KR100502864B1

KR100502864B1 - Ｃ형 간염바이러스의 복제 정량 리플리콘, 이를 포함하는세포주, 및 상기 세포주를 이용한 ｈｃｖ 저해제의 탐색방법

Info

Publication number: KR100502864B1
Application number: KR10-2002-0061440A
Authority: KR
Inventors: 장승기; 김윤기; 김천생
Original assignee: (주)팬바이오넷
Priority date: 2002-10-09
Filing date: 2002-10-09
Publication date: 2005-07-22
Also published as: KR20040032343A

Abstract

본 발명은 C형 간염바이러스(Hepatitis C virus; HCV)의 복제정량 리플리콘, 이를 포함하는 형질전환 세포주, 및 이를 이용한 HCV의 복제정량을 통한 HCV 저해물질 탐색법에 관한 것이다. 더욱 자세하게는, 본 발명에 따른 고등세포내 HCV의 복제 정도를 탐지하는 방법은, 리포터 유전자를 가지는 HCV 리플리콘의 RNA 전사체로 형질전환시킨 세포주를 이용하여 HCV의 복제에 영향을 미칠 수 있는 물질을 탐색할 수 있는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 재조합된 HCV의 프로테아제, 폴리머라제와 같은 단백질의 활성에 의존한 종래의 탐색시스템에 비하여, 고등세포 내에서 효율적으로 복제하는 HCV 리플리콘을 이용함으로써, 보다 높은 정확성 및 민감도로 HCV의 복제를 정량하거나 HCV 저해제를 탐색하는 방법을 제공할 수 있다.

Description

Ｃ형 간염바이러스의 복제 정량 리플리콘, 이를 포함하는 세포주, 및 상기 세포주를 이용한 ＨＣＶ 저해제의 탐색방법{ASSAYABLE HEPATITIS C VIRAL REPLICON, ASSAYABLE REPLICON-CONTAINING CELL, AND SCREENING METHOD OF HCV INHIBITOR USING THE SAME}

[발명이 속하는 기술분야]

본 발명은 C형 간염바이러스의 리플리콘, 이를 포함하는 형질전환 세포주, 및 이를 이용한 HCV의 복제 정량을 통한 HCV 저해제의 탐색방법에 관한 것이다. 더욱 자세하게는, 본 발명에 따라 고등세포내 HCV의 복제 정도를 탐지하는 방법은 리포터 유전자를 가지는 HCV 리플리콘을 제조하고, 이를 포함하는 세포주를 제작함으로써 복제에 영향을 미칠 수 있는 물질을 탐색할 수 있는 방법에 관한 것이다.

[종래기술]

C형 간염 바이러스(Hepatitis C virus, HCV)는 비A형 및 비B형 간염을 일으키는 속에 속하는 바이러스로서, HCV 게놈은 단일가닥 RNA로서 약 3,010개의 아미노산으로 이루어진 단일복합단백질을 발현한다 (Choo et al., 1989, Science, vol.244, 359-362). HCV에 의해 발현되는 단일복합단백질은 숙주세포와 바이러스의 프로테아제에 의해 10개의 서로 다른 기능을 가지는 단백질들로 다시 절단되게 된다. HCV의 유전자 구성은 NH₂-C-E1-E2-p7-NS2-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B-COOH이다 (Steven Rosenberg, 2001, J. Mol. Biol. 313, 451-464). 상기 단백질은 크게 코어(Core), E1, E2, 및 p7을 포함하는 구조를 이루는 구조단백질들과 NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A, 및 NS5B로 이루어진 비구조단백질들로 나눌 수 있다.

HCV에 감염된 환자의 절반이상이 만성간염으로 발전하고 이들은 대부분 간경화나 간암으로 이어져 치사율이 매우 높으며 전세계 인구의 3% 이상이 HCV에 감염되어 있는 것으로 알려져 있다(Miller and Purcell, 2000, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87, 2057-2061). 우리 나라에서도 2%의 사람이 감염되어 있는 것으로 보고되며, C형 간염 바이러스는 50-60세를 전후하여 발병하는 간암의 주요인자의 하나로 알려져 있다. HCV 감염환자를 치료하는 종래에 널리 알려진 방법은 α-인터페론(α-interferon)을 사용하는 것이다. 그러나, α-인터페론에 반응하는 환자의 비율은 약 50%정도이며 그리고 반응하는 환자의 50%에서는 C형 간염 바이러스가 재발하는 것으로 보고되고 있다(Hino et al., 1994; Tsubota et al., 1994).

HCV에 대한 항바이러스제를 개발하기 위해서는 항바이러스 효과를 나타내는 물질을 찾아내거나, 항바이러스제의 효능을 검정할 수 있는 시스템이 필요하다. 그러나 현재까지 사용되고 있는 HCV의 in vitro 배양 시스템은 비효율적이고 기술적으로 조작하는 데에 어려움이 있으며(Yoo et al., 1995; Beach et al., 1993; Shimizu et al., 1992), 더욱이 HCV는 자연상태에서 낮은 수율을 나타내기 때문에 간염 환자의 혈청에서조차도 매우 적은 양의 HCV가 적정된다. 그러므로, HCV를 직접 사용하여 HCV 항바이러스제를 스크리닝하거나 항바이러스 효능을 검정하는 것은 매우 어렵다.

C형 간염 바이러스의 프로테아제인 NS3는 치료제 개발을 위한 좋은 목표이다. 이는 NS3/NS4A, NS4A/NS4B, NS4B/NS5A, NS5A/NS5B의 연결 부위를 NS3 프로테아제가 절단하기 때문에 효율적인 바이러스의 증식에 있어서 대단히 중요한 단백질로 생각되기 때문이다. 프로테아제의 저해제를 찾기 위해서는, NS3 프로테아제를 대장균을 이용하여 순수분리 및 정제하여 효소의 특성에 관한 연구가 선행되어야하며, 정제된 NS3를 이용하여 하이 스루아웃 스크리닝 (High throughout screening; HTS)을 통해서 시험관에서 프로테아제 저해제의 선구물질을 탐색할 수 있을 것이다. 선도물질의 삼차원적인 구조와 투디-앤엠알 스펙트럼 (2D-NMR spectrum)을 이용 기질과 효소의 결합성을 조사, 분석하면 실제 환자의 세포내에서 효과적으로 작용할 수 있는 최종 저해제를 얻을 수 있다. 그러나, 상기의 방법은 NS3의 대량순수분리의 어려움과 시험관에서만 작용할 가능성이 있는 물질의 탐색 가능성을 배제할 수 없다.

따라서, HCV의 복제를 연구하거나 또는 HCV가 암호화하는 효소에 대한 항바이러스제의 효능을 테스트하기 위한 보다 나은 방법은 대체 바이러스 혹은 HCV세포 배양 방법을 개발하는 것이다.

