CN101048502B - 具有自主复制能力的经修饰的人丙型肝炎病毒基因组rna - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种经修饰的丙型肝炎病毒基因组RNA，其由含有两种或以上的丙型肝炎病毒的基因组RNA的5’非翻译区、核心蛋白质编码序列、E1蛋白质编码序列、p7蛋白质编码序列、E2蛋白质编码序列、NS2蛋白质编码序列、NS3蛋白质编码序列、NS4A蛋白质编码序列、NS4B蛋白质编码序列、NS5A蛋白质编码序列、NS5B蛋白质编码序列、以及3’非翻译区的碱基序列构成，并且具有自主复制能力。特别涉及通过将丙型肝炎病毒基因组RNA的编码从NS3开始的NS4、NS5A和NS5B蛋白质的RNA序列部分取代为序列号1所示的JFH1株的编码NS3、NS4、NS5A、以及NS5B蛋白质的RNA部分序列而获得自主复制能力的经修饰的丙型肝炎病毒基因组RNA。

Description

具有自主复制能力的经修饰的人丙型肝炎病毒基因组RNA
技术领域
本发明涉及使各种基因型的人丙型肝炎病毒(HCV)在培养细胞系中进行自主复制的方法，和用于该方法的经修饰的HCV基因组RNA，以及该HCV基因组RNA复制细胞。
背景技术
通过近年的研究可知，丙型肝炎病毒根据基因型或者血清型可分为多种类型。作为现在主流的HCV基因型分类法，在Simmonds等使用的HCV株的碱基序列的系统解析法(phyloanalysis)中，HCV被分为6种类型：基因型1a、基因型1b、基因型2a、基因型2b、基因型3a、基因型3b(非专利文献1)，其各种类型又分为若干亚型。所以，对于HCV的多种基因型，也决定了其基因组全长的碱基序列(专利文献1、和非专利文献2～4)。
HCV通过持续的感染引起慢性肝炎。现在，在世界范围内认为的慢性肝炎的主要原因为HCV的持续感染。实际上，有50％左右的持续感染者罹患慢性肝炎，其中，有大约20％的患者在10年～20年后转变为肝硬化，进而，部分发展为肝癌这样的致命性疾病。
目前对丙型肝炎的治疗主要通过干扰素-α、干扰素-β、以及联合应用干扰素-α和作为嘌呤-核苷衍生物的利巴韦林的治疗方法。但是，即使进行该治疗，在全部治疗患者中也仅有60％观察到治疗效果，如果在产生效果后中止治疗，则半数以上的患者复发。已知干扰素的治疗效果与HCV的基因型相关联，据称其对基因型1b的效果低，对基因型2a的效果高(非专利文献5)。此外，因基因型的不同，HCV所具有的、针对蛋白质酶的底物特异性也有所不同，利用基因型1b的NS3蛋白质酶而开发的抑制药物对其他基因型的NS3蛋白质酶的抑制活性降低50倍以上(非专利文献6)。因此，为了开发效率高的HCV治疗药物，必须在确认在HCV各基因型中的反应性的同时进行开发。
最近，通过制备HCV亚基因组RNA复制子作为HCV来源的具有自主复制能力的RNA(专利文献2、3，和非专利文献7～9)，能够使用培养细胞对HCV的复制结构进行分析。该HCV亚基因组RNA复制子是将存在于HCV基因组RNA 5’非翻译区中的HCV IRES的下游结构蛋白质取代为新霉素抗性基因及其下游连接的EMCV-IRES而得到的。通过将该RNA复制子导入肝癌细胞Huh7中，在新霉素的共存下培养，证实其在Huh7细胞中进行自主复制。进而，还证实了部分HCV亚基因组RNA不仅限于在Huh7细胞中，在人宫颈癌细胞HeLa、人肝癌细胞HepG2等中也进行自主复制(专利文献3)。
但是，这种HCV的细胞内RNA复制系统，与其说是针对限定的基因型的，不如说是仅使用限定的HCV的基因组RNA而制备的。因此，对于存在有大量基因型的HCV，讨论开发的HCV治疗药物因基因型的不同所导致的治疗效果差异，是极为困难的。此外，RNA复制子是仅能评价在HCV病毒的增殖复制过程中的病毒RNA复制的实验系统，无法评价HCV病毒颗粒在感染细胞内的形成和向细胞外的释放，进而感染新的细胞这样的过程。
目前，HCV病毒颗粒的形成和向细胞外的释放，进而感染新的细胞这样的过程的评价方法仅限于使用黑猩猩等动物的实验系统(非专利文献10)。但是，直接使用动物这样的活体的实验系统操作复杂，分析非常困难。因此，需要建立能够再现HCV病毒颗粒的形成和向细胞外的释放，进而感染新的细胞这样的过程的极为简单的实验系统，即，构建使用培养细胞系的HCV病毒颗粒复制系统，用于分析该过程、开发以抑制该过程为作用机制的抗HCV药物。
此外，如果能够通过培养细胞系提供稳定的HCV病毒颗粒，那么也能够使病毒减毒，或使用分子生物学方法制备非感染性的HCV，而用于疫苗。但是，由于HCV的蛋白质序列因基因型的不同而不同，所以HCV的抗原性也因基因型的不同而不同。实际上，多种基因型的存在一直是HCV疫苗生产中的很大阻碍(非专利文献11)。因此，为了高效生产HCV疫苗，也期望通过培养细胞系稳定生产各基因型的HCV病毒颗粒。
已知HCV为55～65nm的球状颗粒，存在于HCV感染患者的血液中。作为纯化存在于人血清中的HCV的方法，已知有使用凝集素的亲和层析(非专利文献12)以及使用肝素的层析(非专利文献13)。但是，以这些方法只能纯化不足1ml浓度为大约1M拷贝/mL的病毒，完全不适于产业应用。
迄今为止，已发明了多种HCV之外的病毒的纯化方法(例如，专利文献4、5和6)。但是，正如从这些文献中知道的那样，病毒颗粒的性质各不相同，因而没有提供关于最适合人丙型肝炎病毒纯化方法的可参考的信息。此外，关于同样是肝炎病毒的甲型肝炎病毒，在专利文献7中公开了通过以阴离子交换层析除去DNA能够纯化甲型肝炎病毒。然而，甲型肝炎病毒虽然也为肝炎病毒，但其是以DNA作为基因的病毒，由于丙型肝炎病毒已知是以RNA作为基因的病毒，所以它们之间完全没有相似点，因而没有提供关于纯化的方法的可参考的信息。今后，为了将人丙型肝炎病毒颗粒产业性应用于疫苗等，需要大量并且高度纯化，因此亟待开发出纯化方法。
专利文献1：特开2002-171978号公报
专利文献2：特开2001-17187号公报
专利文献3：WO2004/104198A1
专利文献4：特许3313117号
专利文献5：特表2002-503484号
专利文献6：特表2000-510682号
专利文献7：特公平6-48980
非专利文献1：Simmonds，P.et al.，Hepatology，10(1994)p1321-1324
非专利文献2：Choo，Q.L et al.，Science，244(1989)p359-362
非专利文献3：Okamoto，H et al.，J.Gen.Virol.，73(1992)p673-679
非专利文献4：Mori，S.et al Biochem.Biophis.Res.Commun.183(1992)p334-342
非专利文献5：Yoshioka，K.et al.，Hepatology，16(1992)p293-299
非专利文献6：Thibeault，D.et al.，J.Virol.，78(2004)p7352-7359
非专利文献7：Blight et al.，Science，290(2000)p1972-1974
非专利文献8：Friebe et al.，J.Virol.，75(2001)p12047-12057
非专利文献9：Kato，T.et al.，Gastroenterology，125(2003)p1808-1817
非专利文献10：Kolykhalov et al.，Science，277(1997)p570-574
非专利文献11：Farci，P.，et al.，Semin Liver Dis 20(2000)p103-126
非专利文献12：Virology，196(1993)p354-357
非专利文献13：Journal of General Virology 86(2005)p 677-685
发明内容
本发明的目的在于提供一种利用培养细胞系复制增殖各种基因型的丙型肝炎病毒的方法。
本发明的发明人为了解决上述课题进行了深入研究，发现，将具有自主复制能力的HCV JFH1株的基因组RNA和在体外(in vitro)没有自主复制能力的HCV株的基因组RNA进行组合，制备经修饰的丙型肝炎病毒基因组RNA，该经修饰的丙型肝炎病毒基因组RNA在细胞系中能够自主复制。具体来说，上述发明发现，通过导入JFH1株的从NS3蛋白质编码序列开始到3’末端的基因组，可以将在体外没有自主复制能力的HCV基因组RNA改变为能够在培养细胞系中自主复制的RNA。
即，本发明涉及一种经修饰的丙型肝炎病毒基因组RNA，其含有两种或以上的丙型肝炎病毒的基因组RNA的5’非翻译区、核心(core)蛋白质编码序列、E1蛋白质编码序列、E2蛋白质编码序列、p7蛋白质编码序列、NS2蛋白质编码序列、和JFH1株的NS3、NS4A、NS4B、NS5A、NS5B各蛋白质编码序列、以及3’非翻译区的碱基序列，并且具有自主复制能力。
具体来说，作为本发明的一个实施方案，提供一种将从丙型肝炎病毒基因组RNA的NS3蛋白质编码序列开始到3’末端为止的基因组序列NS5B蛋白质编码序列取代为序列号1所示的编码JFH1株的NS3、NS4、NS5A、以及NS5B蛋白质的RNA部分序列(将Genbank AccessionNo.AB047639的DNA序列3867-9678位所示的序列的T以U取代后的RNA序列)、并且具有自主复制能力的经修饰的丙型肝炎病毒基因组RNA。
此外，作为另一个实施方案，提供了将丙型肝炎病毒基因组RNA的NS5B蛋白质编码序列取代为序列号2所示的编码JFH1株的NS5B蛋白质编码序列、并且具有自主复制能力的经修饰的丙型肝炎病毒基因组RNA。
作为2种或以上的丙型肝炎病毒，优选使用基因型1b核基因型1a的丙型肝炎病毒。作为基因型1b的病毒株，例如HCV-con1株、HCV-TH株、HCV-J株、HCV-JT株、以及HCV-BK株；此外，作为基因型1a的病毒株，例如HCV-J6株、HCV-JFH1株、以及HCV-JCH1株。
本发明的经修饰的丙型肝炎病毒基因组RNA也可以进一步包含至少一个选择性标记基因和/或至少一个报告基因，和至少一个IRES序列。
此时，在经修饰的丙型肝炎病毒基因组RNA中，从5’到3’依次含有上述5’非翻译区、至少一个选择性标记基因和/或至少一个报告基因、至少一个IRES序列、核心蛋白质编码序列、E1蛋白质编码序列、E2蛋白质编码序列、p7蛋白质编码序列、NS2蛋白质编码序列、NS3蛋白质编码序列、NS4A蛋白质编码序列、NS4B蛋白质编码序列、NS5A蛋白质编码序列、NS5B蛋白质编码序列、以及3’非翻译区。
在本说明书中，作为该经修饰的丙型肝炎病毒基因组RNA的一个例子，例如含有
(a)序列号11所示的碱基序列构成的RNA，或者
(b)在序列号11所示的碱基序列中，1个或多个、优选为100个，更优选为50个，进一步优选为10个碱基发生缺失、取代、或者附加的碱基序列构成的RNA，具有自主复制能力和丙型肝炎病毒颗粒产生能力的经修饰的丙型肝炎病毒基因组RNA。
本发明还提供一种导入了本发明的经修饰的丙型肝炎病毒基因组RNA，可以复制该丙型肝炎病毒，并且产生病毒颗粒的细胞。在本发明中，宿主细胞优选为增殖性细胞，特别优选真核细胞，例如，Huh7细胞、HepG2细胞、IMY-N9细胞、HeLa细胞、或者293细胞等人肝脏来源细胞、人宫颈来源细胞、或者人胚肾来源细胞。
本发明也提供一种以培养上述细胞、从培养液中回收病毒颗粒为特征的丙型肝炎病毒颗粒的制备方法，以及通过该方法制备的丙型肝炎病毒颗粒。
本发明也提供一种以培养上述细胞、使培养物中的病毒颗粒感染其它细胞为特征的丙型肝炎病毒感染细胞的制备方法，以及通过该方法制备的丙型肝炎病毒感染细胞。本发明通过使用柱层析和/或密度梯度离心纯化HCV病毒颗粒，能够得到具有可用于产业和医疗的纯度的HCV病毒颗粒。此时使用的柱层析为选自离子交换层析、凝胶过滤层析、以及亲和层析中的一种或多种层析。密度梯度离心为使用含有选自氯化铯、蔗糖、以及糖聚合物的一种或多种溶质的溶剂进行密度梯度离心，以纯化HCV。
本发明也提供一种使用本发明的细胞或丙型肝炎病毒感染细胞筛选抗丙型肝炎病毒物质的方法。该方法的特征在于，在被检物质的存在下培养本发明的细胞或丙型肝炎病毒感染细胞，通过检测培养物中的丙型肝炎病毒RNA或者病毒颗粒，评价该被检物质的抗丙型肝炎病毒的效果。
此外，本发明提供一种使用本发明的丙型肝炎病毒颗粒或其一部分作为抗原的丙型肝炎疫苗的制备方法。
本发明还提供一种在细胞中复制和/或表达外源基因的方法，和含有靶向本发明的经修饰的丙型肝炎病毒基因组RNA的肝细胞的病毒载体，其特征在于，将编码外源基因的RNA插入本发明的经修饰的丙型肝炎病毒基因组RNA中，将其导入目的细胞中，使其进行复制或者表达。
采用本发明，就能够使用培养细胞系制备具有感染性的HCV病毒颗粒。进而，即使对于从患者中分离的不具有自主复制能力的HCV株，也可以通过将其从NS3区到3’端的区域取代为JFH1的病毒基因组RNA，或者通过将其NS5B区取代为JFH1的NS5B区，来使其在体外自主复制。因此，就能够通过培养细胞系制备各种基因型的HCV株的病毒颗粒，这对于研究HCV感染过程、筛选影响HCV感染的各种物质、以及制备HCV疫苗等是有用的。
附图说明
图1为表示用于制备本发明的HCV基因组RNA的模板DNA的构建步骤的概略图，表示在T7启动子的下游插入全长HCV基因组制备的质粒克隆pJFH1的结构。图中的标记如下：T7：T7RNA启动子；5’UTR：5’非翻译区；C：核心蛋白质；E1、E2：包膜蛋白质；NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A、NS5B：非结构蛋白质；3’UTR：3’非翻译区；AgeI、PmeI、XbaI：限制性内切酶AgeI、PmeI、和XbaI的酶切位点；GDP：NS5B蛋白质的活性中心的氨基酸基序GDP相应的位置。
图2为表示Northern blot结果的照片，提示在导入作为HCV基因组RNA的rJFH1后的Huh7细胞中的rJFH1的复制。
图3为表示在培养基中的HCV核心蛋白质、NS3蛋白质、NS5A蛋白质、E2蛋白质的检测结果。
图4为表示导入HCV基因组RNA后的细胞向培养基中经时释放核心蛋白质的结果。
图5为表示在通过蔗糖密度梯度离心将导入rJFH1后的Huh7细胞的培养上清分离后的各部分中，HCV核心蛋白质和HCV基因组RNA量的图。黑色圆圈表示HCV Core(core)蛋白质，白色圆圈表示HCV基因组RNA。图5A表示未处理、图5B表示RNase处理、图5C表示NP40处理、图5D表示NP40+RNase处理后的导入rJFH1的Huh7细胞。
图6关于分泌到导入rJFH1的Huh7细胞的培养液中的病毒颗粒的感染性。图6A为表示通过抗Core抗体(左)、抗NS5A抗体(右)的免疫染色的结果的照片。图6B为表示抗Core抗体染色阳性细胞数量的图。图6C为表示在细胞内(左)及上清(右)中的HCV RNA量的经时变化的图。
图7关于分泌到导入rJCH1/NS5B(jfh1)的Huh7细胞的培养液中的病毒颗粒的感染性。图7A为关于分泌到导入JCH1/NS5B(jfh1)的Huh7细胞的培养液中的病毒颗粒在Huh7稚细胞中的HCV RNA的扩增的图。图7B为表示抗Core抗体染色阳性细胞数量的图。
图8表示TH/JFH1嵌合复制子的结构
图9为通过转染TH/JFH1嵌合复制子RNA而形成集落的观察结果。
图10为通过TH/JFH1嵌合复制子培养上清感染而形成集落的观察结果。
图11为表示在凝胶过滤层析中的洗脱图。纵轴表示在波长490nm的吸光度。S-300、S-400、S-500分别为Sephacryl(注册商标)S-300、S-400、S-500。此外，横轴表示从柱中洗脱出的溶液量。
图12为表示在离子交换层析中的洗脱图。纵轴表示HCV病毒颗粒的核心蛋白质的量。
图13为表示在凝集素亲和层析中的洗脱图。纵轴表示HCV病毒颗粒的核心蛋白质的量。
图14为表示在肝素、Sulfate cellulofine层析中的洗脱图。纵轴表示在波长490nm的吸光度。
图15为表示在蓝染料亲和层析中的洗脱图。纵轴表示HCV病毒颗粒的核心蛋白质的量。
图16表示组合了柱层析和蔗糖密度梯度离心的纯化图。纵轴表示HCV病毒颗粒的核心蛋白质的量。此外，在纵轴中表示了在蔗糖密度梯度离心中，HCV病毒颗粒的核心蛋白质的量和各部分溶液的密度。
本说明书包含作为本申请的优先权基础的特愿2004-243975号、特愿2004-290801号、特愿2005-69527号、以及特愿2005-69725号的说明书中所述内容。
具体实施方案
以下，对本发明进行详细的说明。
1.经修饰的嵌合丙型肝炎病毒基因组RNA
丙型肝炎病毒(HCV)的基因组是由9600个核苷酸构成的(+)链单链RNA。该基因组RNA由5’非翻译区(也称为5’-NTR或者5’-UTR)、由结构区和非结构区构成的翻译区、以及3’非翻译区(也称为3’-NTR或者3’-UTR)构成。其结构区编码HCV的结构蛋白质，非结构区编码HCV的多种非结构蛋白质。
该HCV的结构蛋白质(Core、E1、以及E2)和非结构蛋白质(NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A、以及NS5B)是从翻译区翻译而成一个连续的多聚蛋白质之后，通过蛋白质酶的限制性分解而释放生成的。在这些结构蛋白质和非结构蛋白质(即，HCV的病毒蛋白质)之中，Core是核心蛋白质，E1和E2是包膜蛋白质。非结构蛋白质是与病毒自身的复制相关的蛋白质，已知NS2具有金属蛋白质酶的活性，NS3具有丝氨酸蛋白质酶(N末端侧的三分之一)的活性和解旋酶(C末端侧的三分之二)的活性。此外也有报告，NS4是与NS3的蛋白质酶活性相对的辅因子，NS5B具有依赖RNA的RNA聚合酶的活性。
目前，作为HCV的基因型，已知至少有1型～6型，Simmonds等(参照Simmonds，P.et al，Hepatology，(1994)10，p.1321-1324)根据其序列，以国际分类将HCV分为各种基因型(HCV1a、HCV1b、HCV2a、HCV2b等)。在本发明中，没有自主复制能力的HCV基因组RNA不限于这些已知的病毒型，而是包括全部的没有自主复制能力，即，不具有将感染性颗粒释放到细胞外的能力的HCV基因组RNA。此外，在本发明中，所谓RNA“具有自主复制能力”或者“进行自主复制”，是指将HCV基因组RNA导入细胞中后，该HCV基因组RNA具有自我增殖的能力，即，具有将感染性颗粒释放到细胞外的能力。
在本说明书中，将包括上述这样的具有培养细胞系自主复制能力的HCV基因组RNA在内的RNA称为“复制子RNA”或者“RNA复制子”。在本说明书中，将包含复制子RNA全长的本发明的复制子RNA称为“全长HCV复制子RNA”。本发明的全长HCV复制子RNA具有产生病毒颗粒的能力。此外，本发明的经修饰的丙型肝炎病毒基因组RNA为全长HCV复制子RNA。
本发明涉及的经修饰的丙型肝炎病毒基因组RNA是由包含2种或以上的丙型肝炎病毒的基因组RNA的5’非翻译区、核心蛋白质编码序列、E1蛋白质编码序列、E2蛋白质编码序列、p7蛋白质编码序列、NS2蛋白质编码序列和JFH1株的NS3、NS4A、NS4B、NS5A、NS5B各蛋白质编码序列以及3’非翻译区的碱基序列构成，并且具有自主复制能力的，经修饰的丙型肝炎病毒基因组RNA。具体来说，作为本发明的一个实施方案涉及将从丙型肝炎病毒基因组RNA的NS3蛋白质编码序列开始到3’末端为止的基因组序列NS5B蛋白质编码序列取代为序列号1所示的编码JFH1株的NS3、NS4、NS5A、以及NS5B蛋白质的RNA部分序列(将GenBank Accession No.AB047639的DNA序列3867-9678位所示的序列的T以U取代后的RNA序列)，具有自主复制能力的、经修饰的丙型肝炎病毒基因组RNA。
此外，作为另一个实施方案提供了将丙型肝炎病毒基因组RNA的NS5B蛋白质编码序列取代为序列号2所示的编码JFH1株的NS5B蛋白质编码序列、具有自主复制能力的、经修饰的丙型肝炎病毒基因组RNA。
