CN102596244A - 丙型肝炎病毒疫苗组合物 - Google Patents

Abstract

找出诱导具有HCV感染抑制活性的抗体的HCV抗原和最适合的佐剂的组合，提供有效的HCV疫苗组合物。丙型肝炎病毒疫苗组合物，其包含：将由含编码来自丙型肝炎病毒的JFH1株的NS3蛋白、NS4A蛋白、NS4B蛋白、NS5A蛋白及NS5B蛋白的序列的丙型肝炎病毒基因组制作的感染性丙型肝炎病毒颗粒灭活获得的灭活病毒颗粒；序列表的SEQ ID NO：5记载的含非甲基化CpG的寡核苷酸；以及氢氧化铝。

Description

丙型肝炎病毒疫苗组合物

技术领域

本发明涉及丙型肝炎病毒疫苗组合物。

背景技术

丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus；下文有时简称“HCV”)是作为非甲非乙型肝炎的主要致病病毒被发现的(非专利文献1)。HCV是具有约9.6kb的单股正链RNA作为基因组的RNA病毒，该基因组编码翻译后由来自宿主的信号肽酶或来自HCV的蛋白酶切割为10种病毒蛋白(核心、E1、E2、p7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A及NS5B)的前体蛋白。其中，核心、E1、E2及p7蛋白被分类为结构蛋白，NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A及NS5B蛋白被分类为非结构蛋白。HCV还根据基因组核苷酸序列的不同，被分类为10种以上的基因型(例如1a、1b、2a、2b、3a及3b)(非专利文献2～4)，可通过HCV抗体检测、HCV核心抗原检测或者核酸扩增检测来判定基因型。

已知HCV通过血液由人传染给人，感染者约60～80％引起慢性肝炎，在不实施适当治疗置之不理的情况下，感染后约20～30年左右引起肝硬化或肝癌。因此，希望早期检测出HCV的感染，以预防慢性肝炎的发病，同时希望发病后进行早期治疗。

作为丙型肝炎的主要治疗方法，干扰素的单独给予或者干扰素与利巴韦林的联合疗法是很普遍的，但最近明确，干扰素的治疗效果因HCV基因型的不同而有着较大的差异，对基因型为1a或1b的HCV难以发挥作用(非专利文献5和6)。而且，即使在干扰素的效果被认为较好的基因型为2a的HCV与2b的HCV之间，也逐渐明确干扰素的抗病毒作用的强度存在差异，并且暗示与2b的HCV相比，对2a的HCV的作用更强(非专利文献7)。

因此，希望开发出一种HCV疫苗，其能预防感染HCV后尚未发生慢性肝炎的病毒携带者发生慢性肝炎，或者在慢性肝炎发病后增强自身免疫而排除HCV。

然而，获得具有感染性的HCV颗粒(下文有时简称“感染性HCV颗粒”)和测试HCV的感染抑制效果较为困难，同时，找出增强发挥感染抑制效果所必需的体液免疫和细胞免疫的佐剂与抗原的组合也较为困难，因此尚未开发出具有足够感染抑制活性的HCV疫苗组合物。

一般来说，佐剂根据物理性质，可以分为粒状佐剂和非粒状佐剂。

粒状佐剂可举例如：铝盐、油包水型乳剂、水包油型乳剂、免疫刺激复合物、脂质体以及纳米和微粒子，单独与抗原混合使用的情况居多。其中，氢氧化铝(下文有时简称“Alum”)作为炎性低的佐剂用于医药用途。然而，已知Alum在与抗原效价为中位至低位的抗原组合时，不能增强发挥感染抑制效果所必需的体液免疫和细胞免疫，不适合用作佐剂。

另一方面，非粒状佐剂可举例如：胞壁酰二肽(由分枝杆菌提取的肽聚糖的佐剂活性成分)、非离子性嵌段共聚物、皂角苷(从Quillajasaponaria树的树皮提取的三萜系化合物的复合混合物)、脂质A(带有长度一般为C12～C16的5个或6个脂肪酸链和2个磷酸根(phosphateradicals)的葡糖胺的二糖类)、细胞因子、核酸、碳水化合物聚合体、衍生化多糖类以及细菌毒素(例如霍乱毒素和大肠杆菌热不稳定毒素)，和粒状佐剂并用的情况居多。

作为被用作佐剂的核酸，含有未经甲基化修饰的CpG二核苷酸基序(motif)的寡脱氧核苷酸(下文有时简称“CpG-ODN”)(非专利文献8)和双股RNA(下文有时简称“dsRNA”)是已知的。

据报导，在CpG-ODN中，含有由6碱基回文结构基序构成的CpG基序的CpG-ODN诱导强的细胞毒活性，其中5’-AACGTT-3’、5’-AGCGCT-3’以及5’-GACGTC-3’这三个序列特别强地诱导细胞毒活性(非专利文献9)。现在，明确了CpG-ODN是TLR9的配体，并且判明了CpG-ODN通过活化TLR9来诱导免疫应答。

代表性的dsRNA可举例如：多核糖肌苷酸(polyI)和多核糖胞苷酸(polyC)杂交而获得的多核糖肌苷酸-多核糖胞苷酸(下称“polyI:C”)，还已知polyI:C与聚L赖氨酸、羧甲基纤维素的复合体polyICLC(非专利文献10)；以及polyI:C的C部分被U取代的polyI:PolyC12U(其中，每12个C被1个U取代)为毒性少的dsRNA(非专利文献11)。已经明确polyI:C为I型干扰素的诱导剂，并且为TLR3的配体。

作为HCV疫苗开发中使用的抗原蛋白的候选，报道了重组蛋白(专利文献1和2)、合成肽(专利文献3)、病毒样颗粒(专利文献4)、裸DNA(专利文献5)、病毒颗粒(专利文献6和7)。

专利文献1中公开了通过将HCV的结构蛋白即E1和E2蛋白作为抗原，将MF59(亚微粒的水包油型乳剂)和CpG-ODN作为佐剂混合，抗E1和E2蛋白的抗体效价上升，但没有明确由此所产生的抗体的HCV感染抑制活性。

专利文献2中公开了通过将HCV的E1和E2蛋白作为抗原，将polyI:C作为佐剂混合，抗E1和E2蛋白的抗体产生量增加，然而，与专利文献1同样，没有公开抗体的HCV的感染抑制活性。

专利文献6和7中记载了以HCV颗粒本身作为抗原的疫苗，但没有关于佐剂的记载，或者只是例示了一般的佐剂，另外完全没有公开由该疫苗引起的抗体产生能和抗体的HCV的感染抑制活性。

非专利文献12中公开了通过将HCV的核心蛋白、NS3蛋白、NS4蛋白和NS5蛋白作为抗原，将Alum和CpG-ODN作为佐剂混合，抗核心蛋白、NS3蛋白、NS4蛋白和NS5蛋白的抗体产生量增加，但与专利文献1和2同样，未公开抗体的HCV的感染抑制活性。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：日本特表2005-502611号公报

专利文献2：日本特许第4286138号说明书

专利文献3：日本特表2009-513542号公报

专利文献4：日本特表2001-504337号公报

专利文献5：日本特开2009-183295号公报

专利文献6：国际公开第05/080575号

专利文献7：国际公开第06/022422号

非专利文献

非专利文献1：Choo等，Science，1989年，244卷，359～362页

非专利文献2：Simmonds等，Hepatology，1994年，10卷，1321～1324页

非专利文献3：Okamoto等，J.Gen.Virol.，1992年，73卷，73～679页

非专利文献4：Mori等，Biochem.Biophys.Res.Commun.，1992年，183卷，334～342页

非专利文献5：Fried等，N.Engl.J.Med.，2002年，347卷，975～982页

非专利文献6：Lusida等，J.Clin.Microbiol.，2001年，39卷，3858～3864页

非专利文献7：Murakami等，Hepatology，1999年，30卷，1045～1053页

非专利文献8：Yamamoto等，Jpn，J.Cancer Res.1988年，79卷，866-873页

非专利文献9：Yamamoto等，J.Immunol.1992年，148卷，4072-4076页

非专利文献10：Nakamura等，J.Interferon Res.1982年，2卷，1-4页

非专利文献11：Laurence等，J.Clin.Invest.19878年，80卷，1631-1639页

非专利文献12：Vajdy等，J.Gen.Virol.2006年，87卷，2253-2262页

发明内容

发明要解决的课题

本发明的课题在于：找出诱导具有HCV感染抑制活性的抗体的HCV抗原和最适合该抗原的佐剂的组合，提供有效的HCV疫苗组合物。

解决课题的手段

以HCV颗粒粘附和感染细胞所需的包膜蛋白即E2蛋白作为抗原对小鼠进行免疫，评价其血清中抗E2蛋白的抗体效价时，显示为高值。以往，人们一直认为抗E2蛋白的抗体效价和抗体的感染抑制活性相关，而本发明人的研究结果却惊人地发现这一说法未必正确。也就是说，如本说明书的实施例所示，本发明人证实：将用Alum和CpG-ODN作为佐剂的、含E2蛋白的疫苗对小鼠进行接种时，血清中抗E2蛋白的抗体效价上升，但HCV感染抑制活性却不上升。

因此，为了探索诱导具有感染抑制活性的抗体的HCV抗原和佐剂的组合，在细胞培养系中产生感染性HCV颗粒、纯化、灭活，然后制作与各种佐剂组合的疫苗组合物，并给予小鼠。测定给予后各小鼠血清中的抗HCV E2蛋白的抗体效价和HCV的感染抑制活性时，发现：如上所述，即使使用对HCV E2蛋白显示高抗体效价的佐剂，HCV感染抑制活性也未必为高值；通过使用灭活HCV颗粒+Alum+CpG-ODN的疫苗组合物，不仅抗E 1蛋白和E2蛋白的抗体效价，而且HCV的感染抑制活性也呈高值，从而完成了本发明。即，本申请的发明包含以下内容。

本发明提供丙型肝炎病毒疫苗组合物，其包含灭活病毒颗粒、序列表的SEQ ID NO：5记载的含非甲基化CpG的寡核苷酸以及氢氧化铝，所述灭活病毒颗粒如下获得：由包含编码来自丙型肝炎病毒的JFH1株的NS3蛋白、NS4A蛋白、NS4B蛋白、NS5A蛋白以及NS5B蛋白的序列的丙型肝炎病毒基因组制作感染性丙型肝炎病毒颗粒，将其灭活。优选该感染性丙型肝炎病毒基因组为包含编码来自丙型肝炎病毒的J6CF株的核心蛋白、E1蛋白、E2蛋白以及p7蛋白的序列的上述丙型肝炎病毒疫苗组合物。

还优选该感染性丙型肝炎病毒基因组为包含编码来自丙型肝炎病毒的J6CF株的NS2蛋白的N末端氨基酸残基至第16位氨基酸残基的序列，以及编码来自丙型肝炎病毒的JFH1株的NS2蛋白的始自N末端的第17位氨基酸残基至C末端的氨基酸残基的序列的上述丙型肝炎病毒疫苗组合物。

