KR101122244B1

KR101122244B1 - 효율적으로 복제할 수 있는 변이 c형 간염 바이러스, 리포터 유전자를 포함하는 변이 c형 간염 바이러스, 상기 변이 c형 간염 바이러스를 이용한 c형 간염 바이러스 백신 제조방법 및 상기 변이 c형 간염 바이러스를 이용한 항c형 간염 바이러스 조성물의 스크리닝 방법

Info

Publication number: KR101122244B1
Application number: KR1020097024873A
Authority: KR
Inventors: 장승기; 김천생
Original assignee: 주식회사 포스코; 포항공과대학교 산학협력단
Priority date: 2007-04-27
Filing date: 2008-04-28
Publication date: 2012-03-22
Also published as: KR20100007937A; US20100215696A1; WO2008133468A1

Abstract

본 발명은 리포터 유전자를 포함하는 변이 C 형 간염 바이러스, 효율적으로 복제하는 변이 C 형 간염 바이러스 및 상기 변이 C 형 간염 바이러스를 이용한 항 C 형 간염 바이러스 물질의 스크리닝 방법에 관한 것이다. 본 발명은 많은 바이러스가 생성되지 않아 효율적으로 바이러스 감염을 유도할 수 없고, 바이러스의 감염의 정량적 측정이 어렵다는 기존의 HCV 세포배양법의 문제점을 극복하기 위하여 개발된 것이다. 본 발명은 많은 HCV 를 생성하고 감염을 살아있는 세포를 그대로 이용하여 효율적으로 관찰할 수 있으므로, 본 발명을 이용한 시스템에 의해, 기존의 HCV 연구에서 불가능하였던 바이러스 감염경로, 바이러스의 조립(assembly) 및 바이러스의 배출(release)에 관한 연구를 수행할 수 있고, HCV 복제 외에도 HCV 의 생활사의 다른 중요한 부분을 억제할 수 있는 억제제를 찾는 연구를 수행할 수 있다.

Description

효율적으로 복제할 수 있는 변이 C 형 간염 바이러스, 리포터 유전자를 포함하는 변이 C 형 간염 바이러스, 상기 변이 C 형 간염 바이러스를 이용한 C 형 간염 바이러스 백신 제조방법 및 상기 변이 C 형 간염 바이러스를 이용한 항 C 형 간염 바이러스 조성물의 스크리닝 방법 {AN EFFICIENTLY REPLICABLE HEPTITIS C VIRUS MUTANT, A HEPTITIS C VIRUS MUTANT COMPRISING REPORTER GENE, A METHOD OF PREPARING OF HCV VACCINE USING THE SAME AND A METHOD OF SCREENING ANTI HCV COMPOSITION USING THE SAME}

(a) Field of the Invention

본 발명은 효율적으로 복제하는 변이 C 형 간염 바이러스, 리포터 유전자를 포함하는 변이 C 형 간염 바이러스, 상기 변이 C 형 간염 바이러스를 이용한 C 형 간염 바이러스 백신 개발 및 상기 변이 C 형 간염 바이러스를 이용한 항 C 형 간염 바이러스 물질의 스크리닝 방법에 관한 것이다.

(b) Description of the Related Art

C 형 간염 바이러스(Heptitis C virus, HCV)는 전세계 인구의 약 3％에 해당하는 약 1 억 7 천만명 이상을 감염시키고 있다. HCV 의 급속 감염은 지속적 감염으로 진행되며, HCV 의 지속적 감염은 만성간염과 같은 간질환, 간경화 및 감암 등을 일으키는 심각한 질병원이다.

현재까지 이용 가능한 백신이 개발되지 않고 있으며, 현재 C 형 간염을 치료하는 적절한 방법은 인터페론-α(Alpha interferon, IFN-α)와 리바비린(Ribavirin)을 함께 사용하는 것이다. 하지만, 상기 치료 방법은 절반 이상의 환자에서 치료가 되지 않고, 치료가 오래 걸리며, 부작용을 유발하는 단점이 보고되어 있다. 그러므로, C 형 간염의 효과적인 치료법과 백신의 개발이 절실히 요구되고 있다.

HCV 의 세포배양법은 HCV 에 대한 연구 및 HCV 와 관련된 질병의 예방 및 치료를 위한 전략을 고안하기 위한 필수 전제이다. 즉, HCV 입자의 감염세포 내에서의 형성과 세포 밖으로의 방출, 또한 새로운 세포로의 감염이라는 과정을 재현할 수 있는 매우 단순화된 실험계, 즉, 배양세포계를 사용한 HCV 의 세포배양법을 구축할 필요가 있다.

HCV 의 세포배양법에 대한 가장 최근의 발전은 급성 간염환자(fulminant hepatitis)로부터 분리한 HCV RNA 게놈(JFH1)을 이용하여 Huh7 세포주(human hepatoma cell line Huh7)에 감염시키는 방법이다. 상기 방법을 이용하여 바이러스의 모든 생활사에 대한 연구가 가능해졌고, 바이러스 감염 과정에 대한 연구들이 많이 진행되고 있다.

그러나, C 형 간염 치료제를 연구하거나 백신을 개발하기 위해서는 많은 양의 바이러스가 필요함에도 불구하고, 상기 방법은 매우 적은 양의 바이러스가 만들어지기 때문에 효율적으로 감염을 유도할 수 없고, 바이러스 감염의 정량적인 분석과 바이러스에 의해 감염된 세포를 효과적으로 연구할 수 없다는 단점이 있다.

또한, HCV 에 대한 연구 및 HCV 에 대한 항바이러스물질을 개발하기 위해서는 항바이러스 효과를 나타내는 물질을 찾아내거나, 항바이러스제의 효능을 검정할 수 있는 시스템이 필요하다. 보다 상세하게는, 바이러스의 증식을 촉진하는 돌연변이를 찾아내거나 이종 유래 서열을 삽입하여 바이러스의 감염을 정량적으로 측정할 수 있는 시스템의 개발이 요구된다.

본 발명은 상술한 많은 바이러스가 생성되지 않아 효율적으로 바이러스 감염을 유도할 수 없고, 바이러스의 감염의 정량적 측정이 어렵다는 기존의 HCV 세포배양법의 문제점을 극복하기 위하여 개발된 것이다. 따라서 본 발명의 목적은 효율적으로 HCV 의 감염을 유도할 수 있는 서열번호 1 의 JFH1 주의 게놈 RNA 의 E2 영역 및 p7 영역으로 이루어진 군 중에서 선택된 1 이상의 영역에 1 이상의 염기서열이 치환된 것인 변이 HCV 게놈을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 목적은 리포터 유전자와 HCV 게놈 RNA 를 포함하는 변이 C 형 간염 바이러스(HCV) 재조합 게놈을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 HCV 재조합 게놈을 포함하는 폴리뉴클레오티드 또는 변이 HCV 게놈을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 갖는 변이 HCV 를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 HCV 재조합 게놈을 포함하는 폴리뉴클레오티드 또는 변이 HCV 게놈을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터에 관한 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 HCV 재조합 게놈을 포함하는 폴리뉴클레오티드 또는 변이 HCV 게놈을 포함하는 폴리뉴클레오티드가 도입된 형질전환체를 제공하는 것이다. 상기 형질전환체는 바람직하게는 상기 HCV 재조합 게놈을 포함하는 폴리뉴클레오티드 또는 변이 HCV 게놈을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 복제하고, 바이러스 입자를 생산할 수 있으며, 숙주세포에 감염될 수 있는 것을 특징으로 하는 형질전환체일 수 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 HCV 재조합 게놈을 포함하는 폴리뉴클레오티드 또는 변이 HCV 게놈을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 변이 HCV 의 바이러스 입자를 제공하는 것이다. 또한, 본 발명의 목적은 상기 형질전환체를 배양한 배양물에서 얻어지는 것인 변이 HCV 의 바이러스 입자를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 변이 HCV 의 바이러스 입자가 감염된 것을 특징으로 하는 HCV 감염세포를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 형질전환체를 배양하는 단계; 상기 배양물에서 바이러스 입자를 수득하는 단계; 및 상기 수득된 바이러스 입자를 이용하여 다른 세포를 감염시키는 단계를 포함하는 HCV 감염세포 제조방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 변이 HCV 의 바이러스 입자 또는 그 일부분을 항원으로서 사용해서 얻어질 수 있는 것을 특징으로 하는 C 형 간염 백신 및 중화항체로 이루어진 군에서 선택된 1 이상을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 피검물질의 존재 하에서 상기 HCV 재조합 게놈을 포함하는 폴리뉴클레오티드 또는 변이 HCV 게놈을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 숙주세포에 도입하고 배양하는 단계; 및 상기 피검물질의 항 HCV 효과를 평가하는 단계를 포함하는 항 HCV 물질 또는 항 HCV 치료제의 스크리닝 방법을 제공하는 것이다. 상기 피검물질의 항 HCV 효과를 평가하는 단계는 상기 배양물 중의 상기 변이 HCV 의 핵산 또는 바이러스 입자를 존재, 정량 및 활성으로 이루어진 군중에서 선택된 1 이상을 측정하는 방법으로 수행하거나 상기 배양물 중의 리포터 유전자 또는 리포터 유전자의 발현물의 존재, 정량 및 활성으로 이루어진 군중에서 선택된 1 이상을 측정하는 방법으로 수행할 수 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 외래 유전자를 암호화(coding)하는 RNA 를 상기 HCV 재조합 게놈을 포함하는 폴리뉴클레오티드 또는 변이 HCV 게놈을 포함하는 폴리뉴클레오티드에 삽입하는 단계; 및 상기 외래 유전자가 삽입된 폴리뉴클레오티드를 목적으로 하는 세포에 도입하여 복제 및/또는 발현시키는 단계를 포함하는 세포 내에서 외래 유전자를 복제 및/또는 발현시키는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 변이 HCV 게놈을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 갖는 변이 HCV 를 이용하여 외래 유전자를 발현하거나 유전자 치료에 이용하기 위한 벡터를 제공하는 것이다.

도 1 은 본 발명의 일 실시예에 따른, JFH1 바이러스의 구조, 리포터 단백질을 포함하는 C 형 간염 바이러스 구조 및 세포적응 돌연변이를 포함하고 있는 JFH 바이러스 구조를 나타내는 개략도이다.

도 2 는 본 발명의 일 실시예에 따른, anti-NS5a 항체와 anticore 항체를 이용하여 웨스턴블럿팅법으로 NS5a 단백질과 core 단백질의 발현 정도를 정량분석한 사진이다.

도 3 은 본 발명의 일 실시예에 따른, JFH 5a-GFP, JFH 5a-Rluc, JFH 및 JFH Pol^- 바이러스를 감염시켜 제조한 형질전환체에서, HCV RNA 수준을 확인한 그래프이다.

도 4 는 본 발명의 일 실시예에 따른, JFH 5a-GFP 및 JFH Pol^- 바이러스를 감염시켜 제조한 형질전환체에서 시간의 경과에 따라 루시퍼라아제 활성의 변화를 확인한 그래프이다.

도 5 는 본 발명의 일 실시예에 따른, JFH 5a-GFP, JFH 5a-Rluc, JFH 및 JFH Pol^- 바이러스를 감염시켜 제조한 형질전환체에서, 형광현미경 및 코어단백질에 대한 항체를 이용하여 코어 단백질과 5a-GFP 단백질을 발현 여부를 확인한 사진이다.

도 6 은 본 발명의 일 실시예에 따른, IFN-α 의 효과를 JFH 5a-Rluc 바이러스를 감염시켜 제조한 형질전환체를 이용하여 검증한 결과를 나타낸 그래프이다.

도 7 은 본 발명의 일 실시예에 따른, Rivabirin 의 효과를 JFH 5a-Rluc 바이러스를 감염시켜 제조한 형질전환체를 이용하여 검증한 결과를 나타낸 그래프이다.

도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른, BILN 2061 의 효과를 JFH 5a-Rluc 바이러스를 감염시켜 제조한 형질전환체를 이용하여 검증한 결과를 나타낸 그래프이다.

도 9 는 본 발명의 일 실시예에 따른, IFN-α 의 처리 없이 JFH 5a-GFP RNA 를 도입시켜 제조한 형질전환체를 간헐촬영 공초첨 현미경를 이용하여 매 12 간마다 60 시간까지 촬영한 사진이다.

도 10 은 본 발명의 일 실시예에 따른, IFN-α 을 처리없이 JFH 5a-GFP RNA 를 도입시켜 제조한 형질전환체 중 형광정도로 선택된 8 개의 형질전환체의 시간에 따른 형광정도의 변화를 측정된 절대값으로 나타낸 그래프이다.

상기 서열번호 1의 JFH1 게놈 RNA상에서 변경될 E2 단백질 코딩 영역은 상기 서열번호 1의 2027번째 내지 2029번째의 염기서열(서열번호 13 의 1687번째의 염기서열 내지 1689번째의 염기서열)일 수 있다. 바람직하게는 2028번째 염기서열(서열번호 13의 1688번째 염기서열)일 수 있다. 상기 E2 단백질 코딩 영역의 변경은 상기 서열번호 1의 2027번째 내지 2029번째의 염기서열(서열번호 13의 1687번째의 염기서열 내지 1689번째의 염기서열)에서 1 이상이 다른 염기서열로 치환된 것일 수 있고, 상기 치환된 염기서열(서열번호 13의 1687번째의 염기서열 내지 1689번째의 염기서열)은 트레오닌을 암호화하지 않는다. 바람직하게는 상기 서열번호 1의 2027번째 내지 2029번째(서열번호 13의 1687번째의 염기서열 내지 1689번째의 염기서열)의 염기서열의 1 이상이 다른 염기서열로 치환되고, 치환된 2027번째 내지 2029번째의 염기서열(서열번호 13의 1687번째의 염기서열 내지 1689번째의 염기서열)이 이소류신, 류신, 발린, 페닐알라닌, 메티오닌, 시스테인, 알라닌, 글리신, 프롤린, 세린, 타이로신, 트립토판, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 글루타민산, 아스파라긴산, 리신 및 아르기닌으로 이루어진 군주에서 선택된 어느 하나를 암호화하는 E2 단백질을 암호화하는 영역일 수 있다. 더욱 바람직하게는 상기 서열번호 1의 2027번째 내지 2029번째(서열번호 13의 1687번째의 염기서열 내지 1689번째의 염기서열)의 변경된 염기 서열에 의해 아미노산을 트레오닌에서 이소류신으로 변화시키는 것일 수 있다.

