 서열번호 6에 나타내는 염기서열로 이루어지는 NS3 단백질 코드 서열, 서열번호 7에 나타내는 염기서열로 이루어지는 NS4A 단백질 코드 서열, 서열번호 8에 나타내는 염기서열로 이루어지는 NS4B 단백질 코드 서열, 서열번호 9에 나타내는 염기서열로 이루어지는 NS5A 단백질 코드 서열, 서열번호 10에 나타내는 염기서열로 이루어지는 NS5B 단백질 코드 서열, 및 서열번호 11에 나타내는 염기서열로 이루어지는 3'비번역영역과, 1개이상의 선택 마커 유전자 및 1개이상의 리포터 유전자 중 어느 하나 이상과, 1개이상의 IRES 서열을 포함하는 염기서열로 이루어지는 것을 특징으로 하는 레플리콘 RNA.
  2. 제1항에 있어서, 상기 염기서열이 상기의 5'비번역영역, 1개이상의 선택 마커 유전자 및 1개이상의 리포터 유전자 중 어느 하나 이상, 1개이상의 IRES 서열, 코어 단백질 코드 서열, E1 단백질 코드 서열, E2 단백질 코드 서열, NS2 단백질 코드 서열, NS3 단백질 코드 서열, NS4A 단백질 코드 서열, NS4B 단백질 코드 서열, NS5A 단백질 코드 서열, NS5B 단백질 코드 서열, 및 3'비번역영역을 5'에서 3'방향으로 이 순서로 함유하는 것을 특징으로 하는 레플리콘 RNA.
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 서열번호 13에 나타내는 염기서열로 이루어지는 RNA인 것을 특징으로 하는 레플리콘 RNA.
  6. 제1항, 제2항 또는 제5항 중 어느 한 항에 기재된 레플리콘 RNA를 세포에 도입하는 것을 포함하는, 상기 레플리콘 RNA를 복제하고 또한 바이러스 입자를 생산하는 세포를 제조하는 방법.
  7. 제6항에 있어서, 세포가 증식성 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제6항에 있어서, 세포가 진핵세포인 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제8항에 있어서, 진핵세포가 인간 간유래 세포, 인간 자궁경부유래 세포, 또는 인간 태아신장유래 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제8항에 있어서, 진핵세포가 Huh7 세포, HepG2 세포, IMY-N9 세포, HeLa 세포, 또는 293 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제6항에 기재된 방법에 의해 제조되는 레플리콘 RNA를 복제하고 또한 바이러스 입자를 생산하는 세포.
  12. 제11항에 기재된 세포를 배양해서 바이러스 입자를 생산시키는 것을 포함하는, C형간염 바이러스 입자의 제조방법.
  13. 제12항에 기재된 방법에 의해 제조되는 것을 특징으로 하는 C형간염 바이러스 입자.
  14. 제11항에 기재된 세포를 배양하고, 배양물 중의 바이러스 입자를 다른 세포에 감염시키는 것을 포함하는, C형간염 바이러스 감염세포를 제조하는 방법.
  15. 제14항에 기재된 방법에 의해 제조되는 것을 특징으로 하는 C형간염 바이러스 감염세포.
  16. 피검물질의 존재 하에서 하기 (a)~(c):
    (a)제11항에 기재된 세포
    (b)상기 (a)세포에 의해 생산된 C형간염 바이러스 입자에 감염된 새로운 C형간염 바이러스 감염세포, 및
    (c)상기 (a)세포에 의해 생산된 C형간염 바이러스 입자 및 C형간염 바이러스 허용세포,
    중 1개이상을 배양하고, 얻어지는 배양물 중의 레플리콘 RNA 또는 바이러스 입자를 검출하는 것을 포함하는, 항C형간염 바이러스 물질을 스크리닝하는 방법.
  17. 제13항에 기재된 C형간염 바이러스 입자를 함유하는 것을 특징으로 하는 C형간염 백신.
  18. 제13항에 기재된 C형간염 바이러스 입자를 항원으로서 사용해서 C형간염 백신을 제조하는 방법.
  19. 제1항, 제2항 또는 제5항 중 어느 한 항에 기재된 레플리콘 RNA를 사용해서 유전자치료를 위한 간세포지향성 바이러스 벡터를 제조하는 방법.
  20. 제19항에 기재된 방법에 의해 제조되는, 간세포지향성 바이러스 벡터.