本发明还提供丙型肝炎病毒疫苗组合物，其包含灭活病毒颗粒、序列表的SEQ ID NO：5记载的含非甲基化CpG的寡核苷酸以及氢氧化铝，所述灭活病毒颗粒通过将包含来自丙型肝炎病毒的JFH1株的NS3蛋白、NS4A蛋白、NS4B蛋白、NS5A蛋白以及NS5B蛋白的感染性丙型肝炎病毒颗粒灭活获得。优选该感染性丙型肝炎病毒为包含来自丙型肝炎病毒的J6CF株的核心蛋白、E1蛋白、E2蛋白以及p7蛋白的上述丙型肝炎病毒疫苗组合物。

还优选该感染性丙型肝炎病毒为：NS2蛋白为嵌合蛋白，且上述NS2蛋白的N末端的氨基酸残基至第16位氨基酸残基来自J6CF株、上述NS2蛋白的始自N末端的第17位氨基酸残基至C末端的氨基酸残基来自JFH1株的上述丙型肝炎病毒疫苗组合物。

本发明还提供丙型肝炎病毒疫苗组合物，其包含灭活的基因型2a的丙型肝炎病毒颗粒、序列表的SEQ ID NO：5记载的含非甲基化CpG的寡核苷酸(CpG-ODN)以及氢氧化铝。优选该基因型2a的丙型肝炎病毒颗粒具有基因型2a的丙型肝炎病毒的结构蛋白，特别是来自J6CF株的结构蛋白(核心蛋白、E1蛋白、E2蛋白及p7蛋白)。优选该基因型2a的丙型肝炎病毒颗粒具有基因型2a的丙型肝炎病毒的E2蛋白，特别是来自J6CF株的E2蛋白。还优选该基因型2a的丙型肝炎病毒颗粒为通过表达具有分别编码来自丙型肝炎病毒的至少1种毒株的NS2蛋白、来自JFH1株的NS3蛋白、NS4A蛋白、NS4B蛋白、NS5A蛋白以及NS5B蛋白的核苷酸序列的HCV基因组而产生的病毒颗粒。还优选该基因型2a的丙型肝炎病毒颗粒为通过表达包含下述核苷酸序列的嵌合HCV基因组而产生的病毒颗粒，所述核苷酸序列包含：分别编码来自J6CF株的结构蛋白(核心蛋白、E1蛋白、E2蛋白以及p7蛋白)、来自J6CF株和JFH1株的嵌合蛋白即NS2蛋白(NS2蛋白的N末端的氨基酸残基至第16位氨基酸残基来自J6CF株，且上述NS2蛋白的始自N末端的第17位氨基酸残基至C末端的氨基酸残基来自JFH1株)、以及来自JFH1株的NS2以外的非结构蛋白(NS3蛋白、NS4A蛋白、NS4B蛋白、NS5A蛋白以及NS5B蛋白)的核苷酸序列；5’非翻译区以及3’非翻译区。

本说明书包含作为本申请的优先权基础的日本专利申请2009-228145号的说明书和/或附图所记载的内容。

发明效果

通过本发明，可以提供有效预防丙型肝炎病毒感染的疫苗组合物。

附图说明

[图1]以J6E2Fc蛋白(5μg或20μg)作为抗原，以及以Alum或Mod87s单独或组合作为佐剂，间隔2周给予小鼠2次。最终给予10天后采集血清，稀释1000倍、3000倍、10000倍，用EIA测定抗J6E2蛋白的抗体效价，显示其结果。

[图2]以J6E2Fc蛋白(20μg)作为抗原，以及以Alum+Mod87s作为佐剂，间隔2周给予小鼠2次，将最终给予10天后采集的血清样品稀释100倍，测定J6CF HCVpp的感染抑制活性，显示其结果。

[图3]以灭活J6/JFH1-HCV颗粒(2pmol)作为抗原，以及以Alum、Mod87s或者polyI:C单独或组合作为佐剂，间隔2周给予小鼠4次，将最终给予1周后采集的血清样品稀释3000倍，测定抗E1蛋白的抗体效价。图中的Saline(盐水)表示仅给予了生理盐水的小鼠的血清。

[图4]以灭活J6/JFH1-HCV颗粒(2pmol)作为抗原，以及以Alum、Mod87s或者polyI:C单独或组合作为佐剂，间隔2周给予小鼠4次，将最终给予1周后采集的血清样品稀释3000倍，测定抗E2蛋白的抗体效价。图中的Saline(盐水)表示仅给予了生理盐水的小鼠的血清。

[图5]以灭活J6/JFH1-HCV颗粒(2pmol)作为抗原，以及以Alum、Mod87s或者polyI:C单独或组合作为佐剂，间隔2周给予小鼠4次，将最终给予1周后采集的血清样品稀释100倍，测定J6CF HCVpp(基因型2a)的感染抑制活性，显示其结果。图中的Saline(盐水)表示仅给予了生理盐水的小鼠的血清。

[图6]以灭活J6/JFH1-HCV颗粒(2pmol)作为抗原，以及以Alum、Mod87s或者polyI:C单独或组合作为佐剂，间隔2周给予小鼠4次，将最终给予1周后采集的血清样品稀释100倍，测定H77HCVpp(基因型1a)的感染抑制活性，显示其结果。图中的Saline(盐水)表示仅给予了生理盐水的小鼠的血清。

[图7]以灭活J6/JFH1-HCV颗粒(2pmol)作为抗原，以及以Alum、Mod87s或者polyI:C单独或组合作为佐剂，间隔2周给予小鼠4次，将最终给予1周后采集的血清样品稀释100倍，测定TH HCVpp(基因型1b)的感染抑制活性，显示其结果。图中的Saline(盐水)表示仅给予了生理盐水的小鼠的血清。

[图8]以灭活J6/JFH1-HCV颗粒(2pmol)作为抗原，以及以Alum、Mod87s或者polyI:C单独或组合作为佐剂，间隔2周给予小鼠4次，将最终给予1周后采集的血清样品稀释100倍，测定J6/JFH1HCVcc(基因型2a)的感染抑制活性，显示其结果。图中的Saline(盐水)表示仅给予了生理盐水的小鼠的血清。

[图9]以灭活J6/JFH1-HCV颗粒(2pmol)作为抗原，以及以Alum、Mod87s或者polyI:C单独或组合作为佐剂，间隔2周给予小鼠4次，将最终给予1周后采集的血清样品稀释100倍，测定TH/JFH1HCVcc(基因型1b)的感染抑制活性，显示其结果。图中的Saline(盐水)表示仅给予了生理盐水的小鼠的血清。

具体实施方式

下面详细说明本发明。

本发明涉及疫苗组合物，其包含：优选将产自特定的HCV基因组的HCV颗粒(优选感染性HCV颗粒)灭活，以此作为抗原制造的适于诱导抑制HCV感染的抗体的佐剂以及该抗原。

本发明可以使用在该领域技术范围内的分子生物学和免疫学的现有技术进行实施。这种技术已在文献中充分说明。参照例如Sambrook等，Molecular Cloning：A Laboratory Manual Cold SpringHarbor Laboratory(第3版，2001)；Ed Harlow等，Antibodies：ALaboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory(1988)。

本说明书中引用的所有刊物、专利和专利申请都作为参考，整体援引到本说明书中。

(1)HCV颗粒的制作

可用于生成可用于本发明的HCV疫苗组合物的抗原的感染性HCV颗粒的HCV基因组的例子具体有：基因型2a的JFH1株的病毒基因组RNA，该RNA从5’一侧向3’一侧顺序由5’非翻译区、核心蛋白编码区域、E1蛋白编码区域、E2蛋白编码区域、p7蛋白编码区域、NS2蛋白编码区域、NS3蛋白编码区域、NS4A蛋白编码区域、NS4B蛋白编码区域、NS5A蛋白编码区域、NS5B蛋白编码区域以及3’非翻译区的核苷酸序列构成。或者，该HCV基因组也可以是由2种以上的HCV株的病毒基因组RNA构成的嵌合RNA。例如，从5’一侧向3’一侧顺序由JFH1株以外的HCV株的5’非翻译区、核心蛋白编码区域、E1蛋白编码区域、E2蛋白编码区域及p7蛋白编码区域；JFH1株以外的HCV株或者JFH1株的NS2蛋白编码区域；以及JFH1株的NS3蛋白编码区域、NS4A蛋白编码区域、NS4B蛋白编码区域、NS5A蛋白编码区域、NS5B蛋白编码区域以及3’非翻译区的核苷酸序列构成的嵌合RNA。或者，该HCV基因组还可以是从5’一侧向3’一侧顺序由JFH1株以外的HCV株的5’非翻译区、核心蛋白编码区域、E1蛋白编码区域、E2蛋白编码区域及p7蛋白编码区域；以及来自一个以上的HCV株的嵌合NS2蛋白编码区域、NS3蛋白编码区域、NS4A蛋白编码区域、NS4B蛋白编码区域、NS5A蛋白编码区域、NS5B蛋白编码区域及3’非翻译区的核苷酸序列构成的嵌合RNA。

因此，为制作本发明中使用的感染性HCV颗粒而使用的HCV基因组的1个优选方案至少含有分别编码JFH1株的非结构蛋白即NS3蛋白、NS4A蛋白、NS4B蛋白、NS5A蛋白、以及NS5B蛋白的核苷酸序列。这样，将保有JFH1株的全长或JFH1株的基因组的一部分、获得了自主复制能力、病毒产生能力的病毒称为“来自JFH1的病毒”。

本发明中优选的1个方案的HCV基因组的例子为：从5’一侧向3’一侧顺序由来自基因型2a的JFH1株的全长基因组(例如，具有SEQID NO：1所示核苷酸序列的基因组；关于RNA，SEQ ID NO：1所示核苷酸序列中的“T(胸腺嘧啶)”改读为“U(尿嘧啶)”。本说明书中，关于其他核苷酸序列，以下也同样)构成的HCV基因组。或者为：从5’一侧向3’一侧顺序由来自基因型2a的J6CF株的5’非翻译区、核心蛋白编码区域、E1蛋白编码区域、E2蛋白编码区域、p7蛋白编码区域及NS2蛋白编码区域的N末端至16位氨基酸残基；以及JFH1株的NS2蛋白编码区域的始自N末端的17位氨基酸残基至C末端、NS3蛋白编码区域、NS4A蛋白编码区域、NS4B蛋白编码区域、NS5A蛋白编码区域、NS5B蛋白编码区域以及3’非翻译区的核苷酸序列构成的嵌合基因组。该特别优选的例子为克隆到由SEQ ID NO：2的核苷酸序列构成的J6/JFH1中的核酸。

在本发明特别优选的方案中，上述HCV(嵌合)基因组为由SEQID NO：1或2所示核苷酸序列构成的核酸。在本发明的感染性HCV颗粒的制造中可以使用HCV基因组RNA或者HCV基因组DNA。