대한민국 등록특허공보 제1999-2263호에는 HCV의 특성과 폴리오바이러스의 특성에 기초하여 HCV의 NS3 프로테아제의 활성이 있을 때에만 생존할 수 있는 유전자 재조합 폴리오바이러스를 생산하고, 항C형 간염 바이러스제의 존재 하에 상기 재조합 바이러스를 증식시키고, 재조합 바이러스의 증식능력을 측정하여 항C형 간염 바이러스제를 탐색하는 대체 바이러스를 이용한 방법이 기재되어 있다. 상기 키메라 바이러스를 이용할 경우, 키메라 바이러스의 증식은 C형 간염바이러스의 프로테아제의 활성에 전적으로 의존한다. 이러한 방법은 기존의 HCV 복제 정량 및 HCV 저해제 탐색방법에 비해 세포막을 투과하지 못하는 저해제를 배제한다는 장점을 가지나, HCV가 암호화하는 다른 단백질들은 전혀 없는 상태, 즉, HCV 프로테아제 하나만을 발현하여 그 활성을 저해하는 물질을 탐색하는 방법이기 때문에 다양한 증식 과정에 대한 저해제를 탐색하기에는 어렵다는 문제점을 내포하고 있다. 게다가 상기의 키메라 바이러스를 이용한 저해제 탐색방법은 저해물질의 존재하에서 키메라 바이러스의 증식능력을 측정함으로써 저해제를 탐색하기 때문에 탐색방법의 민감도 및 정확도가 낮아 하이 스루아웃 스크리닝 (High throughout screening; HTS)를 수행하기가 힘들고, 따라서 짧은 시간에 많은 종류의 물질을 검정할 수 없다는 큰 문제점을 지니고 있다.

최근에는 고등 진핵세포 내에서 C형 간염 바이러스의 복제를 확인할 수 있는 시스템을 확립하고, 이러한 기술을 이용하여 HCV 진단, 치료, 및 백신의 개발을 위한 많은 시도들이 활발하게 진행되고 있다(Lohmann et al., 1999, Science, 285, 110-113; Krieger et al., 2001, J. Virol. 75, 4614-4624; Lohmann et al., 2001, J. Virol. 75, 1437-1449). 상기와 같은 HCV 복제를 실험할 수 있는 세포배양 시스템이 개발되었음에도 불구하고, 이들 리플리콘을 이용하는 경우에는 바이러스 복제 정도를 장시간이 소요되는 노던블랏 (Northern Blot) 방법으로 측정하므로 불편하고 더구나 HCV의 복제 정도를 정량적으로 측정하기 힘들다는 단점이 있다.

상기와 같은 종래 기술의 문제점을 해결하고자, 본 발명은 리포터 유전자를 HCV 리플리콘에 삽입한, DNA 리플리콘(Replicon)을 제공하는데 그 목적이 있다.

본 발명의 또다른 목적은 상기 HCV의 정량 DNA 리플리콘으로부터 전사된 RNA 전사체를 제공하고자 한다.

본 발명의 또다른 목적은 상기 정량 리플리콘으로부터 전사된 RNA 전사체를 포함하는 형질전환된 세포주를 제공하는데 그 목적이 있다.

본 발명의 또다른 목적은 높은 정확도와 민감도로 상기 형질전환된 세포주를 이용하여 HCV의 복제 정량법을 제공하는데 그 목적이 있다.

본 발명의 또다른 목적은 높은 정확도와 민감도로, 상기 형질전환된 세포주를 이용하여 보다 효율적이고 고등세포에 근간한 HCV 리플리콘의 복제 저해제를 탐색하는 방법을 제공하는데 그 목적이 있다.

상기와 같은 목적을 달성하고자, 본 발명은 5'쪽 말단이 5'쪽 방향부터 3'방향으로 C형 간염바이러스(Hepatitis C Virus, HCV)의 내부 라이보좀 도입 자리(Internal Ribosomal Entry site; IRES), 선별 마커를 코딩하는 서열, 및 엔세팔로마이오카디티스 바이러스 (Encephalomyocarditis; EMCV)의 IRES를 포함하는 HCV의 DNA 리플리콘에 있어서, 발현가능하도록 연결된 리포터 단백질을 코딩하는 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는, HCV의 복제 정량용 DNA 리플리콘 (Replicon)을 제공한다.

또한 본 발명은 상기 DNA 리플리콘으로 부터 전사된 RNA 전사체를 제공한다.

또한 본 발명은 상기 DNA 리플리콘으로부터 전사된 RNA 전사체로 형질전환된 세포주를 제공한다.

또한 본 발명은 (a) 상기 리포터 단백질을 코딩하는 서열을 포함하는 HCV의 복제 정량 DNA 리플리콘을 포함하는 세포주에 HCV의 복제 저해제를 처리한 후 세포주를 배양하고, (b) 상기 리포터 단백질의 발현정도를 측정함으로써 HCV의 복제를 정량하여, HCV의 복제 저해제를 탐색하는 방법을 제공한다.

본 발명에서 "리플리콘(replicon)"이라 함은 고등세포내에서 복제가능한 DNA, RNA 전사체, 및 이 전사체를 만들 수 있는 DNA 또는 플라스미드 등을 모두 포함하는 통상의 의미로 사용된다.

본 발명자들은 종래에 HCV 단백질을 이용한 HCV 복제 정량법 또는 이를 이용한 항바이러스제의 탐색법이 정확성이 낮고 하이 스루아웃 스크리닝 (High throughout screening; HTS)를 수행하기가 힘들다는 등의 문제점이 있으며, 또한 키메라 바이러스를 이용하는 경우에 저해물질의 존재하에서 키메라 바이러스의 증식능력을 측정하여 저해제를 탐색하기 때문에 탐색방법의 민감도 및 정확도가 낮다는 문제점을 고려하여, 고등세포 내에서 효율적으로 복제하고 리포터 단백질을 발현하는 HCV의 DNA 리플리콘, RNA 전사체 이를 포함하는 세포주를 개발함으로써 보다 높은 정확성 및 민감도로 HCV의 복제 정도를 탐지하는 방법 및 저해제 탐색법을 제공할 수 있음을 기초로 본 발명을 완성하였다.

본 발명에 따른 HCV 복제 정량법 및 이를 이용한 항바이러스제 탐색방법은 장시간이 소요되는 노던블랏방법을 사용하는 대신 리플리콘 내에 발현유전자를 삽입함으로써 복제 정도를 쉽게 측정할 수 있는 방법을 제공하는다는 데에 본 발명의 의의가 있다. 또한, 본 발명에 따른 정량가능한 HCV 리플리콘과 그 세포주는, HCV 단백질을 이용하거나 프로테아제 또는 폴리머라아제의 활성에 근간한 기존의 탐색시스템에 비하여, 고등세포 내에서 효율적으로 복제를 하는 C형 간염바이러스의 리플리콘을 이용하여 HCV복제과정에 필요한 모든 단백질 활성에 대하여 높은 정확성으로 HCV 복제 정도 및 복제저해제 탐색을 할 수 있다.

