CN101321865B

CN101321865B - 感染性丙型肝炎病毒颗粒高效生产体系

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Publication number: CN101321865B
Application number: CN2006800449391A
Authority: CN
Inventors: 田边纯一; 曾根三郎; 胁田隆字; 石井孝司; 铃木亮介; 铃木哲朗; 宫村达男
Original assignee: Tokyo Metropolitan Organization Medical Research Institute; National Institute of Infectious Diseases; Toray Industries Inc
Current assignee: Tokyo Metropolitan Institute of Medical Science
Priority date: 2005-09-30
Filing date: 2006-09-29
Publication date: 2011-12-14
Anticipated expiration: 2026-09-29
Also published as: US20100035345A1; AU2006295800B2; DE602006014586D1; JP5030065B2; EP1956087A1; EP1956087B1; AU2006295800A1; US8143022B2; CN101321865A; ES2341800T3; WO2007037428A1; JPWO2007037428A1; KR101355903B1; KR20080068817A; EP1956087A4; CA2624242A1

Abstract

本发明涉及生产感染性丙型肝炎病毒(HCV)颗粒的方法，该方法包含将含有以下DNA片段的表达载体导入到可接受HCV增殖的细胞中的步骤，其中所述DNA片段在RNA聚合酶I启动子的下游含有编码HCV的5’非翻译区和结构蛋白以及任意非结构蛋白的DNA序列、以及编码来自HCV JFH1株的非结构蛋白和3’非翻译区的DNA序列，并且在其下游含有RNA聚合酶I终止子。

Description

感染性丙型肝炎病毒颗粒高效生产体系

技术领域

本发明涉及感染性人丙型肝炎病毒颗粒的高效生产方法。

背景技术

人丙型肝炎病毒(HCV)是通过持续性地感染引发慢性肝炎的单链RNA病毒。目前，在世界范围得到承认的慢性肝炎的主要原因是HCV持续感染。实际上，持续感染者的50％左右均患慢性肝炎，其中约20％的患者经过10年～20年转化为肝硬化，并且其中一部分进展为肝癌这样的致死病态。

妨碍上述重大疾病治疗方法的开发研究的主要原因在于：没有在HCV增殖方面高效的细胞培养体系；没有适当的HCV感染的小动物模型；低水平的病毒复制；以及病毒基因组的遗传异质性。

因此，期待细胞培养系中的HCV基因组的复制系统的开发，以了解病毒的复制、病毒与细胞的相互作用，提供由HCV引发的疾病治疗药的评价体系。

最近，作为来自HCV的具有自主复制能力的RNA，制作了HCV亚基因组RNA复制子(专利文献1、专利文献2和非专利文献1-3)，使用培养细胞分析HCV的复制机理成为可能。这些HCV亚基因组RNA复制子是将存在于HCV基因组RNA的5’非翻译区中的HCV IRES的下游的结构蛋白用新霉素抗性基因和与其下游连接的EMCV-IRES置换所得。将该RNA复制子导入到人肝癌细胞Huh7中，在新霉素的存在下进行培养，则可证明在Huh7细胞内RNA复制子自主复制。但是，该实验体系是只能对HCV病毒增殖复制过程中的病毒RNA复制进行评价的实验体系，不产生病毒颗粒，因此无法对HCV颗粒在感染细胞内的形成和向细胞外的释放、还有对新的细胞的感染的过程进行评价。

针对该课题，有人报道了通过培养细胞系生产病毒颗粒的方法。这是不使用RNA复制子而利用HCV全基因组RNA的cDNA的系统。

Lim等人尝试将在四环素应答启动子的下游连接基因型1b的HCV-S1株基因组RNA的cDNA得到的表达载体导入Huh7细胞中，将所得细胞株用四环素进行处理，尝试生产HCV颗粒。他们确认了在该培养上清中有1～6×10⁵拷贝/mL的HCV颗粒存在，但记载该HCV颗粒的感染性低(非专利文献4)。

但是，使HCV cDNA在CMV等RNA聚合酶II型启动子控制下表达，则在被转录的RNA的5’末端附加有帽结构，3’末端附加有PolyA链，因此在核糖体被利用作蛋白质合成的模板，所转录的RNA不会发生复制。

为解决该问题，Heller等人制备了下述构成：在HCV基因组的5’末端和3’末端连接核酶序列，在细胞内用RNA聚合酶II进行转录，然后用核酶切断，由此可在细胞内合成未附加帽和PolyA的HCV RNA(非专利文献5)。通过核酶使5’末端不附加帽的方法可用于在细胞内合成发夹型RNA的方法(非专利文献6)。实际上，将具有由两个核酶夹持的HCV构成的表达载体在Huh7中表达，显示由此生成1×10⁷拷贝/mL的HCV颗粒。但对于该颗粒是否具有感染性则未进行研究。

并且最近的研究显示：可由HCV全基因组RNA在细胞培养体系生产具有感染能力的HCV颗粒(专利文献3、非专利文献7、非专利文献8)。该系统的HCV颗粒的生产量约为1×10⁷拷贝/mL。另外，对于将HCV的基因型1b的con1株非结构蛋白区置换为基因型2a的病毒株的基因所得的嵌合病毒RNA，显示可通过细胞培养体系生产具有感染能力的HCV颗粒(非专利文献9)。并未公开该体系的HCV颗粒生产量的具体数值。

