KR20070011310A - 인간 ｃ형간염 바이러스의 전체 길이 게놈을 함유하는 핵산 구축물 및 상기 핵산 구축물을 도입한 재조합형 전체 길이 바이러스 게놈 복제세포, 및 ｃ형간염 바이러스 입자의 제조방법 - Google Patents
인간 ｃ형간염 바이러스의 전체 길이 게놈을 함유하는 핵산 구축물 및 상기 핵산 구축물을 도입한 재조합형 전체 길이 바이러스 게놈 복제세포, 및 ｃ형간염 바이러스 입자의 제조방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 HCV 전체 길이 게놈서열을 함유하는 RNA를 효율적으로 복제하는 방법, 및 전체 길이 HCV 레플리콘 RNA 또는 전체 길이 HCV 게놈 RNA를 함유하는 HCV 바이러스 입자를 세포배양계에 의해 제조하는 방법을 제공한다. 또, 본 발명은 유전자형2a의 C형간염 바이러스의 전체 길이 게놈 RNA 서열과, 적어도 1개의 선택 마커 유전자 및/또는 적어도 1개의 리포터 유전자와, 적어도 1개의 IRES 서열을 포함하는 염기서열로 이루어지는 레플리콘 RNA, 혹은 유전자형2a의 C형간염 바이러스의 전체 길이 게놈 RNA를 도입한 세포를 배양해서, 배양물 중에 바이러스 입자를 산생시키는 것을 포함하는 C형간염 바이러스 입자의 제조방법에 관한 것이다. 또한 본 발명은, C형간염 백신 및 C형간염 바이러스 입자에 대한 항체에도 관한 것이다.
Description
본 발명은 C형간염 바이러스의 전체 길이 게놈을 함유하는 핵산 구축물, C형간염 바이러스 입자의 in vitro에서의 제조방법, 및 제조된 C형간염 바이러스 입자의 사용에 관한 것이다.
C형간염 바이러스(Hepatitis C virus, HCV)는 플라비바이러스과에 속하는, 단일쇄의 (+)쇄 센스 RNA를 게놈으로 하는 바이러스이며, C형간염의 원인으로 되는 것이 알려져 있다.
HCV는 지속적으로 감염됨으로써 만성 간염을 일으킨다. 현재, 세계적 규모로 인정받는 만성 간염의 주된 원인이 HCV 지속감염이다. 실제, 지속감염자의 50%정도가 만성 간염이 발병하고, 그중 약 20%의 환자가 10년~20년을 거쳐서 간경변으로 이행되며, 또 그 일부는 간암이라는 치사적인 병태로 진전된다.
C형간염에 대한 현재의 주된 치료는 인터페론-α, 인터페론-β, 및 인터페론-α와 푸린-뉴클레오티드 유도체인 리바비린의 병용요법에 의해 행해지고 있다. 그러나 이들 치료를 행해도 전체 치료자의 약 60%에만 치료효과가 확인되며, 효과가 나온 후에 치료를 중지하면 절반이상의 환자가 재발한다.
공업국에 있어서 이환율이 높고, 최종적으로 심각한 결과를 초래하며, 또한 현재는 원인치료법이 존재하지 않는 C형간염에 대한 효과적인 치료약 또는 예방약의 개발은 중요한 목표이다. 그 때문에 HCV 특이적인 화학요법, 백신요법의 발전이 요망되고 있다. 항HCV약 개발의 타깃으로서는 HCV의 복제억제나 HCV의 세포감염의 억제가 고려된다.
최근이 되어서, HCV유래의 자율 복제능을 갖는 RNA로서 HCV 서브 게놈 RNA 레플리콘 시스템이 제조되었다(특허문헌1, 2 및 3, 비특허문헌1~4). HCV 서브 게놈 RNA 레플리콘 시스템은 HCV 게놈의 구조유전자를 제거해서 대신에 선택약제 마커 유전자를 삽입한 HCV 레플리콘 RNA를 제조하고, 그 레플리콘 RNA를 배양세포 내에 도입하여 세포 내에서 레플리콘 RNA를 자율적으로 복제시키는 시스템이다. 이에 따라, 배양세포를 이용하여 HCV의 복제기구를 해석할 수 있게 되었지만, 이것은 HCV 바이러스의 증식 복제과정에 있어서의 바이러스 RNA 복제만을 평가할 수 있는 실험계이며, HCV 바이러스 입자의 감염세포 내에서의 형성과 세포 밖으로의 방출, 더욱 새로운 세포로의 감염이라는 과정은 해석할 수 없다.
현재, HCV 바이러스 입자의 형성과 세포 밖으로의 방출, 더욱 새로운 세포로의 감염이라는 과정을 평가하는 방법으로서는 침팬지 등의 동물을 사용한 실험계밖 에 없다(비특허문헌5). 그러나, 동물이라는 생체를 그대로 사용한 실험계는 번잡해서 해석이 매우 곤란하다. 따라서, HCV 바이러스 입자의 감염세포 내에서의 형성과 세포 밖으로의 방출, 더욱 새로운 세포로의 감염이라는 과정을 해석 및, 이들 과정의 저해를 작용 메커니즘으로 한 항HCV약을 제조하기 위해서는 이들 과정을 재현할 수 있는 매우 단순화한 실험계, 즉, 배양실험계에서의 HCV 바이러스 입자의 제조계를 구축할 필요가 있다.
또한, 세포배양계를 이용하여 안정적으로 HCV 바이러스 입자를 공급할 수 있게 되면, 바이러스를 약독화하거나, 분자생물학적 방법을 이용하여 비감염성 HCV 바이러스를 제조하거나 해서 그것을 백신에 사용할 수 있다.
[특허문헌1 : 일본 특허공개 2001-17187호 공보]
[특허문헌2 : 국제출원PCT/JP03/15038]
[특허문헌3 : 일본 특허출원 2003-329082]
[비특허문헌1 : Lohmann et al.,Science,(1999) 285,p.110-113]
[비특허문헌2 : Blight et al.,Science,(2000) 290,p.1972-1974]
[비특허문헌3 : Friebe et al.,J.Virol.,(2001) 75(24):p.12047-12057]
[비특허문헌4 : Ikeda et al.,J.Virol.,(2002) 76(6):p.2997-3006]
[비특허문헌5 : Kolykhalov et al.,Science,(1997) 277,p.570-574]
[비특허문헌6 : Kato et al.,Gastroenterology,(2003) 125,p.1808-1817]
[비특허문헌7 : Yanagi et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.,(1997) 96(16):p.8738-8743]
[비특허문헌8 : Okamoto et al.,J.Gen.Virol.,(1991) 73,p.2697-26704]
[비특허문헌9 : Aoyagi et al.,J.Clin.Microbiol.,(1999) 37(6):p.1802-1808]
본 발명은 지금까지 성공하지 못한 HCV 전체 길이 게놈서열을 함유하는 RNA를 효율적으로 복제하는 방법, 및 전체 길이 HCV 레플리콘 RNA 또는 전체 길이 HCV 게놈 RNA를 함유하는 HCV 바이러스 입자를 세포배양계에 의해 제조하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명자들은 상기 과제를 해결하기 위해 예의연구를 행한 결과, HCV 바이러스 입자를 세포배양계로 제조하는 방법을 개발했다. 즉, 본 발명은 이하와 같다.
[1]유전자형2a의 C형간염 바이러스의 게놈 RNA의, 5'비번역영역, 코어 단백질 코드 서열, E1 단백질 코드 서열, E2 단백질 코드 서열, NS2 단백질 코드 서열, NS3 단백질 코드 서열, NS4A 단백질 코드 서열, NS4B 단백질 코드 서열, NS5A 단백질 코드 서열, NS5B 단백질 코드 서열, 및 3'비번역영역과, 적어도 1개의 선택 마커 유전자 및/또는 적어도 1개의 리포터 유전자와, 적어도 1개의 IRES 서열을 포함하는 염기서열로 이루어지는 레플리콘 RNA.
이 레플리콘 RNA에 있어서는, 바람직하게는 상기 염기서열이 상기의 5'비번역영역, 적어도 1개의 선택 마커 유전자 및/또는 적어도 1개의 리포터 유전자, 적어도 1개의 IRES 서열, 코어 단백질 코드 서열, E1 단백질 코드 서열, E2 단백질 코드 서열, NS2 단백질 코드 서열, NS3 단백질 코드 서열, NS4A 단백질 코드 서열, NS4B 단백질 코드 서열, NS5A 단백질 코드 서열, NS5B 단백질 코드 서열, 및 3'비번역영역을 5'에서 3'방향으로 이 순서로 포함한다.
이 레플리콘 RNA의 보다 바람직한 실시형태에서는 유전자형2a의 C형간염 바이러스의 게놈 RNA가 서열번호 12에 나타내는 염기서열로 이루어지는 RNA이다.
이 레플리콘 RNA의 더욱 바람직한 실시형태에서는 5'비번역영역이 서열번호 1에 나타내는 염기서열로 이루어지고, 코어 단백질 코드 서열이 서열번호 2에 나타내는 염기서열로 이루어지며, E1 단백질 코드 서열이 서열번호 3에 나타내는 염기서열로 이루어지고, E2 단백질 코드 서열이 서열번호 4에 나타내는 염기서열로 이루어지며, NS2 단백질 코드 서열이 서열번호 5에 나타내는 염기서열로 이루어지고, NS3 단백질 코드 서열이 서열번호 6에 나타내는 염기서열로 이루어지며, NS4A 단백질 코드 서열이 서열번호 7에 나타내는 염기서열로 이루어지고, NS4B 단백질 코드 서열이 서열번호 8에 나타내는 염기서열로 이루어지며, NS5A 단백질 코드 서열이 서열번호 9에 나타내는 염기서열로 이루어지고, NS5B 단백질 코드 서열이 서열번호 10에 나타내는 염기서열로 이루어지며, 3'비번역영역이 서열번호 11에 나타내는 염기서열로 이루어진다.
[2]이하의 (a) 또는 (b)의 RNA로 이루어지는 레플리콘 RNA.
(a)서열번호 13에 나타내는 염기서열로 이루어지는 RNA.
(b)서열번호 13에 나타내는 염기서열에 있어서 1~100개의 염기가 삭제, 치환 또는 부가된 염기서열로 이루어지는 RNA로서, 자율 복제능 및 바이러스 입자 산생능을 갖는 RNA.
[3]상기 [1] 또는 [2]에 기재된 것 중 어느 하나의 레플리콘 RNA를 세포에 도입하는 것을 포함하는, 상기 레플리콘 RNA를 복제하고 또한 바이러스 입자를 산생하는 세포를 제조하는 방법.
이 방법에서는 세포가 증식성 세포인 것이 바람직하다. 혹은, 이 방법에 있어서의 세포는 진핵세포인 것이 바람직하다.
이 방법에서는, 바람직하게는 진핵세포는 인간 간유래 세포, 인간 자궁경부유래 세포, 또는 인간 태아신장유래 세포이다. 더욱 바람직하게는 진핵세포가 Huh7 세포, HepG2 세포, IMY-N9 세포, HeLa 세포, 또는 293 세포이다.
[4]상기 [3]에 기재된 방법에 의해 제조되는 레플리콘 RNA를 복제하고 또한 바이러스 입자를 산생하는 세포.
[5]상기 [4]에 기재된 세포를 배양해서 바이러스 입자를 산생시키는 것을 포함하는 C형간염 바이러스 입자의 제조방법.
[6]상기 [5]에 기재된 방법에 의해 제조되는 C형간염 바이러스 입자.
[7]상기 [4]에 기재된 세포를 배양하고, 배양물 중의 바이러스 입자를 다른 세포에 감염시키는 것을 포함하는 C형간염 바이러스 감염세포를 제조하는 방법.
[8]상기 [7]에 기재된 방법에 의해 제조되는 C형간염 바이러스 감염세포.
[9]피검물질의 존재하에서 하기 (a)~(c):
(a)상기 [4]에 기재된 세포
(b)상기 [8]에 기재된 C형간염 바이러스 감염세포, 및
(c)상기 [6]에 기재된 C형간염 바이러스 입자 및 C형간염 바이러스 감수성 세포,
중의 적어도 1개를 배양하고, 얻어지는 배양물 중의 레플리콘 RNA 또는 바이러스 입자를 검출하는 것을 포함하는, 항C형간염 바이러스 물질을 스크리닝하는 방법.
[10]상기 [6]에 기재된 C형간염 바이러스 입자 또는 그 일부분을 함유하는 C형간염 백신.
[11]상기 [6]에 기재된 C형간염 바이러스 입자 또는 그 일부분을 항원으로서 사용하여 C형간염 백신을 제조하는 방법.
[12]상기 [1] 또는 [2]에 기재된 것 중 어느 하나의 레플리콘 RNA를 사용해서 유전자치료를 위한 간세포지향성 바이러스 벡터를 제조하는 방법.
[13]상기 [12]에 기재된 방법에 의해 제조되는 간세포지향성 바이러스 벡터.
[14]외래유전자를 코드하는 RNA를 상기 [1] 또는 [2]에 기재된 것 중 어느 하나의 레플리콘 RNA 중에 삽입하고, 그것을 세포 중에 도입하는 것을 포함하는, 상기 세포 내에서 외래유전자를 복제 및/또는 발현시키는 방법.
[15]서열번호 12에 나타내는 염기서열로 이루어지는 RNA를 세포에 도입하는 것을 포함하는, 상기 RNA를 복제하고 또한 바이러스 입자를 산생하는 세포를 제조하는 방법.
[16]서열번호 12에 나타내는 염기서열로 이루어지는 RNA를 세포에 도입하고, 그 세포를 배양해서 바이러스 입자를 산생시키는 것을 포함하는 C형간염 바이러스 입자의 제조방법.
[17]세포가 증식성 세포인 상기 [15] 또는 [16]에 기재된 방법.
[18]서열번호 12에 나타내는 염기서열로 이루어지는 RNA에 외래유전자를 코드하는 RNA를 삽입하고, 그것을 세포에 도입하여 그 세포를 배양해서 바이러스 입자를 산생시키는 것을 포함하는, 외래유전자를 함유하는 바이러스 벡터를 제조하는 방법.
[19]상기 [6]에 기재된 C형간염 바이러스 입자에 대한 항체.
본 명세서는 본원의 우선권의 기초인 일본국 특허출원 2004-045489호의 명세서 및 도면에 기재되는 내용을 포함한다.
도 1은, 본 발명의 전체 길이 HCV 레플리콘 RNA 또는 전체 길이 HCV 게놈 RNA를 제조하기 위한 주형 DNA의 구축순서를 나타내는 개략도로서, 상단은 T7프로모터의 하류에 전체 길이 HCV 게놈을 삽입하여 제조한 플라스미드 클론 pJFH1의 구조를 나타내고, 하단은 pJFH1의 T7프로모터와 5'비번역영역의 하류에 네오마이신 내성 유전자와 EMCV IRES를 함유하는 DNA 단편을 삽입한, 전체 길이 HCV 게놈서열을 함유하는 플라스미드 클론 pFGREP-JFH1의 구조를 나타낸다. 도면 중의 기호는 이하와 같다. T7 : T7 RNA 프로모터, 5'UTR : 5'비번역영역, C : 코어 단백질, E1, E2 : 엔벨로프 단백질, NS2, NS3, NS4A, NS4B, 4A, 4B : 비구조 단백질, 3'UTR : 3'비번역영역, AgeI, PmeI, XbaI : 제한효소 AgeI, PmeI 및 XbaI의 절단부위, GDD : NS5B 단백질의 활성중심에 상당하는 아미노산 모티브 GDD의 위치, neo : 네오마이신 내성 유전자, EMCV IRES : EMCV IRES(뇌심근염 바이러스의 내부 리보솜 결합부위)
도 2는, 전체 길이 HCV 게놈 RNA인 rJFH-1을 도입한 Huh7 세포에 있어서의 rJFH-1의 복제를 나타내는 노던 블롯 해석의 결과를 나타내는 사진이다.
도 3은, 배지(培地) 중의 HCV 코어 단백질의 정량의 결과를 나타내고, 흰색 원은 rJFH1을 도입한 세포, 검은색 원은 rJFH1/GND를 도입한 세포를 나타내는 도면이다.
도 4는, rJFH-1을 도입한 Huh7 세포의 배양상청(上淸)을 자당밀도 구배에 의해 분획된 각 획분에 대한 HCV 코어 단백질량 및 전체 길이 HCV 게놈 RNA량, 및 비중을 나타내는 그래프로서, 검은색 원은 HCV 코어 단백질, 흰색 원은 전체 길이 HCV 게놈 RNA, 빗금선에 연결된 원은 비중을 나타낸다.
도 5는, 전체 길이 HCV 레플리콘 RNA인 rFGREP-JFH1을 트랜스펙션한 Huh7 세포의 콜로니 형성을 나타내는 사진이다.
도 6은, rFGREP-JFH1의 Huh7 세포로의 트랜스펙션에 의해 수립된 전체 길이 HCV 레플리콘 RNA 복제세포 클론에 있어서의, 전체 길이 HCV 레플리콘 RNA의 복제를 나타내는 사진이다.
도 7은, 게놈 DNA 중으로의 네오마이신 내성 유전자의 도입의 유무를 확인하기 위한, 숙주세포의 게놈 DNA를 주형으로 하고, 네오마이신 내성 유전자 특이적 프라이머를 사용하여 PCR 증폭한 결과를 나타내는 사진이다. M : DNA 사이즈 마커, P : 양성 대조, N : Huh7 세포.
도 8은, 전체 길이 HCV 레플리콘 RNA인 rFGREP-JFH1을 도입한 Huh7 세포에 있어서의 코어 단백질의 발현을 나타내는 웨스턴 블롯 해석의 결과를 나타내는 사 진이다.
도 9는, 전체 길이 HCV 레플리콘 RNA인 rFGREP-JFH1을 도입한 Huh7 세포에 있어서의 NS3 단백질의 발현을 나타내는 웨스턴 블롯 해석의 결과를 나타내는 사진이다.
도 10은, 전체 길이 HCV 레플리콘 RNA인 rFGREP-JFH1을 도입한 Huh7 세포에 있어서의 NS5A 단백질의 발현을 나타내는 웨스턴 블롯 해석의 결과를 나타내는 사진이다.
도 11은, rFGREP-JFH1을 도입한 Huh7 세포의 배양상청을 자당밀도 구배에 의해 분획된 각 획분에 대한 HCV 코어 단백질의 양 및 전체 길이 HCV 레플리콘 RNA량, 및 비중을 나타내는 그래프로서, 검은색 원은 HCV 코어(core) 단백질, 흰색 원은 전체 길이 HCV 레플리콘 RNA, 빗금선에 연결된 원은 비중을 나타낸다.
도 12는, 전체 길이 HCV 레플리콘 RNA 복제세포의 배양상청에 함유되는 바이러스 입자를 첨가한 Huh7 세포의 콜로니 형성을 나타내는 사진이다.
이하, 본 발명에 대해서 상세하게 설명한다.
1.전체 길이 HCV 레플리콘 RNA
C형간염 바이러스(HCV)의 게놈은 약 9600 뉴클레오티드로 이루어지는 (+)쇄의 단일쇄 RNA이다. 이 게놈 RNA는 5'비번역영역(5'NTR 또는 5'UTR로도 표기함), 구조영역과 비구조영역으로 구성되는 번역영역, 및 3'비번역영역(3'NTR 또는 3'UTR로도 표기함)으로 이루어진다. 그 구조영역에는 HCV의 구조 단백질이 코드되어 있 고, 비구조영역에는 복수의 비구조 단백질이 코드되어 있다.
이러한 HCV의 구조 단백질(core, E1, 및 E2)과 비구조 단백질(NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A, 및 NS5B)은 번역영역으로부터 일련의 폴리프로테인으로서 번역된 후, 프로테아제에 의한 한정분해를 받아서 유리, 생성된다. 이들 구조 단백질 및 비구조 단백질(즉, HCV의 바이러스 단백질) 중, core는 코어 단백질이며, E1 및 E2는 엔벨로프 단백질이다. 비구조 단백질은 바이러스 자신의 복제에 관여하는 단백질이며, NS2는 메탈로프로테아제 활성, NS3은 세린프로테아제 활성(N말단측의 3분의 1)과 헬리카제 활성(C말단측의 3분의 2)을 갖는 것이 알려져 있다. 또, NS4A는 NS3의 프로테아제 활성에 대한 코팩터이며, NS5B는 RNA 의존 RNA 폴리메라제 활성을 갖는 것도 보고되어 있다.
본 발명자들은 HCV 게놈 RNA를 이용해서 자율적으로 복제 가능하고, 또한 바이러스 입자 산생능을 갖는 레플리콘 RNA를 구축했다.
본 명세서에서는 자율 복제능을 갖고 있고 HCV 게놈 RNA를 개변해서 제조된 RNA를 「레플리콘 RNA」 또는 「RNA 레플리콘」이라고 칭한다. 본 명세서에 있어서 HCV유래의 레플리콘 RNA는 HCV-RNA 레플리콘이라고도 칭해진다. 본 명세서에서는 HCV 게놈 RNA의 전체 길이를 함유하는 본 발명의 레플리콘 RNA를 「전체 길이 HCV 레플리콘 RNA」라고 부른다. 본 발명의 전체 길이 HCV 레플리콘 RNA는 바이러스 입자 산생능을 갖는다.
본 발명의 전체 길이 HCV 레플리콘 RNA의 바람직한 실시형태에서는, C형간염 바이러스는 한정되는 것은 아니지만, 유전자형2a의 C형간염 바이러스인 것이 바람 직하다. 본 발명에 있어서 「유전자형2a의 C형간염 바이러스」 「유전자형2a의 HCV」란, Simmonds들(Simmonds,P.et al,Hepatology,(1994)10,p.1321-1324를 참조)에 의한 국제분류에 따라 유전자형2a로 분류되는 C형간염 바이러스를 의미한다. 본 발명에 있어서의 「유전자형2a의 C형간염 바이러스」 「유전자형2a의 HCV」에는, 천연유래의 HCV 게놈 RNA를 갖는 바이러스 뿐만 아니라, 천연유래의 HCV 게놈서열에 인위적인 개변을 가한 게놈 RNA를 갖는 바이러스도 포함된다. 유전자형2a의 HCV의 구체예로서는 JFH-1주(일본 특허공개 2002-171978호 공보를 참조)가 예시된다.
본 명세서에 있어서 「C형간염 바이러스의 게놈 RNA」란, C형간염 바이러스의 단일쇄의 (+)쇄 센스 RNA로 이루어지는 게놈의 전체 길이에 걸치는 염기서열을 갖는 RNA를 의미한다. 한정되는 것은 아니지만, 유전자형2a의 C형간염 바이러스의 게놈 RNA로서는 서열번호 12에 나타내는 염기서열로 이루어지는 RNA가 바람직하다.
본 발명에 따른 전체 길이 HCV 레플리콘 RNA의 하나의 실시형태는, C형간염 바이러스의 게놈 RNA상의 5'비번역영역, 코어 단백질 코드 서열, E1 단백질 코드 서열, E2 단백질 코드 서열, NS2 단백질 코드 서열, NS3 단백질 코드 서열, NS4A 단백질 코드 서열, NS4B 단백질 코드 서열, NS5A 단백질 코드 서열, NS5B 단백질 코드 서열, 및 3'비번역영역과, 적어도 1개의 선택 마커 유전자 또는 리포터 유전자와, 적어도 1개의 IRES 서열을 포함하는 염기서열로 이루어지는 레플리콘 RNA이다.
한정되는 것은 아니지만, 바람직하게는 본 발명의 전체 길이 HCV 레플리콘 RNA는, 5'비번역영역, 적어도 1개의 선택 마커 유전자 또는 리포터 유전자, 적어도 1개의 IRES 서열, 코어 단백질 코드 서열, E1 단백질 코드 서열, E2 단백질 코드 서열, NS2 단백질 코드 서열, NS3 단백질 코드 서열, NS4A 단백질 코드 서열, NS4B 단백질 코드 서열, NS5A 단백질 코드 서열, NS5B 단백질 코드 서열, 및 3'비번역영역을 5'에서 3'방향으로 이 순서로 함유한다.
본 명세서에 있어서 「5'비번역영역(5'NTR 또는 5'UTR)」, 「코어 단백질 코드 서열(core영역 또는 C영역)」, 「E1 단백질 코드 서열(E1영역)」, 「E2 단백질 코드 서열(E2영역)」, 「N2 단백질 코드 서열(NS2영역)」, 「NS3 단백질 코드 서열(NS3영역)」, 「NS4A 단백질 코드 서열(NS4A영역)」, 「NS4B 단백질 코드 서열(NS4B영역)」, 「NS5A 단백질 코드 서열(NS5A영역)」, 「NS5B 단백질 코드 서열(NS5B영역)」, 및 「3'비번역영역(3'NTR 또는 3'UTR)」, 및 다른 특정 영역 혹은 부위는 유전자형2a의 C형간염 바이러스인 JFH-1주(일본 특허공개 2002-171978호 공보)의 게놈의 전체 영역으로 이루어지는 전체 길이 게놈 RNA(서열번호 12)를 기준으로 해서 정할 수 있다.
혹은, 본원 발명에 있어서의 C형간염 바이러스(HCV) 게놈 중의 부분영역 또는 그 부위는 JFH-1주의 게놈 RNA(서열번호 12)의 부분 염기서열인 서열번호 1~11에 나타내는 서열을 기준으로 해서 정할 수도 있다. JFH-1주의 전체 길이 게놈 RNA(JFH-1 클론유래)(서열번호 12)의 「5'비번역영역」은 서열번호 1에 나타내는 염기서열로 이루어진다. 또, 「코어 단백질 코드 서열」은 서열번호 2에 나타내는 염기서열로 이루어진다. 「E1 단백질 코드 서열」은 서열번호 3에 나타내는 염기서열로 이루어진다. 「E2 단백질 코드 서열」은 서열번호 4에 나타내는 염기서열로 이루어진다. 「NS2 단백질 코드 서열」은 서열번호 5에 나타내는 염기서열로 이루어진다. 「NS3 단백질 코드 서열」은 서열번호 6에 나타내는 염기서열로 이루어진다. 「NS4A 단백질 코드 서열」은 서열번호 7에 나타내는 염기서열로 이루어진다. 「NS4B 단백질 코드 서열」은 서열번호 8에 나타내는 염기서열로 이루어진다. 「NS5A 단백질 코드 서열」은 서열번호 9에 나타내는 염기서열로 이루어진다. 「NS5B 단백질 코드 서열」은 서열번호 10에 나타내는 염기서열로 이루어진다. 「3'비번역영역」은 서열번호 11에 나타내는 염기서열로 이루어진다.
예를 들면, HCV유래의 RNA 서열 중의 영역 또는 부위는 그 RNA 서열을 서열번호 1~12에 나타내는 염기서열에 대하여 얼라인먼트하고, 서열번호 1~12의 서열 중의 염기번호를 기준으로 해서 정해도 된다. 이러한 얼라인먼트에 있어서는 서열사이에서 갭, 부가, 삭제, 치환 등이 존재해도 된다.
본 발명의 더욱 바람직한 실시형태에서는 본 발명의 전체 길이 HCV 레플리콘 RNA에 함유되는 5'비번역영역, 코어 단백질 코드 서열, E1 단백질 코드 서열, E2 단백질 코드 서열, NS2 단백질 코드 서열, NS3 단백질 코드 서열, NS4A 단백질 코드 서열, NS4B 단백질 코드 서열, NS5A 단백질 코드 서열, NS5B 단백질 코드 서열, 및 3'비번역영역이 각각 서열번호 1~11에 나타내는 염기서열을 갖는 것이 바람직하다.
본 발명에 따른 전체 길이 HCV 레플리콘 RNA의 바람직한 실시형태는 서열번호 1~11에 나타내는 염기서열과, 적어도 1개의 선택 마커 유전자 및/또는 리포터 유전자와, 적어도 1개의 IRES 서열로 이루어지는 레플리콘 RNA이다.
본 발명에 있어서 「선택 마커 유전자 」란, 그 유전자가 발현된 세포만이 선택되는 선택성을 세포에 부여할 수 있는 유전자를 의미한다. 선택 마커 유전자의 일반적인 예로서는 항생물질 내성 유전자가 예시된다. 본 발명에 있어서 바람직한 선택 마커 유전자의 예로서는 네오마이신 내성 유전자, 티미딘 키나제 유전자, 카나마이신 내성 유전자, 피리티아민 내성 유전자, 아데닐일트랜스페라제 유전자, 제오신 내성 유전자, 퓨로마이신 내성 유전자 등이 예시되지만, 네오마이신 내성 유전자, 티미딘 키나제 유전자가 바람직하고, 네오마이신 내성 유전자가 더욱 바람직하다. 단 본 발명에 있어서의 선택 마커 유전자는 이들에 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 발명에 있어서 「리포터 유전자 」란, 그 유전자발현의 지표가 되는 유전자산물을 코드하는 마커 유전자를 의미한다. 리포터 유전자의 일반적인 예로서는 발광반응이나 정색반응을 촉매하는 효소의 구조유전자가 예시된다. 본 발명에 있어서 바람직한 리포터 유전자의 예로서는 트랜스포슨 Tn9유래의 클로람페니콜 아세틸트랜스페라제 유전자, 대장균유래의 β글루쿠로니다제 혹은 β갈락토시다제 유전자, 루시페라제 유전자, 녹색형광 단백질 유전자, 해파리유래의 에쿼린 유전자, 분비형 태반 알칼리포스파타제(SEAP) 유전자 등이 예시된다. 단, 본 발명에 있어서의 리포터 유전자는 이들에 한정되는 것은 아니다.
상기의 선택 마커 유전자나 리포터 유전자는 전체 길이 HCV 레플리콘 RNA 속에 어느 한쪽만이 함유되어 있어도 되고, 양쪽이 함유되어 있어도 된다. 선택 마커 유전자 또는 리포터 유전자는 전체 길이 HCV 레플리콘 RNA에 1개 함유되어 있어도 되고, 2개이상 함유되어 있어도 된다.
본 발명에 있어서의 「IRES 서열 」이란, RNA의 내부에 리보솜을 결합시켜서 번역을 개시시킬 수 있는 내부 리보솜 결합부위를 의미한다. 본 발명에 있어서의 IRES 서열의 적합한 예로서는, 이하에 한정되는 것은 아니지만 EMCV IRES(뇌심근염 바이러스의 내부 리보솜 결합부위), FMDV IRES, HCV IRES 등이 예시되지만, EMCV IRES, 및 HCV IRES가 보다 바람직하고, EMCV IRES가 가장 바람직하다.
본 발명에 따른 전체 길이 HCV 레플리콘 RNA의 더욱 바람직한 하나의 실시형태는 서열번호 13에 나타내는 염기서열로 이루어지는 RNA이다. 또, 이 서열번호 13에 나타내는 염기서열에 있어서 1~100개, 바람직하게는 1~30개, 보다 바람직하게는 1~10개, 더욱 바람직하게는 1~6개, 가장 바람직하게는 1~수개(2~5개)의 염기가 삭제, 치환 또는 부가된 염기서열로 이루어지는 RNA이고, 또한 자율 복제능 및 바이러스 입자 산생능을 갖는 RNA도 바람직한 실시형태로서 본 발명의 전체 길이 HCV 레플리콘 RNA의 범위에 포함된다.
본 발명에 따른 전체 길이 HCV 레플리콘 RNA는, 그 전체 길이 HCV 레플리콘 RNA를 도입하는 세포 내에서 발현시키고 싶은 임의의 외래유전자를 코드하는 RNA를 더 포함해도 된다. 외래유전자를 코드하는 RNA는 5'비번역영역의 하류에 연결되어도 좋고, 선택 마커 유전자 혹은 리포터 유전자의 상류 또는 하류에 연결시켜도 좋으며, 3'비번역영역의 상류에 연결해도 된다. 또, 코어 단백질 코드 서열, E1 단백질 코드 서열, E2 단백질 코드 서열, NS2 단백질 코드 서열, NS3 단백질 코드 서열, NS4A 단백질 코드 서열, NS4B 단백질 코드 서열, NS5A 단백질 코드 서열, 및 NS5B 단백질 코드 서열 중 어느 하나의 사이에 삽입해도 된다.
외래유전자를 코드하는 RNA를 포함하는 전체 길이 HCV 레플리콘 RNA는, 도입된 세포 내에서 번역될 때에 상기 외래유전자에 코드되는 유전자산물을 발현할 수 있다. 따라서 외래유전자를 코드하는 RNA를 포함하는 전체 길이 HCV 레플리콘 RNA는, 외래유전자의 유전자산물을 세포 내에서 생성시키는 것을 목적으로 하는 경우에도 적합하게 사용할 수 있다.
본 발명에 따른 전체 길이 HCV 레플리콘 RNA는 리보자임을 함유하고 있어도 된다. 전체 길이 HCV 레플리콘 RNA 중의 선택 마커 유전자 및/또는 리포터 유전자의 하류에 리보자임을 연결해 두고, 그 리보자임의 자기절단 활성에 의해 선택 마커 유전자 및/또는 리포터 유전자가 IRES 서열, 코어 단백질 코드 서열, E1 단백질 코드 서열, E2 단백질 코드 서열, NS2 단백질 코드 서열, NS3 단백질 코드 서열, NS4A 단백질 코드 서열, NS4B 단백질 코드 서열, NS5A 단백질 코드 서열, NS5B 단백질 코드 서열, 및 3'비번역영역으로부터 분리되도록 할 수도 있다.
본 발명에 따른 전체 길이 HCV 레플리콘 RNA에 있어서는, 상술한 바와 같은 선택 마커 유전자 및/또는 리포터 유전자, 바이러스 단백질을 코드하는 서열, 및 외래유전자 또는 리보자임 등이 전체 길이 HCV 레플리콘 RNA로부터 바른 해독틀에서 번역되도록 연결된다. 전체 길이 HCV 레플리콘 RNA에 코드되는 단백질은, 일련의 폴리펩티드로서 번역되어 발현된 후에 프로테아제에 의해 각 단백질로 절단되어 유리되도록 프로테아제 절단부위 등을 통해서 서로 연결시키는 것이 바람직하다.
본 발명은 또한, 본원 발명의 레플리콘 RNA를 코드하는 DNA 벡터, 바람직하게는 발현벡터에도 관한 것이다.
또한, 본 발명에 있어서 RNA가 「자율 복제능을 갖는다 」란, RNA를 세포 중에 도입했을 때에 그 RNA가 자기증식하는 것을 의미한다. 한정되는 것은 아니지만, RNA의 자율 복제능은 예를 들면 대상으로 하는 RNA를 Huh7 세포 중에 트랜스펙션하고, 그 Huh7 세포를 배양하여 얻어지는 배양물 중의 세포로부터 추출한 RNA에 대해서, 도입한 RNA를 특이적으로 검출할 수 있는 프로브를 사용한 노던 블롯 하이브리다이제이션에 의해 RNA를 검출함으로써 확인할 수 있다. 자율 복제능을 확인하기 위한 구체적인 조작은 본 명세서의 실시예에 기재된 콜로니 형성능의 측정, HCV 단백질의 발현확인, 레플리콘 RNA의 검출 등의 기재에 예시되어 있다.