更优选，采用基因型1b及基因型2a的丙型肝炎病毒获得的，由包含有5’非翻译区、核心蛋白质编码序列、E1蛋白质编码序列、E2蛋白质编码序列、p7蛋白质编码序列、NS2蛋白质编码序列和JFH1株的NS3、NS4A、NS4B、NS5A、NS5B的各蛋白质编码序列、以及3’非翻译区的碱基序列构成的，并且具有自主复制能力的，经修饰的丙型肝炎病毒基因组RNA。
上述经修饰的丙型肝炎病毒基因组RNA也可以进一步含有至少一个选择性标记基因和/或至少一个报告基因、和至少一个IRES序列。
在本发明中，作为2种或以上的丙型肝炎病毒，通过将在培养细胞系中具有自主复制能力的HCV株和在培养细胞系中不具有自主复制能力的HCV株进行组合，能够将不具有自主复制能力的HCV株转变为能够自主复制的HCV株。或者，能够将自主复制能力低的HCV株转变为自主复制能力高的HCV株。
作为HCV株，具体来说，已知有，在1a型中的HCV-1株、HCV-H株、HCV-J1株等；在1b型中的HCV-con1株、HCV-TH株、HCV-J株HCV-JT株、HCV-BK株等；在2a型中的HCV-J6株、HFH-1株、JCH1株等；在2b型中的HC-J8株；在3a型中的E-b1株等。这些病毒的结构基本上由5’-UTR、Core、E1、E2、p7、NS2、NS3、NS4A、NS4a、NS5a、NS5b、3’-UTR构成(如前述)。上述各HCV株的各区域的碱基序列也已经明确，例如，在TH株的全长序列中，已经明确了Core、E1、E2、p7、NS2的区域。此外，在HCV-JT株中，已经明确了Core、E1、E2、p7、NS2的区域。作为本发明涉及的复制子RNA的一个实施方案，例如使用HCV2a型的JFH1株和除了JFH-1株以外的其他株，例如，HCV-1株、HCV-H株、HCV-J1株、HCV-con1株、HCV-TH株(Wa kita et al.，J.Biol.chem.，(1994)269，p.14205-14210，和Moradpour et al.，Biochem.Biophys.Res.Commun.，(1998)246，p.920-924)、HCV-J株、HCV-JT株、HCV-BK株、HCV-J6株、JCH1、HC-J8、E-b1株的嵌合HCV复制于RNA。
进而，作为本发明的经修饰的HCV基因组RNA的合适的实施方案，例如将丙型肝炎病毒JFH1株的HCV基因组RNA中的从NS3区域开始到3’侧的区域以JFH1的病毒基因组RNA取代，或者将NS5B蛋白质编码序列以其他的HCV基因组RNA中的NS5B蛋白质编码序列取代或者插入的HCV基因组RNA。例如，通过将已知在体外不能复制的HCV基因组RNA JCH1(ref)的从NS3区域开始到3’侧的区域以JFH1的病毒基因组RNA取代，就能够转变为可自主复制HCV基因组RNA的HCV基因组RNA。
此外，通过将作为HCV基因组RNA的HCV基因型1b的Con-1克隆(ref)(EMBL Accession No.AJ238799)的编码从NS3开始的NS4、NS5A、NS5B蛋白质的RNA序列取代为JFH1株的编码从NS3开始的NS4、NS5A、NS5B蛋白质的RNA序列，或者仅将HCV基因型1b的编码Con-1克隆(ref)的NS5B蛋白质的序列取代为JFH1株的编码NS5B蛋白质的序列，就能够转变为可自主复制HCV基因组RNA的HCV基因组RNA。
使用了Con-1克隆的基因的全长复制子尽管具有自主复制能力，但是不形成HCV病毒颗粒(参照Pietschmann et al，Journal of Virology，(2002)76，p.4008-4021)。但是，如本发明的实施例所示，通过将编码从NS3开始的NS4、NS5A、NS5B蛋白质的RNA序列取代为JFH1株的编码从NS3开始的NS4、NS5A、NS5B蛋白质的RNA序列，就能够形成颗粒。即，通过本发明的方法，能够将尽管具有自主复制能力，但是不能形成颗粒的丙型肝炎病毒基因组RNA变为能够形成颗粒的经修饰的丙型肝炎病毒基因组RNA。
此外，即使在如TH株和JCH株这样的不能生成具有自主复制能力的复制子的HCV中，也能够通过如本发明的实施例所示的那样制备其与JFH-1株的嵌合体基因而形成颗粒。因此，就能够使不能自主复制的HCV基因组RNA成为能够形成颗粒的经修饰的丙型肝炎病毒基因组RNA。
进而，通过向JFH株的RNA序列中的NS5B中引入突变，HCV的基因组RNA的增殖停止，HCV的颗粒产生停止，因此可知，NS5B对于赋予自主复制能力和颗粒产生能力是重要的。
目前，Simmonds等(参照Simmonds，P.et al，Hepatology，(1994)10，p.1321-1324)根据HCV的序列，以国际分类将其分为各种基因型(HCV1a、HCV1b、HCV2a、HCV2b等)。在本发明中，没有自主复制能力的HCV基因组RNA不限于这些已知的病毒型，而是包括全部的不具备自主复制能力的HCV基因组RNA。
本说明书涉及的编码NS5B蛋白质的序列为编码JFH1株来源的NS5B蛋白质的序列(序列号3)，具有序列号2所示的碱基序列。但是，只要是能够在严格的条件下与序列号2所示的碱基序列杂交的碱基序列，其编码发挥NS5B蛋白质的功能的氨基酸(例如，含有保守取代的NS5B蛋白质)，均包含在本发明的NS5B蛋白质编码序列中。
此外，所谓严格的条件，例如，是指钠浓度为300～2000mM，温度为40～75℃，优选为钠浓度为600～900mM，温度为65℃的条件。本领域技术人员能够参照Molecular Cloning  (Sambrook，J.et al.，Molecular Cloning：a Laboratory Manual 2nd ed.，Cold Spring HarborLaboratory Press，10 Skyline Drive Plainiew，NY(1989))等容易地获得如上述这样的NS5B的同源物。
本发明涉及的HCV基因组RNA具有JFH1HCV基因组RNA中的编码从NS3开始的NS4、NS5A、NS5B蛋白质的RNA序列，或者具有编码NS5B蛋白质的序列。
在一个实施方案中，本发明的HCV基因组RNA是由含有丙型肝炎病毒株的基因组RNA上的5’非翻译区、核心蛋白质编码序列、E1蛋白质编码序列、E2蛋白质编码序列、NS2蛋白质编码序列、NS3蛋白质编码序列、NS4A蛋白质编码序列、NS4B蛋白质编码序列、NS5A蛋白质编码序列、NS5B蛋白质编码序列、以及3’非翻译区的碱基序列构成的RNA，并且，上述编码从NS3开始的NS4、NS5A、NS5B蛋白质的RNA序列为外源导入的JFH1 HCV基因组RNA来源的编码从NS3开始的NS4、NS5A、NS5B蛋白质的RNA序列部分。优选NS5B蛋白质编码序列为外源导入的JFH1 HCV基因组RNA来源的编码NS5B蛋白质的RNA序列。
在本说明书中，“5’非翻译区(5’NTR或者5’UTR)”、“核心蛋白质编码序列(Core区或者C区)”、“E1蛋白质编码序列(E1区)”、“E2蛋白质编码序列(E2区)”、“NS2蛋白质编码序列(NS2区)”、“NS3蛋白质编码序列(NS3区)”、“NS4A蛋白质编码序列(NS4A区)”、“NS4B蛋白质编码序列(NS4B区)”、“NS5A蛋白质编码序列(NS5A区)”、“NS5B蛋白质编码序列(NS5B区)”、“以及3’非翻译区(3’NTR或者3’UTR)”、和其他的特定区域或位点，在各种基因型中已经公知。至于未知的HCV株的上述个区域或位点，能够通过将已知的HVC全长基因组RNA序列与该HCV株的全长RNA序列进行比对而容易地确定。
在本发明中，所谓“选择性标记”，是指能够赋予细胞选择性的基因，该选择性使得只有表达该基因的细胞能够被选择。作为选择标记基因的一般的例子，例如抗生素抗性基因。在本发明中，作为合适的选择性标记基因的例子，例如新霉素抗性基因、胸苷激酶基因、卡那霉素抗性基因、吡啶硫胺素抗性基因、腺苷酰转移酶基因、潮霉素抗性基因、嘌呤霉素抗性基因等，优选新霉素抗性基因、胸苷激酶基因，进一步优选新霉素抗性基因。但是本发明的选择性标记基因不限于此。
此外，在本发明中，所谓“报告基因”，是指编码成为该基因表达指标的基因产物的标记基因。作为报告基因的一般的例子，例如催化发光反应或者显色反应的酶的结构基因。在本发明中，作为合适的报告基因的例子，例如转座子Tn9来源的氯霉素乙酰转移酶、大肠杆菌来源的β-葡糖醛酸糖苷酶或β-半乳糖苷酶基因、萤光素酶基因、绿色荧光蛋白质基因、水母来源的水母发光蛋白质基因、分泌型胎盘碱性磷酸酶(SEAP)基因等。但是本发明的报告基因并不限于此。
上述选择性标记基因和报告基因在复制子RNA中可以只含有任何一个，也可以二者都含有。选择性标记基因或者报告基因在经修饰的丙型肝炎病毒基因组RNA中可以含有一种，也可以含有两种或以上。
本发明涉及的HCV基因组RNA也可以进一步含有编码希望在其全长HCV基因组RNA导入的细胞中表达的外源基因的RNA。编码外源基因的RNA可以连接在5’非翻译区下游，也可以插入在3’非翻译区的上游。此外，也可以在核心蛋白质编码序列、E1蛋白质编码序列、E2蛋白质编码序列、NS2蛋白质编码序列、NS3蛋白质编码序列、NS4A蛋白质编码序列、NS4B蛋白质编码序列、NS5A蛋白质编码序列、NS5B蛋白质编码序列的任意二者之间。
当含有编码外源基因的RNA的HCV基因组RNA在导入的细胞中翻译的时候，能够表达该外源基因编码的基因产物。因此，当以在细胞内生成外源基因的基因产物为目的时，也能够适当地使用含有编码外源基因的RNA的HCV基因组RNA。
在本发明涉及的HCV基因组RNA中，编码上述的病毒蛋白质的序列以及外来基因等的连接，要保证其以正确的阅读框从HCV基因组RNA中被翻译。优选通过蛋白质酶的酶切位点等互相连接，这样，当HCV基因组RNA编码的蛋白质作为一个连续的多肽被翻译和表达后，就能够利用蛋白质酶将各蛋白质切断、游离。
若将这样制备的含有JFH1株的编码从NS3开始的NS4、NS5A、NS5B蛋白质的RNA序列部分的HCV基因组RNA导入适当的宿主细胞，则可以获得能够自主复制，优选能够连续自主复制HCV基因组RNA(即具有HCV基因组RNA的自主复制能力)的重组细胞。以下，在本说明书中，将拥有含有JFH1株的编码从NS3开始的NS4、NS5A、NS5B蛋白质的RNA序列部分的HCV基因组RNA的复制能力的重组细胞称为“HCV基因组RNA复制细胞”。
用于“HCV基因组RNA复制细胞”的宿主细胞，只要是能够继代培养的细胞即可，没有特殊限定，优选真核细胞，更优选人细胞，进一步优选人肝脏来源细胞、人宫颈来源细胞、或者人胚肾(fetalkidney)来源细胞。此外，作为细胞，优选包括癌细胞或者干细胞在内的增殖性细胞，特别优选Huh7细胞、HepG2细胞、IMY-N9细胞、HeLa细胞、或者293细胞等。这些细胞可以使用市售的，也可以从细胞保藏机构获得，也可以使用从任意细胞(例如癌细胞或干细胞)株化的细胞。
将HCV基因组RNA导入宿主细胞可以使用公知的任意技术进行。作为该导入方法，例如，例如电穿孔、基因枪法、脂质体转染法、磷酸钙法、显微注射法、DEAE琼脂糖法等。特别优选通过电穿孔的方法。
HCV基因组RNA可以单独导入，也可以与其他核酸混合导入。当希望导入的RNA量为一定，而改变HCV基因组RNA的导入量时，将所期望的导入量的HCV基因组RNA与从导入细胞中提取的总细胞RNA混合而成一定的RNA总量，将其导入细胞内即可。用于导入细胞内的HCV基因组RN的量根据使用的导入方法决定即可，优选使用的量为1皮克～100微克，更优选为10皮克～10微克。
在“HCV基因组RNA复制细胞”中的HCV基因组RNA的复制能够依据公知的任意的RNA检测方法进行确认，例如，能够使用以对导入的HCV基因组RNA特异的DNA片段作为探针，对从细胞提取的总RNA进行Northern杂交的方法，或者使用对导入的HCV基因组RNA特异的引物的RT-PCR方法。
进而，如果从“HCV基因组RNA复制细胞”提取的蛋白质中检测出了HCV蛋白质，则能够判断该细胞正在复制HCV基因组RNA。HCV基因组RNA的检测能够依据公知的任意的蛋白质检测方法进行，例如，能够通过将针对由导入的HCV基因组RNA表达的HCV蛋白质的抗体与从细胞提取的蛋白质进行反应而进行。更具体来说，例如，能够通过下述方法进行：将从细胞提取的蛋白质样品印迹在硝酸纤维素上，使抗HCV蛋白质抗体(例如抗NS3特异抗体，或由丙型肝炎患者采集的抗血清)对其进行反应，进而检测该抗HCV蛋白质抗体。
HVC基因组RNA的自主复制的确认方法没有限定，例如，能够通过下述方法进行确认：将目的RNA转染入Huh7细胞中，培养该Huh7细胞，使用能够特异地检测出导入的RNA的探针，对提取自得到的培养物中的细胞的RNA进行Northern blot。用于确认自主复制能力的具体操作例示于本说明书的实施例中所述的HCV蛋白质表达的确认、HCV基因组RNA的检测等的表述中。
2.HCV病毒颗粒的制备
如上述这样制备的HCV基因组RNA复制细胞，能够体外产生HCV病毒颗粒。即，能够通过在适当的培养基中培养本发明的HCV基因组RNA复制细胞，从其培养物(优选为培养液)收集产生的病毒颗粒，就能够简单地获得HCV病毒颗粒。
HCV基因组RNA复制细胞的病毒颗粒产生能力能够使用公知的任意的病毒检测方法来确认。例如，当通过蔗糖密度梯度将认为产生病毒颗粒的细胞的培养液进行分离，测定各部分的密度、HCV核心蛋白质的浓度、以及HCV基因组RNA的量，结果为HCV核心蛋白质与HCV基因组RNA的峰一致，而且，相比较于将培养上清以0.25％NP40(：聚氧乙烯(9)辛基苯醚(polyoxyethylene(9)octylphenylether))处理后分离时的相同成分的密度，检测出峰的部分的密度较轻(例如，1.15mg～1.22mg)时，则能够判定该细胞具有病毒颗粒产生能力。
释放于培养液中的HCV病毒颗粒，例如，也能够使用针对核心蛋白质、E1蛋白质、或者E2蛋白质的抗体检测出来。此外，也能够通过使用特异的引物以RT-PCR的方法对培养液中的HCV病毒颗粒含有的HCV基因组RNA进行扩增，紧接检测出HCV病毒颗粒的存在。
3.本发明的HCV颗粒对其他细胞的感染
以本发明的方法产生的HCV病毒颗粒具有对细胞(优选为HCV感受性细胞)的感染能力。本发明包括培养HCV基因组RNA复制细胞，将得到的培养物(优选为培养液)中的病毒颗粒感染其他细胞(优选为HCV感受性细胞)，也提供丙型肝炎病毒感染细胞的制备方法。在本说明书中，所谓“HCV感受性细胞”，是指对HCV具有感染性的细胞，虽然优选为肝细胞或者淋巴细胞，但是并不限于此。具体来说，作为肝细胞，例如原代肝细胞、Huh7细胞、HepG2细胞、IMY-N9细胞、HeLa细胞、293细胞等；作为淋巴细胞，例如Molt4细胞、HPB-Ma细胞、Daudi细胞等，但是并不限于此。
如果将在本发明的HCV基因组RNA复制细胞中产生的HCV病毒颗粒感染细胞(例如，HCV感受性细胞)，则HCV基因组RNA在感染的细胞中复制，进而形成病毒颗粒。通过将在本发明的HCV基因组RNA复制细胞中产生的HCV病毒颗粒感染细胞，HCV基因组RNA在细胞内被复制，就能够进而制备病毒颗粒。
在本发明的HCV基因组RNA复制细胞中产生的HCV病毒颗粒，感染黑猩猩等可感染HCV病毒的动物能够引起HCV来源的肝炎。
4.HCV病毒颗粒的纯化
在纯化HCV病毒颗粒时，含有该病毒的溶液可以选自HCV感染患者来源的血液、HCV感染培养细胞、和通过基因重组技术而产生HCV病毒颗粒的细胞的培养液以及细胞匀浆液中的任何一种或多种。
将含有HCV病毒的溶液进行离心和/或使用滤器等，除去细胞及细胞残渣。除去残渣后的溶液能够使用截留分子量为100000～500000的超滤膜浓缩10～100倍左右。
除去残渣后的含有HCV的溶液能够通过将下述的层析法和/或密度梯度离心以任意的顺序组合或者单独使用而进行纯化。以下对代表性的层析法和密度梯度离心的方法进行表述，但是本发明并不限于此。
凝胶过滤层析法通过优选使用以丙烯基葡聚糖、N，N’-亚甲基双丙烯酰胺的交联聚合物作为凝胶基质的层析载体，进一步优选使用由Sephacryl(注册商标)S-300、S-400和S-500构成的层析法，能够进行HCV病毒颗粒的纯化。
离子交换层析法优选使用Q Sepharose(注册商标)等作为阴离子交换树脂，以及优选使用SP Sepharose(注册商标)等作为阳离子交换树脂，能够进行HCV病毒颗粒的纯化。
亲和层析优选使用结合有选自肝素、Sulfated cellulofine、凝集素、以及各种色素的基质作为配体的树脂作为载体，能够进行HCV病毒颗粒的纯化。进一步优选使用结合有hiTrap Heparin HP(注册商标)、hiTrap Blue HP(注册商标)、hiTrap Benzamidine FF(注册商标)、Sulfated cellulofine，以及LCA、ConA、RCA-120、和WGA的载体，能够进行HCV病毒颗粒的纯化。最优选使用Sulfated cellulofine作为载体进行HCV病毒颗粒的纯化，该纯化使得在纯化前和纯化后，溶液中的总蛋白质量与HCV的RNA拷贝数的比率达到30倍或以上。
通过密度梯度离心的纯化，能够优选使用氯化铯、蔗糖、Nycodenz(注册商标)、以及Ficoll(注册商标)和Percoll(注册商标)这样的糖聚合物作为形成密度梯度的溶质。优选使用蔗糖。此外，能够优选使用水、磷酸缓冲液、Tris缓冲液、醋酸缓冲液、甘氨酸缓冲液作为使用的溶剂。
进行纯化时的温度优选为0～40℃，进一步优选为0～25℃，最优选为0～10℃。
通过密度梯度离心进行精制时的离心力优选为1×104～1×109g，进一步优选为5×104～1×107g，最优选为5×104～5×105g，
纯化方法的组合，可以将密度梯度离心和层析法以任意的顺序进行任意的组合，优选在通过多种柱层析纯化后，应用密度梯度离心的组合，更优选将使用阴离子交换柱、然后应用亲和层析得到的含有HCV病毒颗粒的部分，应用密度梯度离心进行纯化的组合，最优选将通过使用QSepharose(注册商标)的柱得到的含有HCV病毒颗粒的部分，应用使用Sulfated cellulofine的柱进行进一步纯化的组合。此外，在柱层析和密度梯度离心的步骤之间，能够通过使用透析或超滤将含有HCV病毒颗粒的溶液的溶质进行置换和/或进行HCV病毒颗粒的浓缩。
5.本发明的其他实施方案
在本发明的HCV基因组RNA复制细胞中，HCV基因组RNA被高效复制。因此，使用本发明的HCV基因组RNA复制细胞就能够高效制备HCV基因组RNA。
在本发明中，通过培养HCV基因组RNA复制细胞，从培养物(培养细胞和/或培养液)中提取RNA，通过电泳法将其分离，将分离后的HCV基因组RNA进行分离纯化，就能够制备HCV基因组RNA。这样所制备的RNA含有HCV基因组序列。通过提供含有HCV基因组序列的RNA的制备方法，就能够对HCV基因组进行更加详细的分析。
进而，本发明的HCV基因组RNA复制细胞能够适用于制备HCV蛋白质。HCV蛋白质的制备能够通过公知的任意方法进行，例如，通过将HCV基因组RNA导入细胞，制备重组细胞，培养该重组细胞，通过常规方法从得到的培养物(培养细胞和/或培养液)中回收蛋白质即可。
HCV病毒颗粒可具有肝细胞靶向性。因此，能够使用本发明的HCV基因组RNA制备肝细胞靶向性病毒载体。该病毒载体适用于基因治疗。在本发明中，通过将编码外源基因的RNA重组于HCV基因组RNA中，将该RNA导入细胞，就能够将该外源基因导入细胞，使其在细胞内进行复制和表达。
进而，通过制备将HCV基因组RNA中的E1蛋白质编码序列和/或E2蛋白质编码序列改变为其他物种来源的病毒的外壳蛋白质的RNA，导入细胞内，制备病毒颗粒，就能够使该RNA感染各种物种的细胞。此时，以可以将外源基因重组于HCV基因组RNA中，该外源基因依赖于重组病毒外壳蛋白质的靶向性，能够将其作为用于在各种细胞中表达细胞靶向性病毒载体来使用。
本发明也涉及含有外源基因的病毒载体的制备方法，该方法包括将编码外源基因的RNA插入HCV基因组RNA中，将其导入细胞内，培养该细胞，产生病毒颗粒。