도 12 는 본 발명의 일 실시예에 따른, IFN-α 을 처리없이 JFH 5a-GFP RNA 를 도입시켜 제조한 형질전환체 중 형광정도로 선택된 8 개의 형질전환체의 시간에 따른 형광정도의 평균값을 상대값으로 나타낸 그래프이다.

도 13 은 본 발명의 일 실시예에 따른, IFN-α 을 1000 IU/ml 처리하고 JFH 5a-GFP RNA 를 도입시켜 제조한 형질전환체를 간헐촬영 공초첨 현미경를 이용하여 매 12 간마다 60 시간까지 촬영한 사진이다.

도 14 는 본 발명의 일 실시예에 따른, IFN-α 을 1000 IU/ml 처리하고 JFH 5a-GFP RNA 를 도입시켜 제조한 형질전환체 중 형광정도로 선택된 8 개의 형질전환체의 시간에 따른 형광정도의 변화를 측정된 상대값으로 나타낸 그래프이다.

도 15 는 본 발명의 일 실시예에 따른, IFN-α 을 1000 IU/ml 처리하고 JFH 5a-GFP RNA 를 도입시켜 제조한 형질전환체 중 형광정도로 선택된 8 개의 형질전환 체의 시간에 따른 형광정도의 변화를 초기값을 기준으로 계산된 상대값으로 나타낸 그래프이다.

도 16 은 본 발명의 일 실시예에 따른, IFN-α 을 1000 IU/ml 처리하고 JFH 5a-GFP RNA 를 도입시켜 제조한 형질전환체 중 형광정도로 선택된 8 개의 형질전환체의 시간에 따른 형광정도의 평균값을 상대값으로 나타낸 그래프이다.

도 17 은 본 발명의 일 실시예에 따른, 선별된 세포주들과 원래 Huh 7.5.1 세포주의 감염 효율을 비교한 결과를 나타낸 그래프이다.

도 18 는 본 발명의 일 실시예에 따른, 세포적응이 일어난 바이러스와 원래의 바이러스를 감염하고, 코어 단백질의 발현을 면역 세포 화학(immunocytochemistry) 방법으로 확인하여 감염 효율을 비교한 결과를 나타낸 사진 이다.

도 19 는 본 발명의 일 실시예에 따른, 세포적응이 일어난 바이러스 중, 효율적으로 복제가 가능한 것으로 확인된 바이러스 RNA 를 세포에 도입시켜, 코어 단백질과 NS5a-GFP 단백질을 발현하는 세포 적응 클론 Ad9, Ad12 및 Ad16 의 코어 단백질과 NS5a-GFP 단백질 발현을 조사한 사진이다.

도 20 은 본 발명의 일 실시예에 따른, 세포 적응 클론 Ad9, Ad12 및 Ad16 의 NS5a-GFP 단백질 발현양을 형광정도로 나타낸 사진이다.

도 21 는 본 발명의 일 실시예에 따른, 세포 적응 클론 Ad9, Ad12 및 Ad16 의 TCID₅₀ 을 측정한 그래프이다.

도 22 은 본 발명의 일 실시예에 따른, 코어 단백질과 NS5a-GFP 단백질 발현을 조사한 결과이다.

도 23 은 본 발명의 일 실시예에 따른, 감염된 세포에서 보이는 NS5a-GFP 단백질 형광을 보이는 사진이다.

도 24 는 본 발명의 일 실시예에 따른, 세포 적응 클론 Ad9, Aa12 및 Ad16 에 존재하는 제한효소 부위와 변이부위를 나타낸 그림이다.

도 25 는 본 발명의 일 실시예에 따른, 세포 적응 클론 Ad9, Ad12 및 Ad16 의 주요 염기서열 변화를 요약한 그림이다.

도 26 은 본 발명의 일 실시예에 따른, 세포 적응 클론 9 번에서 발견된 염기서열 변화 중, 바이러스 형성 증가에 중요한 염기변화를 확인한 실험한결과를 나타낸 사진이다.

이하에서 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다.

본 명세서에서 "C 형 간염 바이러스(Heptitis C virus, HCV)"는 양성극성(positive-sensitive) RNA 바이러스로, 상기 HCV 는 약 9.6kb 의 길이를 지닌 단일 가닥의 리보핵산(ribonucleic acid, RNA) 게놈을 가지는 바이러스를 말한다. 상기 HCV 의 게놈의 유전자 구성은 5'비번역영역(5' non-translated region, NTR) 및 3'비번역영역(3' non-translated region, NTR)과 상기 비번역영역(non-translated regions, NTRs) 사이의 긴 해독특(open reading frame, ORF)을 포함할 수 있다. 상기 HCV 의 단백질은 긴 다기능 단백질(polyprotein)으로 먼저 발현된 후, 세포의 혹은 바이러스의 단백질 제한효소(protease)에 의해 10 개의 단백질로 잘릴 수 있다. 상기 10 개의 단백질은 코어(core), E1, E2 및 p7 단백질로 구성된 구조 단백질과 NS2, NS3, NS4a, NS5a 및 NS5b 단백질로 구성된 비구조 단백질로 나눌 수 있다.

또한, 본 명세서에서 "변이 HCV"란 자연계에 존재하는 HCV 의 게놈 유전자 즉, HCV 의 게놈 RNA 의 1 이상의 서열이 치환 및/또는 삭제되거나, HCV 의 게놈 RNA 에 1 개 이상의 서열을 갖는 외부의 폴리뉴클레오티드 또는 외부 유전자가 삽입된 것일 수 있다.

또한, 본 명세서에서 "키메라 HCV(chimeric Hepatitis C Virus) 게놈 RNA 2 이상의 HCV 의 게놈 RNA 가 결합된 것일 수 있다.

또한, 본 명세서에서 "HCV 의 재조합 게놈"이란 자연계에 존재하는 HCV 의 게놈 RNA 에 1 개 이상의 서열을 갖는 외부의 폴리뉴클레오티드가 삽입되거나, HCV 의 게놈 RNA 의 1 이상의 서열이 치환 및/또는 삭제되고 1 개 이상의 서열을 갖는 외부의 폴리뉴클레오티드가 삽입된 것으로, 자율복제능을 갖고 숙주세포를 감염시킬 수 있는 HCV 게놈 RNA 일 수 있다.

또한, 본 명세서에서 "리포터 유전자"라 함은 발현되어 정량할 수 있는 단백질의 유전자를 말하는 것으로서 종래에 알려진 리포터 단백질의 유전자는 모두 본 발명에 적용가능하며, 그 예로 레닐라 루시퍼라아제(Renilla luciferase) 유전자, 녹색 형광 단백질(Green fluorescence protein)의 유전자, 파이어플라이 루시퍼레이즈(Firefly luciferase) 유전자, 적색 형광 단백질(Red fluorescence protein)의 유전자 및 씨크리티드 알칼라인 포스파타아제(Secreted alkaline phosphatase, SeAP)의 유전자로 이루어진 군 중에서 선택된 1 이상일 수 있으나 이에 한정되지 않는다. 본 발명의 리포터 유전자는 바람직하게는 레닐라 루시퍼라아제 및 녹색 형광 단백질로 이루어진 군 중에서 선택된 1 이상일 수 있다.

또한, 상기 리포터 유전자의 검출 및 정량방법은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 알려진 방법을 본 발명에 적용할 수 있다. 상기 녹색 형광 단백질의 유전자를 사용하는 경우에는 발현 유전자의 발현 정도를 자외선을 세포에 조사함으로써 나타나는 녹색 형광 단백질을 관찰함으로써 확인할 수 있어, 살아있는 세포를 그대로 이용하여 발현을 관찰할 수 있다는 장점이 있다.

본 발명은 효율적으로 HCV 의 감염을 유도할 수 있는 서열번호 1 의 JFH1 주의 게놈 RNA 의 E2 영역 및 p7 영역으로 이루어진 군 중에서 선택된 1 이상의 영역에 1 이상의 염기서열이 치환된 것인 변이 HCV 게놈을 포함하는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다. 상기 서열번호 1 는 외래유전자가 포함되지 아니한 JFH1 주의 게놈 RNA 를 의미한다.

본 발명의 발명자는 JFH1 주의 게놈 RNA 의 E2 영역 및 p7 영역으로 이루어진 군 중에서 선택된 1 이상의 영역에 1 이상의 염기서열을 치환시키는 경우, RNA 게놈의 효율적 복제와 효율적인 HCV 의 감염을 유도할 수 있으므로, 상기 변이 HCV 게놈을 포함하는 폴리뉴클레오티드 또는 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 변이 HCV 는 새로운 항 HCV 물질을 개발할 수 있는 시스템을 제공할 수 있다는 것을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

상기 효율적으로 HCV 의 감염을 유도할 수 있는 변이 HCV 게놈은 높은 효율로 바이러스를 생산하는 세포에 적응된 JFH1 주의 돌연변이 바이러스일 수 있으며, 상기 효율적으로 HCV 의 감염을 유도할 수 있는 JFH1 주의 돌연변이 바이러스의 게놈 RNA 는 높은 효율, 일 예로 HCV JFH1 주에 비하여 2 내지 100 배 이상의 높은 효율로 바이러스를 생산할 수 있는 바이러스의 게놈 RNA 일 수 있 다.

상기 서열번호 1 의 JFH1 주의 게놈 RNA 의 E2 영역은 상기 서열번호 1 의 2027 번째 내지 2029 번째의 염기서열(서열번호 13 의 1687 번째의 염기서열 내지 1689 번째의 염기서열)일 수 있으며, 바람직하게는 2028 번째 염기서열(서열번호 13 의 1688 번째 염기서열)일 수 있다. 상기 서열번호 1 의 JFH1 주의 게놈 RNA 의 E2 영역의 염기서열의 치환은 상기 서열번호 1 의 2027 번째 내지 2029 번째의 염기서열(서열번호 13 의 1687 번째의 염기서열 내지 1689 번째의 염기서열)의 1 이상이 다른 염기서열로 치환되고, 치환된 2027 번째 내지 2029 번째의 염기서열(서열번호 13 의 1687 번째의 염기서열 내지 1689 번째의 염기서열)이 트레오닌을 암호화하지 않는 것일 수 있으며, 바람직하게는 상기 서열번호 1 의 2027 번째 내지 2029 번째(서열번호 13 의 1687 번째의 염기서열 내지 1689 번째의 염기서열)의 염기서열의 1 이상이 다른 염기서열로 치환되고, 치환된 2027 번째 내지 2029 번째의 염기서열(서열번호 13 의 1687 번째의 염기서열 내지 1689 번째의 염기서열)이 이소류신, 류신, 발린, 페닐알라닌, 메티오닌, 시스테인, 알라닌, 글시신, 프롤린, 세린, 타이로신, 트립토판, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 글루타민산, 아스파라긴산, 리신 및 아르기닌으로 이루어진 군주에서 선택된 어느 하나를 암호화하는 것일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 상기 염기서열의 변화가 상기 서열번호 1 의 2027 번째 내지 2029 번째(서열번호 13 의 1687 번째의 염기서열 내지 1689 번째의 염기서열)의 염기에 의해 암호화하는 아미노산을 트레오닌에서 이소류신으로 변화시키는 것일 수 있다.

또한, 상기 서열번호 1 의 JFH1 주의 게놈 RNA 의 E2 영역이 염기서열의 치환은 바람직하게는 서열번호 1 의 2027 번째(서열번호 13 의 1687 번째)의 아데닌이 우라실, 티민, 구아닌 및 사이토신으로 이루어진 군 중에서 선택된 어느 하나로 치환된 것일 수 있고, 서열번호 1 의 2028 번째(서열번호 13 의 1688 번째)의 사이토신이 우라실, 티민, 구아닌 및 아데닌으로 이루어진 군 중에서 선택된 어느 하나로 치환된 것일 수 있으며, 서열번호 1 의 2029 번째(서열번호 13 의 1689 번째)의 사이토신이 우라실, 티민, 구아닌 및 아데닌으로 이루어진 군 중에서 선택된 어느 하나로 치환된 것일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 서열번호 1 의 2028 번째(서열번호 13 의 1688 번째)의 사이토신이 우라실, 티민, 구아닌 및 아데닌으로 이루어진 군 중에서 선택된 어느 하나로 치환된 것일 수 있으며, 더더욱 바람직하게는 서열번호 1 의 2028 번째(서열번호 13 의 1688 번째)의 사이토신이 우라실 또는 티민으로 치환된 것일 수 있다.