이하에서, 본 발명을 더욱 자세히 설명하고자 한다.

본 발명은 정량가능한 발현 단백질을 포함하는 HCV 리플리콘, 이의 전사체, 및 이에 의해 형질전환된 세포주를 제공한다. 본 발명은 기본적인 HCV의 DNA 리플리콘에 발현가능한 리포터 단백질을 코딩하는 서열을 추가로 포함함을 특징으로 한다. 본 명세서에서 "리포터 단백질"이라 함은 발현되어 정량할 수 있는 단백질을 말하는 것으로서 종래에 알려진 리포터 단백질은 모두 본 발명에 적용가능하며, 그 예로는 레닐라 루시퍼라아제(Renilla luciferase), 파이어플라이 루시퍼레이즈 (Firefly luciferase), 녹색 형광 단백질(Green fluorescence protein), 또는 SeAP 씨크리티드 알칼라인 포스파타아제 (Secreted alkaline phosphatase)단백질을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 또한 리포터 단백질의 검출 및 정량방법은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 알려진 방법을 본 발명에 적용할 수 있다. 녹색 형광 단백질을 리포터 단백질로 사용하는 경우에는 발현 유전자의 발현 정도를 자외선을 세포에 조사함으로써 나타나는 녹색 형광 단백질 (Green fluorescence)를 관찰함으로써 확인할 수 있어, 살아있는 세포를 그대로 이용하여 발현을 관찰할 수 있다는 장점이 있다.

본 발명에서 사용 가능한 HCV의 DNA 리플리콘은 특별히 한정되지 않으며, 그 예로는 5' 말단이 5'쪽 방향부터 3'방향으로 C형 간염바이러스(Hepatitis C Virus, HCV)의 내부 라이보좀 도입 자리(Internal Ribosomal Entry site; IRES), 선별 마커를 코딩하는 서열, 및 엔세팔로마이오카디티스 바이러스 (Encephalomyocarditis; EMCV)의 IRES를 포함하는 HCV의 DNA 리플리콘이며 이의 예로는 NK5.1이 있다. 도 1에 나타난 기존의 NK 5.1은 neo의 발현은 HCV IRES에 의해, HCV 비구조 단백질들은 엔세팔로마이오카디티스 바이러스의 IRES에 의해 발현되는 두 종류의 시스트론을 포함하는 서브게놈 리플리콘이다. 따라서, 본 발명의 일례에서, 상기 기본 DNA 리플리콘에서 리포터 단백질을 코딩하는 서열을 포함하며, 바람직하게는 리포터 단백질과 선별마커의 융합단백질을 코딩하는 서열로서 HCV IRES의 3'말단에 연결된 HCV 복제정량 DNA 리플리콘을 제공하며, 그 예로는 NK-RN, 또는 NK-GN을 들 수 있다(도 1). 상기 NK-RN은 대한민국 대전광역시 유성구 어은동 52번지에 소재한 생명공학연구소 유전자은행에 2002년 7월 25일자로 기탁하여 기탁번호 KCTC 10309 BP를 받았다.

또한, 기본 HCV의 DNA 리플리콘의 또다른 예로는 상기 DNA 리플리콘에서 추가로 폴리오바이러스의 IRES를 포함하는 것으로서, 즉 5'쪽 말단은 5'쪽 방향부터 3'쪽 방향으로 HCV의 IRES, 폴리오바이러스의 IRES, 선별 마커를 코딩하는 서열, 및 EMCV의 IRES를 포함하는 DNA 리플리콘일 수 있으며 이의 바람직한 예로는 NK/H(1-389)/P, 또는 NK/H(1-119)/P일 수 있다. 이는 상기 NK5.1 리플리콘을 기본 골격으로 하면서 다른 제3의 IRES를 HCV IRES와 neo 사이에 첨가한 것으로서, 본 발명에서는 강력한 단백질 번역 효율을 가지는 폴리오바이러스의 IRES를 첨가한 것이 바람직하다. 본 발명의 일례에서, 상기 DNA 리플리콘의 5'쪽 말단은 5'쪽 방향부터 3'쪽 방향으로 HCV의 IRES, 폴리오바이러스의 IRES, 선별 마커를 코딩하는 서열, 및 EMCV의 IRES를 포함하고, 리포터 단백질을 코딩하는 서열을 포함하는 DNA 리플리콘을 제공한다. 또한 상기 리포터 단백질을 코딩하는 서열은 (i) HCV IRES의 3'쪽 말단에 단독으로 연결되거나, 또는 (ii) 상기 리포터 단백질과 선별 마커의 융합 단백질을 코딩하는 서열로서 폴리오바이러스 IRES의 3'쪽 말단에 연결될 수 있으며, 이러한 예로는 NK/HR/P, 및 NK/HG/P를 포함한다(도 1).

또한 상기 HCV 복제정량 DNA 리플리콘은 추가로 폴리오바이러스의 IRES와, 상기 HCV IRES의 3'쪽 말단에 연결된, HCV의 코어 유전자, E1 유전자, E2 유전자, p7 유전자, 및 NS2 유전자로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 폴리뉴클레오타이드를 추가로 포함하는 DNA 리플리콘 일 수 있으며, 바람직한 예로는 전장 (Full length, FK) 리플리콘이다. 본 발명의 일례에서, 상기 DNA 리플리콘의 5'쪽 말단은 5'쪽 방향부터 3'쪽 방향으로 HCV의 IRES, HCV의 구조 유전자, 폴리오바이러스의 IRES, 선별 마커를 코딩하는 서열, 및 EMCV의 IRES를 포함하고, 리포터 단백질을 코딩하는 서열을 포함하는 DNA 리플리콘을 제공한다. 바람직하게는 상기 리포터 단백질을 코딩하는 서열은 리포터 단백질과 선별마커의 융합단백질을 코딩하는 서열로서 폴리오바이러스 IRES의 3'말단에 연결된 것일 수 있으며, 그 예로는 FK-RN 리플리콘을 들 수 있다(도 1).

상기 DNA 리플리콘에서 선별마커는 리플리콘의 세포내 존재를 확인가능한 모든 마커를 포함하는 의도이며, 예를 들면 neo 유전자를 포함한다.

또한, 본 발명은 상기 HCV의 DNA 리플리콘으로부터 전사된 RNA 전사체에 관한 것이다. 상기 HCV DNA 리플리콘으로부터 RNA 전사체를 제조하는 방법은 본 기술분야의 통상의 지식을 가진 자가 적절히 선택할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 RNA 전사체로 형질전환된 세포주에 관한 것이다. 상기 세포주는 HCV의 복제가 가능한 모든 세포주일 수 있으며, 바람직하게는 사람의 간암세포주(human hepatocellular cell; Huh-7)이다. 상기 NK-RN으로 형질전환된 사람 간암세포주를 대한민국 대전광역시 유성구 어은동 52번지에 소재한 생명공학연구소 유전자은행에 2002년 7월 25일자로 기탁하여 수탁번호 KCTC 10310BP를 받았다.