本发明也提供一种以本发明的HCV病毒颗粒或其一部分作为抗原，或者以为了改变细胞靶向性而重组病毒外壳蛋白质所制备的颗粒或其一部分作为抗原的丙型肝炎疫苗、或者用于针对重组病毒外壳蛋白质的病毒的疫苗的制备方法。进而，使用以本发明涉及的HCV病毒颗粒或其一部分作为抗原，或者以为了改变细胞靶向性而重组病毒外壳蛋白质所制备的颗粒或其一部分作为抗原，也能够制成HCV的感染中和抗体。
本发明的HCV基因组RNA复制细胞，或者感染了该细胞产生的病毒颗粒的HCV感染细胞，例如，能够作为用于HCV复制、病毒颗粒的重构、筛选促进或者抑制病毒颗粒释放的物质(抗丙型肝炎病毒物质)的实验系统而使用。具体来说，例如，在被检物质的存在下培养该细胞，检测得到的培养物中的HCV基因组RNA或者病毒颗粒，通过判断该被检物质是否促进或者抑制复制子RNA或HCV基因组RNA的复制或者病毒颗粒的形成或释放，能够筛选促进或者抑制丙型肝炎病毒增殖的物质。此时，培养物中的HCV基因组RNA的检测可以通过检测从上述细胞中提取的RNA中的HCV基因组RNA的量、比率、或者有无来进行。培养物(主要为培养液)中的病毒颗粒的检测可以通过检测培养液中所含HCV蛋白质的量、比率、或者有无来进行。
在本发明的HCV基因组RNA复制细胞中产生的HCV病毒颗粒和HCV感受性细胞也能够作为用于筛选促进或者抑制HCV对细胞的结合的物质的实验系统而使用。具体来说，例如，在被检物质的存在下，将在本发明的HCV基因组RNA复制细胞中产生的HCV病毒颗粒与HCV感受性细胞共同培养，检测得到的培养物中的HCV基因组RNA或者病毒颗粒，通过判断该被检物质是否促进或者抑制HCV基因组RNA的复制或者病毒颗粒的形成，能够筛选促进或者抑制丙型肝炎病毒增殖的物质。
该HCV基因组RNA或者病毒颗粒的检测能够依照上述的方法或者后述的实施例进行。上述实验系统也能够用于丙型肝炎病毒感染的预防剂、治疗剂、或者诊断剂的制备或评价。
具体来说，作为本发明的上述实验系统的利用例，例如以下例子：
(1)抑制HCV的增殖和感染的物质的探索
作为抑制HCV的增殖和感染的物质，例如，例如直接或者间接对HCV的增殖和感染产生影响的有机化合物，或者通过与HCV基因组或其互补链的靶序列杂交而直接或者间接对HCV的增殖或HCV蛋白质的翻译产生影响的反义寡核苷酸等。
(2)在细胞培养中具有抗病毒作用的各种物质的评价
作为上述的各种物质，例如使用推理性药物设计或者高通量筛选得到的物质(例如经分离纯化的酶)等。
(3)用于HCV感染患者的治疗的新靶点的鉴定
例如，为了鉴定在HCV病毒复制中发挥重要功能的宿主细胞性蛋白质，可以使用本发明涉及的HCV基因组RNA复制细胞。
(4)HCV病毒对药物等的抗性获得能力的评价以及该抗性涉及的突变的鉴定
(5)用于丙型肝炎病毒感染的诊断药物或者治疗药物的开发、制备以及评价所使用的作为可能的抗原的病毒蛋白质的制备
(6)用于丙型肝炎病毒感染的疫苗的开发、制备、以及评价所使用的作为可能的抗原的病毒蛋白质和减毒HCV的制备
实施例
根据以下的实施例和附图对本发明进行更具体的说明。但是，本发明的技术范围并不限于这些实施例。
[实施例1]HCV基因组RNA的制备
1.表达载体的构建
从含有从暴发性肝炎患者中分离的丙型肝炎病毒JFH1株(基因型为2a)的全长基因组cDNA的JFH1克隆(Kato，T.，et al，J.Med.Vitrol.64(2001)p334-339)中，获得与该病毒株总的基因组区域对应的DNA，将其插入在已经插入到pUC19质粒中的T7RNA启动子序列的下游。具体来说，将JFH1株的病毒RNA扩增后的RT-PCR片段克隆入pGEM-T EASY vector(Promega)中，得到pGEM1-258、pGEM44-486、pGEM317-849、pGEM617-1323、pGEM1141-2367、pGEM2285-3509、pGEM3471-4665、pGEM4547-5970、pGEM5883-7003、pGEM6950-8035、pGEM7984-8892、pGEM8680-9283、pGEM9231-9634和pGEM9594-9678各质粒(Kato，T.，et al，Gastroenterology，125(2003)p.1808-1817)。使用PCR法和限制性内切酶连接该各质粒中所含的病毒基因组cDNA，克隆全长基因组cDNA，在上游插入T7RNA启动子序列，得到JFH克隆(pJFH1)(图1)。此外，pJFH1的全长cDNA序列登录在国际DNA数据库(DDBJ/EMBL/GenBank)中，登录号为AB047639。
接下来，针对pJFH1中的NS5B区(碱基序列：序列号2；氨基酸序列：序列号3)，将该区域编码的相当于RNA聚合酶活性中心的氨基酸基序GDD突变为GND导入突变，制备突变质粒克隆pJFH1/GND。由于其编码NS5B蛋白质的活性中心发生了突变，所以突变质粒克隆pJFH1/GND不能表达HCV RNA的复制所必须的活性NS5B蛋白质。
接下来，制备缺失JFH1的E1区到E2区的pJFH1/ΔE1-E2。此外，将不同于JFH1株的J6CF株(GenBank Accession No.AF177036)以及JCH1(Kato，T.，et al，J.Med.Vitrol.64(2001)p334-339)的全长HCV cDNA插入到已经插入在pUC19质粒中的T7RNA启动子序列的下游，制备pJ6CF和p JCH1。进而，以JFH1的NS5B取代p JCH1的编码NS5B的区域，制备p JCH1/NS5B(jfh1)。
2.HCV基因组RNA的制备
为了制备用于RNA合成的模板DNA，分别将上述构建的pJFH1、pJFH1/GND、pJFH1/ΔE1-E2、pJ6CF、p JCH1、以及p JCH1/NS5B(jfh1)用限制性内切酶XbaI切断。然后，分别将10～20μg的这些XbaI酶切片段与20U的Mung Bean Nuclease(总反应溶液量为50μl)在30℃下孵育30分钟。Mung Bean Nuclease为催化对双链DNA中的单链部分进行选择性分解的反应的酶。通常，如果直接将上述XbaI酶切片段作为模板使用进行RNA合成，则作为XbaI的识别序列的一部分的4个碱基CUGA就会使合成的复制子RNA在3’末端添加了多余部分。因此，在本实施例中，通过以Mung Bean Nuclease处理XbaI酶切片段，将4个碱基CUGA从XbaI酶切片段中除去。然后，通过依照常规方法对含有XbaI酶切片段的Mung Bean Nuclease处理后的溶液进行除蛋白质的处理，纯化除去4个碱基CUGA后的XbaI酶切片段，将其作为模板DNA。
接下来，以该模板DNA在体外合成RNA。使用Ambion公司的MEGAscript，将20μl含有0.5～1.0μg模板DNA的反应溶液在37℃下反应3小时～16小时，进行RNA的合成。
RNA合成后，向反应溶液中添加DNase(2U)，在37℃下反应15分钟后，再以酸性酚进行RNA的抽提，除去模板DNA。这样，将由pJFH1和pJFH1/GND来源的上述模板DNA合成的HCV RNA分别命名为rJFH1、rJFH1/GND、rJFH1/ΔE1-E2、rJ6CF、rJCH1、以及rJCH1/NS5B(jfh1)。
这些HCV RNA为，rJFH1是以GenBank Accession No.AB047639的DNA为模板而制备的RNA，rJFH1/GND是以将GenBank AccessionNo.AB047639的第8618位的G取代为A后的DNA为模板而制备的RNA，rJFH1/ΔE1-E2是以将GenBankAccession No.AB047639的序列989-2401序列缺失后的DNA为模板而制备的RNA，pJ6CF是以GenBank Accession No.AF177036的DNA为模板而制备的RNA，pJCH1是以GenBank Accession No.AB047640的DNA为模板而制备的RNA，rJCH1/NS5B(jfh1)是以将GenBank Accession No.AB047640的DNA序列1-3866和GenBank Accession No.AB047639的DNA序列3867-9678的序列利用限制性内切酶AvrⅡ的位点连接后的DNA为模板而制备的RNA，其碱基序列能够被确认。
[实施例2]在细胞内的HCV基因组RNA复制细胞和HCV病毒颗粒的产生
1.在细胞内的HCV基因组复制和HCV病毒颗粒的产生
分别制备上述的合成全长HCV基因组RNA(rJFH1、rJFH1/GND)，使其RNA总量为10μg。然后以电穿孔法将该混合RNA导入Huh7细胞内。将进行电穿孔处理后的Huh7细胞接种于培养皿中，培养12小时、24小时、48小时、72小时后，回收细胞，从细胞中提取RNA，通过Northern blot的方法进行分析。Northern blot分析依照Molecular Cloning，a Laboratory Manual，2nd edition，J.Sambrook，E.F.Fritsch，T.Maniatis著，Cold SpringHarbor LaboratoryPress(1989)中所述的进行。将从细胞中提取的RNA进行变性琼脂糖凝胶电泳，电泳结束后，将该RNA转印到正电荷尼龙膜上。用由pJFH1制备的32P标记的DNA或者RNA探针对上述转印到膜上的RNA进行杂交，然后洗净该膜，让该膜使胶片感光，由此检测除HCV基因组特异的RNA条带。
如图2所示，当转染JFH1/GND时，在转染4小时后，能够确认有弱信号的导入的RNA条带，信号随着时间的推移而减弱，在24小时后几乎不能确认条带的信号。
另一方面，当转染rJFH1时，虽然在转染后4小时～12小时后，导入的RNA条带的信号强度与导入JFH1/GND时几乎相同地暂时减弱，但是在24小时以后仍然能够确认清楚的RNA条带的信号。该信号是HCV所特异的。即，认为导入的一部分rJFH1 RNA进行了复制和增殖。在RNA复制酶NS5B的活性基序发生突变后的rJFH1/GND中则看不到复制，确认NS5B的活性对HCV的全长RNA的复制使重要的。此外，发明人在从慢性肝炎分离的JCH1株(Kato，T.，et al，J.Med.Vitrol.69(2001)p334-339)中进行了同样的实验，在该株中完全不能确认HCV RNA的复制。
2.HCV蛋白质的检测
以常规方法从转染了rJFH1或者rJFH1/GND RNA的细胞中经时提取蛋白质，通过SDS-PAGE和Western blot进行分析。在分析时，以含有NS3、NS5A、Core或者E2基因的表达质粒DNA转染Huh7细胞，将得到的细胞提取液作为阳性对照(NS3蛋白质)。进而，将从未转染的Huh7细胞中提取的蛋白质作为阴性对照。将从每个细胞克隆中提取的蛋白质试样印记在PVDF膜(Immobilon-P，Millipore公司生产)上，使用抗NS3特异性抗体(Dr.Moradpour惠赠；Wolk B，et al，J.Virology.2000；74：2293-2304)、抗NS5A特异性抗体(将JFH1的NS5A区插入到表达载体中，在小鼠中使用DNA免疫法制备)、抗Core特异性抗体(克隆2H9抗体)、抗E2特异性抗体(合成JFH1 E2区的GTTTVGGAVARSTN(序列号4)和CDLEDRDRSQLSPL(序列号5)的肽，以2个合成肽免疫兔子而制备)，检测JFH1 RNA编码的NS3、NS5A、Core以及E2蛋白质。此外，使用抗actin抗体检测actin蛋白质，作为内对照。
如图3所示，确认在转染了rJFH1的细胞中，从转染24小时后开始，能够检测出NS3、NS5A、Core以及E2蛋白质，表达量经时增加。另一方面，在转染了rJFH1/GND的细胞或者未转染的Huh7细胞中，未检测出NS3、NS5A、Core以及E2蛋白质，表明被转染后的rJFH1因自主复制而表达其蛋白质。
从以上的1和2的结果可确认，在转染rJFH1而建立的细胞中，rJFH1被复制。
3.HCV核心蛋白质在转染细胞培养液中的检测
将以电穿孔将rJFH1、rJFH1/GND、rJFH1/ΔE1-E2、rJ6CF、以及rJCH1进行细胞导入后的Huh7细胞接种子培养皿中，培养2小时、12小时、24小时、48小时、72小时后，测定培养液中的HCV核心蛋白质。使用Ortho HCV抗原IRMA实验(Aoyagi et al.，J.Clin.Microbiol.，37(1999)p.1802-1808)进行测定。
如图4所示，从转染rJFH148小时开始到72小时后的培养液中，检测出核心蛋白质。另一方面，在转染了rJFH1/GND、rJ6CF、以及rJCH1的细胞的培养液中，没有检测出HCV核心蛋白质，在转染了rJFH1/ΔE1-E2的细胞的培养液中，检测出少量的HCV核心蛋白质。rJFH1/GND、rJ6CF、以及rJCH1在Huh7细胞中不能自主复制，rJFH1和rJFH1/ΔE1-E2在Huh7细胞中能够自主复制。因此表明，导入的HCV RNA的自主复制对于核心蛋白质的释放是必须的，并且，E1和E2对于使核心蛋白质向细胞外稳定大量地释放是必须的。
4.HCV在转染细胞培养液中的检测
为了分析在上述实施例中释放到培养液中的核心蛋白质是否是作为病毒颗粒被分泌的，将转染rJFH1 6天后的培养液以蔗糖密度梯度进行分离。将60％(重量/重量)蔗糖溶液(溶解于50mM Tris pH7.5/0.1MNaCl/1mM EDTA中)2ml、50％蔗糖溶液1ml、40％蔗糖溶液1ml、30％蔗糖溶液1ml、20％蔗糖溶液1ml、10％蔗糖溶液1ml层加于离心管中，然后层加4ml样品培养上清。使用贝克曼转子SW41Ti，以400000RPM在4℃下离心16小时，离心结束后，从离心管底开始每部分回收0.5ml。定量各部分的密度、HCV核心蛋白质的密度、HCV RNA拷贝数。以定量RT-PCR检测复制子RNA依照Takeuchi等的方法(Takeuchi，T.，et al，Gastroenterology，116：636-642(1999))，通过检测HCV RNA的5’非翻译区的RNA而进行的。具体来说，使用以下的合成引物和EZ rTth RNA kit(Applied Biosystems)，对从细胞中提取的RNA中所含的复制子RNA进行PCR扩增，通过ABI Prism 7700sequence detector system(Applied Biosystems)检测。
R6-130-S17：5’-CGGGAGAGCCATAGTGG-3’(序列号6)
R6-290-R19：5’-AGTACCACAAGGCCTTTCG-3’(序列号7)
TagMan Probe，R6-148-S21FT：
5’-CTGCGGAACCGGTGAGTACAC-3’(序列号8)
如图5所示，在1.17mg/ml的部分中，核心蛋白质与HCV RNA的峰一致。该部分的密度约为1.17mg/ml，该比重小于此前报告的核心蛋白质与核酸的结合物的比重。如果存在于1.17mg/ml的部分的核心蛋白质与HCV RNA形成了HCV病毒颗粒结构，则认为其对核酸酶具有抗性。由此，将转染rJFH16天后的培养液以10μg/ml的RNase A处理20分钟后，通过蔗糖密度梯度进行分离。
其结果如图5B所示，HCV RNA被分解，如RNase A未处理时那样，在1.17mg/ml的部分中，检测出核心蛋白质与HCV RNA的峰。即，确认存在于1.17mg/ml的部分的核心蛋白质与HCV RNA形成了HCV病毒颗粒结构。
进而，将培养液以0.25％的NP40处理后进行同样的分离，核心蛋白质与HCV RNA的峰的比重变为1.28mg/ml(图5C)。进而，如果在以0.25％的NP40处理的同时进行RNase A处理，则HCV RNA的峰消失(图5D)。即，认为含脂质比重小的外膜通过NP40从病毒的表面剥离，变成未保持病毒样结构的仅由核酸和核心蛋白质构成的Core颗粒，比重变大。
由以上确认，通过将rJFH1转染入Huh7细胞中，病毒RNA进行复制，进而形成病毒颗粒，分泌到培养液中。
5.培养液中的病毒颗粒的感染实验
对通过将rJFH1转染入Huh7细胞中而分泌到培养液中的病毒颗粒是否具有感染性进行了研究。将rJFH1或者rJFH1/ΔE1-E2转染入Huh7细胞中3天后，回收培养上清。将回收的培养上清进行离心，回收离心上清，再以0.45μm的滤膜过滤。在该培养液存在下，培养未转染RNA的Huh7细胞，在48小时后，以抗Core抗体或者抗NS5A抗体对细胞进行免疫荧光染色。如图6A所示，在将rJFH1转染入Huh7细胞中得到的培养液存在下培养的细胞中，在细胞内观察到核心蛋白质和NS5A蛋白质的表达。另一方面，在将rJFH1/ΔE1-E2转染入Huh7细胞中得到的培养液的存在下培养的细胞中，在细胞内没有观察到核心蛋白质和NS5A蛋白质的表达(数据未显示)。
接下来，将rJFH1转染入Huh7细胞中3天后，回收培养上清，使用超滤膜(cut off 1×105Da)浓缩30倍。以100μl浓缩后的含有HCV病毒颗粒的培养液在15mm盖玻片上培养未转染RNA的Huh7细胞，48小时后以抗Core抗体进行免疫染色，计数抗Core抗体染色阳性，即，感染细胞，如图6B所示，确认了394.0±26.5个感染细胞(占总细胞数的0.51％)。因此确认，该感染是由将rJFH1转染入Huh7细胞中而分泌到培养液中的HCV病毒颗粒所引起的。即，将用于感染的培养液进行UV处理，或者使用不经过RNA转染的过程而制备的培养液，在15mm盖玻片上培养未转染的Huh7细胞，48小时后以抗Core抗体进行免疫染色，计数感染细胞。其结果为，在UV处理下，感染细胞骤减，在使用不经过RNA转染的过程而制备的培养液时，确认没有感染的细胞。
进而，研究了感染的HCV病毒颗粒是否在细胞内进行RNA扩增，将新的HCV病毒颗粒释放到培养液中。将rJFH1转染入Huh7细胞中48小时后的培养液浓缩，在100μl该浓缩后的含有HCV病毒颗粒的培养液中培养未转染RNA的Huh7细胞，每天回收细胞、培养液，回收RNA，以上述方法对HCV RNA进行定量。其结果为，如图6C所示，在细胞内，HCV RNA扩增了一定量，在上清中，HCV RNA量逐日增加。另一方面，使用将rJFH1/ΔE1-E2转染入Huh7细胞中得到的培养液进行同样的研究，在细胞内和培养液中均无法检测出HCVRNA。
由这些结果确认，通过将rJFH1转染入Huh7细胞中而分泌到培养液中的HCV病毒颗粒具有感染能力，而且具有在感染的细胞中扩增HCV RNA，产生新的HCV病毒颗粒的能力。
6.使用rJCH1/NS5B(jfh1)制备HCV病毒颗粒
对通过将rJCH1/NS5B(jfh1)转染入Huh7细胞中是否能够将HCV病毒颗粒分泌到培养液中，分泌的HCV病毒颗粒是否具有感染性进行了研究。将rJCH1/NS5B(jfh1)转染入Huh7细胞中6天后的培养液以5.中所述方法进行浓缩后，在该培养液存在下，培养未转染RNA的Huh7细胞，经时定量HCV RNA量，从培养开始后12小时后开始，细胞内的HCV RNA量经时增加(图7A)。进而，在15mm盖玻片上培养未转染RNA的Huh7细胞，在浓缩后的培养液的存在下培养48小时后，以抗Core抗体进行免疫染色，计数抗Core抗体染色阳性，即，感染细胞，如图7B所示，确认了感染细胞。这些结果表示，通过将rJCH1/NS5B(jfh1)转染入Huh7细胞中而分泌到培养液中的HCV病毒颗粒获得了感染能力，而且具有在感染的细胞中扩增HCV RNA，产生新的HCV病毒颗粒的能力。
因此，对于从患者分离的HCV株这样的在体外不具有自主复制能力的株，通过将该株的NS5B区取代为rJFH1的NS5B，就能够使其在培养细胞系中自主复制、产生HCV病毒颗粒。
[实施例3]
1.使用Con1/C-NS2/JFH-1制备HCV病毒颗粒
对通过将含有HCV基因型1b的Con-1株和JFH-1的NS5B部分的嵌合HCV RNA转染入Huh7细胞中是否能够将HCV病毒颗粒分泌到培养液中，分泌的HCV病毒颗粒是否具有感染性进行了研究。