本发明还优选的1个方案的HCV基因组的例子为：JFH1株的5’非翻译区；基因型1b的TH株(Wakita，T.等，J.Biol.Chem.，269，14205-14210，1994，日本特开2004-179)的核心蛋白编码区域、E1蛋白编码区域、E2蛋白编码区域及p7蛋白编码区域；以及JFH1株的NS2蛋白编码区域、NS3蛋白编码区域、NS4A蛋白编码区域、NS4B蛋白编码区域、NS5A蛋白编码区域、NS5B蛋白编码区域及3’非翻译区的核苷酸序列按该顺序连接而成的HCV嵌合基因组，优选为来自JFH1株的5’非翻译区；TH株的核心蛋白编码区域、E1蛋白编码区域、E2蛋白编码区域、p7蛋白以及NS2蛋白编码区域的编码N末端至33位氨基酸残基的区域；以及JFH1株的NS2蛋白编码区域的编码始自N末端的34位氨基酸残基至C末端的区域，NS3蛋白编码区域、NS4A蛋白编码区域、NS4B蛋白编码区域、NS5A蛋白编码区域、NS5B蛋白编码区域以及3’非翻译区的核苷酸序列按该顺序连接而成的HCV嵌合基因组。该特别优选的例子为克隆到SEQ IDNO：3的核苷酸序列所示TH/JFH1中的核酸。

本发明特别优选的方案中，上述HCV嵌合基因组为由SEQ IDNO：3所示核苷酸序列构成的核酸。在本发明的感染性HCV颗粒的制造中可以使用HCV基因组RNA或者HCV基因组DNA。

即，本发明是以如下HCV颗粒作为抗原的疫苗，得自：从5’一侧向3’一侧顺序由HCV的J6CF株的5’非翻译区、核心蛋白编码区域、E1蛋白编码区域、E2蛋白编码区域及p7蛋白编码区域；以及JFH1株的NS2蛋白编码区域、NS3蛋白编码区域、NS4A蛋白编码区域、NS4B蛋白编码区域、NS5A蛋白编码区域、NS5B蛋白编码区域及3’非翻译区的核苷酸序列连接而成的HCV嵌合基因组的HCV颗粒，优选得自：从5’一侧向3’一侧顺序由J6CF株的5’非翻译区、核心蛋白编码区域、E1蛋白编码区域、E2蛋白编码区域、p7蛋白编码区域及NS2蛋白编码区域的编码N末端至16位氨基酸残基的序列；以及JFH1株的NS2蛋白编码区域的编码始自N末端的17位氨基酸残基至C末端的区域、NS3蛋白编码区域、NS4A蛋白编码区域、NS4B蛋白编码区域、NS5A蛋白编码区域、NS5B蛋白编码区域以及3’非翻译区的核苷酸序列连接而成的HCV嵌合基因组的HCV颗粒。

本发明中优选的其他方案的HCV基因组的例子为：用于制作本发明中使用的感染性HCV颗粒而使用的HCV基因组至少含有分别编码基因型2a的J6CF株的结构蛋白即核心蛋白、E1蛋白、E2蛋白及p7蛋白的核苷酸序列。

上述感染性HCV颗粒可以如下制作：由将上述完全长度的HCV基因组RNA的cDNA克隆到转录启动子下游的载体(例如，在T7启动子的控制下克隆HCV基因组DNA的载体)合成RNA，将该RNA导入细胞中。以在T7启动子的控制下克隆了HCV cDNA的核酸作为模板，在体外制作RNA的方法可以用MEGAscript T7试剂盒(Ambion公司)等合成。导入RNA的细胞只要是容许形成HCV颗粒的细胞即可，可举例如Huh7细胞、HepG2细胞、IMY-N9细胞、HeLa细胞、293细胞等培养细胞，更优选的例子有Huh7细胞等来自肝脏的培养细胞，更为合适的有Huh7细胞、以及Huh7细胞的衍生细胞即Huh7.5细胞、Huh7.5.1细胞。还可以举出Huh7细胞、HepG2细胞、IMY-N9细胞、HeLa细胞或者293细胞中表达CD81基因和/或Claudin1基因的细胞，其中优选使用Huh7细胞或者Huh7细胞的衍生细胞。本发明中“衍生细胞”是指由该细胞诱导的细胞株。

作为将RNA导入细胞的方法，可以使用公知的任意方法。这种方法有磷酸钙共沉淀法、DEAE葡聚糖法、脂质转染法、显微注射法、电穿孔法，优选脂质转染法和电穿孔法，更优选电穿孔法。

细胞的病毒颗粒产生能力可以使用针对构成释放到培养液中的HCV病毒颗粒的要素(例如核心蛋白、E1蛋白或E2蛋白)的抗体来检测。还可以通过使用特异性引物的RT-PCR法将培养液中的HCV病毒颗粒所含有的HCV基因组RNA扩增而检测，从而间接地检测HCV病毒颗粒的存在。

制作的病毒颗粒是否具有感染能力可以如下判断：培养用上述方法导入了HCV RNA的细胞，将获得的上清液处理(添加)到HCV感染感受性细胞(例如Huh7)中，例如在48小时后用抗核心抗体对细胞进行免疫染色，对感染细胞数进行计数，或者将细胞的提取物通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶进行电泳，用蛋白质印迹法检测核心蛋白。

本说明书中，将由来自JFH1株的全长基因组制作的病毒颗粒称为“JFH1-HCV”，由J6/JFH1基因组制作的病毒颗粒称为“J6/JFH1-HCV”，由TH/JFH1基因组制作的病毒颗粒称为“TH/JFH1-HCV”。这些颗粒是来自JFH1的病毒。

本发明中，基因型2a的丙型肝炎病毒颗粒，如下面所述，也可以根据需要进行纯化、并且进行灭活，用作本发明的疫苗组合物的抗原。作为基因型2a的丙型肝炎病毒颗粒，优选具有基因型2a的丙型肝炎病毒的结构蛋白，特别是来自J6CF株的结构蛋白(核心蛋白、E1蛋白、E2蛋白及p7蛋白)的病毒颗粒。优选该基因型2a的丙型肝炎病毒颗粒为具有基因型2a的丙型肝炎病毒的E2蛋白，特别是来自J6CF株的E2蛋白的病毒颗粒。作为由来自J6CF株的结构蛋白即核心蛋白、E1蛋白、E2蛋白及p7蛋白构成的多蛋白区域，优选由通过SEQ ID NO：2所示序列上的341位～2779位核苷酸序列所编码的氨基酸序列构成的区域。

再有，从具有感染性及自主复制性的观点来看，优选该基因型2a的丙型肝炎病毒颗粒为通过表达含有分别编码来自丙型肝炎病毒的至少1种毒株的NS2蛋白，以及来自JFH1株的NS3蛋白、NS4A蛋白、NS4B蛋白、NS5A蛋白和NS5B蛋白的核苷酸序列的HCV基因组而产生的病毒颗粒。这种基因型2a的丙型肝炎病毒(颗粒)可以为嵌合病毒(颗粒)。优选该基因型2a的丙型肝炎病毒颗粒为通过表达包含下述核苷酸序列的嵌合HCV基因组而产生的病毒颗粒，所述核苷酸序列包含：来自丙型肝炎病毒的任一毒株的5‘非翻译区；分别编码来自J6CF株的结构蛋白(核心蛋白、E1蛋白、E2蛋白及p7蛋白)、来自J6CF株和JFH1株的嵌合蛋白即NS2蛋白(NS2蛋白的N末端的氨基酸残基至第16位氨基酸残基来自J6CF株，且上述NS2蛋白的始自N末端的第17位氨基酸残基至C末端的氨基酸残基来自JFH1株)、以及来自JFH1株的NS2以外的非结构蛋白(NS3蛋白、NS4A蛋白、NS4B蛋白、NS5A蛋白及NS5B蛋白)的核苷酸序列；以及来自丙型肝炎病毒的任一毒株的3’非翻译区。

(2)病毒颗粒的纯化

将含有上述(1)中获得的HCV颗粒的病毒液用离心和/或过滤器等除去细胞和细胞残渣。除去了残渣的溶液也可以使用截留分子量100,000至500,000的超滤膜浓缩至10～100倍左右。除去了残渣的含HCV颗粒的溶液可以将下述色谱法和密度梯度离心按任意顺序组合、或者单独进行纯化。下面描述了代表性的色谱法、密度梯度离心的方法，但并不限于这些方法。

凝胶过滤色谱法可以优选通过使用以烯丙基葡聚糖和N，N’-亚甲基双丙烯酰胺的交联聚合物作为凝胶基质的色谱载体，且优选由Sephacryl(注册商标)S-300、S-400或S-500构成的色谱，进行HCV颗粒的纯化。

离子交换色谱法可以优选用Q-Sepharose(注册商标)等作为阴离子交换树脂来进行HCV颗粒的纯化。还可以优选使用SP Sepharose(注册商标)等作为阳离子交换树脂来进行HCV颗粒的纯化。

亲和色谱法中作为配体，可以优选将选自肝素、硫酸化Cellulofine、凝集素及各种色素的基质结合而成的树脂用作载体，进行HCV颗粒的纯化。更优选可以利用HiTrap Heparin HP(注册商标)、HiTrap Blue HP(注册商标)、HiTrap Benzamidine FF(注册商标)、硫酸化Cellulofine以及LCA、ConA、RCA-120和WGA结合而成的载体来纯化HCV颗粒。最优选的手法为将硫酸化Cellulofine用作载体来纯化HCV颗粒，作为纯化前和纯化后溶液中的总蛋白量与HCV的RNA拷贝数的比率，可以纯化至30倍以上。

用密度梯度离心进行的纯化中，作为形成密度梯度的溶质，优选可以使用氯化铯、蔗糖、Nycodenz(注册商标)以及称为Ficoll(注册商标)和Percoll(注册商标)的糖聚合体。更优选可以使用蔗糖。作为使用的溶剂，优选可以使用水或者磷酸缓冲液、Tris缓冲液、乙酸缓冲液或甘氨酸缓冲液等缓冲液。通过密度梯度离心进行纯化时的离心力优选为1×10⁴～1×10⁹g，更优选为5×10⁴～1×10⁷g，最优选为5×10⁴～5×10⁵g。

进行纯化时的温度优选为0～40℃，更优选为0～25℃，最优选为0～10℃。

也可以用超滤膜浓缩HCV颗粒，之后通过密度梯度离心纯化HCV颗粒。而且，在将密度梯度离心和柱色谱法组合进行纯化的情况下，无论按何种顺序何种组合均可，但优选通过多个柱色谱法纯化后使用密度梯度离心的组合，更优选将使用阴离子交换柱、之后再用亲和色谱法获得的含HCV颗粒的组分用密度梯度离心进行纯化的组合，最优选将使用Q-Sepharose(注册商标)的柱获得的含HCV颗粒的组分用使用硫酸Cellulofine的柱进一步纯化，将所得含HCV颗粒的组分用密度梯度离心纯化的组合。需要说明的是，柱色谱法和密度梯度离心的步骤之间可以通过使用透析、超滤，进行含HCV颗粒的溶液的溶质置换和/或HCV颗粒的浓缩。