상기 서열번호 1 의 JFH1 주의 게놈 RNA 의 p7 영역은 상기 서열번호 1 의 2633 번째 내지 2635 번째(서열번호 13 의 2293 번째 염기서열 내지 2295 번째 염기서열)의 염기서열일 수 있으며, 바람직하게는 2633 번째 염기서열(서열번호 13 의 2293 번째 염기서열)일 수 있다. 상기 서열번호 1 의 JFH1 주의 게놈 RNA 의 p7 영역의 염기서열의 치환은 상기 서열번호 1 의 2633 번째 내지 2635 번째의 염기서열(서열번호 13 의 2293 번째 염기서열 내지 2295 번째 염기서열)의 1 이상이 다른 염기서열로 치환되고, 치환된 2633 번째 내지 2635 번째의 염기서열(서열번호 13 의 2293 번째 염기서열 내지 2295 번째 염기서열)이 아스파라긴을 암호화하지 않는 것일 수 있으며, 바람직하게는 상기 서열번호 1 의 2633 번째 내지 2635 번째의 염기서열(서열번호 13 의 2293 번째 염기서열 내지 2295 번째 염기서열)의 1 이상이 다른 염기서열로 치환되고, 치환된 2633 번째 내지 2635 번째의 염기서열(서열번호 13 의 2293 번째 염기서열 내지 2295 번째 염기서열)이 이소류신, 류신, 발린, 페닐알라닌, 메티오닌, 시스테인, 알라닌, 글시신, 프롤린, 세린, 타이로신, 트립토판, 글루타민, 트레오닌, 히스티딘, 글루타민산, 아스파라긴산, 리신 및 아르기닌으로 이루어진 군주에서 선택된 어느 하나를 암호화하는 것일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 상기 서열번호 1 의 2633 번째 내지 2635 번째의 염기서열(서열번호 13 의 2293 번째 염기서열 내지 2295 번째 염기서열)의 1 이상이 다른 염기서열로 치환되고, 치환된 2633 번째 내지 2635 번째의 염기서열(서열번호 13 의 2293 번째 염기서열 내지 2295 번째 염기서열)이 아스파라긴산으로 치환된 것일 수 있다.

또한, 상기 서열번호 1 의 JFH1 주의 게놈 RNA 의 E2 영역의 염기서열의 치환은 바람직하게는 서열번호 1 의 2633 번째(서열번호 13 의 2293 번째)의 아데닌이 우라실, 티민, 구아닌 및 사이토신으로 이루어진 군 중에서 선택된 어느 하나로 치환된 것일 수 있고, 서열번호 1 의 2634 번째(서열번호 13 의 2294 번째)의 아데닌이 우라실, 티민, 구아닌 및 사이토신으로 이루어진 군 중에서 선택된 어느 하나 로 치환된 것일 수 있으며, 서열번호 1 의 2635 번째(서열번호 13 의 2295 번째)의 사이토신이 우라실, 티민, 구아닌 및 아데닌으로 이루어진 군 중에서 선택된 어느 하나로 치환된 것일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 서열번호 1 의 2633 번째(서열번호 13 의 2293 번째)의 아데닌이 우라실, 티민, 구아닌 및 사이토신으로 이루어진 군 중에서 선택된 어느 하나로 치환된 것일 수 있고, 더더욱 바람직하게는 서열번호 1 의 2633 번째(서열번호 13 의 2293 번째)의 아데닌이 구아닌으로 치환된 것일 수 있다.

상기 효율적으로 HCV 의 감염을 유도할 수 있는 변이 HCV 게놈을 포함하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 1 의 JFH1 주의 게놈 RNA 의 NS5a 영역에 리포터 유전자가 더욱 삽입된 것을 포함하는 폴리뉴클레오티드일 수 있다.

상기 리포터 유전자는 레닐라 루시버라아제(Renilla luciferase) 유전자, 녹색 형광 단백질(Green fluorescence protein)의 유전자, 파이어플라이 루시퍼레이즈(Firefly luciferase) 유전자, 적색 형광 단백질(Red fluorescence protein)의 유전자 및 씨크리티드 알칼라인 포스파타아제(Secreted alkaline phosphatase, SeAP)의 유전자로 이루어진 군 중에서 선택된 1 이상일 수 있다. 상기 리포터 유전자는 바람직하게는 레닐라 루시퍼라아제 및 녹색 형광 단백질로 이루어진 군 중에서 선택된 1 이상일 수 있다.

보다 구체적으로, 상기 리포터 유전자는 상기 서열번호 1 의 JFH1 주의 게놈 RNA 의 E2 영역 및 p7 영역으로 이루어진 군 중에서 선택된 1 이상의 영역에 1 이상의 염기서열이 치환된 것인 변이 HCV 게놈의 NS5A 영역, 바람직하게는 NS5A 영역 의 카복시 말단(C-terminal)에 해당하는 영역, 더욱 바람직하게는 서열번호 1 의 JFH1 주의 게놈 RNA 의 7176 번째 염기서열, 7179 번째 염기서열, 7182 번째 염기서열, 7185 번째 염기서열 및 7188 번째 염기서열(서열번호 13 의 6836 번째 염기서열, 6839 번째 염기서열, 6842 번째 염기서열, 6845 번째 염기서열 및 6848 번째 염기서열)로 이루어진 군중에서 선택된 어느 하나에 해당하는 영역, 더더욱 바람직하게는 서열번호 1 의 JFGI 주의 게놈 RNA 의 6842 번째와 6843 번째 사이 핵산(NS5A 의 418 번째 아미노산을 암호화하는 핵산의 세 번째 염기서열과 NS5A 의 419 번째 아미노산을 암호화하는 핵산의 첫 번째 염기서열 사이)에 삽입될 수 있다.

본 발명은 또한 상기 효율적으로 HCV 의 감염을 유도할 수 있는 변이 HCV 게놈을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 갖는 변이 HCV 또는 상기 변이 HCV 의 게놈 RNA 의 cDNA 에 관한 것이다.

본 발명은 또한 리포터 유전자와 HCV 게놈 RNA 를 포 함하는 변이 C 형 간염 바이러스(HCV) 재조합 게놈을 포함하는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다.

본 발명의 발명자는 JFH1 주의 NS5A 부위에 리포터 유전자를 삽입시키는 경우, HCV 의 생활사와 복제 및 감염과 관련된 활성에 영향을 미치지 아니하므로, 엔세팔로마이오카디티스 바이러스(Encephalomyocarditis virus, EMCV)의 내부 라이보좀 도입 자리(internal ribosome entry site, IRES)와 같은 이종의 조절 요소(heterologous controlling element)의 삽입 없이 리포터 단백질을 효율적으로 발현시킬 수 있어서, 상기 리포터유전자를 가진 HCV 는 HCV 의 감염 경로나 HCV 의 생활환을 연구할 수 있고 새로운 항 HCV 물질을 개발할 수 있는 시스템을 제공할 수 있다는 것을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

상기 HCV 게놈 RNA 는 자율복제능을 갖고 감염될 수 있는 HCV 게놈 RNA 일 수 있으며, 바람직하게는 상기 HCV 게놈 RNA 는 서열번호 1 의 JFH1 주(JFH1 strain)의 게놈 RNA, 키메라 HCV(chimeric Hepatitis C Virus) 게놈 RNA, 서열번호 1 의 JFH1 주의 게놈 RNA 의 E2 영역 및 p7 영역으로 이루어진 군 중에서 선택된 1 이상의 영역에 1 이상의 염기서열이 변화된 변이 게놈 RNA 또는 변이 HCV 재조합 게놈 RNA 일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 상기 서열번호 1 의 JFH1 주의 게놈 RNA 의 E2 영역 및 p7 영역으로 이루어진 군 중에서 선택된 1 이상의 영역에 1 이상의 염기서열이 변화된 변이 게놈 RNA 일 수 있다.

구체적으로, 상기 변이 HCV 의 재조합 게놈 RNA 란 자연계에 존재하는 HCV 의 게놈 RNA, 바람직하게는 서열번호 1 의 JFH1 주(JFH1 strain)의 게놈 RNA 의 1 이상의 서열이 치환 및/또는 삭제되고 1 개 이상의 서열을 갖는 외부의 폴리뉴클레오티드가 삽입된 것으로, 자율복제능을 갖고 숙주세포를 감염시킬 수 있는 HCV 게놈 RNA 일 수 있다.

또 하나의 실시형태로서, 키메라 HCV 는 HCV 의 게놈 RNA 의 5'비번역영역, Core 단백질 코드 서열, E1 단백질 코드 서열, E2 단백질 코드 서열, p7 단백질 코드 서열, NS2 단백질 코드 서열; 및 서열번호 1 의 JFH1 주의 NS3, NS4a, NS4b, NS5a, NS5b 의 각 단백질 코드 서열과 3'비번역영역을 포함하는 염기서열로 이루어진 것일 수 있다.

본 발명은 또한 리포터 유전자와 HCV 게놈 RNA 를 포함하는 변이 C 형 간염 바이러스(HCV) 재조합 게놈을 포함하는 폴리뉴클레오티드 또는 효율적으로 HCV 의 감염을 유도할 수 있는 서열번호 1 의 JFH1 주의 게놈 RNA 의 E2 영역 및 p7 영역으로 이루어진 군 중에서 선택된 1 이상의 영역에 1 이상의 염기서열이 치환된 것인 변이 HCV 게놈을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터에 관한 것이다. 상기 벡터는 외래 유전자를 발현하기 위해 사용되거나 유전자 치료에 이용될 수 있다.

상기 변이 HCV 또는 상기 변이 HCV 바이러스 입자는 간세포 지향성을 가지므로, 상기 벡터는 간세포 지향성 바이러스 벡터 또는 간세포용 바이러스 벡터일 수 있다. 상기 간세포 지향성 바이러스 벡터 또는 간세포용 바이러스 벡터는 HCV 와 관련된 연구를 위하여 상기 변이 HCV 를 숙주세포에 감염시키기 위하여 사용될 수 있으며, HCV 바이러스와 관련된 간 질환, 일 예로 만성간염, 간경화 또는 간암 등의 유전자 치료용으로 사용될 수 있다. 상기 유전자 치료용으로 사용되는 바이러스는 사용되는 바이러스 자체로는 감염이 불가능한 반면, 바이러스 유전자 산물의 일부를 다른 바이러스나 숙죽에서 공급받아 감염은 가능하고, 바이러스의 증식은 불가능한 바이러스인 변이 HCV 일 수 있다.

또한, 본 발명은 리포터 유전자와 HCV 게놈 RNA 를 포함하는 변이 C 형 간염 바이러스(HCV) 재조합 게놈을 포함하는 폴리뉴클레오티드 또는 효율적으로 HCV 의 감염을 유도할 수 있는 서열번호 1 의 JFH1 주의 게놈 RNA 의 E2 영역 및 p7 영역으로 이루어진 군 중에서 선택된 1 이상의 영역에 1 이상의 염기서열이 치환된 것인 변이 HCV 게놈을 포함하는 폴리뉴클레오티드가 도입된 형질전환체에 관한 것이 다.

상기 형질전환체는 상기 폴리뉴클레오티드가 도입된 숙주세포, 상기 변이 HCV 재조합 게놈 RNA 또는 상기 변이 HCV 게놈 RNA 가 도입된 숙주세포로서, 상기 변이 HCV 재조합 게놈 RNA 또는 상기 변이 HCV 게놈 RNA 를 복제하고 또한 상기 변이 HCV 의 바이러스 입자를 생산하는 것일 수 있다.

상기 숙주세포는 계대배양할 수 있는 세포이면 특별히 한정되지 않지만, 바람직하게는 진핵세포이고, 더욱 바람직하게는 인간세포일 수 있다. 상기 인간세포는 바람직하게는 인간 간유래 세포, 인간 자궁경부유래세포 또는 인간 태아신장유래 세포일 수 있다. 또한, 상기 숙주세포는 바람직하게는 암세포주나 간세포주 등을 포함하는 증식성 세포일 수 있고, 더욱 바람직하게는 Huh7 세포, HepG2 세포, IMY-N9 세포, HeLa 세포, 또는 293 세포일 수 있다. 이들 세포는 시판되는 것을 이용하거나, 세포기탁 기관으로부터 입수하여 사용할 수 있으며, 임의의 세포(예를 들면, 암세포 또는 감세포)로부터 주화한 세포를 사용할 수 있다.

상기 Huh7 세포는 HCV 에 감염이 잘 된다고 알려진 Huh 7.5.1 세포주(Zhnog et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 102, 9294-9299) 또는 본 발명의 실시예에서 7.5.1 세포주로부터 분리되고 HCV 에 감염이 잘 되는 것으로 확인된 Huh 7.5.9 라고 명명한 세포주일 수 있다.

상기 폴리뉴클레오티드, 상기 변이 HCV 재조합 게놈 RNA 또는 상기 변이 HCV 게놈 RNA 의 숙주세포로의 도입 즉, 형질전환은 공지의 방법, 예컨대 바이러스 내의 폴리뉴클레오티드를 포장하고 숙주 세포에 바이러스를 형질도입을 하는 단계를 포함하는 방법, 폴리뉴클레오티드 자체를 도입시키는 방법에 의해 수행될 수 있다. 구체적으로, 상기 형질전환은 일렉트로포레이션, 파티클 건법, 리포펙션법, 마이크로인젝션법, DEAE 세파로오스법 등에 의해 수행될 수 있으며, 바람직하게는 일렉트로포레이션법에 의해 수행될 수 있다.

상기 숙주세포에 상기 폴리뉴클레오티드, 상기 변이 HCV 재조합 게놈 RNA 또는 상기 변이 HCV 게놈 RNA 가 도입되었는지 여부 또는 상기 숙주세포 중에서 상기 변이 HCV 재조합 게놈 RNA 또는 상기 변이 HCV 게놈 RNA 가 복제될 수 있는지 여부는 공지의 임의의 RNA 검출법으로 수행하거나 상기 숙주세포로부터 추출한 단백질에 HCV 단백질이 검출되었는지 여부를 공지의 임의의 단백질 검출법을 통하여 수행할 수 있으며, 바람직하게는 리포터 전자의 단백질이 발현되었는지 여부 또는 리포터 유전자의 단백질의 발현량의 정략적 측정를 통하여 수행할 수 있다.

또한 상기 형질전환체 또는 상기 형질전환체에서 생산된 상기 바이러스 입자로 감염시킨 HCV 감염세포는, 항 HCV 물질, 예를 들면 HCV 의 복제, 바이러스 입자의 재구축, 바이러스 입자의 방출을 촉진 또는 억제하는 물질(항 C 형 간염 바이러스 물질)을 스크리닝하기 위한 시험계로 사용될 수 있다.