制备了如下构建体：将HCV基因型1b的Con-1株的Core、E1、E2、p7、以及NS2区连接于JFH-1株的5’UTR下游，其下游连接JFH-1株的NS3～NS5b区域，进而在其下游连接JFH-1株的3’UTR。使用该构建体，以实施例1的2中所述方法制备r Con1/C-NS2/JFH-1嵌合HCV RNA，以实施例2的1中所述方法，将RNA转染入Huh7中。将HCV RNA转染入Huh7细胞中，经时测定上清中的核心蛋白质，从大约48小时以后开始，在上清中检测出核心蛋白质，确认在细胞上清中产生了HCV病毒颗粒。然后，将该上清以超滤膜浓缩20倍之后，将浓缩液添加于Huh7细胞中。培养48小时后，以兔抗NS3抗体对细胞进行染色。
其结果为，在mock和rJFH-1/ΔEE1-E2中，没有观察到抗NS3抗体阳性细胞，而在rJFH-1和rCon1/C-NS2/JFH-1中，检测出抗NS3抗体阳性细胞。由以上结果能够确认，rCon1/C-NS2/JFH-1与rJFH-1一样，能够产生感染性HCV病毒颗粒。
[实施例4]全长嵌合HCV基因组RNA来源的全长嵌合HCV复制子RNA的制备
(1)表达载体的构建
制备将含有从暴发性肝炎患者中分离的丙型肝炎病毒JFH-1株(基因型为2a)的全长基因组cDNA的DNA(JFH-1克隆：序列号9)插入在已经插入到pUC19质粒中的T7RNA启动子序列的下游的质粒DNA。
具体来说，将JFH-1株的病毒RNA扩增后的RT-PCR片段克隆入pGEM-T EASY载体(Promega)中，得到pGEM1-258、pGEM44-486、pGEM317-849、pGEM617-1323、pGEM1141-2367、pGEM2285-3509、pGEM3471-4665、pGEM4547-5970、pGEM5883-7003、pGEM6950-8035、pGEM7984-8892、pGEM8680-9283、pGEM9231-9634和pGEM9594-9678的各质粒DNA(Kato，T.，et al，Gastroenterology，(2003)125 p.1808-1817)。使用PCR法和限制性内切酶连接该各质粒中所含的病毒基因组RNA来源的cDNA，克隆全长的病毒基因组cDNA。全长的病毒基因组的上游插入了T7RNA启动子序列。以下，将这样构建的质粒DNA称为pJFH1。此外，关于上述JFH-1克隆的制备，记述于特开2002-171978号以及Kato等(Kato，T.，et al，J.Med.Vitrol.(2001)64(3)：p.334-339)中。此外，pJFH1克隆的全长cDNA的碱基序列登录在国际DNA数据库(DDBJ/EMBL/GenBank)中，登录号为AB047639。
然后，在质粒DNA pJFH1的5’非翻译区与core区之间，插入EMCV-IRES(脑心肌炎病毒的内部核糖体进入位点)及新霉素抗性基因(neo；也称为新霉素磷酸转移酶基因)，构建质粒DNApFGREP-JFH1。该构建步骤依照Ikeda(Ikeda et al，J.Vitrol.(2002)76(6)：p.2997-3006)。
(2)嵌合表达载体的构建
JFH株是HCV2a型来源的HCV，使用HCV1b型来源的TH株(Wakita et al.，J.Biol.Chem..，(1994)269，p.14205-14210，和Moradpour et al.，Biochem.Biophys.Res.Commun.，(1998)246，p.920-924)制备嵌合HCV载体。将上述所制备的pFGREP-JFH1的Core、E1、E2、p7部分取代为TH株来源的Core、E1、E2、p7，制备嵌合HCV、pFGREP-TH/JFH1。
此外，在本说明书中，上述JFH1株(JFH-1克隆来源)的全长以及在嵌合体中使用的TH株的部分RNA序列(含有HCV TH株的从5’非翻译区到NS3区的一部分的部分基因组RNA序列(1-3748))分别表示于序列表的序列号9和10中。在上述JFH-1株的全长基因组RNA序列(序列号9)中，“5’非翻译区”对应于1～340、“核心蛋白质编码序列”对应于341～913、“E1蛋白质编码序列”对应于914～1489、“E2蛋白质编码序列”对应于1490～2590、“NS2蛋白质编码序列”对应于2780～3430、“NS3蛋白质编码序列”对应于3431～5323、“NS4A蛋白质编码序列”对应于5324～5486、“NS4B蛋白质编码序列”对应于5487～6268、“NS5A蛋白质编码序列”对应于6269～7663、“NS5B蛋白质编码序列”对应于7664～9442。
(3)全长嵌合HCV复制子RNA的制备
为了制备用于合成全长嵌合HCV复制子RNA的模板DNA，将上述构建的表达载体pFGREP-TH/JFH1以限制性内切酶XbaI切断。然后，以10～20μg该XbaI酶切片段制成50μl反应溶液，使用20U的Mung Bean Nuclease在30℃下孵育30分钟，由此进一步处理。MungBean Nuclease为催化对双链DNA中的单链部分进行选择性分解反应的酶。通常，如果直接将上述XbaI酶切片段作为模板使用进行RNA合成，则作为XbaI的识别序列的一部分的4个碱基CUGA就会使合成的复制子RNA在3’末端添加了多余部分。因此，在本实施例中，通过以Mung Bean Nuclease处理XbaI酶切片段，将4个碱基CUGA从XbaI酶切片段中除去。然后，通过依照常规方法对含有XbaI酶切片段的Mung Bean Nuclease处理后的溶液进行除蛋白质的处理，纯化除去4个碱基CUGA后的XbaI酶切片段，将其作为模板DNA。
接下来，使用T7RNA聚合酶以该模板DNA在体外合成RNA。使用Ambion公司的MEGAscript用于RNA的合成。依照生产商的使用说明书，使20μl含有0.5～1.0μg模板DNA的反应溶液进行反应。
RNA合成后，向反应溶液中添加DNAse(2U)，在37℃下反应15分钟后，再以酸性酚进行RNA的抽提，除去模板DNA。这样，将由pFGREP-TH/JFH1来源的上述模板DNA合成的HCV RNA命名为rFGREP-TH/JFH1。该rFGREP-TH/JFH1中的嵌合HCV基因组RNA的碱基序列如序列号11所示。rFGREP-TH/JFH1是本发明的全长嵌合HCV复制子RNA的一个例子。
[实施例5]全长嵌合HCV复制子RNA的复制细胞的制备和细胞克隆的建立
(1)全长嵌合HCV基因组RNA导入细胞内
将上述合成的全长嵌合HCV复制子RNA(rFGREP-TH/JFH1)以多种剂量与从Huh7细胞中提取的细胞总RNA混合，使其总量为10μg。然后，以电穿孔法将该RNA导入Huh7细胞中。培养16小时～24小时后，以多种浓度添加G418。每周更换2次培养液，继续培养。培养21天后，以结晶紫对存活细胞进行染色。计测被染色的集落，计算每单位重量的转染RNA得到的集落数量。此外，将一部分培养皿中存活的细胞集落进行克隆化，继续培养。从克隆化的细胞中分别提取RNA、基因组DNA、蛋白质后，研究全长嵌合HCV复制子RNA的检测、新霉素抗性基因重组进入基因组DNA的有无、HCV蛋白质的表达。这些结果的详细内容在下述中表示。
(2)集落形成能力
上述转染的结果为，即使在G418浓度为1.0mg/ml时，也能够观察到细胞集落的形成。认为这是由于rFGREP-TH/JFH1复制子RNA的自主复制，新霉素抗性基因持续表达，持续维持了G418抗性，结果使转染了rFGREP-TH/JFH1复制子RNA的Huh7细胞具有集落形成能力，细胞能够增殖。
[实施例6]培养上清中的嵌合HCV病毒的感染
培养上清中的嵌合HCV病毒颗粒的感染实验
回收将rFGREP-TH/JFH1转染入Huh7细胞中建立的全长嵌合HCV复制子RNA复制细胞克隆的培养上清，将该培养上清再添加于未感染的Huh7细胞中，使培养上清中的病毒颗粒感染Huh7细胞。在感染的第二天，向Huh7细胞的培养液中添加0.3mg/ml的G418，再培养21天。培养结束后将细胞固定，以结晶紫进行染色后，在使用转染rFGREP-TH/JFH1得到的全长嵌合HCV复制子RNA复制细胞克隆的培养上清而被感染细胞中，观察到集落形成。该结果表示，从转染rFGREP-TH/JFH1得到的全长嵌合HCV复制子RNA复制细胞克隆中产生了感染性的HCV，而且，该HCV保持着对新细胞的感染性。
[实施例7]HCV病毒颗粒的纯化
(1)凝胶过滤
在图11中表示了通过凝胶过滤层析，HCV病毒颗粒在各部分中的分布。使用的凝胶载体为Sephacryl(注册商标)S300、S400和S500。采用分别含有上述凝胶载体的柱层析，对用于柱层析的含有HCV病毒颗粒的溶液进行纯化。在纯化时使用的缓冲液为10mM Tris盐酸盐、1mM乙二胺四乙酸和100mM氯化钠(pH8.0)。其结果为，在使用Sephacryl(注册商标)S300时，在称为Void部分的通过部分中得到HCV病毒颗粒，因此，通过使用Sephacryl(注册商标)S300能够分离分子量小的蛋白质，改变溶液的盐浓度。此时，HCV核心蛋白质/总蛋白质量的比率变为3.78，相比于纯化前的HCV病毒颗粒，HCV颗粒在总蛋白质中所占比率升高了。另一方面，在使用Sephacryl(注册商标)S400和S500时，由于HCV存在于依据分子量的不同被洗脱下来的部分中，所以能够将其与其他分子量的蛋白质分离。
(2)离子交换层析
在图12中表示了通过离子交换层析，HCV病毒颗粒在各部分中的分布。使用的载体为SP Sepharose HP(注册商标)和Q Sepharose HP(注册商标)。
在采用使用了SP Sepharose HP(注册商标)的柱时，以50mM的柠檬酸缓冲液(pH6.2)对柱进行平衡。将使用截留分子量为100000～500000的超滤膜进行浓缩、以50mM柠檬酸缓冲液(pH6.2)稀释后的含有HCV病毒颗粒的溶液添加在柱上，然后将50mM柠檬酸缓冲液(pH6.2)以10倍柱容量左右流过柱子。然后，分别将添加了0.1MNaCl、0.3M NaCl、或1M NaCl的50mM柠檬酸缓冲液(pH6.2)以柱容量的3倍左右依次流过柱子。然后，将添加了1M NaCl的50mM柠檬酸缓冲液(pH6.2)以柱容量的5倍左右流过柱子(1M NaCl W部分)。其结果为，HCV病毒颗粒在添加了0.1M NaCl的50mM柠檬酸缓冲液(pH6.2)部分中被洗脱下来。
在采用Q Sepharose HP(注册商标)时，以50mM的Tris-HCl缓冲液(pH8.0)对柱进行平衡。将使用截留分子量为100000～500000的超滤膜进行浓缩、以50mM的Tris-HCl缓冲液(pH8.0)稀释后的含有HCV病毒颗粒的溶液添加在柱上，然后将50mM Tris-HCl缓冲液(pH8.0)以10倍柱容量左右流过柱子。然后，分别将添加了0.1MNaCl、0.3M NaCl、或1M NaCl的50mM的Tris-HCl缓冲液(pH8.0)以柱容量的3倍左右依次流过柱子。然后，将添加了1M NaCl的50mMTris-HCl缓冲液(pH8.0)以柱容量的5倍左右流过柱子(1M NaCl W部分)。其结果为，HCV病毒颗粒在添加了0.3M NaCl的50mMTris-HCl缓冲液(pH8.0)部分中被洗脱下来。此时，HCV核心蛋白质/总蛋白质量的比率变为2.32，相比于纯化前的HCV病毒颗粒，HCV颗粒在总蛋白质中所占比率升高了。
(3)亲和层析
在图13中表示了通过亲和层析，HCV病毒颗粒在各部分中的分布。亲和层析使用分别接合有RCA-120、ConA、LCA、以及WGA的载体。
在采用ConA、LCA、以及WGA亲和层析时，以磷酸盐缓冲生理盐水对柱进行平衡。将使用截留分子量为100000～500000的超滤膜进行浓缩、以磷酸盐缓冲生理盐水稀释后的含有HCV病毒颗粒的溶液添加在柱上，然后将磷酸盐缓冲生理盐水以10倍柱容量左右流过柱子。然后，将添加了0.35M乳糖的磷酸盐缓冲生理盐水以柱容量的3倍左右流过柱子。然后，将添加了0.5M乳糖的磷酸盐缓冲生理盐水以柱容量的5倍左右流过柱子。其结果为，在采用LCA和ConA亲和层析时，HCV没有与载体特异接合。在采用WGA亲和层析时，HCV病毒颗粒在添加了0.35M乳糖的磷酸盐缓冲生理盐水部分中被洗脱下来。
在采用RCA-120亲和层析时，以磷酸盐缓冲生理盐水对柱进行平衡。将使用截留分子量为100000～500000的超滤膜进行浓缩、以磷酸盐缓冲生理盐水稀释后的含有HCV病毒颗粒的溶液添加在柱上，然后将磷酸盐缓冲生理盐水以10倍柱容量左右流过柱子。然后，将添加了0.38M乳糖的磷酸盐缓冲生理盐水以柱容量的3倍左右流过柱子。然后，将添加了0.38M乳糖的磷酸盐缓冲生理盐水以柱容量的5倍左右流过柱子。在采用RCA-120亲和层析时，HCV病毒颗粒在添加了0.38M乳糖的磷酸盐缓冲生理盐水部分中被洗脱下来。
在图14中表示了通过肝素、Sulfated cellulofine层析，HCV病毒颗粒在各部分中的分布。
在每次层析中，以20mM磷酸盐缓冲液(pH7.0)对柱进行平衡。将使用截留分子量为100000～500000的超滤膜进行浓缩、以20mM磷酸盐缓冲液(pH7.0)稀释后的含有HCV病毒颗粒的溶液添加在柱上，然后将20mM磷酸盐缓冲液(pH7.0)以10倍柱容量左右流过柱子。然后，分别将添加了0.5M NaCl、0.3M NaCl、或1M NaCl的20mM磷酸盐缓冲液(pH7.0)以柱容量的3倍左右依次流过柱子。然后，将添加了1M NaCl的20mM磷酸盐缓冲液(pH7.0)以柱容量的5倍左右流过柱子。其结果为，在采用肝素亲和层析时，HCV病毒颗粒在添加了0.3M NaCl的20mM磷酸盐缓冲液(pH7.0)部分中被洗脱下来。此时，HCV核心蛋白质/总蛋白质量的比率变为0.36，相比于纯化前的HCV病毒颗粒，HCV颗粒在总蛋白质中所占比率降低了。在采用Sulfatedcellulofine层析时，HCV病毒颗粒在添加了0.1M NaCl的20mM磷酸盐缓冲液(pH7.0)部分中被洗脱下来。
在图15中表示了通过蓝染料亲和层析(blue dye affinitychromatography)，HCV病毒颗粒在各部分中的分布。
在蓝染料亲和层析中，将Cibacron Blue F3G-A结合于琼脂糖颗粒的载体用于柱子。以20mM磷酸盐缓冲液(pH7.0)对柱进行平衡。将使用截留分子量为100000～500000的超滤膜进行浓缩、以20mM磷酸盐缓冲液(pH7.0)稀释后的含有HCV病毒颗粒的溶液添加在柱上，然后将磷酸盐缓冲生理盐水以10倍柱容量左右流过柱子。然后，分别将添加了1M NaCl或2M NaCl的20mM磷酸盐缓冲液(pH7.0)以柱容量的3倍左右依次流过柱子。然后，将添加了2M NaCl的20mM磷酸盐缓冲液(pH7.0)以柱容量的5倍左右流过柱子。其结果为，HCV病毒颗粒在柱不结合部分中被洗脱下来。此时，HCV核心蛋白质/总蛋白质量的比率变为3.33，相比于纯化前的HCV病毒颗粒，HCV颗粒在总蛋白质中所占比率降升高了。
(4)蔗糖密度梯度离心
参考上述实施例，将柱层析和蔗糖密度梯度离心组合，进行HCV病毒颗粒的纯化。
首先，使用Q Sepharose HP(注册商标)进行HCV病毒颗粒的纯化。以50mM的Tris-HCl缓冲液(pH8.0)对柱进行平衡。将使用截留分子量为100000～500000的超滤膜进行浓缩、以50mM的Tris-HCl缓冲液(pH8.0)稀释后的含有HCV病毒颗粒的溶液添加在柱上，然后将50mM Tris-HCl缓冲液(pH8.0)以10倍柱容量左右流过柱子。然后，分别将添加了0.1M NaCl、0.3M NaCl、或1M NaCl的50mM的Tris-HCl缓冲液(pH8.0)以柱容量的3倍左右依次流过柱子。然后，将添加了1M NaCl的50mM Tris-HCl缓冲液(pH8.0)以柱容量的5倍左右流过柱子(1M NaCl W部分)。如图16A所示，HCV病毒颗粒在添加了0.3M NaCl的50mM Tris-HCl缓冲液(pH8.0)部分中、添加了1M NaCl的50mM Tris-HCl缓冲液(pH8.0)部分中、以及1M NaClW部分中洗脱下来。收集含有HCV病毒颗粒的部分，此时，HCV核心蛋白质/总蛋白质量的比率变为2.29，相比于纯化前的HCV病毒颗粒，HCV颗粒在总蛋白质中所占比率升高了。
然后，使用Sulfated cellulofine层析对HCV进行纯化。在每次层析中，以20mM磷酸盐缓冲液(pH7.0)对柱进行平衡。将使用QSepharose HP(注册商标)纯化后的含有HCV病毒颗粒的部分，使用截留分子量为100000～500000的超滤膜进行浓缩，以20mM磷酸盐缓冲液(pH7.0)稀释，将稀释后的含有HCV病毒颗粒的溶液添加在柱上，然后将磷酸盐缓冲液(pH7.0)以10倍柱容量左右流过柱子。然后，分别将添加了0.25M NaCl或1M NaCl的20mM磷酸盐缓冲液(pH7.0)以柱容量的3倍左右依次流过柱子。然后，将添加了1M NaCl的20mM磷酸盐缓冲液(pH7.0)以柱容量的5倍左右流过柱子。如图16B所示，HCV病毒颗粒主要在添加了1M NaCl的20mM磷酸盐缓冲液(pH7.0)部分中洗脱下来。在添加了1M NaCl的20mM磷酸盐缓冲液(pH7.0)中，HCV核心蛋白质/总蛋白质量的比率变为31.4，相比于纯化前的HCV病毒颗粒，HCV颗粒在总蛋白质中所占比率提高了。
进而，进行蔗糖密度梯度离心。将使用Sulfated cellulofine层析后的添加了1M NaCl的20mM磷酸盐缓冲液(pH7.0)部分使用截留分子量为100000～500000的超滤膜进行浓缩，以TEN缓冲液(10mM Tris盐酸缓冲液(pH8.0)、0.1M氯化钠、1mM乙二胺四乙酸(pH8.0))稀释。将含有HCV病毒颗粒的溶液层加在已层加好的60％、50％、40％、30％、20％、10％蔗糖溶液上，在4℃下以390k×g离心18小时。由于HCV集中在比重大约为1.2的部分中，所以收集该部分。在收集的部分中，HCV核心蛋白质/总蛋白质量的比率变为1.69，相比于纯化前的HCV病毒颗粒，HCV颗粒在总蛋白质中所占比率升高了。
通过蔗糖密度梯度离心纯化的含有HCV病毒颗粒的部分，相比于开始纯化前，HCV核心蛋白质/总蛋白质量的比率被纯化达到120倍左右。在最终的部分中，含有109copies/mL的HCV。
在本说明书中引用的全部出版物、专利以及专利申请，作为直接的参考纳入到本说明书中。
工业实用性
通过本发明，能够在培养细胞系中生产各种基因型的HCV株的病毒颗粒。即，即使对于从患者分离的HCV株这样的在体外不具有自主复制能力的HCV株，通过将其编码从NS3开始的NS4、NS5A、NS5B蛋白质的RNA序列部分取代为JFH1的编码从NS3开始的NS4、NS5A、NS5B蛋白质的RNA序列部分，就能够使其在培养细胞系中自主复制，产生HCV病毒颗粒。以本发明纯化的HCV病毒颗粒能够直接用作医疗用途的疫苗。本发明提供的HCV基因组RNA或病毒颗粒也能够用作外源基因的病毒载体。此外，本发明的方法也能够用作HCV感染过程的研究、影响HCV的感染过程的各种物质的筛选系统。
序列表内容
序列号1：JFH1株的编码NS3、NS4、NS5A和NS5B蛋白质的RNA部分序列(cDNA序列)
序列号2：编码JFH1的NS3到NS5蛋白质的序列(cDNA)
序列号3：JFH1的NS5B蛋白质
序列号4：基于JFH1 E2区设计的合成肽
序列号5：基于JFH1 E2区设计的合成肽
序列号6：引物(R6-130-S17)
序列号7：引物(R6-290-S19)
序列号8：TaqMan探针(R6-148-S21FT)
序列号9：HCV JFH1株(JFH-1克隆)的全长基因组RNA
序列号10：HCV TH株的包含从5’非翻译区到NS3区的部分的基因组RNA
序列号11：由HCV JFH1株(JFH-1克隆)的基因组RNA和HCVTH株的基因组RNA构成的嵌合HCV基因组RNA。
序列表
<110>Tokyo Metropolitan Organization for Medical Research
     Toray Industries Inc.