또한, 본 발명에 있어서 RNA가 「바이러스 입자 산생능을 갖는다 」란, 그 RNA를 세포(예를 들면 Huh7 세포 등의 배양세포)에 도입했을 때에 상기 세포 중에서 바이러스 입자가 산생되는 것을 의미한다. 바이러스 입자 산생능은, 예를 들면 대상으로 하는 RNA를 도입한 세포의 배양상청에 대해서 그 RNA에 특이적인 프라이머를 사용한 RT-PCR법에서의 검출을 행하는 방법, 또는 그 배양상청을 자당농도 구배법에 의해 바이러스 입자를 분리하고, HCV 단백질을 검출하는 방법 등에 의해 확인할 수 있다. 이들의 구체적인 조작은 본 명세서의 실시예에 기재된 콜로니 형성능의 측정, HCV 단백질의 발현확인, 레플리콘 RNA의 검출 등의 기재에 예시되어 있다.
2.전체 길이 HCV 레플리콘 RNA의 제조
본 발명에 따른 전체 길이 HCV 레플리콘 RNA는 당업자에 공지인 임의의 유전자공학적 방법을 이용하여 제조할 수 있다. 한정되는 것은 아니지만, 전체 길이 HCV 레플리콘 RNA는, 예를 들면 유전자형2a의 C형간염 바이러스로서 JFH-1주를 사용할 경우에는 이하와 같은 방법으로 제조할 수 있다.
우선, JFH-1주의 게놈 전체 영역의 RNA(서열번호 12)에 대응하는 DNA(이 서열은 국제 DNA 데이터 뱅크에 액세션 번호 AB047639로서 등록되어 있음)를, 통상의 방법에 의해 재구축해서 RNA 프로모터의 하류에 삽입하여 DNA 클론을 제조한다. 여기서 「RNA에 대응하는 DNA」란, 상기 RNA의 염기서열의 U(우라실)를 T(티민)으로 치환한 염기서열로 이루어지는 DNA를 의미한다. 상기 RNA 프로모터는 플라스미드 클론 중에 함유되는 것이 바람직하다. 바람직한 RNA 프로모터로서는, 한정되는 것은 아니지만 T7 RNA 프로모터, SP6 RNA 프로모터, SP3 RNA 프로모터가 예시되지만, T7 RNA 프로모터가 특히 바람직하다.
다음에 선택 마커 유전자 및/또는 리포터 유전자, 및 IRES 서열을 코드하는 DNA를 상기 DNA 클론에 삽입한다. 5'비번역영역의 하류에 선택 마커 유전자 및/또는 리포터 유전자를, 또한 그 하류에 IRES 서열을 삽입하는 것이 바람직하다.
이어서, 이상과 같이 해서 제조된 DNA 클론을 주형으로 해서 RNA 폴리메라제에 의해 RNA를 합성한다. RNA 합성은 5'비번역영역으로부터 통상의 방법에 의해 개시시킬 수 있다. DNA 클론이 플라스미드 클론일 경우에는, 플라스미드 클론으로부터 제한효소에 의해 잘라진 DNA 단편을 주형으로 해서 사용하여 RNA를 합성할 수도 있다. 또, 합성되는 RNA의 3'말단이 바이러스 게놈 RNA의 3'비번역영역의 말단과 일치되어 있어 다른 서열이 부가되거나 삭제되거나 하지 않는 것이 바람직하다. 이렇게 해서 합성되는 RNA가 본 발명에 따른 전체 길이 HCV 레플리콘 RNA이다.
3.HCV 입자의 제조
상기와 같이 해서 제조되는 전체 길이 HCV 레플리콘 RNA를 세포에 도입함으로써 전체 길이 HCV 레플리콘 RNA를 복제할 수 있고, 바람직하게는 지속적으로 복제할 수 있는(즉, 레플리콘 RNA의 복제능을 갖는) 재조합형 세포를 얻을 수 있다. 본 명세서에서는 전체 길이 HCV 레플리콘 RNA를 복제하고 있는 재조합형 세포를 「전체 길이 HCV 레플리콘 RNA 복제세포」라고 칭한다.
이 전체 길이 HCV 레플리콘 RNA 복제세포는 바이러스 입자를 산생할 수 있다. 산생된 바이러스 입자는 HCV의 바이러스 단백질로 구성되는 바이러스 셸 중에 전체 길이 HCV 레플리콘 RNA를 함유한다. 따라서 본 발명의 전체 길이 HCV 레플리콘 RNA 복제세포로부터 산생되는 바이러스 입자는 HCV 입자이다. 즉 본 발명에서는, 전체 길이 HCV 레플리콘 RNA 복제세포를 배양함으로써 HCV 입자를 세포배양계에서 제조할 수 있다. 바람직하게는, 전체 길이 HCV 레플리콘 RNA 복제세포를 배양하고, 그 배양물(바람직하게는 배양상청) 중에 산생된 바이러스 입자를 채취함으로써 HCV 입자를 취득할 수 있다.
혹은, HCV 입자는 전체 길이 HCV 게놈 RNA를 도입해서 얻어지는 재조합형 세포에 의해서도 산생된다. 본 발명에 따른 전체 길이 HCV 게놈 RNA(바람직하게는 JFH-1 클론유래의 전체 길이 HCV 게놈 RNA, 보다 바람직하게는 서열번호 12에 나타내는 염기서열을 갖는 RNA)를 도입한 세포에서는, 그 전체 길이 HCV 게놈 RNA가 고효율로 복제된다. 본 명세서에서는, 전체 길이 HCV 게놈 RNA를 복제하고 있는 재조합형 세포를 「전체 길이 HCV 게놈 RNA 복제세포」라고 칭한다. 이 전체 길이 HCV 게놈 RNA 복제세포에 의해 산생되는 바이러스 입자는, HCV의 바이러스 단백질로 구성되는 바이러스 셸 중에 전체 길이 HCV 게놈 RNA를 함유한다. 즉, 본 발명의 전체 길이 HCV 게놈 RNA를 도입한 세포로부터 산생되는 바이러스 입자는 HCV 입자이다. 한정되는 것은 아니지만, 바람직하게는 JFH-1 클론유래의 전체 길이 HCV 게놈 RNA(예를 들면 서열번호 12에 나타내는 염기서열을 갖는 RNA)를 도입한 세포를 배양함으로써 HCV 입자를 세포배양계에서 제조할 수 있다. 예를 들면, 전체 길이 HCV 게놈 RNA(예를 들면 서열번호 12에 나타내는 염기서열을 갖는 RNA)를 도입한 세포를 배양하고, 그 배양물(바람직하게는 배양상청) 중에 산생된 HCV 입자를 채취함으로써 HCV 입자를 취득할 수 있다.
상기의 전체 길이 HCV 레플리콘 RNA 또는 전체 길이 HCV 게놈 RNA를 도입하는 세포로서는 계대배양할 수 있는 세포이면 임의의 세포를 사용할 수 있지만, 진핵세포인 것이 바람직하고, 인간세포인 것이 보다 바람직하며, 인간 간유래 세포, 인간 자궁경부유래 세포, 또는 인간 태아신장유래 세포인 것이 더욱 바람직하다. 이들 세포로서는 암세포주나 간세포주 등을 포함하는 증식성 세포가 바람직하고, Huh7 세포, HepG2 세포, IMY-N9 세포, HeLa 세포, 또는 293 세포 등이 더욱 바람직하다. 이들 세포는 시판되는 것을 이용해도 좋고, 세포기탁 기관으로부터 입수하여 사용해도 좋으며, 임의의 세포(예를 들면 암세포 또는 간세포)로부터 주화(株化)한 세포를 사용해도 된다.
전체 길이 HCV 레플리콘 RNA 또는 전체 길이 HCV 게놈 RNA의 세포 내로의 도입은 당업자에게는 공지의 임의의 기술을 이용해서 행할 수 있다. 그러한 도입법으 로서는, 예를 들면 일렉트로포레이션, 파티클 건법, 리포펙션법, 인산칼슘법, 현미주사법, DEAE 세파로오스법 등이 예시되지만, 일렉트로포레이션에 의한 방법이 특히 바람직하다.
전체 길이 HCV 레플리콘 RNA 또는 전체 길이 HCV 게놈 RNA는 단독으로 도입해도 되고, 다른 핵산과 혼합시킨 것을 도입해도 된다. 도입하는 RNA량을 일정하게 하면서 전체 길이 HCV 레플리콘 RNA 또는 전체 길이 HCV 게놈 RNA의 도입량을 변경하고 싶을 경우에는, 원하는 도입량의 전체 길이 HCV 레플리콘 RNA 또는 전체 길이 HCV 게놈 RNA를, 도입하는 세포로부터 추출한 토털 세포성 RNA와 혼합해서 일정한 RNA 총량으로 하여 그것을 세포내 도입에 사용하면 된다. 세포내 도입에 사용하는 레플리콘 RNA의 양은 사용하는 도입법에 따라 정하면 되지만, 바람직하게는 1피코그램~100마이크로그램, 보다 바람직하게는 10피코그램~10마이크로그램의 양을 사용한다.
전체 길이 HCV 레플리콘 RNA 복제세포는, 전체 길이 HCV 레플리콘 RNA에 함유되는 선택 마커 유전자 또는 리포터 유전자의 발현을 이용하여 선택할 수 있다. 구체적으로는, 예를 들면 그러한 전체 길이 HCV 레플리콘 RNA의 세포내 도입처리를 실시한 세포를 선택 마커 유전자의 발현에 의해 선택 가능하게 되는 배지에 있어서 배양하면 된다. 혹은, 그러한 전체 길이 HCV 레플리콘 RNA의 세포내 도입처리를 실시한 세포를 배양한 후, 리포터 유전자(예를 들면 형광 단백질)의 발현에 대해서 검출하면 된다.
일례로서, 전체 길이 HCV 레플리콘 RNA에 네오마이신 내성 유전자가 선택 마 커 유전자로서 함유될 경우에는 그 전체 길이 HCV 레플리콘 RNA를 이용하여 일렉트로포레이션 처리한 세포를 배양접시에 파종하고, 12~72시간, 바람직하게는 16~48시간 배양한 후에 배양접시에 G418(네오마이신)을 0.05밀리그램/밀리리터~3.0밀리그램/밀리리터의 농도로 첨가하고, 그 후에 1주에 2회 배양액을 교환하면서 배양을 계속하여, 파종시부터 바람직하게는 10일간~40일간, 보다 바람직하게는 14일간~28일간 배양한 후에 크리스탈 바이올렛으로 생존세포를 염색함으로써, 도입된 전체 길이 HCV 레플리콘 RNA가 복제되어 있는 세포를 콜로니로서 선택할 수 있다.
형성된 콜로니로부터는 통상의 방법에 의해 세포를 클론화할 수 있다. 이렇게 해서 얻어지는 전체 길이 HCV 레플리콘 RNA를 복제하고 있는 세포 클론을 본 명세서에서는 「전체 길이 HCV 레플리콘 RNA 복제세포 클론」이라고 칭한다. 본 발명의 전체 길이 HCV 레플리콘 RNA 복제세포는 전체 길이 HCV 레플리콘 RNA 복제세포 클론을 포함한다.
전체 길이 HCV 레플리콘 RNA 복제세포에 대해서는 복제된 전체 길이 HCV 레플리콘 RNA를 검출하여, 전체 길이 HCV 레플리콘 RNA 중의 선택 마커 유전자 또는 리포터 유전자가 세포의 숙주 게놈 DNA에 도입되어 있지 않은 것을 확인하고, 또한 HCV 단백질의 검출을 행함으로써 실제로 상기 세포 또는 세포 클론이 전체 길이 HCV 레플리콘 RNA를 복제하고 있는 것을 확인할 수 있다.
복제된 전체 길이 HCV 레플리콘 RNA의 검출은 당업자에는 공지의 임의의 RNA 검출법에 따라서 행하면 좋지만, 예를 들면 세포로부터 추출한 토털 RNA에 대해서, 도입된 전체 길이 HCV 레플리콘 RNA에 대하여 특이적인 DNA 단편을 프로브로서 사 용하는 노던 하이브리다이제이션법을 실시함으로써 검출할 수 있다.
또한 전체 길이 HCV 레플리콘 RNA 중의 선택 마커 유전자 또는 리포터 유전자가 세포의 숙주 게놈 DNA에 도입되어 있지 않은 것의 확인은, 한정되는 것은 아니지만, 예를 들면 세포로부터 추출한 게놈 DNA에 대해서 상기 선택 마커 유전자 또는 리포터 유전자 중 적어도 일부를 증폭하는 PCR를 행하고, 그 증폭산물의 유무를 확인함으로써 행할 수 있다. 증폭산물이 확인된 세포에서는, 숙주 게놈 중에 선택 마커 유전자 또는 리포터 유전자가 도입되어 있다고 판단되는 점에서, 전체 길이 HCV 레플리콘 RNA 자체는 복제되어 있지 않을 가능성이 있다. 이 경우, 전체 길이 HCV 레플리콘 RNA가 복제되어 있는지의 여부를 다음에 설명하는 HCV 단백질의 검출에 의해 또한 확인할 수 있다.
HCV 단백질의 검출은, 예를 들면 도입된 전체 길이 HCV 레플리콘 RNA로부터 발현되어야 하는 HCV 단백질에 대한 항체를, 세포로부터 추출한 단백질과 반응시킴으로써 행할 수 있다. 이 방법은 당업자에게는 공지의 임의의 단백질 검출법에 의해 행할 수 있지만, 구체적으로는 예를 들면 세포로부터 추출한 단백질 시료를 니트로셀루로오스막에 블롯팅하고, 그것에 대해서 항HCV 단백질 항체(예를 들면 항NS3 특이적 항체, 또는 C형간염환자로부터 채취한 항혈청)를 반응시키며, 또 그 항HCV 단백질 항체를 검출함으로써 행할 수 있다. 세포로부터 추출한 단백질 중에서 HCV 단백질이 검출되면, 그 세포는 전체 길이 HCV 레플리콘 RNA를 복제하고, HCV 단백질을 발현하고 있는 것이라고 판단할 수 있다.
본 발명의 전체 길이 HCV 레플리콘 RNA 복제세포 또는 전체 길이 HCV 게놈 RNA 복제세포의 바이러스 입자 산생능은, 당업자에게는 공지의 임의의 바이러스 검출법에 따라서 확인하면 된다. 예를 들면 바이러스 입자를 산생하고 있다고 생각되는 세포의 배양상청을 자당밀도 구배에 의해 분획하고, 각 획분의 밀도, HCV 코어 단백질 농도, 및 전체 길이 HCV 레플리콘 RNA 혹은 전체 길이 HCV 게놈 RNA의 양을 측정한 결과, HCV 코어 단백질과 전체 길이 HCV 레플리콘 RNA 혹은 전체 길이 HCV 게놈 RNA의 피크가 일치하고, 또 그 피크가 검출되는 획분의 밀도가 배양상청을 25％ NP40(폴리옥시에틸렌(9)옥틸페닐에테르[Polyoxyethylene(9)Octylphenyl Ether])으로 처리하고나서 분획된 경우의 동 획분의 밀도와 비교해서 가벼울(예를 들면 1.18~1.20㎎) 경우에는, 상기 세포는 바이러스 입자 산생능을 갖는다고 판정할 수 있다.
배양상청 중에 방출된 HCV 바이러스 입자는, 예를 들면 코어 단백질, E1 단백질, 또는 E2 단백질에 대한 항체를 이용하여 검출할 수도 있다. 또, 배양상청 중의 전체 길이 HCV 레플리콘 RNA를, 특이적 프라이머를 사용한 RT-PCR법에 의해 증폭해서 검출함으로써 HCV 바이러스 입자의 존재를 간접적으로 검출할 수도 있다.
4.본 발명의 HCV 입자의 다른 세포로의 감염
본 발명의 HCV 바이러스 입자는 세포(바람직하게는 HCV 감수성 세포)로의 감염능을 갖는다. 본 발명은 전체 길이 HCV 레플리콘 RNA 복제세포 또는 전체 길이 HCV 게놈 RNA 복제세포를 배양하고, 얻어진 배양물(바람직하게는 배양상청) 중의 바이러스 입자를 다른 세포(바람직하게는 HCV 감수성 세포)에 감염시키는 것을 포함하는 C형간염 바이러스 감염세포를 제조하는 방법에도 관한 것이다. 본 발명에 있어서 HCV 감수성 세포란, HCV에 대하여 감염성을 갖는 세포이며, 바람직하게는 간장세포 또는 임파구계 세포이지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. 구체적으로는, 간장세포로서는 초대간장 세포나 Huh7 세포, HepG2 세포, IMY-N9 세포, HeLa 세포, 203 세포 등이 예시되고, 임파구계 세포로서는 Molt4 세포나 HPB-Ma 세포, Daudi 세포 등이 예시되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 전체 길이 HCV 레플리콘 RNA 복제세포에 있어서 산생된 HCV 입자를 세포(예를 들면 HCV 감수성 세포)에 감염시키면, 그 감염세포 중에서는 전체 길이 HCV 레플리콘 RNA가 복제되고, 또한 바이러스 입자가 형성된다. 전체 길이 HCV 레플리콘 RNA 복제세포에 있어서 산생된 바이러스 입자에 감염된 세포는 선택 마커 유전자 및/또는 리포터 유전자를 발현하므로, 그 발현을 이용해서 선택 및/또는 검출하는 것이 가능하다. 본 발명의 전체 길이 HCV 레플리콘 RNA 복제세포에 있어서 산생된 바이러스 입자를 세포에 감염시킴으로써, 전체 길이 HCV 레플리콘 RNA가 세포 내에서 복제되어 바이러스 입자를 더 제조할 수 있다.
또한, 본 발명의 전체 길이 HCV 게놈 RNA 복제세포에 있어서 산생된 HCV 입자를 세포(예를 들면 HCV 감수성 세포)에 감염시킴으로써, 그 감염세포 중에서 전체 길이 HCV 게놈 RNA가 복제되어 바이러스 입자가 형성된다. 본 발명의 전체 길이 HCV 게놈 RNA 복제세포에 있어서 산생된 바이러스 입자를 세포에 감염시킴으로써, 전체 길이 HCV 게놈 RNA가 세포 내에서 복제되어 바이러스 입자를 더 제조할 수 있다.
본 발명의 전체 길이 HCV 레플리콘 RNA 복제세포 또는 전체 길이 HCV 게놈 RNA 복제세포에 있어서 산생된 HCV 바이러스 입자는, 침팬지 등의 HCV 바이러스에 감염될 수 있는 동물에 감염시켜서 HCV유래의 간염을 일으킬 수 있다.
5.본 발명의 다른 실시형태
본 발명의 전체 길이 HCV 레플리콘 RNA 복제세포에서는 전체 길이 HCV 레플리콘 RNA가 고효율로 복제된다. 또, 본 발명의 전체 길이 HCV 게놈 RNA 복제세포에서도 전체 길이 HCV 게놈 RNA가 고효율로 복제된다. 따라서, 본 발명의 전체 길이 HCV 레플리콘 RNA 복제세포 또는 전체 길이 HCV 게놈 RNA 복제세포를 이용하여, 전체 길이 HCV 레플리콘 RNA 또는 전체 길이 HCV 게놈 RNA를 고효율로 제조할 수 있다.
본 발명에서는 전체 길이 HCV 레플리콘 RNA 복제세포를 배양하고, 배양물(배양세포 및/또는 배양 배지)로부터 RNA를 추출하여 그것을 전기영동법에 의해, 분리된 전체 길이 HCV 레플리콘 RNA를 단리 정제함으로써 전체 길이 HCV 레플리콘 RNA를 제조할 수 있다. 전체 길이 HCV 게놈 RNA 복제세포를 사용한 경우에도 같은 방법으로 전체 길이 HCV 게놈 RNA를 제조할 수 있다. 이렇게 해서 제조되는 RNA는 C형간염 바이러스의 전체 길이 게놈서열을 함유한다. 이 경우, C형간염 바이러스의 전체 길이 게놈서열은 선택 마커 유전자 및/또는 리포터 유전자서열에 IRES 서열에 의해 분단되어 있어도 된다. C형간염 바이러스의 전체 길이 게놈서열을 함유하는 RNA의 제조방법이 제공됨으로써 C형간염 바이러스 게놈에 관하여 보다 상세한 분석이 가능하게 된다.
또한 본 발명의 전체 길이 HCV 레플리콘 RNA 복제세포 또는 전체 길이 HCV 게놈 RNA 복제세포는, HCV 단백질을 제조하기 위해 바람직하게 사용할 수 있다. HCV 단백질의 제조는 당업자에게 주지의 임의의 방법에 의해 행하면 되지만, 예를 들면 전체 길이 HCV 레플리콘 RNA 또는 전체 길이 HCV 게놈 RNA를 세포에 도입해서 재조합형 세포를 제조하고, 상기 재조합형 세포를 배양하여 얻어지는 배양물(배양세포 및/또는 배양 배지)로부터 통상의 방법에 의해 단백질을 회수함으로써 행하면 된다.
또한 본 발명의 HCV 바이러스 입자는 간세포지향성을 가질 수 있다. 그 때문에 본 발명의 전체 길이 HCV 레플리콘 RNA를 사용하여 간세포지향성 바이러스 벡터를 제조할 수 있다. 이 바이러스 벡터는 유전자 치료용으로 바람직하게 사용된다. 본 발명에서는 외래유전자를 코드하는 RNA를 전체 길이 HCV 레플리콘 RNA 또는 전체 길이 HCV 게놈 RNA에 도입하고, 그 RNA를 세포에 도입함으로써 상기 외래유전자를 세포 중에 도입하여 세포 내에서 복제시키며, 또한 발현시킬 수 있다. 또한, 전체 길이 HCV 레플리콘 RNA 또는 전체 길이 HCV 게놈 RNA 중의 E1 단백질 코드 서열, 및/또는 E2 단백질 코드 서열을, 다른 생물종유래의 바이러스의 외각단백질로 변환한 RNA를 제조함으로써 그 RNA를 여러 가지 생물종의 세포에 감염시킬 수도 있게 된다. 이 경우에도 전체 길이 HCV 레플리콘 RNA 또는 전체 길이 HCV 게놈 RNA에 더 외래유전자를 도입해서 그것을 상기 외래유전자를 간세포에서 발현시키기 위한 간세포지향성 바이러스 벡터로서 사용할 수 있다.
본 발명은 서열번호 12에 나타내는 염기서열로 이루어지는 RNA에 외래유전자를 코드하는 RNA를 삽입하고, 그것을 세포에 도입하여 그 세포를 배양해서 바이러 스 입자를 산생시키는 것을 포함하는, 외래유전자를 함유하는 바이러스 벡터를 제조하는 방법에도 관한 것이다.
본 발명은 본 발명에 따른 HCV 입자 또는 그 일부분을 백신 항원으로서 함유하는 C형간염 백신, 및 본 발명에 따른 HCV 입자 또는 그 일부분을 항원으로서 사용하여 C형간염 백신을 제조하는 방법도 제공한다.
구체적으로는, 제작된 HCV 입자를 직접 백신으로서 사용할 수도 있고, 해당 분야에서 이미 알려진 방법에 의해 약독화 또는 불활화해서 사용할 수도 있다. 예를 들면, 조제한 HCV 입자를 컬럼 크로마토그래피, 여과, 원심 등에 의해 정제함으로써 HCV 백신 원액을 얻은 후, 이러한 원액으로부터 약독생 HCV 백신 혹은 불활화 HCV 백신을 조제하면 된다. 또, 바이러스의 불활화는 포르말린, β-프로피오락톤, 글루타르디알데히드 등의 불활화제를 예를 들면 바이러스 부유액에 첨가해서 혼합하고, 바이러스와 반응시킴으로써 달성할 수 있다(Appaiahgari et al.,백신,(2004) 22(27-28),p.3669-3675).
본 발명의 백신의 제조에는, HCV 레플리콘 RNA에 공지의 기술을 이용해서 변이를 도입하여 병원성을 원약(原弱) 혹은 소실시킨 것을 사용할 수도 있다.
본 발명의 백신은 용액 또는 현탁액 중 어느 하나로서 투여 가능하게 조제된다. 액체 중의 용해 또는 현탁에 적합한 고형물의 형태로 조제할 수 있다. 조제물은 유탁되거나 또는 리포솜으로 캡슐화될 수 있다. HCV 입자 등의 활성 면역원성 성분은 의약상 허용되는 활성 성분에 적합한 부형제가 종종 혼합된다. 적절한 부형제로는, 예를 들면 물, 생리식염수, 포도당, 글리세롤, 에탄올 등 및 그들의 혼합 물이 있다. 또, 원한다면, 백신은 소량의 보조제(예를 들면 가습제 또는 유화제), pH완충제, 및/또는 백신의 효능을 높이는 애쥬번트를 함유할 수 있다. 유효할 수 있는 애쥬번트의 예는 한정되지 않지만, 이하를 포함한다. 수산화알루미늄, N-아세틸-무라밀-L-스레오닐-D-이소글루타민(thr-MDP), N-아세틸-노르-무라밀-L-아라닐-D-이소글루타민(CGP11637, nor-MDP라고 칭해짐), N-아세틸무라밀-L-아라닐-D-이소글루타미닐-L-알라닌-2-(1'-2'-디팔미토일-sn-글리세로-3-히드록시포스포릴옥시)-에틸아민(CGP19835A, MTP-PE라고 칭해짐), 및 RIBI. RIBI는 박테리아로부터 추출한 3성분, 즉 모노포스포릴리피드A, 트레할로스디미콜레이트, 및 세포벽 골격(HPL+TDM+CWS)을 2% 스쿠알렌/Tween(등록상표) 80에멀젼 중에 함유하고 있다. 애쥬번트의 효능은, HCV 입자로 구성되는 백신을 투여함으로써 생기는 이 면역원성 HCV 입자에 대한 항체의 양을 측정함으로써 결정될 수 있다.
본 백신은 통상 비경구적으로 예를 들면 피하주사 또는 근육내 주사와 같은 주사에 의해 투여된다. 다른 투여경로에 적합한 별도의 제형으로서 좌약, 및 경우에 따라 경구제제가 예시된다.
원하는 바에 따라, 애쥬번트 활성을 갖는 1이상의 화합물을 HCV 백신에 첨가할 수 있다. 애쥬번트는 상기 면역계의 비특이적 자극인자이다. 그들은 HCV 백신에 대한 숙주의 면역응답을 증강한다. 상기 기술분야에서 공지의 애쥬번트의 구체예로서는 프로인트 완전 및 불완전 애쥬번트, 비타민E, 비이온 블록 중합체, 무라밀디펩티드, 사포닌, 광유, 식물유 및 Carbopol이 예시된다. 점막적용에 특히 적합한 애쥬번트로서는, 예를 들면 대장균(E.coli) 역열성 독소(LT) 또는 콜레라(Cholera) 독소(CT)가 예시된다. 다른 적당한 애쥬번트로서는, 예를 들면 수산화알루미늄, 인산알루미늄 또는 산화알류미늄, 유성 유제(예를 들면, Bayol(등록상표) 또는 Marcol52(등록상표)의 것), 사포닌 또는 비타민E 솔루빌리세이트가 예시된다. 바람직한 형태에 있어서는 본 발명의 백신은 애쥬번트를 함유한다.
예를 들면 피하, 피내, 근육내, 정맥내에 투여하는 주사제에 있어서, 본 발명의 HCV 백신과 함께 함유되는 의약상 허용되는 담체 또는 희석제의 다른 구체예로서는 안정화제, 탄수화물(예를 들면 소르비톨, 만니톨, 전분, 자당, 글루코오스, 덱스트란), 알부민 또는 카세인 등의 단백질, 소혈청 또는 탈지유 등의 단백질함유 물질, 및 버퍼(예를 들면 인산 버퍼) 등이 예시된다.
좌약에 사용되는 종래의 결합제 및 담체에는, 예를 들면 폴리알킬렌글리콜 또는 트리글리세리드가 함유될 수 있다. 좌약은 활성성분을 0.5%에서 50%까지의 범위에서, 바람직하게는 1%에서 20%까지의 범위에서 함유되는 혼합물로 형성할 수 있다. 경구제제는 통상 사용되는 부형제를 함유해도 된다. 이 부형제로서는, 예를 들면 제약등급의 만니톨, 락토제, 전분, 스테아린산마그네슘, 사카린나트륨, 셀룰로오스, 탄산마그네슘 등이 예시된다.
본 발명의 백신은 용액, 현탁액, 정제, 환제, 캡슐제, 지속방출제제, 또는 분제의 제형을 취할 수 있고, 10%~95%, 바람직하게는 25%~70%의 활성 성분(바이러스 입자 또는 그 일부분)을 함유한다.
본 백신은 투여제형에 적합한 방법으로, 그리고 예방 및/또는 치료효과가 있는 양으로 투여된다. 투여되어야 하는 양은 통상 1회의 투여당 항원을 0.01㎍에서 100,000㎍까지의 범위이며, 이것은 처치되는 환자, 그 환자의 면역계에서의 항체합성능, 및 원하는 방어의 정도에 의존하고, 경구, 피하, 피내, 근육내, 정맥내 경로 등의 투여경로에도 의존한다.
본 백신은 단독투여 스케줄에서, 또는 바람직하게는 복합투여 스케줄에서 주어질 수 있다. 복합투여 스케줄에서는 접종의 개시시기에 1~10회의 개별투여를 행하고, 계속해서 면역응답을 유지하는 및 또는 강화하기 위해 필요하게 되는 시간간격으로, 예를 들면 2회째의 투여로 해서 1~4개월 후에 별도의 투여를 행할 수 있다. 필요하면, 수개월 후에 계속해서 투여를 행할 수 있다. 투여계획도 또한, 적어도 부분적으로는 개개의 환자의 필요성에 따라 결정되고, 의사의 판단에 의존한다.
또한, 면역원성 HCV 입자를 함유하는 백신은 다른 면역제어제(예를 들면 면역 글로불린)와 함께 투여해도 된다.
HCV 입자 백신은 건강한 보통사람에게 투여해서, 건강한 보통사람에게 HCV에 대한 면역응답을 유도함으로써 새롭게 생길 수 있는 HCV 감염에 대하여 예방적으로 사용할 수도 있다. 또, HCV 입자 백신을 HCV에 감염된 환자에 투여하고, 생체 내에 HCV에 대한 강한 면역반응을 유도함으로써 HCV를 배제하는 치료적 백신으로서 사용할 수도 있다.
본 발명의 전체 길이 HCV 레플리콘 RNA 복제세포 또는 전체 길이 HCV 게놈 RNA 복제세포, 또는 그들의 세포에 있어서 산생되는 바이러스 입자를 감염시킨 C형간염 바이러스 감염세포를, 예를 들면 C형간염 바이러스의 복제, 바이러스 입자의 재구축, 바이러스 입자의 방출을 촉진 또는 억제하는 물질(항C형간염 바이러스 물 질)을 스크리닝하기 위한 시험계로서 사용할 수도 있다. 구체적으로는, 예를 들면 피검물질의 존재 하에서 그들 세포를 배양하고, 얻어지있는 배양물 중의 전체 길이 HCV 레플리콘 RNA 혹은 전체 길이 HCV 게놈 RNA 또는 바이러스 입자를 검출하며, 그 피검물질이 레플리콘 RNA 혹은 전체 길이 HCV 게놈 RNA의 복제 또는 바이러스 입자의 형성 혹은 방출을 촉진 또는 억제하는지의 여부를 판정함으로써, C형간염 바이러스의 증식을 촉진 또는 억제하는 물질을 스크리닝할 수 있다. 이 경우, 배양물 중의 전체 길이 HCV 레플리콘 RNA 혹은 전체 길이 HCV 게놈 RNA의 검출은, 상기 세포로부터 추출한 RNA 중의 전체 길이 HCV 레플리콘 RNA 혹은 전체 길이 HCV 게놈 RNA의 양, 비율 혹은 유무를 측정하는 것에 의한 것으로서 좋다. 배양물(주로 배양상청) 중의 바이러스 입자의 검출은 배양상청 중에 함유되는 HCV 단백질의 양, 비율 혹은 유무를 검출하는 것으로서 좋다.
또한 본 배양물 중의 바이러스 입자를 검출함으로써, HCV 감염환자 혈청으로부터 정제한 면역 글로불린이 본 발명에 의한 HCV 바이러스 입자의 감염을 저지하는 능력을 갖는지의 여부를 검토할 수 있다. 이 시험에 있어서는, 본 발명의 HCV 바이러스 입자에 의해 면역된 생쥐, 쥐, 토끼 등의 혈청을 사용해도 된다. HCV의 부분단백질, HCV 유전자 등에 의한 면역을 이용해도 된다. 항체분자 이외의, 감염을 저지할 수 있는 다른 물질에 대해서도 이 시험을 마찬가지로 적용할 수 있다.
본 발명의 HCV 바이러스 입자에 대하여 산생되는 본 발명의 항체에는 폴리클로날 항체 및 모노클로날 항체를 포함한다. 폴리클로날 항체가 바람직할 경우, 우선, 선택된 포유류(예를 들면 생쥐, 토끼, 염소, 양, 말 등)를 본 발명의 HCV 입자 로 면역감작한다. 감작동물유래의 혈청을 채집하고, 이미 알려진 방법에 따라 처리한다. HCV 에피토프에 대한 폴리클로날 항체를 함유하는 혈청이 다른 항원에 대한 항체를 함유할 경우에는, 이 폴리클로날 항체를 면역친화 크로마토그래피에 의해 정제하면 된다. 폴리클로날 항혈청을 산생시키는 방법 및 그것을 처리하는 방법은 해당 분야에서 이미 알려져 있다. 폴리클로날 항체는 이미 HCV에 감염된 포유류로부터 단리해도 된다.
HCV 에피토프에 대한 모노클로날 항체도 또한, 당업자에 의해 용이하게 제조될 수 있다. 모노클로날 항체를 산생하는 하이브리도마를 제조하는 일반적인 방법은 두루 알려져 있다. 예를 들면 Current Protocols in Immunology(John Wiley & Sons,Inc.)에 기재된 방법을 이용할 수 있다.
모노클로날 항체산생 세포주는 세포융합에 의해 생성해도 좋고, 또 종상유전자 DNA에 의한 B임파구의 직접 형질 전환 또는 Epstein-Barr 바이러스에서의 형질이입과 같은 다른 방법에 의해서 생성해도 된다.
이들 방법에 의해 얻어진 모노클로날 항체나 폴리클로날 항체는 HCV의 진단이나 치료, 예방에 유용하다.
본 발명의 HCV 입자를 이용하여 제조된 항체는 의약상 허용되는 용해제, 첨가제, 안정화제, 버퍼 등과 함께 투여된다. 투여경로는 어떤 투여경로라도 좋지만, 바람직하게는 피하, 피내, 근육내 투여이며, 보다 바람직하게는 정맥내 투여가 바람직하다.
본 발명의 전체 길이 HCV 레플리콘 RNA 복제세포 또는 전체 길이 HCV 게놈 RNA 복제세포에 있어서 산생된 HCV 입자와 HCV 감수성 세포를, HCV의 세포로의 결합을 촉진 또는 억제하는 물질을 스크리닝하기 위한 시험계로서 사용할 수도 있다. 구체적으로는 예를 들면, 피검물질의 존재 하에서 본 발명의 전체 길이 HCV 레플리콘 RNA 복제세포에 있어서 산생된 HCV 입자와 함께 HCV 감수성 세포를 배양하고, 얻어지는 배양물 중의 전체 길이 HCV 레플리콘 RNA 또는 바이러스 입자를 검출하며, 그 피검물질이 레플리콘 RNA의 복제 또는 바이러스 입자의 형성을 촉진 또는 억제하는지의 여부를 판정함으로써, C형간염 바이러스의 증식을 촉진 또는 억제하는 물질을 스크리닝할 수 있다.