(3)病毒颗粒的灭活

本发明的疫苗以灭活HCV颗粒作为抗原。关于本发明的疫苗，由于HCV对啮齿类不显示感染性，因此该HCV颗粒有无感染性，在使用啮齿类进行评价时不成问题，但向人接种时需要使用灭活的HCV颗粒。作为将HCV颗粒灭活的方法，可以将福尔马林、β-丙内酯、戊二醛等灭活剂添加混合到例如病毒悬液中，通过与病毒反应来实现(Appaiahgari等人，Vaccine，22：3669-3675，2004)。还有通过用紫外线照射HCV颗粒，使病毒失去感染性，迅速灭活的方法。紫外线照射对构成病毒的蛋白等的影响小，可以进行病毒的灭活，因此优选。作为用于灭活的紫外线的线源，可以使用一般市售的杀菌灯，特别是使用15W杀菌灯进行，但并不限于此。另外，在本发明中，HCV颗粒使用通过上面所述方法纯化的颗粒，但本灭活方法不受纯化、未纯化等状态限制。优选可以通过将含感染性HCV颗粒的溶液用20mW/cm²的紫外线在室温下照射5分钟以上来灭活感染性HCV颗粒。

(4)佐剂

佐剂可以使用已经作为疫苗用佐剂得到认可的氢氧化铝(Alum)、正在进行临床试验的双股RNA(dsRNA)、含非甲基化CpG的寡核苷酸(CpG-ODN)。

dsRNA可举例如polyI:C，polyICLC或polyIpolyC 12U。

本发明疫苗中所含的免疫刺激寡核苷酸含有非甲基化CpG即可，优选为国际公开专利07/139190号中记载的寡核苷酸。更优选为GGGGGGGCGACGATCGTCAGG(SEQ ID NO：4：称为Mod87)。

具有磷酸二酯骨架的寡核苷酸的分解通过核酸外切酶和核酸内切酶介导。已知通过对核苷酸之间的键进行硫代磷酸修饰，获得对这些核酸酶的抵抗性。作为一部分核苷酸残基间被修饰的寡核苷酸，例如有5’和3’末端的核苷酸之间具有硫代磷酸修饰键的寡核苷酸、PolyG序列的核苷酸之间具有硫代磷酸修饰键的寡核苷酸，对核酸外切酶具有耐性。

因此，作为更优选的寡核苷酸，可举例如：SEQ ID NO：4的寡核苷酸的5’-末端的Poly G序列和3’-末端一侧最末端的磷酸二酯键被硫代磷酸修饰的EEEEEEECGACGATCGTCAEG(SEQ ID NO：5；将硫代磷酸化的鸟嘌呤(G)记作E，称为“Mod87s”)。

(5)疫苗组合物及其效果

本发明的疫苗组合物可以如下制造：通过用常规方法将上述方法等制造的灭活丙型肝炎病毒颗粒和佐剂，特别是将序列表的SEQ IDNO：5记载的含非甲基化CpG的寡核苷酸和氢氧化铝混合，制造丙型肝炎病毒疫苗组合物。本发明的疫苗组合物中含有0.001～99.999重量％作为抗原的灭活HCV颗粒即可。

给予量是根据对象者的年龄、患者的症状、治疗目的、给予途径等适当选择的，只要是能激活可防止HCV感染或发病的免疫的量即可，通常，成人每次的给予量优选0.1mg～10000mg，更优选1mg～100mg。另外，初次给予后，通过在2周、4周、6周、8周、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月或1年以上之后追加给予1次以上本发明的疫苗组合物，可维持免疫应答诱导能力。因此，给予次数优选2次以上，更优选2～6次，更加优选3～5次，最优选4次。

本发明疫苗组合物的效果可通过将本疫苗给予动物，检测免疫反应诱导的抗HCV抗体来评价。作为免疫中使用的动物，为黑猩猩、猴、小鼠、大鼠、仓鼠，兔子等非人动物(例如非人哺乳动物)的任一种均可，但本发明中优选小鼠，使用小鼠的例子如下所示。

通常，通过将上述(1)～(3)的步骤获得的HCV颗粒作为抗原，将抗原和佐剂一起数次给予4～10周龄的小鼠来进行免疫。作为佐剂，可以单独或组合使用(4)中所示的Alum、CpG-ODN、dsRNA。

疫苗组合物给予后，由给予小鼠的尾静脉采血，如下面(6)所述，测定血清中抗HCV蛋白的抗体效价，由此可以测定疫苗组合物的免疫应答诱导的程度。已知HCV经由包膜蛋白感染细胞，因此优选测定抗包膜蛋白(例如E1、E2蛋白)的抗体效价。更优选，如下面(7)所述，通过测定HCV感染抑制活性来查证疫苗组合物的效果。

(6)抗体效价测定

为了评价本发明疫苗组合物的效果，将HCV的蛋白固定(固相化)于载体，接着添加血清，在血清中的抗体和固相化的抗原足以形成复合体的时间和条件下使其反应即可。接下来，使生成的复合体与识别血清中抗体的抗体(二次抗体)接触，生成第2混合物，所述血清中抗体结合有作为信号的酶、色素或放射性同位素。使第2混合物在足以形成抗体/抗原复合体的时间和条件下反应。通过用酶、色素或放射性同位素的信号检测，来检测识别HCV蛋白的抗体的存在。

作为固相化于载体上的HCV蛋白，可以使用HCV颗粒本身，也可以使用由HCV基因组中的核心蛋白编码区域、E1蛋白编码区域、E2蛋白编码区域、p7蛋白编码区域、NS2蛋白编码区域、NS3蛋白编码区域、NS4A蛋白编码区域、NS4B蛋白编码区域、NS5A蛋白编码区域和/或NS5B蛋白编码区域的核苷酸序列构成的cDNA，也可以使用在大肠杆菌、酵母、哺乳动物细胞、昆虫细胞等中表达的、编码这些区域的蛋白，还可以化学合成该蛋白使用。

使J6CF株的包膜蛋白在哺乳动物细胞中表达的方法记载于日本专利申请2007-193413号和日本专利申请2008-254338号中。具体来说，在以J6CF株全长蛋白的氨基酸序列(NCBI蛋白质登录号AAF01178.1)的起始甲硫氨酸作为第1位的情况下，J6CF株的E1蛋白始自上述的192位的氨基酸残基，止于383位的氨基酸残基。J6CF株的E2蛋白始自上述氨基酸序列的384位的氨基酸残基，止于750位的氨基酸残基。该E1蛋白的353位的氨基酸残基至383位的氨基酸残基、E2蛋白的722位的氨基酸残基至750位的氨基酸残基被认为是跨膜域(Cocquerel，L.等人，J.Virol.74：3623-3633，2000)。

利用哺乳动物细胞使蛋白在培养上清液中分泌表达的情况下，该蛋白需要携带信号肽，不具有跨膜域。

因此，在J6CF株中，E1蛋白的情况下，如果为192位的氨基酸残基至352位的氨基酸残基内的序列，E2蛋白的情况下，如果为384位的氨基酸残基至720位的氨基酸残基内的序列，则可用作不含跨膜域的蛋白。

使E1或E2蛋白的不含跨膜域的蛋白在哺乳动物细胞中分泌表达时，在密码子的框架(读框)符合的状态(in-frame，符合读框)下将该蛋白编码的核酸连接到编码信号肽的核酸的下游，再在其3’末端附加终止密码子插入表达载体中。信号肽由分泌蛋白的N末端存在的15～30氨基酸残基、主要为疏水性氨基酸构成，参与蛋白的细胞膜通透机制。

可用于在哺乳动物细胞中分泌表达蛋白的信号肽是分泌蛋白的信号肽即可。作为携带信号肽的载体，可举例如：携带小鼠GM-CSF的信号肽序列的载体(日本特开昭63-276490)、携带IgGκ链的信号肽序列的载体pSecTag/FRT/V5-His(Invitrogen公司)、携带前胰蛋白酶原的信号肽序列的载体p3XFLAG-CMV13(Sigma公司)、携带IL-2的信号肽序列的载体pFUSE-Fc2(Invivogen公司)以及携带IgM的信号肽序列的载体pTriEx-7(Novagen公司)等。

表达蛋白时，以目标蛋白与标记蛋白的融合蛋白形式表达，可以用抗标记蛋白的抗体或特异性结合分子来进行融合蛋白的检测或纯化。这种标记蛋白也称为标签(Tag)。对标记蛋白没有限定，例如有FLAG肽(flag肽，也称为Flag肽)、3×FLAG肽(也称为3×FLAG肽、3×Flag肽、3×flag肽)、HA肽、3×HA肽、myc肽、6×His肽、GST多肽、MBP多肽、PDZ域多肽、碱性磷酸酶、免疫球蛋白、抗生物素蛋白等。这些肽或多肽通常融合到目标蛋白的N末端或C末端，但根据情况也可以插入目标蛋白内。另外，携带前胰蛋白酶原信号肽和3×FLAG肽的融合多肽的载体可以作为p3×FLAG-CMV-9购自Sigma公司。

(7)感染抑制测定

为了测定疫苗组合物给予后的动物血清样品是否具有HCV的感染抑制活性，可以使用感染性HCV样颗粒(HCVpp)或感染性HCV颗粒(HCVcc)。

通过在逆转录病毒颗粒上提呈功能性HCV包膜蛋白，可以制作感染性HCV样颗粒。通过在这些感染性HCV样颗粒中包装绿色荧光蛋白标记基因、荧光素酶基因，能够以高可靠性迅速地测定HCV包膜蛋白介导的感染(Bartosch，B.等人.J.Exp.Med.197：633-642，2003)。

具体来说，例如，通过使用FuGENE6，将编码基因型2a的HCV株即J6CF的蛋白(NCBI蛋白质登录号AAF01178.1)的132位的氨基酸残基至750位的氨基酸残基(核心蛋白的一部分、E1、E2蛋白)的核酸克隆至pcDNA3.1的载体pcDNA J6dC-E2、克隆了编码小鼠白血病病毒的gag和pol的基因的表达载体Gag-Pol 5349、以及克隆了荧光素酶基因的逆转录病毒载体Luc126转染到293T人胚肾细胞(ATCCCRL-1573)中，可以生产HCVpp。转染后，回收含假颗粒的培养液，用0.45μm的薄膜滤器过滤，可以作为HCVpp样品。