<120>具有自主复制能力的经修饰的人丙型肝炎病毒基因组RNA
<130>PH-2565-PCT
<140>
<141>
<150>JP 2004-290801
<151>2004-10-01
<150>JP 2004-243975
<151>2004-08-24
<150>JP 2005-069527
<151>2005-03-11
<150>JP 2005-069725
<151>2005-03-11
<160>11
<170>PatentIn Ver.3.1
<210>1
<211>6013
<212>DNA
<213>丙型肝炎病毒
<220>
<223>Inventor：Wakita，Takaji
     Inventor：Kato，Takanobu
     Inventor：Date，Tomoko
     Inventor：Bartenchlager，Ralf
     Inventor：Tanabe，Junichi
     Inventor：Sone，Saburou
<220>
<223>编码JFH1的NS3到NS5蛋白质的序列(cDNA序列)
<400>1
gctcccatca ctgcttatgc ccagcaaaca cgaggcctcc tgggcgccat agtggtgagt       60
atgacggggc gtgacaggac agaacaggcc ggggaagtcc aaatcctgtc cacagtctct      120
cagtccttcc tcggaacaac catctcgggg gttttgtgga ctgtttacca cggagctggc      180
aacaagactc tagccggctt acggggtccg gtcacgcaga tgtactcgag tgctgagggg      240
gacttggtag gctggcccag cccccctggg accaagtctt tggagccgtg caagtgtgga      300
gccgtcgacc tatatctggt cacgcggaac gctgatgtca tcccggctcg gagacgcggg      360
gacaagcggg gagcattgct ctccccgaga cccatttcga ccttgaaggg gtcctcgggg      420
gggccggtgc tctgccctag gggccacgtc gttgggctct tccgagcagc tgtgtgctct      480
cggggcgtgg ccaaatccat cgatttcatc cccgttgaga cactcgacgt tgttacaagg      540
tctcccactt tcagtgacaa cagcacgcca ccggctgtgc cccagaccta tcaggtcggg      600
tacttgcatg ctccaactgg cagtggaaag agcaccaagg tccctgtcgc gtatgccgcc      660
caggggtaca aagtactagt gcttaacccc tcggtagctg ccaccctggg gtttggggcg      720
tacctatcca aggcacatgg catcaatccc aacattagga ctggagtcag gaccgtgatg      780
accggggagg ccatcacgta ctccacatat ggcaaatttc tcgccgatgg gggctgcgct      840
agcggcgcct atgacatcat catatgcgat gaatgccacg ctgtggatgc tacctccatt      900
ctcggcatcg gaacggtcct tgatcaagca gagacagccg gggtcagact aactgtgctg      960
gctacggcca caccccccgg gtcagtgaca accccccatc ccgatataga agaggtaggc     1020
ctcgggcggg agggtgagat ccccttctat gggagggcga ttcccctatc ctgcatcaag     1080
ggagggagac acctgatttt ctgccactca aagaaaaagt gtgacgagct cgcggcggcc     1140
cttcggggca tgggcttgaa tgccgtggca tactatagag ggttggacgt ctccataata     1200
ccagctcagg gagatgtggt ggtcgtcgcc accgacgccc tcatgacggg gtacactgga     1260
gactttgact ccgtgatcga ctgcaatgta gcggtcaccc aagctgtcga cttcagcctg     1320
gaccccacct tcactataac cacacagact gtcccacaag acgctgtctc acgcagtcag     1380
cgccgcgggc gcacaggtag aggaagacag ggcacttata ggtatgtttc cactggtgaa     1440
cgagcctcag gaatgtttga cagtgtagtg ctttgtgagt gctacgacgc aggggctgcg     1500
tggtacgatc tcacaccagc ggagaccacc gtcaggctta gagcgtattt caacacgccc     1560
ggcctacccg tgtgtcaaga ccatcttgaa ttttgggagg cagttttcac cggcctcaca     1620
cacatagacg cccacttcct ctcccaaaca aagcaagcgg gggagaactt cgcgtaccta     1680
gtagcctacc aagctacggt gtgcgccaga gccaaggccc ctcccccgtc ctgggacgcc     1740
atgtggaagt gcctggcccg actcaagcct acgcttgcgg gccccacacc tctcctgtac     1800
cgtttgggcc ctattaccaa tgaggtcacc ctcacacacc ctgggacgaa gtacatcgcc     1860
acatgcatgc aagctgacct tgaggtcatg accagcacgt gggtcctagc tggaggagtc     1920
ctggcagccg tcgccgcata ttgcctggcg actggatgcg tttccatcat cggccgcttg     1980
cacgtcaacc agcgagtcgt cgttgcgccg gataaggagg tcctgtatga ggcttttgat     2040
gagatggagg aatgcgcctc tagggcggct ctcatcgaag aggggcagcg gatagccgag     2100
atgttgaagt ccaagatcca aggcttgctg cagcaggcct ctaagcaggc ccaggacata     2160
caacccgcta tgcaggcttc atggcccaaa gtggaacaat tttgggccag acacatgtgg     2220
aacttcatta gcggcatcca atacctcgca ggattgtcaa cactgccagg gaaccccgcg     2280
gtggcttcca tgatggcatt cagtgccgcc ctcaccagtc cgttgtcgac cagtaccacc     2340
atccttctca acatcatggg aggctggtta gcgtcccaga tcgcaccacc cgcgggggcc     2400
accggctttg tcgtcagtgg cctggtgggg gctgccgtgg gcagcatagg cctgggtaag     2460
gtgctggtgg acatcctggc aggatatggt gcgggcattt cgggggccct cgtcgcattc     2520
aagatcatgt ctggcgagaa gccctctatg gaagatgtca tcaatctact gcctgggatc     2580
ctgtctccgg gagccctggt ggtgggggtc atctgcgcgg ccattctgcg ccgccacgtg     2640
ggaccggggg agggcgcggt ccaatggatg aacaggctta ttgcctttgc ttccagagga     2700
aaccacgtcg cccctactca ctacgtgacg gagtcggatg cgtcgcagcg tgtgacccaa     2760
ctacttggct ctcttactat aaccagccta ctcagaagac tccacaattg gataactgag      2820
gactgcccca tcccatgctc cggatcctgg ctccgcgacg tgtgggactg ggtttgcacc      2880
atcttgacag acttcaaaaa ttggctgacc tctaaattgt tccccaagct gcccggcctc      2940
cccttcatct cttgtcaaaa ggggtacaag ggtgtgtggg ccggcactgg catcatgacc      3000
acgcgctgcc cttgcggcgc caacatctct ggcaatgtcc gcctgggctc tatgaggatc      3060
acagggccta aaacctgcat gaacacctgg caggggacct ttcctatcaa ttgctacacg      3120
gagggccagt gcgcgccgaa accccccacg aactacaaga ccgccatctg gagggtggcg      3180
gcctcggagt acgcggaggt gacgcagcat gggtcgtact cctatgtaac aggactgacc      3240
actgacaatc tgaaaattcc ttgccaacta ccttctccag agtttttctc ctgggtggac      3300
ggtgtgcaga tccataggtt tgcacccaca ccaaagccgt ttttccggga tgaggtctcg      3360
ttctgcgttg ggcttaattc ctatgctgtc gggtcccagc ttccctgtga acctgagccc      3420
gacgcagacg tattgaggtc catgctaaca gatccgcccc acatcacggc ggagactgcg      3480
gcgcggcgct tggcacgggg atcacctcca tctgaggcga gctcctcagt gagccagcta      3540
tcagcaccgt cgctgcgggc cacctgcacc acccacagca acacctatga cgtggacatg      3600
gtcgatgcca acctgctcat ggagggcggt gtggctcaga cagagcctga gtccagggtg      3660
cccgttctgg actttctcga gccaatggcc gaggaagaga gcgaccttga gccctcaata      3720
ccatcggagt gcatgctccc caggagcggg tttccacggg ccttaccggc ttgggcacgg      3780
cctgactaca acccgccgct cgtggaatcg tggaggaggc cagattacca accgcccacc      3840
gttgctggtt gtgctctccc cccccccaag aaggccccga cgcctccccc aaggagacgc      3900
cggacagtgg gtctgagcga gagcaccata tcagaagccc tccagcaact ggccatcaag      3960
acctttggcc agcccccctc gagcggtgat gcaggctcgt ccacgggggc gggcgccgcc      4020
gaatccggcg gtccgacgtc ccctggtgag ccggccccct cagagacagg ttccgcctcc      4080
tctatgcccc ccctcgaggg ggagcctgga gatccggacc tggagtctga tcaggtagag      4140
cttcaacctc ccccccaggg ggggggggta gctcccggtt cgggctcggg gtcttggtct      4200
acttgctccg aggaggacga taccaccgtg tgctgctcca tgtcatactc ctggaccggg      4260
gctctaataa ctccctgtag ccccgaagag gaaaagttgc caatcaaccc tttgagtaac      4320
tcgctgttgc gataccataa caaggtgtac tgtacaacat caaagagcgc ctcacagagg      4380
gctaaaaagg taacttttga caggacgcaa gtgctcgacg cccattatga ctcagtctta      4440
aaggacatca agctagcggc ttccaaggtc agcgcaaggc tcctcacctt ggaggaggcg      4500
tgccagttga ctccacccca ttctgcaaga tccaagtatg gattcggggc caaggaggtc      4560
cgcagcttgt ccgggagggc cgttaaccac atcaagtccg tgtggaagga cctcctggaa      4620
gacccacaaa caccaattcc cacaaccatc atggccaaaa atgaggtgtt ctgcgtggac      4680
cccgccaagg ggggtaagaa accagctcgc ctcatcgttt accctgacct cggcgtccgg      4740
gtctgcgaga aaatggccct ctatgacatt acacaaaagc ttcctcaggc ggtaatggga      4800
gcttcctatg gcttccagta ctcccctgcc caacgggtgg agtatctctt gaaagcatgg      4860
gcggaaaaga aggaccccat gggtttttcg tatgataccc gatgcttcga ctcaaccgtc      4920
actgagagag acatcaggac cgaggagtcc atataccagg cctgctccct gcccgaggag      4980
gcccgcactg ccatacactc gctgactgag agactttacg taggagggcc catgttcaac      5040
agcaagggtc aaacctgcgg ttacagacgt tgccgcgcca gcggggtgct aaccactagc      5100
atgggtaaca ccatcacatg ctatgtgaaa gccctagcgg cctgcaaggc tgcggggata      5160
gttgcgccca caatgctggt atgcggcgat gacctagtag tcatctcaga aagccagggg      5220
actgaggagg acgagcggaa cctgagagcc ttcacggagg ccatgaccag gtactctgcc      5280
cctcctggtg atccccccag accggaatat gacctggagc taataacatc ctgttcctca      5340
aatgtgtctg tggcgttggg cccgcggggc cgccgcagat actacctgac cagagaccca      5400
accactccac tcgcccgggc tgcctgggaa acagttagac actcccctat caattcatgg      5460
ctgggaaaca tcatccagta tgctccaacc atatgggttc gcatggtcct aatgacacac      5520
ttcttctcca ttctcatggt ccaagacacc ctggaccaga acctcaactt tgagatgtat      5580
ggatcagtat actccgtgaa tcctttggac cttccagcca taattgagag gttacacggg      5640
cttgacgcct tttctatgca cacatactct caccacgaac tgacgcgggt ggcttcagcc      5700
ctcagaaaac ttggggcgcc acccctcagg gtgtggaaga gtcgggctcg cgcagtcagg      5760
gcgtccctca tctcccgtgg agggaaagcg gccgtttgcg gccgatatct cttcaattgg      5820
gcggtgaaga ccaagctcaa actcactcca ttgccggagg cgcgcctact ggacttatcc      5880
agttggttca ccgtcggcgc cggcgggggc gacatttttc acagcgtgtc gcgcgcccga      5940
ccccgctcat tactcttcgg cctactccta cttttcgtag gggtaggcct cttcctactc      6000
cccgctcggt aga                                                         6013
<210>2
<211>1773
<212>DNA
<213>丙型肝炎病毒
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(1773)
<220>
<223>编码JFH1的NS3到NS5蛋白质的序列(cDNA序列)
<400>2
tcc atg tca tac tcc tgg acc ggg gct cta ata act ccc tgt agc ccc         48
Ser Met Ser Tyr Ser Trp Thr Gly Ala Leu Ile Thr Pro Cys Ser Pro
  1               5                  10                  15
gaa gag gaa aag ttg cca atc aac cct ttg agt aac tcg ctg ttg cga         96
Glu Glu Glu Lys Leu Pro Ile Asn Pro Leu Ser Asn Ser Leu Leu Arg
             20                  25                  30
tac cat aac aag gtg tac tgt aca aca tca aag agc gcc tca cag agg        144
Tyr His Asn Lys Val Tyr Cys Thr Thr Ser Lys Ser Ala Ser Gln Arg
         35                  40                  45
gct aaa aag gta act ttt gac agg acg caa gtg ctc gac gcc cat tat        192
Ala Lys Lys Val Thr Phe Asp Arg Thr Gln Val Leu Asp Ala His Tyr
     50                  55                  60
gac tca gtc tta aag gac atc aag cta gcg gct tcc aag gtc agc gca        240
Asp Ser Val Leu Lys Asp Ile Lys Leu Ala Ala Ser Lys Val Ser Ala
 65                  70                  75                  80
agg ctc ctc acc ttg gag gag gcg tgc cag ttg act cca ccc cat tct        288
Arg Leu Leu Thr Leu Glu Glu Ala Cys Gln Leu Thr Pro Pro His Ser
                 85                  90                  95
gca aga tcc aag tat gga ttc ggg gcc aag gag gtc cgc agc ttg tcc        336
Ala Arg Ser Lys Tyr Gly Phe Gly Ala Lys Glu Val Arg Ser Leu Ser
            100                 105                 110
ggg agg gcc gtt aac cac atc aag tcc gtg tgg aag gac ctc ctg gaa        384
Gly Arg Ala Val Asn His Ile Lys Ser Val Trp Lys Asp Leu Leu Glu
        115                 120                 125
gac cca caa aca cca att ccc aca acc atc atg gcc aaa aat gag gtg        432
Asp Pro Gln Thr Pro Ile Pro Thr Thr Ile Met Ala Lys Asn Glu Val
    130                 135                 140
ttc tgc gtg gac ccc gcc aag ggg ggt aag aaa cca gct cgc ctc atc        480
Phe Cys Val Asp Pro Ala Lys Gly Gly Lys Lys Pro Ala Arg Leu Ile
145                 150                 155                 160
gtt tac cct gac ctc ggc gtc cgg gtc tgc gag aaa atg gcc ctc tat        528
Val Tyr Pro Asp Leu Gly Val Arg Val Cys Glu Lys Met Ala Leu Tyr
                165                 170                 175
gac att aca caa aag ctt cct cag gcg gta atg gga gct tcc tat ggc        576
Asp Ile Thr Gln Lys Leu Pro Gln Ala Val Met Gly Ala Ser Tyr Gly
            180                 185                 190
ttc cag tac tcc cct gcc caa cgg gtg gag tat ctc ttg aaa gca tgg        624
Phe Gln Tyr Ser Pro Ala Gln Arg Val Glu Tyr Leu Leu Lys Ala Trp
        195                 200                 205
gcg gaa aag aag gac ccc atg ggt ttt tcg tat gat acc cga tgc ttc        672
Ala Glu Lys Lys Asp Pro Met Gly Phe Ser Tyr Asp Thr Arg Cys Phe
    210                 215                 220
gac tca acc gtc act gag aga gac atc agg acc gag gag tcc ata tac        720
Asp Ser Thr Val Thr Glu Arg Asp Ile Arg Thr Glu Glu Ser Ile Tyr
225                 230                 235                 240
cag gcc tgc tcc ctg ccc gag gag gcc cgc act gcc ata cac tcg ctg        768
Gln Ala Cys Ser Leu Pro Glu Glu Ala Arg Thr Ala Ile His Ser Leu
                245                 250                 255
act gag aga ctt tac gta gga ggg ccc atg ttc aac agc aag ggt caa        816
Thr Glu Arg Leu Tyr Val Gly Gly Pro Met Phe Asn Ser Lys Gly Gln
            260                 265                 270
acc tgc ggt tac aga cgt tgc cgc gcc agc ggg gtg cta acc act agc        864
Thr Cys Gly Tyr Arg Arg Cys Arg Ala Ser Gly Val Leu Thr Thr Ser
        275                 280                 285
atg ggt aac acc atc aca tgc tat gtg aaa gcc cta gcg gcc tgc aag        912
Met Gly Asn Thr Ile Thr Cys Tyr Val Lys Ala Leu Ala Ala Cys Lys
    290                 295                 300
gct gcg ggg ata gtt gcg ccc aca atg ctg gta tgc ggc gat gac cta        960
Ala Ala Gly Ile Val Ala Pro Thr Met Leu Val Cys Gly Asp Asp Leu
305                 310                 315                 320
gta gtc atc tca gaa agc cag ggg act gag gag gac gag cgg aac ctg        1008
Val Val Ile Ser Glu Ser Gln Gly Thr Glu Glu Asp Glu Arg Asn Leu
                325                 330                 335
aga gcc ttc acg gag gcc atg acc agg tac tct gcc cct cct ggt gat        1056
Arg Ala Phe Thr Glu Ala Met Thr Arg Tyr Ser Ala Pro Pro Gly Asp
            340                 345                 350
ccc ccc aga ccg gaa tat gac ctg gag cta ata aca tcc tgt tcc tca        1104
Pro Pro Arg Pro Glu Tyr Asp Leu Glu Leu Ile Thr Ser Cys Ser Ser
        355                 360                 365
aat gtg tct gtg gcg ttg ggc ccg cgg ggc cgc cgc aga tac tac ctg        1152
Asn Val Ser Val Ala Leu Gly Pro Arg Gly Arg Arg Arg Tyr Tyr Leu
    370                 375                 380
acc aga gac cca acc act cca ctc gcc cgg gct gcc tgg gaa aca gtt        1200
Thr Arg Asp Pro Thr Thr Pro Leu Ala Arg Ala Ala Trp Glu Thr Val
385                 390                 395                 400
aga cac tcc cct atc aat tca tgg ctg gga aac atc atc cag tat gct        1248
Arg His Ser Pro Ile Asn Ser Trp Leu Gly Asn Ile Ile Gln Tyr Ala
                405                 410                 415
cca acc ata tgg gtt cgc atg gtc cta atg aca cac ttc ttc tcc att        1296
Pro Thr Ile Trp Val Arg Met Val Leu Met Thr His Phe Phe Ser Ile
            420                 425                 430
ctc atg gtc caa gac acc ctg gac cag aac ctc aac ttt gag atg tat        1344