由以上结果可知，可以建立对HCV颗粒在感染细胞内的形成、向细胞外的释放、以及进一步感染新的细胞的过程进行评价的实验体系。

但是，Lim等人的体系产率低、Heller等人的体系的感染性不明确，在使用HCV全基因组RNA的体系中，可能在RNA复制时发生变异。已知如果HCV基因组发生变异，则可能不再发生复制。实际上已显示：如果HCV非结构蛋白NS5B蛋白质中的GDD氨基酸序列变异为GND，则不再发生复制。另一方面，关于HCV颗粒的生产量，两者均为约1×10⁷拷贝/mL，人们期待能够更进一步提高生产量。

作为提高HCV病毒颗粒生产量的方法，研究了制做复制子生产量高的细胞。HCV病毒的复制中使用来自人肝脏的Huh7细胞，由该株派生的细胞有几种克隆。其中，命名为Huh7.5的细胞显示可复制亲株约3倍的HCV RNA复制子(非专利文献10)。

鉴于以上状况，可以想象使用HCV全基因组RNA的cDNA开发感染性HCV颗粒的高效生产体系是很重要的。

使用与RNA病毒的基因组RNA对应的cDNA生产病毒颗粒的体系已知有：使用在流感病毒(负链的RNA病毒)动物细胞系内生产中所使用的RNA聚合酶I启动子和终止子的体系(非专利文献11)。但是，上述的使用RNA聚合酶I启动子和终止子的流感病毒颗粒的生产体系很难说在生产量方面比以往的流感病毒颗粒生产体系更优异。另外，非专利文献11中对于作为正链RNA病毒的HCV生产体系没有任何记载。

专利文献1：日本特开2001-17187号公报

专利文献2：WO2004/104198A1

专利文献3：WO05080575A1

非专利文献1：Blight等人.，Science，290(2000)1972-1974页

非专利文献2：FrieBe等人.，J.Virol.，75(2001)12047-12057页

非专利文献3：Kato，T.等人.，Gastroenterology，125(2003)1808-1817页

非专利文献4：Lim SP.等人.，Virology.，303(2002)79-99页

非专利文献5：Heller，T.等人.Proc.Natl.Acad.Sci.USA.，102(2005)2579-83页

非专利文献6：Sinagawa，T.和Ishii，S.，Gene Dev.，17(2003)1340-45页

非专利文献7：Wakita等人，Nature Med.11(2005)791-96页

非专利文献8：Lindenbach BD.等人.，Science.309(2005)623-26页

非专利文献9：Pietschmann T.等人.，11^th International Symposium onHepatitis C Virus and Related Viruses，(2004)

非专利文献10：Blight，KJ.等人.，J.Virol.，76(2002)13001-14页

非专利文献11：Neumann，G.等人.，Virology，202(1994)477-479页

发明内容

本发明的目的在于提供在培养细胞系中由重组DNA高效生产感染性丙型肝炎病毒颗粒的方法。

本发明人为了构建在细胞内由HCV基因组cDNA合成具有复制能力的HCV基因组RNA的方法，对基因型不同的HCV基因组、用于使其表达的启动子/终止子进行了研究，发现了复制HCV基因组RNA的新型的组合。接着，培养了合成该HCV基因组RNA的细胞，确认可比以往报道的产率高地生产感染性HCV颗粒，从而完成了本发明。

即，本发明涉及以下的(a)～(c)。

(a)生产感染性HCV颗粒的方法，该方法是生产感染性丙型肝炎病毒(HCV)颗粒的方法，该方法包含以下步骤：将含有下述DNA的表达载体导入可接受HCV增殖的细胞中的步骤，其中，所述DNA是在来自核糖体RNA基因的RNA聚合酶I识别的启动子下游含有来自JFH1株的HCV基因组cDNA，且在其下游进一步含有来自核糖体RNA基因的RNA聚合酶I识别的终止子的DNA。

(b)(a)的生产感染性HCV颗粒的方法，其中，可接受HCV增殖的细胞选自Huh7、RCYM1RC、5-15RC、HepG2以及由这些细胞所派生的细胞株(株化細胞)。

(c)表达载体，该表达载体用于生产感染性丙型肝炎病毒(HCV)颗粒，该表达载体含有下述DNA：在来自核糖体RNA基因的RNA聚合酶I识别的启动子的下游含有来自JFH1株的HCV基因组cDNA，且在其下游进一步含有来自核糖体RNA基因的RNA聚合酶I识别的终止子的DNA。

本发明还涉及生产感染性丙型肝炎病毒(HCV)颗粒的方法，该方法包含以下步骤：将含有下述DNA的表达载体导入可接受HCV增殖的细胞的步骤，其中所述DNA是在RNA聚合酶I启动子的下游含有编码HCV的5’非翻译区和结构蛋白以及任意的非结构蛋白的DNA序列，和编码来自HCV JFH1株的非结构蛋白和3’非翻译区的DNA序列，并且在其下游进一步含有RNA聚合酶I终止子。

更具体地说，本发明涉及以下(1)～(4)的方法。

(1)生产感染性丙型肝炎病毒(HCV)颗粒的方法，该方法包含将以下的i)或ii)的表达载体导入由Huh7、RCYM1RC、5-15RC、HepG2以及由这些细胞派生的细胞株中选择的细胞中的步骤：

i)含有下述DNA的表达载体，该DNA在RNA聚合酶I启动子的下游含有编码来自HCV株的5’非翻译区、核心蛋白、E1蛋白、E2蛋白、p7蛋白、NS2蛋白的DNA序列，和编码来自HCV JFH1株的NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B蛋白以及3’非翻译区的DNA序列，并且在其下游进一步含有RNA聚合酶I终止子；或者

ii)含有下述DNA的表达载体，该DNA在RNA聚合酶I启动子的下游含有编码来自HCV株的5’非翻译区、核心蛋白、E1蛋白、E2蛋白、p7蛋白的DNA序列，和编码来自HCV JFH1株的NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B蛋白以及3’非翻译区的DNA序列，并且在其下游进一步含有RNA聚合酶I终止子。