制作携带基因型1a的包膜蛋白的HCVpp时，可以使用将编码基因型1a的HCV即H77的蛋白(NCBI蛋白质登录号AAB67036.1)的132位氨基酸残基至746位氨基酸残基(核心蛋白的一部分、E1、E2蛋白)的核酸克隆至pcDNA3.1的载体pcDNA H77dC-E2。制作携带基因型1b的包膜蛋白的HCVpp时，可以使用将编码基因型1b的HCV即TH的蛋白(Wakita，T.等人，J.Biol.Chem.，269，14205-14210，1994)的132位氨基酸残基至747位氨基酸残基(核心蛋白的一部分、E1、E2蛋白)的核酸克隆至pcDNA3.1的载体pcDNA THdC-E2。

例如，将HCVpp和稀释的血清样品混合，在室温下反应30分钟。血清的稀释用DMEM培养基(含10％FCS(Invitrogen公司)，1％MEM非必需氨基酸溶液(Invitrogen公司)、10mM HEPES-Tris(pH7.3)、1mM丙酮酸钠的DMEM)进行。向前一天在96孔板上按1×10⁴细胞/孔培养的Huh7.5.1细胞中添加上述HCVpp和血清样品的混合液，在37℃培养3小时。培养后除去样品，用PBS洗涤细胞1次，然后加入新鲜培养基继续培养。72小时后，除去培养上清液，用PBS洗涤4次，然后加入25μL/孔的DMEM培养基和25μL/孔的Steady-Glo(Promega公司：目录号E2520)，按所附的说明书溶解细胞，将细胞的溶解液按40μL/孔移至白色的96孔板(住友Bakelite公司：目录号MS-8496W)上，用ARVO X4(PerkinElmer公司)测定发光强度。

以和DMEM混合时的值作为100％感染，用％表示和血清样品混合时荧光素酶的活性后，可以求出感染抑制活性(％)。

例如，将HCVcc和稀释的血清样品混合，在室温下反应30分钟。血清的稀释用DMEM培养基(含10％FCS(Invitrogen公司)、1％MEM非必需氨基酸溶液(Invitrogen公司)、10mM HEPES-Tris(pH7.3)、1mM丙酮酸钠的DMEM)进行。向前一天在96孔板上按1×10⁴细胞/孔培养的Huh7.5.1细胞中添加J6/JFH1-HCV颗粒等的HCVcc和血清样品的混合液，在37℃培养3小时。培养后除去样品，用PBS洗涤细胞1次，然后加入新鲜培养基继续培养。72小时后，除去培养上清液，将板浸在冰冷却的甲醇中，固定细胞。之后，风干除去甲醇，用含0.3％Triton(注册商标)-X100(GE Healthcare公司)的BlockAce(注册商标)(大日本制药公司)进行细胞的可溶化处置。与HRP标记抗HCV-核心抗体(Ortho公司)反应后，用QuantaBlu(注册商标)(PIERCE公司)反应液检测丙型肝炎病毒感染细胞。加入QuantaBlu终止液后，按20μL/孔移至黑色的384孔板(Corning公司：目录号3676)，用ARVOX4(PerkinElmer公司)测定荧光强度。

以和DMEM混合时的值作为100％感染，用％表示和血清样品混合时QuantaBlu的荧光强度后，可以求出感染抑制活性(％)。

按以上的操作可以确认，本发明的疫苗组合物具有显著优异的感染抑制活性。而且，该疫苗组合物不仅对用作抗原的基因型2a的HCV，对其他各种基因型(例如1a、1b、2b等)的HCV也可发挥优异的感染抑制活性，是有利的。

实施例

下面，基于实施例更具体地说明本发明。

(实施例1)

J6/JFH1-HCV颗粒的制作

将分离自暴发性肝炎患者的丙型肝炎病毒(HCV)JFH1株(基因型2a)的基因组RNA全部区域逆转录获得的cDNA(基因组cDNA)克隆至pUC19质粒的T7RNA启动子序列的下游，将获得的质粒DNA即pJFH1(Wakita，T.等人，Nat.Med.，11(2005)791-796页及国际公开WO 2004/104198)用EcoR I消化后，进一步用Bcl I部分消化，制备切除了EcoR I部位至最初的BclI部位的片段(约2840bp)的质粒DNA片段，将其纯化。

另一方面，将来自HCV J6CF株的基因组cDNA(GenBank登录号AF177036，Yanagi，M.，等人，Virology 262：250-263(1999))克隆至pUC19质粒的T7 RNA启动子序列的下游，将获得的质粒DNA即pJ6CF(国际公开WO 2006/022422)用EcoR I和Bcl I部分消化，将获得的约2840bp的片段纯化，将该片段连接至切除了上述EcoRI-Bcl I片段的pJFH1质粒片段，制作质粒DNA pJ6/JFH1。克隆至该pJ6/JFH1中的DNA(SEQ ID NO：2)为嵌合病毒基因组cDNA，其是使JFH1株基因组cDNA的编码NS2蛋白的17位氨基酸残基至C末端的区域的序列，顺序编码NS3蛋白、NS4A蛋白、NS4B蛋白、NS5A蛋白及NS5B蛋白的序列以及3’非翻译区与J6CF株基因组cDNA的5’非翻译区，编码核心蛋白、E1蛋白、E2蛋白及p7蛋白的序列以及编码NS2蛋白的N末端至16位氨基酸残基的区域的序列连接而成的。

用XbaI切割上述pJ6/JFH1后，加入绿豆核酸酶20U(总反应液量50μL)在30℃培育30分钟，由此使XbaI切割末端平滑。接下来，进行苯酚-氯仿提取、乙醇沉淀，获得除去了CTAG的4碱基的XbaI切割片段。以该DNA作为模板，用MEGAscript T7试剂盒(Ambion公司)合成RNA。将如此合成的HCV RNA用于以下的细胞导入。

将3×10⁶个的Huh-7细胞和5μg的HCV RNA悬浮于Cytomix溶液(120mM KCl、0.15mM CaCl₂、10mM K₂HPO₄/KH₂PO₄、25mM Hepes、2mM EGTA、5mM MgCl₂、20mM ATP、50mM谷胱甘肽400μL)中，移至4mm小玻璃管中，然后使用Gene Pulser(BioRad公司)在260V、950μF下使HCV RNA电穿孔至Huh-7细胞中。之后，将HCV RNA导入细胞接种在10cm²培养皿中，进行继代培养。继代时，使用HCV抗原ELISA检测试剂盒(Ortho公司)对培养上清液中所含的HCV核心蛋白进行定量，确认HCV颗粒的产生。选择核心蛋白的量多、HCV颗粒产生的活性高的培养上清液，作为病毒原液(virus stocks)保存。

向用10％FCS-DMEM培养基(1％MEM非必需氨基酸溶液(Invitrogen公司)、10mM HEPES-Tris(pH7.3)、1mM丙酮酸钠)培养的10cm培养皿中的Huh-7细胞中加入上述获得的J6/JFH1病毒原液(4×10⁴ffu/mL)各100μL左右，使HCV病毒感染Huh-7细胞。

细胞适宜在不融合的情况下进行继代，由1个225cm²培养瓶(flask)扩大培养至6个。接下来由其中的5个225cm²培养瓶剥离细胞，接种在3个5层CellSTACK(注册商标)(Corning公司)中，培养基添加至650mL/个。将得自余下1个培养瓶的细胞接种在6个培养瓶中，由此继续以良好的效率产生病毒。

继代次日弃去培养基，加入650mL 2％FCS-DMEM培养基(1％MEM非必需氨基酸溶液(Invitrogen公司)、10mM HEPES(pH7.3)、1mM丙酮酸钠)。培养基更换3天后回收培养基，通过0.45μm过滤器，然后保存在超低温冰柜中。另外，向回收培养上清液后的CellSTACK中加入650mL 2％FCS-DMEM培养基(1％MEM非必需氨基酸溶液、10mM HEPES(pH7.3)、1mM丙酮酸钠)，继续培养。培养基更换2天后进行同样的操作，回收培养上清液。再重复1次同样的操作。这里，将回收的培养上清液用作后述实施例中含有J6/JFH1-HCV颗粒的培养上清液。

(实施例2)

J6/JFH1-HCV颗粒的纯化

将实施例1中产生的J6/JFH1-HCV颗粒用以下3个步骤纯化。

1)浓缩和透析过滤

利用中空纤维滤芯(Hollow Fiber Cartridge)(GE Healthcare公司：500kDa截留，型号UFP-500-C-8A，下称“中空纤维”)，将上述实施例1获得的含HCV颗粒的培养上清液浓缩至60倍。

2)密度梯度超离心

向Ultra-clear 25×89mm离心管(Beckman Coulter公司：目录号344058)中加入3mL冷却的含60％蔗糖的TNE缓冲液(10mM Tris-HCl(pH7.4)、150mM NaCl、1mM EDTA)，覆盖7mL含20％蔗糖的TNE缓冲液。再在含20％蔗糖的TNE缓冲液上覆盖25mL样品。使用SW-28(Beckman Coulter公司)，以28,000转在4℃下超速离心4小时。

使用25G注射针(Terumo公司)在管的底面穿孔，由该孔获得12支1mL的组分。测定各组分溶液的比重，确认形成了蔗糖的密度梯度。由比重大的组分开始，回收第3、4、5号的各个组分，用于浓缩和缓冲液置换。

3)浓缩和缓冲液置换

使用Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Units(排除分子量100kDa，Millipore公司)和TNE缓冲液，将洗脱组分进行缓冲液置换的同时进行浓缩。将如此获得的浓缩液在后述免疫步骤中用作含感染性HCV颗粒的病毒液。

(实施例3)

HCV颗粒的灭活

将实施例2的步骤1)～3)获得的浓缩丙型肝炎病毒通过紫外线照射灭活。使用东芝公司制GL-15作为紫外线的线源。具体来说，将纯化的感染效价1×10⁶ffu/mL的含丙型肝炎病毒颗粒(JFH1株)的溶液装入涂布了硅的聚乙烯制微量离心管(Assist公司制)中，放置在使紫外线的照射强度为20mW/cm²的距离，照射5分钟UV-C。

处置后，将丙型肝炎病毒颗粒在Dulbecco’s改良培养基(Dulbecco’s modified Eagle medium，DMEM)中以50倍、250倍、1250倍、6250倍、31250倍、156250倍、781250倍系列稀释。

前一天，按1×10⁴细胞/孔在96孔聚-L-赖氨酸包被板(Corning公司制；Corning 96孔透明平底聚-L-赖氨酸包被微孔板(Corning 96 WellClear Flat Bottom Poly-L-Lysine Coated Microplate))中接种Huh-7细胞，向其中接种系列稀释的上述病毒颗粒，在37℃培养72小时。