Leu Met Val Gln Asp Thr Leu Asp Gln Asn Leu Asn Phe Glu Met Tyr
        435                 440                 445
gga tca gta tac tcc gtg aat cct ttg gac ctt cca gcc ata att gag        1392
Gly Ser Val Tyr Ser Val Asn Pro Leu Asp Leu Pro Ala Ile Ile Glu
    450                 455                 460
agg tta cac ggg ctt gac gcc ttt tct atg cac aca tac tct cac cac        1440
Arg Leu His Gly Leu Asp Ala Phe Ser Met His Thr Tyr Ser His His
465                 470                 475                 480
gaa ctg acg cgg gtg gct tca gcc ctc aga aaa ctt ggg gcg cca ccc        1488
Glu Leu Thr Arg Val Ala Ser Ala Leu Arg Lys Leu Gly Ala Pro Pro
                485                 490                 495
ctc agg gtg tgg aag agt cgg gct cgc gca gtc agg gcg tcc ctc atc        1536
Leu Arg Val Trp Lys Ser Arg Ala Arg Ala Val Arg Ala Ser Leu Ile
            500                 505                 510
tcc cgt gga ggg aaa gcg gcc gtt tgc ggc cga tat ctc ttc aat tgg        1584
Ser Arg Gly Gly Lys Ala Ala Val Cys Gly Arg Tyr Leu Phe Asn Trp
        515                 520                 525
gcg gtg aag acc aag ctc aaa ctc act cca ttg ccg gag gcg cgc cta        1632
Ala Val Lys Thr Lys Leu Lys Leu Thr Pro Leu Pro Glu Ala Arg Leu
    530                 535                 540
ctg gac tta tcc agt tgg ttc acc gtc ggc gcc ggc ggg ggc gac att        1680
Leu Asp Leu Ser Ser Trp Phe Thr Val Gly Ala Gly Gly Gly Asp Ile
545                 550                 555                 560
ttt cac agc gtg tcg cgc gcc cga ccc cgc tca tta ctc ttc ggc cta        1728
Phe His Ser Val Ser Arg Ala Arg Pro Arg Ser Leu Leu Phe Gly Leu
                565                 570                 575
ctc cta ctt ttc gta ggg gta ggc ctc ttc cta ctc ccc gct cgg            1773
Leu Leu Leu Phe Val Gly Val Gly Leu Phe Leu Leu Pro Ala Arg
            580                 585                 590
<210>3
<211>591
<212>PRT
<213>丙型肝炎病毒
<220>
<223>JFH1的NS5B蛋白质
<400>3
Ser Met Ser Tyr Ser Trp Thr Gly Ala Leu Ile Thr Pro Cys Ser Pro
  1               5                  10                  15
Glu Glu Glu Lys Leu Pro Ile Asn Pro Leu Ser Asn Ser Leu Leu Arg
             20                  25                  30
Tyr His Asn Lys Val Tyr Cys Thr Thr Ser Lys Ser Ala Ser Gln Arg
         35                  40                  45
Ala Lys Lys Val Thr Phe Asp Arg Thr Gln Val Leu Asp Ala His Tyr
     50                  55                  60
Asp Ser Val Leu Lys Asp Ile Lys Leu Ala Ala Ser Lys Val Ser Ala
 65                  70                  75                  80
Arg Leu Leu Thr Leu Glu Glu Ala Cys Gln Leu Thr Pro Pro His Ser
                 85                  90                  95
Ala Arg Ser Lys Tyr Gly Phe Gly Ala Lys Glu Val Arg Ser Leu Ser
            100                 105                 110
Gly Arg Ala Val Asn His Ile Lys Ser Val Trp Lys Asp Leu Leu Glu
        115                 120                 125
Asp Pro Gln Thr Pro Ile Pro Thr Thr Ile Met Ala Lys Asn Glu Val
    130                 135                 140
Phe Cys Val Asp Pro Ala Lys Gly Gly Lys Lys Pro Ala Arg Leu Ile
145                 150                 155                 160
Val Tyr Pro Asp Leu Gly Val Arg Val Cys Glu Lys Met Ala Leu Tyr
                165                 170                 175
Asp Ile Thr Gln Lys Leu Pro Gln Ala Val Met Gly Ala Ser Tyr Gly
            180                 185                 190
Phe Gln Tyr Ser Pro Ala Gln Arg Val Glu Tyr Leu Leu Lys Ala Trp
        195                 200                 205
Ala Glu Lys Lys Asp Pro Met Gly Phe Ser Tyr Asp Thr Arg Cys Phe
    210                 215                 220
Asp Ser Thr Val Thr Glu Arg Asp Ile Arg Thr Glu Glu Ser Ile Tyr
225                 230                 235                 240
Gln Ala Cys Ser Leu Pro Glu Glu Ala Arg Thr Ala Ile His Ser Leu
                245                 250                 255
Thr Glu Arg Leu Tyr Val Gly Gly Pro Met Phe Asn Ser Lys Gly Gln
            260                 265                 270
Thr Cys Gly Tyr Arg Arg Cys Arg Ala Ser Gly Val Leu Thr Thr Ser
        275                 280                 285
Met Gly Asn Thr Ile Thr Cys Tyr Val Lys Ala Leu Ala Ala Cys Lys
    290                 295                 300
Ala Ala Gly Ile Val Ala Pro Thr Met Leu Val Cys Gly Asp Asp Leu
305                 310                 315                 320
Val Val Ile Ser Glu Ser Gln Gly Thr Glu Glu Asp Glu Arg Asn Leu
                325                 330                 335
Arg Ala Phe Thr Glu Ala Met Thr Arg Tyr Ser Ala Pro Pro Gly Asp
            340                 345                 350
Pro Pro Arg Pro Glu Tyr Asp Leu Glu Leu Ile Thr Ser Cys Ser Ser
        355                 360                 365
Asn Val Ser Val Ala Leu Gly Pro Arg Gly Arg Arg Arg Tyr Tyr Leu
    370                 375                 380
Thr Arg Asp Pro Thr Thr Pro Leu Ala Arg Ala Ala Trp Glu Thr Val
385                 390                 395                 400
Arg His Ser Pro Ile Asn Ser Trp Leu Gly Asn Ile Ile Gln Tyr Ala
                405                 410                 415
Pro Thr Ile Trp Val Arg Met Val Leu Met Thr His Phe Phe Ser Ile
            420                 425                 430
Leu Met Val Gln Asp Thr Leu Asp Gln Asn Leu Asn Phe Glu Met Tyr
        435                 440                 445
Gly Ser Val Tyr Ser Val Asn Pro Leu Asp Leu Pro Ala Ile Ile Glu
    450                 455                 460
Arg Leu His Gly Leu Asp Ala Phe Ser Met His Thr Tyr Ser His His
465                 470                 475                 480
Glu Leu Thr Arg Val Ala Ser Ala Leu Arg Lys Leu Gly Ala Pro Pro
                485                 490                 495
Leu Arg Val Trp Lys Ser Arg Ala Arg Ala Val Arg Ala Ser Leu Ile
            500                 505                 510
Ser Arg Gly Gly Lys Ala Ala Val Cys Gly Arg Tyr Leu Phe Asn Trp
        515                 520                 525
Ala Val Lys Thr Lys Leu Lys Leu Thr Pro Leu Pro Glu Ala Arg Leu
    530                 535                 540
Leu Asp Leu Ser Ser Trp Phe Thr Val Gly Ala Gly Gly Gly Asp Ile
545                 550                 555                 560
Phe His Ser Val Ser Arg Ala Arg Pro Arg Ser Leu Leu Phe Gly Leu
                565                 570                 575
Leu Leu Leu Phe Val Gly Val Gly Leu Phe Leu Leu Pro Ala Arg
            580                 585                 590
<210>4
<211>14
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：基于JFH1 E2片段设计的合成肽
<400>4
Gly Thr Thr Thr Val Gly Gly Ala Val Ala Arg Ser Thr Asn
  1               5                  10
<210>5
<211>14
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：基于JFH1 E2片段设计的合成肽
<400>5
Cys Asp Leu Glu Asp Arg Asp Arg Ser Gln Leu Ser Pro Leu
  1               5                  10
<210>6
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：引物(R6-130-S17)
<400>6
cgggagagcc atagtgg                   17
<210>7
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：引物(R6-290-R19)
<400>7
agtaccacaa ggcctttcg                 19
<210>8
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：TaqMan探针(R6-148-S21FT)
<400>8
ctgcggaacc ggtgagtaca c              21
<210>9
<211>9707
<212>RNA
<213>智人(Homo sapiens)
<220>
<223>源于JFH1株的全长丙型肝炎病毒基因组RNA(JFH-1克隆)
<400>9
gaauucuaau acgacucacu auagaccugc cccuaauagg ggcgacacuc cgccaugaau      60
cacuccccug ugaggaacua cugucuucac gcagaaagcg ccuagccaug gcguuaguau      120
gagugucgua cagccuccag gccccccccu cccgggagag ccauaguggu cugcggaacc      180
ggugaguaca ccggaauugc cgggaagacu ggguccuuuc uuggauaaac ccacucuaug      240
cccggccauu ugggcgugcc cccgcaagac ugcuagccga guagcguugg guugcgaaag      300
gccuuguggu acugccugau agggcgcuug cgagugcccc gggaggucuc guagaccgug      360
caccaugagc acaaauccua aaccucaaag aaaaaccaaa agaaacacca accgucgccc      420
agaagacguu aaguucccgg gcggcggcca gaucguuggc ggaguauacu uguugccgcg      480
caggggcccc agguugggug ugcgcacgac aaggaaaacu ucggagcggu cccagccacg      540
ugggagacgc cagcccaucc ccaaagaucg gcgcuccacu ggcaaggccu ggggaaaacc      600
aggucgcccc uggccccuau augggaauga gggacucggc ugggcaggau ggcuccuguc      660
cccccgaggc ucucgccccu ccuggggccc cacugacccc cggcauaggu cgcgcaacgu      720
ggguaaaguc aucgacaccc uaacgugugg cuuugccgac cucauggggu acauccccgu      780
cguaggcgcc ccgcuuagug gcgccgccag agcugucgcg cacggcguga gaguccugga      840
ggacgggguu aauuaugcaa cagggaaccu acccgguuuc cccuuuucua ucuucuugcu      900
ggcccuguug uccugcauca ccguuccggu cucugcugcc caggugaaga auaccaguag      960
cagcuacaug gugaccaaug acugcuccaa ugacagcauc acuuggcagc ucgaggcugc      1020
gguucuccac guccccgggu gcgucccgug cgagagagug gggaauacgu cacgguguug      1080
ggugccaguc ucgccaaaca uggcugugcg gcagcccggu gcccucacgc agggucugcg      1140
gacgcacauc gauaugguug ugauguccgc caccuucugc ucugcucucu acguggggga      1200
ccucuguggc ggggugaugc ucgcggccca gguguucauc gucucgccgc aguaccacug      1260
guuugugcaa gaaugcaauu gcuccaucua cccuggcacc aucacuggac accgcauggc      1320
augggacaug augaugaacu ggucgcccac ggccaccaug auccuggcgu acgugaugcg      1380
cguccccgag gucaucauag acaucguuag cggggcucac uggggcguca uguucggcuu      1440
ggccuacuuc ucuaugcagg gagcgugggc gaaggucauu gucauccuuc ugcuggccgc      1500
ugggguggac gcgggcacca ccaccguugg aggcgcuguu gcacguucca ccaacgugau      1560
ugccggcgug uucagccaug gcccucagca gaacauucag cucauuaaca ccaacggcag      1620
uuggcacauc aaccguacug ccuugaauug caaugacucc uugaacaccg gcuuucucgc      1680
ggccuuguuc uacaccaacc gcuuuaacuc gucagggugu ccagggcgcc uguccgccug      1740
ccgcaacauc gaggcuuucc ggauagggug gggcacccua caguacgagg auaaugucac      1800
caauccagag gauaugaggc cguacugcug gcacuacccc ccaaagccgu guggcguagu      1860
ccccgcgagg ucugugugug gcccagugua cuguuucacc cccagcccgg uaguaguggg      1920
cacgaccgac agacguggag ugcccaccua cacaugggga gagaaugaga cagaugucuu      1980
ccuacugaac agcacccgac cgccgcaggg cucaugguuc ggcugcacgu ggaugaacuc      2040
cacugguuuc accaagacuu guggcgcgcc accuugccgc accagagcug acuucaacgc      2100
cagcacggac uuguugugcc cuacggauug uuuuaggaag cauccugaug ccacuuauau      2160
uaaguguggu ucugggcccu ggcucacacc aaagugccug guccacuacc cuuacagacu      2220
cuggcauuac cccugcacag ucaauuuuac caucuucaag auaagaaugu auguaggggg      2280
gguugagcac aggcucacgg ccgcaugcaa cuucacucgu ggggaucgcu gcgacuugga      2340
ggacagggac aggagucagc ugucuccucu guugcacucu accacggaau gggccauccu      2400
gcccugcacc uacucagacu uacccgcuuu gucaacuggu cuucuccacc uucaccagaa      2460
caucguggac guacaauaca uguauggccu cucaccugcu aucacaaaau acgucguucg      2520
augggagugg gugguacucu uauuccugcu cuuagcggac gccagagucu gcgccugcuu      2580
guggaugcuc aucuuguugg gccaggccga agcagcauug gagaaguugg ucgucuugca      2640
cgcugcgagu gcggcuaacu gccauggccu ccuauauuuu gccaucuucu ucguggcagc      2700
uuggcacauc aggggucggg ugguccccuu gaccaccuau ugccucacug gccuauggcc      2760
cuucugccua cugcucaugg cacugccccg gcaggcuuau gccuaugacg caccugugca      2820
cggacagaua ggcguggguu uguugauauu gaucacccuc uucacacuca ccccggggua      2880
uaagacccuc cucggccagu gucuguggug guugugcuau cuccugaccc ugggggaagc      2940
caugauucag gaguggguac cacccaugca ggugcgcggc ggccgcgaug gcaucgcgug      3000
ggccgucacu auauucugcc cggguguggu guuugacauu accaaauggc uuuuggcguu      3060
gcuugggccu gcuuaccucu uaagggccgc uuugacacau gugccguacu ucgucagagc      3120
ucacgcucug auaaggguau gcgcuuuggu gaagcagcuc gcggggggua gguauguuca      3180
gguggcgcua uuggcccuug gcagguggac uggcaccuac aucuaugacc accucacacc      3240
uaugucggac ugggccgcua gcggccugcg cgacuuagcg gucgccgugg aacccaucau      3300
cuucaguccg auggagaaga aggucaucgu cuggggagcg gagacggcug caugugggga      3360
cauucuacau ggacuucccg uguccgcccg acucggccag gagauccucc ucggcccagc      3420
ugauggcuac accuccaagg gguggaagcu ccuugcuccc aucacugcuu augcccagca      3480
aacacgaggc cuccugggcg ccauaguggu gaguaugacg gggcgugaca ggacagaaca      3540
ggccggggaa guccaaaucc uguccacagu cucucagucc uuccucggaa caaccaucuc      3600
ggggguuuug uggacuguuu accacggagc uggcaacaag acucuagccg gcuuacgggg      3660
uccggucacg cagauguacu cgagugcuga gggggacuug guaggcuggc ccagcccccc      3720
ugggaccaag ucuuuggagc cgugcaagug uggagccguc gaccuauauc uggucacgcg      3780
gaacgcugau gucaucccgg cucggagacg cggggacaag cggggagcau ugcucucccc      3840
gagacccauu ucgaccuuga agggguccuc gggggggccg gugcucugcc cuaggggcca      3900
cgucguuggg cucuuccgag cagcugugug cucucggggc guggccaaau ccaucgauuu      3960
cauccccguu gagacacucg acguuguuac aaggucuccc acuuucagug acaacagcac      4020
gccaccggcu gugccccaga ccuaucaggu cggguacuug caugcuccaa cuggcagugg      4080
aaagagcacc aaggucccug ucgcguaugc cgcccagggg uacaaaguac uagugcuuaa      4140
ccccucggua gcugccaccc ugggguuugg ggcguaccua uccaaggcac auggcaucaa      4200
ucccaacauu aggacuggag ucaggaccgu gaugaccggg gaggccauca cguacuccac      4260
auauggcaaa uuucucgccg augggggcug cgcuagcggc gccuaugaca ucaucauaug      4320
cgaugaaugc cacgcugugg augcuaccuc cauucucggc aucggaacgg uccuugauca      4380
agcagagaca gccgggguca gacuaacugu gcuggcuacg gccacacccc ccgggucagu      4440
gacaaccccc caucccgaua uagaagaggu aggccucggg cgggagggug agauccccuu      4500
cuaugggagg gcgauucccc uauccugcau caagggaggg agacaccuga uuuucugcca      4560
cucaaagaaa aagugugacg agcucgcggc ggcccuucgg ggcaugggcu ugaaugccgu      4620
ggcauacuau agaggguugg acgucuccau aauaccagcu cagggagaug ugguggucgu      4680
cgccaccgac gcccucauga cgggguacac uggagacuuu gacuccguga ucgacugcaa      4740
uguagcgguc acccaagcug ucgacuucag ccuggacccc accuucacua uaaccacaca      4800
gacuguccca caagacgcug ucucacgcag ucagcgccgc gggcgcacag guagaggaag      4860
acagggcacu uauagguaug uuuccacugg ugaacgagcc ucaggaaugu uugacagugu      4920
agugcuuugu gagugcuacg acgcaggggc ugcgugguac gaucucacac cagcggagac      4980
caccgucagg cuuagagcgu auuucaacac gcccggccua cccguguguc aagaccaucu      5040