상기 형질전환체는 상기 폴리뉴클레오티드, 상기 변이 HCV 재조합 게놈 RNA 또는 상기 변이 HCV 게놈 RNA 의 도입 또는 복제 여부를 리포터 단백질의 발현 여부 및 발현량에 의하여 용이하게 확인할 수 있는 장점 또는 상기 형질전환체에 도입된 상기 폴리뉴클레오티드, 상기 변이 HCV 재조합 게놈 RNA 또는 상기 변이 HCV 게놈 RNA 폴리뉴클레오티드가 고효율로 복제될 수 있다는 장점이 있다.

상기 형질전환체의 장점으로 인하여, 상기 형질전환체는 다양한 용도에 응용될 수 있다.

일 측면에서, 본 발명은 상기 형질전환체를 배양하는 단계; 상기 형질전환체를 배양하여 얻어진 배양물로부터 RNA 를 추출하는 단계; 전기영동법을 이용하여 추출된 RNA 로부터 HCV 게놈 RNA 를 분리하는 단계; 및 분리된 HCV 게놈 RNA 를 단리 정제함으로써 HCV 게놈 RNA 를 제조하는 단계를 포함하는 HCV 게놈 서열을 포함하는 RNA 제조방법에 관한 것일 수 있다. 상기 방법에 의해 제조된 RNA 는 HCV 의 게놈 서열을 포함한다. 상기 HCV 의 게놈 서열을 포함하는 RNA 의 제조방법이 제공됨으로써 HCV 의 게놈에 관하여 보다 상세한 분석이 가능하게 된다.

또 다른 일 측면에서, 본 발명의 형질전환체는 HCV 단백질을 제조하기 위해 사용될 수 있다. 상기 HCV 단백질의 제조는 공지의 임의의 방법에 의해 수행할 수 있고, 일 예로 상기 HCV 단백질의 제조방법은 상기 형질전환체를 배양하는 단계; 및 상기 형질전환체를 배양하여 얻어지는 배양물로부터 통상의 방법에 의해 단백질을 회수하는 단계를 포함하는 방법일 수 있다.

또 다른 일 측면에서, 본 발명의 형질전환체는 HCV 의 세포로의 결합을 촉진 또는 억제하는 물질을 스크리닝하기 위한 시험계로서 사용할 수도 있다. 구체적으로는, 피검물질의 존재 하에서 상기 형질전환체를 배양하고, 얻어지는 배양물 중의 HCV 게놈 RNA, 바이러스 입자 또는 리포터 유전자의 단백질을 검출하며, 그 피검물질이 HCV 게놈 RNA 의 복제 또는 바이러스 입자의 형성을 촉진 또는 억제하는지의 여부를 판정함으로써, HCV 의 증식을 촉진 또는 억제하는 물질을 스크리닝할 수 있 다.

상기 HCV 게놈 RNA, 바이러스 입자 또는 리포터 유전자의 단백질의 검출은 상술의 방법 또는 후술의 실시예에 따라 행할 수 있다. 상기 시험계는 HCV 감염의 예방제, 치료제 혹은 진단제의 제조 또는 평가를 위해서도 사용할 수 있다.

구체적으로는, 본 발명의 상기 시험계의 이용예로서는 이하가 예시된다.

(1) HCV 의 증식 및 감염을 억제하는 물질의 탐색

HCV 의 증식 및 감염을 억제하는 물질로서는, 예를 들면 직접적 혹은 간접적으로 HCV 의 증식 및 감염에 영향을 미치는 유기 화합물, 혹은 HCV 게놈 혹은 그 상보쇄의 표적 서열에 혼성화함으로써 HCV 의 증식 혹은 HCV 단백질의 번역에 직접적 또는 간접적으로 영향을 미치는 안티센스 올리고 뉴클레오티드 등이 예시된다.

(2) 세포배양 중에서 항바이러스 작용을 갖는 각종 물질의 평가

상기 각종 물질로서는 합리적 드래그 디자인 또는 하이스루풋 스크리닝을 이용하여 얻어진 물질(예를 들면 단리 정제된 효소) 등이 예시된다.

(3) HCV 에 감염된 환자의 치료를 위한 신규공격 표적의 동정(同定)

예를 들면 HCV 바이러스 복제를 위해 중요한 역할을 다하는 숙주세포성 단백질을 동정하기 위해, 본 발명에 따른 HCV 게놈 RNA 복제세포를 사용할 수 있다.

(4) HCV 바이러스의 약제 등에 대한 내성획득능의 평가 및 상기 내성에 관한 변이의 동정

(5) C 형 간염 바이러스 감염의 진단약 또는 치료약의 개발, 제조 및 평가를 위해 사용 가능한 항원으로서의 바이러스 단백질의 제조

(6) C 형 간염 바이러스 감염의 백신의 개발, 제조 및 평가를 위해 사용 가능한 항원으로서의 바이러스 단백질 및 약독화 HCV 의 제조

(7) C 형 간염 바이러스를 벡터로 이용한 유전자 치료

또한, 본 발명은 상기 변이 HCV 의 바이러스 입자에 관한 것이다.

상기 변이 HCV 의 바이러스 입자는 리포터 유전자와 HCV 게놈 RNA 를 포함하는 변이 C 형 간염 바이러스 세포를 배양하고, 배양물 중에서 얻어지는 것을 특징으로 하는 HCV 바이러스 입자 (HCV) 재조합 게놈을 포함하는 폴리뉴클레오티드 또는 효율적으로 HCV 의 감염을 유도할 수 있는 서열번호 1 의 JFH1 주의 게놈 RNA 의 E2 영역 및 p7 영역으로 이루어진 군 중에서 선택된 1 이상의 영역에 1 이상의 염기서열이 치환된 것인 변이 HCV 게놈을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 변이 HCV 의 바이러스 입자일 수 있다.

또한, 상기 변이 HCV 의 바이러스 입자는 상기 형질전환체를 배양한 배양물에서 얻어지는 것일 수 있다.

상기 배양물은 상기 형질전환체를 배양한 배양액으로서, 배양세포가 없거나 배양세포가 있는 것을 포함한다.

상기 폴리뉴클레오티드, 변이 HCV 재조합 게놈 RNA 또는 상기 변이 HCV 게놈 RNA 를 숙주세포 내로 형질전환시킨 세포 즉, 형질전환체는 HCV 바이러스 입자를 in vitro 에서 생산할 수 있다. 즉, 상기 형질전환체를 적당한 배지에서 배양하고, 그 배양물(바람직하게는 배양액)에서 생산된 바이러스 입자를 채취함으로써 HCV 입자를 간단하게 수득할 수 있다. 상기 배양물 속에 방출된 변이 HCV 의 바이러스 입 자는 세포, 바람직하게는 HCV 감수성 세포로의 감염능을 갖는다.

또한, 본 발명은 상기 변이 HCV 의 바이러스 입자가 감염된 것을 특징으로 하는 HCV 감염세포일 수 있다.

상기 HCV 감염세포는 상기 변이 HCV 의 바이러스 입자가 감염되어, 리포터 유전자와 HCV 게놈 RNA 를 포함하는 변이 C 형 간염 바이러스(HCV) 재조합 게놈을 포함하는 폴리뉴클레오티드 또는 효율적으로 HCV 의 감염을 유도할 수 있는 서열번호 1 의 JFH1 주의 게놈 RNA 의 E2 영역 및 p7 영역으로 이루어진 군 중에서 선택된 1 이상의 영역에 1 이상의 염기서열이 치환된 것인 변이 HCV 게놈을 포함하는 폴리뉴클레오티드가 도입된 것을 특징으로 하며, 상기 변이 HCV 의 바이러스 입자가 감염되는 대상 세포는 상기 숙주세포일 수 있다.

본 발명은 또한, 상기 형질전환체를 배양하는 단계; 및 상기 배양물 또는 바이러스 입자를 대상세포, 바람직하게는 상기 숙주세포, 더욱 바람직하게는 HCV 감수성 세포에 감염시키는 단계를 포함하는 HCV 감염세포의 제조방법에 관한 것이다.

상기 HCV 감수성 세포는 HCV 에 대하여 감염성을 갖는 세포이며, 바람직하게는 간장세포 또는 임파구계 세포일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 구체적으로, 상기 간장세포는 일 에로 초대간장세포나 Huh7 세포, HepG2 세포, IMY-N9 세포, HeLa 세포, 또는 293 세포 등일 수 있고, 임파구계 세포는 Molt4 세포, HPB-Ma 세포 또는 Daudi 세포 등 일 수 있으나, 이들에 한정되는 것은 아니다. 상기 Huh7 세포는 HCV 에 감염이 잘 된다고 알려진 Huh 7.5.1 세포주 또는 Huh 7.5.9 세포주일 수 있다.

상기 HCV 바이러스 입자를 세포, 예를 들면 HCV 감수성 세포에 감염시키면, 그 감염세포에서 상기 폴리뉴클레오티드 또는 변이 HCV 의 게놈 RNA 가 복제되거나 바이러스 입자가 형성될 수 있다. 따라서, 본 발명의 형질전환체를 이용하여 생산된 바이러스 입자를 세포에 감염시킴으로써, 상기 폴리뉴클레오티드 또는 변이 HCV 의 게놈 RNA 가 상기 감염세포에서 복제될 수 있으므로, 상기 바이러스 입자를 더 많이 제조할 수 있다.

상기 HCV 바이러스 입자는 침팬지 등 HCV 에 감염될 수 있는 동물에 감염시켜 HCV 유래의 간염 등의 질병을 유도할 수 있다.

본 발명은 또한 상기 변이 HCV 바이러스 입자 또는 그 일부분을 항원으로서 사용해서 얻어질 수 있는 것을 특징으로 하는 C 형 간염 백신 및 중화항체로 이루어진 군에서 선택된 1 이상에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 상기 HCV 바이러스 입자 또는 그 일부분을 항원으로 하거나 세포지향성을 바꾸기 위해 바이러스 외각단백질을 재조합해서 제조한 입자 또는 그 일부분을 항원으로 해서, C 형 간염 백신 혹은, 외각단백질을 재조합하는데 사용한 바이러스에 대한 백신을 제조하는 방법에 관한 것이다.

또한, 본 발명에 따른 HCV 바이러스 입자 또는 그 일부분을 항원으로서, 혹은 세포지향성을 바꾸기 위해 바이러스 외각단백질을 재조합하여 제조된 입자 또는 그 일부분을 항원으로서 이용하여 HCV 의 감염 중화 항체를 작성할 수도 있다.

또한, 본 발명은 상기 폴리뉴클레오티드, 상기 HCV 바이러스 입자 또는 그 일부분을 이용하여 유전자 치료를 하는 방법에 관한 것이다. 상기 유전자 치료 방 법은 본 발명의 특정 물질, 즉 상기 폴리뉴클레오티드, 상기 HCV 바이러스 입자 또는 그 일부분을 이용한다는 것을 특징으로 하며, 바이러스 게놈 RNA 또는 이의 일부 등을 이용하는 공지의 유전자 치료 방법을 응용할 수 있다.

본 발명은 또한 피검물질의 존재 하에서 리포터 유전자와 HCV 게놈 RNA 를 포함하는 변이 C 형 간염 바이러스(HCV) 재조합 게놈을 포함하는 폴리뉴클레오티드 또는 효율적으로 HCV 의 감염을 유도할 수 있는 서열번호 1 의 JFH1 주의 게놈 RNA 의 E2 영역 및 p7 영역으로 이루어진 군 중에서 선택된 1 이상의 영역에 1 이상의 염기서열이 치환된 것인 변이 HCV 게놈을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 숙주세포에 도입하고 배양하는 단계; 및 상기 피검물질의 항 HCV 효과를 평가하는 단계를 포함하는 항 HCV 물질의 스크리닝 방법일 수 있다.

일 예로, 피검물질의 존재 하에서 상기 리포터 유전자를 가진 HCV 게놈 RNA 또는 상기 HCV JFH1 주의 돌연변이의 게놈 RNA 를 도입하여, 상기 HCV 게놈 RNA 를 복제하고 또한 HCV 바이러스 입자를 생산할 수 있는 것을 특징으로 하는 세포 또는 상기 HCV 가 감염된 형질전환체를 배양하고, 배양물 중의 HCV 게놈 RNA 또는 상기 HCV 바이러스 입자를 검출하며, 그 피검물질이 레플리콘 RNA 혹은 HCV 게놈 RNA 의 복제 또는 바이러스 입자의 형성 혹은 방출을 촉진 또는 억제하는지의 여부를 판정함으로써, C 형간염 바이러스의 증식을 촉진 또는 억제하는 물질을 스크리닝할 수 있다. 이 경우, 배양물 중의 HCV 게놈 RNA 의 검출은, 상기 세포로부터 추출한 RNA 중의 HCV 게놈 RNA 의 양, 비율 혹은 유무를 측정하는 것에 의한 것으로서 좋다. 배양물(주로 배양액) 중의 바이러스 입자의 검출은 배양액 속에 함유되는 HCV 단백 질의 양, 비율 혹은 유무를 검출하는 것이거나 리포터 유전자의 단백질의 발현량을 측정하는 것일 수 있다.

상기 항 HCV 효과는 HCV 저해 효과, HCV 의 도입 저해, HCV 게놈 RNA 의 복제 저해 및 HCV 단백질의 발현 저해 등을 포함한다.

상기 피검물질의 항 HCV 효과를 평가하는 단계는 상기 배양물 중의 상기 변이 HCV 의 핵산 또는 바이러스 입자를 존재, 정량 및 활성으로 이루어진 군중에서 선택된 1 이상을 측정하는 방법으로 수행하거나 상기 배양물 중의 리포터 유전자 또는 리포터 유전자의 발현물인 리포터 단백질의 존재, 정량 및 활성으로 이루어진 군중에서 선택된 1 이상을 측정하는 방법으로 수행할 수 있다.