除去培养上清液后，将板浸在冰冷却的甲醇中，固定细胞。之后，风干除去甲醇，用含0.3％Triton(注册商标)-X100(GE Healthcare公司)的BlockAce(注册商标)(大日本制药公司)进行细胞的可溶化处置。使用克隆2H9抗HCV-核心抗体(Wakita，T.等人，Nat.Med.11：791-796，2005)和山羊抗-小鼠IgG-Alexa488(Molecular Probe公司)，检测丙型肝炎病毒感染细胞，在荧光显微镜(Olympus公司制IX-70)下计数。确认紫外线处置后的丙型肝炎病毒的感染效价在检测限以下。在后述实施例中，给予小鼠时使用这种感染性完全消失的HCV颗粒。

(实施例4)

J6E1Fc蛋白及J6E2Fc蛋白的制作

J6E1Fc蛋白及J6E2Fc蛋白按下示方法制作。

(1)构建用于表达在来自HCV2a的J6CF株的E1蛋白中附加了人IgG的Fc蛋白的融合蛋白的载体

以HCV2a的J6CF株的基因组RNA的cDNA(GenBank登录号AF177036)作为模板，利用Advantage GC2PCR试剂盒(Takara Bio公司)，将J6E1F-s(SEQ ID NO：9：CACAAGCTTGCCGAAGTGAAGAACATCAGT)和J6E1F-as(SEQ ID NO：10：TCGGGATCCCAATGAGCCCCGCTAATGATGTC)用作引物，通过PCR法扩增编码E1蛋白的基因，所述E1蛋白为以J6CF株的前体蛋白的N末端的起始甲硫氨酸作为第1位时由第192位～第353位构成的蛋白。

将PCR法扩增的片段克隆至pCR-TOPO(Invitrogen公司)中。分析3个克隆的核苷酸序列，将核苷酸序列正确的克隆命名为“pTOPO-J6E1F”。

接着，用Hind III和BamH I消化p3XFLAG-CMV-13(Sigma公司)，通过琼脂糖凝胶电泳分离后进行纯化。将该DNA片段、以及用Hind III和BamH I消化pTOPO-J6E1F获得的含编码J6CF的E1蛋白的cDNA的DNA片段用T4 DNA连接酶环化。将该载体命名为“CMV-13-J6E1F”。将CMV-13-J6E1F用Sac I和BamH I消化，将编码JFH1的E1蛋白的DNA片段通过琼脂糖凝胶电泳分离，用GeneElute(Sigma公司)纯化。

将表达由小鼠IL-7受体-人免疫球蛋白Fc区域构成的嵌合蛋白的载体CDM-mIL7R-Ig(Sudo等，Proc Natl.Acad Sci USA，1993年，90卷，9125～9129页)用Sac I和BamH I消化，将含编码人免疫球蛋白Fc区域的序列的DNA片段通过琼脂糖电泳分离、纯化。将该DNA片段和上述编码J6E1蛋白的DNA片段用T4DNA连接酶连接，获得表达由J6E1蛋白和免疫球蛋白的Fc区域构成的嵌合蛋白(下称“J6E1Fc蛋白”)的载体“CDM-J6E1Fc”。(2)构建用于表达在来自HCV2a的J6CF株的E2蛋白中附加了人IgG的Fc蛋白的融合蛋白的载体

首先，以HCV2a的J6CF株的基因组RNA的cDNA(GenBank登录号：AF177036)作为模板，利用Advantage GC2 PCR试剂盒(TakaraBio公司)，将J6E2Fc-s(SEQ ID NO：6：CACAAGCTTCGCACCCATACTGTTGGGG)和J6E2Fc-as(SEQ ID NO：7：ACAGGATCCCATCGGACGATGTATTTTGTG)用作引物，通过PCR法扩增编码下述蛋白的基因，所述蛋白为以J6CF株的前体蛋白的N末端的起始甲硫氨酸作为第1位时由相当于第384位～第720位的氨基酸残基的区域构成的蛋白。

接着，将扩增的DNA片段克隆至pCR-TOPO(InVitrogen公司)中，分析3个克隆的核苷酸序列。从具有正确的核苷酸序列的插入片段的克隆中，用Hind III和BamH I消化编码抗原E2蛋白的基因片段并切出，插入p3×FLAG-CMV-13(Sigma公司)的信号肽序列下游的Hind III部位和BamH I部位之间，使符合读框，将该载体命名为“CMV-13-J6E2”。

接下来，将CMV-13-J6E2用Sac I和BamH I消化，将生成的编码信号肽序列和抗原E2蛋白的DNA片段通过琼脂糖凝胶电泳分离，用GeneElute(Sigma公司)纯化。

之后，在表达由小鼠IL-7受体-人免疫球蛋白Fc区域构成的嵌合蛋白的载体CDM-mIL7R-Ig(Sudo等，Proc Natl.Acad Sci USA，1993年，90卷，9125～9129页)的Sac I部位和BamH I部位之间，插入上述编码信号肽序列和抗原E2蛋白的各个DNA片段，使符合读框，获得表达附加了人免疫球蛋白的Fc区域的抗原E2蛋白(下称“J6E2Fc蛋白”)的载体“CDM-J6E2Fc”。

(3)表达HCVE1蛋白或HCVE2蛋白与IgGFc蛋白的融合蛋白

如下所述，将CDM-J6E1Fc或CDM-J6E2Fc导入来自猴肾脏的COS1细胞中，表达各融合蛋白。

首先，用含有10％胎牛血清(Invitrogen公司)、100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素的RPMI1640培养基(Invitrogen公司)继代培养COS1细胞，在基因导入的前一天，以2倍的稀释倍率接种到150cm²培养瓶(Corning Coaster公司)中，在37℃、5％CO₂培养箱中培养一夜。

之后，在RPMI1640培养基中加入DEAE葡聚糖(GE Healthcare公司)和氯喹(Sigma公司)，使其终浓度分别为400μg/mL和100μM，按每13mL为0.1μg/μL的浓度加入50μg上述表达载体CDM-J6E1Fc或CDM-J6E2Fc，培养3～4天。

培养后，吸除COS1细胞的上清液，添加10mL的PBS(-)(日水制药公司)，再次通过吸除PBS(-)洗涤细胞，接下来，按13mL/150cm²培养瓶添加DEAE葡聚糖-DNA混合液，在37℃、5％CO₂存在下静置。

4小时后，吸除DEAE葡聚糖-DNA混合液，用10mL的PBS洗涤1次，按50mL/培养瓶加入Hybridoma-SFM培养基(Invitrogen公司)，在37℃、5％CO₂存在下培养4天。之后，将培养上清液回收到50mL的离心管(Corning Coaster公司)中，在2500rpm、30分钟、4℃下离心分离，将其上清液用0.2μm的过滤器(Whatman公司)过滤。

(3)纯化HCVE1蛋白或HCVE2蛋白与IgGFc蛋白的融合蛋白

使用结合有蛋白-A的载体Prosep-A(Millipore公司)，如下所述将导入了CDM-J6E1Fc或CDM-J6E2Fc的COS1细胞的培养上清液纯化。

首先，将1mL的Prosep-A填充在Econo-Column中，使500mL的培养上清液以1～1.5mL/分钟的流速通过，之后用20mL的PBS(-)洗涤。

接着，用0.1M甘氨酸-HCl(pH3.0)按1mL/组分洗脱出5个组分。洗脱后，立即添加1M Tris-HCl(pH9.5)，返回中性。将各组分的其中20μL在还原下通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分级分离，用考马斯亮蓝染色。结果显示，HCVE1蛋白与人免疫球蛋白Fc区域的融合蛋白(J6E1Fc蛋白)或HCVE2蛋白与人免疫球蛋白Fc区域的融合蛋白(J6E2Fc蛋白)得到纯化，还原下的分子量分别为约60kDa和约97kDa。

(实施例5)

含抗原和佐剂的疫苗组合物的制备

如下所示，以乳剂的形式制备疫苗组合物。

佐剂使用Alum、非甲基化CpG-ODN、polyI:C。Alum使用PIERCE公司的Imject Alum(注册商标)，目录号77161。非甲基化CpG-ODN使用Mod87s(SEQ ID NO：5)。polyI:C购自Yamasa Shoyu公司。这些佐剂单独或组合使用。

单独使用佐剂时，按Alum为200μg/100μL、Mod87s为25μg/100μL、polyI:C为100μg/100μL制备。另外，组合使用佐剂时(Alum+Mod87s、Alum+poly I:C或Mod87s+poly I:C)，按Alum为200μg/50μL、Mod87s为25μg/50μL、polyI:C为100μg/50μL制备，分别组合使用3种之中的2种佐剂。

用实施例4所示的J6E2Fc蛋白作为抗原时，向100μL 0.2μg/μL的J6E2Fc蛋白溶液(含20μg的J6E2Fc蛋白)中加入50μL的Alum和Mod87s，形成乳剂。需要说明的是，将5μg的J6E2Fc蛋白作为抗原时，向25μL 0.2μg/μL的J6E2Fc蛋白溶液中加入75μL的PBS达到100μL，同样地与佐剂混合。

单独使用佐剂时，相对于实施例3所示的、用作抗原的含灭活J6/JFH1-HCV颗粒(相当于2pmol HCV核心的量)的溶液100μL，加入等量的Alum、Mod87s或poly I:C，形成乳剂。另外，组合使用佐剂时，相对于含灭活J6/JFH1-HCV颗粒的溶液100μL，加入分别组合选自50μL的Alum、50μL的Mod87s、50μL的poly I:C中的2种佐剂(合计100μL)，形成乳剂。

(实施例6)

疫苗组合物的免疫应答诱导能力的评价

1.疫苗组合物的给予

1)J6E2Fc嵌合蛋白的给予

向Balb/c小鼠(5周龄，雌)腹腔内给予实施例5制备的含J6E2Fc蛋白(5μg或20μg)的乳剂进行免疫。2周后，同样地腹腔内给予同样制备的含J6E2Fc蛋白的乳剂进一步免疫。血清样品由最终免疫10天后采集的血液制备。

需要说明的是，作为对照，给予生理盐水。

2)灭活J6/JFH1-HCV颗粒的给予

向Balb/c小鼠(5周龄，雌)腹腔内给予实施例5制备的含灭活J6/JFH1-HCV颗粒(相当于2pmol HCV核心的量)的乳剂进行免疫。2周后，同样地腹腔内给予同样制备的含灭活J6/JFH1-HCV颗粒的乳剂进一步免疫。再在4周后及6周后，同样地腹腔内给予进行免疫。血清样品由最终免疫1周后(初次免疫7周后)采集的血液制备。

需要说明的是，作为对照，给予生理盐水。

2.测定抗E1蛋白和E2蛋白的抗体效价

测定上述“1.疫苗组合物的给予”中给予各疫苗组合物小鼠的血清中抗E1蛋白和E2蛋白的抗体效价。抗体效价的测定如下进行：将E1蛋白或E2蛋白固定在板上，用EIA评价疫苗接种小鼠血清中的抗体是否与固定在该板上的E1蛋白或E2蛋白结合。