ugaauuuugg gaggcaguuu ucaccggccu cacacacaua gacgcccacu uccucuccca      5100
aacaaagcaa gcgggggaga acuucgcgua ccuaguagcc uaccaagcua cggugugcgc      5160
cagagccaag gccccucccc cguccuggga cgccaugugg aagugccugg cccgacucaa      5220
gccuacgcuu gcgggcccca caccucuccu guaccguuug ggcccuauua ccaaugaggu      5280
cacccucaca cacccuggga cgaaguacau cgccacaugc augcaagcug accuugaggu      5340
caugaccagc acgugggucc uagcuggagg aguccuggca gccgucgccg cauauugccu      5400
ggcgacugga ugcguuucca ucaucggccg cuugcacguc aaccagcgag ucgucguugc      5460
gccggauaag gagguccugu augaggcuuu ugaugagaug gaggaaugcg ccucuagggc      5520
ggcucucauc gaagaggggc agcggauagc cgagauguug aaguccaaga uccaaggcuu      5580
gcugcagcag gccucuaagc aggcccagga cauacaaccc gcuaugcagg cuucauggcc      5640
caaaguggaa caauuuuggg ccagacacau guggaacuuc auuagcggca uccaauaccu      5700
cgcaggauug ucaacacugc cagggaaccc cgcgguggcu uccaugaugg cauucagugc      5760
cgcccucacc aguccguugu cgaccaguac caccauccuu cucaacauca ugggaggcug      5820
guuagcgucc cagaucgcac cacccgcggg ggccaccggc uuugucguca guggccuggu      5880
gggggcugcc gugggcagca uaggccuggg uaaggugcug guggacaucc uggcaggaua      5940
uggugcgggc auuucggggg cccucgucgc auucaagauc augucuggcg agaagcccuc      6000
uauggaagau gucaucaauc uacugccugg gauccugucu ccgggagccc uggugguggg      6060
ggucaucugc gcggccauuc ugcgccgcca cgugggaccg ggggagggcg cgguccaaug      6120
gaugaacagg cuuauugccu uugcuuccag aggaaaccac gucgccccua cucacuacgu      6180
gacggagucg gaugcgucgc agcgugugac ccaacuacuu ggcucucuua cuauaaccag      6240
ccuacucaga agacuccaca auuggauaac ugaggacugc cccaucccau gcuccggauc      6300
cuggcuccgc gacguguggg acuggguuug caccaucuug acagacuuca aaaauuggcu      6360
gaccucuaaa uuguucccca agcugcccgg ccuccccuuc aucucuuguc aaaaggggua      6420
caagggugug ugggccggca cuggcaucau gaccacgcgc ugcccuugcg gcgccaacau      6480
cucuggcaau guccgccugg gcucuaugag gaucacaggg ccuaaaaccu gcaugaacac      6540
cuggcagggg accuuuccua ucaauugcua cacggagggc cagugcgcgc cgaaaccccc      6600
cacgaacuac aagaccgcca ucuggagggu ggcggccucg gaguacgcgg aggugacgca      6660
gcaugggucg uacuccuaug uaacaggacu gaccacugac aaucugaaaa uuccuugcca      6720
acuaccuucu ccagaguuuu ucuccugggu ggacggugug cagauccaua gguuugcacc      6780
cacaccaaag ccguuuuucc gggaugaggu cucguucugc guugggcuua auuccuaugc      6840
ugucgggucc cagcuucccu gugaaccuga gcccgacgca gacguauuga gguccaugcu      6900
aacagauccg ccccacauca cggcggagac ugcggcgcgg cgcuuggcac ggggaucacc      6960
uccaucugag gcgagcuccu cagugagcca gcuaucagca ccgucgcugc gggccaccug      7020
caccacccac agcaacaccu augacgugga cauggucgau gccaaccugc ucauggaggg      7080
cgguguggcu cagacagagc cugaguccag ggugcccguu cuggacuuuc ucgagccaau      7140
ggccgaggaa gagagcgacc uugagcccuc aauaccaucg gagugcaugc uccccaggag      7200
cggguuucca cgggccuuac cggcuugggc acggccugac uacaacccgc cgcucgugga      7260
aucguggagg aggccagauu accaaccgcc caccguugcu gguugugcuc uccccccccc      7320
caagaaggcc ccgacgccuc ccccaaggag acgccggaca gugggucuga gcgagagcac      7380
cauaucagaa gcccuccagc aacuggccau caagaccuuu ggccagcccc ccucgagcgg      7440
ugaugcaggc ucguccacgg gggcgggcgc cgccgaaucc ggcgguccga cguccccugg      7500
ugagccggcc cccucagaga cagguuccgc cuccucuaug cccccccucg agggggagcc      7560
uggagauccg gaccuggagu cugaucaggu agagcuucaa ccuccccccc aggggggggg      7620
gguagcuccc gguucgggcu cggggucuug gucuacuugc uccgaggagg acgauaccac      7680
cgugugcugc uccaugucau acuccuggac cggggcucua auaacucccu guagccccga      7740
agaggaaaag uugccaauca acccuuugag uaacucgcug uugcgauacc auaacaaggu      7800
guacuguaca acaucaaaga gcgccucaca gagggcuaaa aagguaacuu uugacaggac      7860
gcaagugcuc gacgcccauu augacucagu cuuaaaggac aucaagcuag cggcuuccaa      7920
ggucagcgca aggcuccuca ccuuggagga ggcgugccag uugacuccac cccauucugc      7980
aagauccaag uauggauucg gggccaagga gguccgcagc uuguccggga gggccguuaa      8040
ccacaucaag uccgugugga aggaccuccu ggaagaccca caaacaccaa uucccacaac      8100
caucauggcc aaaaaugagg uguucugcgu ggaccccgcc aaggggggua agaaaccagc      8160
ucgccucauc guuuacccug accucggcgu ccgggucugc gagaaaaugg cccucuauga      8220
cauuacacaa aagcuuccuc aggcgguaau gggagcuucc uauggcuucc aguacucccc      8280
ugcccaacgg guggaguauc ucuugaaagc augggcggaa aagaaggacc ccauggguuu      8340
uucguaugau acccgaugcu ucgacucaac cgucacugag agagacauca ggaccgagga      8400
guccauauac caggccugcu cccugcccga ggaggcccgc acugccauac acucgcugac      8460
ugagagacuu uacguaggag ggcccauguu caacagcaag ggucaaaccu gcgguuacag      8520
acguugccgc gccagcgggg ugcuaaccac uagcaugggu aacaccauca caugcuaugu      8580
gaaagcccua gcggccugca aggcugcggg gauaguugcg cccacaaugc ugguaugcgg      8640
cgaugaccua guagucaucu cagaaagcca ggggacugag gaggacgagc ggaaccugag      8700
agccuucacg gaggccauga ccagguacuc ugccccuccu ggugaucccc ccagaccgga      8760
auaugaccug gagcuaauaa cauccuguuc cucaaaugug ucuguggcgu ugggcccgcg      8820
gggccgccgc agauacuacc ugaccagaga cccaaccacu ccacucgccc gggcugccug      8880
ggaaacaguu agacacuccc cuaucaauuc auggcuggga aacaucaucc aguaugcucc      8940
aaccauaugg guucgcaugg uccuaaugac acacuucuuc uccauucuca ugguccaaga      9000
cacccuggac cagaaccuca acuuugagau guauggauca guauacuccg ugaauccuuu      9060
ggaccuucca gccauaauug agagguuaca cgggcuugac gccuuuucua ugcacacaua      9120
cucucaccac gaacugacgc ggguggcuuc agcccucaga aaacuugggg cgccaccccu      9180
cagggugugg aagagucggg cucgcgcagu cagggcgucc cucaucuccc guggagggaa      9240
agcggccguu ugcggccgau aucucuucaa uugggcggug aagaccaagc ucaaacucac      9300
uccauugccg gaggcgcgcc uacuggacuu auccaguugg uucaccgucg gcgccggcgg      9360
gggcgacauu uuucacagcg ugucgcgcgc ccgaccccgc ucauuacucu ucggccuacu      9420
ccuacuuuuc guagggguag gccucuuccu acuccccgcu cgguagagcg gcacacacua      9480
gguacacucc auagcuaacu guuccuuuuu uuuuuuuuuu uuuuuuuuuu uuuuuuuuuu      9540
uuuuuuuucu uuuuuuuuuu uuucccucuu ucuucccuuc ucaucuuauu cuacuuucuu      9600
ucuugguggc uccaucuuag cccuagucac ggcuagcugu gaaagguccg ugagccgcau      9660
gacugcagag agugccguaa cuggucucuc ugcagaucau gucuaga                    9707
<210>10
<211>3748
<212>DNA
<213>丙型肝炎病毒
<220>
<223>包含TH1株的5’UTR到NS3区域的RNA序列
<400>10
gccagccccc gattgggggc gacactccac catagatcac tcccctgtga ggaactactg       60
tcttcacgca gaaagcgtct agccatggcg ttagtatgag tgtcgtgcag cctccaggac      120
cccccctccc gggagagcca tagtggtctg cggaaccggt gagtacaccg gaattgccag      180
gacgaccggg tcctttcttg gatcaacccg ctcaatgcct ggagatttgg gcgtgccccc      240
gcgagactgc tagccgagta gtgttgggtc gcgaaaggcc ttgtggtact gcctgatagg      300
gtgcttgcga gtgccccggg aggtctcgta gaccgtgcac catgagcacg aatcctaaac      360
ctcaaagaaa aaccaaacgt aacaccaacc gccgcccaca ggacgtcaag ttcccgggcg      420
gtggccagat cgttggtgga gtttacctgt tgccgcgcag gggccccagg ttgggtgtgc      480
gcgcgactag gaagacttcc gagcggtcgc aacctcgtgg aaggcgacaa cctatcccca      540
aggatcgccg acccgagggc agggcctggg ctcagcccgg gtacccttgg cccctctatg      600
gcaacgaggg catggggtgg gcaggatggc tcctgtcacc ccgtggctcc cggcctagtt       660
ggggccccaa tgacccccgg cgcaggtcgc gtaatttggg taaagtcatc gataccctta       720
catgcggctt cgccgacctc atggggtaca ttccgctcgt cggcgctccc ttggggggcg       780
ctgccagggc cttggcgcat ggcgtccggg ttctggagga cggcgtgaac tatgcaacag       840
ggaatctgcc cggttgctct ttctctatct tcctcttggc tctgctgtcc tgtctaacca       900
tcccagcttc cgcttatgaa gtgcgcaacg tgtccggggt gtaccatgtc acgaacgact       960
gctccaactc gagcattgtg tacgagacag gggacatgat tatgcacacc cctgggtgcg      1020
tgccctgtgt tcgggagaac aactcctccc gctgctgggc agcgctcact cccacgctcg      1080
cggccaggaa cgccagcgtc cccaccacga caatacggcg ccacgtcgat ttgctcgttg      1140
gggcggctgc tttctgctcc gctatgtacg tgggggatct ctgcggatct gttttcctcg      1200
tctcccagtt gttcaccttc tcgcctcgcc ggcatgagac agtgcaggac tgcaattgtt      1260
caatctatcc cggccacgta tcaggtcacc gcatggcttg ggatatgatg atgaactggt      1320
cacctacaac agccctactg gtatcgcagt tactccggat cccacaagcc gtcgtggaca      1380
tggtggcggg ggcccactgg ggagtcctgg cgggccttgc ctactattcc atggcgggga      1440
actgggctaa ggttttgatt gtgctgctac tctttgccgg cgttgatggg gcgacctacg      1500
tgacgggggg gtcggaagcc agaggggcct ctggcttagc aaacctcttt tcatttgggg      1560
cgtctcagaa gatccagctc ataaatacca acggcagttg gcacatcaat agaactgccc      1620
tgaactgcaa tgactccctc cacactgggt ttcttgccgc gctattctac acacacaaat      1680
tcaacgcgtc cggatgtcca gagcgcatgg ccagctgccg ccccattgaa gagttcgctc      1740
aggggtatgg tcccatcact tatgctgagc cctccccctc ggaccagagg ccctattgct      1800
ggcactacgc gcctcgaccg tgtggtatca tacccgcgtc gcaggtgtgt ggtccagtgt      1860
actgcttcac cccaagccct gttgtggtgg ggacgaccga tcgctccggt gcccccacgt      1920
ataattgggg ggcgaatgag acggacgtgc tgtatctcaa caacacgcgg ccgccgcaag      1980
gcaactggtt cggctgcaca tggatgaatg gcaccgggtt caccaagacg tgcgggggcc      2040
ccccgtgcaa catcgggggg ggcggcaaca acaacacctt gacctgcccc acggactgtt      2100
tccggaaaca ccccgaggcc acctacacca aatgtggttc gggaccttgg ttgacaccta      2160
ggtgcatggt cgactaccca tacaggctct ggcactaccc ctgcaccgtt aactttacca      2220
tctttaaggt taggatgtac gtgggaggtg tggagcacag gctcaacgcc gcatgcaatt      2280
ggacccgagg agagcgttgt aacttagagg acagggatag atcagagctt agcccgctgc      2340
tgctgtcaac aacagagtgg caggtgctac cttgttcctt caccacccta ccggctctgt      2400
ccactggttt gatccatctc caccagaaca tcgtggacgt gcaatacctg tacggtatag      2460
ggtcggcggt tgtctcctat gcaatcaaat gggaatatgt cttgttgctc ttcctcctcc      2520
tggcagacgc gcgcgtctgc gcctgcttgt ggatgatgct gctgatagct caagctgagg      2580
ccgccttaga gaacctggtg gtcctcaatg cggcgtccct ggctggagcg catggccttc      2640
tctctttcct tgtgttcttc tgtgccgctt ggtacatcaa gggcaggttg atccccgggg      2700
cggcgtatgc tttttacggc gtatggccgc tgctcctact cctgctggcg ttaccaccac      2760
gagcatacgc catggaccgg gagatggctg catcgtgcgg aggcgcggtt tttgtaggtc      2820
tggcattcct gaccttgtca ccacactata aggcattcct cgccaagctc atatggtggt      2880
tacaatattt tatcaccaga gccgaggccc atttgcaagt gtggatcccc cccctcaacg      2940
tccggggggg ccgcgatgcc atcatcctcc tcacatgcgc gatccatcca gaccttatct      3000
ttgacatcac caaactcttg ctcgccatgc tcggtccact catggtgctc caggctggca      3060
taactagagt gccgtacttc gtgcgcgctc aagggctcat tcgtgcatgc atgttggtgc      3120
ggaaagtcgc tgggggtcat tatgtccaaa tggccctcat gaagctggcc tcgctgacag      3180
gtacgtacgt ttacgaccat cttactccac tgcgggactg ggcccacggg ggcctacgag      3240
accttgcggt ggcagttgag cccgtcatct tctctgacat ggagaccaaa atcatcactt      3300
ggggagcaga caccgcggcg tgtggggaca tcatctcggg tctgcccgtc tccgcccgaa      3360
gggggaggga gatatttctg ggaccggccg acaagatcag agagcagggg tggcgactcc      3420
ttgcccccat cacggcctat tcccaacaga cgcgaggcct actcggctgc atcatcacta      3480
gcctcacagg ccgggacaag aaccaggtcg agggggaggt tcaagtggtc tctaccgcaa      3540
cgcaatcttt cctggcgacc tgcgtcaacg gcgtgtgttg gactgtctac catggtgccg      3600
gctcgaaaac tctagccggc ccgaagggac caatcaccca aatgtacacc aatgtagacc      3660
aggacctcgt cggctggcag gcgccccccg gggcgcgctc cttaacacca tgcacctgcg      3720
gcagctcgga cctttacttg gtcacgag                                         3748
<210>11
<211>11102
<212>RNA
<213>智人
<220>
<223>源于HCV JFH1株和HCV TH株的嵌合丙型肝炎病毒基因在RNA(JFH-1克隆)
<400>11
accugccccu aauaggggcg acacuccgcc augaaucacu ccccugugag gaacuacugu      60
cuucacgcag aaagcgccua gccauggcgu uaguaugagu gucguacagc cuccaggccc      120
cccccucccg ggagagccau aguggucugc ggaaccggug aguacaccgg aauugccggg      180
aagacugggu ccuuucuugg auaaacccac ucuaugcccg gccauuuggg cgugcccccg      240
caagacugcu agccgaguag cguuggguug cgaaaggccu ugugguacug ccugauaggg      300
cgcuugcgag ugccccggga ggucucguag accgugcacc augagcacaa auccuaaacc      360
ucaaagaaaa accaaaagaa acaccaaccg ucgcccaaug auugaacaag auggauugca      420
cgcagguucu ccggccgcuu ggguggagag gcuauucggc uaugacuggg cacaacagac      480
aaucggcugc ucugaugccg ccguguuccg gcugucagcg caggggcgcc cgguucuuuu      540
ugucaagacc gaccuguccg gugcccugaa ugaacugcag gacgaggcag cgcggcuauc      600
guggcuggcc acgacgggcg uuccuugcgc agcugugcuc gacguuguca cugaagcggg      660
aagggacugg cugcuauugg gcgaagugcc ggggcaggau cuccugucau cucaccuugc      720
uccugccgag aaaguaucca ucauggcuga ugcaaugcgg cggcugcaua cgcuugaucc      780
ggcuaccugc ccauucgacc accaagcgaa acaucgcauc gagcgagcac guacucggau      840
ggaagccggu cuugucgauc aggaugaucu ggacgaagag caucaggggc ucgcgccagc      900
cgaacuguuc gccaggcuca aggcgcgcau gcccgacggc gaggaucucg ucgugaccca      960
uggcgaugcc ugcuugccga auaucauggu ggaaaauggc cgcuuuucug gauucaucga      1020
cuguggccgg cugggugugg cggaccgcua ucaggacaua gcguuggcua cccgugauau      1080
ugcugaagag cuuggcggcg aaugggcuga ccgcuuccuc gugcuuuacg guaucgccgc      1140
ucccgauucg cagcgcaucg ccuucuaucg ccuucuugac gaguucuucu gaguuuaaac      1200
ccucucccuc cccccccccu aacguuacug gccgaagccg cuuggaauaa ggccggugug      1260
cguuugucua uauguuauuu uccaccauau ugccgucuuu uggcaaugug agggcccgga      1320
aaccuggccc ugucuucuug acgagcauuc cuaggggucu uuccccucuc gccaaaggaa      1380
ugcaaggucu guugaauguc gugaaggaag caguuccucu ggaagcuucu ugaagacaaa      1440
caacgucugu agcgacccuu ugcaggcagc ggaacccccc accuggcgac aggugccucu      1500
gcggccaaaa gccacgugua uaagauacac cugcaaaggc ggcacaaccc cagugccacg      1560
uugugaguug gauaguugug gaaagaguca aauggcucuc cucaagcgua uucaacaagg      1620
ggcugaagga ugcccagaag guaccccauu guaugggauc ugaucugggg ccucggugca      1680
caugcuuuac auguguuuag ucgagguuaa aaaaacgucu aggccccccg aaccacgggg      1740
acgugguuuu ccuuugaaaa acacgaugau accaugagca cgaauccuaa accucaaaga      1800
aaaaccaaac guaacaccaa ccgccgccca caggacguca aguucccggg cgguggccag      1860
aucguuggug gaguuuaccu guugccgcgc aggggcccca gguugggugu gcgcgcgacu      1920
aggaagacuu ccgagcgguc gcaaccucgu ggaaggcgac aaccuauccc caaggaucgc      1980
cgacccgagg gcagggccug ggcucagccc ggguacccuu ggccccucua uggcaacgag      2040
ggcauggggu gggcaggaug gcuccuguca ccccguggcu cccggccuag uuggggcccc      2100
aaugaccccc ggcgcagguc gcguaauuug gguaaaguca ucgauacccu uacaugcggc      2160