본 발명의 일례에서, 형질전환방법은 세포주와 상기 RNA전사체를 일렉트로포레이션시켜 제조할 수 있으며, 또한 RNA 전사체로 세포주를 형질전환시키는 모든 방법을 본 발명에 적용할 수 있다.

상기 형질전환된 세포주의 콜로니 형성율를 비교하면, 기존의 비구조 단백질만을 발현하는 리플리콘 (NK5.1)의 경우, 단위 RNA 농도 당 약 10⁴개의 콜로니를 형성한다 (도 2). 정량 HCV 리플리콘인 NK-RN의 경우, 단위 RNA 농도 당 약 10¹~ 10²개의 콜로니를 형성한다. 도 3에 나타난 바와 같이, NS5A, NS5B, 액틴(Actin)에 대한 항체로 웨쓰턴블랏을 수행한 결과, 정량가능한 리플리콘인 NK-RN을 지니고 있는 세포주의 경우, 기존의 서브제놈믹 리플리콘인 NK 5.1을 지니는 세포주에 비해 매우 적은량의 NS5A와 NS5B 단백질을 발현하고 있음을 관찰하였다. HCV의 IRES의 뉴클레오타이드 (nucleotide) 1-119를 포함하고 폴리오바이러스의 전체 IRES를 가지고 있는 키메라 리플리콘인 NK/H(1-119)/P의 경우에 비해서도 다소 적은 양을 발현하였다. 실제로 NK 5.1은 10⁴, NK/H(1-119)/P은 10², 본 발명에 따른 정량 HCV 리플리콘인 NK/RN의 경우, 단위 RNA 농도 당 약 10¹~ 10²개의 콜로니를 형성하였다.

또한 본 발명은 (a) 본 발명에 따라 제조된, 리포터 단백질을 포함하는 HCV의 복제 정량 리플리콘 RNA전사체를 포함하는 세포주에 HCV의 복제 저해제를 처리한 후 세포주를 배양하고, (b) 상기 리포터 단백질의 발현정도를 측정함으로써 HCV의 복제를 정량하여, HCV의 복제 저해제를 탐색하는 방법에 관한 것이다.

본 발명에 따른 상기 정량가능한 HCV 리플리콘 RNA 전사체로 형질전환된 세포주에 기존에 알려진 HCV 복제저해제인 인터페론 알파를 이용한 복제 정량 실험에의하면, 본 발명에 따른 정량 리플리콘이 레닐라 루씨퍼레이즈의 발현 정도는 HCV의 복제정도를 그대로 반영하고 있음을 나타내고 있다(도 4)

상기 형질전환된 세포주는 리포터 단백질을 발현가능한 HCV의 리플리콘으로 형질전환된 세포주이며, 바람직하게는 HCV의 복제정량 리플리콘으로 형질전환된 사람 간암세포주이며 이러한 예로는 KCTC 10310 수탁번호를 갖는 사람 간암세포주이다.

본 발명의 구체적 일례에서, 바이러스의 복제를 저해하는 물질의 탐색은 정량 리플리콘을 지니고 있는 세포주를 이용하여 발현유전자의 발현 정도를 측정함으로써 수행할 수 있으며, 구체적으로는 상기 HCV 리플리콘 발현벡터의 전사체를 일렉트로포레이션 방법으로 Huh-7 세포주 내로 형질전환 시킨다. Huh-7 세포주내에서 복제되는 리플리콘을 가지는 세포주만을 선별하기 위해서 3 내지 4일 간격으로 G418 (600 ㎍/ml)을 포함하는 배양액으로 배양액을 치환한다. G418의 존재 하에서 지속적인 배양을 한 후, 2 내지 3주 후에 콜로니(colony)를 형성하는 세포주를 픽킹 (picking)하여 세포주의 양을 증폭시킨다. 상기 HCV 리플리콘 전사체로 형질전환된 세포주를 대량 탐색에 적절한 규모로 분주한 후, 임의의 물질을 처리하고 임의의 시간동안 배양한다. 그 후 세포주의 추출물을 이용하여 발현유전자의 발현 정도를 조사함으로써 복제를 저해하는 물질을 탐색할 수 있다.

본 발명에 따른 정량 HCV 리플리콘의 전사체로 형질전환된 세포주는 리포터 단백질이 발현정도를 측정함으로써 HCV의 복제정량 및 HCV 복제 저해제를 탐색하는 것으로서, 민감도와 정확도가 매우 높아 고등세포에 근간한 하이 쓰루아웃 스크리닝 (high throughout screening) 방식으로 단시간에 많은 후보 물질을 탐색가능하다. 또한, 본 발명의 HCV 복제정량 리플리콘은 고동세포내에서 활발히 복제하는 리플리콘 시스템을 이용한 항바이러스제를 탐색하는 것으로서, HCV의 NS3 프로테아제 뿐만 아니라 다른 비구조 단백질인 NS4A, NS4B, NS5A, NS5B를 모두 발현한 상태에서 저해제를 탐색가능하며, 순수분리에 의한 단백질의 변형가능성을 완전히 배제할 수 있으며, 세포막을 통과하지 못하는 화합물을 미리 제거가능하며, 리플리콘을 포함하는 세포를 이용함으로써 후보 물질이 세포에 미치는 독성을 동시에 측정가능 하다는 장점이 있다.

이하의 실시예를 통해 본 발명을 더욱 상세히 설명할 것이나, 하기 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하는 것일 뿐, 본 발명의 보호범위를 제한하는 의도는 아니다.

실시예 1: 복제정량 리플리콘 NK-RN의 클로닝

1-1: NK5.1 리플리콘

기존의 NK5.1 리플리콘은 HCV IRES-네오마이신 포스포트랜스퍼라제-EMCV IRES-HCV 비구조 단백질의 서열로 구성되어 있다. 즉, neo의 발현은 HCV IRES에 의해, HCV 비구조 단백질들은 EMCV IRES에 의해 발현되는 두 개의 시스트론을 포함하는 서브게놈(dicistronic subgenomic) 리플리콘이다 (도 1) (Krieger et al., 2001, J. Virol. 75, 4614-4624; Lohmann et al., 2001, J. Virol. 75, 1437-1449).

1-2: 레닐라 루시퍼라아제를 코딩하는 DNA 준비

하기 두 종류의 단일가닥 DNA 올리고뉴클레오타이드와 pRL-CMV (Promega사로 부터 구입)을 주형으로 하여 중합효소 연쇄반응 (polymerase chain reaction; PCR)을 통해 레닐라루시퍼라아제를 증폭시켰다.