(2)上述(1)的方法，其中，上述HCV株是基因型1或基因型2的HCV株。

(3)上述(2)的方法，其中，基因型1的HCV株选自H77c株、1株、H株、HC-J1株、J1株、con1株、TH株、J株、JT株、BK株。

(4)上述(2)的方法，其中，基因型2的HCV株选自J6CF株、JFH1株、JCH1株、HC-J8株。

根据本发明，在培养细胞系中由重组DNA生产感染性丙型肝炎病毒颗粒的方法中，与以往的方法相对，可以以约60倍的高密度高产率生产具有感染性的HCV颗粒。

附图说明

图1A表示使用RNA聚合酶I启动子/终止子系的HCV表达载体的构建图。

图1B表示pHH H77c、pHH JFH1、pHH JFH1/GND的图谱。

图1C表示pHH H77c(C-p7)/JFH1、pHH J6(C-p7)/JFH1、pHHJ1(C-p7)/JFH1和pHH J1(C-NS2)/JFH1的图谱。

图2是在导入了RNA聚合酶I启动子/终止子系的HCV表达载体的细胞中，确认HCV RNA被转录的实验结果的照片。泳道1、3是将pHHJFH1分别导入到Huh7和HepG2中时的结果，泳道2、4是将pHHJFH1/GND分别导入到Huh7和HepG2中的结果。

图3表示通过聚合酶I启动子/终止子系的表达载体转录的HCVRNA的5’末端的序列。在导入了PHH JFH1和pHH JFH1/GND的细胞中转录的HCV RNA的5’末端与JFH1基因组RNA的序列相同。

图4是在导入了RNA聚合酶I启动子/终止子系的HCV表达载体的细胞中，对于HCV蛋白质是否被翻译进行确认的实验结果照片。在导入了pHH JFH1的细胞中，显示核心蛋白和NS5A蛋白被翻译。在导入了pHH H77c和pHH JFH1/GND的细胞中，HCV蛋白质未被翻译。

图5是将pHH JFH1和pHH JFH1/GND与GFP表达载体一起导入到Huh7、RCYM1RC、5-15RC、HepG2和293T细胞中后，通过GFP的表达显示这些细胞中HCV蛋白的表达和载体的导入效率的照片。pHHJFH1在293T以外的细胞中表达核心蛋白。pHH JFH1/GND在任何细胞中都未表达核心蛋白。

图6A是表示导入了pHH JFH1的HepG2细胞中的核心蛋白的照片。图6B表示通过蔗糖密度离心将导入了pHH JFH1的HepG2细胞培养液进行分级得到的试样的核心蛋白质量。发现了pHH JFH1培养上清(▲)的核心蛋白的比重为1.15g/mL的级分，显示核心蛋白以病毒颗粒的形式分泌。另一方面，表达核心、E1、E2、p7的细胞的培养上清(×)成为宽峰。

图7是表示在将导入了pHH JFH1的HepG2细胞培养液进行NP40处理时，与未处理进行比较，核心蛋白的峰发生变动。与NP40未处理(◆)进行比较，如果用NP40进行处理(■)，则核心蛋白的峰位移至比重1.20g/mL。显示比重轻的表面膜通过NP40从病毒颗粒上剥离。

图8是表示将导入了用超滤膜浓缩的pHH JFH1的HepG2细胞培养液(A)或Huh7细胞培养液(B)接种于Huh7.5.1中，4天后用抗NS5A抗体进行染色的结果照片。表示检测出抗NS5A抗体阳性细胞(感染细胞)。