일 예로, 리포터 유전자인 레닐라 루시퍼라아제(Renilla luciferase) 또는 녹색 형광 단백질(Green fluorescence protein)의 유전자를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 이용한 경우에는 루시퍼라아제 활성 또는 형광 단백질의 정량 즉, 형광 단백질에 의한 형광 정도를 측정하여 항 HCV 효과를 평가할 수 있다.

상기 항 HCV 효과의 평가는 피검물질의 사용여부 또는 피검물질의 농도에 따라 상기 변이 HCV 의 핵산 또는 바이러스 입자가 감소하였는지 또는 상기 리포터 유전자의 발현물이 감소하였는지 여부를 판단하는 방법으로 수행할 수 있다.

또한, 상기 리포터 유전자를 가진 폴리뉴클레오티드를 이용하는 경우, 항 HCV 물질 또는 HCV 저해제를 정량적으로 스크리닝하는 것이 가능하고, 개개의 세포에서의 항 HCV 효과를 정량적으로 측정할 수 있다.

또한, 본 발명은 리포터 유전자와 HCV 게놈 RNA 를 포함하는 변이 C 형 간염 바이러스(HCV) 재조합 게놈을 포함하는 폴리뉴클레오티드 또는 효율적으로 HCV 의 감염을 유도할 수 있는 서열번호 1 의 JFH1 주의 게놈 RNA 의 E2 영역 및 p7 영역으로 이루어진 군 중에서 선택된 1 이상의 영역에 1 이상의 염기서열이 치환된 것인 변이 HCV 게놈을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 숙주세포에 도입하고 배양하는 단계; 및 상기 HCV 감염을 정량적으로 측정하는 단계를 포함하는 HCV 감염의 정량적 측정방법일 수 있다.

상기 HCV 감염을 정량적으로 측정하는 단계는 상기 폴리뉴클레오티드, 변이 HCV 게놈, 또는 변이 HCV 재조합 게놈의 양을 측정하거나, 상기 리포터 유전자의 단백질의 발현량을 측정하는 방법으로 수행할 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드의 양의 정량적 측정은 통상의 핵산의 정략적 측정법에 의할 수 있으며, 상기 단백질의 발현량은 리포터 유전자의 단백질 즉, 리포터 단백질의 양 또는 형광 정도의 정량적 측정법에 의할 수 있다.

또한, 본 발명은 리포터 유전자와 HCV 게놈 RNA 를 포함하는 변이 C 형 간염 바이러스(HCV) 재조합 게놈을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 도입하여, 상기 HCV 게놈 RNA 를 복제하고 또한 바이러스 입자를 생산할 수 있는 것을 특징으로 하는 세포 또는 상기 리포터 유전자를 포함하는 변이 HCV 를 배양하고, 리포터 유전자가 발현된 단백질을 정량하여 HCV 의 감염이 용이한 세포를 검출할 수 있는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 외래 유전자를 암호화(coding)하는 RNA 를 상기 리포터 유전자와 HCV 게놈 RNA 를 포함하는 변이 C 형 간염 바이러스(HCV) 재조합 게놈을 포 함하는 폴리뉴클레오티드 또는 효율적으로 HCV 의 감염을 유도할 수 있는 서열번호 1 의 JFH1 주의 게놈 RNA 의 E2 영역 및 p7 영역으로 이루어진 군 중에서 선택된 1 이상의 영역에 1 이상의 염기서열이 치환된 것인 변이 HCV 게놈을 포함하는 폴리뉴클레오티드에 삽입하고, 이것을 목적으로 하는 세포 중에 도입해서 복제 또는 발현시키는 것을 특징으로 하는, 세포 내에서 외래 유전자를 복제 및/또는 발현시키는 방법에 관한 것이다.

본 발명에서는 외래 유전자를 암호화하는 RNA 를 상기 HCV 게놈 RNA 에 삽입하고, 상기 외래 유전자를 암호화하는 RNA 가 삽입된 HCV 게놈 RNA 를 세포에 도입함으로써, 상기 외래 유전자를 세포 중에 도입하여 세포내에서 복제시키고 발현시킬 수 있다.

또한, 상기 HCV 게놈 RNA 중의 E1 단백질 코드 서열, 및/또는 E2 단백질 코드 서열을, 다른 생물 종 유래의 바이러스의 외각단백질로 변환한 RNA 를 제조하고, 상기 RNA 를 세포 내에 도입해서 바이러스 입자를 제조함으로써, 그 RNA 를 다양한 생물 종의 세포에 감염시킬 수도 있게 된다. 이 경우에도 상기 HCV 게놈 RNA 에 외래유전자를 추가로 도입시킴으로써, 상기 외래유전자를 상기 재조합한 바이러스 외각단백질의 지향성에 의존하여, 각종 세포에서 발현시키기 위한 세포지향성 바이러스 벡터로서 사용할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 HCV 게놈 RNA 에 외래유전자를 암호화하는 RNA 를 삽입하는 단계; 상기 외래유전자를 암호화하는 RNA 가 삽입된 HCV 게놈 RNA 를 숙주세포에 유입시켜 형질전환체를 제조하는 단계 및 상기 형질전환체를 배양해서 바이 러스 입자를 제조시키는 단계를 포함하는 외래유전자를 함유하는 바이러스벡터를 제조하는 방법에 관한 것이다.

하기 실시예를 들어 본 발명을 더욱 자세히 설명할 것이나, 본 발명의 보호범위가 하기 실시예로 한정되는 의도는 아니다.

＜실시예 1＞

리포터 단백질을 발현하는 JFH 5a-GFP 와 JFH 5a-Rluc 플라스미드 클로닝

1-1: JFH 5a-Pmel 클로닝

도 1 에 나타난 종래 JFH 구조(JFH construct)의 NS5a 부위에 리포터 단백질을 발현시키기 위하여, 보다 구체적으로 JFH 플라스미드(Dr. Wakita 제공)의 2394 번째 아미노산과 2395 번째 아미노산(NS5a 의 418 번째 아미노산과 419 번째 아미노산) 사이에 리포터 단백질을 발현키기 위하여, 상기 부위에 대응하는 JFH1 genome 의 위치에 Pme 1 제한효소로 잘리는 염기서열을 넣는 클로닝을 수행하였다.

보다 상세하게, 클로닝은 하기 표 1 의 2 쌍의 프라이머 및 주형(template)인 서열번호 1 의 JFH1 플라스미드 이용하여 중합효소연쇄반응(PCR)을 통해 2 개의 DNA 를 증폭시켰다.

[표 1]

상기 중합효소연쇄반응을 통하여 증폭된 2 개의 DNA 조각을 PCR 을 통하여 합치고, 제한효소 Rsr II 와 Hpa I 을 이용하여 상기 JFH1 플라스미드에 치환시켰다. 상기 치환에 의해 올바르게 제작된 DNA 인지 여부는 DNA 서열분석으로 수행하였다.

1-2: JFH 5a-GFP 및 JFH 5a-Rluc 클로닝

레닐라루시퍼라아제(Renilla luciferase)와 녹색형광단백질(GFP)을 암호화하는 DNA 를 하기 표 2 에 기재된 프라이머로 증폭시켰다.

[표 2]

상기 중합효소연쇄반응을 통하여 증폭된 DNA 를 EcoR V 및 SnaB I 제한효소 로 처리하여 삽입체(insert)를 제조하고, Pmel 제한효소로 처리한 상기 실시예 1-1 의 JFH 5a- Pmel 플라스미드에 삽입하였으며, 상기 삽입체가 들어간 클론들을 찾아냈다. 상기 레닐라루시퍼라제(Rulc)가 삽입된 클론을 JFH 5a-Rluc 라 명명하였고, 상기 녹색형광단백질(GFP)가 삽입된 클론을 JFH 5a-GFP 라 명명하였다.

＜실시예 2＞

JFH 5a-GFP 및 JFH 5a-Rluc 바이러스 감염

2-1: JFH 5a-GFP RNA 및 JFH 5a-Rluc RNA 합성

상기 삽입체가 들어간 플라스미드(JFH 5a-GFP 및 JFH 5a-Rluc)를 전사하여 RNA 를 합성하였다. 구체적으로, 16 ㎍의 플라스미드 주형을 제한효소 XbaI 으로 처리하고, 단일가닥을 mung bean nuclease 로 처리하여 제거하였다. 페놀 추출과 에탄을 추출을 통하여 잘려진 DNA 주형을 분리하였다. T7 RNA 중합효소(stratagem 사)를 이용하여 RNA 를 합성하고, DNA 주형은 DNase I(ambion 사)를 이용하여 분해시켰다. RNA 를 페놀 추출과 에탄올 추출을 통하여 분리하고, nuclesse free water 에 녹인 후, UV 스펙트로포토미터(spectrophothmeter)를 이용하여 정량하였다. 정량된 RNA 를 1％ 아가로스겔에 로딩하여 RNA 가 제대로 형성되었는지 확인하였다.

2-2: JFH 5a-GFP 및 JFH 5a-Rluc 바이러스 제작 및 감염

상기 실시예 2-1 에서 제조된 RNA 와 JFH RNA 및 negative control 인 HCV 의 복제를 담당하는 RNA 중합효소인 NS5b 의 촉매(효소)부위(GOD 아미노산)를 변이시킨 복제가 불가능한 JFG POI^-RNA 를 일렉트로포레이션법(electroporation)으로 숙 주세포(Huh 7.5.1 cell line)에 도입시켜, 감염된 숙주세포에서 발현된 바이러스 단백질(viral protein)을 비교하였다.

보다 구체적으로, 감염 3 일 후, NS5a 단백질과 core 단백질의 발현 정도를 Ralf Barten-schlager(University of Heidelberg)로부터 얻은 anti-NS5a 항체와 anticore 항체를 이용하여 웨스턴블럿팅법으로 정량분석하였으며, 그 결과를 도 2 에 나타내었다.

상기 도 2 에 나타낸 바와 같이, 레닐라루시퍼라아제(Renilla luciferase)와 녹색형광단백질(GFP)에 해당하는 단백질이 잘 발현되었고, JFH 와 JFH 5a-GFP RNA 로 감염된 숙주세포에서 유사한 량의 core 단백질이 발현되었다. 또한, JFH 5a-Rluc RNA 로 감염된 숙주세포의 경우, JFH 에 비하여 많은 량의 core 단백질이 발현되는 것으로 확인되었다. 한편, JFG Pol^- RNA 로 감염된 숙주세포에서는 어떠한 NS5a 단백질이나 코어 단백질도 발견되지 아니하였다.

2-3: JFH 5a-GFP 및 JFH 5a-Rluc 바이러스 감염 세포에서의 루시퍼라아제 활성 및 녹색 형광의 확인

상기 실시예 2-1 에서 제조된 RNA, JFH RNA 및 JFH Pol^-RNA 를 일렉트로포레이션법(electroporation)으로 숙주세포(Huh 7.5.1 cell line)에 도입시켜, 세포를 형질전환시켜 형질전환체를 제조하였다. 상기 형질전환체를 8 일간 배양한 후에, 상기 형질전환체를 제거한 즉, 세포를 제거한( cell-free) 배양액 100 ㎕를 수득하였다. 상기 수득한 배양액에 대해 원심분리를 수행한 후에, 0.45 ㎛ 필터를 통과시 켰다. 상기 필터를 통과시킨 배양액을 이용하여 숙주세포(Huh 7.5.1 cell line)를 감염시켰다.

상기 상기 실시예 2-1 에서 제조된 RNA, JFH RNA 및 JFH Pol^-RNA 를 도입시킨 형질전환체의 배양액으로 감염시킨 Huh 7.5.1 cell 을 3 일간 배양한 후에, 감염된 세포로부터 전체 세포 RNA(total cellular RNA)를 배양액으로부터 분리하고, HCV-RNA 의 양을 정량적 reverse transcription-PCR(quantitative RT-PCR) 구체적으로, real-time reverse transcription-PCR(real-time RT-PCR)을 통하여 측정하였다. GADPH(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase) mRNA 를 내부 RNA 대조군(internal RNA control)로 사용하였으며, 그 결과를 도 3 에 나타내었다.

상기 도 3 의 HCV RNA 의 수준은 세포내 RNA 1 ㎍ 당 복제수(copy number)를 표현한 것이다. 상기 도 3 에 나타낸 바와 같이, JFH, JFH 5a-GFP 및 JFH 5a-Rluc 에 의해 감염된 형질전환체는 유사한 수준의 HCV RNA 가 측정되었으나, JFH Pol^- RNA 를 감염시킨 형질전환체에 대해서는 HCV RNA 가 검출되지 아니하였다.

또한, 상기 JFH 5a-Rluc 를 감염시킨 형질전환체를 감염시킨 형질전환체를 감염 후 1 일, 2 일 및 3 일이 경과한 시점에서 감염된 세포에서 발현되는 루시퍼라아제의 활성을 각각 측정하였으며, 그 결과를 도 4 에 나타내었다. 상기 JFH Pol^- RNA 를 감염시킨 형질전환체에 대해 상기와 같은 방법으로 루시퍼라아제 활성을 측정하여 음성 대조군으로 사용하였다.

상기 도 4 에 나타낸 바와 같이, JFH Pol^- RNA 를 감염시킨 형질전환체에 대해서는 아무런 활성도 관찰되지 아니한 반면, JFH 5a-GFP 를 감염시킨 형질전환체의 경우 시간이 경과함에 따라 루시퍼라아제 활성이 증가하였다. 상기 시간이 경과함에 따라 감염된 세포에서 발현되는 레닐라 루시퍼라아제가 증가한 결과로부터, JFH 5a-GFP 를 감염시킨 형질전환체는 루시퍼라아제 활성을 측정함으로써 바이러스 감염을 민감하고 정략적으로 측정할 수 있는 시스템을 제공할 수 있는 것으로 확인되었다.