정방향 프라이머: 5'-TTGGCGCGCCACCATGACTTCGAAAG-3', 및

역방향 프라이머: 5'-TTGGCGCGCCCTTGTTCATTTTTGAGAACTCGC-3'

PCR 반응시 0.4 mM dNTPs, 각 1 mM의 단일가닥 DNA 올리고뉴클레오타이드, 2 ng 주형 DNA, 1.75 단위 폴리머라제 (expand high fidelity PCR system; Boehringer Mannheim 사로부터 구입)를 50 ml에 넣은 후 55 ℃에서 어닐링시키고, 상기 증폭과정을 30회 반복하였다.

1-3: NK-RN의 클로닝

증폭된 레닐라 루시퍼라아제와 서브게놈 리플리콘 NK5.1을 제한효소 AscI을 이용하여 자른 후 서로 결합(ligation)시켰다. 결합 후 얻어진 플라스미드를 E.coli(JM109)에 일렉트로포레이션 (eletroporation) 방법으로 형질전환시켰다. 얻어진 E.coli를 암피실린 (amphicillin: Sigma사로부터 입수)이 포함된 아가 플레이트에서 37 ℃, 15시간 동안 성장시켜, 아가플레이트에 성장한 각각의 콜로니 중 수십 개를 선택하여 미니-프레퍼레이션(mini-preparation)을 수행하였다. 이렇게 얻은 DNA를 AscI, BstBI, 및 NotI 제한효소를 이용하여 삽입체(insert)가 들어간 클론들을 찾아냈다. 올바르게 제작된 DNA를 선별한 후, DNA 서열분석을 통해 재확인하였다.

실시예 2: 정량 리플리콘 NK/HG/P의 클로닝

2-1: 키메라 리플리콘 NK/H(1-389)/P 제조

HCV 구조 단백질을 발현하는 리플리콘을 제조하기 위한 골격을 만들기 위해서 폴리오바이러스의 IRES(Internal Ribosomal Entry Site)를 기존의 NK5.1의 HCV IRES-네오마이신 포스포트랜스퍼라제(neo)의 오픈 리딩 프레임(open reading frame) 사이에 도입하였다.

기존의 NK5.1은 HCV IRES-네오마이신 포스포트랜스퍼라제-EMCV IRES-HCV 비구조 단백질의 서열로 구성되어 있다. 즉, neo의 발현은 HCV IRES에 의해, HCV 비구조 단백질들은 EMCV IRES에 의해 발현되는 두 개의 시스트론을 포함하는 서브게놈(dicistronic subgenomic) 리플리콘이다(도 1).

하기 두 종류의 단일가닥 DNA 올리고뉴클레오타이드 pMPS1-ECAT(Jang and Wimmer, 1990, Genes. Dev. 4, 1560-1572)을 주형으로 하여 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction; PCR)을 통해 폴리오바이러스의 IRES를 증폭시켰다.

5'-TTGGCGCGCCCCATTATGATACAATTGTCTGA-3', 및

5'-TTGGCGCGCCCTCTAGACTCCGGTATTGCGGTACC-3'

PCR 반응시 0.4 mM dNTPs, 각 1 mM의 단일가닥 DNA 올리고뉴클리오타이드, 2 ng 주형 DNA, 1.75 단위 폴리머라제(expand high fidelity PCR system; Boehringer Mannheim 사로부터 구입)를 50 ml에 넣은 후 55℃에서 어닐링시키고, 상기 증폭과정을 30회 반복하였다.

증폭된 폴리오바이러스의 IRES와 서브게놈 리플리콘 NK5.1을 제한효소 AscI을 이용하여 자른 후 서로 결합(ligation)시켰다. 결합 후 얻어진 플라스미드를 E.coli(JM109)에 일렉트로포레이션(eletroporation)방법으로 형질전환시켰다. 얻어진 E.coli를 암피실린 (amphicillin: Sigma사로부터 입수)이 포함된 아가플레이트에서 37℃, 15시간 동안 성장시켜, 아가플레이트에 성장한 각각의 콜로니 중 수십 개를 선택하여 미니-프레퍼레이션(mini-preparation)을 수행하였다. 이렇게 얻은 DNA를 AscI, BalI, KpnI, 및 NcoI 제한효소를 이용하여 삽입체(insert)가 들어간 클론들을 찾아냈다. 올바르게 제작된 DNA를 선별한 후, DNA 서열분석을 통해 재확인하였다.

2-2: 녹색 형광 단백질 (Green Fluorescence Protein; GFP) 코딩 DNA의 제조

하기 두 종류의 단일가닥 DNA 올리고뉴클레오타이드와 리플리콘 DNA인 NK 5.1을 주형으로 하여 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction; PCR)을 통해 HCV의 내부 라이보좀 도입 자리(Internal Ribosomal Entry site; IRES)의 뒷부분에 해당하는 부분을 증폭시켰다.

정방향 프라이머: 5'-CGACACTCCACCATAGATCAC-3', 및

역방향 프라이머: 5'-CTGTTGTGCCCAGTCATAGCC-3'

또한, 하기 두 종류의 단일가닥 DNA 올리고뉴클레오타이드와 리플리콘 DNA인 NK 5.1을 주형으로 하여 중합효소 연쇄반응 (polymerase chain reaction; PCR)을 통해 녹색 형광 단백질에 해당하는 부분을 증폭시켰다.

정방향 프라이머: 5'-TTGGCGCGCCATGGTGAGCAAGGGCGAGG-3', 및

역방향 프라이머: 5'-TGCTCTAGACGTCGACTGCAGAATTCGAAG-3'

2-3: NK/HG/P의 클로닝

증폭된 HCV의 내부 라이보좀 도입 자리(Internal Ribosomal Entry site; IRES)의 뒷부분을 NruI 및 AscI 제한효소로 처리한 조각과 증폭된 녹색 형광 단백질에 해당하는 부분을 AscI 및 XbaI 제한효소로 처리한 조각을 NruI 및 AscI 제한효소를 이용하여 자른 키메라 리플리콘 NK/H(1-389)/P와 함께 서로 결합 (ligation)시켰다. 결합 후 얻어진 플라스미드를 E.coli(JM109)에 일렉트로포레이션(eletroporation) 방법으로 형질전환시켰다. 얻어진 E.coli를 암피실린 (amphicillin: Sigma사로부터 입수)이 포함된 아가플레이트에서 37 ℃, 15시간 동안 성장시켜, 아가플레이트에 성장한 각각의 콜로니 중 수십 개를 선택하여 미니-프레퍼레이션(mini-preparation)을 수행하였다. 이렇게 얻은 DNA를 AscI, NruI, 및 XbaI 제한효소를 이용하여 삽입체 (insert)가 들어간 클론들을 찾아냈다. 올바르게 제작된 DNA를 선별한 후, DNA 서열분석을 통해 재확인하였다.