图9是表示在pHH JFH1中插入了在SV40启动子控制下表达Zeocin抗性基因的盒的载体的图谱。

图10A中，图10是表示插入片段J6(C-p7)JFH1的DNA序列的图，图10A是其最靠近5’末端一侧的序列。

图10B中，图10是表示插入片段J6(C-p7)JFH1的DNA序列的图，图10B表示与图10A的序列的3’一侧连接的序列。

图10C中，图10是表示插入片段J6(C-p7)JFH1的DNA序列的图，图10C表示与图10B的序列的3’一侧连接的序列。

图10D中，图10是表示插入片段J6(C-p7)JFH1的DNA序列的图，图10D表示与图10C的序列的3’一侧连接的最靠近3’末端的序列。

图11A中，图11是表示插入片段H77c(C-p7)JFH1的DNA序列的图，图11A是其最靠近5’末端一侧的序列。

图11B中，图11是表示插入片段H77c(C-p7)JFH1的DNA序列的图，图11B表示与图11A的序列的3’一侧连接的序列。

图11C中，图10是表示插入片段H77c(C-p7)JFH1的DNA序列的图，图11C表示与图11B的序列的3’一侧连接的序列。

图11D中，图11是表示插入片段H77c(C-p7)JFH1的DNA序列的图，图11D表示与图11C的序列的3’一侧连接的最靠近3’末端的序列。

图12A中，图12是表示插入片段J1(C-p7)JFH1的DNA序列的图，图12A是其最靠近5’末端一侧的序列。

图12B中，图12是表示插入片段J1(C-p7)JFH1的DNA序列的图，图12B表示与图12A的序列的3’一侧连接的序列。

图12C中，图12是表示插入片段J1(C-p7)JFH1的DNA序列的图，图12C表示与图12B的序列的3’一侧连接的序列。

图12D中，图12是表示插入片段J1(C-p7)JFH1的DNA序列的图，图12D表示与图12C的序列的3’一侧连接的最靠近3’末端的序列。

图13A中，图13是表示插入片段J1(C-NS2)JFH1的DNA序列的图，图13A是其最靠近5’末端一侧的序列。

图13B中，图13是表示插入片段J1(C-NS2)JFH1的DNA序列的图，图13B表示与图13A的序列的3’一侧连接的序列。

图13C中，图13是表示插入片段J1(C-NS2)JFH1的DNA序列的图，图13C表示与图13B的序列的3’一侧连接的序列。

图13D中，图13是表示插入片段J1(C-NS2)JFH1的DNA序列的图，图13D表示与图13C的序列的3’一侧连接的最靠近3’末端的序列。

具体实施方式

1.使用RNA聚合酶I启动子/终止子体系的HCV表达载体的构建

已知转录RNA的RNA聚合酶有三种。RNA聚合酶I由核糖体RNA基因转录rRNA，RNA聚合酶II由编码蛋白质的基因转录mRNA，RNA聚合酶III由tRNA基因转录tRNA。

由RNA聚合酶I和III转录的基因组RNA分别具有各自的终止子，通过该终止子序列终止转录。而在利用RNA聚合酶II的转录中无需终止子序列。该转录终止的方式尚未明确，但可以认为对于mRNA的3’末端的形成，重要的并不是转录终止本身，而是初次转录产物的切断反应。

与RNA聚合酶I和III启动子下游连接的基因的转录产物中，与在RNA聚合酶II启动子下游的基因转录产物不同，其5’和3’末端并未分别附加帽、polyA。天然的HCV基因组RNA的5’和3’末端未附加帽和polyA。由此显示，通过RNA聚合酶I或III启动子使HCV基因组DNA表达，可以转录与HCV病毒基因组RNA同样的RNA。

可利用的启动子只要是在被转录的RNA的5’和3’末端未分别附加帽、polyA即可，优选RNA聚合酶I启动子，进一步优选来自rRNA基因的启动子。另外，启动子的来源只要是来自动物即可，但优选来自小鼠、人。特别优选的RNA聚合酶I启动子是人核糖体RNA(rRNA)基因的启动子。

并且，终止子序列可以是RNA聚合酶I终止子，优选来自rRNA基因的终止子。终止子的来源只要是来自动物即可，但优选来自小鼠、人。特别优选的RNA聚合酶I终止子是小鼠核糖体RNA(rRNA)基因的终止子。

RNA聚合酶I启动子/终止子体系用于流感病毒颗粒的再构成(Neumann，G.等人.，Virology，202(1994)477-479页、Neumann，G.和Kawaoka，Y.，Virology，287(2001)243-250页、日本特表2003-520573)。本发明的方法中，可以使用作为RNA聚合酶I启动子/终止子体系载体的pHH21(Neumann，G.等人.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，96(1999)9345-9350页)。pHH21是含有人RNA聚合酶I启动子作为启动子、含有小鼠RNA聚合酶I终止子作为终止子的表达载体。

使用PCR在HCV基因组cDNA的5’端和3’端分别附加限制酶BsmBI识别序列，然后用BsmBI消化，将HCV基因组插入到pHH21的BsmBI位点，则在启动子/终止子与HCV基因组cDNA之间不含有多余的碱基序列地将它们连接。

通过将上述启动子、HCV基因组cDNA和终止子适当连接，可以新构建本发明的方法中使用的表达载体。

使用HCV株的碱基序列的系统分析法中，HCV被分为基因型1a、基因型1b、基因型2a、基因型2b、基因型3a、基因型3b共六个类型，并且各类型均分成几个亚型。关于HCV的多种基因型，其基因组全长碱基序列已得到确定(Simmonds，P.等人.，Hepatology，10(1994)1321-1324页、和Choo，Q.L等人.，Science，244(1989)359-362页、Okamoto，H等人.，J.Gen.Virol.，73(1992)673-679页、Mori，S.等人Biochem.Biophis.Res.Commun.183(1992)334-342页)。

本发明中，作为HCV株，具体可使用基因型1(包含基因型1a和1b)的H77c(H77株的共有序列：GenBank登录号AF011751)、1株(GenBank登录号M62321)、H株(GenBank登录号M67463)、HC-J1株(GenBank登录号D10749)、J1株(GenBank登录号D89815)、con1株(GenBank登录号AJ238799)、TH株(Wakita，T.等人.，J.Biol.Chem.，(1994)269，14205-14210页)、J株(GenBank登录号D90208)、JT株(GenBank登录号D01171)、BK株(GenBank登录号M58335)等，基因型2(包含基因型2a和2b)的J6CF株(GenBank登录号AF177036)、JFH1株(GenBank登录号AB047639，也称为JFH-1株)、JCH1株(GenBank登录号AB047640)、HC-J8株(GenBank登录号D01221)等。关于其它的株也已在GenBank登录号的清单中有报告(Tokita，T.等人.，J.Gen.Virol.(1998)79，1847-1857页、Cristina J.&Colina R.Virolgy Journal，(2006)3，1-8页)，可以获得。

插入到RNA聚合酶I启动子/终止子系载体中的、来自HCV基因组RNA的cDNA可以利用上述基因型的任何类型，并且可以利用含有它们的嵌合型的基因型。优选来自在导入到Huh7等可接受HCV的细胞中时发生HCV基因组RNA的自主复制的基因型的(Wakita，T.等人.，Nat.Med.，11，(2005)，791-796页、Lindenbach BD.，等人.，Science，309(2005)623-626页)，进一步优选与基因型2a的JFH1株(日本特开2002-171978号公报)的基因组RNA对应的基因组cDNA序列(GenBank登录号AB047639，Kato，T等人.，Gastroenterology，125(2003)1808-1817页，SEQID NO.27)。