또한, 상기 JFH 5a-GFP 를 감염시킨 형질전환체의 감염성을 형광현미경을 이용하여 측정하였다. 보다 상세하게는 상기 바이러스가 감염되지 않은(

) Huh 7.5.1 cell 을 상기 실시예 2-1 에서 제조된 RNA, JFH RNA 및 JFH Pol^-RNA 를 도입시킨 형질전환체의 배양액과 함께 배양한 후, 감염여부를 HCV 코어 단백질에 대한 항체를 이용한 면역세포화학적 방법(immunocytochemical method)으로 확인하였으며, 그 결과를 도 5 에 나타내었다.

상기 도 5 에 나타낸 바와 같이, JFH, JFH 5s-GFP 및 JFH 5a-Rluc 바이러스에 의한 감염이 쉽게 확인되었으나, JFH Pol^- RNA 를 감염시킨 형질전환체에 대해서는 아무런 붉은 부분이 확인되지 아니하여, 바이러스가 복제되지 아니하는 것으로 확인되었다(도 5 의 a 내지 d). 또한, JFH 5a-GFP 를 감염시킨 경우, 감염된 세포에서 코어 단백질과 NS5a-GFP 단백질이 발현되는지 형광 현미경을 통해서 조사한 결과, 코어 단백질이 발현되는 같은 세포 중, JFH 5a-GFP 바이러스에 의해 감염된 경우에만, NS5a-GFP 단백질의 녹색 형광이 관찰되어, NS5a-GFP 단백질의 녹색 형광을 관찰하는 것만으로 바이러스에 감염된 세포를 관찰할 수 있음이 확인되었다.

＜실시예 3＞

바이러스 억제제의 항바이러스 효과 검증

바이러스 치료제로 사용되는 인터페론-α(INF-α), 리바비린(Ribavirin) 및 NS3 프로테아제 저해제(NS3 protease inhibitor)인 BILN 2061 을 처리하고 항바이러스 효과가 보이는지, 민감하고 정략적으로 바이러스 감염의 측정이 가능한지 JFH 5a-Rluc 를 감염시킨 형질전환체를 이용하여 조사하였다.

3-1: 바이러스 억제제의 항바이러스 효과 검증

상기 실시예 2-1 에서 제조된 JFH 5a-Rluc RNA 를 일렉트로포레이션법(electroporation)으로 숙주세포(Huh 7.5.1 cell line)에 도입시켜 형질전환시킨 형질전환체의 배양액을 이용하여 숙주세포(Huh 7.5.1 Cell line)를 감염시킨 후에, 바이러스 억제제를 3 일 동안 같은 양으로 유지하였다. 상기 바이러스 억제제는 인터페론-α, 리바비린 및 BILN 2061 을 사용하였다. 3 일간 바이러스 억제제를 처리한 후, 숙주세포를 수득하고, 루시퍼라아제의 활성을 각각 측정하였으며, 상기 바이러스 억제제 별로 그 결과를 도 6 내지 도 8 에 나타내었다.

상기 도 6 내지 도 8 은 바이러스 억제제를 처리하지 않은 경우의 루시퍼라아제 활성을 1 로 하여, 상기 바이러스 억제제의 농도 별로 정량화하였다. 상기 도 6 및 도 7 에 나타난 인터페론-α 와 BILN 2061 의 JFH 5a-Rluc RNA에 대한 치료 유효 농도(median effective concentration)는 기존에 보고된 J6/JFH 바이러스를 이용한 경우와 유사하였다. 이는 이형 폴리펩타이드를 포함하는 형질전환된 JFH 5a-Rluc RNA 가 JFH 와 유사한 방식으로 항바이러스제에 반응한다는 것을 나타낸다.

상기 도 6 내지 도 8 의 결과는 JFH 5a-Rluc RNA 는 간단한 방법으로 항바이러스 효과를 정량적으로 측정할 수 있다는 것을 나타낸다. 또한, 상기 도 6 내지 도 8 의 결과는 외래 유전자가 도입되어, 이에 상응하는 이형 폴리펩타이드를 포함하는 JFH 5a-Rluc RNA 는 이형 폴리펩타이드를 포함하지 않는 HCV 인 JHF 와 항바이러스제에 대한 유사 반응을 보이며, HCV 와 유사한 생활사를 보인다는 것을 나타낸다.

따라서, JFH 5a-Rluc RNA 는 실제 HCV 와 유사한 항바이러스 효과를 확인할 수 있으므로, 본 발명의 리포터 유전자를 가진 HCV 는 새로운 바이러스 억제제를 탐색할 수 효과적인 시스템을 제공할 수 있다.

3-2: 개개의 세포를 이용한 인터페론-α 의 항바이러스 효과의 실시간 검증

상기 실시예 2-1 에서 제조된 JFH 5a-GFP RNA 를 일렉트로포레이션법(electroporation)으로 숙주세포(Huh 7.5.1 cell line)에 도입시켜 형질전환시킨 형질전환체의 배양액을 이용하여 숙주세포(Huh 7.5.1 cell line)를 감염시켜 JFH 5a-GFP 가 감염 형질전환체를 제조하였다.

상기 형질전환체에 인터페론-α 를 처리하거나 처리하지 않은 후, 간헐촬영 공초첨 현미경(time-lapse confocal microscopy, Zeiss LSM 5 Live)을 이용하여 매 12 시간마다 60 시간까지 NS5a-GFP 단백질의 녹색형광발현 모습을 관찰하였다. 간헐촬영을 위해서, 온도와 공기가 제어되는 챔버(a temperature- and gas-controlled chamber)에 장착된 현미경위에 coverslip 을 위치시켜 촬영하였으며, 인터페론-α 처리 여부에 따른 결과를 도 9 및 도 13 에 나타내었다.

또한, 형광이미지(fluorescence image)의 정량적 분석은 촬영된 사진 중에서 8 개의 세포를 선택하여, NS5a-GFP 단백질의 형광세기 MetaMorph software 를 이용하여 분석하는 방법으로 수행하였으며, 그 결과를 인터페론-α 처리 여부에 따라 도 10 내지 12 및 도 14 내지 16 에 나타내었다. 상기 8 개의 세포의 선택은 5a-GFP 단백질의 형광세기의 분석을 통하여 수행하였다.

상기 도 10 및 도 14 는 각각 형광정도로 선택된 8 개의 형질전환체의 시간에 따른 형광정도의 변화를 측정된 절대값으로 나타낸 그래프이고, 도 11 및 도 15 는 각각 형광정도로 선택된 8 개의 형질전환체의 시간에 따른 형광정도의 변화를 초기값을 기준으로 즉, 초기값으로 나누어 계산된 상대값으로 나타낸 그래프이며, 도 12 및 도 16 은 각각 형광정도로 선택된 8 개의 형질전환체의 시간에 따른 형광정도의 평균값 즉, 전체 세포의 형광정도와 8 개의 형질전환체의 형광정도로부터 구한 상대값으로 나타낸 그래프이다.

상기 도 9 내지 도 16 에서 확인된 바와 같이, 인터페론-α 처리하지 않은 경우에는 형광정도가 증가하였으나, 인터페론-α 처리한 경우에는 형광정도가 8 개 중 7 개의 형질전환체에서 감소하였으며, 각 형질전환체 별로 형광정도의 증가 또는 감소 정도가 상이하였다.

상기한 결과로부터 JFH 5a- GFP RNA 는 실시간으로 살아있는 HCV 의 복제정도를 확인할 수 있고, 각 형질전환체 별로 즉, 세포별로 HCV 의 복제정도를 확인할 수 있으며, 개개의 세포에서 억제제에 대한 항바이러스 효과가 가능하다는 것을 확인할 수 있는 효과적인 시스템을 제공할 수 있다는 것을 확인하였다.

＜실시예 4＞

감염이 잘 되는 세포주 선별

바이러스 감염이 잘 된다고 보고된 Huh 7.5.1 세포주(Francis Chisari at Scripps Research Institute)를 연속 2 배 희석법(consecutive two-fold dilution method), 즉, 96 well plate 를 이용하여 절반의 농도로 여러 번 희석함으로써 한 개의 세포가 한 well 에 자랄 수 있도록 수행하여, 개개의 세포로 분리하였다.

상기 개개의 세포로 분리한 세포를 키워서 71 개의 독립된 세포주를 제조한 후, 각각의 세포주들에 정량이 가능한 JFH 5a-Rluc 바이러스를 감염시키고, 감염된 세포를 37℃ 및 6％의 CO₂ 조건에서 항생제(penicillin 100U/ml; streptomycin 10 ㎍/ml)이 포함된 Dulbecco's modified Eagle's medium(Gibco)와 10％ fetal bovine serum(Sigma)의 배지에서 배양하였고, 세포 안에 발현되는 레닐라 루시퍼라아제 발현여부를 tissue culture 50％ in-fectivity dose(TCID₅₀)을 계산하는 방법으로 조사하여 도 17 에 나타내었다.

상기 도 17 에 나타낸 바와 같이, 레닐라 루시퍼라아제 활성이 가장 우수하고, Huh 7.5.1 세포주보다 2 배 이상 간염이 잘되는 것으로 세포주를 찾아 Huh 7.5.9 라고 명명하였다. 이 외에도 Huh 7.5.1 세포주보다 20 내지 30％ 정도로 바이러스 감염이 감소된 세포주도 분리할 수 있었다.

＜실시예 5＞

세포적응 돌연변이를 가진 JFH 5a-GFP 플라스미드 클로닝

5-1: 세포적응 돌연변이가 있는 구조 단백질을 코딩하는 DNA 의 증폭

분리된 세포주들에 JFH 5a-GFP RNA 를 감염시키고, 감염 후, 20 일간 상기 실시예 5-1 의 배양조건 및 배양배지에서 20 일간 배양하였으며, 감염 후, 6 일 및 20 일이 경과된 후, 배양액을 수득하여 감염여부를 확인하였으며, 그 결과를 도 18 에 나타내었다. 상기 상기 6 일 및 20 일이 경과된 시점에서 배양액을 수득하여, 상기 분리된 Huh 7.5.9 세포와 배양하여 JFH 5a-GFP RNA 감염을 유도하였다. 상기 JFH 5a-GFP RNA 가 감염된 세포에서 코어단백질의 발현 여부를 감염 후, 5 일된 시점에서 면역세포화학적 방법으로 확인하였으며, 그 결과를 도 19 내지 도 21 에 나타내었다.

상기 도 18 에 나타낸 바와 같이, 20 일 동안 배양한 배양액을 이용한 경우, 거의 모든 세포가 감염된 것을 확인하였으나, 6 일 동안 배양한 배양액을 배양액의 경우, 약간의 세포에서만 감염이 진행된 것을 확인하였다. 상기 결과는 20 일 동안 배양한 배양액의 경우, 고효율로 감염을 진행시킬 수 있는 적응변이(adaptive mutation)가 축적된 것임을 제안하였다.

한편, 상기 도 19 에 나타낸 바와 같이, 상기 분리된 Huh 7.5.9 세포와 배양하여 JFH 5a-GFP RNA 감염을 유도한 클론 중, 세 개의 클론 즉, Ad 9, Ad 12 및 Ad 16 에서 코어 단백질과 NS5a-GFP 단백질이 모두 발현되는 것으로 확인되었다.

따라서, 상기 배양액으로 감염시킨 세포에서 전체 RNA 를 분리하였다. 적응변이를 확인하기 위하여, 역전사 중합 효소 반응(RT-PCR)을 통해 바이러스 구조 단백질(structural region)인 코어단백질부터 NS2 까지의 영역의 cDNA 를 합성하였다. 상기 역전사 중합 효소 반응은 하기 표 3 의 역전사 프라이머와 상기 분리된 전체 RNA 를 이용해 Expand 역전사 중합효소(Roche 사)를 이용하여 43℃에서 1 시간 반응시켜 수행하였고, 하기 표 3 의 프라이머와 Expand 역전사 중합효소(Roche 사)를 이용하여 상기 cDNA 를 증폭하였다.

[표 3]

5-2: 세포적응 돌연변이를 가진 JFH 5a-GFP 플라스미드 클로닝과 RNA 합성

상기 실시예 6-1 에서 증폭된 DNA 를 Avr II 및 Ag I 제한효소로 잘라서 같은 제한효소로 자른 JFH 5a-GFP 에 치환하였다. 올바르게 삽입체가 들어간 클론 12 개를 찾아내었다. 12 개의 클론을 제한효소 Xba I 으로 처리하고, 페놀 추출 에탄올 침전을 통하여 잘려진 DNA 주형을 분리하였다. T7 RNA 중합효소(Stratagen 사)를 이용하여 RNA 를 합성하였다. DNA 주형을 DNase I(Ambion 사) 처리하여 분해시킨 후, UV 스펙트로포토미터(UV spec-trophotometer)를 이용하여 정량하였다.

5-3: 세포적응 돌연변이를 가진 JFH 5a-GFP 바이러스 제작 및 감염 효율 측 정

상기 실시예 6-2 에서 합성된 RNA 를 세포에 일렉트로포레이션 방법으로 도입시켜 형질전환시켰다. 3 일 후, 세포에서 코어 단백질과 NS5a-GFP 단백질이 잘 발현되는지 여부를 형광현미경을 통하여 조사하여 도 18 에 나타내었다.

또한, 상기 실시예 6-2 에서 합성된 RNA 를 세포에 일렉트로포레이션 방법으로 도입시키고 7 일이 경과한 후에, 세포 배양액을 수득하여, 이를 이용하여 감염시키고, 감염된 세포에서 NS5a-GFP 단백질의 발현 정도를 형광 여부로 확인하여 감염 효율을 측정하였으며, 그 결과를 도 19 내지 도 23 에 나타내었다.

상기 도 19 내지 도 23 에 나타내 바와 같이, original 바이러스의 감염 정도와 비교했을 때, 9 번 클론의 바이러스가 감염이 가장 잘 되었고, 12 번의 클론의 바이러스도 역시 감염이 잘되었으나, 16 번 클론에서는 바이러스의 감염을 전혀 확인할 수 없었다. 상기 결과로부터 9 번 클론의 바이러스에 가장 많은 바이러스를 형성하는 세포적응 돌연변이가 있음이 확인되었으며, 16 번 클론에서는 바이러스 게놈 RNA 의 복제나 감염에 문제가 있는 돌연변이가 있음이 확인되었다.