이러한 전체 길이 HCV 레플리콘 RNA 혹은 전체 길이 HCV 게놈 RNA 또는 바이러스 입자의 검출은 상기의 방법 또는 후술의 실시예에 따라 행할 수 있다. 상기 시험계는 C형간염 바이러스 감염의 예방제, 치료제 혹은 진단제의 제조 또는 평가를 위해서도 사용할 수 있다.
구체적으로는, 본 발명의 상기 시험계의 이용예로서는 이하가 예시된다.
(1)HCV의 증식 및 감염을 억제하는 물질의 탐색
HCV의 증식 및 감염을 억제하는 물질로서는, 예를 들면 직접적 혹은 간접적으로 HCV의 증식 및 감염에 영향을 미치는 유기 화합물, 혹은 HCV 게놈 혹은 그 상보쇄의 표적서열에 하이브리다이즈함으로써 HCV의 증식 혹은 HCV 단백질의 번역에 직접적 또는 간접적으로 영향을 미치게 하는 안티센스 올리고뉴클레오티드 등이 예시된다.
(2)세포배양 중에서 항바이러스작용을 갖는 각종 물질의 평가
상기 각종 물질로서는 합리적 드래그 디자인 또는 하이스루풋 스크리닝을 이용하여 얻어진 물질(예를 들면 단리 정제된 효소) 등이 예시된다.
(3)HCV에 감염된 환자의 치료를 위한 신규공격 표적의 분류
예를 들면 HCV 바이러스 증식을 위해 중요한 역활을 다하는 숙주세포성 단백질을 분류하기 위해, 본 발명에 따른 전체 길이 HCV 레플리콘 RNA 복제세포 또는 전체 길이 HCV 게놈 RNA 복제세포를 사용할 수 있다.
(4)HCV 바이러스의 약제 등에 대한 내성획득능의 평가 및 상기 내성에 관한 변이의 분류
(5)C형간염 바이러스 감염의 진단약 또는 치료약의 개발, 제조 및 평가를 위해 사용 가능한 항원으로서의 바이러스 단백질의 제조
(6)C형간염 바이러스 감염의 백신의 개발, 제조 및 평가를 위해 사용 가능한 항원으로서의 바이러스 단백질 및 약독화 HCV의 제조
(7)C형간염 바이러스 감염의 진단 또는 치료용 폴리클로날 항체 혹은 모노클로날 항체 및 폴리클로날 항체의 제조.
본 발명을 이하의 실시예 및 도면에 기초하여 더욱 구체적으로 설명한다. 단, 본 발명의 기술적 범위는 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
[실시예1] 전체 길이 HCV 게놈 RNA유래의 전체 길이 HCV 레플리콘 RNA의 제조
(A)발현 벡터의 구축
극증간염 환자로부터 분리한 C형간염 바이러스인 JFH-1주(유전자형2a)의 게 놈 전체 길이 cDNA를 포함하는 DNA(JFH-1 클론)을, pUC19 플라스미드 중에서 T7 RNA 프로모터 서열의 하류에 삽입한 플라스미드 DNA를 제조했다.
구체적으로는, JFH-1주의 바이러스 RNA를 증폭한 RT-PCR 단편을 pGEM-T EASY vector(Promega)에 클로닝해서 pGEM1-258, pGEM44-486, pGEM317-849, pGEM617-1323, pGEM1141-2367, pGEM2285-3509, pGEM3471-4665, pGEM4547-5970, pGEM5883-7003, pGEM6950-8035, pGEM7984-8892, pGEM8680-9283, pGEM9231-9634 및 pGEM9594-9678의 각 플라스미드 DNA를 얻었다(비특허문헌6을 참조). 각 플라스미드에 함유되는 바이러스 게놈 RNA유래의 cDNA를 PCR법 및 제한효소를 이용하여 서로 연결시켜서 전체 길이의 바이러스 게놈 cDNA를 클로닝했다. 전체 길이의 바이러스 게놈의 상류에 T7R RNA 프로모터 서열을 삽입했다. 이렇게 해서 구축된 플라스미드 DNA를 이하 pJFH1이라고 칭한다(도 1 상단). 또, 상기 JFH-1 클론의 제조에 대해서는 특허문헌1 및 비특허문헌3에 기재되어 있다. 또한 JFH-1 클론의 전체 길이 cDNA의 염기서열은 국제 DNA 데이터 뱅크(DDBJ/EMBL/GenBank)의 액세션 번호:AB047639에 등록되어 있다.
다음에, 플라스미드 DNA인 pJFH1의 5'비번역영역과 core영역 사이에 EMCV-IRES(뇌심근염 바이러스의 내부 리보솜 결합부위) 및 네오마이신 내성 유전자(neo;네오마이신 포스포트랜스페라제 유전자라고도 칭함)를 삽입하여 플라스미드 DNA인 pFGREP-JFH1을 구축했다(도 1의 하단). 이 구축순서는 기보(비특허문헌4)를 따랐다. 또, pJFH1 및 pFGREP-JFH1 중의 NS5B 영역에 대하여, 상기 영역에 코드되는 RNA 폴리메라제의 활성중심에 상당하는 아미노산 모티브 GDD를 GND로 변이시키는 돌연변이를 도입해서, 돌연변이 플라스미드 클론 pJFH1/GND, 및 pFGREP-JFH1/GND도 제조했다. 돌연변이 클론 pJFH1/GND 및 pFGREP-JFH1/GND는, 그것에 코드되는 NS5B 단백질의 활성부위의 아미노산서열이 변이되어 있으므로 레플리콘 RNA를 복제하는데 필요한 활성 NS5B 단백질을 발현할 수 없다.
또한, 리포터 유전자 도입 발현 벡터로서 pFGREP-JFH1의 415에서 420번의 MluI사이트와 2075에서 2082번의 PmeI사이트 사이에 루시페라제 유전자를 도입하고, pFGREP-JFH1의 네오마이신 내성 유전자를 루시페라제 유전자로 치환한 pFGREP-JFH1/Luc를 제조했다. 또, pFGREP-JFH1/Luc의 10933번을 G으로부터 A로 변이시키고, NS5b의 RNA 폴리메라제의 활성중심의 GDD 모티브를 GND로 바꾼 변이체 pFGREP-JFH1/Luc/GND를 제조했다.
pFGREP-JFH1의 415에서 420번의 MluI사이트와 1142에서 1149번의 PmeI사이트 사이에 녹색형광 단백질 유전자를 도입하고, pFGREP-JFH1의 네오마이신 내성 유전자를 녹색형광 단백질 유전자로 치환한 pFGREP-JFH1/EGFP를 제조했다. 또, pFGREP-JFH1/EGFP의 10000번을 G에서 A로 변이시키고, NS5b의 RNA 폴리메라제의 활성중심의 GDD 모티브를 GND로 바꾼 변이체 pFGREP-JFH1/EGFP/GND를 제조했다.
pFGREP-JFH1의 415에서 420번의 MluI사이트와 1982에서 1989번의 PmeI사이트 사이에 분비형 태반 알칼리성 포스파타제 유전자를 도입하고, pFGREP-JFH1의 네오마이신 내성 유전자를 분비형 태반 알칼리성 포스파타제 유전자로 치환한 pFGREP-JFH1/SEAP를 제조했다. 또, pFGREP-JFH1/SEAP의 10840번을 G에서 A로 변이시키고, NS5b의 RNA 폴리메라제의 활성중심의 GDD 모티브를 GND로 바꾼 변이체 pFGREP- JFH1/SEAP/GND를 제조했다.
(B)전체 길이 HCV 게놈 RNA와 전체 길이 HCV 레플리콘 RNA의 제조
전체 길이 HCV 게놈 RNA 합성 및 전체 길이 HCV 레플리콘 RNA 합성에 사용하는 주형 DNA를 제조하기 위해, 상기와 같이 구축한 발현 벡터 pJFH1, pJFH1/GND, pFGREP-JFH1, pFGREP-JFH1/GND를 각각 제한효소 XbaI로 절단했다. 이어서, 이들 XbaI 절단단편의 각각에 대해서 10~20㎍을 50μl의 반응액 중에 함유시켜, Mung Bean Nuclease 20 U를 이용하여 30℃에서 30분간 인큐베이트함으로써 더 처리했다. Mung Bean Nuclease는 이중쇄 DNA 중의 단일쇄부분을 선택적으로 분해하는 반응을 촉매하는 효소이다. 통상, 상기 XbaI 절단단편을 그대로 주형으로서 사용하여 RNA 합성을 행하면, XbaI의 인식서열의 일부인 CUGA의 4염기가 3'말단에 더 부가된 레플리콘 RNA가 합성되어버린다. 그래서 본 실시예에서는, XbaI 절단단편을 Mung Bean Nuclease로 처리함으로써 XbaI 절단단편으로부터 CUGA의 4염기를 제거했다. 이후, XbaI 절단단편을 함유하는 Mung Bean Nuclease처리 후의 용액에 대해서, 통상법에 따른 단백질 제거 처리에 의해 CUGA의 4염기가 제거된 XbaI 절단단편을 정제하여 이것을 주형 DNA로 했다.
다음에 이 주형 DNA로부터 T7 RNA 폴리메라제를 이용하여 RNA를 in vitro 합성했다. 이 RNA 합성에는 Ambion사의 MEGAscript를 사용했다. 주형 DNA를 0.5~1.0마이크로그램 함유하는 반응액 20μl를 제조업자의 사용설명서에 따라 반응시켰다.
RNA 합성종료 후, 반응용액에 DNase(2U)를 첨가하여 37℃에서 15분간 반응시킨 후, 또한 산성 페놀에 의한 RNA 추출을 행해서 주형 DNA를 제거했다. 이렇게 해 서 pJFH1, pJFH1/GND, pFGREP-JFH1, pFGREP-JFH1/GND에 유래하는 상술의 주형 DNA로부터 합성한 RNA를 각각 rJFH1, rJFH1/GND, rFGREP-JFH1, rFGREP-JFH1/GND로 명명했다. 이들 RNA의 염기서열을 rJFH-1, rFGREP-JFH1에 대해서는 서열번호 12 및 13, rJFH1/GND, rFGREP-JFH1/GND에 대해서는 서열번호 14 및 15에 각각 나타낸다. rJFH1은 JFH-1주의 전체 길이 HCV 게놈과 같은 서열구조를 갖는, 본 발명의 전체 길이 HCV 게놈 RNA의 일례이다. rFGREP-JFH1은 본 발명에 있어서의 전체 길이 HCV 레플리콘 RNA의 일례이다.
계속해서, 상술과 같이 제조한 발현 벡터 pFGREP-JFH1/Luc, pFGREP-JFH1/Luc/GND, pFGREP-JFH1/EGFP, pFGREP-JFH1/EGFP/GND, pFGREP-JFH1/SEAP, pFGREP-JFH1/SEAP/GND를 각각 주형으로서 사용하여 HCV 레플리콘 RNA인 rFGR-JFH1/Luc(서열번호 21), rFGR-JFH1/Luc/GND(서열번호 22), rFGR-JFH1/EGFP(서열번호 23), rFGR-JFH1/EGFP/GND(서열번호 24), rFGR-JFH1/SEAP(서열번호 25), rFGR-JFH1/SEAP/GND(서열번호 26)를 상기와 같은 방법으로 제조했다.
[실시예2]세포 내에 있어서의 전체 길이 HCV 게놈 RNA 복제세포와 바이러스 입자산생
(C)세포 내에 있어서의 전체 길이 HCV 게놈 RNA의 복제와 바이러스 입자의 산생
상기와 같이 합성한 전체 길이 HCV 게놈 RNA(rJFH1, rJFH1/GND)의 각각을 여러 가지 양으로 Huh7 세포로부터 추출한 토털 세포성 RNA와 혼합해서 RNA 총량이 10㎍으로 되도록 조제했다. 이어서 그 혼합 RNA를 일렉트로포레이션법에 의해 Huh7 세포에 도입했다. 일렉트로포레이션 처리를 행한 Huh7 세포를 배양접시에 파종하고, 12시간, 24시간, 48시간 및 72시간 배양한 후에 세포를 회수해서 세포로부터 RNA를 추출하여 노던 블롯으로 해석했다. 노던 블롯 해석은 Molecular Cloning,A laboratory Manual,2nd edition,J.Sambrook,E.F.Fritsch,T.Maniatis저, Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)의 기재에 따라 행했다. 구체적으로는, 배양 후의 세포로부터 추출한 RNA를 변성 아가로우스 전기영동에 제공하고, 영동종료 후에 RNA를 양전하 나일론막에 전사했다. pJFH1로부터 제조한 32P라벨한 DNA 또는 RNA 프로브를 상기와 같이 막에 전사한 RNA에 대하여 하이브리다이제이션시키고, 이어서 그 막을 세정하여 그것을 필름에 감광시킴으로써 JFH-1 클론의 전체 길이 HCV 게놈 RNA에 특이적인 RNA 밴드를 검출했다.
도 2에 나타내는 바와 같이 rJFH1/GND를 트랜스펙션한 경우, 트랜스펙션 4시간 후에 있어서 도입한 RNA 밴드는 약한 시그널로서 확인할 수 있었지만, 시간의 경과와 함께 시그널은 감약되어 24시간 후에는 밴드의 시그널을 거의 확인할 수 없었다. 한편, rJFH1을 트랜스펙션한 경우, 트랜스펙션의 4시간 후~12시간 후에는 도입한 RNA 밴드의 시그널의 강도는 rJFH1/GND를 도입한 경우와 마찬가지로 일단 감약되었지만, 24시간이후에는 뚜렷한 RNA 밴드의 시그널을 확인할 수 있었다. 확인된 시그널은 HCV 게놈 RNA에 특이적이었다. 즉 도입한 전체 길이 HCV 게놈 RNA의 일부가 복제 증식된 것으로 생각되었다. RNA 복제효소인 NS5B의 활성 모티브를 변이시킨 rJFH1/GND에서는 복제는 보여지지 않고, NS5B의 활성이 전체 길이 HCV 게놈 RNA의 복제에 중요한 것이 나타내어졌다. 한편, 지금까지 분리된 H77주(비특허문헌7), J6주(비특허문헌8)나 본 발명자들이 만성 간염으로부터 분리한 JCH1주(비특허문헌6) 등의 C형간염 바이러스주에 유래하는 전체 길이 HCV 게놈 RNA에 대해서도 같은 실험을 행했지만, 이들 주에서는 전체 길이 HCV 게놈 RNA의 복제는 전혀 확인할 수 없었다.
(D)트랜스펙션 세포배양액 중의 HCV 바이러스 입자의 검출
상기에 따라 일렉트로포레이션 처리를 행한 Huh7 세포를 배양접시에 파종하고, 12시간, 24시간, 48시간, 및 72시간 배양한 후, 배양상청 중의 HCV 코어 단백질을 측정했다. 측정은 오르소 HCV 항원 IRMA 테스트에 의해 행했다(비특허문헌9). 도 3에 나타내는 바와 같이, rJFH1을 트랜스펙션해서 48시간 후 및 72시간 후의 배양상청 중에 코어 단백질이 검출되었다. 이 코어 단백질이 바이러스 입자로서 분비되어 있는지의 여부를 확인하기 위해, rJFH1을 트랜스펙션한 72시간 후의 배양액을 자당밀도 구배에 의해 분획했다. 60%(중량/중량) 자당용액(50mM Tris pH7.5/0.1M NaCl/1mM EDTA에 용해) 2ml, 50% 자당용액 1ml, 40% 자당용액 1ml, 30% 자당용액 1ml, 20% 자당용액 1ml, 10% 자당용액 1ml를 원심 튜브에 중층하고, 또한 그 위에 샘플의 배양상청을 4ml 중층했다. 이것을 배크만 로터S W41Ti로 400,000RPM, 4℃, 16시간 원심했다. 원심종료 후 원심 튜브의 바닥으로부터 0.5ml씩 분획 회수했다. 각 분획의 밀도, HCV 코어 단백질 농도, 전체 길이 HCV 게놈 RNA량을 정량했다. 전체 길이 HCV 게놈 RNA의 정량적 RT-PCR에 의한 검출은 Takeuchi T, Katsume A, Tanaka T, Abe A, Inoue K, Tsukiyama-Kohara K, Kawaguchi R, Tanaka S, Kohara M. Real-Time detection system for quantification of Hepatitis C virus genome. Gastroenterology 116:636-642(1999)에 따라 전체 길이 HCV 게놈 RNA의 5'비번역영역의 RNA를 검출함으로써 행했다. 구체적으로는, 세포로부터 추출한 RNA에 함유되는 전체 길이 HCV 게놈 RNA를 합성 프라이머, R6-130-S17:5'-CGGGAGAGCCATAGTGG-3'(서열번호 16), R6-290-R19:5'-AGTACCACAAGGCCTTTCG-3'(서열번호 17), TaqMan Probe:R6-148-S21FT,5'-CTGCGGAACCGGTGAGTACAC-3'(서열번호 18)와 EZ rTth RNA PCR kit를 이용하여 PCR 증폭하고, 이어서 ABI Prism 7700 sequence detector system에 의해 검출했다.
도 4에 나타내는 바와 같이, 11번의 프랙션에서 코어 단백질과 전체 길이 HCV 게놈 RNA의 피크가 일치했다. 이 프랙션의 밀도는 약 1.18mg/ml이며, 지금까지 보고되어 있는 코어 단백질과 핵산의 결합물보다 가벼운 비중이었다. 또, 배양상청을 0.25% NP40으로 처리한 후에 같은 분획을 행하면, 코어 단백질과 전체 길이 HCV 게놈 RNA의 피크는 비중 약 1.28mg/ml로 시프트했다. 즉, NP40 처리에 의해 지질을 함유하는 비중의 가벼운 표면막이 바이러스 입자로부터 박리되어서 핵산과 코어 단백질만의 코어 입자로 된 결과, 비중이 무거워졌다고 생각되었다. 이상의 결과로부터, rJFH1을 Huh7 세포로 트랜스펙션함으로써 세포 내에서 전체 길이 HCV 게놈 RNA가 복제된 것, 또한 바이러스 입자가 형성되어 배양상청 중에 분비된 것이 밝혀졌다.
[실시예3]
(E)전체 길이 HCV 레플리콘 RNA 복제세포의 제조 및 세포 클론의 수립
실시예1에서 제조한 rFGREP-JFH1 및 rFGREP-JFH1/GND를 실시예2와 마찬가지로 Huh7 세포로 트랜스펙션하여 전체 길이 HCV 레플리콘 RNA 복제세포의 제조를 행하고, 또 전체 길이 HCV 레플리콘 RNA 복제세포 클론의 수립을 시험했다.
우선, rFGREP-JFH1 및 rFGREP-JFH1/GND의 각각을 Huh7 세포로 트랜스펙션한 후, 배양접시에 그 세포를 파종했다. 16시간에서 24시간 배양한 후에 G418을 여러 가지 농도로 첨가했다. 1주에 2회 배양액을 교환하면서 배양을 계속했다. 21일간 배양한 후, 크리스탈 바이올렛으로 생존세포를 염색했다. 염색되는 콜로니수를 계측하여, 트랜스펙션한 RNA 중량당 얻어진 콜로니수를 계산했다. 또, 일부의 배양접시에서는 생존세포의 콜로니를 클론화해서 배양을 계속했다. 클론화된 세포로부터 RNA, 게놈 DNA, 단백질을 각각 추출한 후, 전체 길이 HCV 레플리콘 RNA의 검출, 네오마이신 내성 유전자의 게놈 DNA로의 도입의 유무, HCV 단백질의 발현을 검토했다. 이들의 결과의 상세는 하기에 나타낸다.
(F)콜로니 형성능
상기의 트랜스펙션의 결과, 트랜스펙션한 레플리콘 RNA 1㎍당 콜로니 형성능은 rFGREP-JFH1을 트랜스펙션한 Huh7 세포에서는, G418 농도가 1.0mg/ml인 경우, 368 CFU(Colony Forming Unit;콜로니 형성단위)/㎍·RNA였다(도 5의 좌측). 이것에 대하여 rFGREP-JFH1/GND를 트랜스펙션한 Huh7 세포에서는 콜로니 형성이 확인되지 않았다(도 5의 우측). 이것은, rFGREP-JFH1 레플리콘 RNA를 트랜스펙션한 Huh7 세포의 콜로니 형성능은 rFGREP-JFH1로부터 발현되는 NS5B(RNA 폴리메라제)의 활성에 의존하는 것을 나타냈다. 즉, 콜로니를 형성한 세포에서는 rFGREP-JFH1로부터 발현 되는 NS5B의 기능에 의해 rFGREP-JFH1 레플리콘 RNA가 자율 복제함으로써 네오마이신 내성 유전자가 지속적으로 발현되어 G418 내성이 유지되는 결과, 세포증식이 가능하게 된 것으로 생각되었다.
(G)수립한 세포 클론에 있어서의 전체 길이 HCV 레플리콘 RNA의 검출
상기 (E)에 따라 rFGREP-JFH1의 Huh7 세포로의 트랜스펙션에 의해 수립된 전체 길이 HCV 레플리콘 RNA 복제세포 클론으로부터 산성페놀 추출법에 의해 토털 RNA를 추출했다. 이어서 이 토털 RNA를 노던 블롯법에 의해 해석했다. 프로브로서는 pFGREP-JFH1 특이적 프로브를 사용했다. 대조로서는 트랜스펙션을 행하고 있지 않은 Huh7 세포로부터 마찬가지로 추출한 토털 RNA(도 6 중, 「Huh7」로서 나타냄), Huh7 세포로부터 추출한 토털 RNA에 시험관 내에서 합성한 레플리콘 RNA를 10의 7승 카비하여 가한 샘플(도 6중, 「107」로서 나타냄), 및 Huh7 세포로부터 추출한 토털 RNA에 시험관 내에서 합성한 레플리콘 RNA를 10의 8승 카피하여 가한 샘플(도 6중, 「108」로서 나타냄)을 사용했다. 도 6 중, 1~4는 세포 클론의 번호이다.
이 결과, rFGREP-JFH1과 같은 정도의 크기의 RNA가 pFGREP-JFH1 특이적 프로브에 의해 검출되었다(도 6). 이에 따라 트랜스펙션한 rFGREP-JFH1 레플리콘 RNA가 세포 클론 내에서 복제 증식되어 있는 것이 확인되었다. 또, 세포 클론사이에서 레플리콘 RNA의 양에 차가 있는 것이 나타내어졌다. 도 6 중, 예를 들면 클론2는 레플리콘 RNA의 양이 다른 클론에 비해서 적었다.
(H)네오마이신 내성 유전자의 게놈 DNA로의 도입의 유무의 확인
(E)에 따라 얻어진 세포 클론 1~8(도 7 중에서는 FGR-JFH1/2-1~FGR-JFH1/2-8로 표기)에 대해서, 그 세포 클론의 G418에 대한 내성이 네오마이신 내성 유전자의 숙주세포 게놈으로의 도입에 의한 것은 아님을 확인하기 위해, 네오마이신 내성 유전자 특이적 프라이머(센스 프라이머, NEO-S3:5'-AACAAGATGGATTGCACGCA-3'(서열번호 19), 안티센스 프라이머, NEO-R:5'-CGTCAAGAAGGCGATAGAAG-3'(서열번호 20))를 사용해서 세포 클론으로부터 추출한 숙주세포의 게놈 DNA를 주형으로 하는 PCR 증폭을 행했다. 이 결과, 도 7에 나타내는 바와 같이 네오마이신 내성 유전자의 증폭이 나타내어진 양성 클론은 확인되지 않았다.
이 (H)의 결과로부터, 본 발명의 전체 길이 HCV 레플리콘 RNA를 트랜스펙션하여 수립한 세포 클론에서는 전체 길이 HCV 레플리콘 RNA가 복제되어 있는 것이 확인되었다.
(I)HCV 단백질의 검출
rFGREP-JFH1을 트랜스펙션하여 수립한 세포 클론으로부터 통상의 방법에 의해 단백질을 추출해서, SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯법에 의한 해석을 행했다. 조사한 세포 클론은 상기 (G)에서 사용한 것과 같다. 합성한 전체 길이 HCV 게놈 RNA를 Huh7 세포에 일과성(一過性)으로 트랜스펙션하여 얻어진 세포추출액을 양성 대조로 했다(도 8, 도 9 및 도 10 중, JFH-1로 해서 나타냄). HCV의 서브제노믹 RNA 레플리콘(SGR-JFH1)을 트랜스펙션해서 얻어진 클론 세포추출액을 코어 단백질의 음성 대조로 하고, 및 NS3, NS5A 단백질의 양성 대조로 해서 사용했다(도 8, 도 9 및 도 10 중, SGR-JFH1로 해서 나타냄). 트랜스펙션되어 있지 않은 Huh7 세포추출액은 모 든 음성 대조로 해서 사용했다(도 8, 도 9 및 도 10 중, Huh7로 해서 나타냄). 각각의 세포 클론으로부터 추출한 단백질 시료를 PVDF막(Immobilon-P, Millipore사제)에 블롯팅하고, 항core 특이적 항체 및 항NS3 특이적 항체(Dr.Moradpour에 의해 분여된 것； Wolk B, et al,J.Virology.2000;74:2293-2304)를 이용하여 전체 길이 HCV 레플리콘 RNA에 코드되어 있는 코어 단백질 및 NS3 단백질을 검출했다. 도 8 및 도 9에 나타내어지는 바와 같이, rFGREP-JFH1을 트랜스펙션하여 수립한 세포 클론 1~4에서는 각각의 단백질에 대해서 양성 대조와 같은 크기의 단백질이 검출되었다. 트랜스펙션되어 있지 않은 Huh7 세포에서는 코어 단백질, 및 NS3 단백질도 검출되지 않았으므로, 세포 클론 1~4에서는 트랜스펙션된 전체 길이 HCV 레플리콘 RNA가 자율 복제되고, 또 코어 단백질이나 NS3 단백질이 발현되어 있는 것이 확인되었다.
또한, C형간염환자의 혈청을 항체로서 사용함으로써, 상기에서 NS3 단백질의 발현이 확인된 각 세포 클론에 대하여 전체 길이 HCV 레플리콘 RNA로부터의 NS5A 단백질의 발현도 마찬가지로 확인되었다(도 10).
이상의 (H) 및 (I)의 결과로부터, 전체 길이 HCV 레플리콘 RNA를 트랜스펙션하여 수립한 세포 클론에서는 전체 길이 HCV 레플리콘 RNA가 복제되고, 또한 바이러스 단백질이 발현되어 있는 것이 확인되었다.
(J)전체 길이 HCV 레플리콘 RNA 복제세포에 있어서의 바이러스 입자 산생
상기 (E)에 따라서 rFGREP-JFH1을 Huh7 세포로 트랜스펙션하고, 수립한 전체 길이 HCV 레플리콘 RNA 복제세포 클론2 및 3(FGR-JFH1/2-3)의 배양상청을 회수해 서, 상기 (D)와 같은 방법으로 배양상청 중의 HCV 바이러스 입자를 측정했다. 이 결과를 도 11에 나타낸다. 도 11 중, 빗금선에 연결된 원은 각 프랙션(획분)의 비중(g/ml)을 나타낸다. 또 검은색 원은 코어 단백질의 양(fmol/L)을 나타낸다. 흰색 원은 전체 길이 HCV 레플리콘 RNA의 역가(×0.1카피/mL)를 나타낸다.
도 11에 나타내는 바와 같이, 비중이 약 1.18~1.20mg/ml로 되는 프랙션에서 코어 단백질과 전체 길이 HCV 레플리콘 RNA의 피크는 일치되어 있었다. 또 그것보다 가벼운 획분에도 작은 피크를 확인했다. 이상의 결과로부터, rFGREP-JFH11을 트랜스펙션한 Huh7 세포 중에서는 전체 길이 HCV 레플리콘 RNA가 복제된 것, 및 바이러스 입자가 형성되어서 배양상청 중에 분비된 것이 나타내어졌다.
[실시예4]
(K)배양상청 중의 바이러스 입자의 감염실험
(H)에서 사용한 세포 클론 1~8(FGR-JFH1/2-1, FGR-JFH1/2-2, FGR-JFH1/2-3, FGR-JFH1/2-4, FGR-JFH1/2-5, FGR-JFH1/2-6, FGR-JFH1/2-7, FGR-JFH1/2-8)의 각각의 배양상청을 Huh7 세포에 첨가해서 배양상청 중의 바이러스 입자를 Huh7 세포에 감염시켰다. 감염 다음날에 감염시킨 Huh7 세포의 배양액에 G418을 0.3mg/ml 첨가하고, 21일간 더 배양했다. 배양종료 후에 세포를 고정하고, 크리스탈 바이올렛으로 염색한 결과, FGR-JFH1/2-3, FGR-JFH1/2-5, FGR-JFH1/2-6의 배양상청을 이용하여 감염시킨 세포에 대해서 콜로니 형성이 관찰되었다. 한편, 대조에 사용한 서브제노믹 레플리콘 세포 SGR-JFH1/4-1(비특허문헌6 기재)의 배양상청을 이용하여 감염시킨 세포에서는 콜로니 형성은 보이지 않았다. 도 12에, FGR-JFH1/2-3과 SGR- JFH1/4-1의 배양상청 4ml 또는 8ml를 Huh7 세포에 첨가하고, 21일간 배양한 후에 염색한 배양접시의 사진을 나타낸다. FGR-JFH1/2-3의 배양상청 4ml를 첨가한 세포를 파종한 접시에는 3콜로니, FGR-JFH1/2-3의 배양상청 8ml를 첨가한 세포를 파종한 접시에는 9콜로니의 형성을 확인했다. 그러나, SGR-JFH1/4-1의 배양상청을 첨가한 세포를 파종한 접시에서는 콜로니 형성은 보이지 않았다.
FGR-JFH1/2-3, FGR-JFH1/2-5의 배양상청을 이용하여 C형간염 바이러스에 감염시키고, 형성된 콜로니를 이어서 클론화했다. FGR-JFH1/2-3의 배양상청을 사용한 배양접시로부터 FGR-JFH1/C2-3-11, FGR-JFH1/C2-3-12, FGR-JFH1/C2-3-13의 3클론을 수립했다. FGR-JFH1/C2-5의 배양상청을 사용한 배양접시로부터 FGR-JFH1/C2-5-11, FGR-JFH1/C2-5-12의 2클론을 수립했다.
FGR-JFH1/C2-3-11, FGR-JFH1/C2-3-12, FGR-JFH1/C2-3-13, FGR-JFH1/C2-5-11, FGR-JFH1/C2-5-12의 각 세포 클론의 배양상청을 이용하여 다시 Huh7 세포를 감염시키면, FGR-JFH1/C2-3-12, FGR-JFH1/C2-5-12의 배양상청을 사용한 배양접시에서는 콜로니의 형성이 관찰되었다. FGR-JFH1/C2-3-12의 배양상청을 이용하여 감염시킨 세포로부터 FGR-JFH1/C2-3-12-1, FGR-JFH1/C2-3-12-2의 2클론을 더 수립했다. FGR-JFH1/C2-5-12의 배양상청을 이용하여 감염시킨 세포로부터 FGR-JFH1/C2-5-12-1, FGR-JFH1/C2-5-12-2의 2클론을 더 수립했다.
이상과 같이 전체 길이 HCV 레플리콘 RNA 복제세포의 배양상청을 이용하여 감염시키고, 그 감염세포로부터 수립한 이들 세포 클론으로부터 RNA, 단백질, 게놈 DNA를 추출했다. 게놈 DNA를 주형으로 한 PCR에서 네오마이신 내성 유전자의 도입 의 유무를 검토한 결과, 모두 음성이었다. 또, RNA를 주형으로 하는 정량적 PCR법에 의해, 세포 내에서 복제되어 있는 전체 길이 HCV 레플리콘 RNA를 검출할 수 있었다. 또한 배양상청 중에 코어 단백질을 검출할 수 있었다. 이 결과는, 본 발명의 전체 길이 HCV 레플리콘 RNA 복제세포로부터 산생된 전체 길이 HCV 레플리콘 RNA를 함유하는 바이러스 입자가 새로운 세포에 감염될 수 있는 것을 나타내고 있다.
<서열표 프리 텍스트>
서열번호 1의 서열은 JFH-1 클론유래의 HCV 게놈 RNA의 5'비번역영역을 나타낸다.
서열번호 2의 서열은 JFH-1 클론유래의 HCV 게놈 RNA의 코어 단백질 코드 서열을 나타낸다.
서열번호 3의 서열은 JFH-1 클론유래의 HCV 게놈 RNA의 E1 단백질 코드 서열을 나타낸다.
서열번호 4의 서열은 JFH-1 클론유래의 HCV 게놈 RNA의 E2 단백질 코드 서열을 나타낸다.
서열번호 5의 서열은 JFH-1 클론유래의 HCV 게놈 RNA의 NS2 단백질 코드 서열을 나타낸다.
서열번호 6의 서열은 JFH-1 클론유래의 HCV 게놈 RNA의 NS3 단백질 코드 서열을 나타낸다.
서열번호 7의 서열은 JFH-1 클론유래의 HCV 게놈 RNA의 NS4A 단백질 코드 서열을 나타낸다.
서열번호 8의 서열은 JFH-1 클론유래의 HCV 게놈 RNA의 NS4B 단백질 코드 서열을 나타낸다.
서열번호 9의 서열은 JFH-1 클론유래의 HCV 게놈 RNA의 NS5A 단백질 코드 서열을 나타낸다.
서열번호 10의 서열은 JFH-1 클론유래의 HCV 게놈 RNA의 NS5B 단백질 코드 서열을 나타낸다.
서열번호 11의 서열은 JFH-1 클론유래의 HCV 게놈 RNA의 3'비번역영역을 나타낸다.
서열번호 12의 서열은 JFH-1 클론유래의 전체 길이 HCV 게놈 RNA를 나타낸다.
서열번호 13의 서열은 JFH-1 클론유래의 전체 길이 HCV 게놈 RNA를 함유하는 레플리콘 RNA를 나타낸다.
서열번호 14의 서열은 아미노산 모티브 GDD를 GND로 변이시킨, JFH-1 클론유래의 전체 길이 HCV 게놈 RNA를 나타낸다.
서열번호 15의 서열은 아미노산 모티브 GDD를 GND로 변이시킨, JFH-1 클론유래의 전체 길이 HCV 게놈 RNA를 함유하는 레플리콘 RNA를 나타낸다.
서열번호 16~20의 서열은 프라이머를 나타낸다.
서열번호 21의 서열은 발현 벡터 pFGREP-JFH1/Luc유래의 레플리콘 RNA를 나타낸다.
서열번호 22의 서열은 발현 벡터 pFGREP-JFH1/Luc/GND유래의 레플리콘 RNA를 나타낸다.
서열번호 23의 서열은 발현 벡터 pFGREP-JFH1/EGFP유래의 레플리콘 RNA를 나타낸다.
서열번호 24의 서열은 발현 벡터 pFGREP-JFH1/EGFP/GND유래의 레플리콘 RNA를 나타낸다.