丙型肝炎病毒(HCV)的基因组是含有约9600个核苷酸的(+)链单链RNA。该基因组RNA含有5’非翻译区(也表示为5’NTR或5’UTR)、由结构区和非结构区构成的翻译区以及3’非翻译区(也表示为3’NTR或3’UTR)。在该结构区中编码HCV的结构蛋白，在非结构区中编码多种非结构蛋白。

上述HCV的结构蛋白(核心、E1、E2和p7)和非结构蛋白(NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A、NS5B)是在被从翻译区翻译成一系列多蛋白后，通过蛋白酶进行限定分解(限定分解)，使其游离并生成。这些结构蛋白和非结构蛋白(即HCV的病毒蛋白)中，Core是核心蛋白，E1和E2是包膜蛋白。已知非结构蛋白是与病毒自身复制有关的蛋白质，NS2具有金属蛋白酶活性，NS3具有丝氨酸蛋白酶活性(N末端一侧的3分之1)和解旋酶活性(C末端一侧的3分之2)。并且，NS4A是NS3的蛋白酶活性的辅因子，NS5B具有依赖于RNA的RNA聚合酶活性。

本发明的生产HCV颗粒的方法中使用的表达载体具有下述DNA，所述DNA含有在RNA聚合酶I所识别的启动子(RNA聚合酶I启动子)的下游依次排列HCV基因组cDNA的5’非翻译区、核心蛋白编码序列、E1、E2蛋白编码序列、p7蛋白编码序列、NS2、NS3、NS4(包含NS4A和NS4B)、NS5A和NS5B蛋白编码序列以及3’非翻译区的序列，并且在其下游可以含有RNA聚合酶I所识别的终止子(RNA聚合酶I终止子)。这些序列被翻译成一系列的多蛋白后，通过蛋白酶进行限定分解，使其游离并生成，生产HCV颗粒。

生产本发明的HCV颗粒的方法中，使用含有下述DNA片段的表达载体，该DNA片段是在RNA聚合酶I启动子的下游连接由来自任意的HCV株的HCV基因组RNA合成的cDNA，再在其下游连接RNA聚合酶I终止子所得。与RNA聚合酶I启动子的下游和RNA聚合酶I终止子的上游连接的上述HCV cDNA可以是与来自一种HCV株(优选为JFH1株)的基因组RNA对应的基因组cDNA，也可以是由来自两种以上HCV株(优选至少其中一种为JFH1株)的基因组RNA合成的cDNA所衍生的嵌合核酸。在RNA聚合酶I启动子和RNA聚合酶I终止子之间连接的上述HCV cDNA优选为将编码HCV的5’非翻译区、结构蛋白(核心、E1、E2和p7)、非结构蛋白(NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B)以及3’非翻译区的DNA序列按此顺序含有各一个的HCV全基因组样cDNA序列。

特别是，含有下述DNA片段的嵌合HCV表达载体的感梁性HCV生产能力高，因而非常优选，其中所述DNA片段在RNA聚合酶I启动子的下游依次含有分别编码来自HCV株(优选基因型1或2的HCV株)的5’非翻译区和结构蛋白的DNA序列，以及根据需要编码来自HCV株的非结构蛋白的DNA序列，接着是分别编码来自HCV JFH1株的非结构蛋白和3’非翻译区的DNA序列，并且在其下游进一步含有RNA聚合酶I终止子。

本发明的更优选的表达载体是含有下述DNA的表达载体，其中所述DNA是在RNA聚合酶I启动子的下游含有HCV基因组cDNA序列，在其下游进一步含有RNA聚合酶I终止子，其中所述HCV基因组cDNA包含来自任意的HCV株的HCV基因组cDNA(即，编码HCV基因组RNA全长的DNA)的5’非翻译区编码序列、核心蛋白编码序列、E1、E2蛋白编码序列、p7蛋白编码序列、NS2蛋白编码序列，以及来自JFH1株的HCV基因组cDNA的NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B蛋白编码序列以及3’非翻译区编码序列。另外，其它优选的表达载体含有以下DNA：在RNA聚合酶I启动子的下游含有HCV基因组cDNA序列，在其下游进一步含有RNA聚合酶I终止子的DNA，其中所述HCV基因组cDNA序列包含来自任意的HCV株的HCV基因组cDNA的5’非翻译区、核心蛋白编码序列、E1、E2蛋白编码序列、p7蛋白编码序列，以及来自JFH1株的HCV基因组cDNA的NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A、NS5B蛋白编码序列以及3’非翻译区编码序列。

上述表达载体中，任意的HCV株优选为基因型1或2的HCV株。上述表达载体中的5’非翻译区编码序列优选为来自JFH1株的序列或来自选自基因型1和基因型2的HCV株中的两种以上HCV株的嵌合序列，为嵌合序列时，进一步优选含有来自JFH1株的序列。作为基因型1的HCV株，例如可使用H77c株、1株、H株、HC-J1株、J1株、con1株、TH株、J株、JT株、BK株等。作为基因型2的HCV株，例如可使用J6CF株、JFH1株、JCH1株、HC-J8株等。更优选的HCV株有JFH1株、J6CF株、J1株、H77c株。

作为一个例子，在来自JFH1株的全长基因组cDNA中，可整合到本发明的表达载体中的、编码由5’非翻译区至NS2蛋白的区域在SEQ IDNO.27(GenBank登录号AB047639的DNA序列)所示的碱基序列中为碱基编号1-3430，编码由NS3蛋白至3’非翻译区的区域是碱基编号3431-9678。同样，在来自JFH1株的全长基因组cDNA中，编码由5’非翻译区至p7蛋白质的区域为SEQ ID NO.27所示的碱基序列中的碱基编号1-2779，编码由NS2蛋白至3’非翻译区的区域是碱基编号2780-9678。对于其它的来自HCV株的基因组cDNA上的各区的位置，也可以以该JFH1株的基因组cDNA序列为基准确定。