실시예 3: 정량 리플리콘 FK-RN의 제조

3-1: 전장 리플리콘의 제조

HCV의 모든 구조유전자와 비구조 유전자를 포함하는 전장 리플리콘 (full-length replicon, FK)을 제작하기 위하여, 상기 실시예 1-1에서 얻어진 NK/H(1-389)/P, HCV의 코어부터 NS2의 N-말단 절반까지의 삽입체, 및 NS2의 나머지 C-말단 절반을 포함하는 삽입체를 결합시켰다.

상세히 기술하면, 상기 실시예 1-1에서 제조된 NK/H(1-389)/P를 NruI, 및 XbaI로 절단하였다. HCV의 코어부터 NS2의 N-말단 절반까지를 포함하는 삽입체 부분은 유전형 1b의 HCV (genotype 1b HCV, 이하 HCV 1b)의 전체 서열을 포함하는 벡터(Lohmann et al., 1999, Science, 285, 110-113)에서 SplI과 NruI을 이용하여 잘라서 얻었다. NS2의 나머지 C-말단 절반을 포함하는 또 다른 삽입체는, HCV 1b의 뉴클레오타이드 3153-3173bp과 어닐링하는 단일가닥 DNA 올리고뉴클레오타이드와, 뉴클레오타이드 3400-3419bp와 어닐링하고 단백질 발현 중지 코돈을 가지고 XbaI 제한효소 자리를 추가로 포함하는 하기의 두 단일가닥 DNA 올리고뉴클레오타이드, 그리고 HCV 1b의 전체 서열을 포함하는 벡터를 주형으로 하여 PCR을 통해 증폭하였다.

5'-CTCATGAAGTTGGCCGCACTG-3'

5'-TGCTCTAGAACTAGAGGAGTCGCCACCCCTGCC-3'

증폭된 삽입체는 제한효소 SplI과 XbaI을 이용하여 절단하였다.

상기 1-1에서 얻어진 NK/H(1-389)/P, HCV의 코어부터 NS2의 N-말단까지의 삽입체, 및 NS2의 나머지 C-말단을 포함하는 삽입체를 모두 결합(ligation)시켰다. 결합된 플라스미드를 E.coli(JM109)에 일렉트로포레이션 방법으로 형질전환시킨 후 암피실린이 포함된 아가플레이트에서 37℃, 15시간 동안 성장시켰다. 형질전환되어 아가플레이트에 성장한 각각의 콜로니 중 수십 개를 선택하여 미니- 프레퍼레이션 (mini-preparation)을 수행하였다. 이렇게 얻은 DNA를 XbaI, SplI, NruI 제한효소를 이용하여 삽입체(insert)가 제대로 들어간 클론들을 찾아냈다. 올바르게 제작된 DNA를 선별한 후, DNA 서열을 분석하여 재확인하였다.

3-2: FK-RN 의 제조

상기 실시예 1-2에 따라 증폭된 레닐라 루시퍼라아제와 상기 3-1에 따라 제조된 전장 레플리콘을 제한효소 AscI을 이용하여 자른 후 서로 결합(ligation)시켰다. 결합후 얻어진 플라스미드를 E.coli(JM109)에 일렉트로포레이션 (eletroporation) 방법으로 형질전환시켰다. 얻어진 E.coli를 암피실린 (amphicillin: Sigma사로부터 입수)이 포함된 아가 플레이트에서 37 ℃, 15시간 동안 성장시켜, 아가플레이트에 성장한 각각의 콜로니 중 수십 개를 선택하여 미니-프레퍼레이션(mini-preparation)을 수행하였다. 이렇게 얻은 DNA를 AscI, BstBI, 및 NotI 제한효소를 이용하여 삽입체(insert)가 들어간 클론들을 찾아냈다. 올바르게 제작된 DNA를 선별한 후, DNA 서열분석을 통해 재확인하였다.

실시예 4: 리플리콘 RNA의 제조

상기 실시예 1 내지 3에서 제조하여 얻어진, HCV 복제정량 리플리콘 DNA를 전사하여 리플리콘 RNA를 제조하였다.

10 ㎍의 이중가닥 DNA 주형을 제한효소 ScaI로 절단하고, 페놀추출과 에탄올침전을 통하여 잘려진 DNA 주형을 분리하였다. 잘려진 이중가닥 DNA 주형, 1 X 전사완충액, 10 mM DTT (Sigma사), 1 mM ATP, CTP, GTP, UTP (Boehringer Mannheim 사), 120 U RNase 저해제 (Promega사), 150 U T7 RNA 중합효소 (Stratagen사), DEPC-H₂O를 75 ml 넣어서 혼합한 후 37℃에서 2시간 동안 반응시켰다. 120 U RNase 저해제와 150 U T7 RNA 중합효소를 추가로 첨가하여 3시간 더 반응을 진행시켰다. 상기 반응액으로부터 페놀 추출과 에탄올 침전을 통하여 RNA를 정제한 후 20 U DNaseⅠ(Ambion사)을 37 ℃에서 1시간 처리하여 남아있는 DNA 주형을 분해시켰다. 얻어진 반응액에 다시 페놀추출과 에탄올침전을 통하여 RNA를 정제하고, 정제된 RNA를 DEPC-H₂O에 용해시킨 후 UV 스펙트로포토미터 (spectrophotometer)를 이용하여 정량하였다. 정량된 리플리콘 RNA를 1% 아가로스젤에 로딩하여 RNA의 충실성을 재확인하였다.

실시예 5: 형질전환 세포주의 제조

5-1: 형질전환

사람의 간암 세포주의 일종인 Huh-7 세포를 10% 소태아혈청 (FBS; Hyclone사), 페니실린, 스트렙토마이신을 포함하는 Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM; Gibco-BRL에서 구입) 하에서 배양하여 세포주를 준비하였다.

상기 실시예 4에서 전사과정을 통해 얻어진 정량 리플리콘 RNA를 일렉트로포레이션으로 상기 세포주 내로 형질전환시켰다. 형질전환 직후 세포주를 10% FBS를 포함하는 DMEM 배지에서 하루 동안 배양한 후, G418 (600 mg/ml)을 포함하는 배양액으로 상기 배양배지를 치환하여 37℃에서 배양하였다. Huh-7 세포주내에서 복제되는 리플리콘을 가지는 세포주만을 선별하기 위해서 3 내지 4일 간격으로 G418 (600 mg/ml)을 포함하는 배양액으로 배양 배지를 치환하였다. G418의 존재 하에서 지속적으로 배양한 후, 2 내지 3주 후에 콜로니(colony)를 형성하는 세포주를 픽킹 (picking)하여 세포주의 양을 증폭시켰다.