1)来自J6CF株的E2蛋白的制作

如下所示制备J6CF株的E2蛋白。以来自基因型2a的J6CF株的基因组cDNA(GenBank登录号AF177036)作为模板，使用Advantage GC2 PCR试剂盒(Takara Bio公司)、以及J6E2Fc-s(SEQ IDNO：6：CACAAGCTTCGCACCCATACTGTTGGGG)和J6E2dTM-as(SEQ ID NO：8：GCTCTAGATTACCATCGGACGATGTATTTTGT)，通过PCR法扩增编码E2蛋白的基因，所述E2蛋白为以J6CF全长蛋白序列(J6CF株基因组序列所编码的一个连续的蛋白序列；GenBank登录号AF177036中也有记载的氨基酸序列)的N末端的起始甲硫氨酸作为第1位时相当于384位至720位氨基酸残基的、不含跨膜域的蛋白。将扩增的DNA片段克隆至pCR-TOPO(Invitrogen)中，分析3个克隆的核苷酸序列。将具有正确的核苷酸序列的插入片段的克隆命名为pTOPO-J6E2dTM。

接着，将用Hind III和XbaI消化p3XFLAG-CMV-9(SIGMA)获得的DNA和用Hind III和XbaI自pTOPO-J6E2dTM切出的约1,000bp的DNA片段用T4DNA连接酶连接而环化。将该载体命名为“CMV-3XFLAGJ6E2dTM”。

如下所述，将CMV-3XFLAGJ6E2dTM导入来自猴肾脏的COS1细胞(根据理研细胞银行的保藏号RCB0143获得)表达蛋白。

用含有10％胎牛血清(Invitrogen公司)、100U/mL青霉素、100μg/mL硫酸链霉素的Dulbecco’s MEM(D-MEM：Invitrogen公司)培养COS1细胞。在基因导入前一天，以2倍的稀释倍率将COS1细胞接种到150cm²培养瓶(Corning Coaster)中，在37℃、5％CO₂培养箱中培养一夜。

另一方面，向D-MEM培养基(Invitorogen)中加入DEAE葡聚糖(Pharmacia)和氯喹(SIGMA)，使其终浓度分别为400μg/mL和100μM，再按照每13mL该溶液为0.1μg/μL的浓度加入50μg上述表达载体CMV-3XFLAGJ6E2dTM进行培养。接着，吸除培养的COS1细胞的上清液后，添加10mL的PBS(-)(日水)洗涤细胞1次。吸除PBS(-)后，按照13mL/150cm²培养瓶加入DEAE葡聚糖-DNA混合液，在37℃、5％CO₂存在下培育4小时。

4小时后，吸除DEAE葡聚糖-DNA混合液，用10mL的PBS洗涤1次，按50mL/培养瓶加入CHO-SFM培养基(Invitorogen)，在37℃、5％CO₂存在下培养。4天后，将培养上清液回收至50mL的离心管(Corning Coaster)中。回收的上清液在以6,000rpm(使用HITACHIRPR9-2转子)、30分钟、4℃离心后，用0.2μm的过滤器(Whatman公司)过滤。

使用抗FLAG M2琼脂糖(SIGMA)，如下所述纯化过滤的培养上清液。向500mL的培养上清液中添加1mL的抗FLAG M2琼脂糖，用转瓶边搅拌边在4℃(低温室)下反应2小时。2小时后，将上清液和抗FLAG M2琼脂糖的混合液移至Econo-Column(BIO-RAD)中，回收流出的组分(flow-through fractions)。接着，用10mL的TBS(50mMTris-HCl、150mM NaCl、pH7.4)洗涤2次。用0.1M甘氨酸-HCl(pH3.5)按1mL/组分洗脱出6个组分。洗脱后，立即添加1M Tris-HCl(pH9.5)，返回中性。将各组分的20μL在还原下供给SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，用考马斯亮蓝染色。结果，确认来自J6CF株的E2蛋白得到纯化。将该蛋白称为“J6E2dTM蛋白”。

2)测定血清样品中的抗包膜蛋白的抗体效价

关于由上述“1.疫苗组合物的给予”中给予了各疫苗组合物的小鼠采血得到的血清，通过下示方法测定抗J6CF株的E1蛋白和E2蛋白的抗体效价。关于抗来自J6CF株的E1蛋白的抗体效价，用J6E1Fc蛋白作为抗原，关于抗来自J6CF株的E2蛋白的抗体效价，用J6E2Fc蛋白或J6E2dTM蛋白作为抗原。用PBS将抗原稀释至1μg/mL后，按每50μL/孔添加至酶标板(Immunoplate)(Nunc公司：目录号439454)，通过在室温下培育2小时或在4℃下培育一夜使其固相化。弃去抗原溶液，按每200μL/孔添加用MilliQ水稀释5倍的BlockingOne(Nacalai Tesque公司：目录号03953-95)，在室温下培育1小时或在4℃下培育一夜，进行封闭。封闭结束后，用0.05％吐温20/PBS按150μL/孔洗涤2次，按每50μL/孔添加用0.05％吐温20/PBS稀释至1000～10000倍的血清，在室温下反应1.5小时。反应结束后，用0.05％吐温20/PBS按150μL/孔洗涤3次，按每50μL/孔添加用0.05％吐温20/PBS稀释至5000倍的辣根过氧化物酶复合体化抗小鼠IgG(GE Healthcare公司)，在室温下反应1小时。反应结束后，用0.05％吐温20/PBS洗涤4次，按每50μL/孔添加过氧化物酶显色试剂盒(住友Bakelite公司：目录号ML-1120T)的显色液(含1/100量的基质液)，在室温下培育5分～15分钟。通过按每50μL/孔添加停止液终止反应，用Benchmark Plus(Bio-Rad公司)测定450nm的吸光度。

3.测定中和效价

通过评价由上述1.中给予各疫苗组合物的小鼠采血得到的血清样品中的抗体是否可抑制HCVpp感染或HCVcc感染来检验疫苗效果。

1)感染性HCV样颗粒(HCVpp)的制作

HCVpp的制作按照Bartosch等的方法进行(文献：Bartosch，B.等人，(2003)J.Exp.Med.，197，633-642)。该方法如下：通过使3种载体(表达逆转录病毒的Gag-pol的载体、表达HCV的包膜蛋白的载体、表达报道基因的逆转录病毒包装载体)在动物细胞中表达，报道基因被包装，制作在其病毒表面表达HCV包膜蛋白的假病毒。

为了制作携带基因型2a的包膜蛋白的HCVpp，使用将编码基因型2a的HCV株即J6CF的蛋白(NCBI蛋白质登录号AAF01178.1)的132位的氨基酸残基至750位的氨基酸残基(核心蛋白的一部分、E1、E2蛋白)的核酸克隆至pcDNA3.1而获得的表达载体pcDNA J6dC-E2。为了制作携带基因型1a的包膜蛋白的HCVpp，使用将编码基因型1a的HCV即H77的蛋白(NCBI蛋白质登录号AAB67036.1)的132位的氨基酸残基至746位的氨基酸残基(核心蛋白的一部分、E1、E2蛋白)的核酸克隆至pcDNA3.1而获得的表达载体pcDNA H77dC-E2。为了制作携带基因型1b的包膜蛋白的HCVpp，使用将编码基因型1b的HCV即TH的蛋白(Wakita，T.等人，J.Biol.Chem.，269：14205-14210，1994；Moradpour，D.等人，Biochem.Biophys.Res.Commun.，246：920-924，1998；以及国际公开WO2006/022422)的132位的氨基酸残基至747位的氨基酸残基(核心蛋白的一部分、E1、E2蛋白)的核酸克隆至pcDNA3.1而获得的表达载体pcDNA THdC-E2。

作为将编码小鼠白血病病毒的gag和pol的基因克隆化的表达载体，使用Gag-Pol 5349。作为将荧光素酶基因克隆化的逆转录病毒包装载体，使用Luc126。

293T细胞在10％FCS-DMEM培养基(1％MEM非必需氨基酸溶液(Invitrogen公司)、10mM HEPES(pH7.3)、1mM丙酮酸钠、100单位/mL青霉素、100μg/mL链霉素(Gibco公司：目录号15140-122))(下称“DMEM-10F”)中继代培养。培养使用胶原包被的培养瓶(IWAKI公司：目录号4100-010和4160-010)。将293T细胞接种在胶原包被的10cm培养皿中(IWAKI公司：目录号4020-010)，达到2.5×10⁶细胞/培养皿，培养一夜。将下示量的Opti-MEM(Gibco公司：目录号11058)、FuGENE6(Roche公司：目录号11814443001)以及3种构建物(construct)(HCV包膜蛋白表达载体、Gag-Pol 5349及Luc 126)按Opti-MEM为500μL、FuGENE6为21.6μL、HCV包膜蛋白表达载体为1μg、Gag-Pol 5349为3.1μg、Luc126为3.1μg(或与它们相同的构成比)进行混合，在室温下培育15分钟。将293T细胞的培养基更换为Opti-MEM 7.5mL，向其中添加DNA复合体，在37℃、5％CO₂下培育6小时。反应结束后，用PBS洗涤1次，添加8mL DMEM-10F，在37℃、5％CO₂下培育48小时。培养结束后，回收上清液，将用0.45μm过滤器过滤所得的溶液作为HCVpp溶液。HCVpp按每1mL分注，在-80℃下保存。

将如此获得的携带基因型2a的J6CF株的结构蛋白的假HCV颗粒称为“J6CF HCVpp”，携带基因型1a的H77株的结构蛋白的假HCV颗粒称为“H77 HCVpp”，携带基因型1b的TH株的结构蛋白的假HCV颗粒称为“TH HCVpp”。

2)感染抑制活性的测定

对于由上述“1.疫苗组合物的给予”中给予各疫苗组合物进行免疫的小鼠采集的血清，通过下示方法测定HCV感染抑制活性。

(A)使用HCVpp病毒的HCV感染抑制活性

将Huh7.5.1细胞按1×10⁴细胞/孔接种在96孔板(包被poly-D-lysin)上，培养一夜。向上述1)的步骤获得的J6CF HCVpp病毒液(培养上清液)中等量混合小鼠血清，在室温下培育30分钟。小鼠血清用DMEM培养基(含10％FCS(Invitrogen公司)、1％MEM非必需氨基酸溶液(Invitrogen公司)、10mM HEPES-Tris(pH7.3)、1mM丙酮酸钠的DMEM)稀释50倍使用(小鼠血清的最终稀释倍率100倍)。弃去细胞的培养基后，加入小鼠血清按50μL/孔加入培育的病毒液，在37℃下培育3小时。弃去病毒液后，用PBS按100μL/孔洗涤1次，加入200μL/孔的DMEM培养基，在37℃下培育72小时。弃去培养基后，加入25μL/孔的DMEM培养基和25μL/孔的Steady-Glo(Promega公司：目录号E2520)，按所附的说明书溶解细胞。将细胞的溶解液按40μL/孔移至白色的96孔板(住友Bakelite公司：目录号MS-8496W)，使用ARVO X4(PerkinElmer公司)测定发光强度。