  21. 외래유전자를 코드하는 RNA를 제1항, 제2항 또는 제5항 중 어느 한 항에 기재된 레플리콘 RNA 속에 삽입하고, 그것을 세포 중에 도입하는 것을 포함하는, 상기 세포 내에서 외래유전자를 복제시키는 방법.
  22. 서열번호 12에 나타내는 염기서열로 이루어지는 RNA를 세포에 도입하는 것을 포함하는, 상기 RNA를 복제하고 또한 바이러스 입자를 생산하는 세포를 제조하는 방법.
  23. 서열번호 12에 나타내는 염기서열로 이루어지는 RNA를 세포에 도입하고, 그 세포를 배양해서 바이러스 입자를 생산시키는 것을 포함하는, C형간염 바이러스 입자의 제조방법.
  24. 제21항에 있어서, 세포가 증식성 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
  25. 서열번호 12에 나타내는 염기서열로 이루어지는 RNA에 외래유전자를 코드하는 RNA를 삽입하고, 그것을 세포에 도입하여 그 세포를 배양해서 바이러스 입자를 생산시키는 것을 포함하는, 외래유전자를 함유하는 바이러스 벡터를 제조하는 방법.
  26. 제13항에 기재된 C형간염 바이러스 입자에 대한 항체.
  27. 외래유전자를 코드하는 RNA를 제1항, 제2항 또는 제5항 중 어느 한 항에 기재된 레플리콘 RNA 속에 삽입하고, 그것을 세포 중에 도입하는 것을 포함하는, 상기 세포 내에서 외래유전자를 발현시키는 방법.
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Families Citing this family (24)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP4573776B2 (ja) * 2003-09-19 2010-11-04 財団法人 東京都医学研究機構 新規ｈｃｖ株由来の核酸、遺伝子、及び該遺伝子を利用したレプリコン複製細胞
CA2851807C (en) * 2004-02-20 2016-06-28 Toray Industries, Inc. Nucleic acid construct containing full length genome of human hepatitis c virus, recombinant full length virus genome-replicating cells having the nucleic acid construct transferred thereinto and method of producing hepatitis c virus particle
JP5086082B2 (ja) * 2004-10-01 2012-11-28 ノバルティス ヴァクシンズ アンド ダイアグノスティクス エスアールエル Ｃ型肝炎ウイルス複製系
AU2006295716B2 (en) * 2005-09-30 2011-11-03 Japan As Represented By Director-General Of National Institute Of Infectious Diseases Novel recombinant human hepatitis C virus-like particle and method for producing the same
CN101321865B (zh) * 2005-09-30 2011-12-14 日本国立感染症研究所 感染性丙型肝炎病毒颗粒高效生产体系
JP2009051733A (ja) * 2005-12-13 2009-03-12 Univ Kurume Ｃ型肝炎ウイルス由来ペプチド
JP2008161080A (ja) * 2006-12-27 2008-07-17 Japan Health Science Foundation Ｃ型肝炎ウイルス阻害剤を検出するためのアッセイ方法
WO2008133468A1 (en) * 2007-04-27 2008-11-06 Postech Academy-Industry Foundation An efficiently replicable heptitis c virus mutant, a heptitis c virus mutant comprising reporter gene a method of preparing of hcv vaccine using the same and a method of screening anti hcv composition using the same
EP2186893A4 (en) 2007-07-13 2010-10-20 Jp Nat Inst Infectious Disease PREPARATION AND USE OF A EPITOPEAGED HEPATITIS C VIRUS PARTICLE
US20100291545A1 (en) 2007-07-25 2010-11-18 Takaji Wakita Antibody having inhibitory activity on infection with hepatitis c virus (hcv) and use thereof
JP5584407B2 (ja) * 2008-03-07 2014-09-03 公益財団法人東京都医学総合研究所 Ｃ型肝炎ウイルス遺伝子を有する組換えワクシニアウイルス
CA2722423A1 (en) * 2008-04-22 2009-10-29 Rutgers, The State University Hcv e2 construct compositions and methods
US9758794B2 (en) 2008-04-22 2017-09-12 Rutgers, The State University Of New Jersey HCV E2 construct compositions and methods
CA2722043A1 (en) 2008-04-25 2009-10-29 Toray Industries, Inc. Nucleic acid comprising chimeric gene derived from hepatitis c virus
US8834893B2 (en) 2008-12-26 2014-09-16 Toray Industries, Inc. Nucleic acid derived from hepatitis C virus and expression vector, transformed cell, and hepatitis C virus particles each prepared by using the same