상기 실시예 1 및 4에 따라 제조된 NK-RN 리플리콘 DNA 및 그 전사체로 형질전환시킨 간암세포주는 대한민국 대전광역시 유성구 어은동 52번지에 소재한 생명공학연구소 유전자 은행에 2002년 7월 25일에 기탁하여 각각 수탁번호 KCTC 10309BP 및 KCTC10310BP 를 받았다.

5-2: 콜로니 형성 효율 확인

G418의 존재 하에서 상기 NK5.1, 및 NK-RN 리플리콘의 전사체로 형질전환된 세포주를 지속적으로 배양한 후, 2 내지 3주 후에 콜로니를 관찰한 후, 70% 메탄올에 0.5% 크리스탈 바이올렛(Crystal violet)을 용해시킨 용액을 이용하여 세포를 고정, 염색하였다. 0.5 또는 5 mg의 전사체를 일렉트로포레이션을 하여 얻어진 콜로니의 염색 결과는 도 2와 같다. 전사체 없는 세포주를 음성대조군으로 제조하였다.

형질전환된 RNA의 단위 농도 당 생성된 콜로니 개수를 서로 비교하였다. 기존 리플리콘 (NK5.1)의 경우, 사용한 RNA 1 mg 당 약 10⁴개의 콜로니를 형성하였다 (도 2). HCV 복제정량 리플리콘인 NK-RN의 경우, 단위 RNA 농도 당 약 10¹~ 10²개의 콜로니를 형성한다. 이러한 콜로니 형성 효율의 감소는 발현 유전자인 레닐라 루시퍼레이즈와 선별 마커인 니오마이신 포스포트랜스퍼레이즈 (neo)를 융합시켰기 때문에 neo의 안정도가 낮아졌기 때문이라고 생각된다. HCV의 내부 라이보좀 도입 자리(Internal Ribosomal Entry site; IRES)의 뉴클레오타이드 1-119를 포함하고 폴리오바이러스의 전체 IRES를 가지고 있는 키메라 리플리콘인 NK/H(1-119)/P (Kim et al., 2002, Biochem. Biophys. Res. Commun. 290, 105-112)의 경우에 비해서도 다소 적은 콜로니 형성 효율을 보였다. 전사체 없이 형질전환된 음성 대조군의 경우, 어떠한 콜로니도 관찰되지 않았다(도 2의 mock).

실시예 6: 형질전환 세포주로부터 HCV 단백질의 검출

NK5.1 리플리콘을 포함하는 형질전환 세포주, 실시예 2의 HCV 복제정량 리플리콘인 NK-RN, 및 HCV의 내부 라이보좀 도입 자리(Internal Ribosomal Entry site; IRES)의 1-119를 포함하고 폴리오바이러스의 전체 IRES를 가지고 있는 키메라 리플리콘인 NK/H(1-119)/P를 포함하는 형질전환 세포주가 발현하는 각각의 HCV 단백질을 확인하기 위해서 웨스턴 블랏을 수행하였다 (도 3). 각각의 리플리콘을 지니는 세포 추출물을 12% SDS-PAGE에 로딩해서 전기영동한 후, 니트로셀룰로스 멤브레인 (nitrocellulose membrane)으로 이동시켰다. 상기 멤브레인을 5% 스킴 밀크 (skimmed milk)가 용해된 TBS 완충액 (20 mM Tris-HCl pH 7.5, 150 mM NaCl, 0.5% Tween-20)에 3시간 이상 블로킹 (blocking)을 하였다. 그런 후, HCV NS5A (Dr. Francesco R.에게서 얻음) 또는 NS5B (Dr. Francesco R.에게서 얻음)를 인식하는 각각의 항체와 반응시키고, 홀스래디쉬 퍼옥시데이즈 (horseradish peroxidase)가 연결된 2차 항체 (Amersham사)를 이용하여 웨스턴 블랏을 수행하였다.

도 3에 나타난 바와 같이, NS5A, NS5B, Actin에 대한 항체로 웨쓰턴블랏을 수행한 결과, 정량가능한 리플리콘인 NK-RN을 지니고 있는 세포주의 경우, 기존의 서브제놈믹 리플리콘인 NK 5.1을 지니고 있는 세포주에 비해 매우 적은량의 NS5A와 NS5B 단백질을 발현하고 있음을 관찰하였다. 키메라 리플리콘인 NK/H(1-119)/P를 지니는 세포주의 믹스처 (mixture) 또는 단일 콜로니에서 얻어진 세포주 [NK/H(1-119)/P #6]의 경우에 비해서도 다소 적은 양을 발현하였다. 이는 최초의 일렉트로포레이션을 한 후 단위 RNA 농도 당 콜로니 형성 효율을 비교함으로써 미루어 짐작 가능한 결과이었다. 실제로 NK 5.1은 10⁴, NK/H(1-119)/P은 10², 본 발명에 따른 정량 HCV 리플리콘인 NK-RN의 경우 단위 RNA 농도 당 약 10¹~ 10²개의 콜로니를 형성하였다. 로딩의 보정을 위한 Actin으로 웨쓰턴 블랏을 수행한 결과 모든 레인에 비슷한 양의 단백질이 로딩 되었음을 알 수 있었다.

실시예 7: 인터페론 알파를 이용한 HCV 복제 정량

7-1: NK-RN 리플리콘을 이용한 HCV 복제 정량

본 발명에 따른 또한 상기 정량가능한 HCV 리플리콘 RNA 전사체로 형질전환된 세포주에 유일한 HCV의 치료제로 알려진 인터페론 알파 (IFN-℃)의 효과를 검증하였다. 상기 실시예 2에서 제조한 NK-RN 리플리콘 전사체로 형질전환된 간암 세포주에 인터페론 알파를 0, 50, 100, 200 및 400 IU/ml로 처리하였다. 자세하게는 대량 배양된 NK-RN 세포주를 일정량 분주하였다. 하루 동안 배양시킨 후, 인터페론 알파가 첨가된 새 배양액으로 교체하였다. 그 후 하루 동안 더 배양시킨 후 세포내에 존재하는 발현 유전자인 레닐라루시퍼라아제를 정량하였다.

도 4에 나타난 바와 같이, 인터페론 알파의 50 IU/ml의 처리는 HCV 리플리콘의 복제에 따른 레닐라 루씨퍼레이즈의 발현양을 90% 이상 저해하는 것을 알 수 있었다. 50 IU/ml 이상의 인터페론 알파처리는 더 이상의 감소 효과를 보이지는 않았다. 이는 50 IU/ml 농도의 인터페론 알파를 처리함은 본 발명에 따른 NK-RN을 지니는 세포주에서 바이러스의 복제를 저해하기에 충분함을 나타낸다. 또한, 인터페론 알파는 HCV의 저해제로 기존에 알려져 있음을 고려할 때, 본 발명에 따른 정량 리플리콘인 NK-RN의 경우, 레닐라 루씨퍼레이즈의 발현 정도는 HCV의 복제정도를 그대로 반영하고 있음을 또한 보여주고 있다.