＜실시예 6＞

바이러스 형성이 잘 되는 돌연변이 분리 및 확인

6-1: Ad9, Ad12 및 Ad16 클론 서열 분석

상기 실시예 5 에서 찾아진 Ad9, Ad12 및 Ad16 클론에 어떤 부분의 염기 서열이 바뀌었는지 알아보기 위해서 서열분석을 수행하였다. 치환된 모든 부분의 서열 분석을 수행하고 원래의 염기 서열과 비교하였으며, 그 결과를 도 24 및 도 25 에 나타내었다.

6-2: Ad9 클론에서 발견된 여러 염기 변화 중, 바이러스 형성 증가에 중요한 염기 변화 확인

Ad9 클론(JFH 5a-GFP ad#9 라고 명명, 도 1)에서 발견된 5 개의 염기변화 중에 바이러스 형성 증가에 중요한 염기변화를 확인하기 위해 각각의 염기 변화를 가지는 클론들을 제작하여 바이러스 형성을 조사하여 그 결과를 도 26 에 나타내었다.

상기 도 26 에 나타낸 바와 같이, E2 단백질 안의 변화(JFH 5a-GFP ad#9_1 라고 명명, 도 1)와 p7 단백질 안의 변화(JFH 5a-GFP ad#9_2 라고 명명, 도 1)가 바이러스 형성 증가에 중요한 역할을 함을 알 수 있었고(도 26 의 Ad 9_1 과 Ad9_2), 2 개의 돌연변이가 같이 있을 때(JFH 5a-GFP ad#34 라고 명명, 도 1), 바이러스 형성이 훨씬 증가한다는 것을 화인하였다(도 26 의 Ad 34).

<110> POSCO POSTECH Foundation <120> A EFFICIENTLY REPLICABLE HEPTITIS C VIRUS MUTANT, A HEPTITIS C VIRUS MUTANT COMPRISING REPORTER GENE, A METHOD OF PREPARING OF HCV VACCINE USING THE SAME AND A METHOD OF SCREENING ANTI HCV COMPOSITION USING THE SAME <160> 13 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 9678 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> JFH1 strain <400> 1 acctgcccct aataggggcg acactccgcc atgaatcact cccctgtgag gaactactgt 60 cttcacgcag aaagcgccta gccatggcgt tagtatgagt gtcgtacagc ctccaggccc 120 ccccctcccg ggagagccat agtggtctgc ggaaccggtg agtacaccgg aattgccggg 180 aagactgggt cctttcttgg ataaacccac tctatgcccg gccatttggg cgtgcccccg 240 caagactgct agccgagtag cgttgggttg cgaaaggcct tgtggtactg cctgataggg 300 cgcttgcgag tgccccggga ggtctcgtag accgtgcacc atgagcacaa atcctaaacc 360 tcaaagaaaa accaaaagaa acaccaaccg tcgcccagaa gacgttaagt tcccgggcgg 420 cggccagatc gttggcggag tatacttgtt gccgcgcagg ggccccaggt tgggtgtgcg 480 cacgacaagg aaaacttcgg agcggtccca gccacgtggg agacgccagc ccatccccaa 540 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caacccgcta tgcaggcttc atggcccaaa gtggaacaat tttgggccag 5640 acacatgtgg aacttcatta gcggcatcca atacctcgca ggattgtcaa cactgccagg 5700 gaaccccgcg gtggcttcca tgatggcatt cagtgccgcc ctcaccagtc cgttgtcgac 5760 cagtaccacc atccttctca acatcatggg aggctggtta gcgtcccaga tcgcaccacc 5820 cgcgggggcc accggctttg tcgtcagtgg cctggtgggg gctgccgtgg gcagcatagg 5880 cctgggtaag gtgctggtgg acatcctggc aggatatggt gcgggcattt cgggggccct 5940 cgtcgcattc aagatcatgt ctggcgagaa gccctctatg gaagatgtca tcaatctact 6000 gcctgggatc ctgtctccgg gagccctggt ggtgggggtc atctgcgcgg ccattctgcg 6060 ccgccacgtg ggaccggggg agggcgcggt ccaatggatg aacaggctta ttgcctttgc 6120 ttccagagga aaccacgtcg cccctactca ctacgtgacg gagtcggatg cgtcgcagcg 6180 tgtgacccaa ctacttggct ctcttactat aaccagccta ctcagaagac tccacaattg 6240 gataactgag gactgcccca tcccatgctc cggatcctgg ctccgcgacg tgtgggactg 6300 ggtttgcacc atcttgacag acttcaaaaa ttggctgacc tctaaattgt tccccaagct 6360 gcccggcctc cccttcatct cttgtcaaaa ggggtacaag ggtgtgtggg ccggcactgg 6420 catcatgacc acgcgctgcc cttgcggcgc caacatctct ggcaatgtcc gcctgggctc 6480 tatgaggatc acagggccta aaacctgcat gaacacctgg caggggacct ttcctatcaa 6540 ttgctacacg gagggccagt gcgcgccgaa accccccacg aactacaaga ccgccatctg 6600 gagggtggcg gcctcggagt acgcggaggt gacgcagcat gggtcgtact cctatgtaac 6660 aggactgacc actgacaatc tgaaaattcc ttgccaacta ccttctccag agtttttctc 6720 ctgggtggac ggtgtgcaga tccataggtt tgcacccaca ccaaagccgt ttttccggga 6780 tgaggtctcg ttctgcgttg ggcttaattc ctatgctgtc gggtcccagc ttccctgtga 6840 acctgagccc gacgcagacg tattgaggtc catgctaaca gatccgcccc acatcacggc 6900 ggagactgcg gcgcggcgct tggcacgggg atcacctcca tctgaggcga gctcctcagt 6960 gagccagcta tcagcaccgt cgctgcgggc cacctgcacc acccacagca acacctatga 7020 cgtggacatg gtcgatgcca acctgctcat ggagggcggt gtggctcaga cagagcctga 7080 gtccagggtg cccgttctgg actttctcga gccaatggcc gaggaagaga gcgaccttga 7140 gccctcaata ccatcggagt gcatgctccc caggagcggg tttccacggg ccttaccggc 7200 ttgggcacgg cctgactaca acccgccgct cgtggaatcg tggaggaggc cagattacca 7260 accgcccacc 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<210> 12 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> csp 427 <400> 12 tcggaagagc ccaacgac 18 <210> 13 <211> 9102 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> JFH1 codon sequence <400> 13 atgagcacaa atcctaaacc tcaaagaaaa accaaaagaa acaccaaccg tcgcccagaa 60 gacgttaagt tcccgggcgg cggccagatc gttggcggag tatacttgtt gccgcgcagg 120 ggccccaggt tgggtgtgcg cacgacaagg aaaacttcgg agcggtccca gccacgtggg 180 agacgccagc ccatccccaa agatcggcgc tccactggca aggcctgggg aaaaccaggt 240 cgcccctggc ccctatatgg gaatgaggga ctcggctggg caggatggct cctgtccccc 300 cgaggctctc gcccctcctg gggccccact gacccccggc ataggtcgcg caacgtgggt 360 aaagtcatcg acaccctaac gtgtggcttt gccgacctca tggggtacat ccccgtcgta 420 ggcgccccgc ttagtggcgc cgccagagct gtcgcgcacg gcgtgagagt cctggaggac 480 ggggttaatt atgcaacagg gaacctaccc ggtttcccct tttctatctt cttgctggcc 540 ctgttgtcct gcatcaccgt tccggtctct gctgcccagg tgaagaatac cagtagcagc 600 tacatggtga ccaatgactg ctccaatgac agcatcactt ggcagctcga ggctgcggtt 660 ctccacgtcc ccgggtgcgt cccgtgcgag agagtgggga atacgtcacg gtgttgggtg 720 ccagtctcgc caaacatggc tgtgcggcag cccggtgccc tcacgcaggg tctgcggacg 780 cacatcgata tggttgtgat gtccgccacc ttctgctctg ctctctacgt gggggacctc 840 tgtggcgggg tgatgctcgc ggcccaggtg ttcatcgtct cgccgcagta ccactggttt 900 gtgcaagaat gcaattgctc catctaccct ggcaccatca ctggacaccg catggcatgg 960 gacatgatga tgaactggtc gcccacggcc accatgatcc tggcgtacgt gatgcgcgtc 1020 cccgaggtca tcatagacat cgttagcggg gctcactggg gcgtcatgtt cggcttggcc 1080 tacttctcta tgcagggagc gtgggcgaag gtcattgtca tccttctgct ggccgctggg 1140 gtggacgcgg gcaccaccac cgttggaggc gctgttgcac gttccaccaa cgtgattgcc 1200 ggcgtgttca gccatggccc tcagcagaac attcagctca ttaacaccaa cggcagttgg 1260 cacatcaacc gtactgcctt gaattgcaat gactccttga acaccggctt tctcgcggcc 1320 ttgttctaca ccaaccgctt taactcgtca gggtgtccag ggcgcctgtc cgcctgccgc 1380 aacatcgagg ctttccggat agggtggggc accctacagt acgaggataa tgtcaccaat 1440 ccagaggata tgaggccgta ctgctggcac taccccccaa agccgtgtgg cgtagtcccc 1500 gcgaggtctg tgtgtggccc agtgtactgt ttcaccccca gcccggtagt agtgggcacg 1560 accgacagac gtggagtgcc cacctacaca tggggagaga atgagacaga tgtcttccta 1620 ctgaacagca cccgaccgcc gcagggctca tggttcggct gcacgtggat gaactccact 1680 ggtttcacca agacttgtgg cgcgccacct tgccgcacca gagctgactt caacgccagc 1740 acggacttgt tgtgccctac ggattgtttt aggaagcatc ctgatgccac ttatattaag 1800 tgtggttctg ggccctggct cacaccaaag tgcctggtcc actaccctta cagactctgg 1860 cattacccct gcacagtcaa ttttaccatc ttcaagataa gaatgtatgt agggggggtt 1920 gagcacaggc tcacggccgc atgcaacttc actcgtgggg atcgctgcga cttggaggac 1980 agggacagga gtcagctgtc tcctctgttg cactctacca cggaatgggc catcctgccc 2040 tgcacctact cagacttacc cgctttgtca actggtcttc tccaccttca ccagaacatc 2100 gtggacgtac aatacatgta tggcctctca cctgctatca caaaatacgt cgttcgatgg 2160 gagtgggtgg tactcttatt cctgctctta gcggacgcca gagtctgcgc ctgcttgtgg 2220 atgctcatct tgttgggcca ggccgaagca gcattggaga agttggtcgt cttgcacgct 2280 gcgagtgcgg ctaactgcca tggcctccta tattttgcca tcttcttcgt ggcagcttgg 2340 cacatcaggg gtcgggtggt ccccttgacc acctattgcc tcactggcct atggcccttc 2400 tgcctactgc tcatggcact gccccggcag gcttatgcct atgacgcacc tgtgcacgga 2460 cagataggcg tgggtttgtt gatattgatc accctcttca cactcacccc ggggtataag 2520 accctcctcg gccagtgtct gtggtggttg tgctatctcc tgaccctggg ggaagccatg 2580 attcaggagt gggtaccacc catgcaggtg cgcggcggcc gcgatggcat cgcgtgggcc 2640 gtcactatat tctgcccggg tgtggtgttt gacattacca aatggctttt ggcgttgctt 2700 gggcctgctt acctcttaag ggccgctttg acacatgtgc cgtacttcgt cagagctcac 2760 gctctgataa gggtatgcgc tttggtgaag cagctcgcgg ggggtaggta tgttcaggtg 2820 gcgctattgg cccttggcag gtggactggc acctacatct atgaccacct cacacctatg 2880 tcggactggg ccgctagcgg cctgcgcgac ttagcggtcg ccgtggaacc catcatcttc 2940 agtccgatgg agaagaaggt catcgtctgg ggagcggaga cggctgcatg tggggacatt 3000 ctacatggac ttcccgtgtc cgcccgactc ggccaggaga tcctcctcgg cccagctgat 3060 ggctacacct ccaaggggtg gaagctcctt gctcccatca ctgcttatgc ccagcaaaca 3120 cgaggcctcc tgggcgccat agtggtgagt atgacggggc gtgacaggac agaacaggcc 3180 ggggaagtcc aaatcctgtc cacagtctct cagtccttcc tcggaacaac catctcgggg 3240 gttttgtgga ctgtttacca cggagctggc aacaagactc tagccggctt acggggtccg 3300 gtcacgcaga tgtactcgag tgctgagggg gacttggtag gctggcccag cccccctggg 3360 accaagtctt tggagccgtg caagtgtgga gccgtcgacc tatatctggt cacgcggaac 3420 gctgatgtca tcccggctcg gagacgcggg gacaagcggg gagcattgct ctccccgaga 3480 cccatttcga ccttgaaggg gtcctcgggg gggccggtgc tctgccctag gggccacgtc 3540 gttgggctct tccgagcagc tgtgtgctct cggggcgtgg ccaaatccat cgatttcatc 3600 cccgttgaga cactcgacgt tgttacaagg tctcccactt tcagtgacaa cagcacgcca 3660 ccggctgtgc cccagaccta tcaggtcggg tacttgcatg ctccaactgg cagtggaaag 3720 agcaccaagg tccctgtcgc gtatgccgcc caggggtaca aagtactagt gcttaacccc 3780 tcggtagctg ccaccctggg gtttggggcg tacctatcca aggcacatgg catcaatccc 3840 aacattagga ctggagtcag gaccgtgatg accggggagg ccatcacgta ctccacatat 3900 ggcaaatttc tcgccgatgg gggctgcgct agcggcgcct atgacatcat catatgcgat 3960 gaatgccacg ctgtggatgc tacctccatt ctcggcatcg gaacggtcct tgatcaagca 4020 gagacagccg gggtcagact aactgtgctg gctacggcca caccccccgg gtcagtgaca 4080 accccccatc ccgatataga agaggtaggc ctcgggcggg agggtgagat ccccttctat 4140 gggagggcga ttcccctatc ctgcatcaag ggagggagac acctgatttt ctgccactca 4200 aagaaaaagt gtgacgagct cgcggcggcc cttcggggca tgggcttgaa tgccgtggca 4260 tactatagag ggttggacgt ctccataata ccagctcagg gagatgtggt ggtcgtcgcc 4320 accgacgccc tcatgacggg gtacactgga gactttgact ccgtgatcga ctgcaatgta 4380 gcggtcaccc aagctgtcga cttcagcctg gaccccacct tcactataac cacacagact 4440 gtcccacaag acgctgtctc acgcagtcag cgccgcgggc gcacaggtag aggaagacag 4500 ggcacttata ggtatgtttc cactggtgaa cgagcctcag gaatgtttga cagtgtagtg 4560 ctttgtgagt gctacgacgc aggggctgcg tggtacgatc tcacaccagc ggagaccacc 4620 gtcaggctta gagcgtattt caacacgccc ggcctacccg tgtgtcaaga ccatcttgaa 4680 ttttgggagg cagttttcac cggcctcaca cacatagacg cccacttcct ctcccaaaca 4740 aagcaagcgg gggagaactt cgcgtaccta gtagcctacc aagctacggt gtgcgccaga 4800 gccaaggccc ctcccccgtc ctgggacgcc atgtggaagt gcctggcccg actcaagcct 4860 acgcttgcgg gccccacacc tctcctgtac cgtttgggcc ctattaccaa tgaggtcacc 4920 ctcacacacc ctgggacgaa gtacatcgcc acatgcatgc aagctgacct tgaggtcatg 4980 accagcacgt gggtcctagc tggaggagtc ctggcagccg tcgccgcata ttgcctggcg 5040 actggatgcg tttccatcat cggccgcttg cacgtcaacc agcgagtcgt cgttgcgccg 5100 gataaggagg tcctgtatga ggcttttgat gagatggagg aatgcgcctc tagggcggct 5160 ctcatcgaag aggggcagcg gatagccgag atgttgaagt ccaagatcca aggcttgctg 5220 cagcaggcct ctaagcaggc ccaggacata caacccgcta tgcaggcttc atggcccaaa 5280 gtggaacaat tttgggccag acacatgtgg aacttcatta gcggcatcca atacctcgca 5340 ggattgtcaa cactgccagg gaaccccgcg gtggcttcca tgatggcatt cagtgccgcc 5400 ctcaccagtc cgttgtcgac cagtaccacc atccttctca acatcatggg aggctggtta 5460 gcgtcccaga tcgcaccacc cgcgggggcc accggctttg tcgtcagtgg cctggtgggg 5520 gctgccgtgg gcagcatagg cctgggtaag gtgctggtgg acatcctggc aggatatggt 5580 gcgggcattt cgggggccct cgtcgcattc aagatcatgt ctggcgagaa gccctctatg 5640 gaagatgtca tcaatctact gcctgggatc ctgtctccgg gagccctggt ggtgggggtc 5700 atctgcgcgg ccattctgcg ccgccacgtg ggaccggggg agggcgcggt ccaatggatg 5760 aacaggctta ttgcctttgc ttccagagga aaccacgtcg cccctactca ctacgtgacg 5820 gagtcggatg cgtcgcagcg tgtgacccaa ctacttggct ctcttactat aaccagccta 5880 ctcagaagac tccacaattg gataactgag gactgcccca tcccatgctc cggatcctgg 5940 ctccgcgacg tgtgggactg ggtttgcacc atcttgacag acttcaaaaa ttggctgacc 6000 tctaaattgt tccccaagct gcccggcctc cccttcatct cttgtcaaaa ggggtacaag 6060 ggtgtgtggg ccggcactgg catcatgacc acgcgctgcc cttgcggcgc caacatctct 6120 ggcaatgtcc gcctgggctc tatgaggatc acagggccta aaacctgcat gaacacctgg 6180 caggggacct ttcctatcaa ttgctacacg gagggccagt gcgcgccgaa accccccacg 6240 aactacaaga ccgccatctg gagggtggcg gcctcggagt acgcggaggt gacgcagcat 6300 gggtcgtact cctatgtaac aggactgacc actgacaatc tgaaaattcc ttgccaacta 6360 ccttctccag agtttttctc ctgggtggac ggtgtgcaga tccataggtt tgcacccaca 6420 ccaaagccgt ttttccggga tgaggtctcg ttctgcgttg ggcttaattc ctatgctgtc 6480 gggtcccagc ttccctgtga acctgagccc gacgcagacg tattgaggtc catgctaaca 6540 gatccgcccc acatcacggc ggagactgcg gcgcggcgct tggcacgggg atcacctcca 6600 tctgaggcga gctcctcagt gagccagcta tcagcaccgt cgctgcgggc cacctgcacc 6660 acccacagca acacctatga cgtggacatg gtcgatgcca acctgctcat ggagggcggt 6720 gtggctcaga cagagcctga gtccagggtg cccgttctgg actttctcga gccaatggcc 6780 gaggaagaga gcgaccttga gccctcaata ccatcggagt gcatgctccc caggagcggg 6840 tttccacggg ccttaccggc ttgggcacgg cctgactaca acccgccgct cgtggaatcg 6900 tggaggaggc cagattacca accgcccacc gttgctggtt gtgctctccc cccccccaag 6960 aaggccccga cgcctccccc aaggagacgc cggacagtgg gtctgagcga gagcaccata 7020 tcagaagccc tccagcaact ggccatcaag acctttggcc agcccccctc gagcggtgat 7080 gcaggctcgt ccacgggggc gggcgccgcc gaatccggcg gtccgacgtc ccctggtgag 7140 ccggccccct cagagacagg ttccgcctcc tctatgcccc ccctcgaggg ggagcctgga 7200 gatccggacc tggagtctga tcaggtagag cttcaacctc ccccccaggg ggggggggta 7260 gctcccggtt cgggctcggg gtcttggtct acttgctccg aggaggacga taccaccgtg 7320 tgctgctcca tgtcatactc ctggaccggg gctctaataa ctccctgtag ccccgaagag 7380 gaaaagttgc caatcaaccc tttgagtaac tcgctgttgc gataccataa caaggtgtac 7440 tgtacaacat caaagagcgc ctcacagagg gctaaaaagg taacttttga caggacgcaa 7500 gtgctcgacg cccattatga ctcagtctta aaggacatca agctagcggc ttccaaggtc 7560 agcgcaaggc tcctcacctt ggaggaggcg tgccagttga ctccacccca ttctgcaaga 7620 tccaagtatg gattcggggc caaggaggtc cgcagcttgt ccgggagggc cgttaaccac 7680 atcaagtccg tgtggaagga cctcctggaa gacccacaaa caccaattcc cacaaccatc 7740 atggccaaaa atgaggtgtt ctgcgtggac cccgccaagg ggggtaagaa accagctcgc 7800 ctcatcgttt accctgacct cggcgtccgg gtctgcgaga aaatggccct ctatgacatt 7860 acacaaaagc ttcctcaggc ggtaatggga gcttcctatg gcttccagta ctcccctgcc 7920 caacgggtgg agtatctctt gaaagcatgg gcggaaaaga aggaccccat gggtttttcg 7980 tatgataccc gatgcttcga ctcaaccgtc actgagagag acatcaggac cgaggagtcc 8040 atataccagg cctgctccct gcccgaggag gcccgcactg ccatacactc gctgactgag 8100 agactttacg taggagggcc catgttcaac agcaagggtc aaacctgcgg ttacagacgt 8160 tgccgcgcca gcggggtgct aaccactagc atgggtaaca ccatcacatg ctatgtgaaa 8220 gccctagcgg cctgcaaggc tgcggggata gttgcgccca caatgctggt atgcggcgat 8280 gacctagtag tcatctcaga aagccagggg actgaggagg acgagcggaa cctgagagcc 8340 ttcacggagg ccatgaccag gtactctgcc cctcctggtg atccccccag accggaatat 8400 gacctggagc taataacatc ctgttcctca aatgtgtctg tggcgttggg cccgcggggc 8460 cgccgcagat actacctgac cagagaccca accactccac tcgcccgggc tgcctgggaa 8520 acagttagac actcccctat caattcatgg ctgggaaaca tcatccagta tgctccaacc 8580 atatgggttc gcatggtcct aatgacacac ttcttctcca ttctcatggt ccaagacacc 8640 ctggaccaga acctcaactt tgagatgtat ggatcagtat actccgtgaa tcctttggac 8700 cttccagcca taattgagag gttacacggg cttgacgcct tttctatgca cacatactct 8760 caccacgaac tgacgcgggt ggcttcagcc ctcagaaaac ttggggcgcc acccctcagg 8820 gtgtggaaga gtcgggctcg cgcagtcagg gcgtccctca tctcccgtgg agggaaagcg 8880 gccgtttgcg gccgatatct cttcaattgg gcggtgaaga ccaagctcaa actcactcca 8940 ttgccggagg cgcgcctact ggacttatcc agttggttca ccgtcggcgc cggcgggggc 9000 gacatttttc acagcgtgtc gcgcgcccga ccccgctcat tactcttcgg cctactccta 9060 cttttcgtag gggtaggcct cttcctactc cccgctcggt ag 9102