本发明的特别优选的表达载体的例子是含有后述实施例所示的DNA片段J6(C-p7)JFH1(SEQ ID NO.29)、H77c(C-p7)JFH1(SEQ IDNO.30)、J1(C-p7)JFH1(SEQ ID NO.31)、J1(C-NS2)JFH1(SEQ ID NO.32)中的任意序列的表达载体。优选这些DNA片段在载体中的表达启动子的控制下插入。

如果HCV非结构蛋白NS5B中的GDD氨基酸序列突变为GND，则无法发生自主复制(Kato，T.等人.，Gastroenterology，125(2003)1808-1817页)，因此作为实验的对照，可以使用氨基酸序列突变为GND的NS5B蛋白。

2.细胞内HCV RNA的合成的确认

可将上述制备的本发明的表达载体导入细胞内，转录HCV RNA。DNA向细胞的导入可使用电穿孔法、脂转染法、磷酸钙法等常规方法进行。

由表达载体DNA转录的HCV RNA的分析可通过通常的分子生物学方法(Molecular Cloning 3^rd Edition Sambrook & Russell Cold SpringHarbor Laboratory Press 2001)分析。具体来说，可使用RNA印迹法、核糖核酸酶保护测定法、RT-PCR法和RACE法等，对所转录的RNA的量或序列进行分析。对RNA进行定量时，可以采用RNA印迹法、RT-PCR法，对RNA的序列进行分析时可以采用RACE法。

对在细胞内转录的HCV RNA的5’末端的序列进行分析时，可使用RNA连接酶将特定序列的合成RNA接头与HCV RNA连接，以此为模板，使用与HCV RNA互补的合成DNA引物，通过反转录酶合成cDNA。接着，由接头内的序列和之前使用的引物5’侧的引物进行PCR，扩增与HCV RNA互补的片段，克隆到质粒载体中，然后确定碱基序列，由此可以对在细胞内转录的HCV RNA的序列进行分析。最初的PCR未扩增DNA片段时，通过嵌套式PCR法进行也可以进行分析。

3.细胞内HCV蛋白表达的确认

在感染了HCV、并有HCV基因组RNA复制的细胞中，上述HCV蛋白表达。因此，如果从由HCV基因组RNA复制细胞中提取的蛋白质中检测出HCV蛋白质，则可以判断该细胞正在复制HCV基因组RNA。HCV蛋白质的检测可按照公知的任意蛋白质检测方法进行，例如，可将由导入的HCV基因组RNA表达的HCV蛋白质的抗体与由细胞提取的蛋白反应来进行。更具体地说，例如将由细胞提取的蛋白质试样转印在硝基纤维素膜上，使抗HCV蛋白抗体(例如抗NS3特异性抗体、或由丙型肝炎患者采集的抗血清)与其反应，再检测该抗HCV蛋白抗体来进行。

表达HCV蛋白质的宿主细胞只要是可继代培养的细胞即可，没有特别限定，优选为真核细胞，更优选为人细胞，进一步优选来自人肝脏的细胞、来自人子宫颈的细胞、或来自人胎儿肾的细胞。细胞优选含有癌细胞株、干细胞株等的增殖性细胞，更优选Huh7细胞(ATCCCCL-185)、HepG2细胞(ATCC HB 8065)、IMY-N9细胞(Date，T.等人.，J.Biol.Chem.，(2004)279，22371-22376页)、HeLa细胞(ECACC93021013)、RCYM1RC细胞(Murakami，K.，等人.，Virology，351，381-392，2006)、5-15RC细胞(Pietschmann T.，等.，J Virol.(2001)75，1252-1264页)以及由这些细胞所派生的细胞株等。特别优选的细胞有：Huh7细胞、RCYM1RC细胞、5-15RC细胞、HepG2细胞以及由这些细胞派生的细胞株。这些细胞可以利用市售的商品，也可以由细胞保藏机构获得并使用，可以使用由任意的细胞(例如癌细胞或干细胞)株化的细胞。由Huh7细胞派生的细胞株有：Huh7.5细胞(Blight，KJ.等人.，Virol.，(2002)76，13001-13014页)和Huh7.5.1细胞(Zhong，J.等人.，Proc.Natl.Acad.SciUSA，(2005)102，9294-9299页)。前者是在Huh7细胞中基因导入复制子，然后建立复制子复制细胞、将其用干扰素处理、排除复制子、由此得到的HCV复制能力高的细胞，后者是通过干扰素γ处理，从用Huh7.5细胞制备的复制子复制细胞中排除复制子而得到的复制效率好的细胞。

4.HCV颗粒产生的确认

将本发明的表达载体导入HCV可接受性细胞(可接受HCV增殖的细胞)，培养该细胞，由此可产生具有由本发明的表达载体转录的HCV基因组RNA的丙型肝炎病毒(HCV)颗粒。HCV可接受性细胞优选使用Huh7细胞、RCYM1RC细胞、5-15RC细胞、HepG2细胞以及由这些细胞所派生的细胞株等。上述生成的丙型肝炎病毒(HCV)颗粒保持对其它细胞的感染性。本发明涉及上述感染性丙型肝炎病毒颗粒的生产方法。