서열번호 25의 서열은 발현 벡터 pFGREP-JFH1/SEAP유래의 레플리콘 RNA를 나타낸다.
서열번호 26의 서열은 발현 벡터 pFGREP-JFH1/SEAP/GND유래의 레플리콘 RNA를 나타낸다.
본 발명의 방법에 의해 HCV 바이러스 입자를 세포배양계에서 제조할 수 있다. 본 발명의 레플리콘 RNA를 사용하면, 세포배양계에 있어서 HCV의 전체 길이 게놈 RNA를 함유하는 RNA를 효율적으로 제조할 수 있다. 또 본 발명에 따른 전체 길이 HCV 레플리콘 RNA 또는 전체 길이 HCV 게놈 RNA를 도입한 세포를 사용하면, 전체 길이 HCV 레플리콘 RNA 또는 전체 길이 HCV 게놈 RNA를 복제하여, 본 발명의 HCV 바이러스 입자를 세포배양계로 지속적으로 산생시킬 수 있다. 본 발명의 전체 길이 HCV 레플리콘 RNA 또는 전체 길이 HCV 게놈 RNA를 도입한 세포는 HCV의 복제과정, 바이러스 입자 형성과정, 바이러스 입자의 세포밖 방출과정에 영향을 미치는 각종 물질을 스크리닝하기 위한 시험계로서 이용할 수도 있다. 본 발명의 전체 길이 HCV 레플리콘 RNA 및 전체 길이 HCV 게놈 RNA 서열에 바이러스 입자는 외래유전 자의 바이러스 벡터로서도 유용하다. 본 발명의 바이러스 입자 또는 그 일부분은 또한, C형간염 바이러스에 대한 백신 항원으로서 백신에 함유시킬 수 있다. 또, 본 발명의 바이러스 입자와 다른 세포를 함께 배양하는 계를, 바이러스 입자의 세포로의 감염에 영향을 미치는 각종 물질을 스크리닝하기 위한 시험계로서 이용할 수 있다. 본 발명의 전체 길이 HCV 레플리콘 RNA 또는 전체 길이 HCV 게놈 RNA는 또한, HCV의 전체 길이 게놈서열을 용이하게 복제할 수 있는 주형으로서도 유용하다.
본 명세서에서 인용한 모든 간행물, 특허 및 특허출원의 전체를 참조로 해서 본 명세서에 구비하는 것으로 한다.
SEQUENCE LISTING
<110> Tokyo Metropolitan Organization for Medical Research
Toray Industries Inc.
<120> A nucleic acid construct comprising a full-length genome of human
Hepatitis C virus, a recombinant cell transfected with the same replicating
the full-length virus genome, and a process for producing human Hepatitis
C virus particles
<130> PH-2372-PCT
<150> JP 2004-045489
<151> 2004-02-20
<160> 26
<170> PatentIn Ver. 2.1
<210> 1
<211> 340
<212> RNA
<213> Hepatitis C virus
<220>
<223> 5' non-translated region of hepatitis C virus genomic RNA derived from
JFH-1 clone
<220>
<223> inventor: Wakita, Takaji
Inventor: Kato, Takanobu
Inventor: Date, Tomoko
Inventor: Miyamoto, Michiko
Inventor: Tanabe, Junichi
Inventor: Sone, Saburo
<400> 1
accugccccu aauaggggcg acacuccgcc augaaucacu ccccugugag gaacuacugu 60
cuucacgcag aaagcgccua gccauggcgu uaguaugagu gucguacagc cuccaggccc 120
cccccucccg ggagagccau aguggucugc ggaaccggug aguacaccgg aauugccggg 180
aagacugggu ccuuucuugg auaaacccac ucuaugcccg gccauuuggg cgugcccccg 240
caagacugcu agccgaguag cguuggguug cgaaaggccu ugugguacug ccugauaggg 300
cgcuugcgag ugccccggga ggucucguag accgugcacc 340
<210> 2
<211> 573
<212> RNA
<213> Hepatitis C virus
<220>
<223> core protein-coding sequence of hepatitis C virus genomic RNA derived
from JFH-1 clone
<400> 2
augagcacaa auccuaaacc ucaaagaaaa accaaaagaa acaccaaccg ucgcccagaa 60
gacguuaagu ucccgggcgg cggccagauc guuggcggag uauacuuguu gccgcgcagg 120
ggccccaggu ugggugugcg cacgacaagg aaaacuucgg agcgguccca gccacguggg 180
agacgccagc ccauccccaa agaucggcgc uccacuggca aggccugggg aaaaccaggu 240
cgccccuggc cccuauaugg gaaugaggga cucggcuggg caggauggcu ccuguccccc 300
cgaggcucuc gccccuccug gggccccacu gacccccggc auaggucgcg caacgugggu 360
aaagucaucg acacccuaac guguggcuuu gccgaccuca ugggguacau ccccgucgua 420
ggcgccccgc uuaguggcgc cgccagagcu gucgcgcacg gcgugagagu ccuggaggac 480
gggguuaauu augcaacagg gaaccuaccc gguuuccccu uuucuaucuu cuugcuggcc 540
cuguuguccu gcaucaccgu uccggucucu gcu 573
<210> 3
<211> 576
<212> RNA
<213> Hepatitis C virus
<220>
<223> E1 protein-coding sequence of hepatitis C virus genomic RNA derived
from JFH-1 clone
<400> 3
gcccagguga agaauaccag uagcagcuac auggugacca augacugcuc caaugacagc 60
aucacuuggc agcucgaggc ugcgguucuc cacguccccg ggugcguccc gugcgagaga 120
guggggaaua cgucacggug uugggugcca gucucgccaa acauggcugu gcggcagccc 180
ggugcccuca cgcagggucu gcggacgcac aucgauaugg uugugauguc cgccaccuuc 240
ugcucugcuc ucuacguggg ggaccucugu ggcgggguga ugcucgcggc ccagguguuc 300
aucgucucgc cgcaguacca cugguuugug caagaaugca auugcuccau cuacccuggc 360
accaucacug gacaccgcau ggcaugggac augaugauga acuggucgcc cacggccacc 420
augauccugg cguacgugau gcgcgucccc gaggucauca uagacaucgu uagcggggcu 480
cacuggggcg ucauguucgg cuuggccuac uucucuaugc agggagcgug ggcgaagguc 540
auugucaucc uucugcuggc cgcuggggug gacgcg 576
<210> 4
<211> 1290
<212> RNA
<213> Hepatitis C virus
<220>
<223> E2 protein-coding sequence of hepatitis C virus genomic RNA derived
from JFH-1 clone
<400> 4
ggcaccacca ccguuggagg cgcuguugca cguuccacca acgugauugc cggcguguuc 60
agccauggcc cucagcagaa cauucagcuc auuaacacca acggcaguug gcacaucaac 120
cguacugccu ugaauugcaa ugacuccuug aacaccggcu uucucgcggc cuuguucuac 180
accaaccgcu uuaacucguc agggugucca gggcgccugu ccgccugccg caacaucgag 240
gcuuuccgga uagggugggg cacccuacag uacgaggaua augucaccaa uccagaggau 300
augaggccgu acugcuggca cuacccccca aagccgugug gcguaguccc cgcgaggucu 360
guguguggcc caguguacug uuucaccccc agcccgguag uagugggcac gaccgacaga 420
cguggagugc ccaccuacac auggggagag aaugagacag augucuuccu acugaacagc 480
acccgaccgc cgcagggcuc augguucggc ugcacgugga ugaacuccac ugguuucacc 540
aagacuugug gcgcgccacc uugccgcacc agagcugacu ucaacgccag cacggacuug 600
uugugcccua cggauuguuu uaggaagcau ccugaugcca cuuauauuaa gugugguucu 660
gggcccuggc ucacaccaaa gugccugguc cacuacccuu acagacucug gcauuacccc 720
ugcacaguca auuuuaccau cuucaagaua agaauguaug uagggggggu ugagcacagg 780
cucacggccg caugcaacuu cacucguggg gaucgcugcg acuuggagga cagggacagg 840
agucagcugu cuccucuguu gcacucuacc acggaauggg ccauccugcc cugcaccuac 900
ucagacuuac ccgcuuuguc aacuggucuu cuccaccuuc accagaacau cguggacgua 960
caauacaugu auggccucuc accugcuauc acaaaauacg ucguucgaug ggagugggug 1020
guacucuuau uccugcucuu agcggacgcc agagucugcg ccugcuugug gaugcucauc 1080
uuguugggcc aggccgaagc agcauuggag aaguuggucg ucuugcacgc ugcgagugcg 1140
gcuaacugcc auggccuccu auauuuugcc aucuucuucg uggcagcuug gcacaucagg 1200
ggucgggugg uccccuugac caccuauugc cucacuggcc uauggcccuu cugccuacug 1260
cucauggcac ugccccggca ggcuuaugcc 1290
<210> 5
<211> 651
<212> RNA
<213> Hepatitis C virus
<220>
<223> NS2 protein-coding sequence of hepatitis C virus genomic RNA derived
from JFH-1 clone
<400> 5
uaugacgcac cugugcacgg acagauaggc guggguuugu ugauauugau cacccucuuc 60
acacucaccc cgggguauaa gacccuccuc ggccaguguc uguggugguu gugcuaucuc 120
cugacccugg gggaagccau gauucaggag uggguaccac ccaugcaggu gcgcggcggc 180
cgcgauggca ucgcgugggc cgucacuaua uucugcccgg gugugguguu ugacauuacc 240
aaauggcuuu uggcguugcu ugggccugcu uaccucuuaa gggccgcuuu gacacaugug 300
ccguacuucg ucagagcuca cgcucugaua aggguaugcg cuuuggugaa gcagcucgcg 360
ggggguaggu auguucaggu ggcgcuauug gcccuuggca gguggacugg caccuacauc 420
uaugaccacc ucacaccuau gucggacugg gccgcuagcg gccugcgcga cuuagcgguc 480
gccguggaac ccaucaucuu caguccgaug gagaagaagg ucaucgucug gggagcggag 540
acggcugcau guggggacau ucuacaugga cuucccgugu ccgcccgacu cggccaggag 600
auccuccucg gcccagcuga uggcuacacc uccaaggggu ggaagcuccu u 651
<210> 6
<211> 1893
<212> RNA
<213> Hepatitis C virus
<220>
<223> NS3 protein-coding sequence of hepatitis C virus genomic RNA derived
from JFH-1 clone
<400> 6
gcucccauca cugcuuaugc ccagcaaaca cgaggccucc ugggcgccau aguggugagu 60
augacggggc gugacaggac agaacaggcc ggggaagucc aaauccuguc cacagucucu 120
caguccuucc ucggaacaac caucucgggg guuuugugga cuguuuacca cggagcuggc 180
aacaagacuc uagccggcuu acgggguccg gucacgcaga uguacucgag ugcugagggg 240
gacuugguag gcuggcccag ccccccuggg accaagucuu uggagccgug caagugugga 300
gccgucgacc uauaucuggu cacgcggaac gcugauguca ucccggcucg gagacgcggg 360
gacaagcggg gagcauugcu cuccccgaga cccauuucga ccuugaaggg guccucgggg 420
gggccggugc ucugcccuag gggccacguc guugggcucu uccgagcagc ugugugcucu 480
cggggcgugg ccaaauccau cgauuucauc cccguugaga cacucgacgu uguuacaagg 540
ucucccacuu ucagugacaa cagcacgcca ccggcugugc cccagaccua ucaggucggg 600
uacuugcaug cuccaacugg caguggaaag agcaccaagg ucccugucgc guaugccgcc 660
cagggguaca aaguacuagu gcuuaacccc ucgguagcug ccacccuggg guuuggggcg 720
uaccuaucca aggcacaugg caucaauccc aacauuagga cuggagucag gaccgugaug 780
accggggagg ccaucacgua cuccacauau ggcaaauuuc ucgccgaugg gggcugcgcu 840
agcggcgccu augacaucau cauaugcgau gaaugccacg cuguggaugc uaccuccauu 900
cucggcaucg gaacgguccu ugaucaagca gagacagccg gggucagacu aacugugcug 960
gcuacggcca caccccccgg gucagugaca accccccauc ccgauauaga agagguaggc 1020
cucgggcggg agggugagau ccccuucuau gggagggcga uuccccuauc cugcaucaag 1080
ggagggagac accugauuuu cugccacuca aagaaaaagu gugacgagcu cgcggcggcc 1140
cuucggggca ugggcuugaa ugccguggca uacuauagag gguuggacgu cuccauaaua 1200
ccagcucagg gagauguggu ggucgucgcc accgacgccc ucaugacggg guacacugga 1260
gacuuugacu ccgugaucga cugcaaugua gcggucaccc aagcugucga cuucagccug 1320
gaccccaccu ucacuauaac cacacagacu gucccacaag acgcugucuc acgcagucag 1380
cgccgcgggc gcacagguag aggaagacag ggcacuuaua gguauguuuc cacuggugaa 1440
cgagccucag gaauguuuga caguguagug cuuugugagu gcuacgacgc aggggcugcg 1500
ugguacgauc ucacaccagc ggagaccacc gucaggcuua gagcguauuu caacacgccc 1560
ggccuacccg ugugucaaga ccaucuugaa uuuugggagg caguuuucac cggccucaca 1620
cacauagacg cccacuuccu cucccaaaca aagcaagcgg gggagaacuu cgcguaccua 1680
guagccuacc aagcuacggu gugcgccaga gccaaggccc cucccccguc cugggacgcc 1740
auguggaagu gccuggcccg acucaagccu acgcuugcgg gccccacacc ucuccuguac 1800
cguuugggcc cuauuaccaa ugaggucacc cucacacacc cugggacgaa guacaucgcc 1860
acaugcaugc aagcugaccu ugaggucaug acc 1893
<210> 7
<211> 162
<212> RNA
<213> Hepatitis C virus
<220>
<223> NS4A protein-coding sequence of hepatitis C virus genomic RNA derived
from JFH-1 clone
<400> 7
agcacguggg uccuagcugg aggaguccug gcagccgucg ccgcauauug ccuggcgacu 60
ggaugcguuu ccaucaucgg ccgcuugcac gucaaccagc gagucgucgu ugcgccggau 120
aaggaggucc uguaugaggc uuuugaugag auggaggaau gc 162
<210> 8
<211> 783
<212> RNA
<213> Hepatitis C virus
<220>
<223> NS4B protein-coding sequence of hepatitis C virus genomic RNA derived
from JFH-1 clone
<400> 8
gccucuaggg cggcucucau cgaagagggg cagcggauag ccgagauguu gaaguccaag 60
auccaaggcu ugcugcagca ggccucuaag caggcccagg acauacaacc cgcuaugcag 120
gcuucauggc ccaaagugga acaauuuugg gccagacaca uguggaacuu cauuagcggc 180
auccaauacc ucgcaggauu gucaacacug ccagggaacc ccgcgguggc uuccaugaug 240
gcauucagug ccgcccucac caguccguug ucgaccagua ccaccauccu ucucaacauc 300
augggaggcu gguuagcguc ccagaucgca ccacccgcgg gggccaccgg cuuugucguc 360
aguggccugg ugggggcugc cgugggcagc auaggccugg guaaggugcu gguggacauc 420
cuggcaggau auggugcggg cauuucgggg gcccucgucg cauucaagau caugucuggc 480
gagaagcccu cuauggaaga ugucaucaau cuacugccug ggauccuguc uccgggagcc 540
cugguggugg gggucaucug cgcggccauu cugcgccgcc acgugggacc gggggagggc 600
gcgguccaau ggaugaacag gcuuauugcc uuugcuucca gaggaaacca cgucgccccu 660
acucacuacg ugacggaguc ggaugcgucg cagcguguga cccaacuacu uggcucucuu 720
acuauaacca gccuacucag aagacuccac aauuggauaa cugaggacug ccccauccca 780
ugc 783
<210> 9
<211> 1398
<212> RNA
<213> Hepatitis C virus
<220>
<223> NS5A protein-coding sequence of hepatitis C virus genomic RNA derived
from JFH-1 clone
<400> 9
uccggauccu ggcuccgcga cgugugggac uggguuugca ccaucuugac agacuucaaa 60
aauuggcuga ccucuaaauu guuccccaag cugcccggcc uccccuucau cucuugucaa 120
aagggguaca agggugugug ggccggcacu ggcaucauga ccacgcgcug cccuugcggc 180
gccaacaucu cuggcaaugu ccgccugggc ucuaugagga ucacagggcc uaaaaccugc 240
augaacaccu ggcaggggac cuuuccuauc aauugcuaca cggagggcca gugcgcgccg 300
aaacccccca cgaacuacaa gaccgccauc uggagggugg cggccucgga guacgcggag 360
gugacgcagc augggucgua cuccuaugua acaggacuga ccacugacaa ucugaaaauu 420
ccuugccaac uaccuucucc agaguuuuuc uccugggugg acggugugca gauccauagg 480
uuugcaccca caccaaagcc guuuuuccgg gaugaggucu cguucugcgu ugggcuuaau 540
uccuaugcug ucggguccca gcuucccugu gaaccugagc ccgacgcaga cguauugagg 600
uccaugcuaa cagauccgcc ccacaucacg gcggagacug cggcgcggcg cuuggcacgg 660
ggaucaccuc caucugaggc gagcuccuca gugagccagc uaucagcacc gucgcugcgg 720
gccaccugca ccacccacag caacaccuau gacguggaca uggucgaugc caaccugcuc 780
auggagggcg guguggcuca gacagagccu gaguccaggg ugcccguucu ggacuuucuc 840
gagccaaugg ccgaggaaga gagcgaccuu gagcccucaa uaccaucgga gugcaugcuc 900
cccaggagcg gguuuccacg ggccuuaccg gcuugggcac ggccugacua caacccgccg 960
cucguggaau cguggaggag gccagauuac caaccgccca ccguugcugg uugugcucuc 1020
ccccccccca agaaggcccc gacgccuccc ccaaggagac gccggacagu gggucugagc 1080
gagagcacca uaucagaagc ccuccagcaa cuggccauca agaccuuugg ccagcccccc 1140
ucgagcggug augcaggcuc guccacgggg gcgggcgccg ccgaauccgg cgguccgacg 1200
uccccuggug agccggcccc cucagagaca gguuccgccu ccucuaugcc cccccucgag 1260
ggggagccug gagauccgga ccuggagucu gaucagguag agcuucaacc ucccccccag 1320
gggggggggg uagcucccgg uucgggcucg gggucuuggu cuacuugcuc cgaggaggac 1380
gauaccaccg ugugcugc 1398
<210> 10
<211> 1773
<212> RNA
<213> Hepatitis C virus
<220>
<223> NS5B protein-coding sequence of hepatitis C virus genomic RNA derived
from JFH-1 clone
<400> 10
uccaugucau acuccuggac cggggcucua auaacucccu guagccccga agaggaaaag 60
uugccaauca acccuuugag uaacucgcug uugcgauacc auaacaaggu guacuguaca 120
acaucaaaga gcgccucaca gagggcuaaa aagguaacuu uugacaggac gcaagugcuc 180
gacgcccauu augacucagu cuuaaaggac aucaagcuag cggcuuccaa ggucagcgca 240
aggcuccuca ccuuggagga ggcgugccag uugacuccac cccauucugc aagauccaag 300
uauggauucg gggccaagga gguccgcagc uuguccggga gggccguuaa ccacaucaag 360
uccgugugga aggaccuccu ggaagaccca caaacaccaa uucccacaac caucauggcc 420
aaaaaugagg uguucugcgu ggaccccgcc aaggggggua agaaaccagc ucgccucauc 480
guuuacccug accucggcgu ccgggucugc gagaaaaugg cccucuauga cauuacacaa 540
aagcuuccuc aggcgguaau gggagcuucc uauggcuucc aguacucccc ugcccaacgg 600
guggaguauc ucuugaaagc augggcggaa aagaaggacc ccauggguuu uucguaugau 660
acccgaugcu ucgacucaac cgucacugag agagacauca ggaccgagga guccauauac 720
caggccugcu cccugcccga ggaggcccgc acugccauac acucgcugac ugagagacuu 780
uacguaggag ggcccauguu caacagcaag ggucaaaccu gcgguuacag acguugccgc 840
gccagcgggg ugcuaaccac uagcaugggu aacaccauca caugcuaugu gaaagcccua 900
gcggccugca aggcugcggg gauaguugcg cccacaaugc ugguaugcgg cgaugaccua 960
guagucaucu cagaaagcca ggggacugag gaggacgagc ggaaccugag agccuucacg 1020
gaggccauga ccagguacuc ugccccuccu ggugaucccc ccagaccgga auaugaccug 1080
gagcuaauaa cauccuguuc cucaaaugug ucuguggcgu ugggcccgcg gggccgccgc 1140
agauacuacc ugaccagaga cccaaccacu ccacucgccc gggcugccug ggaaacaguu 1200
agacacuccc cuaucaauuc auggcuggga aacaucaucc aguaugcucc aaccauaugg 1260
guucgcaugg uccuaaugac acacuucuuc uccauucuca ugguccaaga cacccuggac 1320
cagaaccuca acuuugagau guauggauca guauacuccg ugaauccuuu ggaccuucca 1380
gccauaauug agagguuaca cgggcuugac gccuuuucua ugcacacaua cucucaccac 1440
gaacugacgc ggguggcuuc agcccucaga aaacuugggg cgccaccccu cagggugugg 1500
aagagucggg cucgcgcagu cagggcgucc cucaucuccc guggagggaa agcggccguu 1560
ugcggccgau aucucuucaa uugggcggug aagaccaagc ucaaacucac uccauugccg 1620
gaggcgcgcc uacuggacuu auccaguugg uucaccgucg gcgccggcgg gggcgacauu 1680
uuucacagcg ugucgcgcgc ccgaccccgc ucauuacucu ucggccuacu ccuacuuuuc 1740
guagggguag gccucuuccu acuccccgcu cgg 1773
<210> 11
<211> 239
<212> RNA
<213> Hepatitis C virus
<220>
<223> 3' non-translated region of hepatitis C virus genomic RNA derived from
JFH-1 clone
<400> 11
uagagcggca cacacuaggu acacuccaua gcuaacuguu ccuuuuuuuu uuuuuuuuuu 60
uuuuuuuuuu uuuuuuuuuu uuuuucuuuu uuuuuuuuuu cccucuuucu ucccuucuca 120
ucuuauucua cuuucuuucu ugguggcucc aucuuagccc uagucacggc uagcugugaa 180
agguccguga gccgcaugac ugcagagagu gccguaacug gucucucugc agaucaugu 239
<210> 12
<211> 9707
<212> RNA
<213> Hepatitis C virus
<220>
<223> full-length Hepatitis C virus genomic RNA derived from JFH-1 clone
<400> 12
gaauucuaau acgacucacu auagaccugc cccuaauagg ggcgacacuc cgccaugaau 60
cacuccccug ugaggaacua cugucuucac gcagaaagcg ccuagccaug gcguuaguau 120
gagugucgua cagccuccag gccccccccu cccgggagag ccauaguggu cugcggaacc 180
ggugaguaca ccggaauugc cgggaagacu ggguccuuuc uuggauaaac ccacucuaug 240
cccggccauu ugggcgugcc cccgcaagac ugcuagccga guagcguugg guugcgaaag 300
gccuuguggu acugccugau agggcgcuug cgagugcccc gggaggucuc guagaccgug 360
caccaugagc acaaauccua aaccucaaag aaaaaccaaa agaaacacca accgucgccc 420
agaagacguu aaguucccgg gcggcggcca gaucguuggc ggaguauacu uguugccgcg 480
caggggcccc agguugggug ugcgcacgac aaggaaaacu ucggagcggu cccagccacg 540
ugggagacgc cagcccaucc ccaaagaucg gcgcuccacu ggcaaggccu ggggaaaacc 600
aggucgcccc uggccccuau augggaauga gggacucggc ugggcaggau ggcuccuguc 660
cccccgaggc ucucgccccu ccuggggccc cacugacccc cggcauaggu cgcgcaacgu 720
ggguaaaguc aucgacaccc uaacgugugg cuuugccgac cucauggggu acauccccgu 780
cguaggcgcc ccgcuuagug gcgccgccag agcugucgcg cacggcguga gaguccugga 840
ggacgggguu aauuaugcaa cagggaaccu acccgguuuc cccuuuucua ucuucuugcu 900
ggcccuguug uccugcauca ccguuccggu cucugcugcc caggugaaga auaccaguag 960
cagcuacaug gugaccaaug acugcuccaa ugacagcauc acuuggcagc ucgaggcugc 1020
gguucuccac guccccgggu gcgucccgug cgagagagug gggaauacgu cacgguguug 1080
ggugccaguc ucgccaaaca uggcugugcg gcagcccggu gcccucacgc agggucugcg 1140
gacgcacauc gauaugguug ugauguccgc caccuucugc ucugcucucu acguggggga 1200
ccucuguggc ggggugaugc ucgcggccca gguguucauc gucucgccgc aguaccacug 1260
guuugugcaa gaaugcaauu gcuccaucua cccuggcacc aucacuggac accgcauggc 1320
augggacaug augaugaacu ggucgcccac ggccaccaug auccuggcgu acgugaugcg 1380
cguccccgag gucaucauag acaucguuag cggggcucac uggggcguca uguucggcuu 1440
ggccuacuuc ucuaugcagg gagcgugggc gaaggucauu gucauccuuc ugcuggccgc 1500
ugggguggac gcgggcacca ccaccguugg aggcgcuguu gcacguucca ccaacgugau 1560
ugccggcgug uucagccaug gcccucagca gaacauucag cucauuaaca ccaacggcag 1620
uuggcacauc aaccguacug ccuugaauug caaugacucc uugaacaccg gcuuucucgc 1680
ggccuuguuc uacaccaacc gcuuuaacuc gucagggugu ccagggcgcc uguccgccug 1740
ccgcaacauc gaggcuuucc ggauagggug gggcacccua caguacgagg auaaugucac 1800
caauccagag gauaugaggc cguacugcug gcacuacccc ccaaagccgu guggcguagu 1860
ccccgcgagg ucugugugug gcccagugua cuguuucacc cccagcccgg uaguaguggg 1920
cacgaccgac agacguggag ugcccaccua cacaugggga gagaaugaga cagaugucuu 1980
ccuacugaac agcacccgac cgccgcaggg cucaugguuc ggcugcacgu ggaugaacuc 2040
cacugguuuc accaagacuu guggcgcgcc accuugccgc accagagcug acuucaacgc 2100
cagcacggac uuguugugcc cuacggauug uuuuaggaag cauccugaug ccacuuauau 2160
uaaguguggu ucugggcccu ggcucacacc aaagugccug guccacuacc cuuacagacu 2220
cuggcauuac cccugcacag ucaauuuuac caucuucaag auaagaaugu auguaggggg 2280
gguugagcac aggcucacgg ccgcaugcaa cuucacucgu ggggaucgcu gcgacuugga 2340
ggacagggac aggagucagc ugucuccucu guugcacucu accacggaau gggccauccu 2400
gcccugcacc uacucagacu uacccgcuuu gucaacuggu cuucuccacc uucaccagaa 2460
caucguggac guacaauaca uguauggccu cucaccugcu aucacaaaau acgucguucg 2520
augggagugg gugguacucu uauuccugcu cuuagcggac gccagagucu gcgccugcuu 2580
guggaugcuc aucuuguugg gccaggccga agcagcauug gagaaguugg ucgucuugca 2640
cgcugcgagu gcggcuaacu gccauggccu ccuauauuuu gccaucuucu ucguggcagc 2700
uuggcacauc aggggucggg ugguccccuu gaccaccuau ugccucacug gccuauggcc 2760
cuucugccua cugcucaugg cacugccccg gcaggcuuau gccuaugacg caccugugca 2820
cggacagaua ggcguggguu uguugauauu gaucacccuc uucacacuca ccccggggua 2880
uaagacccuc cucggccagu gucuguggug guugugcuau cuccugaccc ugggggaagc 2940
caugauucag gaguggguac cacccaugca ggugcgcggc ggccgcgaug gcaucgcgug 3000
ggccgucacu auauucugcc cggguguggu guuugacauu accaaauggc uuuuggcguu 3060
gcuugggccu gcuuaccucu uaagggccgc uuugacacau gugccguacu ucgucagagc 3120
ucacgcucug auaaggguau gcgcuuuggu gaagcagcuc gcggggggua gguauguuca 3180
gguggcgcua uuggcccuug gcagguggac uggcaccuac aucuaugacc accucacacc 3240
uaugucggac ugggccgcua gcggccugcg cgacuuagcg gucgccgugg aacccaucau 3300
cuucaguccg auggagaaga aggucaucgu cuggggagcg gagacggcug caugugggga 3360
cauucuacau ggacuucccg uguccgcccg acucggccag gagauccucc ucggcccagc 3420
ugauggcuac accuccaagg gguggaagcu ccuugcuccc aucacugcuu augcccagca 3480
aacacgaggc cuccugggcg ccauaguggu gaguaugacg gggcgugaca ggacagaaca 3540
ggccggggaa guccaaaucc uguccacagu cucucagucc uuccucggaa caaccaucuc 3600
ggggguuuug uggacuguuu accacggagc uggcaacaag acucuagccg gcuuacgggg 3660
uccggucacg cagauguacu cgagugcuga gggggacuug guaggcuggc ccagcccccc 3720
ugggaccaag ucuuuggagc cgugcaagug uggagccguc gaccuauauc uggucacgcg 3780
gaacgcugau gucaucccgg cucggagacg cggggacaag cggggagcau ugcucucccc 3840
gagacccauu ucgaccuuga agggguccuc gggggggccg gugcucugcc cuaggggcca 3900
cgucguuggg cucuuccgag cagcugugug cucucggggc guggccaaau ccaucgauuu 3960
cauccccguu gagacacucg acguuguuac aaggucuccc acuuucagug acaacagcac 4020
gccaccggcu gugccccaga ccuaucaggu cggguacuug caugcuccaa cuggcagugg 4080
aaagagcacc aaggucccug ucgcguaugc cgcccagggg uacaaaguac uagugcuuaa 4140
ccccucggua gcugccaccc ugggguuugg ggcguaccua uccaaggcac auggcaucaa 4200
ucccaacauu aggacuggag ucaggaccgu gaugaccggg gaggccauca cguacuccac 4260
auauggcaaa uuucucgccg augggggcug cgcuagcggc gccuaugaca ucaucauaug 4320
cgaugaaugc cacgcugugg augcuaccuc cauucucggc aucggaacgg uccuugauca 4380
agcagagaca gccgggguca gacuaacugu gcuggcuacg gccacacccc ccgggucagu 4440
gacaaccccc caucccgaua uagaagaggu aggccucggg cgggagggug agauccccuu 4500
cuaugggagg gcgauucccc uauccugcau caagggaggg agacaccuga uuuucugcca 4560
cucaaagaaa aagugugacg agcucgcggc ggcccuucgg ggcaugggcu ugaaugccgu 4620
ggcauacuau agaggguugg acgucuccau aauaccagcu cagggagaug ugguggucgu 4680
cgccaccgac gcccucauga cgggguacac uggagacuuu gacuccguga ucgacugcaa 4740
uguagcgguc acccaagcug ucgacuucag ccuggacccc accuucacua uaaccacaca 4800
gacuguccca caagacgcug ucucacgcag ucagcgccgc gggcgcacag guagaggaag 4860
acagggcacu uauagguaug uuuccacugg ugaacgagcc ucaggaaugu uugacagugu 4920
agugcuuugu gagugcuacg acgcaggggc ugcgugguac gaucucacac cagcggagac 4980
caccgucagg cuuagagcgu auuucaacac gcccggccua cccguguguc aagaccaucu 5040
ugaauuuugg gaggcaguuu ucaccggccu cacacacaua gacgcccacu uccucuccca 5100
aacaaagcaa gcgggggaga acuucgcgua ccuaguagcc uaccaagcua cggugugcgc 5160
cagagccaag gccccucccc cguccuggga cgccaugugg aagugccugg cccgacucaa 5220
gccuacgcuu gcgggcccca caccucuccu guaccguuug ggcccuauua ccaaugaggu 5280
cacccucaca cacccuggga cgaaguacau cgccacaugc augcaagcug accuugaggu 5340
caugaccagc acgugggucc uagcuggagg aguccuggca gccgucgccg cauauugccu 5400
ggcgacugga ugcguuucca ucaucggccg cuugcacguc aaccagcgag ucgucguugc 5460
gccggauaag gagguccugu augaggcuuu ugaugagaug gaggaaugcg ccucuagggc 5520
ggcucucauc gaagaggggc agcggauagc cgagauguug aaguccaaga uccaaggcuu 5580
gcugcagcag gccucuaagc aggcccagga cauacaaccc gcuaugcagg cuucauggcc 5640
caaaguggaa caauuuuggg ccagacacau guggaacuuc auuagcggca uccaauaccu 5700
cgcaggauug ucaacacugc cagggaaccc cgcgguggcu uccaugaugg cauucagugc 5760
cgcccucacc aguccguugu cgaccaguac caccauccuu cucaacauca ugggaggcug 5820
guuagcgucc cagaucgcac cacccgcggg ggccaccggc uuugucguca guggccuggu 5880
gggggcugcc gugggcagca uaggccuggg uaaggugcug guggacaucc uggcaggaua 5940
uggugcgggc auuucggggg cccucgucgc auucaagauc augucuggcg agaagcccuc 6000
uauggaagau gucaucaauc uacugccugg gauccugucu ccgggagccc uggugguggg 6060
ggucaucugc gcggccauuc ugcgccgcca cgugggaccg ggggagggcg cgguccaaug 6120
gaugaacagg cuuauugccu uugcuuccag aggaaaccac gucgccccua cucacuacgu 6180
gacggagucg gaugcgucgc agcgugugac ccaacuacuu ggcucucuua cuauaaccag 6240
ccuacucaga agacuccaca auuggauaac ugaggacugc cccaucccau gcuccggauc 6300
cuggcuccgc gacguguggg acuggguuug caccaucuug acagacuuca aaaauuggcu 6360
gaccucuaaa uuguucccca agcugcccgg ccuccccuuc aucucuuguc aaaaggggua 6420
caagggugug ugggccggca cuggcaucau gaccacgcgc ugcccuugcg gcgccaacau 6480
cucuggcaau guccgccugg gcucuaugag gaucacaggg ccuaaaaccu gcaugaacac 6540
cuggcagggg accuuuccua ucaauugcua cacggagggc cagugcgcgc cgaaaccccc 6600
cacgaacuac aagaccgcca ucuggagggu ggcggccucg gaguacgcgg aggugacgca 6660
gcaugggucg uacuccuaug uaacaggacu gaccacugac aaucugaaaa uuccuugcca 6720
acuaccuucu ccagaguuuu ucuccugggu ggacggugug cagauccaua gguuugcacc 6780
cacaccaaag ccguuuuucc gggaugaggu cucguucugc guugggcuua auuccuaugc 6840
ugucgggucc cagcuucccu gugaaccuga gcccgacgca gacguauuga gguccaugcu 6900
aacagauccg ccccacauca cggcggagac ugcggcgcgg cgcuuggcac ggggaucacc 6960
uccaucugag gcgagcuccu cagugagcca gcuaucagca ccgucgcugc gggccaccug 7020
caccacccac agcaacaccu augacgugga cauggucgau gccaaccugc ucauggaggg 7080
cgguguggcu cagacagagc cugaguccag ggugcccguu cuggacuuuc ucgagccaau 7140
ggccgaggaa gagagcgacc uugagcccuc aauaccaucg gagugcaugc uccccaggag 7200
cggguuucca cgggccuuac cggcuugggc acggccugac uacaacccgc cgcucgugga 7260
aucguggagg aggccagauu accaaccgcc caccguugcu gguugugcuc uccccccccc 7320
caagaaggcc ccgacgccuc ccccaaggag acgccggaca gugggucuga gcgagagcac 7380
cauaucagaa gcccuccagc aacuggccau caagaccuuu ggccagcccc ccucgagcgg 7440
ugaugcaggc ucguccacgg gggcgggcgc cgccgaaucc ggcgguccga cguccccugg 7500
ugagccggcc cccucagaga cagguuccgc cuccucuaug cccccccucg agggggagcc 7560
uggagauccg gaccuggagu cugaucaggu agagcuucaa ccuccccccc aggggggggg 7620
gguagcuccc gguucgggcu cggggucuug gucuacuugc uccgaggagg acgauaccac 7680
cgugugcugc uccaugucau acuccuggac cggggcucua auaacucccu guagccccga 7740