7-2: NK/HG/P 리플리콘을 이용한 HCV 복제정량

NK/HG/P를 지니는 세포주는 발현 유전자가 레닐라 루씨퍼레이즈가 아니라 살아있는 세포를 그대로 이용하여 발현을 관찰할 수 있는 녹색 형광 단백질을 리포터 유전자로 포함하고 있다. 따라서, 발현 유전자의 발현 정도는 자외선을 세포에 조사함으로써 나타나는 녹색 형광 단백질(Green fluorescence)을 관찰함으로써 알 수 있었다. 더욱 상세하게는 NK/HG/P를 지니는 세포주에서는 C형 간염바이러스가 복제함에 비례하여 세포내 녹색 형광 단백질을 발현한다. 녹색 형광 단백질의 특징은 자외선을 조사하는 상태에서 녹색 파장만을 통과시키는 필터를 이용하여 세포를 관찰하면 녹색 형광 단백질에서 나오는 녹색의 형광을 관찰할 수 있다.

도 5에서와 같이, G418에서 선별과정을 거쳐 얻어진 혼합 세포주에서 녹색 형광 단백질의 신호가 약하게 관찰되었다. 정상 세포의 이미지와 겹쳐봄으로써, 녹색 형광 단백질의 신호는 세포에서 특이적으로 발현됨을 알 수 있었다. 또한, 모든 선택된 세포주에서 고르게 관찰되지 않는다는 점을 고려해 볼 때, HCV의 복제는 특정 상태에 있는 세포에서만 활발히 일어나고 있음을 시사하고 있다.

본 발명에 따른 정량 HCV 리플리콘의 전사체로 형질전환된 세포주를 이용하여 고등세포에 근간한 하이 트루아웃 스크리닝 (high throughout screening) 방식으로 저해제 탐색하는 방법을 제공한다. 또한, 본 발명에 따른 정량 리플리콘과 이를 포함하는 세포주를 이용한 HCV 저해제 탐색방법은, 재조합된 HCV 단백질을 이용하거나 프로테아제 또는 폴리머라아제의 활성에 근간한 기존의 탐색시스템에 비하여, 고등세포 내에서 효율적으로 복제를 하는 C형 간염바이러스의 정량 리플리콘을 이용한다는 점에서 보다 정확성이 높은 HCV의 복제 정도를 탐지하는 방법 및 저해제 탐색 방법을 제공할 수 있다.

도 1은 종래에 알려진 HCV 리플리콘인 NK5.1의 구조, 폴리오바이러스의 내부 라이보좀 도입자리를 포함하는 키메라 리플리콘(NK/H(1-119)/P)의 구조, HCV의 모든 단백질을 발현하는 전장 리플리콘(FK)의 구조, 및 본 발명의 일례에 따른 리포터 유전자를 포함하는 HCV 리플리콘의 구조를 나타내는 개략도이다.

도 2는 본 발명의 일례에 따른 리플리콘의 RNA 전사체로 형질전환된 세포주의 콜로니 개수를 나타내는 도면이다.

도 3은 실시예 6에 따라 NK5.1 리플리콘을 지니는 세포주, NK/H(1-119)/P 리플리콘의 혼합 세포주, 단일 콜로니 NK/H(1-119)/P #6, 및 본 발명의 일례에 따른 NK-RN를 지니는 세포주에서 HCV 단백질의 발현 양상을 나타내는 도면이다.

도 4는 본 발명의 일례에 따른 NK-RN 리플리콘을 포함하는 세포주 및 인터페론-알파를 이용하여 HCV의 복제를 정량한 결과를 나타내는 그래프이다.

도 5는 본 발명의 일례에 따른 NK/HG/P 리플리콘을 포함하는 세포주 및 인터페론-알파를 이용하여 HCV 복제를 정량한 결과를 나타내는 형광사진이다.

Claims

5' 방향부터 3'방향으로

(a) 5' 말단이 C형 간염바이러스(Hepatitis C Virus, HCV)의 내부 라이보좀 도입 자리(Internal Ribosomal Entry site; IRES);

(b) HCV의 코어 유전자, E1 유전자, E2 유전자, p7 유전자, 및 NS2 유전자로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 폴리뉴클레오타이드;

(c) 폴리오바이러스의 IRES;

(d) 선별 마커를 코딩하는 서열;

(e) 엔세팔로마이오카디티스 바이러스(Encephalomyocarditis; EMCV)의 IRES; 및

(f) HCV의 NS3에서부터 NS5B까지의 비구조 유전자 영역과 HCV의 3' NTR(non-translated region);

를 포함하며,

발현가능하도록 연결된 리포터 단백질을 코딩하는 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는, HCV의 복제 정량용 DNA 리플리콘 (Replicon).
삭제
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제 1 항에 있어서, 상기 리포터 단백질을 코딩하는 서열은 리포터 단백질과 선별 마커의 융합 단백질을 코딩하는 서열로서 폴리오바이러스 IRES의 3' 말단에 연결된 것인 DNA 리플리콘.
삭제
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제 1항 또는 5항에 있어서, 상기 리포터 단백질은 레닐라 루시퍼라아제(Renilla luciferase), 파이어플라이 루시퍼레이즈 (Firefly luciferase), 녹색 형광 단백질(Green fluorescence protein), 및 SeAP, 씨크리티드 알칼라인 포스파타아제 (Secreted alkaline phosphatase)단백질로 이루어진 군에서 선택되는 것인 DNA 리플리콘.
삭제
제 1항 또는 5항에 따른 HCV의 DNA 리플리콘으로부터 전사된 RNA 전사체.
제 10 항에 따른 HCV의 RNA 전사체로 형질전환된 세포주.
제 11 항에 있어서, 상기 세포주가 간암세포주인 세포주.
삭제
(a) 제 1항 또는 5항에 따른 HCV의 복제 정량 DNA 리플리콘을 포함하는 세포주에 HCV의 복제 저해제를 처리한 후 세포주를 배양하고,

(b) 상기 리포터 단백질의 발현정도를 측정함으로써 HCV의 복제를 정량하여, HCV의 복제 저해제를 탐색하는 방법.
제 14 항에 있어서, 상기 리포터 단백질은 레닐라 루시퍼라아제(Renilla luciferase), 파이어플라이 루시퍼레이즈 (Firefly luciferase), 녹색 형광 단백질(Green fluorescence protein), 및 SeAP 씨크리티드 알칼라인 포스파타아제 (Secreted alkaline phosphatase)단백질로 이루어진 군에서 선택되는 것인 방법.
제 14 항에 있어서, 상기 세포주가 간암세포주인 세포주.
삭제