uucgccgacc ucauggggua cauuccgcuc gucggcgcuc ccuugggggg cgcugccagg      2220
gccuuggcgc auggcguccg gguucuggag gacggcguga acuaugcaac agggaaucug      2280
cccgguugcu cuuucucuau cuuccucuug gcucugcugu ccugucuaac caucccagcu      2340
uccgcuuaug aagugcgcaa cguguccggg guguaccaug ucacgaacga cugcuccaac      2400
ucgagcauug uguacgagac aggggacaug auuaugcaca ccccugggug cgugcccugu      2460
guucgggaga acaacuccuc ccgcugcugg gcagcgcuca cucccacgcu cgcggccagg      2520
aacgccagcg uccccaccac gacaauacgg cgccacgucg auuugcucgu uggggcggcu      2580
gcuuucugcu ccgcuaugua cgugggggau cucugcggau cuguuuuccu cgucucccag      2640
uuguucaccu ucucgccucg ccggcaugag acagugcagg acugcaauug uucaaucuau      2700
cccggccacg uaucagguca ccgcauggcu ugggauauga ugaugaacug gucaccuaca      2760
acagcccuac ugguaucgca guuacuccgg aucccacaag ccgucgugga caugguggcg      2820
ggggcccacu ggggaguccu ggcgggccuu gccuacuauu ccauggcggg gaacugggcu      2880
aagguuuuga uugugcugcu acucuuugcc ggcguugaug gggcgaccua cgugacgggg      2940
gggucggaag ccagaggggc cucuggcuua gcaaaccucu uuucauuugg ggcgucucag      3000
aagauccagc ucauaaauac caacggcagu uggcacauca auagaacugc ccugaacugc      3060
aaugacuccc uccacacugg guuucuugcc gcgcuauucu acacacacaa auucaacgcg      3120
uccggauguc cagagcgcau ggccagcugc cgccccauug aagaguucgc ucagggguau      3180
ggucccauca cuuaugcuga gcccuccccc ucggaccaga ggcccuauug cuggcacuac      3240
gcgccucgac cgugugguau cauacccgcg ucgcaggugu gugguccagu guacugcuuc      3300
accccaagcc cuguuguggu ggggacgacc gaucgcuccg gugcccccac guauaauugg      3360
ggggcgaaug agacggacgu gcuguaucuc aacaacacgc ggccgccgca aggcaacugg      3420
uucggcugca cauggaugaa uggcaccggg uucaccaaga cgugcggggg ccccccgugc      3480
aacaucgggg ggggcggcaa caacaacacc uugaccugcc ccacggacug uuuccggaaa      3540
caccccgagg ccaccuacac caaauguggu ucgggaccuu gguugacacc uaggugcaug      3600
gucgacuacc cauacaggcu cuggcacuac cccugcaccg uuaacuuuac caucuuuaag      3660
guuaggaugu acgugggagg uguggagcac aggcucaacg ccgcaugcaa uuggacccga      3720
ggagagcguu guaacuuaga ggacagggau agaucagagc uuagcccgcu gcugcuguca      3780
acaacagagu ggcaggugcu accuuguucc uucaccaccc uaccggcucu guccacuggu      3840
uugauccauc uccaccagaa caucguggac gugcaauacc uguacgguau agggucggcg      3900
guugucuccu augcaaucaa augggaauau gucuuguugc ucuuccuccu ccuggcagac      3960
gcgcgcgucu gcgccugcuu guggaugaug cugcugauag cucaagcuga ggccgccuua      4020
gagaaccugg ugguccucaa ugcggcgucc cuggcuggag cgcauggccu ucucucuuuc      4080
cuuguguucu ucugugccgc uugguacauc aagggcaggu ugauccccgg ggcggcguau      4140
gcuuuuuacg gcguauggcc gcugcuccua cuccugcugg cguuaccacc acgagcauac      4200
gccuaugacg caccugugca cggacagaua ggcguggguu uguugauauu gaucacccuc      4260
uucacacuca ccccggggua uaagacccuc cucggccagu gucuguggug guugugcuau      4320
cuccugaccc ugggggaagc caugauucag gaguggguac cacccaugca ggugcgcggc      4380
ggccgcgaug gcaucgcgug ggccgucacu auauucugcc cggguguggu guuugacauu      4440
accaaauggc uuuuggcguu gcuugggccu gcuuaccucu uaagggccgc uuugacacau      4500
gugccguacu ucgucagagc ucacgcucug auaaggguau gcgcuuuggu gaagcagcuc      4560
gcggggggua gguauguuca gguggcgcua uuggcccuug gcagguggac uggcaccuac      4620
aucuaugacc accucacacc uaugucggac ugggccgcua gcggccugcg cgacuuagcg      4680
gucgccgugg aacccaucau cuucaguccg auggagaaga aggucaucgu cuggggagcg      4740
gagacggcug caugugggga cauucuacau ggacuucccg uguccgcccg acucggccag      4800
gagauccucc ucggcccagc ugauggcuac accuccaagg gguggaagcu ccuugcuccc      4860
aucacugcuu augcccagca aacacgaggc cuccugggcg ccauaguggu gaguaugacg      4920
gggcgugaca ggacagaaca ggccggggaa guccaaaucc uguccacagu cucucagucc      4980
uuccucggaa caaccaucuc ggggguuuug uggacuguuu accacggagc uggcaacaag      5040
acucuagccg gcuuacgggg uccggucacg cagauguacu cgagugcuga gggggacuug      5100
guaggcuggc ccagcccccc ugggaccaag ucuuuggagc cgugcaagug uggagccguc      5160
gaccuauauc uggucacgcg gaacgcugau gucaucccgg cucggagacg cggggacaag      5220
cggggagcau ugcucucccc gagacccauu ucgaccuuga agggguccuc gggggggccg      5280
gugcucugcc cuaggggcca cgucguuggg cucuuccgag cagcugugug cucucggggc      5340
guggccaaau ccaucgauuu cauccccguu gagacacucg acguuguuac aaggucuccc      5400
acuuucagug acaacagcac gccaccggcu gugccccaga ccuaucaggu cggguacuug      5460
caugcuccaa cuggcagugg aaagagcacc aaggucccug ucgcguaugc cgcccagggg      5520
uacaaaguac uagugcuuaa ccccucggua gcugccaccc ugggguuugg ggcguaccua      5580
uccaaggcac auggcaucaa ucccaacauu aggacuggag ucaggaccgu gaugaccggg      5640
gaggccauca cguacuccac auauggcaaa uuucucgccg augggggcug cgcuagcggc      5700
gccuaugaca ucaucauaug cgaugaaugc cacgcugugg augcuaccuc cauucucggc      5760
aucggaacgg uccuugauca agcagagaca gccgggguca gacuaacugu gcuggcuacg      5820
gccacacccc ccgggucagu gacaaccccc caucccgaua uagaagaggu aggccucggg      5880
cgggagggug agauccccuu cuaugggagg gcgauucccc uauccugcau caagggaggg      5940
agacaccuga uuuucugcca cucaaagaaa aagugugacg agcucgcggc ggcccuucgg      6000
ggcaugggcu ugaaugccgu ggcauacuau agaggguugg acgucuccau aauaccagcu      6060
cagggagaug ugguggucgu cgccaccgac gcccucauga cgggguacac uggagacuuu      6120
gacuccguga ucgacugcaa uguagcgguc acccaagcug ucgacuucag ccuggacccc      6180
accuucacua uaaccacaca gacuguccca caagacgcug ucucacgcag ucagcgccgc      6240
gggcgcacag guagaggaag acagggcacu uauagguaug uuuccacugg ugaacgagcc      6300
ucaggaaugu uugacagugu agugcuuugu gagugcuacg acgcaggggc ugcgugguac      6360
gaucucacac cagcggagac caccgucagg cuuagagcgu auuucaacac gcccggccua      6420
cccguguguc aagaccaucu ugaauuuugg gaggcaguuu ucaccggccu cacacacaua      6480
gacgcccacu uccucuccca aacaaagcaa gcgggggaga acuucgcgua ccuaguagcc      6540
uaccaagcua cggugugcgc cagagccaag gccccucccc cguccuggga cgccaugugg      6600
aagugccugg cccgacucaa gccuacgcuu gcgggcccca caccucuccu guaccguuug      6660
ggcccuauua ccaaugaggu cacccucaca cacccuggga cgaaguacau cgccacaugc      6720
augcaagcug accuugaggu caugaccagc acgugggucc uagcuggagg aguccuggca      6780
gccgucgccg cauauugccu ggcgacugga ugcguuucca ucaucggccg cuugcacguc      6840
aaccagcgag ucgucguugc gccggauaag gagguccugu augaggcuuu ugaugagaug      6900
gaggaaugcg ccucuagggc ggcucucauc gaagaggggc agcggauagc cgagauguug      6960
aaguccaaga uccaaggcuu gcugcagcag gccucuaagc aggcccagga cauacaaccc      7020
gcuaugcagg cuucauggcc caaaguggaa caauuuuggg ccagacacau guggaacuuc      7080
auuagcggca uccaauaccu cgcaggauug ucaacacugc cagggaaccc cgcgguggcu      7140
uccaugaugg cauucagugc cgcccucacc aguccguugu cgaccaguac caccauccuu      7200
cucaacauca ugggaggcug guuagcgucc cagaucgcac cacccgcggg ggccaccggc      7260
uuugucguca guggccuggu gggggcugcc gugggcagca uaggccuggg uaaggugcug      7320
guggacaucc uggcaggaua uggugcgggc auuucggggg cccucgucgc auucaagauc      7380
augucuggcg agaagcccuc uauggaagau gucaucaauc uacugccugg gauccugucu      7440
ccgggagccc uggugguggg ggucaucugc gcggccauuc ugcgccgcca cgugggaccg      7500
ggggagggcg cgguccaaug gaugaacagg cuuauugccu uugcuuccag aggaaaccac      7560
gucgccccua cucacuacgu gacggagucg gaugcgucgc agcgugugac ccaacuacuu      7620
ggcucucuua cuauaaccag ccuacucaga agacuccaca auuggauaac ugaggacugc      7680
cccaucccau gcuccggauc cuggcuccgc gacguguggg acuggguuug caccaucuug      7740
acagacuuca aaaauuggcu gaccucuaaa uuguucccca agcugcccgg ccuccccuuc      7800
aucucuuguc aaaaggggua caagggugug ugggccggca cuggcaucau gaccacgcgc      7860
ugcccuugcg gcgccaacau cucuggcaau guccgccugg gcucuaugag gaucacaggg      7920
ccuaaaaccu gcaugaacac cuggcagggg accuuuccua ucaauugcua cacggagggc      7980
cagugcgcgc cgaaaccccc cacgaacuac aagaccgcca ucuggagggu ggcggccucg      8040
gaguacgcgg aggugacgca gcaugggucg uacuccuaug uaacaggacu gaccacugac      8100
aaucugaaaa uuccuugcca acuaccuucu ccagaguuuu ucuccugggu ggacggugug      8160
cagauccaua gguuugcacc cacaccaaag ccguuuuucc gggaugaggu cucguucugc      8220
guugggcuua auuccuaugc ugucgggucc cagcuucccu gugaaccuga gcccgacgca      8280
gacguauuga gguccaugcu aacagauccg ccccacauca cggcggagac ugcggcgcgg      8340
cgcuuggcac ggggaucacc uccaucugag gcgagcuccu cagugagcca gcuaucagca      8400
ccgucgcugc gggccaccug caccacccac agcaacaccu augacgugga cauggucgau      8460
gccaaccugc ucauggaggg cgguguggcu cagacagagc cugaguccag ggugcccguu      8520
cuggacuuuc ucgagccaau ggccgaggaa gagagcgacc uugagcccuc aauaccaucg      8580
gagugcaugc uccccaggag cggguuucca cgggccuuac cggcuugggc acggccugac      8640
uacaacccgc cgcucgugga aucguggagg aggccagauu accaaccgcc caccguugcu      8700
gguugugcuc uccccccccc caagaaggcc ccgacgccuc ccccaaggag acgccggaca      8760
gugggucuga gcgagagcac cauaucagaa gcccuccagc aacuggccau caagaccuuu      8820
ggccagcccc ccucgagcgg ugaugcaggc ucguccacgg gggcgggcgc cgccgaaucc      8880
ggcgguccga cguccccugg ugagccggcc cccucagaga cagguuccgc cuccucuaug      8940
cccccccucg agggggagcc uggagauccg gaccuggagu cugaucaggu agagcuucaa      9000
ccuccccccc aggggggggg gguagcuccc gguucgggcu cggggucuug gucuacuugc      9060
uccgaggagg acgauaccac cgugugcugc uccaugucau acuccuggac cggggcucua      9120
auaacucccu guagccccga agaggaaaag uugccaauca acccuuugag uaacucgcug      9180
uugcgauacc auaacaaggu guacuguaca acaucaaaga gcgccucaca gagggcuaaa      9240
aagguaacuu uugacaggac gcaagugcuc gacgcccauu augacucagu cuuaaaggac      9300
aucaagcuag cggcuuccaa ggucagcgca aggcuccuca ccuuggagga ggcgugccag      9360
uugacuccac cccauucugc aagauccaag uauggauucg gggccaagga gguccgcagc      9420
uuguccggga gggccguuaa ccacaucaag uccgugugga aggaccuccu ggaagaccca      9480
caaacaccaa uucccacaac caucauggcc aaaaaugagg uguucugcgu ggaccccgcc      9540
aaggggggua agaaaccagc ucgccucauc guuuacccug accucggcgu ccgggucugc      9600
gagaaaaugg cccucuauga cauuacacaa aagcuuccuc aggcgguaau gggagcuucc      9660
uauggcuucc aguacucccc ugcccaacgg guggaguauc ucuugaaagc augggcggaa      9720
aagaaggacc ccauggguuu uucguaugau acccgaugcu ucgacucaac cgucacugag      9780
agagacauca ggaccgagga guccauauac caggccugcu cccugcccga ggaggcccgc      9840
acugccauac acucgcugac ugagagacuu uacguaggag ggcccauguu caacagcaag      9900
ggucaaaccu gcgguuacag acguugccgc gccagcgggg ugcuaaccac uagcaugggu      9960
aacaccauca caugcuaugu gaaagcccua gcggccugca aggcugcggg gauaguugcg     10020
cccacaaugc ugguaugcgg cgaugaccua guagucaucu cagaaagcca ggggacugag     10080
gaggacgagc ggaaccugag agccuucacg gaggccauga ccagguacuc ugccccuccu     10140
ggugaucccc ccagaccgga auaugaccug gagcuaauaa cauccuguuc cucaaaugug     10200
ucuguggcgu ugggcccgcg gggccgccgc agauacuacc ugaccagaga cccaaccacu     10260
ccacucgccc gggcugccug ggaaacaguu agacacuccc cuaucaauuc auggcuggga     10320
aacaucaucc aguaugcucc aaccauaugg guucgcaugg uccuaaugac acacuucuuc     10380
uccauucuca ugguccaaga cacccuggac cagaaccuca acuuugagau guauggauca     10440
guauacuccg ugaauccuuu ggaccuucca gccauaauug agagguuaca cgggcuugac     10500
gccuuuucua ugcacacaua cucucaccac gaacugacgc ggguggcuuc agcccucaga     10560
aaacuugggg cgccaccccu cagggugugg aagagucggg cucgcgcagu cagggcgucc     10620
cucaucuccc guggagggaa agcggccguu ugcggccgau aucucuucaa uugggcggug     10680
aagaccaagc ucaaacucac uccauugccg gaggcgcgcc uacuggacuu auccaguugg     10740
uucaccgucg gcgccggcgg gggcgacauu uuucacagcg ugucgcgcgc ccgaccccgc     10800
ucauuacucu ucggccuacu ccuacuuuuc guagggguag gccucuuccu acuccccgcu     10860
cgguagagcg gcacacacua gguacacucc auagcuaacu guuccuuuuu uuuuuuuuuu     10920
uuuuuuuuuu uuuuuuuuuu uuuuuuuucu uuuuuuuuuu uuucccucuu ucuucccuuc     10980
ucaucuuauu cuacuuucuu ucuugguggc uccaucuuag cccuagucac ggcuagcugu     11040
gaaagguccg ugagccgcau gacugcagag agugccguaa cuggucucuc ugcagaucau     11100
gu                                                                    11102

Claims (23)

1.一种经修饰的丙型肝炎病毒基因组RNA，其由两种或以上的丙型肝炎病毒的基因组RNA构成，含有基因型为1b或2a的丙型肝炎病毒株的5’非翻译区、核心蛋白质编码序列、E1蛋白质编码序列、p7蛋白质编码序列、E2蛋白质编码序列、NS2蛋白质编码序列，序列号1所示的编码JFH1株的NS3、NS4、NS5A和NS5B蛋白的部分RNA序列以及基因型为1b或2a的丙型肝炎病毒株的3’非翻译区，并且所述的经修饰的丙型肝炎病毒基因组RNA具有自主复制能力。
2.一种经修饰的丙型肝炎病毒基因组RNA，其由两种或以上的丙型肝炎病毒的基因组RNA构成，含有基因型为1b或2a的丙型肝炎病毒株的5’非翻译区、核心蛋白质编码序列、E1蛋白质编码序列、p7蛋白质编码序列、E2蛋白质编码序列、NS2蛋白质编码序列、NS3蛋白质编码序列、NS4A蛋白质编码序列、NS4B蛋白质编码序列、NS5A蛋白质编码序列，序列号2所示的JFH1株的NS5B蛋白质编码序列以及基因型为1b或2a的丙型肝炎病毒株的3’非翻译区，并且经修饰的丙型肝炎病毒基因组RNA具有自主复制能力。
3.如权利要求1或2所述的经修饰的丙型肝炎病毒基因组RNA，其中的基因型1b的病毒株选自HCV-con1株和HCV-TH株。
4.如权利要求1或2所述的经修饰的丙型肝炎病毒基因组RNA，其中的基因型2a的病毒株选自HCV-JFH1株、以及HCV-JCH1株。
5.一种靶向肝细胞的病毒载体，其含有权利要求1或2所述的经修饰的丙型肝炎病毒基因组RNA。
6.一种导入了权利要求1或2所述的经修饰的丙型肝炎病毒基因组RNA、能够复制该丙型肝炎病毒基因组RNA且产生病毒颗粒的细胞。
7.丙型肝炎病毒颗粒，其是通过培养权利要求6所述的细胞，从培养物中得到的。
8.纯化HCV病毒颗粒的方法，该方法通过将含有权利要求7所述的HCV病毒颗粒的液体、或者细胞碎片通过组合柱层析和/或密度梯度离心来进行的。
9.如权利要求8所述的方法，其中，所述柱层析是选自离子交换层析、凝胶过滤层析、以及亲和层析中的一种或一种以上的层析。
10.如权利要求9所述的方法，其中，所述离子交换层析是选自阴离子交换层析和阳离子交换层析的一种或一种以上的层析；所述凝胶过滤层析是使用选自注册商标为Sepahcryl-S300、Sepahcryl-S400、Sepahcryl-S500的树脂的一种或一种以上的层析；所述亲和层析是使用选自Sulfated cellulofine、肝素、以及凝集素的树脂的一种或一种以上的层析。
11.如权利要求9所述的方法，其中，所述层析为Sulfatedcellulofine层析。
12.如权利要求8所述的方法，其中，所述密度梯度离心是使用选自氯化铯、蔗糖、以及糖聚合物的一种或一种以上的溶质进行的。
13.如权利要求8所述的方法，其中，在所述纯化方法中，将阴离子交换层析、Sulfated cellulofine层析、以及蔗糖密度梯度离心至少使用一次、且以任意顺序组合进行。
14.HCV病毒颗粒，其是通过将含有权利要求7所述的HCV病毒颗粒的液体或者细胞碎片以组合柱层析和密度梯度离心来纯化HCV病毒颗粒的方法得到的。
15.如权利要求14所述的HCV病毒颗粒，其是通过柱层析进行纯化的，其中，所述柱层析是选自离子交换层析、凝胶过滤层析、以及亲和层析中的一种或一种以上的层析。
16.如权利要求14所述的HCV病毒颗粒，其是通过柱层析进行纯化的，其中，所述离子交换层析为选自阴离子交换层析和阳离子交换层析中的一种或一种以上的层析；所述凝胶过滤层析为使用选自注册商标为Sepahcryl-S300、Sepahcryl-S400、Sepahcryl-S500的树脂的一种或一种以上的层析；所述亲和层析为使用选自Sulfatedcellulofine、肝素、以及凝集素的树脂的一种或一种以上的层析。
17.如权利要求14所述的HCV病毒颗粒，其是通过柱层析进行纯化的，其中，所述层析为Sulfated cellulofine层析。
18.如权利要求14所述的HCV病毒颗粒，其是通过密度梯度离心进行纯化的，其中，所述密度梯度离心是使用选自氯化铯、蔗糖、以及糖聚合物的一种或一种以上的溶质进行的。
19.如权利要求14所述的HCV病毒颗粒，其是以所述的纯化方法将阴离子交换层析、Sulfated cellulofine层析、以及蔗糖密度梯度离心组合进行的。
20.丙型肝炎病毒感染细胞，其是经权利要求7所述的丙型肝炎病毒颗粒感染得到的。
21.一种丙型肝炎病毒感染细胞的制备方法，其中，培养权利要求6所述的细胞，从培养液中回收病毒颗粒。
22.一种丙型肝炎病毒感染细胞的制备方法，其中，培养权利要求6所述的细胞，使培养液中的病毒颗粒感染其他细胞。
23.于体外在细胞内复制和/或表达的外源基因的方法，其特征在于：
将编码外源基因的RNA插入权利要求1或2所述的经修饰的丙型肝炎病毒基因组RNA中，再将其导入目的细胞中，使所述的外源基因进行复制或者表达。
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