agaggaaaag uugccaauca acccuuugag uaacucgcug uugcgauacc auaacaaggu 7800
guacuguaca acaucaaaga gcgccucaca gagggcuaaa aagguaacuu uugacaggac 7860
gcaagugcuc gacgcccauu augacucagu cuuaaaggac aucaagcuag cggcuuccaa 7920
ggucagcgca aggcuccuca ccuuggagga ggcgugccag uugacuccac cccauucugc 7980
aagauccaag uauggauucg gggccaagga gguccgcagc uuguccggga gggccguuaa 8040
ccacaucaag uccgugugga aggaccuccu ggaagaccca caaacaccaa uucccacaac 8100
caucauggcc aaaaaugagg uguucugcgu ggaccccgcc aaggggggua agaaaccagc 8160
ucgccucauc guuuacccug accucggcgu ccgggucugc gagaaaaugg cccucuauga 8220
cauuacacaa aagcuuccuc aggcgguaau gggagcuucc uauggcuucc aguacucccc 8280
ugcccaacgg guggaguauc ucuugaaagc augggcggaa aagaaggacc ccauggguuu 8340
uucguaugau acccgaugcu ucgacucaac cgucacugag agagacauca ggaccgagga 8400
guccauauac caggccugcu cccugcccga ggaggcccgc acugccauac acucgcugac 8460
ugagagacuu uacguaggag ggcccauguu caacagcaag ggucaaaccu gcgguuacag 8520
acguugccgc gccagcgggg ugcuaaccac uagcaugggu aacaccauca caugcuaugu 8580
gaaagcccua gcggccugca aggcugcggg gauaguugcg cccacaaugc ugguaugcgg 8640
cgaugaccua guagucaucu cagaaagcca ggggacugag gaggacgagc ggaaccugag 8700
agccuucacg gaggccauga ccagguacuc ugccccuccu ggugaucccc ccagaccgga 8760
auaugaccug gagcuaauaa cauccuguuc cucaaaugug ucuguggcgu ugggcccgcg 8820
gggccgccgc agauacuacc ugaccagaga cccaaccacu ccacucgccc gggcugccug 8880
ggaaacaguu agacacuccc cuaucaauuc auggcuggga aacaucaucc aguaugcucc 8940
aaccauaugg guucgcaugg uccuaaugac acacuucuuc uccauucuca ugguccaaga 9000
cacccuggac cagaaccuca acuuugagau guauggauca guauacuccg ugaauccuuu 9060
ggaccuucca gccauaauug agagguuaca cgggcuugac gccuuuucua ugcacacaua 9120
cucucaccac gaacugacgc ggguggcuuc agcccucaga aaacuugggg cgccaccccu 9180
cagggugugg aagagucggg cucgcgcagu cagggcgucc cucaucuccc guggagggaa 9240
agcggccguu ugcggccgau aucucuucaa uugggcggug aagaccaagc ucaaacucac 9300
uccauugccg gaggcgcgcc uacuggacuu auccaguugg uucaccgucg gcgccggcgg 9360
gggcgacauu uuucacagcg ugucgcgcgc ccgaccccgc ucauuacucu ucggccuacu 9420
ccuacuuuuc guagggguag gccucuuccu acuccccgcu cgguagagcg gcacacacua 9480
gguacacucc auagcuaacu guuccuuuuu uuuuuuuuuu uuuuuuuuuu uuuuuuuuuu 9540
uuuuuuuucu uuuuuuuuuu uuucccucuu ucuucccuuc ucaucuuauu cuacuuucuu 9600
ucuugguggc uccaucuuag cccuagucac ggcuagcugu gaaagguccg ugagccgcau 9660
gacugcagag agugccguaa cuggucucuc ugcagaucau gucuaga 9707
<210> 13
<211> 11111
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: replicon RNA comprising
full-length Hepatitis C virus genomic RNA derived from JFH-1 clone
<400> 13
accugccccu aauaggggcg acacuccgcc augaaucacu ccccugugag gaacuacugu 60
cuucacgcag aaagcgccua gccauggcgu uaguaugagu gucguacagc cuccaggccc 120
cccccucccg ggagagccau aguggucugc ggaaccggug aguacaccgg aauugccggg 180
aagacugggu ccuuucuugg auaaacccac ucuaugcccg gccauuuggg cgugcccccg 240
caagacugcu agccgaguag cguuggguug cgaaaggccu ugugguacug ccugauaggg 300
cgcuugcgag ugccccggga ggucucguag accgugcacc augagcacaa auccuaaacc 360
ucaaagaaaa accaaaagaa acaccaaccg ucgcccaaug auugaacaag auggauugca 420
cgcagguucu ccggccgcuu ggguggagag gcuauucggc uaugacuggg cacaacagac 480
aaucggcugc ucugaugccg ccguguuccg gcugucagcg caggggcgcc cgguucuuuu 540
ugucaagacc gaccuguccg gugcccugaa ugaacugcag gacgaggcag cgcggcuauc 600
guggcuggcc acgacgggcg uuccuugcgc agcugugcuc gacguuguca cugaagcggg 660
aagggacugg cugcuauugg gcgaagugcc ggggcaggau cuccugucau cucaccuugc 720
uccugccgag aaaguaucca ucauggcuga ugcaaugcgg cggcugcaua cgcuugaucc 780
ggcuaccugc ccauucgacc accaagcgaa acaucgcauc gagcgagcac guacucggau 840
ggaagccggu cuugucgauc aggaugaucu ggacgaagag caucaggggc ucgcgccagc 900
cgaacuguuc gccaggcuca aggcgcgcau gcccgacggc gaggaucucg ucgugaccca 960
uggcgaugcc ugcuugccga auaucauggu ggaaaauggc cgcuuuucug gauucaucga 1020
cuguggccgg cugggugugg cggaccgcua ucaggacaua gcguuggcua cccgugauau 1080
ugcugaagag cuuggcggcg aaugggcuga ccgcuuccuc gugcuuuacg guaucgccgc 1140
ucccgauucg cagcgcaucg ccuucuaucg ccuucuugac gaguucuucu gaguuuaaac 1200
ccucucccuc cccccccccu aacguuacug gccgaagccg cuuggaauaa ggccggugug 1260
cguuugucua uauguuauuu uccaccauau ugccgucuuu uggcaaugug agggcccgga 1320
aaccuggccc ugucuucuug acgagcauuc cuaggggucu uuccccucuc gccaaaggaa 1380
ugcaaggucu guugaauguc gugaaggaag caguuccucu ggaagcuucu ugaagacaaa 1440
caacgucugu agcgacccuu ugcaggcagc ggaacccccc accuggcgac aggugccucu 1500
gcggccaaaa gccacgugua uaagauacac cugcaaaggc ggcacaaccc cagugccacg 1560
uugugaguug gauaguugug gaaagaguca aauggcucuc cucaagcgua uucaacaagg 1620
ggcugaagga ugcccagaag guaccccauu guaugggauc ugaucugggg ccucggugca 1680
caugcuuuac auguguuuag ucgagguuaa aaaaacgucu aggccccccg aaccacgggg 1740
acgugguuuu ccuuugaaaa acacgaugau accaugagca caaauccuaa accucaaaga 1800
aaaaccaaaa gaaacaccaa ccgucgccca gaagacguua aguucccggg cggcggccag 1860
aucguuggcg gaguauacuu guugccgcgc aggggcccca gguugggugu gcgcacgaca 1920
aggaaaacuu cggagcgguc ccagccacgu gggagacgcc agcccauccc caaagaucgg 1980
cgcuccacug gcaaggccug gggaaaacca ggucgccccu ggccccuaua ugggaaugag 2040
ggacucggcu gggcaggaug gcuccugucc ccccgaggcu cucgccccuc cuggggcccc 2100
acugaccccc ggcauagguc gcgcaacgug gguaaaguca ucgacacccu aacguguggc 2160
uuugccgacc ucauggggua cauccccguc guaggcgccc cgcuuagugg cgccgccaga 2220
gcugucgcgc acggcgugag aguccuggag gacgggguua auuaugcaac agggaaccua 2280
cccgguuucc ccuuuucuau cuucuugcug gcccuguugu ccugcaucac cguuccgguc 2340
ucugcugccc aggugaagaa uaccaguagc agcuacaugg ugaccaauga cugcuccaau 2400
gacagcauca cuuggcagcu cgaggcugcg guucuccacg uccccgggug cgucccgugc 2460
gagagagugg ggaauacguc acgguguugg gugccagucu cgccaaacau ggcugugcgg 2520
cagcccggug cccucacgca gggucugcgg acgcacaucg auaugguugu gauguccgcc 2580
accuucugcu cugcucucua cgugggggac cucuguggcg gggugaugcu cgcggcccag 2640
guguucaucg ucucgccgca guaccacugg uuugugcaag aaugcaauug cuccaucuac 2700
ccuggcacca ucacuggaca ccgcauggca ugggacauga ugaugaacug gucgcccacg 2760
gccaccauga uccuggcgua cgugaugcgc guccccgagg ucaucauaga caucguuagc 2820
ggggcucacu ggggcgucau guucggcuug gccuacuucu cuaugcaggg agcgugggcg 2880
aaggucauug ucauccuucu gcuggccgcu gggguggacg cgggcaccac caccguugga 2940
ggcgcuguug cacguuccac caacgugauu gccggcgugu ucagccaugg cccucagcag 3000
aacauucagc ucauuaacac caacggcagu uggcacauca accguacugc cuugaauugc 3060
aaugacuccu ugaacaccgg cuuucucgcg gccuuguucu acaccaaccg cuuuaacucg 3120
ucaggguguc cagggcgccu guccgccugc cgcaacaucg aggcuuuccg gauagggugg 3180
ggcacccuac aguacgagga uaaugucacc aauccagagg auaugaggcc guacugcugg 3240
cacuaccccc caaagccgug uggcguaguc cccgcgaggu cugugugugg cccaguguac 3300
uguuucaccc ccagcccggu aguagugggc acgaccgaca gacguggagu gcccaccuac 3360
acauggggag agaaugagac agaugucuuc cuacugaaca gcacccgacc gccgcagggc 3420
ucaugguucg gcugcacgug gaugaacucc acugguuuca ccaagacuug uggcgcgcca 3480
ccuugccgca ccagagcuga cuucaacgcc agcacggacu uguugugccc uacggauugu 3540
uuuaggaagc auccugaugc cacuuauauu aagugugguu cugggcccug gcucacacca 3600
aagugccugg uccacuaccc uuacagacuc uggcauuacc ccugcacagu caauuuuacc 3660
aucuucaaga uaagaaugua uguagggggg guugagcaca ggcucacggc cgcaugcaac 3720
uucacucgug gggaucgcug cgacuuggag gacagggaca ggagucagcu gucuccucug 3780
uugcacucua ccacggaaug ggccauccug cccugcaccu acucagacuu acccgcuuug 3840
ucaacugguc uucuccaccu ucaccagaac aucguggacg uacaauacau guauggccuc 3900
ucaccugcua ucacaaaaua cgucguucga ugggaguggg ugguacucuu auuccugcuc 3960
uuagcggacg ccagagucug cgccugcuug uggaugcuca ucuuguuggg ccaggccgaa 4020
gcagcauugg agaaguuggu cgucuugcac gcugcgagug cggcuaacug ccauggccuc 4080
cuauauuuug ccaucuucuu cguggcagcu uggcacauca ggggucgggu gguccccuug 4140
accaccuauu gccucacugg ccuauggccc uucugccuac ugcucauggc acugccccgg 4200
caggcuuaug ccuaugacgc accugugcac ggacagauag gcguggguuu guugauauug 4260
aucacccucu ucacacucac cccgggguau aagacccucc ucggccagug ucuguggugg 4320
uugugcuauc uccugacccu gggggaagcc augauucagg aguggguacc acccaugcag 4380
gugcgcggcg gccgcgaugg caucgcgugg gccgucacua uauucugccc ggguguggug 4440
uuugacauua ccaaauggcu uuuggcguug cuugggccug cuuaccucuu aagggccgcu 4500
uugacacaug ugccguacuu cgucagagcu cacgcucuga uaaggguaug cgcuuuggug 4560
aagcagcucg cgggggguag guauguucag guggcgcuau uggcccuugg cagguggacu 4620
ggcaccuaca ucuaugacca ccucacaccu augucggacu gggccgcuag cggccugcgc 4680
gacuuagcgg ucgccgugga acccaucauc uucaguccga uggagaagaa ggucaucguc 4740
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cucggccagg agauccuccu cggcccagcu gauggcuaca ccuccaaggg guggaagcuc 4860
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aguaugacgg ggcgugacag gacagaacag gccggggaag uccaaauccu guccacaguc 4980
ucucaguccu uccucggaac aaccaucucg gggguuuugu ggacuguuua ccacggagcu 5040
ggcaacaaga cucuagccgg cuuacggggu ccggucacgc agauguacuc gagugcugag 5100
ggggacuugg uaggcuggcc cagccccccu gggaccaagu cuuuggagcc gugcaagugu 5160
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ggggacaagc ggggagcauu gcucuccccg agacccauuu cgaccuugaa gggguccucg 5280
ggggggccgg ugcucugccc uaggggccac gucguugggc ucuuccgagc agcugugugc 5340
ucucggggcg uggccaaauc caucgauuuc auccccguug agacacucga cguuguuaca 5400
aggucuccca cuuucaguga caacagcacg ccaccggcug ugccccagac cuaucagguc 5460
ggguacuugc augcuccaac uggcagugga aagagcacca aggucccugu cgcguaugcc 5520
gcccaggggu acaaaguacu agugcuuaac cccucgguag cugccacccu gggguuuggg 5580
gcguaccuau ccaaggcaca uggcaucaau cccaacauua ggacuggagu caggaccgug 5640
augaccgggg aggccaucac guacuccaca uauggcaaau uucucgccga ugggggcugc 5700
gcuagcggcg ccuaugacau caucauaugc gaugaaugcc acgcugugga ugcuaccucc 5760
auucucggca ucggaacggu ccuugaucaa gcagagacag ccggggucag acuaacugug 5820
cuggcuacgg ccacaccccc cgggucagug acaacccccc aucccgauau agaagaggua 5880
ggccucgggc gggaggguga gauccccuuc uaugggaggg cgauuccccu auccugcauc 5940
aagggaggga gacaccugau uuucugccac ucaaagaaaa agugugacga gcucgcggcg 6000
gcccuucggg gcaugggcuu gaaugccgug gcauacuaua gaggguugga cgucuccaua 6060
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ggagacuuug acuccgugau cgacugcaau guagcgguca cccaagcugu cgacuucagc 6180
cuggacccca ccuucacuau aaccacacag acugucccac aagacgcugu cucacgcagu 6240
cagcgccgcg ggcgcacagg uagaggaaga cagggcacuu auagguaugu uuccacuggu 6300
gaacgagccu caggaauguu ugacagugua gugcuuugug agugcuacga cgcaggggcu 6360
gcgugguacg aucucacacc agcggagacc accgucaggc uuagagcgua uuucaacacg 6420
cccggccuac ccguguguca agaccaucuu gaauuuuggg aggcaguuuu caccggccuc 6480
acacacauag acgcccacuu ccucucccaa acaaagcaag cgggggagaa cuucgcguac 6540
cuaguagccu accaagcuac ggugugcgcc agagccaagg ccccuccccc guccugggac 6600
gccaugugga agugccuggc ccgacucaag ccuacgcuug cgggccccac accucuccug 6660
uaccguuugg gcccuauuac caaugagguc acccucacac acccugggac gaaguacauc 6720
gccacaugca ugcaagcuga ccuugagguc augaccagca cguggguccu agcuggagga 6780
guccuggcag ccgucgccgc auauugccug gcgacuggau gcguuuccau caucggccgc 6840
uugcacguca accagcgagu cgucguugcg ccggauaagg agguccugua ugaggcuuuu 6900
gaugagaugg aggaaugcgc cucuagggcg gcucucaucg aagaggggca gcggauagcc 6960
gagauguuga aguccaagau ccaaggcuug cugcagcagg ccucuaagca ggcccaggac 7020
auacaacccg cuaugcaggc uucauggccc aaaguggaac aauuuugggc cagacacaug 7080
uggaacuuca uuagcggcau ccaauaccuc gcaggauugu caacacugcc agggaacccc 7140
gcgguggcuu ccaugauggc auucagugcc gcccucacca guccguuguc gaccaguacc 7200
accauccuuc ucaacaucau gggaggcugg uuagcguccc agaucgcacc acccgcgggg 7260
gccaccggcu uugucgucag uggccuggug ggggcugccg ugggcagcau aggccugggu 7320
aaggugcugg uggacauccu ggcaggauau ggugcgggca uuucgggggc ccucgucgca 7380
uucaagauca ugucuggcga gaagcccucu auggaagaug ucaucaaucu acugccuggg 7440
auccugucuc cgggagcccu gguggugggg gucaucugcg cggccauucu gcgccgccac 7500
gugggaccgg gggagggcgc gguccaaugg augaacaggc uuauugccuu ugcuuccaga 7560
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caacuacuug gcucucuuac uauaaccagc cuacucagaa gacuccacaa uuggauaacu 7680
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cuccccuuca ucucuuguca aaagggguac aagggugugu gggccggcac uggcaucaug 7860
accacgcgcu gcccuugcgg cgccaacauc ucuggcaaug uccgccuggg cucuaugagg 7920
aucacagggc cuaaaaccug caugaacacc uggcagggga ccuuuccuau caauugcuac 7980
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gcggccucgg aguacgcgga ggugacgcag caugggucgu acuccuaugu aacaggacug 8100
accacugaca aucugaaaau uccuugccaa cuaccuucuc cagaguuuuu cuccugggug 8160
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ucguucugcg uugggcuuaa uuccuaugcu gucggguccc agcuucccug ugaaccugag 8280
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accguugcug guugugcucu cccccccccc aagaaggccc cgacgccucc cccaaggaga 8760
cgccggacag ugggucugag cgagagcacc auaucagaag cccuccagca acuggccauc 8820
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gagcuucaac cuccccccca gggggggggg guagcucccg guucgggcuc ggggucuugg 9060
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ggggcucuaa uaacucccug uagccccgaa gaggaaaagu ugccaaucaa cccuuugagu 9180
aacucgcugu ugcgauacca uaacaaggug uacuguacaa caucaaagag cgccucacag 9240
agggcuaaaa agguaacuuu ugacaggacg caagugcucg acgcccauua ugacucaguc 9300
uuaaaggaca ucaagcuagc ggcuuccaag gucagcgcaa ggcuccucac cuuggaggag 9360
gcgugccagu ugacuccacc ccauucugca agauccaagu auggauucgg ggccaaggag 9420
guccgcagcu uguccgggag ggccguuaac cacaucaagu ccguguggaa ggaccuccug 9480
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gaccccgcca agggggguaa gaaaccagcu cgccucaucg uuuacccuga ccucggcguc 9600
cgggucugcg agaaaauggc ccucuaugac auuacacaaa agcuuccuca ggcgguaaug 9660
ggagcuuccu auggcuucca guacuccccu gcccaacggg uggaguaucu cuugaaagca 9720
ugggcggaaa agaaggaccc cauggguuuu ucguaugaua cccgaugcuu cgacucaacc 9780
gucacugaga gagacaucag gaccgaggag uccauauacc aggccugcuc ccugcccgag 9840
gaggcccgca cugccauaca cucgcugacu gagagacuuu acguaggagg gcccauguuc 9900
aacagcaagg gucaaaccug cgguuacaga cguugccgcg ccagcggggu gcuaaccacu 9960
agcaugggua acaccaucac augcuaugug aaagcccuag cggccugcaa ggcugcgggg 10020
auaguugcgc ccacaaugcu gguaugcggc gaugaccuag uagucaucuc agaaagccag 10080
gggacugagg aggacgagcg gaaccugaga gccuucacgg aggccaugac cagguacucu 10140
gccccuccug gugauccccc cagaccggaa uaugaccugg agcuaauaac auccuguucc 10200
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ccaaccacuc cacucgcccg ggcugccugg gaaacaguua gacacucccc uaucaauuca 10320
uggcugggaa acaucaucca guaugcucca accauauggg uucgcauggu ccuaaugaca 10380
cacuucuucu ccauucucau gguccaagac acccuggacc agaaccucaa cuuugagaug 10440
uauggaucag uauacuccgu gaauccuuug gaccuuccag ccauaauuga gagguuacac 10500
gggcuugacg ccuuuucuau gcacacauac ucucaccacg aacugacgcg gguggcuuca 10560
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cuccccgcuc gguagagcgg cacacacuag guacacucca uagcuaacug uuccuuuuuu 10920
uuuuuuuuuu uuuuuuuuuu uuuuuuuuuu uuuuuuucuu uuuuuuuuuu uucccucuuu 10980
cuucccuucu caucuuauuc uacuuucuuu cuugguggcu ccaucuuagc ccuagucacg 11040
gcuagcugug aaagguccgu gagccgcaug acugcagaga gugccguaac uggucucucu 11100
gcagaucaug u 11111
<210> 14
<211> 11111
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: full-length Hepatitis C virus
genomic RNA derived from JFH-1 clone, wherein an amino acid motif GDD has
been mutated into GND
<400> 14
accugccccu aauaggggcg acacuccgcc augaaucacu ccccugugag gaacuacugu 60
cuucacgcag aaagcgccua gccauggcgu uaguaugagu gucguacagc cuccaggccc 120
cccccucccg ggagagccau aguggucugc ggaaccggug aguacaccgg aauugccggg 180
aagacugggu ccuuucuugg auaaacccac ucuaugcccg gccauuuggg cgugcccccg 240
caagacugcu agccgaguag cguuggguug cgaaaggccu ugugguacug ccugauaggg 300
cgcuugcgag ugccccggga ggucucguag accgugcacc augagcacaa auccuaaacc 360
ucaaagaaaa accaaaagaa acaccaaccg ucgcccaaug auugaacaag auggauugca 420
cgcagguucu ccggccgcuu ggguggagag gcuauucggc uaugacuggg cacaacagac 480
aaucggcugc ucugaugccg ccguguuccg gcugucagcg caggggcgcc cgguucuuuu 540
ugucaagacc gaccuguccg gugcccugaa ugaacugcag gacgaggcag cgcggcuauc 600
guggcuggcc acgacgggcg uuccuugcgc agcugugcuc gacguuguca cugaagcggg 660
aagggacugg cugcuauugg gcgaagugcc ggggcaggau cuccugucau cucaccuugc 720
uccugccgag aaaguaucca ucauggcuga ugcaaugcgg cggcugcaua cgcuugaucc 780
ggcuaccugc ccauucgacc accaagcgaa acaucgcauc gagcgagcac guacucggau 840
ggaagccggu cuugucgauc aggaugaucu ggacgaagag caucaggggc ucgcgccagc 900
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uggcgaugcc ugcuugccga auaucauggu ggaaaauggc cgcuuuucug gauucaucga 1020
cuguggccgg cugggugugg cggaccgcua ucaggacaua gcguuggcua cccgugauau 1080
ugcugaagag cuuggcggcg aaugggcuga ccgcuuccuc gugcuuuacg guaucgccgc 1140
ucccgauucg cagcgcaucg ccuucuaucg ccuucuugac gaguucuucu gaguuuaaac 1200
ccucucccuc cccccccccu aacguuacug gccgaagccg cuuggaauaa ggccggugug 1260
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ugcaaggucu guugaauguc gugaaggaag caguuccucu ggaagcuucu ugaagacaaa 1440
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uugugaguug gauaguugug gaaagaguca aauggcucuc cucaagcgua uucaacaagg 1620
ggcugaagga ugcccagaag guaccccauu guaugggauc ugaucugggg ccucggugca 1680
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cgcuccacug gcaaggccug gggaaaacca ggucgccccu ggccccuaua ugggaaugag 2040
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ccuugccgca ccagagcuga cuucaacgcc agcacggacu uguugugccc uacggauugu 3540
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uucacucgug gggaucgcug cgacuuggag gacagggaca ggagucagcu gucuccucug 3780
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ucaccugcua ucacaaaaua cgucguucga ugggaguggg ugguacucuu auuccugcuc 3960
uuagcggacg ccagagucug cgccugcuug uggaugcuca ucuuguuggg ccaggccgaa 4020
gcagcauugg agaaguuggu cgucuugcac gcugcgagug cggcuaacug ccauggccuc 4080
cuauauuuug ccaucuucuu cguggcagcu uggcacauca ggggucgggu gguccccuug 4140
accaccuauu gccucacugg ccuauggccc uucugccuac ugcucauggc acugccccgg 4200
caggcuuaug ccuaugacgc accugugcac ggacagauag gcguggguuu guugauauug 4260
aucacccucu ucacacucac cccgggguau aagacccucc ucggccagug ucuguggugg 4320
uugugcuauc uccugacccu gggggaagcc augauucagg aguggguacc acccaugcag 4380
gugcgcggcg gccgcgaugg caucgcgugg gccgucacua uauucugccc ggguguggug 4440
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aagcagcucg cgggggguag guauguucag guggcgcuau uggcccuugg cagguggacu 4620
ggcaccuaca ucuaugacca ccucacaccu augucggacu gggccgcuag cggccugcgc 4680
gacuuagcgg ucgccgugga acccaucauc uucaguccga uggagaagaa ggucaucguc 4740
uggggagcgg agacggcugc auguggggac auucuacaug gacuucccgu guccgcccga 4800
cucggccagg agauccuccu cggcccagcu gauggcuaca ccuccaaggg guggaagcuc 4860
cuugcuccca ucacugcuua ugcccagcaa acacgaggcc uccugggcgc cauaguggug 4920
aguaugacgg ggcgugacag gacagaacag gccggggaag uccaaauccu guccacaguc 4980
ucucaguccu uccucggaac aaccaucucg gggguuuugu ggacuguuua ccacggagcu 5040
ggcaacaaga cucuagccgg cuuacggggu ccggucacgc agauguacuc gagugcugag 5100
ggggacuugg uaggcuggcc cagccccccu gggaccaagu cuuuggagcc gugcaagugu 5160
ggagccgucg accuauaucu ggucacgcgg aacgcugaug ucaucccggc ucggagacgc 5220
ggggacaagc ggggagcauu gcucuccccg agacccauuu cgaccuugaa gggguccucg 5280
ggggggccgg ugcucugccc uaggggccac gucguugggc ucuuccgagc agcugugugc 5340
ucucggggcg uggccaaauc caucgauuuc auccccguug agacacucga cguuguuaca 5400
aggucuccca cuuucaguga caacagcacg ccaccggcug ugccccagac cuaucagguc 5460
ggguacuugc augcuccaac uggcagugga aagagcacca aggucccugu cgcguaugcc 5520
gcccaggggu acaaaguacu agugcuuaac cccucgguag cugccacccu gggguuuggg 5580
gcguaccuau ccaaggcaca uggcaucaau cccaacauua ggacuggagu caggaccgug 5640
augaccgggg aggccaucac guacuccaca uauggcaaau uucucgccga ugggggcugc 5700
gcuagcggcg ccuaugacau caucauaugc gaugaaugcc acgcugugga ugcuaccucc 5760
auucucggca ucggaacggu ccuugaucaa gcagagacag ccggggucag acuaacugug 5820
cuggcuacgg ccacaccccc cgggucagug acaacccccc aucccgauau agaagaggua 5880
ggccucgggc gggaggguga gauccccuuc uaugggaggg cgauuccccu auccugcauc 5940
aagggaggga gacaccugau uuucugccac ucaaagaaaa agugugacga gcucgcggcg 6000
gcccuucggg gcaugggcuu gaaugccgug gcauacuaua gaggguugga cgucuccaua 6060
auaccagcuc agggagaugu gguggucguc gccaccgacg cccucaugac gggguacacu 6120
ggagacuuug acuccgugau cgacugcaau guagcgguca cccaagcugu cgacuucagc 6180
cuggacccca ccuucacuau aaccacacag acugucccac aagacgcugu cucacgcagu 6240
cagcgccgcg ggcgcacagg uagaggaaga cagggcacuu auagguaugu uuccacuggu 6300
gaacgagccu caggaauguu ugacagugua gugcuuugug agugcuacga cgcaggggcu 6360
gcgugguacg aucucacacc agcggagacc accgucaggc uuagagcgua uuucaacacg 6420
cccggccuac ccguguguca agaccaucuu gaauuuuggg aggcaguuuu caccggccuc 6480
acacacauag acgcccacuu ccucucccaa acaaagcaag cgggggagaa cuucgcguac 6540
cuaguagccu accaagcuac ggugugcgcc agagccaagg ccccuccccc guccugggac 6600
gccaugugga agugccuggc ccgacucaag ccuacgcuug cgggccccac accucuccug 6660
uaccguuugg gcccuauuac caaugagguc acccucacac acccugggac gaaguacauc 6720
gccacaugca ugcaagcuga ccuugagguc augaccagca cguggguccu agcuggagga 6780
guccuggcag ccgucgccgc auauugccug gcgacuggau gcguuuccau caucggccgc 6840
uugcacguca accagcgagu cgucguugcg ccggauaagg agguccugua ugaggcuuuu 6900
gaugagaugg aggaaugcgc cucuagggcg gcucucaucg aagaggggca gcggauagcc 6960
gagauguuga aguccaagau ccaaggcuug cugcagcagg ccucuaagca ggcccaggac 7020
auacaacccg cuaugcaggc uucauggccc aaaguggaac aauuuugggc cagacacaug 7080
uggaacuuca uuagcggcau ccaauaccuc gcaggauugu caacacugcc agggaacccc 7140
gcgguggcuu ccaugauggc auucagugcc gcccucacca guccguuguc gaccaguacc 7200
accauccuuc ucaacaucau gggaggcugg uuagcguccc agaucgcacc acccgcgggg 7260
gccaccggcu uugucgucag uggccuggug ggggcugccg ugggcagcau aggccugggu 7320
aaggugcugg uggacauccu ggcaggauau ggugcgggca uuucgggggc ccucgucgca 7380
uucaagauca ugucuggcga gaagcccucu auggaagaug ucaucaaucu acugccuggg 7440
auccugucuc cgggagcccu gguggugggg gucaucugcg cggccauucu gcgccgccac 7500
gugggaccgg gggagggcgc gguccaaugg augaacaggc uuauugccuu ugcuuccaga 7560
ggaaaccacg ucgccccuac ucacuacgug acggagucgg augcgucgca gcgugugacc 7620
caacuacuug gcucucuuac uauaaccagc cuacucagaa gacuccacaa uuggauaacu 7680
gaggacugcc ccaucccaug cuccggaucc uggcuccgcg acguguggga cuggguuugc 7740
accaucuuga cagacuucaa aaauuggcug accucuaaau uguuccccaa gcugcccggc 7800
cuccccuuca ucucuuguca aaagggguac aagggugugu gggccggcac uggcaucaug 7860
accacgcgcu gcccuugcgg cgccaacauc ucuggcaaug uccgccuggg cucuaugagg 7920
aucacagggc cuaaaaccug caugaacacc uggcagggga ccuuuccuau caauugcuac 7980
acggagggcc agugcgcgcc gaaacccccc acgaacuaca agaccgccau cuggagggug 8040
gcggccucgg aguacgcgga ggugacgcag caugggucgu acuccuaugu aacaggacug 8100
accacugaca aucugaaaau uccuugccaa cuaccuucuc cagaguuuuu cuccugggug 8160
gacggugugc agauccauag guuugcaccc acaccaaagc cguuuuuccg ggaugagguc 8220
ucguucugcg uugggcuuaa uuccuaugcu gucggguccc agcuucccug ugaaccugag 8280
cccgacgcag acguauugag guccaugcua acagauccgc cccacaucac ggcggagacu 8340
gcggcgcggc gcuuggcacg gggaucaccu ccaucugagg cgagcuccuc agugagccag 8400
cuaucagcac cgucgcugcg ggccaccugc accacccaca gcaacaccua ugacguggac 8460
auggucgaug ccaaccugcu cauggagggc gguguggcuc agacagagcc ugaguccagg 8520
gugcccguuc uggacuuucu cgagccaaug gccgaggaag agagcgaccu ugagcccuca 8580
auaccaucgg agugcaugcu ccccaggagc ggguuuccac gggccuuacc ggcuugggca 8640
cggccugacu acaacccgcc gcucguggaa ucguggagga ggccagauua ccaaccgccc 8700
accguugcug guugugcucu cccccccccc aagaaggccc cgacgccucc cccaaggaga 8760
cgccggacag ugggucugag cgagagcacc auaucagaag cccuccagca acuggccauc 8820
aagaccuuug gccagccccc cucgagcggu gaugcaggcu cguccacggg ggcgggcgcc 8880
gccgaauccg gcgguccgac guccccuggu gagccggccc ccucagagac agguuccgcc 8940
uccucuaugc ccccccucga gggggagccu ggagauccgg accuggaguc ugaucaggua 9000
gagcuucaac cuccccccca gggggggggg guagcucccg guucgggcuc ggggucuugg 9060
ucuacuugcu ccgaggagga cgauaccacc gugugcugcu ccaugucaua cuccuggacc 9120
ggggcucuaa uaacucccug uagccccgaa gaggaaaagu ugccaaucaa cccuuugagu 9180
aacucgcugu ugcgauacca uaacaaggug uacuguacaa caucaaagag cgccucacag 9240
agggcuaaaa agguaacuuu ugacaggacg caagugcucg acgcccauua ugacucaguc 9300
uuaaaggaca ucaagcuagc ggcuuccaag gucagcgcaa ggcuccucac cuuggaggag 9360
gcgugccagu ugacuccacc ccauucugca agauccaagu auggauucgg ggccaaggag 9420
guccgcagcu uguccgggag ggccguuaac cacaucaagu ccguguggaa ggaccuccug 9480
gaagacccac aaacaccaau ucccacaacc aucauggcca aaaaugaggu guucugcgug 9540
gaccccgcca agggggguaa gaaaccagcu cgccucaucg uuuacccuga ccucggcguc 9600
cgggucugcg agaaaauggc ccucuaugac auuacacaaa agcuuccuca ggcgguaaug 9660
ggagcuuccu auggcuucca guacuccccu gcccaacggg uggaguaucu cuugaaagca 9720
ugggcggaaa agaaggaccc cauggguuuu ucguaugaua cccgaugcuu cgacucaacc 9780
gucacugaga gagacaucag gaccgaggag uccauauacc aggccugcuc ccugcccgag 9840
gaggcccgca cugccauaca cucgcugacu gagagacuuu acguaggagg gcccauguuc 9900