Claims

서열번호 1 의 JFH1 주(JFH1 strain)의 게놈 RNA 에서,

1) 2027 내지 2029번째 염기서열에 의해 암호화되는 아미노산이 트레오닌에서 이소류신으로 치환되도록 상기 2027 번째 내지 2029 번째의 염기서열 중에서 1 이상의 염기가 치환되거나,

2) 2633 번째 내지 2635 번째 염기서열에 의해 암호화되는 아미노산이 아스파라긴에서 아스파르트산으로 치환되도록 상기 2633 번째 내지 2635 번째의 염기서열 중에서 1 이상의 염기가 치환되거나, 또는

3) 상기 1) 및 2) 의 염기가 모두 치환된,

효율적으로 HCV 의 감염을 유도할 수 있는 변이 HCV 게놈을 포함하는 폴리뉴클레오티드.
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제 1 항에 있어서,

상기 변이 HVC 게놈을 포함하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 1 의 JFH1 주의 게놈 RNA 의 NS5a 영역에 리포터 유전자가 더욱 삽입된 것인 변이 HCV 게놈을 포함하는 폴리뉴클레오티드.
제 4 항에 있어서,

상기 리포터 유전자는 레닐라 루시퍼라아제(Renilla luciferase) 유전자, 녹색 형광 단백질(Green fluorescence protein)의 유전자, 파이어플라이 루시퍼레이즈(Firefly luciferase) 유전자, 적색 형광 단백질(Red flu-orescence protein)의 유전자 및 씨크리티드 알칼라인 포스파타아제(Secreted alkaline phosphatase, SeAP)의 유전자로 이루어진 군 중에서 선택된 1 이상인 리포터 유전자를 포함하는 변이 HCV 게놈을 포함하는 폴리뉴클레오티드.
제4항에 있어서,

상기 리포터 유전자는 서열번호 1의 JFH1 주의 게놈 RNA의 7176, 7179, 7182, 7185 및 7188 번째 뉴클레오티드로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 뉴클레오티드 바로 다음에 삽입되는 것인, 변이 HCV 게놈을 포함하는 폴리뉴클레오티드.
제 1 항의 변이 HCV 의 폴리뉴클레오티드를 갖는 변이 HCV.
제 1 항의 변이 HCV 의 게놈 RNA 의 cDNA.
제 1 항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
제 9항에 있어서,

상기 벡터는 간세포용 바이러스 벡터인 벡터.
제 1 항의 폴리뉴클레오티드가 도입된 형질전환체.
제 1 항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 변이 HCV 의 바이러스 입자.
제 11 항의 형질전환체를 배양한 배양물에서 얻어지는 것인 변이 HCV 의 바이러스 입자.
제 12 항 또는 제 13 항의 변이 HCV 의 바이러스 입자가 감염된 것을 특징으로 하는 HCV 감염세포.
제 12 항의 변이 HCV 의 바이러스 입자, 제 13 항의 변이 HCV 의 바이러스 입자 또는 그 일부분을 항원으로서 사용해서 얻어지는 것인 C 형 간염 백신 또는 중화항체.
피검물질의 존재 하에서 제 1 항의 폴리뉴클레오티드 또는 제 4 항의 폴리뉴클레오티드를 숙주세포에 도입하고 배양하는 단계; 및 상기 피검물질의 항 HCV 효과를 평가하는 단계를 포함하는 항 HCV 물질의 스크리닝 방법.
제 16 항에 있어서,

상기 피검물질의 항 HCV 효과를 평가하는 단계는 상기 배양물 중의 상기 변이 HCV 의 핵산 또는 바이러스 입자를 검출 또는 정량하여 수행하거나, 또는 검출 및 정량하여 수행하는 것인 항 HCV 물질의 스크리닝 방법.
제 16 항에 있어서,

상기 숙주세포에 도입하는 폴리뉴클레오티드는 제4항의 폴리뉴클레오티드이고, 상기 피검물질의 항 HCV 효과를 평가하는 단계는 상기 배양물 중의 리포터 유전자의 발현물을 검출 또는 정량하여 수행하거나, 또는 검출 및 정량하여 수행하는 것인 항 HCV 물질의 스크리닝 방법.
제 12 항의 HCV 바이러스 입자, 제 13 항의 HCV 바이러스 입자 또는 상기 바이러스 입자의 일부분을 항원으로 이용하는 것을 특징으로 한 바이러스 백신을 제조하는 방법.
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