细胞的病毒颗粒生产能力可使用公知的任意的病毒检测法确认。例如，将被认为正在产生病毒颗粒的细胞的培养液通过蔗糖密度梯度进行分级，测定各级分的密度、HCV核心蛋白浓度以及HCV基因组RNA的量，如果HCV核心蛋白与HCV基因组RNA的峰一致，并且检测出该峰的级分的密度比将培养上清用0.25％NP40(聚氧乙烯(9)辛基苯基醚，Polyoxyethylene(9)Octylphenyl Ether)处理之后分级时的相同级分的密度轻，则可以判定该细胞具有病毒颗粒产生能力。有报道称，游离的HCV颗粒的比重是1.14-1.16g/mL(Kaito，M.等人.，J.Gen.Virol.75(1994)1755-1760页)，也可以与该值进行比较。

释放到培养液中的HCV病毒颗粒例如可使用核心蛋白、E1蛋白或E2蛋白的抗体检测。培养液中的HCV病毒颗粒所含有的HCV基因组RNA可以通过使用特异性引物的RT-PCR法扩增并检测，由此可以间接检测HCV病毒颗粒的存在。

5.本发明的HCV颗粒对其它细胞的感染

通过本发明的方法生产的HCV病毒颗粒对细胞(优选HCV可接受性(感受性)细胞)具有感染能力。本发明提供丙型肝炎病毒感染细胞的制备方法，该方法包含将导入了使用RNA聚合酶I启动子/终止子体系的HCV表达载体的细胞进行培养，将所得培养物(优选培养液)中的病毒颗粒感染其它细胞(优选HCV感受性细胞)。这里，HCV可接受性细胞是指具有HCV基因组RNA的复制能力和/或被HCV感染的能力的细胞。HCV可接受性细胞优选为肝脏细胞或淋巴细胞系细胞，但并不限于此。具体来说，作为肝脏细胞，可列举原代肝脏细胞、Huh7细胞、HepG2细胞、IMY-N9细胞、HeLa细胞、293细胞等，作为淋巴细胞系细胞，可列举Molt4细胞、HPB-Ma细胞、Daudi细胞等，但并不限于这些。作为特别优选的HCV可接受性细胞，可列举Huh7细胞、RCYM1RC细胞、5-15RC细胞、HepG2细胞以及由这些细胞所派生的(制备的)细胞株。作为由Huh7细胞派生的细胞中优选的细胞，可列举Huh7.5细胞和Huh7.5.1细胞。

将使用本发明的RNA聚合酶I启动子/终止子体系的HCV表达载体导入到细胞中，用该细胞中产生的HCV颗粒感染细胞(例如HCV可接受性细胞)，则在该感染细胞中，HCV基因组RNA被复制，进而形成病毒颗粒。

将使用本发明的RNA聚合酶I启动子/终止子体系的HCV表达载体导入到细胞中，将该细胞中产生的HCV病毒颗粒感染黑猩猩等可感染HCV病毒的动物，可引发HCV引起的肝炎。

将使用本发明的RNA聚合酶I启动子/终止子体系的HCV表达载体导入到细胞中，该细胞中产生的HCV颗粒是否具有感染性，可以如下判断：将导入了本发明的使用RNA聚合酶I启动子/终止子系的HCV表达载体的细胞进行培养，将所得的上清对HCV可接受性细胞(例如Huh7)进行处理，例如在48小时后用细胞抗核心抗体进行免疫染色，对感染细胞数进行计数，或者通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶对细胞提取物进行电泳，通过蛋白质印迹法检测核心蛋白。

6.感染性HCV颗粒产生细胞株的获得

稳定地导入了本发明的使用RNA聚合酶I启动子/终止子系的HCV表达载体的细胞可持续地生产感染性HCV颗粒。为了获得稳定地表达本发明的使用RNA聚合酶I启动子/终止子系的HCV表达载体的细胞株，优选将抗药性基因整合到该载体中。作为抗药性基因，可列举G418抗性基因、潮霉素抗性基因、嘌呤霉素抗性基因、Zeocin抗性基因、杀稻瘟素抗性基因等。以抗药性为指标筛选的克隆的HCV颗粒生产能力可通过采用RNA印迹、定量RT-PCR检测这些克隆的培养上清中的核心蛋白质量或由克隆复制的HCV RNA的量来推定。

本说明书包含作为本申请的优先权主张基础的日本特许出愿2005-287646号说明书和/或附图所记载的内容。

本说明书中所引用的所有刊物、专利和专利申请全体均作为参照引用到本说明书中。

实施例

以下给出实施例更具体地说明本发明。但这些实施例只是用于说明，并不限制本发明的技术范围。

[实施例1]

使用RNA聚合酶I启动子/终止子系的HCV表达载体的构建

作为HCV基因组RNA的cDNA，使用来自基因型2a的JFH1株的基因组RNA的cDNA(GenBank登录号AB047639、Kato，T.等人，Gastroenterology，125(2003)1808-1817页)、来自发生了DNA序列变换的JFH1株的基因组RNA的cDNA，其中JFH1株的NS5B中的GDD氨基酸序列变异为GND(Wakita等人，Nat Med.，11(2005)791-796页)、来自J6CF株的基因组RNA的cDNA(GenBank登录号AF177036、Yanagi，M.等人.，Virology，262(1999)250-263页)、来自基因型1a的H77c株的基因组RNA的cDNA(GenBank登录号AF011751、Yanagi，M.等人.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，94(1997)8738-8743页)、以及来自基因型1b的J1株的基因组RNA的cDNA(GenBank登录号D89815、Aizaki，H.等人.Hepatology，27(1998)621-627页)。

使用PCR，分别在上述HCV基因组cDNA(JFH1、JFH1/GND和H77c)的5’端和3’端附加限制酶BsmBI识别序列。利用BsmBI的切断位点与该酶的识别位点有一定距离的性质，在启动子/终止子与HCV基因组之间没有多余碱基序列地将HCV基因组插入到具有人RNA聚合酶I启动子和小鼠RNA聚合酶I终止子序列的pHH21载体(Neumann，G.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，96(1999)9345-9350页)的BsmBI位点(图1A)。另外，各克隆的图谱如图1B所示。所得的含有HCV基因组cDNA的载体分别称为pHH JFH1、pHH JFH1/GND和pHH H77c。