aacagcaagg gucaaaccug cgguuacaga cguugccgcg ccagcggggu gcuaaccacu 9960
agcaugggua acaccaucac augcuaugug aaagcccuag cggccugcaa ggcugcgggg 10020
auaguugcgc ccacaaugcu gguaugcggc aaugaccuag uagucaucuc agaaagccag 10080
gggacugagg aggacgagcg gaaccugaga gccuucacgg aggccaugac cagguacucu 10140
gccccuccug gugauccccc cagaccggaa uaugaccugg agcuaauaac auccuguucc 10200
ucaaaugugu cuguggcguu gggcccgcgg ggccgccgca gauacuaccu gaccagagac 10260
ccaaccacuc cacucgcccg ggcugccugg gaaacaguua gacacucccc uaucaauuca 10320
uggcugggaa acaucaucca guaugcucca accauauggg uucgcauggu ccuaaugaca 10380
cacuucuucu ccauucucau gguccaagac acccuggacc agaaccucaa cuuugagaug 10440
uauggaucag uauacuccgu gaauccuuug gaccuuccag ccauaauuga gagguuacac 10500
gggcuugacg ccuuuucuau gcacacauac ucucaccacg aacugacgcg gguggcuuca 10560
gcccucagaa aacuuggggc gccaccccuc agggugugga agagucgggc ucgcgcaguc 10620
agggcguccc ucaucucccg uggagggaaa gcggccguuu gcggccgaua ucucuucaau 10680
ugggcgguga agaccaagcu caaacucacu ccauugccgg aggcgcgccu acuggacuua 10740
uccaguuggu ucaccgucgg cgccggcggg ggcgacauuu uucacagcgu gucgcgcgcc 10800
cgaccccgcu cauuacucuu cggccuacuc cuacuuuucg uagggguagg ccucuuccua 10860
cuccccgcuc gguagagcgg cacacacuag guacacucca uagcuaacug uuccuuuuuu 10920
uuuuuuuuuu uuuuuuuuuu uuuuuuuuuu uuuuuuucuu uuuuuuuuuu uucccucuuu 10980
cuucccuucu caucuuauuc uacuuucuuu cuugguggcu ccaucuuagc ccuagucacg 11040
gcuagcugug aaagguccgu gagccgcaug acugcagaga gugccguaac uggucucucu 11100
gcagaucaug u 11111
<210> 15
<211> 9707
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: replicon RNA comprising
full-length Hepatitis C virus genomic RNA derived from JFH-1 clone, wherein
an amino acid motif GDD has been mutated into GND
<400> 15
gaauucuaau acgacucacu auagaccugc cccuaauagg ggcgacacuc cgccaugaau 60
cacuccccug ugaggaacua cugucuucac gcagaaagcg ccuagccaug gcguuaguau 120
gagugucgua cagccuccag gccccccccu cccgggagag ccauaguggu cugcggaacc 180
ggugaguaca ccggaauugc cgggaagacu ggguccuuuc uuggauaaac ccacucuaug 240
cccggccauu ugggcgugcc cccgcaagac ugcuagccga guagcguugg guugcgaaag 300
gccuuguggu acugccugau agggcgcuug cgagugcccc gggaggucuc guagaccgug 360
caccaugagc acaaauccua aaccucaaag aaaaaccaaa agaaacacca accgucgccc 420
agaagacguu aaguucccgg gcggcggcca gaucguuggc ggaguauacu uguugccgcg 480
caggggcccc agguugggug ugcgcacgac aaggaaaacu ucggagcggu cccagccacg 540
ugggagacgc cagcccaucc ccaaagaucg gcgcuccacu ggcaaggccu ggggaaaacc 600
aggucgcccc uggccccuau augggaauga gggacucggc ugggcaggau ggcuccuguc 660
cccccgaggc ucucgccccu ccuggggccc cacugacccc cggcauaggu cgcgcaacgu 720
ggguaaaguc aucgacaccc uaacgugugg cuuugccgac cucauggggu acauccccgu 780
cguaggcgcc ccgcuuagug gcgccgccag agcugucgcg cacggcguga gaguccugga 840
ggacgggguu aauuaugcaa cagggaaccu acccgguuuc cccuuuucua ucuucuugcu 900
ggcccuguug uccugcauca ccguuccggu cucugcugcc caggugaaga auaccaguag 960
cagcuacaug gugaccaaug acugcuccaa ugacagcauc acuuggcagc ucgaggcugc 1020
gguucuccac guccccgggu gcgucccgug cgagagagug gggaauacgu cacgguguug 1080
ggugccaguc ucgccaaaca uggcugugcg gcagcccggu gcccucacgc agggucugcg 1140
gacgcacauc gauaugguug ugauguccgc caccuucugc ucugcucucu acguggggga 1200
ccucuguggc ggggugaugc ucgcggccca gguguucauc gucucgccgc aguaccacug 1260
guuugugcaa gaaugcaauu gcuccaucua cccuggcacc aucacuggac accgcauggc 1320
augggacaug augaugaacu ggucgcccac ggccaccaug auccuggcgu acgugaugcg 1380
cguccccgag gucaucauag acaucguuag cggggcucac uggggcguca uguucggcuu 1440
ggccuacuuc ucuaugcagg gagcgugggc gaaggucauu gucauccuuc ugcuggccgc 1500
ugggguggac gcgggcacca ccaccguugg aggcgcuguu gcacguucca ccaacgugau 1560
ugccggcgug uucagccaug gcccucagca gaacauucag cucauuaaca ccaacggcag 1620
uuggcacauc aaccguacug ccuugaauug caaugacucc uugaacaccg gcuuucucgc 1680
ggccuuguuc uacaccaacc gcuuuaacuc gucagggugu ccagggcgcc uguccgccug 1740
ccgcaacauc gaggcuuucc ggauagggug gggcacccua caguacgagg auaaugucac 1800
caauccagag gauaugaggc cguacugcug gcacuacccc ccaaagccgu guggcguagu 1860
ccccgcgagg ucugugugug gcccagugua cuguuucacc cccagcccgg uaguaguggg 1920
cacgaccgac agacguggag ugcccaccua cacaugggga gagaaugaga cagaugucuu 1980
ccuacugaac agcacccgac cgccgcaggg cucaugguuc ggcugcacgu ggaugaacuc 2040
cacugguuuc accaagacuu guggcgcgcc accuugccgc accagagcug acuucaacgc 2100
cagcacggac uuguugugcc cuacggauug uuuuaggaag cauccugaug ccacuuauau 2160
uaaguguggu ucugggcccu ggcucacacc aaagugccug guccacuacc cuuacagacu 2220
cuggcauuac cccugcacag ucaauuuuac caucuucaag auaagaaugu auguaggggg 2280
gguugagcac aggcucacgg ccgcaugcaa cuucacucgu ggggaucgcu gcgacuugga 2340
ggacagggac aggagucagc ugucuccucu guugcacucu accacggaau gggccauccu 2400
gcccugcacc uacucagacu uacccgcuuu gucaacuggu cuucuccacc uucaccagaa 2460
caucguggac guacaauaca uguauggccu cucaccugcu aucacaaaau acgucguucg 2520
augggagugg gugguacucu uauuccugcu cuuagcggac gccagagucu gcgccugcuu 2580
guggaugcuc aucuuguugg gccaggccga agcagcauug gagaaguugg ucgucuugca 2640
cgcugcgagu gcggcuaacu gccauggccu ccuauauuuu gccaucuucu ucguggcagc 2700
uuggcacauc aggggucggg ugguccccuu gaccaccuau ugccucacug gccuauggcc 2760
cuucugccua cugcucaugg cacugccccg gcaggcuuau gccuaugacg caccugugca 2820
cggacagaua ggcguggguu uguugauauu gaucacccuc uucacacuca ccccggggua 2880
uaagacccuc cucggccagu gucuguggug guugugcuau cuccugaccc ugggggaagc 2940
caugauucag gaguggguac cacccaugca ggugcgcggc ggccgcgaug gcaucgcgug 3000
ggccgucacu auauucugcc cggguguggu guuugacauu accaaauggc uuuuggcguu 3060
gcuugggccu gcuuaccucu uaagggccgc uuugacacau gugccguacu ucgucagagc 3120
ucacgcucug auaaggguau gcgcuuuggu gaagcagcuc gcggggggua gguauguuca 3180
gguggcgcua uuggcccuug gcagguggac uggcaccuac aucuaugacc accucacacc 3240
uaugucggac ugggccgcua gcggccugcg cgacuuagcg gucgccgugg aacccaucau 3300
cuucaguccg auggagaaga aggucaucgu cuggggagcg gagacggcug caugugggga 3360
cauucuacau ggacuucccg uguccgcccg acucggccag gagauccucc ucggcccagc 3420
ugauggcuac accuccaagg gguggaagcu ccuugcuccc aucacugcuu augcccagca 3480
aacacgaggc cuccugggcg ccauaguggu gaguaugacg gggcgugaca ggacagaaca 3540
ggccggggaa guccaaaucc uguccacagu cucucagucc uuccucggaa caaccaucuc 3600
ggggguuuug uggacuguuu accacggagc uggcaacaag acucuagccg gcuuacgggg 3660
uccggucacg cagauguacu cgagugcuga gggggacuug guaggcuggc ccagcccccc 3720
ugggaccaag ucuuuggagc cgugcaagug uggagccguc gaccuauauc uggucacgcg 3780
gaacgcugau gucaucccgg cucggagacg cggggacaag cggggagcau ugcucucccc 3840
gagacccauu ucgaccuuga agggguccuc gggggggccg gugcucugcc cuaggggcca 3900
cgucguuggg cucuuccgag cagcugugug cucucggggc guggccaaau ccaucgauuu 3960
cauccccguu gagacacucg acguuguuac aaggucuccc acuuucagug acaacagcac 4020
gccaccggcu gugccccaga ccuaucaggu cggguacuug caugcuccaa cuggcagugg 4080
aaagagcacc aaggucccug ucgcguaugc cgcccagggg uacaaaguac uagugcuuaa 4140
ccccucggua gcugccaccc ugggguuugg ggcguaccua uccaaggcac auggcaucaa 4200
ucccaacauu aggacuggag ucaggaccgu gaugaccggg gaggccauca cguacuccac 4260
auauggcaaa uuucucgccg augggggcug cgcuagcggc gccuaugaca ucaucauaug 4320
cgaugaaugc cacgcugugg augcuaccuc cauucucggc aucggaacgg uccuugauca 4380
agcagagaca gccgggguca gacuaacugu gcuggcuacg gccacacccc ccgggucagu 4440
gacaaccccc caucccgaua uagaagaggu aggccucggg cgggagggug agauccccuu 4500
cuaugggagg gcgauucccc uauccugcau caagggaggg agacaccuga uuuucugcca 4560
cucaaagaaa aagugugacg agcucgcggc ggcccuucgg ggcaugggcu ugaaugccgu 4620
ggcauacuau agaggguugg acgucuccau aauaccagcu cagggagaug ugguggucgu 4680
cgccaccgac gcccucauga cgggguacac uggagacuuu gacuccguga ucgacugcaa 4740
uguagcgguc acccaagcug ucgacuucag ccuggacccc accuucacua uaaccacaca 4800
gacuguccca caagacgcug ucucacgcag ucagcgccgc gggcgcacag guagaggaag 4860
acagggcacu uauagguaug uuuccacugg ugaacgagcc ucaggaaugu uugacagugu 4920
agugcuuugu gagugcuacg acgcaggggc ugcgugguac gaucucacac cagcggagac 4980
caccgucagg cuuagagcgu auuucaacac gcccggccua cccguguguc aagaccaucu 5040
ugaauuuugg gaggcaguuu ucaccggccu cacacacaua gacgcccacu uccucuccca 5100
aacaaagcaa gcgggggaga acuucgcgua ccuaguagcc uaccaagcua cggugugcgc 5160
cagagccaag gccccucccc cguccuggga cgccaugugg aagugccugg cccgacucaa 5220
gccuacgcuu gcgggcccca caccucuccu guaccguuug ggcccuauua ccaaugaggu 5280
cacccucaca cacccuggga cgaaguacau cgccacaugc augcaagcug accuugaggu 5340
caugaccagc acgugggucc uagcuggagg aguccuggca gccgucgccg cauauugccu 5400
ggcgacugga ugcguuucca ucaucggccg cuugcacguc aaccagcgag ucgucguugc 5460
gccggauaag gagguccugu augaggcuuu ugaugagaug gaggaaugcg ccucuagggc 5520
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caaaguggaa caauuuuggg ccagacacau guggaacuuc auuagcggca uccaauaccu 5700
cgcaggauug ucaacacugc cagggaaccc cgcgguggcu uccaugaugg cauucagugc 5760
cgcccucacc aguccguugu cgaccaguac caccauccuu cucaacauca ugggaggcug 5820
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gggggcugcc gugggcagca uaggccuggg uaaggugcug guggacaucc uggcaggaua 5940
uggugcgggc auuucggggg cccucgucgc auucaagauc augucuggcg agaagcccuc 6000
uauggaagau gucaucaauc uacugccugg gauccugucu ccgggagccc uggugguggg 6060
ggucaucugc gcggccauuc ugcgccgcca cgugggaccg ggggagggcg cgguccaaug 6120
gaugaacagg cuuauugccu uugcuuccag aggaaaccac gucgccccua cucacuacgu 6180
gacggagucg gaugcgucgc agcgugugac ccaacuacuu ggcucucuua cuauaaccag 6240
ccuacucaga agacuccaca auuggauaac ugaggacugc cccaucccau gcuccggauc 6300
cuggcuccgc gacguguggg acuggguuug caccaucuug acagacuuca aaaauuggcu 6360
gaccucuaaa uuguucccca agcugcccgg ccuccccuuc aucucuuguc aaaaggggua 6420
caagggugug ugggccggca cuggcaucau gaccacgcgc ugcccuugcg gcgccaacau 6480
cucuggcaau guccgccugg gcucuaugag gaucacaggg ccuaaaaccu gcaugaacac 6540
cuggcagggg accuuuccua ucaauugcua cacggagggc cagugcgcgc cgaaaccccc 6600
cacgaacuac aagaccgcca ucuggagggu ggcggccucg gaguacgcgg aggugacgca 6660
gcaugggucg uacuccuaug uaacaggacu gaccacugac aaucugaaaa uuccuugcca 6720
acuaccuucu ccagaguuuu ucuccugggu ggacggugug cagauccaua gguuugcacc 6780
cacaccaaag ccguuuuucc gggaugaggu cucguucugc guugggcuua auuccuaugc 6840
ugucgggucc cagcuucccu gugaaccuga gcccgacgca gacguauuga gguccaugcu 6900
aacagauccg ccccacauca cggcggagac ugcggcgcgg cgcuuggcac ggggaucacc 6960
uccaucugag gcgagcuccu cagugagcca gcuaucagca ccgucgcugc gggccaccug 7020
caccacccac agcaacaccu augacgugga cauggucgau gccaaccugc ucauggaggg 7080
cgguguggcu cagacagagc cugaguccag ggugcccguu cuggacuuuc ucgagccaau 7140
ggccgaggaa gagagcgacc uugagcccuc aauaccaucg gagugcaugc uccccaggag 7200
cggguuucca cgggccuuac cggcuugggc acggccugac uacaacccgc cgcucgugga 7260
aucguggagg aggccagauu accaaccgcc caccguugcu gguugugcuc uccccccccc 7320
caagaaggcc ccgacgccuc ccccaaggag acgccggaca gugggucuga gcgagagcac 7380
cauaucagaa gcccuccagc aacuggccau caagaccuuu ggccagcccc ccucgagcgg 7440
ugaugcaggc ucguccacgg gggcgggcgc cgccgaaucc ggcgguccga cguccccugg 7500
ugagccggcc cccucagaga cagguuccgc cuccucuaug cccccccucg agggggagcc 7560
uggagauccg gaccuggagu cugaucaggu agagcuucaa ccuccccccc aggggggggg 7620
gguagcuccc gguucgggcu cggggucuug gucuacuugc uccgaggagg acgauaccac 7680
cgugugcugc uccaugucau acuccuggac cggggcucua auaacucccu guagccccga 7740
agaggaaaag uugccaauca acccuuugag uaacucgcug uugcgauacc auaacaaggu 7800
guacuguaca acaucaaaga gcgccucaca gagggcuaaa aagguaacuu uugacaggac 7860
gcaagugcuc gacgcccauu augacucagu cuuaaaggac aucaagcuag cggcuuccaa 7920
ggucagcgca aggcuccuca ccuuggagga ggcgugccag uugacuccac cccauucugc 7980
aagauccaag uauggauucg gggccaagga gguccgcagc uuguccggga gggccguuaa 8040
ccacaucaag uccgugugga aggaccuccu ggaagaccca caaacaccaa uucccacaac 8100
caucauggcc aaaaaugagg uguucugcgu ggaccccgcc aaggggggua agaaaccagc 8160
ucgccucauc guuuacccug accucggcgu ccgggucugc gagaaaaugg cccucuauga 8220
cauuacacaa aagcuuccuc aggcgguaau gggagcuucc uauggcuucc aguacucccc 8280
ugcccaacgg guggaguauc ucuugaaagc augggcggaa aagaaggacc ccauggguuu 8340
uucguaugau acccgaugcu ucgacucaac cgucacugag agagacauca ggaccgagga 8400
guccauauac caggccugcu cccugcccga ggaggcccgc acugccauac acucgcugac 8460
ugagagacuu uacguaggag ggcccauguu caacagcaag ggucaaaccu gcgguuacag 8520
acguugccgc gccagcgggg ugcuaaccac uagcaugggu aacaccauca caugcuaugu 8580
gaaagcccua gcggccugca aggcugcggg gauaguugcg cccacaaugc ugguaugcgg 8640
caaugaccua guagucaucu cagaaagcca ggggacugag gaggacgagc ggaaccugag 8700
agccuucacg gaggccauga ccagguacuc ugccccuccu ggugaucccc ccagaccgga 8760
auaugaccug gagcuaauaa cauccuguuc cucaaaugug ucuguggcgu ugggcccgcg 8820
gggccgccgc agauacuacc ugaccagaga cccaaccacu ccacucgccc gggcugccug 8880
ggaaacaguu agacacuccc cuaucaauuc auggcuggga aacaucaucc aguaugcucc 8940
aaccauaugg guucgcaugg uccuaaugac acacuucuuc uccauucuca ugguccaaga 9000
cacccuggac cagaaccuca acuuugagau guauggauca guauacuccg ugaauccuuu 9060
ggaccuucca gccauaauug agagguuaca cgggcuugac gccuuuucua ugcacacaua 9120
cucucaccac gaacugacgc ggguggcuuc agcccucaga aaacuugggg cgccaccccu 9180
cagggugugg aagagucggg cucgcgcagu cagggcgucc cucaucuccc guggagggaa 9240
agcggccguu ugcggccgau aucucuucaa uugggcggug aagaccaagc ucaaacucac 9300
uccauugccg gaggcgcgcc uacuggacuu auccaguugg uucaccgucg gcgccggcgg 9360
gggcgacauu uuucacagcg ugucgcgcgc ccgaccccgc ucauuacucu ucggccuacu 9420
ccuacuuuuc guagggguag gccucuuccu acuccccgcu cgguagagcg gcacacacua 9480
gguacacucc auagcuaacu guuccuuuuu uuuuuuuuuu uuuuuuuuuu uuuuuuuuuu 9540
uuuuuuuucu uuuuuuuuuu uuucccucuu ucuucccuuc ucaucuuauu cuacuuucuu 9600
ucuugguggc uccaucuuag cccuagucac ggcuagcugu gaaagguccg ugagccgcau 9660
gacugcagag agugccguaa cuggucucuc ugcagaucau gucuaga 9707
<210> 16
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:primer
<400> 16
cgggagagcc atagtgg 17
<210> 17
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:primer
<400> 17
agtaccacaa ggcctttcg 19
<210> 18
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:primer
<400> 18
ctgcggaacc ggtgagtaca c 21
<210> 19
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:primer
<400> 19
aacaagatgg attgcacgca 20
<210> 20
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:primer
<400> 20
cgtcaagaag gcgatagaag 20
<210> 21
<211> 11969
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: replicon RNA derived from the expression vector rFGR-JFH1/Luc
<400> 21
accugccccu aauaggggcg acacuccgcc augaaucacu ccccugugag gaacuacugu 60
cuucacgcag aaagcgccua gccauggcgu uaguaugagu gucguacagc cuccaggccc 120
cccccucccg ggagagccau aguggucugc ggaaccggug aguacaccgg aauugccggg 180
aagacugggu ccuuucuugg auaaacccac ucuaugcccg gccauuuggg cgugcccccg 240
caagacugcu agccgaguag cguuggguug cgaaaggccu ugugguacug ccugauaggg 300
cgcuugcgag ugccccggga ggucucguag accgugcacc augagcacaa auccuaaacc 360
ucaaagaaaa accaaaagaa acaccaaccg acgcguaaug gaagacgcca aaaacauaaa 420
gaaaggcccg gcgccauucu auccucugga ggauggaacc gcuggagagc aacugcauaa 480
ggcuaugaag agauacgccc ugguuccugg aacaauugcu uuuacagaug cacauaucga 540
ggugaacauc acguacgcgg aauacuucga aauguccguu cgguuggcag aagcuaugaa 600
acgauauggg cugaauacaa aucacagaau cgucguaugc agugaaaacu cucuucaauu 660
cuuuaugccg guguugggcg cguuauuuau cggaguugca guugcgcccg cgaacgacau 720
uuauaaugaa cgugaauugc ucaacaguau gaacauuucg cagccuaccg uaguguuugu 780
uuccaaaaag ggguugcaaa aaauuuugaa cgugcaaaaa aaauuaccaa uaauccagaa 840
aauuauuauc auggauucua aaacggauua ccagggauuu cagucgaugu acacguucgu 900
cacaucucau cuaccucccg guuuuaauga auacgauuuu guaccagagu ccuuugaucg 960
ugacaaaaca auugcacuga uaaugaacuc cucuggaucu acuggguuac cuaagggugu 1020
ggcccuuccg cauagaacug ccugcgucag auucucgcau gccagagauc cuauuuuugg 1080
caaucaaauc auuccggaua cugcgauuuu aaguguuguu ccauuccauc acgguuuugg 1140
aauguuuacu acacucggau auuugauaug uggauuucga gucgucuuaa uguauagauu 1200
ugaagaagag cuguuuuuac gaucccuuca ggauuacaaa auucaaagug cguugcuagu 1260
accaacccua uuuucauucu ucgccaaaag cacucugauu gacaaauacg auuuaucuaa 1320
uuuacacgaa auugcuucug ggggcgcacc ucuuucgaaa gaagucgggg aagcgguugc 1380
aaaacgcuuc caucuuccag ggauacgaca aggauauggg cucacugaga cuacaucagc 1440
uauucugauu acacccgagg gggaugauaa accgggcgcg gucgguaaag uuguuccauu 1500
uuuugaagcg aagguugugg aucuggauac cgggaaaacg cugggcguua aucagagagg 1560
cgaauuaugu gucagaggac cuaugauuau guccgguuau guaaacaauc cggaagcgac 1620
caacgccuug auugacaagg auggauggcu acauucugga gacauagcuu acugggacga 1680
agacgaacac uucuucauag uugaccgcuu gaagucuuua auuaaauaca aaggauauca 1740
gguggccccc gcugaauugg aaucgauauu guuacaacac cccaacaucu ucgacgcggg 1800
cguggcaggu cuucccgacg augacgccgg ugaacuuccc gccgccguug uuguuuugga 1860
gcacggaaag acgaugacgg aaaaagagau cguggauuac gucgccaguc aaguaacaac 1920
cgcgaaaaag uugcgcggag gaguuguguu uguggacgaa guaccgaaag gucuuaccgg 1980
aaaacucgac gcaagaaaaa ucagagagau ccucauaaag gccaagaagg gcggaaaguc 2040
caaauuguaa guuuaaaccc ucucccuccc cccccccuaa cguuacuggc cgaagccgcu 2100
uggaauaagg ccggugugcg uuugucuaua uguuauuuuc caccauauug ccgucuuuug 2160
gcaaugugag ggcccggaaa ccuggcccug ucuucuugac gagcauuccu aggggucuuu 2220
ccccucucgc caaaggaaug caaggucugu ugaaugucgu gaaggaagca guuccucugg 2280
aagcuucuug aagacaaaca acgucuguag cgacccuuug caggcagcgg aaccccccac 2340
cuggcgacag gugccucugc ggccaaaagc cacguguaua agauacaccu gcaaaggcgg 2400
cacaacccca gugccacguu gugaguugga uaguugugga aagagucaaa uggcucuccu 2460
caagcguauu caacaagggg cugaaggaug cccagaaggu accccauugu augggaucug 2520
aucuggggcc ucggugcaca ugcuuuacau guguuuaguc gagguuaaaa aaacgucuag 2580
gccccccgaa ccacggggac gugguuuucc uuugaaaaac acgaugauac caugagcaca 2640
aauccuaaac cucaaagaaa aaccaaaaga aacaccaacc gucgcccaga agacguuaag 2700
uucccgggcg gcggccagau cguuggcgga guauacuugu ugccgcgcag gggccccagg 2760
uugggugugc gcacgacaag gaaaacuucg gagcgguccc agccacgugg gagacgccag 2820
cccaucccca aagaucggcg cuccacuggc aaggccuggg gaaaaccagg ucgccccugg 2880
ccccuauaug ggaaugaggg acucggcugg gcaggauggc uccugucccc ccgaggcucu 2940
cgccccuccu ggggccccac ugacccccgg cauaggucgc gcaacguggg uaaagucauc 3000
gacacccuaa cguguggcuu ugccgaccuc augggguaca uccccgucgu aggcgccccg 3060
cuuaguggcg ccgccagagc ugucgcgcac ggcgugagag uccuggagga cgggguuaau 3120
uaugcaacag ggaaccuacc cgguuucccc uuuucuaucu ucuugcuggc ccuguugucc 3180
ugcaucaccg uuccggucuc ugcugcccag gugaagaaua ccaguagcag cuacauggug 3240
accaaugacu gcuccaauga cagcaucacu uggcagcucg aggcugcggu ucuccacguc 3300
cccgggugcg ucccgugcga gagagugggg aauacgucac gguguugggu gccagucucg 3360
ccaaacaugg cugugcggca gcccggugcc cucacgcagg gucugcggac gcacaucgau 3420
augguuguga uguccgccac cuucugcucu gcucucuacg ugggggaccu cuguggcggg 3480
gugaugcucg cggcccaggu guucaucguc ucgccgcagu accacugguu ugugcaagaa 3540
ugcaauugcu ccaucuaccc uggcaccauc acuggacacc gcauggcaug ggacaugaug 3600
augaacuggu cgcccacggc caccaugauc cuggcguacg ugaugcgcgu ccccgagguc 3660
aucauagaca ucguuagcgg ggcucacugg ggcgucaugu ucggcuuggc cuacuucucu 3720
augcagggag cgugggcgaa ggucauuguc auccuucugc uggccgcugg gguggacgcg 3780
ggcaccacca ccguuggagg cgcuguugca cguuccacca acgugauugc cggcguguuc 3840
agccauggcc cucagcagaa cauucagcuc auuaacacca acggcaguug gcacaucaac 3900
cguacugccu ugaauugcaa ugacuccuug aacaccggcu uucucgcggc cuuguucuac 3960
accaaccgcu uuaacucguc agggugucca gggcgccugu ccgccugccg caacaucgag 4020
gcuuuccgga uagggugggg cacccuacag uacgaggaua augucaccaa uccagaggau 4080
augaggccgu acugcuggca cuacccccca aagccgugug gcguaguccc cgcgaggucu 4140
guguguggcc caguguacug uuucaccccc agcccgguag uagugggcac gaccgacaga 4200
cguggagugc ccaccuacac auggggagag aaugagacag augucuuccu acugaacagc 4260
acccgaccgc cgcagggcuc augguucggc ugcacgugga ugaacuccac ugguuucacc 4320
aagacuugug gcgcgccacc uugccgcacc agagcugacu ucaacgccag cacggacuug 4380
uugugcccua cggauuguuu uaggaagcau ccugaugcca cuuauauuaa gugugguucu 4440
gggcccuggc ucacaccaaa gugccugguc cacuacccuu acagacucug gcauuacccc 4500
ugcacaguca auuuuaccau cuucaagaua agaauguaug uagggggggu ugagcacagg 4560
cucacggccg caugcaacuu cacucguggg gaucgcugcg acuuggagga cagggacagg 4620
agucagcugu cuccucuguu gcacucuacc acggaauggg ccauccugcc cugcaccuac 4680
ucagacuuac ccgcuuuguc aacuggucuu cuccaccuuc accagaacau cguggacgua 4740
caauacaugu auggccucuc accugcuauc acaaaauacg ucguucgaug ggagugggug 4800
guacucuuau uccugcucuu agcggacgcc agagucugcg ccugcuugug gaugcucauc 4860
uuguugggcc aggccgaagc agcauuggag aaguuggucg ucuugcacgc ugcgagugcg 4920
gcuaacugcc auggccuccu auauuuugcc aucuucuucg uggcagcuug gcacaucagg 4980
ggucgggugg uccccuugac caccuauugc cucacuggcc uauggcccuu cugccuacug 5040
cucauggcac ugccccggca ggcuuaugcc uaugacgcac cugugcacgg acagauaggc 5100
guggguuugu ugauauugau cacccucuuc acacucaccc cgggguauaa gacccuccuc 5160
ggccaguguc uguggugguu gugcuaucuc cugacccugg gggaagccau gauucaggag 5220
uggguaccac ccaugcaggu gcgcggcggc cgcgauggca ucgcgugggc cgucacuaua 5280
uucugcccgg gugugguguu ugacauuacc aaauggcuuu uggcguugcu ugggccugcu 5340
uaccucuuaa gggccgcuuu gacacaugug ccguacuucg ucagagcuca cgcucugaua 5400
aggguaugcg cuuuggugaa gcagcucgcg ggggguaggu auguucaggu ggcgcuauug 5460
gcccuuggca gguggacugg caccuacauc uaugaccacc ucacaccuau gucggacugg 5520
gccgcuagcg gccugcgcga cuuagcgguc gccguggaac ccaucaucuu caguccgaug 5580
gagaagaagg ucaucgucug gggagcggag acggcugcau guggggacau ucuacaugga 5640
cuucccgugu ccgcccgacu cggccaggag auccuccucg gcccagcuga uggcuacacc 5700
uccaaggggu ggaagcuccu ugcucccauc acugcuuaug cccagcaaac acgaggccuc 5760
cugggcgcca uaguggugag uaugacgggg cgugacagga cagaacaggc cggggaaguc 5820
caaauccugu ccacagucuc ucaguccuuc cucggaacaa ccaucucggg gguuuugugg 5880
acuguuuacc acggagcugg caacaagacu cuagccggcu uacggggucc ggucacgcag 5940
auguacucga gugcugaggg ggacuuggua ggcuggccca gccccccugg gaccaagucu 6000
uuggagccgu gcaagugugg agccgucgac cuauaucugg ucacgcggaa cgcugauguc 6060
aucccggcuc ggagacgcgg ggacaagcgg ggagcauugc ucuccccgag acccauuucg 6120
accuugaagg gguccucggg ggggccggug cucugcccua ggggccacgu cguugggcuc 6180
uuccgagcag cugugugcuc ucggggcgug gccaaaucca ucgauuucau ccccguugag 6240
acacucgacg uuguuacaag gucucccacu uucagugaca acagcacgcc accggcugug 6300
ccccagaccu aucaggucgg guacuugcau gcuccaacug gcaguggaaa gagcaccaag 6360
gucccugucg cguaugccgc ccagggguac aaaguacuag ugcuuaaccc cucgguagcu 6420
gccacccugg gguuuggggc guaccuaucc aaggcacaug gcaucaaucc caacauuagg 6480
acuggaguca ggaccgugau gaccggggag gccaucacgu acuccacaua uggcaaauuu 6540
cucgccgaug ggggcugcgc uagcggcgcc uaugacauca ucauaugcga ugaaugccac 6600
gcuguggaug cuaccuccau ucucggcauc ggaacggucc uugaucaagc agagacagcc 6660
ggggucagac uaacugugcu ggcuacggcc acaccccccg ggucagugac aaccccccau 6720
cccgauauag aagagguagg ccucgggcgg gagggugaga uccccuucua ugggagggcg 6780
auuccccuau ccugcaucaa gggagggaga caccugauuu ucugccacuc aaagaaaaag 6840
ugugacgagc ucgcggcggc ccuucggggc augggcuuga augccguggc auacuauaga 6900
ggguuggacg ucuccauaau accagcucag ggagaugugg uggucgucgc caccgacgcc 6960
cucaugacgg gguacacugg agacuuugac uccgugaucg acugcaaugu agcggucacc 7020
caagcugucg acuucagccu ggaccccacc uucacuauaa ccacacagac ugucccacaa 7080
gacgcugucu cacgcaguca gcgccgcggg cgcacaggua gaggaagaca gggcacuuau 7140
agguauguuu ccacugguga acgagccuca ggaauguuug acaguguagu gcuuugugag 7200
ugcuacgacg caggggcugc gugguacgau cucacaccag cggagaccac cgucaggcuu 7260
agagcguauu ucaacacgcc cggccuaccc gugugucaag accaucuuga auuuugggag 7320
gcaguuuuca ccggccucac acacauagac gcccacuucc ucucccaaac aaagcaagcg 7380
ggggagaacu ucgcguaccu aguagccuac caagcuacgg ugugcgccag agccaaggcc 7440
ccucccccgu ccugggacgc cauguggaag ugccuggccc gacucaagcc uacgcuugcg 7500
ggccccacac cucuccugua ccguuugggc ccuauuacca augaggucac ccucacacac 7560
ccugggacga aguacaucgc cacaugcaug caagcugacc uugaggucau gaccagcacg 7620
uggguccuag cuggaggagu ccuggcagcc gucgccgcau auugccuggc gacuggaugc 7680
guuuccauca ucggccgcuu gcacgucaac cagcgagucg ucguugcgcc ggauaaggag 7740
guccuguaug aggcuuuuga ugagauggag gaaugcgccu cuagggcggc ucucaucgaa 7800
gaggggcagc ggauagccga gauguugaag uccaagaucc aaggcuugcu gcagcaggcc 7860
ucuaagcagg cccaggacau acaacccgcu augcaggcuu cauggcccaa aguggaacaa 7920
uuuugggcca gacacaugug gaacuucauu agcggcaucc aauaccucgc aggauuguca 7980
acacugccag ggaaccccgc gguggcuucc augauggcau ucagugccgc ccucaccagu 8040
ccguugucga ccaguaccac cauccuucuc aacaucaugg gaggcugguu agcgucccag 8100
aucgcaccac ccgcgggggc caccggcuuu gucgucagug gccugguggg ggcugccgug 8160
ggcagcauag gccuggguaa ggugcuggug gacauccugg caggauaugg ugcgggcauu 8220
ucgggggccc ucgucgcauu caagaucaug ucuggcgaga agcccucuau ggaagauguc 8280
aucaaucuac ugccugggau ccugucuccg ggagcccugg uggugggggu caucugcgcg 8340
gccauucugc gccgccacgu gggaccgggg gagggcgcgg uccaauggau gaacaggcuu 8400
auugccuuug cuuccagagg aaaccacguc gccccuacuc acuacgugac ggagucggau 8460
gcgucgcagc gugugaccca acuacuuggc ucucuuacua uaaccagccu acucagaaga 8520
cuccacaauu ggauaacuga ggacugcccc aucccaugcu ccggauccug gcuccgcgac 8580