此外，为了确认来自用携带基因型2a的结构蛋白的J6/JFH1-HCV颗粒免疫的小鼠的血清对携带基因型1a和1b的结构蛋白的HCV是否具有感染抑制活性，使用H77HCVpp(携带基因型1a的结构蛋白的假HCV颗粒)和TH HCVpp(携带基因型1b的结构蛋白的假HCV颗粒)，通过与上述同样的方法测定小鼠血清的感染抑制活性。(B)使用HCVcc病毒的HCV感染抑制活性

将Huh7.5.1细胞按1×10⁴细胞/孔接种在96孔板(包被poly-D-lysin)上，培养一夜。作为HCVcc病毒液，使用上述实施例2中的步骤1)获得的J6/JFH1-HCV颗粒液(含HCV颗粒的培养上清液的浓缩液)(下称“J6/JFH1 HCVcc”)，向其中等量混合小鼠血清，在室温下培育30分钟。小鼠血清用DMEM培养基(含10％FCS(Invitrogen公司)、1％MEM非必需氨基酸溶液(Invitrogen公司)、10mM HEPES-Tris(pH7.3)、1mM丙酮酸钠的DMEM)稀释50倍使用(小鼠血清的最终稀释倍率100倍)。弃去细胞的培养基后，加入小鼠血清按50μL/孔加入培育的病毒液，在37℃下培育3小时。弃去病毒液后，用PBS按100μL/孔洗涤1次，加入200μL/孔的DMEM培养基，在37℃下培育72小时。除去培养上清液后，将板浸在冰冷却的甲醇中，固定细胞。之后，风干除去甲醇，按100μL/孔加入含0.3％Triton(注册商标)-X100(GEHealthcare公司)的BlockAce(注册商标)(大日本制药公司)，在4℃封闭处置一夜。用PBS按150μL/孔洗涤2次，按50μL/孔加入稀释100倍的HRP标记抗HCV-核心抗体(Ortho公司)，反应1小时，然后用PBS按150μL/孔洗涤4次，按50μL/孔加入QuantaBlu(注册商标)(PIERCE公司)反应液，在室温下静置30分钟，按50μL/孔加入QuantaBlu停止液停止反应。按20μL/孔移至黑色的384孔板(Corning公司：目录号3676)，使用ARVO X4(PerkinElmer公司)测定荧光强度。

此外，为了确认来自用携带基因型2a的结构蛋白的J6/JFH1-HCV颗粒免疫的小鼠的血清对携带基因型1b的结构蛋白的HCVcc是否具有感染抑制活性，使用TH/JFH1-HCV颗粒液(携带基因型1b的结构蛋白的HCVcc颗粒)(下称“TH/JFH1 HCVcc”)，通过与上述同样的方法测定血清的感染抑制活性。需要说明的是，TH/JFH1 HCVcc利用WO2009/131203中记载的方法制备。

4.以J6E2Fc蛋白为抗原的疫苗组合物的免疫应答诱导能力的评价

1)含J6E2Fc蛋白作为抗原的疫苗组合物的免疫应答诱导能力

关于上述“1.疫苗组合物的给予”的1)中给予含J6E2Fc蛋白的疫苗组合物的小鼠，抗E2蛋白的抗体效价测定(上述“2.抗E1蛋白和E2蛋白的抗体效价测定”)的结果示于图1中。图中的对照表示未给予的正常小鼠血清、5μg和20μg表示给予的J6E2Fc蛋白的量，×1000、×3000、×10000表示小鼠血清稀释倍率。如图1所示，确认与单独的Alum、Mod87s相比，Alum+Mod87s诱导抗E2蛋白抗体的活性强。

关于在上述“1.疫苗组合物的给予”的1)中给予含J6E2Fc蛋白的疫苗组合物的小鼠，中和效价(感染抑制率)测定(上述“3.中和效价测定”)的结果中，给予含对E2蛋白显示最高值抗体效价的20μg的J6E2Fc蛋白和作为佐剂的Alum+Mod87s的疫苗组合物的小鼠的结果示于图2。如图2所示，免疫小鼠的血清停留在对J6CF HCVpp显示12％的感染抑制活性。

因此，以J6E2Fc蛋白作为抗原的疫苗组合物，即使在用Alum+Mod87s作为佐剂的情况下，抗E2蛋白的抗体效价也升高，但没有HCV的感染抑制活性。

2)含灭活J6/JFH1-HCV颗粒作为抗原的疫苗组合物的免疫应答诱导能力

关于上述“1.疫苗组合物的给予”的2)中给予含灭活J6/JFH1-HCV的疫苗组合物的小鼠，抗E1蛋白或E2蛋白的抗体效价测定(上述“2.抗E1蛋白和E2蛋白的抗体效价测定”)的结果分别示于图3和图4中。如图3所示，与单独的Alum和单独的Mod87s相比，含单独的polyI:C、Alum+Mod87s、Alum+poly I:C以及Mod87s+poly I:C的疫苗组合物显示出抗E1蛋白的抗体效价有所增加。另外，如图4所示，与单独的Alum和单独的Mod87s相比，含单独的polyI:C、Alum+Mod87s、Alum+poly I:C、Mod87s+poly I:C的疫苗组合物显示出抗E2蛋白的抗体效价有所增加。

关于上述“1.疫苗组合物的给予”的2)中给予含灭活J6/JFH1-HCV的疫苗组合物的小鼠，中和效价(感染抑制率)测定(上述“3.中和效价测定”)的结果示于图5中。如图5所示，使用Alum和Mod87s的组合佐剂的疫苗组合物对J6CF HCVpp显示60％的感染抑制活性，而使用其他佐剂的疫苗组合物，给予使用感染抑制活性最强的、单独的Alum佐剂的疫苗组合物的小鼠仍停留在显示47％的感染抑制活性。

关于上述“3.中和效价测定”的2)中用灭活J6/JFH1-HCV免疫的小鼠的血清，研究免疫使用的基因型2a以外的基因型的HCV的感染抑制能力的结果示于图6(H77HCVpp(携带基因型1a的结构蛋白的假HCV颗粒))和图7(TH HCVpp(携带基因型1b的结构蛋白的假HCV颗粒))中。使用基因型1a的H77HCVpp测定感染抑制活性的结果为：以Alum+Mod87s作为佐剂的疫苗组合物显示84％的感染抑制活性，以Alum单独作为佐剂的疫苗组合物显示70％的感染抑制活性(图6)。另一方面，使用基因型1b的TH HCVpp测定感染抑制活性的结果为：以Alum+Mod87s作为佐剂的疫苗组合物显示72％的感染抑制活性，以Alum单独作为佐剂的疫苗组合物显示55％的感染抑制活性(图7)。

关于上述“1.疫苗组合物的给予”的2)中给予含灭活J6/JFH1-HCV的疫苗组合物的小鼠的血清，使用基因型2a的J6/JFH1HCVcc的中和效价测定(上述“3.中和效价测定”)的结果示于图8中。如图8所示，以Alum+Mod87s作为佐剂的疫苗组合物显示56％的感染抑制活性，而使用其他佐剂的疫苗组合物中，给予使用感染抑制活性最强的、单独的Mod87s和单独的poly I:C佐剂的疫苗组合物的小鼠各自仍停留在显示26％的阻害活性。

关于在上述“3.中和效价测定”的2)中给予含灭活J6/JFH1-HCV的疫苗组合物的小鼠的血清，研究免疫使用的基因型2a以外的基因型的HCVcc的感染抑制能力的结果示于图9中。如图9所示，使用基因型1b的TH/JFH1 HCVcc测定感染抑制活性的结果为：以Alum+Mod87s作为佐剂的疫苗组合物显示42％的感染抑制活性，而使用其他佐剂的疫苗组合物，以感染抑制活性最强的Mod87s+polyI:C作为佐剂的疫苗组合物为27％。

由这些结果可知，Alum+Mod87s的佐剂有利地诱导显示HCV的感染抑制活性的抗体。而且，这些结果显示：在用基因型2a的HCV免疫诱导的抗体中，不仅存在抑制基因型2a的HCV感染的抗体，也存在抑制基因型1a和1b的HCV感染的抗体。

[序列表自由文本]

SEQ ID NO：1：JFH1

SEQ ID NO：2：合成DNA J6/JFH1

SEQ ID NO：3：合成DNA TH/JFH1

SEQ ID NO：4：合成寡核苷酸Mod87

SEQ ID NO：5：合成寡核苷酸Mod87s。1～7及20位的碱基为硫代磷酸酯化的鸟嘌呤。

SEQ ID NO：6：引物J6E2Fc-s

SEQ ID NO：7：引物J6E2Fc-as

SEQ ID NO：8：引物J6E2dTM-as

Claims (6)

1.丙型肝炎病毒疫苗组合物，其包含：

将由含编码来自丙型肝炎病毒的JFH1株的NS3蛋白、NS4A蛋白、NS4B蛋白、NS5A蛋白及NS5B蛋白的序列的丙型肝炎病毒基因组制作的感染性丙型肝炎病毒颗粒灭活获得的灭活病毒颗粒；

序列表的SEQ ID NO：5记载的含非甲基化CpG的寡核苷酸；以及

氢氧化铝。

2.权利要求1记载的丙型肝炎病毒疫苗组合物，其中所述丙型肝炎病毒基因组含有编码来自丙型肝炎病毒的J6CF株的核心蛋白、E1蛋白、E2蛋白及p7蛋白的序列。

3.权利要求1或2记载的丙型肝炎病毒疫苗组合物，其中所述丙型肝炎病毒基因组包含：

编码来自丙型肝炎病毒的J6CF株的NS2蛋白的N末端的氨基酸残基至第16位氨基酸残基的序列；和

编码来自丙型肝炎病毒的JFH1株的NS2蛋白的始自N末端的第17位氨基酸残基至C末端的氨基酸残基的序列。

4.丙型肝炎病毒疫苗组合物，其包含：

将含有来自丙型肝炎病毒的JFH1株的NS3蛋白、NS4A蛋白、NS4B蛋白、NS5A蛋白及NS5B蛋白的感染性丙型肝炎病毒颗粒灭活获得的灭活病毒颗粒；

序列表的SEQ ID NO：5记载的含非甲基化CpG的寡核苷酸；以及

氢氧化铝。

5.权利要求3记载的丙型肝炎病毒疫苗组合物，其中所述感染性丙型肝炎病毒含有来自丙型肝炎病毒的J6CF株的核心蛋白、E1蛋白、E2蛋白及p7蛋白。

6.权利要求4或5记载的丙型肝炎病毒疫苗组合物，其中所述感染性丙型肝炎病毒的NS2蛋白为嵌合蛋白，所述NS2蛋白的N末端的氨基酸残基至第16位氨基酸残基来自J6CF株，所述NS2蛋白的始自N末端的第17位氨基酸残基至C末端的氨基酸残基来自JFH1株。

Images