US20120251572A1 (en) * 2009-09-30 2012-10-04 Takaji Wakita Hepatitis c virus vaccine composition
JP5756757B2 (ja) 2009-10-30 2015-07-29 東レ株式会社 Ｃ型肝炎ウイルス（ｈｃｖ）に対して感染阻害活性を有する抗体及びその用途
CN102199613A (zh) 2010-03-25 2011-09-28 国立大学法人东京大学 感染性丙型肝炎病毒高生产hcv突变体及其应用
WO2012133735A1 (ja) 2011-03-31 2012-10-04 国立感染症研究所長が代表する日本国 遺伝子型１ｂのＣ型肝炎ウイルスゲノム由来の核酸を含む核酸構築物、及び該核酸構築物が導入されたＣ型肝炎ウイルスゲノム複製細胞、並びに感染性Ｃ型肝炎ウイルス粒子の製造方法
EP2716757A4 (en) 2011-05-31 2015-02-25 Jp Nat Inst Infectious Disease MUTANT REPLICON FROM THE GENE OF THE HEPATITIS C VIRUS STRAIN J6CF
EP2752485A4 (en) 2011-08-31 2015-06-24 Japan As Represented By The Director General Of Nat Inst Of Infectious Diseases NUCLEIC ACID RECOMBINANT PRODUCT COMPRISING NUCLEIC ACID DERIVED FROM GENOTYPE 3A GENE VHC GENOME
WO2013085889A1 (en) * 2011-12-05 2013-06-13 Duke University Identification and cloning of transmitted hepatitic c virus (hcv) genomes by single genome amplification
JP6283315B2 (ja) * 2012-09-28 2018-02-21 国立大学法人神戸大学 Ｃ型肝炎ウイルス粒子形成促進剤及びｃ型肝炎ウイルス粒子の産生方法
CN109609505A (zh) * 2019-01-14 2019-04-12 中国科学院成都生物研究所 一种体内筛选的剪切rna的锤头状核酶

Family Cites Families (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5428145A (en) 1991-08-09 1995-06-27 Immuno Japan, Inc. Non-A, non-B, hepatitis virus genome, polynucleotides, polypeptides, antigen, antibody and detection systems
JPH06121689A (ja) 1991-08-09 1994-05-06 Tetsuo Nakamura 非ａ非ｂ型肝炎ウイルス遺伝子、ポリヌクレオチド、ポリペ プタイド、抗原、抗体検出系
DE19915178A1 (de) 1999-04-03 2000-10-05 Univ Mainz Johannes Gutenberg Hepatitis C Virus Zellkultursystem
EP1185665B1 (en) 1999-06-04 2008-09-10 The Government of the United States of America as represented by the Secretary of the Department of Health and Human Services INFECTIOUS cDNA CLONE OF GB VIRUS B AND USES THEREOF
DE60034884T2 (de) 1999-06-04 2008-01-17 The Government Of The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Klonierte genome von infektiösen hepatitis c viren genotyp 2a und deren verwendungen
JP4880116B2 (ja) * 2000-12-01 2012-02-22 財団法人 東京都医学総合研究所 劇症ｃ型肝炎ウイルス株の遺伝子
US20030009775A1 (en) 2001-05-25 2003-01-09 Glenn Jeffrey S. Mouse model for hepatitis C
JP3811854B2 (ja) 2002-05-10 2006-08-23 清水建設株式会社 制震機構
JP2004045489A (ja) 2002-07-09 2004-02-12 Fuji Photo Film Co Ltd 感光性樹脂転写材料を用いた金属酸化物構造体の製造方法
JP2006506074A (ja) * 2002-11-13 2006-02-23 ワシントン ユニヴァーシティー Ｃ型肝炎ウイルスの複製に対して高許容性である細胞系
WO2004104198A1 (ja) 2003-05-26 2004-12-02 Toray Industries, Inc. 遺伝子型2aのC型肝炎ウイルス（HCV）ゲノム由来の核酸を含む核酸構築物、及び該核酸構築物を導入した細胞
CA2851807C (en) * 2004-02-20 2016-06-28 Toray Industries, Inc. Nucleic acid construct containing full length genome of human hepatitis c virus, recombinant full length virus genome-replicating cells having the nucleic acid construct transferred thereinto and method of producing hepatitis c virus particle

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
enBank Accession Number AF169005. *
HEPATOLOGY. 2001, Vol. 34, No. 2, 페이지 417-423. *

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Publication number Publication date
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