gugugggacu ggguuugcac caucuugaca gacuucaaaa auuggcugac cucuaaauug 8640
uuccccaagc ugcccggccu ccccuucauc ucuugucaaa agggguacaa gggugugugg 8700
gccggcacug gcaucaugac cacgcgcugc ccuugcggcg ccaacaucuc uggcaauguc 8760
cgccugggcu cuaugaggau cacagggccu aaaaccugca ugaacaccug gcaggggacc 8820
uuuccuauca auugcuacac ggagggccag ugcgcgccga aaccccccac gaacuacaag 8880
accgccaucu ggaggguggc ggccucggag uacgcggagg ugacgcagca ugggucguac 8940
uccuauguaa caggacugac cacugacaau cugaaaauuc cuugccaacu accuucucca 9000
gaguuuuucu ccugggugga cggugugcag auccauaggu uugcacccac accaaagccg 9060
uuuuuccggg augaggucuc guucugcguu gggcuuaauu ccuaugcugu cgggucccag 9120
cuucccugug aaccugagcc cgacgcagac guauugaggu ccaugcuaac agauccgccc 9180
cacaucacgg cggagacugc ggcgcggcgc uuggcacggg gaucaccucc aucugaggcg 9240
agcuccucag ugagccagcu aucagcaccg ucgcugcggg ccaccugcac cacccacagc 9300
aacaccuaug acguggacau ggucgaugcc aaccugcuca uggagggcgg uguggcucag 9360
acagagccug aguccagggu gcccguucug gacuuucucg agccaauggc cgaggaagag 9420
agcgaccuug agcccucaau accaucggag ugcaugcucc ccaggagcgg guuuccacgg 9480
gccuuaccgg cuugggcacg gccugacuac aacccgccgc ucguggaauc guggaggagg 9540
ccagauuacc aaccgcccac cguugcuggu ugugcucucc ccccccccaa gaaggccccg 9600
acgccucccc caaggagacg ccggacagug ggucugagcg agagcaccau aucagaagcc 9660
cuccagcaac uggccaucaa gaccuuuggc cagccccccu cgagcgguga ugcaggcucg 9720
uccacggggg cgggcgccgc cgaauccggc gguccgacgu ccccugguga gccggccccc 9780
ucagagacag guuccgccuc cucuaugccc ccccucgagg gggagccugg agauccggac 9840
cuggagucug aucagguaga gcuucaaccu cccccccagg gggggggggu agcucccggu 9900
ucgggcucgg ggucuugguc uacuugcucc gaggaggacg auaccaccgu gugcugcucc 9960
augucauacu ccuggaccgg ggcucuaaua acucccugua gccccgaaga ggaaaaguug 10020
ccaaucaacc cuuugaguaa cucgcuguug cgauaccaua acaaggugua cuguacaaca 10080
ucaaagagcg ccucacagag ggcuaaaaag guaacuuuug acaggacgca agugcucgac 10140
gcccauuaug acucagucuu aaaggacauc aagcuagcgg cuuccaaggu cagcgcaagg 10200
cuccucaccu uggaggaggc gugccaguug acuccacccc auucugcaag auccaaguau 10260
ggauucgggg ccaaggaggu ccgcagcuug uccgggaggg ccguuaacca caucaagucc 10320
guguggaagg accuccugga agacccacaa acaccaauuc ccacaaccau cauggccaaa 10380
aaugaggugu ucugcgugga ccccgccaag ggggguaaga aaccagcucg ccucaucguu 10440
uacccugacc ucggcguccg ggucugcgag aaaauggccc ucuaugacau uacacaaaag 10500
cuuccucagg cgguaauggg agcuuccuau ggcuuccagu acuccccugc ccaacgggug 10560
gaguaucucu ugaaagcaug ggcggaaaag aaggacccca uggguuuuuc guaugauacc 10620
cgaugcuucg acucaaccgu cacugagaga gacaucagga ccgaggaguc cauauaccag 10680
gccugcuccc ugcccgagga ggcccgcacu gccauacacu cgcugacuga gagacuuuac 10740
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agcggggugc uaaccacuag cauggguaac accaucacau gcuaugugaa agcccuagcg 10860
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aucuuagccc uagucacggc uagcugugaa agguccguga gccgcaugac ugcagagagu 11940
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<210> 22
<211> 11969
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: replicon RNA derived from the expression vector rFGR-JFH1/Luc/GND
<400> 22
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cgcauggucc uaaugacaca cuucuucucc auucucaugg uccaagacac ccuggaccag 11280
aaccucaacu uugagaugua uggaucagua uacuccguga auccuuugga ccuuccagcc 11340
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cugacgcggg uggcuucagc ccucagaaaa cuuggggcgc caccccucag gguguggaag 11460
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gcgcgccuac uggacuuauc caguugguuc accgucggcg ccggcggggg cgacauuuuu 11640
cacagcgugu cgcgcgcccg accccgcuca uuacucuucg gccuacuccu acuuuucgua 11700
gggguaggcc ucuuccuacu ccccgcucgg uagagcggca cacacuaggu acacuccaua 11760
gcuaacuguu ccuuuuuuuu uuuuuuuuuu uuuuuuuuuu uuuuuuuuuu uuuuucuuuu 11820
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<211> 11036
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: replicon RNA derived from the expression vector rFGR-JFH1/EGFP
<400> 23
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cccccucccg ggagagccau aguggucugc ggaaccggug aguacaccgg aauugccggg 180
aagacugggu ccuuucuugg auaaacccac ucuaugcccg gccauuuggg cgugcccccg 240
caagacugcu agccgaguag cguuggguug cgaaaggccu ugugguacug ccugauaggg 300
cgcuugcgag ugccccggga ggucucguag accgugcacc augagcacaa auccuaaacc 360
ucaaagaaaa accaaaagaa acaccaaccg acgcguaaug gugagcaagg gcgaggagcu 420
guucaccggg guggugccca uccuggucga gcuggacggc gacguaaacg gccacaaguu 480
cagcgugucc ggcgagggcg agggcgaugc caccuacggc aagcugaccc ugaaguucau 540
cugcaccacc ggcaagcugc ccgugcccug gcccacccuc gugaccaccc ugaccuacgg 600
cgugcagugc uucagccgcu accccgacca caugaagcag cacgacuucu ucaaguccgc 660
caugcccgaa ggcuacgucc aggagcgcac caucuucuuc aaggacgacg gcaacuacaa 720
gacccgcgcc gaggugaagu ucgagggcga cacccuggug aaccgcaucg agcugaaggg 780
caucgacuuc aaggaggacg gcaacauccu ggggcacaag cuggaguaca acuacaacag 840
ccacaacguc uauaucaugg ccgacaagca gaagaacggc aucaagguga acuucaagau 900
ccgccacaac aucgaggacg gcagcgugca gcucgccgac cacuaccagc agaacacccc 960
caucggcgac ggccccgugc ugcugcccga caaccacuac cugagcaccc aguccgcccu 1020
gagcaaagac cccaacgaga agcgcgauca caugguccug cuggaguucg ugaccgccgc 1080
cgggaucacu cucggcaugg acgagcugua caaguaaguu uaaacccucu cccucccccc 1140
ccccuaacgu uacuggccga agccgcuugg aauaaggccg gugugcguuu gucuauaugu 1200
uauuuuccac cauauugccg ucuuuuggca augugagggc ccggaaaccu ggcccugucu 1260
ucuugacgag cauuccuagg ggucuuuccc cucucgccaa aggaaugcaa ggucuguuga 1320
augucgugaa ggaagcaguu ccucuggaag cuucuugaag acaaacaacg ucuguagcga 1380
cccuuugcag gcagcggaac cccccaccug gcgacaggug ccucugcggc caaaagccac 1440
guguauaaga uacaccugca aaggcggcac aaccccagug ccacguugug aguuggauag 1500
uuguggaaag agucaaaugg cucuccucaa gcguauucaa caaggggcug aaggaugccc 1560
agaagguacc ccauuguaug ggaucugauc uggggccucg gugcacaugc uuuacaugug 1620
uuuagucgag guuaaaaaaa cgucuaggcc ccccgaacca cggggacgug guuuuccuuu 1680
gaaaaacacg augauaccau gagcacaaau ccuaaaccuc aaagaaaaac caaaagaaac 1740
accaaccguc gcccagaaga cguuaaguuc ccgggcggcg gccagaucgu uggcggagua 1800
uacuuguugc cgcgcagggg ccccagguug ggugugcgca cgacaaggaa aacuucggag 1860
cggucccagc cacgugggag acgccagccc auccccaaag aucggcgcuc cacuggcaag 1920
gccuggggaa aaccaggucg ccccuggccc cuauauggga augagggacu cggcugggca 1980
ggauggcucc uguccccccg aggcucucgc cccuccuggg gccccacuga cccccggcau 2040
aggucgcgca acguggguaa agucaucgac acccuaacgu guggcuuugc cgaccucaug 2100
ggguacaucc ccgucguagg cgccccgcuu aguggcgccg ccagagcugu cgcgcacggc 2160
gugagagucc uggaggacgg gguuaauuau gcaacaggga accuacccgg uuuccccuuu 2220
ucuaucuucu ugcuggcccu guuguccugc aucaccguuc cggucucugc ugcccaggug 2280
aagaauacca guagcagcua cauggugacc aaugacugcu ccaaugacag caucacuugg 2340
cagcucgagg cugcgguucu ccacgucccc gggugcgucc cgugcgagag aguggggaau 2400
acgucacggu guugggugcc agucucgcca aacauggcug ugcggcagcc cggugcccuc 2460
acgcaggguc ugcggacgca caucgauaug guugugaugu ccgccaccuu cugcucugcu 2520
cucuacgugg gggaccucug uggcggggug augcucgcgg cccagguguu caucgucucg 2580
ccgcaguacc acugguuugu gcaagaaugc aauugcucca ucuacccugg caccaucacu 2640
ggacaccgca uggcauggga caugaugaug aacuggucgc ccacggccac caugauccug 2700
gcguacguga ugcgcguccc cgaggucauc auagacaucg uuagcggggc ucacuggggc 2760
gucauguucg gcuuggccua cuucucuaug cagggagcgu gggcgaaggu cauugucauc 2820
cuucugcugg ccgcuggggu ggacgcgggc accaccaccg uuggaggcgc uguugcacgu 2880
uccaccaacg ugauugccgg cguguucagc cauggcccuc agcagaacau ucagcucauu 2940
aacaccaacg gcaguuggca caucaaccgu acugccuuga auugcaauga cuccuugaac 3000
accggcuuuc ucgcggccuu guucuacacc aaccgcuuua acucgucagg guguccaggg 3060
cgccuguccg ccugccgcaa caucgaggcu uuccggauag gguggggcac ccuacaguac 3120
gaggauaaug ucaccaaucc agaggauaug aggccguacu gcuggcacua ccccccaaag 3180
ccguguggcg uaguccccgc gaggucugug uguggcccag uguacuguuu cacccccagc 3240
ccgguaguag ugggcacgac cgacagacgu ggagugccca ccuacacaug gggagagaau 3300
gagacagaug ucuuccuacu gaacagcacc cgaccgccgc agggcucaug guucggcugc 3360
acguggauga acuccacugg uuucaccaag acuuguggcg cgccaccuug ccgcaccaga 3420
gcugacuuca acgccagcac ggacuuguug ugcccuacgg auuguuuuag gaagcauccu 3480
gaugccacuu auauuaagug ugguucuggg cccuggcuca caccaaagug ccugguccac 3540
uacccuuaca gacucuggca uuaccccugc acagucaauu uuaccaucuu caagauaaga 3600
auguauguag gggggguuga gcacaggcuc acggccgcau gcaacuucac ucguggggau 3660
cgcugcgacu uggaggacag ggacaggagu cagcugucuc cucuguugca cucuaccacg 3720
gaaugggcca uccugcccug caccuacuca gacuuacccg cuuugucaac uggucuucuc 3780
caccuucacc agaacaucgu ggacguacaa uacauguaug gccucucacc ugcuaucaca 3840
aaauacgucg uucgauggga guggguggua cucuuauucc ugcucuuagc ggacgccaga 3900
gucugcgccu gcuuguggau gcucaucuug uugggccagg ccgaagcagc auuggagaag 3960
uuggucgucu ugcacgcugc gagugcggcu aacugccaug gccuccuaua uuuugccauc 4020
uucuucgugg cagcuuggca caucaggggu cggguggucc ccuugaccac cuauugccuc 4080
acuggccuau ggcccuucug ccuacugcuc auggcacugc cccggcaggc uuaugccuau 4140
gacgcaccug ugcacggaca gauaggcgug gguuuguuga uauugaucac ccucuucaca 4200
cucaccccgg gguauaagac ccuccucggc cagugucugu ggugguugug cuaucuccug 4260
acccuggggg aagccaugau ucaggagugg guaccaccca ugcaggugcg cggcggccgc 4320
gauggcaucg cgugggccgu cacuauauuc ugcccgggug ugguguuuga cauuaccaaa 4380
uggcuuuugg cguugcuugg gccugcuuac cucuuaaggg ccgcuuugac acaugugccg 4440
uacuucguca gagcucacgc ucugauaagg guaugcgcuu uggugaagca gcucgcgggg 4500
gguagguaug uucagguggc gcuauuggcc cuuggcaggu ggacuggcac cuacaucuau 4560
gaccaccuca caccuauguc ggacugggcc gcuagcggcc ugcgcgacuu agcggucgcc 4620
guggaaccca ucaucuucag uccgauggag aagaagguca ucgucugggg agcggagacg 4680
gcugcaugug gggacauucu acauggacuu cccguguccg cccgacucgg ccaggagauc 4740
cuccucggcc cagcugaugg cuacaccucc aaggggugga agcuccuugc ucccaucacu 4800
gcuuaugccc agcaaacacg aggccuccug ggcgccauag uggugaguau gacggggcgu 4860
gacaggacag aacaggccgg ggaaguccaa auccugucca cagucucuca guccuuccuc 4920
ggaacaacca ucucgggggu uuuguggacu guuuaccacg gagcuggcaa caagacucua 4980
gccggcuuac gggguccggu cacgcagaug uacucgagug cugaggggga cuugguaggc 5040
uggcccagcc ccccugggac caagucuuug gagccgugca aguguggagc cgucgaccua 5100
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agugacaaca gcacgccacc ggcugugccc cagaccuauc aggucgggua cuugcaugcu 5400
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acgguccuug aucaagcaga gacagccggg gucagacuaa cugugcuggc uacggccaca 5760
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ggugagaucc ccuucuaugg gagggcgauu ccccuauccu gcaucaaggg agggagacac 5880
cugauuuucu gccacucaaa gaaaaagugu gacgagcucg cggcggcccu ucggggcaug 5940
ggcuugaaug ccguggcaua cuauagaggg uuggacgucu ccauaauacc agcucaggga 6000
gauguggugg ucgucgccac cgacgcccuc augacggggu acacuggaga cuuugacucc 6060
gugaucgacu gcaauguagc ggucacccaa gcugucgacu ucagccugga ccccaccuuc 6120
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acagguagag gaagacaggg cacuuauagg uauguuucca cuggugaacg agccucagga 6240
auguuugaca guguagugcu uugugagugc uacgacgcag gggcugcgug guacgaucuc 6300
acaccagcgg agaccaccgu caggcuuaga gcguauuuca acacgcccgg ccuacccgug 6360
ugucaagacc aucuugaauu uugggaggca guuuucaccg gccucacaca cauagacgcc 6420
cacuuccucu cccaaacaaa gcaagcgggg gagaacuucg cguaccuagu agccuaccaa 6480
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cuggcccgac ucaagccuac gcuugcgggc cccacaccuc uccuguaccg uuugggcccu 6600
auuaccaaug aggucacccu cacacacccu gggacgaagu acaucgccac augcaugcaa 6660
gcugaccuug aggucaugac cagcacgugg guccuagcug gaggaguccu ggcagccguc 6720
gccgcauauu gccuggcgac uggaugcguu uccaucaucg gccgcuugca cgucaaccag 6780
cgagucgucg uugcgccgga uaaggagguc cuguaugagg cuuuugauga gauggaggaa 6840
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aagauccaag gcuugcugca gcaggccucu aagcaggccc aggacauaca acccgcuaug 6960
caggcuucau ggcccaaagu ggaacaauuu ugggccagac acauguggaa cuucauuagc 7020
ggcauccaau accucgcagg auugucaaca cugccaggga accccgcggu ggcuuccaug 7080
auggcauuca gugccgcccu caccaguccg uugucgacca guaccaccau ccuucucaac 7140
aucaugggag gcugguuagc gucccagauc gcaccacccg cgggggccac cggcuuuguc 7200
gucaguggcc uggugggggc ugccgugggc agcauaggcc uggguaaggu gcugguggac 7260
auccuggcag gauauggugc gggcauuucg ggggcccucg ucgcauucaa gaucaugucu 7320
ggcgagaagc ccucuaugga agaugucauc aaucuacugc cugggauccu gucuccggga 7380
gcccuggugg ugggggucau cugcgcggcc auucugcgcc gccacguggg accgggggag 7440
ggcgcggucc aauggaugaa caggcuuauu gccuuugcuu ccagaggaaa ccacgucgcc 7500
ccuacucacu acgugacgga gucggaugcg ucgcagcgug ugacccaacu acuuggcucu 7560
cuuacuauaa ccagccuacu cagaagacuc cacaauugga uaacugagga cugccccauc 7620
ccaugcuccg gauccuggcu ccgcgacgug ugggacuggg uuugcaccau cuugacagac 7680
uucaaaaauu ggcugaccuc uaaauuguuc cccaagcugc ccggccuccc cuucaucucu 7740
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accugcauga acaccuggca ggggaccuuu ccuaucaauu gcuacacgga gggccagugc 7920
gcgccgaaac cccccacgaa cuacaagacc gccaucugga ggguggcggc cucggaguac 7980
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cuuaauuccu augcugucgg gucccagcuu cccugugaac cugagcccga cgcagacgua 8220
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augcucccca ggagcggguu uccacgggcc uuaccggcuu gggcacggcc ugacuacaac 8580
ccgccgcucg uggaaucgug gaggaggcca gauuaccaac cgcccaccgu ugcugguugu 8640
gcucuccccc cccccaagaa ggccccgacg ccucccccaa ggagacgccg gacagugggu 8700
cugagcgaga gcaccauauc agaagcccuc cagcaacugg ccaucaagac cuuuggccag 8760
ccccccucga gcggugaugc aggcucgucc acgggggcgg gcgccgccga auccggcggu 8820
ccgacguccc cuggugagcc ggcccccuca gagacagguu ccgccuccuc uaugcccccc 8880
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ccccaggggg gggggguagc ucccgguucg ggcucggggu cuuggucuac uugcuccgag 9000
gaggacgaua ccaccgugug cugcuccaug ucauacuccu ggaccggggc ucuaauaacu 9060
cccuguagcc ccgaagagga aaaguugcca aucaacccuu ugaguaacuc gcuguugcga 9120
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acuuuugaca ggacgcaagu gcucgacgcc cauuaugacu cagucuuaaa ggacaucaag 9240
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gaccccaugg guuuuucgua ugauacccga ugcuucgacu caaccgucac ugagagagac 9720
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accugcgguu acagacguug ccgcgccagc ggggugcuaa ccacuagcau ggguaacacc 9900
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augcugguau gcggcgauga ccuaguaguc aucucagaaa gccaggggac ugaggaggac 10020
gagcggaacc ugagagccuu cacggaggcc augaccaggu acucugcccc uccuggugau 10080
ccccccagac cggaauauga ccuggagcua auaacauccu guuccucaaa ugugucugug 10140
gcguugggcc cgcggggccg ccgcagauac uaccugacca gagacccaac cacuccacuc 10200
gcccgggcug ccugggaaac aguuagacac uccccuauca auucauggcu gggaaacauc 10260
auccaguaug cuccaaccau auggguucgc augguccuaa ugacacacuu cuucuccauu 10320
cucauggucc aagacacccu ggaccagaac cucaacuuug agauguaugg aucaguauac 10380
uccgugaauc cuuuggaccu uccagccaua auugagaggu uacacgggcu ugacgccuuu 10440
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agcggcacac acuagguaca cuccauagcu aacuguuccu uuuuuuuuuu uuuuuuuuuu 10860
uuuuuuuuuu uuuuuuuuuu uucuuuuuuu uuuuuuuccc ucuuucuucc cuucucaucu 10920
uauucuacuu ucuuucuugg uggcuccauc uuagcccuag ucacggcuag cugugaaagg 10980
uccgugagcc gcaugacugc agagagugcc guaacugguc ucucugcaga ucaugu 11036
<210> 24
<211> 11036
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: replicon RNA derived from the expression vector rFGR-JFH1/EGFP/GND
<400> 24
accugccccu aauaggggcg acacuccgcc augaaucacu ccccugugag gaacuacugu 60
cuucacgcag aaagcgccua gccauggcgu uaguaugagu gucguacagc cuccaggccc 120
cccccucccg ggagagccau aguggucugc ggaaccggug aguacaccgg aauugccggg 180
aagacugggu ccuuucuugg auaaacccac ucuaugcccg gccauuuggg cgugcccccg 240
caagacugcu agccgaguag cguuggguug cgaaaggccu ugugguacug ccugauaggg 300
cgcuugcgag ugccccggga ggucucguag accgugcacc augagcacaa auccuaaacc 360
ucaaagaaaa accaaaagaa acaccaaccg acgcguaaug gugagcaagg gcgaggagcu 420
guucaccggg guggugccca uccuggucga gcuggacggc gacguaaacg gccacaaguu 480
cagcgugucc ggcgagggcg agggcgaugc caccuacggc aagcugaccc ugaaguucau 540
cugcaccacc ggcaagcugc ccgugcccug gcccacccuc gugaccaccc ugaccuacgg 600
cgugcagugc uucagccgcu accccgacca caugaagcag cacgacuucu ucaaguccgc 660
caugcccgaa ggcuacgucc aggagcgcac caucuucuuc aaggacgacg gcaacuacaa 720
gacccgcgcc gaggugaagu ucgagggcga cacccuggug aaccgcaucg agcugaaggg 780
caucgacuuc aaggaggacg gcaacauccu ggggcacaag cuggaguaca acuacaacag 840
ccacaacguc uauaucaugg ccgacaagca gaagaacggc aucaagguga acuucaagau 900
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caucggcgac ggccccgugc ugcugcccga caaccacuac cugagcaccc aguccgcccu 1020
gagcaaagac cccaacgaga agcgcgauca caugguccug cuggaguucg ugaccgccgc 1080
cgggaucacu cucggcaugg acgagcugua caaguaaguu uaaacccucu cccucccccc 1140
ccccuaacgu uacuggccga agccgcuugg aauaaggccg gugugcguuu gucuauaugu 1200
uauuuuccac cauauugccg ucuuuuggca augugagggc ccggaaaccu ggcccugucu 1260
ucuugacgag cauuccuagg ggucuuuccc cucucgccaa aggaaugcaa ggucuguuga 1320
augucgugaa ggaagcaguu ccucuggaag cuucuugaag acaaacaacg ucuguagcga 1380
cccuuugcag gcagcggaac cccccaccug gcgacaggug ccucugcggc caaaagccac 1440
guguauaaga uacaccugca aaggcggcac aaccccagug ccacguugug aguuggauag 1500
uuguggaaag agucaaaugg cucuccucaa gcguauucaa caaggggcug aaggaugccc 1560
agaagguacc ccauuguaug ggaucugauc uggggccucg gugcacaugc uuuacaugug 1620
uuuagucgag guuaaaaaaa cgucuaggcc ccccgaacca cggggacgug guuuuccuuu 1680
gaaaaacacg augauaccau gagcacaaau ccuaaaccuc aaagaaaaac caaaagaaac 1740
accaaccguc gcccagaaga cguuaaguuc ccgggcggcg gccagaucgu uggcggagua 1800
uacuuguugc cgcgcagggg ccccagguug ggugugcgca cgacaaggaa aacuucggag 1860
cggucccagc cacgugggag acgccagccc auccccaaag aucggcgcuc cacuggcaag 1920
gccuggggaa aaccaggucg ccccuggccc cuauauggga augagggacu cggcugggca 1980
ggauggcucc uguccccccg aggcucucgc cccuccuggg gccccacuga cccccggcau 2040
aggucgcgca acguggguaa agucaucgac acccuaacgu guggcuuugc cgaccucaug 2100
ggguacaucc ccgucguagg cgccccgcuu aguggcgccg ccagagcugu cgcgcacggc 2160
gugagagucc uggaggacgg gguuaauuau gcaacaggga accuacccgg uuuccccuuu 2220
ucuaucuucu ugcuggcccu guuguccugc aucaccguuc cggucucugc ugcccaggug 2280
aagaauacca guagcagcua cauggugacc aaugacugcu ccaaugacag caucacuugg 2340
cagcucgagg cugcgguucu ccacgucccc gggugcgucc cgugcgagag aguggggaau 2400
acgucacggu guugggugcc agucucgcca aacauggcug ugcggcagcc cggugcccuc 2460
acgcaggguc ugcggacgca caucgauaug guugugaugu ccgccaccuu cugcucugcu 2520
cucuacgugg gggaccucug uggcggggug augcucgcgg cccagguguu caucgucucg 2580
ccgcaguacc acugguuugu gcaagaaugc aauugcucca ucuacccugg caccaucacu 2640
ggacaccgca uggcauggga caugaugaug aacuggucgc ccacggccac caugauccug 2700
gcguacguga ugcgcguccc cgaggucauc auagacaucg uuagcggggc ucacuggggc 2760
gucauguucg gcuuggccua cuucucuaug cagggagcgu gggcgaaggu cauugucauc 2820
cuucugcugg ccgcuggggu ggacgcgggc accaccaccg uuggaggcgc uguugcacgu 2880
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aacaccaacg gcaguuggca caucaaccgu acugccuuga auugcaauga cuccuugaac 3000
accggcuuuc ucgcggccuu guucuacacc aaccgcuuua acucgucagg guguccaggg 3060
cgccuguccg ccugccgcaa caucgaggcu uuccggauag gguggggcac ccuacaguac 3120
gaggauaaug ucaccaaucc agaggauaug aggccguacu gcuggcacua ccccccaaag 3180
ccguguggcg uaguccccgc gaggucugug uguggcccag uguacuguuu cacccccagc 3240
ccgguaguag ugggcacgac cgacagacgu ggagugccca ccuacacaug gggagagaau 3300
gagacagaug ucuuccuacu gaacagcacc cgaccgccgc agggcucaug guucggcugc 3360
acguggauga acuccacugg uuucaccaag acuuguggcg cgccaccuug ccgcaccaga 3420
gcugacuuca acgccagcac ggacuuguug ugcccuacgg auuguuuuag gaagcauccu 3480
gaugccacuu auauuaagug ugguucuggg cccuggcuca caccaaagug ccugguccac 3540
uacccuuaca gacucuggca uuaccccugc acagucaauu uuaccaucuu caagauaaga 3600
auguauguag gggggguuga gcacaggcuc acggccgcau gcaacuucac ucguggggau 3660
cgcugcgacu uggaggacag ggacaggagu cagcugucuc cucuguugca cucuaccacg 3720
gaaugggcca uccugcccug caccuacuca gacuuacccg cuuugucaac uggucuucuc 3780
caccuucacc agaacaucgu ggacguacaa uacauguaug gccucucacc ugcuaucaca 3840
aaauacgucg uucgauggga guggguggua cucuuauucc ugcucuuagc ggacgccaga 3900
gucugcgccu gcuuguggau gcucaucuug uugggccagg ccgaagcagc auuggagaag 3960
uuggucgucu ugcacgcugc gagugcggcu aacugccaug gccuccuaua uuuugccauc 4020
uucuucgugg cagcuuggca caucaggggu cggguggucc ccuugaccac cuauugccuc 4080
acuggccuau ggcccuucug ccuacugcuc auggcacugc cccggcaggc uuaugccuau 4140
gacgcaccug ugcacggaca gauaggcgug gguuuguuga uauugaucac ccucuucaca 4200
cucaccccgg gguauaagac ccuccucggc cagugucugu ggugguugug cuaucuccug 4260
acccuggggg aagccaugau ucaggagugg guaccaccca ugcaggugcg cggcggccgc 4320
gauggcaucg cgugggccgu cacuauauuc ugcccgggug ugguguuuga cauuaccaaa 4380
uggcuuuugg cguugcuugg gccugcuuac cucuuaaggg ccgcuuugac acaugugccg 4440
uacuucguca gagcucacgc ucugauaagg guaugcgcuu uggugaagca gcucgcgggg 4500
gguagguaug uucagguggc gcuauuggcc cuuggcaggu ggacuggcac cuacaucuau 4560
gaccaccuca caccuauguc ggacugggcc gcuagcggcc ugcgcgacuu agcggucgcc 4620
guggaaccca ucaucuucag uccgauggag aagaagguca ucgucugggg agcggagacg 4680
gcugcaugug gggacauucu acauggacuu cccguguccg cccgacucgg ccaggagauc 4740
cuccucggcc cagcugaugg cuacaccucc aaggggugga agcuccuugc ucccaucacu 4800
gcuuaugccc agcaaacacg aggccuccug ggcgccauag uggugaguau gacggggcgu 4860
gacaggacag aacaggccgg ggaaguccaa auccugucca cagucucuca guccuuccuc 4920
ggaacaacca ucucgggggu uuuguggacu guuuaccacg gagcuggcaa caagacucua 4980
gccggcuuac gggguccggu cacgcagaug uacucgagug cugaggggga cuugguaggc 5040
uggcccagcc ccccugggac caagucuuug gagccgugca aguguggagc cgucgaccua 5100
uaucugguca cgcggaacgc ugaugucauc ccggcucgga gacgcgggga caagcgggga 5160
gcauugcucu ccccgagacc cauuucgacc uugaaggggu ccucgggggg gccggugcuc 5220
ugcccuaggg gccacgucgu ugggcucuuc cgagcagcug ugugcucucg gggcguggcc 5280
aaauccaucg auuucauccc cguugagaca cucgacguug uuacaagguc ucccacuuuc 5340
agugacaaca gcacgccacc ggcugugccc cagaccuauc aggucgggua cuugcaugcu 5400
ccaacuggca guggaaagag caccaagguc ccugucgcgu augccgccca gggguacaaa 5460
guacuagugc uuaaccccuc gguagcugcc acccuggggu uuggggcgua ccuauccaag 5520
gcacauggca ucaaucccaa cauuaggacu ggagucagga ccgugaugac cggggaggcc 5580
aucacguacu ccacauaugg caaauuucuc gccgaugggg gcugcgcuag cggcgccuau 5640
gacaucauca uaugcgauga augccacgcu guggaugcua ccuccauucu cggcaucgga 5700
acgguccuug aucaagcaga gacagccggg gucagacuaa cugugcuggc uacggccaca 5760
ccccccgggu cagugacaac cccccauccc gauauagaag agguaggccu cgggcgggag 5820
ggugagaucc ccuucuaugg gagggcgauu ccccuauccu gcaucaaggg agggagacac 5880
cugauuuucu gccacucaaa gaaaaagugu gacgagcucg cggcggcccu ucggggcaug 5940
ggcuugaaug ccguggcaua cuauagaggg uuggacgucu ccauaauacc agcucaggga 6000
gauguggugg ucgucgccac cgacgcccuc augacggggu acacuggaga cuuugacucc 6060
gugaucgacu gcaauguagc ggucacccaa gcugucgacu ucagccugga ccccaccuuc 6120
acuauaacca cacagacugu cccacaagac gcugucucac gcagucagcg ccgcgggcgc 6180
acagguagag gaagacaggg cacuuauagg uauguuucca cuggugaacg agccucagga 6240
auguuugaca guguagugcu uugugagugc uacgacgcag gggcugcgug guacgaucuc 6300
acaccagcgg agaccaccgu caggcuuaga gcguauuuca acacgcccgg ccuacccgug 6360
ugucaagacc aucuugaauu uugggaggca guuuucaccg gccucacaca cauagacgcc 6420
cacuuccucu cccaaacaaa gcaagcgggg gagaacuucg cguaccuagu agccuaccaa 6480
gcuacggugu gcgccagagc caaggccccu cccccguccu gggacgccau guggaagugc 6540
cuggcccgac ucaagccuac gcuugcgggc cccacaccuc uccuguaccg uuugggcccu 6600
auuaccaaug aggucacccu cacacacccu gggacgaagu acaucgccac augcaugcaa 6660
gcugaccuug aggucaugac cagcacgugg guccuagcug gaggaguccu ggcagccguc 6720
gccgcauauu gccuggcgac uggaugcguu uccaucaucg gccgcuugca cgucaaccag 6780
cgagucgucg uugcgccgga uaaggagguc cuguaugagg cuuuugauga gauggaggaa 6840
ugcgccucua gggcggcucu caucgaagag gggcagcgga uagccgagau guugaagucc 6900
aagauccaag gcuugcugca gcaggccucu aagcaggccc aggacauaca acccgcuaug 6960
caggcuucau ggcccaaagu ggaacaauuu ugggccagac acauguggaa cuucauuagc 7020
ggcauccaau accucgcagg auugucaaca cugccaggga accccgcggu ggcuuccaug 7080
auggcauuca gugccgcccu caccaguccg uugucgacca guaccaccau ccuucucaac 7140
aucaugggag gcugguuagc gucccagauc gcaccacccg cgggggccac cggcuuuguc 7200
gucaguggcc uggugggggc ugccgugggc agcauaggcc uggguaaggu gcugguggac 7260
auccuggcag gauauggugc gggcauuucg ggggcccucg ucgcauucaa gaucaugucu 7320
ggcgagaagc ccucuaugga agaugucauc aaucuacugc cugggauccu gucuccggga 7380
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ccuacucacu acgugacgga gucggaugcg ucgcagcgug ugacccaacu acuuggcucu 7560
cuuacuauaa ccagccuacu cagaagacuc cacaauugga uaacugagga cugccccauc 7620
ccaugcuccg gauccuggcu ccgcgacgug ugggacuggg uuugcaccau cuugacagac 7680
uucaaaaauu ggcugaccuc uaaauuguuc cccaagcugc ccggccuccc cuucaucucu 7740
ugucaaaagg gguacaaggg ugugugggcc ggcacuggca ucaugaccac gcgcugcccu 7800
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accugcauga acaccuggca ggggaccuuu ccuaucaauu gcuacacgga gggccagugc 7920
gcgccgaaac cccccacgaa cuacaagacc gccaucugga ggguggcggc cucggaguac 7980
gcggagguga cgcagcaugg gucguacucc uauguaacag gacugaccac ugacaaucug 8040
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cuuaauuccu augcugucgg gucccagcuu cccugugaac cugagcccga cgcagacgua 8220
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cugcucaugg agggcggugu ggcucagaca gagccugagu ccagggugcc cguucuggac 8460
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augcucccca ggagcggguu uccacgggcc uuaccggcuu gggcacggcc ugacuacaac 8580
ccgccgcucg uggaaucgug gaggaggcca gauuaccaac cgcccaccgu ugcugguugu 8640
gcucuccccc cccccaagaa ggccccgacg ccucccccaa ggagacgccg gacagugggu 8700
cugagcgaga gcaccauauc agaagcccuc cagcaacugg ccaucaagac cuuuggccag 8760
ccccccucga gcggugaugc aggcucgucc acgggggcgg gcgccgccga auccggcggu 8820
ccgacguccc cuggugagcc ggcccccuca gagacagguu ccgccuccuc uaugcccccc 8880
cucgaggggg agccuggaga uccggaccug gagucugauc agguagagcu ucaaccuccc 8940
ccccaggggg gggggguagc ucccgguucg ggcucggggu cuuggucuac uugcuccgag 9000
gaggacgaua ccaccgugug cugcuccaug ucauacuccu ggaccggggc ucuaauaacu 9060
cccuguagcc ccgaagagga aaaguugcca aucaacccuu ugaguaacuc gcuguugcga 9120
uaccauaaca agguguacug uacaacauca aagagcgccu cacagagggc uaaaaaggua 9180
acuuuugaca ggacgcaagu gcucgacgcc cauuaugacu cagucuuaaa ggacaucaag 9240
cuagcggcuu ccaaggucag cgcaaggcuc cucaccuugg aggaggcgug ccaguugacu 9300
ccaccccauu cugcaagauc caaguaugga uucggggcca aggagguccg cagcuugucc 9360
gggagggccg uuaaccacau caaguccgug uggaaggacc uccuggaaga cccacaaaca 9420
ccaauuccca caaccaucau ggccaaaaau gagguguucu gcguggaccc cgccaagggg 9480
gguaagaaac cagcucgccu caucguuuac ccugaccucg gcguccgggu cugcgagaaa 9540
auggcccucu augacauuac acaaaagcuu ccucaggcgg uaaugggagc uuccuauggc 9600
uuccaguacu ccccugccca acggguggag uaucucuuga aagcaugggc ggaaaagaag 9660
gaccccaugg guuuuucgua ugauacccga ugcuucgacu caaccgucac ugagagagac 9720
aucaggaccg aggaguccau auaccaggcc ugcucccugc ccgaggaggc ccgcacugcc 9780
auacacucgc ugacugagag acuuuacgua ggagggccca uguucaacag caagggucaa 9840
accugcgguu acagacguug ccgcgccagc ggggugcuaa ccacuagcau ggguaacacc 9900
aucacaugcu augugaaagc ccuagcggcc ugcaaggcug cggggauagu ugcgcccaca 9960
augcugguau gcggcaauga ccuaguaguc aucucagaaa gccaggggac ugaggaggac 10020
gagcggaacc ugagagccuu cacggaggcc augaccaggu acucugcccc uccuggugau 10080
ccccccagac cggaauauga ccuggagcua auaacauccu guuccucaaa ugugucugug 10140
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gcccgggcug ccugggaaac aguuagacac uccccuauca auucauggcu gggaaacauc 10260
auccaguaug cuccaaccau auggguucgc augguccuaa ugacacacuu cuucuccauu 10320
cucauggucc aagacacccu ggaccagaac cucaacuuug agauguaugg aucaguauac 10380
uccgugaauc cuuuggaccu uccagccaua auugagaggu uacacgggcu ugacgccuuu 10440
ucuaugcaca cauacucuca ccacgaacug acgcgggugg cuucagcccu cagaaaacuu 10500
ggggcgccac cccucagggu guggaagagu cgggcucgcg cagucagggc gucccucauc 10560
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gucggcgccg gcgggggcga cauuuuucac agcgugucgc gcgcccgacc ccgcucauua 10740
cucuucggcc uacuccuacu uuucguaggg guaggccucu uccuacuccc cgcucgguag 10800
agcggcacac acuagguaca cuccauagcu aacuguuccu uuuuuuuuuu uuuuuuuuuu 10860
uuuuuuuuuu uuuuuuuuuu uucuuuuuuu uuuuuuuccc ucuuucuucc cuucucaucu 10920
uauucuacuu ucuuucuugg uggcuccauc uuagcccuag ucacggcuag cugugaaagg 10980
uccgugagcc gcaugacugc agagagugcc guaacugguc ucucugcaga ucaugu 11036
<210> 25
<211> 11876
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: replicon RNA derived from the expression vector rFGR-JFH1/SEAP
<400> 25
accugccccu aauaggggcg acacuccgcc augaaucacu ccccugugag gaacuacugu 60
cuucacgcag aaagcgccua gccauggcgu uaguaugagu gucguacagc cuccaggccc 120
cccccucccg ggagagccau aguggucugc ggaaccggug aguacaccgg aauugccggg 180
aagacugggu ccuuucuugg auaaacccac ucuaugcccg gccauuuggg cgugcccccg 240
caagacugcu agccgaguag cguuggguug cgaaaggccu ugugguacug ccugauaggg 300
cgcuugcgag ugccccggga ggucucguag accgugcacc augagcacaa auccuaaacc 360
ucaaagaaaa accaaaagaa acaccaaccg acgcguaaug cugcugcugc ugcugcugcu 420
gggccugagg cuacagcucu cccugggcau caucccaguu gaggaggaga acccggacuu 480
cuggaaccgc gaggcagccg aggcccuggg ugccgccaag aagcugcagc cugcacagac 540
agccgccaag aaccucauca ucuuccuggg cgaugggaug ggggugucua cggugacagc 600
ugccaggauc cuaaaagggc agaagaagga caaacugggg ccugagauac cccuggccau 660
ggaccgcuuc ccauaugugg cucuguccaa gacauacaau guagacaaac augugccaga 720
caguggagcc acagccacgg ccuaccugug cggggucaag ggcaacuucc agaccauugg 780
cuugagugca gccgcccgcu uuaaccagug caacacgaca cgcggcaacg aggucaucuc 840
cgugaugaau cgggccaaga aagcagggaa gucaguggga gugguaacca ccacacgagu 900
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cuccaacaug gacauugacg ugauccuagg uggaggccga aaguacaugu uucgcauggg 1080
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ccuauacgga aacgguccag gcuaugugcu caaggacggc gcccggccgg auguuaccga 1680
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ccccuaacgu uacuggccga agccgcuugg aauaaggccg gugugcguuu gucuauaugu 2040
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ggacaccgca uggcauggga caugaugaug aacuggucgc ccacggccac caugauccug 3540
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gaggauaaug ucaccaaucc agaggauaug aggccguacu gcuggcacua ccccccaaag 4020
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acccuggggg aagccaugau ucaggagugg guaccaccca ugcaggugcg cggcggccgc 5160
gauggcaucg cgugggccgu cacuauauuc ugcccgggug ugguguuuga cauuaccaaa 5220
uggcuuuugg cguugcuugg gccugcuuac cucuuaaggg ccgcuuugac acaugugccg 5280
uacuucguca gagcucacgc ucugauaagg guaugcgcuu uggugaagca gcucgcgggg 5340
gguagguaug uucagguggc gcuauuggcc cuuggcaggu ggacuggcac cuacaucuau 5400
gaccaccuca caccuauguc ggacugggcc gcuagcggcc ugcgcgacuu agcggucgcc 5460
guggaaccca ucaucuucag uccgauggag aagaagguca ucgucugggg agcggagacg 5520
gcugcaugug gggacauucu acauggacuu cccguguccg cccgacucgg ccaggagauc 5580
cuccucggcc cagcugaugg cuacaccucc aaggggugga agcuccuugc ucccaucacu 5640
gcuuaugccc agcaaacacg aggccuccug ggcgccauag uggugaguau gacggggcgu 5700
gacaggacag aacaggccgg ggaaguccaa auccugucca cagucucuca guccuuccuc 5760
ggaacaacca ucucgggggu uuuguggacu guuuaccacg gagcuggcaa caagacucua 5820
gccggcuuac gggguccggu cacgcagaug uacucgagug cugaggggga cuugguaggc 5880
uggcccagcc ccccugggac caagucuuug gagccgugca aguguggagc cgucgaccua 5940
uaucugguca cgcggaacgc ugaugucauc ccggcucgga gacgcgggga caagcgggga 6000
gcauugcucu ccccgagacc cauuucgacc uugaaggggu ccucgggggg gccggugcuc 6060
ugcccuaggg gccacgucgu ugggcucuuc cgagcagcug ugugcucucg gggcguggcc 6120
aaauccaucg auuucauccc cguugagaca cucgacguug uuacaagguc ucccacuuuc 6180
agugacaaca gcacgccacc ggcugugccc cagaccuauc aggucgggua cuugcaugcu 6240
ccaacuggca guggaaagag caccaagguc ccugucgcgu augccgccca gggguacaaa 6300
guacuagugc uuaaccccuc gguagcugcc acccuggggu uuggggcgua ccuauccaag 6360
gcacauggca ucaaucccaa cauuaggacu ggagucagga ccgugaugac cggggaggcc 6420
aucacguacu ccacauaugg caaauuucuc gccgaugggg gcugcgcuag cggcgccuau 6480
gacaucauca uaugcgauga augccacgcu guggaugcua ccuccauucu cggcaucgga 6540
acgguccuug aucaagcaga gacagccggg gucagacuaa cugugcuggc uacggccaca 6600
ccccccgggu cagugacaac cccccauccc gauauagaag agguaggccu cgggcgggag 6660
ggugagaucc ccuucuaugg gagggcgauu ccccuauccu gcaucaaggg agggagacac 6720
cugauuuucu gccacucaaa gaaaaagugu gacgagcucg cggcggcccu ucggggcaug 6780
ggcuugaaug ccguggcaua cuauagaggg uuggacgucu ccauaauacc agcucaggga 6840
gauguggugg ucgucgccac cgacgcccuc augacggggu acacuggaga cuuugacucc 6900
gugaucgacu gcaauguagc ggucacccaa gcugucgacu ucagccugga ccccaccuuc 6960
acuauaacca cacagacugu cccacaagac gcugucucac gcagucagcg ccgcgggcgc 7020
acagguagag gaagacaggg cacuuauagg uauguuucca cuggugaacg agccucagga 7080
auguuugaca guguagugcu uugugagugc uacgacgcag gggcugcgug guacgaucuc 7140
acaccagcgg agaccaccgu caggcuuaga gcguauuuca acacgcccgg ccuacccgug 7200
ugucaagacc aucuugaauu uugggaggca guuuucaccg gccucacaca cauagacgcc 7260
cacuuccucu cccaaacaaa gcaagcgggg gagaacuucg cguaccuagu agccuaccaa 7320
gcuacggugu gcgccagagc caaggccccu cccccguccu gggacgccau guggaagugc 7380
cuggcccgac ucaagccuac gcuugcgggc cccacaccuc uccuguaccg uuugggcccu 7440
auuaccaaug aggucacccu cacacacccu gggacgaagu acaucgccac augcaugcaa 7500
gcugaccuug aggucaugac cagcacgugg guccuagcug gaggaguccu ggcagccguc 7560
gccgcauauu gccuggcgac uggaugcguu uccaucaucg gccgcuugca cgucaaccag 7620
cgagucgucg uugcgccgga uaaggagguc cuguaugagg cuuuugauga gauggaggaa 7680
ugcgccucua gggcggcucu caucgaagag gggcagcgga uagccgagau guugaagucc 7740
aagauccaag gcuugcugca gcaggccucu aagcaggccc aggacauaca acccgcuaug 7800
caggcuucau ggcccaaagu ggaacaauuu ugggccagac acauguggaa cuucauuagc 7860
ggcauccaau accucgcagg auugucaaca cugccaggga accccgcggu ggcuuccaug 7920
auggcauuca gugccgcccu caccaguccg uugucgacca guaccaccau ccuucucaac 7980
aucaugggag gcugguuagc gucccagauc gcaccacccg cgggggccac cggcuuuguc 8040
gucaguggcc uggugggggc ugccgugggc agcauaggcc uggguaaggu gcugguggac 8100
auccuggcag gauauggugc gggcauuucg ggggcccucg ucgcauucaa gaucaugucu 8160
ggcgagaagc ccucuaugga agaugucauc aaucuacugc cugggauccu gucuccggga 8220
gcccuggugg ugggggucau cugcgcggcc auucugcgcc gccacguggg accgggggag 8280
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ccuacucacu acgugacgga gucggaugcg ucgcagcgug ugacccaacu acuuggcucu 8400
cuuacuauaa ccagccuacu cagaagacuc cacaauugga uaacugagga cugccccauc 8460
ccaugcuccg gauccuggcu ccgcgacgug ugggacuggg uuugcaccau cuugacagac 8520
uucaaaaauu ggcugaccuc uaaauuguuc cccaagcugc ccggccuccc cuucaucucu 8580
ugucaaaagg gguacaaggg ugugugggcc ggcacuggca ucaugaccac gcgcugcccu 8640
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accugcauga acaccuggca ggggaccuuu ccuaucaauu gcuacacgga gggccagugc 8760
gcgccgaaac cccccacgaa cuacaagacc gccaucugga ggguggcggc cucggaguac 8820
gcggagguga cgcagcaugg gucguacucc uauguaacag gacugaccac ugacaaucug 8880
aaaauuccuu gccaacuacc uucuccagag uuuuucuccu ggguggacgg ugugcagauc 8940
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cuuaauuccu augcugucgg gucccagcuu cccugugaac cugagcccga cgcagacgua 9060
uugaggucca ugcuaacaga uccgccccac aucacggcgg agacugcggc gcggcgcuug 9120
gcacggggau caccuccauc ugaggcgagc uccucaguga gccagcuauc agcaccgucg 9180
cugcgggcca ccugcaccac ccacagcaac accuaugacg uggacauggu cgaugccaac 9240
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uuucucgagc caauggccga ggaagagagc gaccuugagc ccucaauacc aucggagugc 9360
augcucccca ggagcggguu uccacgggcc uuaccggcuu gggcacggcc ugacuacaac 9420
ccgccgcucg uggaaucgug gaggaggcca gauuaccaac cgcccaccgu ugcugguugu 9480
gcucuccccc cccccaagaa ggccccgacg ccucccccaa ggagacgccg gacagugggu 9540
cugagcgaga gcaccauauc agaagcccuc cagcaacugg ccaucaagac cuuuggccag 9600
ccccccucga gcggugaugc aggcucgucc acgggggcgg gcgccgccga auccggcggu 9660
ccgacguccc cuggugagcc ggcccccuca gagacagguu ccgccuccuc uaugcccccc 9720
cucgaggggg agccuggaga uccggaccug gagucugauc agguagagcu ucaaccuccc 9780
ccccaggggg gggggguagc ucccgguucg ggcucggggu cuuggucuac uugcuccgag 9840
gaggacgaua ccaccgugug cugcuccaug ucauacuccu ggaccggggc ucuaauaacu 9900
cccuguagcc ccgaagagga aaaguugcca aucaacccuu ugaguaacuc gcuguugcga 9960
uaccauaaca agguguacug uacaacauca aagagcgccu cacagagggc uaaaaaggua 10020
acuuuugaca ggacgcaagu gcucgacgcc cauuaugacu cagucuuaaa ggacaucaag 10080
cuagcggcuu ccaaggucag cgcaaggcuc cucaccuugg aggaggcgug ccaguugacu 10140
ccaccccauu cugcaagauc caaguaugga uucggggcca aggagguccg cagcuugucc 10200
gggagggccg uuaaccacau caaguccgug uggaaggacc uccuggaaga cccacaaaca 10260
ccaauuccca caaccaucau ggccaaaaau gagguguucu gcguggaccc cgccaagggg 10320
gguaagaaac cagcucgccu caucguuuac ccugaccucg gcguccgggu cugcgagaaa 10380
auggcccucu augacauuac acaaaagcuu ccucaggcgg uaaugggagc uuccuauggc 10440
uuccaguacu ccccugccca acggguggag uaucucuuga aagcaugggc ggaaaagaag 10500
gaccccaugg guuuuucgua ugauacccga ugcuucgacu caaccgucac ugagagagac 10560
aucaggaccg aggaguccau auaccaggcc ugcucccugc ccgaggaggc ccgcacugcc 10620
auacacucgc ugacugagag acuuuacgua ggagggccca uguucaacag caagggucaa 10680
accugcgguu acagacguug ccgcgccagc ggggugcuaa ccacuagcau ggguaacacc 10740
aucacaugcu augugaaagc ccuagcggcc ugcaaggcug cggggauagu ugcgcccaca 10800
augcugguau gcggcgauga ccuaguaguc aucucagaaa gccaggggac ugaggaggac 10860
gagcggaacc ugagagccuu cacggaggcc augaccaggu acucugcccc uccuggugau 10920
ccccccagac cggaauauga ccuggagcua auaacauccu guuccucaaa ugugucugug 10980
gcguugggcc cgcggggccg ccgcagauac uaccugacca gagacccaac cacuccacuc 11040
gcccgggcug ccugggaaac aguuagacac uccccuauca auucauggcu gggaaacauc 11100
auccaguaug cuccaaccau auggguucgc augguccuaa ugacacacuu cuucuccauu 11160
cucauggucc aagacacccu ggaccagaac cucaacuuug agauguaugg aucaguauac 11220
uccgugaauc cuuuggaccu uccagccaua auugagaggu uacacgggcu ugacgccuuu 11280
ucuaugcaca cauacucuca ccacgaacug acgcgggugg cuucagcccu cagaaaacuu 11340
ggggcgccac cccucagggu guggaagagu cgggcucgcg cagucagggc gucccucauc 11400
ucccguggag ggaaagcggc cguuugcggc cgauaucucu ucaauugggc ggugaagacc 11460
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gucggcgccg gcgggggcga cauuuuucac agcgugucgc gcgcccgacc ccgcucauua 11580
cucuucggcc uacuccuacu uuucguaggg guaggccucu uccuacuccc cgcucgguag 11640
agcggcacac acuagguaca cuccauagcu aacuguuccu uuuuuuuuuu uuuuuuuuuu 11700
uuuuuuuuuu uuuuuuuuuu uucuuuuuuu uuuuuuuccc ucuuucuucc cuucucaucu 11760
uauucuacuu ucuuucuugg uggcuccauc uuagcccuag ucacggcuag cugugaaagg 11820
uccgugagcc gcaugacugc agagagugcc guaacugguc ucucugcaga ucaugu 11876
<210> 26
<211> 11876
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: replicon RNA derived from the expression vector rFGR-JFH1/SEAP/GND
<400> 26
accugccccu aauaggggcg acacuccgcc augaaucacu ccccugugag gaacuacugu 60
cuucacgcag aaagcgccua gccauggcgu uaguaugagu gucguacagc cuccaggccc 120
cccccucccg ggagagccau aguggucugc ggaaccggug aguacaccgg aauugccggg 180
aagacugggu ccuuucuugg auaaacccac ucuaugcccg gccauuuggg cgugcccccg 240
caagacugcu agccgaguag cguuggguug cgaaaggccu ugugguacug ccugauaggg 300
cgcuugcgag ugccccggga ggucucguag accgugcacc augagcacaa auccuaaacc 360
ucaaagaaaa accaaaagaa acaccaaccg acgcguaaug cugcugcugc ugcugcugcu 420
gggccugagg cuacagcucu cccugggcau caucccaguu gaggaggaga acccggacuu 480
cuggaaccgc gaggcagccg aggcccuggg ugccgccaag aagcugcagc cugcacagac 540
agccgccaag aaccucauca ucuuccuggg cgaugggaug ggggugucua cggugacagc 600
ugccaggauc cuaaaagggc agaagaagga caaacugggg ccugagauac cccuggccau 660
ggaccgcuuc ccauaugugg cucuguccaa gacauacaau guagacaaac augugccaga 720
caguggagcc acagccacgg ccuaccugug cggggucaag ggcaacuucc agaccauugg 780
cuugagugca gccgcccgcu uuaaccagug caacacgaca cgcggcaacg aggucaucuc 840
cgugaugaau cgggccaaga aagcagggaa gucaguggga gugguaacca ccacacgagu 900
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cgccgacgug ccugccucgg cccgccagga ggggugccag gacaucgcua cgcagcucau 1020
cuccaacaug gacauugacg ugauccuagg uggaggccga aaguacaugu uucgcauggg 1080
aaccccagac ccugaguacc cagaugacua cagccaaggu gggaccaggc uggacgggaa 1140
gaaucuggug caggaauggc uggcgaagcg ccagggugcc cgguaugugu ggaaccgcac 1200
ugagcucaug caggcuuccc uggacccguc ugugacccau cucauggguc ucuuugagcc 1260
uggagacaug aaauacgaga uccaccgaga cuccacacug gaccccuccc ugauggagau 1320
gacagaggcu gcccugcgcc ugcugagcag gaacccccgc ggcuucuucc ucuucgugga 1380
ggguggucgc aucgaccaug gucaucauga aagcagggcu uaccgggcac ugacugagac 1440
gaucauguuc gacgacgcca uugagagggc gggccagcuc accagcgagg aggacacgcu 1500
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cucuacgugg gggaccucug uggcggggug augcucgcgg cccagguguu caucgucucg 3420
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gcguacguga ugcgcguccc cgaggucauc auagacaucg uuagcggggc ucacuggggc 3600
gucauguucg gcuuggccua cuucucuaug cagggagcgu gggcgaaggu cauugucauc 3660
cuucugcugg ccgcuggggu ggacgcgggc accaccaccg uuggaggcgc uguugcacgu 3720
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aacaccaacg gcaguuggca caucaaccgu acugccuuga auugcaauga cuccuugaac 3840
accggcuuuc ucgcggccuu guucuacacc aaccgcuuua acucgucagg guguccaggg 3900
cgccuguccg ccugccgcaa caucgaggcu uuccggauag gguggggcac ccuacaguac 3960
gaggauaaug ucaccaaucc agaggauaug aggccguacu gcuggcacua ccccccaaag 4020
ccguguggcg uaguccccgc gaggucugug uguggcccag uguacuguuu cacccccagc 4080
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ccccccgggu cagugacaac cccccauccc gauauagaag agguaggccu cgggcgggag 6660
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gccgcauauu gccuggcgac uggaugcguu uccaucaucg gccgcuugca cgucaaccag 7620
cgagucgucg uugcgccgga uaaggagguc cuguaugagg cuuuugauga gauggaggaa 7680
ugcgccucua gggcggcucu caucgaagag gggcagcgga uagccgagau guugaagucc 7740
aagauccaag gcuugcugca gcaggccucu aagcaggccc aggacauaca acccgcuaug 7800
caggcuucau ggcccaaagu ggaacaauuu ugggccagac acauguggaa cuucauuagc 7860
ggcauccaau accucgcagg auugucaaca cugccaggga accccgcggu ggcuuccaug 7920
auggcauuca gugccgcccu caccaguccg uugucgacca guaccaccau ccuucucaac 7980
aucaugggag gcugguuagc gucccagauc gcaccacccg cgggggccac cggcuuuguc 8040
gucaguggcc uggugggggc ugccgugggc agcauaggcc uggguaaggu gcugguggac 8100
auccuggcag gauauggugc gggcauuucg ggggcccucg ucgcauucaa gaucaugucu 8160
ggcgagaagc ccucuaugga agaugucauc aaucuacugc cugggauccu gucuccggga 8220
gcccuggugg ugggggucau cugcgcggcc auucugcgcc gccacguggg accgggggag 8280
ggcgcggucc aauggaugaa caggcuuauu gccuuugcuu ccagaggaaa ccacgucgcc 8340
ccuacucacu acgugacgga gucggaugcg ucgcagcgug ugacccaacu acuuggcucu 8400
cuuacuauaa ccagccuacu cagaagacuc cacaauugga uaacugagga cugccccauc 8460
ccaugcuccg gauccuggcu ccgcgacgug ugggacuggg uuugcaccau cuugacagac 8520
uucaaaaauu ggcugaccuc uaaauuguuc cccaagcugc ccggccuccc cuucaucucu 8580
ugucaaaagg gguacaaggg ugugugggcc ggcacuggca ucaugaccac gcgcugcccu 8640
ugcggcgcca acaucucugg caauguccgc cugggcucua ugaggaucac agggccuaaa 8700
accugcauga acaccuggca ggggaccuuu ccuaucaauu gcuacacgga gggccagugc 8760
gcgccgaaac cccccacgaa cuacaagacc gccaucugga ggguggcggc cucggaguac 8820
gcggagguga cgcagcaugg gucguacucc uauguaacag gacugaccac ugacaaucug 8880
aaaauuccuu gccaacuacc uucuccagag uuuuucuccu ggguggacgg ugugcagauc 8940
cauagguuug cacccacacc aaagccguuu uuccgggaug aggucucguu cugcguuggg 9000
cuuaauuccu augcugucgg gucccagcuu cccugugaac cugagcccga cgcagacgua 9060
uugaggucca ugcuaacaga uccgccccac aucacggcgg agacugcggc gcggcgcuug 9120
gcacggggau caccuccauc ugaggcgagc uccucaguga gccagcuauc agcaccgucg 9180
cugcgggcca ccugcaccac ccacagcaac accuaugacg uggacauggu cgaugccaac 9240
cugcucaugg agggcggugu ggcucagaca gagccugagu ccagggugcc cguucuggac 9300
uuucucgagc caauggccga ggaagagagc gaccuugagc ccucaauacc aucggagugc 9360
augcucccca ggagcggguu uccacgggcc uuaccggcuu gggcacggcc ugacuacaac 9420
ccgccgcucg uggaaucgug gaggaggcca gauuaccaac cgcccaccgu ugcugguugu 9480
gcucuccccc cccccaagaa ggccccgacg ccucccccaa ggagacgccg gacagugggu 9540
cugagcgaga gcaccauauc agaagcccuc cagcaacugg ccaucaagac cuuuggccag 9600
ccccccucga gcggugaugc aggcucgucc acgggggcgg gcgccgccga auccggcggu 9660
ccgacguccc cuggugagcc ggcccccuca gagacagguu ccgccuccuc uaugcccccc 9720
cucgaggggg agccuggaga uccggaccug gagucugauc agguagagcu ucaaccuccc 9780
ccccaggggg gggggguagc ucccgguucg ggcucggggu cuuggucuac uugcuccgag 9840
gaggacgaua ccaccgugug cugcuccaug ucauacuccu ggaccggggc ucuaauaacu 9900
cccuguagcc ccgaagagga aaaguugcca aucaacccuu ugaguaacuc gcuguugcga 9960
uaccauaaca agguguacug uacaacauca aagagcgccu cacagagggc uaaaaaggua 10020
acuuuugaca ggacgcaagu gcucgacgcc cauuaugacu cagucuuaaa ggacaucaag 10080
cuagcggcuu ccaaggucag cgcaaggcuc cucaccuugg aggaggcgug ccaguugacu 10140
ccaccccauu cugcaagauc caaguaugga uucggggcca aggagguccg cagcuugucc 10200
gggagggccg uuaaccacau caaguccgug uggaaggacc uccuggaaga cccacaaaca 10260
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gaccccaugg guuuuucgua ugauacccga ugcuucgacu caaccgucac ugagagagac 10560
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gagcggaacc ugagagccuu cacggaggcc augaccaggu acucugcccc uccuggugau 10920
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gcccgggcug ccugggaaac aguuagacac uccccuauca auucauggcu gggaaacauc 11100
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cucauggucc aagacacccu ggaccagaac cucaacuuug agauguaugg aucaguauac 11220
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ucccguggag ggaaagcggc cguuugcggc cgauaucucu ucaauugggc ggugaagacc 11460
aagcucaaac ucacuccauu gccggaggcg cgccuacugg acuuauccag uugguucacc 11520
gucggcgccg gcgggggcga cauuuuucac agcgugucgc gcgcccgacc ccgcucauua 11580
cucuucggcc uacuccuacu uuucguaggg guaggccucu uccuacuccc cgcucgguag 11640
agcggcacac acuagguaca cuccauagcu aacuguuccu uuuuuuuuuu uuuuuuuuuu 11700
uuuuuuuuuu uuuuuuuuuu uucuuuuuuu uuuuuuuccc ucuuucuucc cuucucaucu 11760
uauucuacuu ucuuucuugg uggcuccauc uuagcccuag ucacggcuag cugugaaagg 11820
uccgugagcc gcaugacugc agagagugcc guaacugguc ucucugcaga ucaugu 11876
Claims (26)
- 유전자형2a의 C형간염 바이러스의 게놈 RNA의 5'비번역영역, 코어(core) 단백질 단백질 코드 서열, E1 단백질 코드 서열, E2 단백질 코드 서열, NS2 단백질 코드 서열, NS3 단백질 코드 서열, NS4A 단백질 코드 서열, NS4B 단백질 코드 서열, NS5A 단백질 코드 서열, NS5B 단백질 코드 서열, 및 3'비번역영역과, 1개이상의 선택 마커 유전자 및/또는 1개이상의 리포터 유전자와, 1개이상의 IRES 서열을 포함하는 염기서열로 이루어지는 것을 특징으로 하는 레플리콘 RNA.
- 제1항에 있어서, 상기 염기서열이 상기의 5'비번역영역, 1개이상의 선택 마커 유전자 및/또는 1개이상의 리포터 유전자, 1개이상의 IRES 서열, 코어 단백질 코드 서열, E1 단백질 코드 서열, E2 단백질 코드 서열, NS2 단백질 코드 서열, NS3 단백질 코드 서열, NS4A 단백질 코드 서열, NS4B 단백질 코드 서열, NS5A 단백질 코드 서열, NS5B 단백질 코드 서열, 및 3'비번역영역을 5'에서 3'방향으로 이 순서로 함유하는 것을 특징으로 하는 레플리콘 RNA.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 유전자형2a의 C형간염 바이러스의 게놈 RNA가 서열번호 12에 나타내는 염기서열로 이루어지는 RNA인 것을 특징으로 하는 레플리콘 RNA.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 5'비번역영역이 서열번호 1에 나타내는 염기서열로 이루어지고, 코어 단백질 코드 서열이 서열번호 2에 나타내는 염기서열로 이루어지며, E1 단백질 코드 서열이 서열번호 3에 나타내는 염기서열로 이루어지고, E2 단백질 코드 서열이 서열번호 4에 나타내는 염기서열로 이루어지며, NS2 단백질 코드 서열이 서열번호 5에 나타내는 염기서열로 이루어지고, NS3 단백질 코드 서열이 서열번호 6에 나타내는 염기서열로 이루어지며, NS4A 단백질 코드 서열이 서열번호 7에 나타내는 염기서열로 이루어지고, NS4B 단백질 코드 서열이 서열번호 8에 나타내는 염기서열로 이루어지며, NS5A 단백질 코드 서열이 서열번호 9에 나타내는 염기서열로 이루어지고, NS5B 단백질 코드 서열이 서열번호 10에 나타내는 염기서열로 이루어지며, 3'비번역영역이 서열번호 11에 나타내는 염기서열로 이루어지는 것을 특징으로 하는 레플리콘 RNA.
- 이하의 (a) 또는 (b)의 RNA로 이루어지는 것을 특징으로 하는 레플리콘 RNA.(a)서열번호 13에 나타내는 염기서열로 이루어지는 RNA.(b)서열번호 13에 나타내는 염기서열에 있어서 1~100개의 염기가 삭제, 치환 또는 부가된 염기서열로 이루어지는 RNA로서, 자율 복제능 및 바이러스 입자 산생능을 갖는 RNA.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 기재된 레플리콘 RNA를 세포에 도입하는 것을 포함하는, 상기 레플리콘 RNA를 복제하고 또한 바이러스 입자를 산생하는 세 포를 제조하는 방법.
- 제6항에 있어서, 세포가 증식성 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제6항 또는 제7항에 있어서, 세포가 진핵세포인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제8항에 있어서, 진핵세포가 인간 간유래 세포, 인간 자궁경부유래 세포, 또는 인간 태아신장유래 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제8항에 있어서, 진핵세포가 Huh7 세포, HepG2 세포, IMY-N9 세포, HeLa 세포, 또는 293 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제6항 내지 제10항 중 어느 한 항에 기재된 방법에 의해 제조되는 레플리콘 RNA를 복제하고 또한 바이러스 입자를 산생하는 세포.
- 제11항에 기재된 세포를 배양해서 바이러스 입자를 산생시키는 것을 포함하는, C형간염 바이러스 입자의 제조방법.
- 제12항에 기재된 방법에 의해 제조되는 것을 특징으로 하는 C형간염 바이러스 입자.
- 제11항에 기재된 세포를 배양하고, 배양물 중의 바이러스 입자를 다른 세포에 감염시키는 것을 포함하는, C형간염 바이러스 감염세포를 제조하는 방법.
- 제14항에 기재된 방법에 의해 제조되는 것을 특징으로 하는 C형간염 바이러스 감염세포.
- 피검물질의 존재 하에서 하기 (a)~(c):(a)제11항에 기재된 세포(b)제15항에 기재된 C형간염 바이러스 감염세포, 및(c)제13항에 기재된 C형간염 바이러스 입자 및 C형간염 바이러스 감수성 세포,중 1개이상를 배양하고, 얻어지는 배양물 중의 레플리콘 RNA 또는 바이러스 입자를 검출하는 것을 포함하는, 항C형간염 바이러스 물질을 스크리닝하는 방법.
- 제13항에 기재된 C형간염 바이러스 입자 또는 그 일부분을 함유하는 것을 특징으로 하는 C형간염 백신.
- 제13항에 기재된 C형간염 바이러스 입자 또는 그 일부분을 항원으로서 사용해서 C형간염 백신을 제조하는 방법.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 기재된 레플리콘 RNA를 사용해서 유전자치료를 위한 간세포지향성 바이러스 벡터를 제조하는 방법.
- 제18항에 기재된 방법에 의해 제조되는, 간세포지향성 바이러스 벡터.
- 외래유전자를 코드하는 RNA를 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 기재된 레플리콘 RNA 속에 삽입하고, 그것을 세포 중에 도입하는 것을 포함하는, 상기 세포 내에서 외래유전자를 복제 및/또는 발현시키는 방법.
- 서열번호 12에 나타내는 염기서열로 이루어지는 RNA를 세포에 도입하는 것을 포함하는, 상기 RNA를 복제하고 또한 바이러스 입자를 산생하는 세포를 제조하는 방법.
- 서열번호 12에 나타내는 염기서열로 이루어지는 RNA를 세포에 도입하고, 그 세포를 배양해서 바이러스 입자를 산생시키는 것을 포함하는, C형간염 바이러스 입자의 제조방법.
- 제21항 또는 제22항에 있어서, 세포가 증식성 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
- 서열번호 12에 나타내는 염기서열로 이루어지는 RNA에 외래유전자를 코드하는 RNA를 삽입하고, 그것을 세포에 도입하여 그 세포를 배양해서 바이러스 입자를 산생시키는 것을 포함하는, 외래유전자를 함유하는 바이러스 벡터를 제조하는 방법.
- 제13항에 기재된 C형간염 바이러스 입자에 대한 항체.
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