并且，分别来自J6CF和JFH1、H77c和JFH1、J1和JFH1的基因组cDNA的嵌合HCV表达载体的制备按以下方法进行。

PHH J6(C-p7)/JFH1的制备

将与来自JFH1株的基因组RNA全部区域对应的cDNA克隆到pUC19质粒中，由此构建作为质粒DNA的pJFH1(Wakita，T.等人.，Nat.Med.，11(2005)，791-796页、国际公开WO2004/104198)，将其用AgeI消化后，再用BclI进行部分消化，纯化由AgeI位点至最初的BclI位点的片段(2672bp)被除去的质粒DNA片段。另外，将来自J6CF株的基因组cDNA用AgeI和BclI部分消化，将所得的2672bp片段与上述片段连接，得到pUC J6/JFH1。

接着，将pHH JFH1用NocI消化，得到约4.3kb的片段；将pUCJ6/JFH1用NocI消化，得到约8.2kb的片段，将它们用连接酶连接，得到表达载体pHH J6(C-p7)/JFH1。该pHH J6(C-p7)/JFH1的插入片段(J6(C-p7)JFH1，SEQ ID NO.29，图10A-D)含有分别编码来自JFH1株和J6CF株的嵌合的5’非翻译区、来自J6CF株的核心蛋白、E1蛋白、E2蛋白、以及p7蛋白的DNA序列，以及分别编码来自JFH1株的NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B蛋白以及3’非翻译区的DNA序列。

pHH H77c(C-p7)/JFH1的制备

以上述JFH1基因组cDNA为模板，分别加入LA-PCR试剂盒(タカラバイオ社)所附带的10×缓冲液5μL、2.5mM dNTP混合液5μL、10μM引物5-JFH-S(SEQ ID NO.10：GCCATGGCGTTAGTATGAGTGTCGT)和5-JFH-A(SEQ ID NO.11：TCGTGCTCATGGTGCACGGTCTACGAGACC)各1μL，最后加入去离子水，使总量为49μL。接着加入1μL Takara LA Taq(タカラバイオ社)，然后进行PCR反应。PCR反应是以含有94℃1分钟、64℃2分钟、72℃3分钟的步骤作为一个循环，进行30个循环。将所得PCR产物作为PCR产物no.1。接着，以JFH1基因组cDNA为模板，分别加入LA-PCR试剂盒(タカラバイオ制备)所附带的10×缓冲液5μL、2.5mM dNTP混合液5μL、10μM引物3-JFH-S(SEQ ID NO.12：GGCATACGCATATGACGCACCTGTGCACGG)和3-JFH-A(SEQ ID NO.13：GCTCTGACGAAGTACGGCACATGTGTC)各1μL，最后加入去离子水，使总量为49μL。接着加入1μL Takara LA Taq(タカラバイオ公司)，然后进行PCR反应。PCR反应是以含有94℃1分钟、64℃2分钟、72℃3分钟的步骤作为一个循环，进行25个循环。将所得PCR产物作为PCR产物no.2。再以上述H77c基因组cDNA为模板，分别加入LA-PCR试剂盒(タカラバイオ社)所附带的10×缓冲液5μL、2.5mM dNTP混合液5μL、10μM引物5-H77-S(SEQ ID NO.14：ACCGTGCACCATGAGCACGAATCCTAAACC)和5-H77-A(SEQ ID NO.15：GAAGCCGCACGTAAGGGTATCGATG：)各1μL，最后加入去离子水，使总量为49μL。接着加入1μL Takara LA Taq(タカラバイオ社)，然后进行PCR反应。PCR反应是以含有94℃1分钟、64℃2分钟、72℃3分钟的步骤作为一个循环，进行25个循环。将所得PCR产物作为PCR产物no.3。再以上述H77c基因组cDNA为模板，分别加入LA-PCR试剂盒(タカラバイオ社)所附带的10×缓冲液5μL、2.5mM dNTP混合液5μL、10μM引物3-H77-S(SEQ ID NO.16：CATTGTGCCCGCAAAGAGCGTGTGT)和3-H77-A(SEQ ID NO.17：GTGCGTCATATGCGTATGCCCGCTGAGGCA)各1μL，最后加入去离子水，使总量为49μL。接着加入1μL Takara LA Taq(タカラバイオ社)，然后进行PCR反应。PCR反应是以含有94℃1分钟、64℃2分钟、72℃3分钟的步骤作为一个循环，进行25个循环。将所得PCR产物作为PCR产物no.4。

接着，将各PCR产物进行纯化，溶解于50μL水中。将PCR产物no.1和PCR产物no.3的DNA稀释100倍，各取1μL混合。以该混合液为模板，不加入引物，在上述条件下进行5个循环的PCR。然后添加引物5-JFH-S(SEQ ID NO.10)和5-H77-A(SEQ ID NO.15)，再进行25个循环的PCR，由此纯化扩增的嵌合DNA片段。将该片段克隆到质粒载体pCRII上，确定该DNA片段的碱基序列，确认碱基序列正确。将嵌合DNA片段克隆到pCRII上，将所得的该质粒命名为pCR5HJ。接着，将PCR产物no.2和PCR产物no.4的DNA稀释100倍，各取1μL混合。以该混合液为模板，不加入引物，在上述条件下进行5个循环的PCR。然后添加引物3-H77-S(SEQ ID NO.16)和3-JFH-A(SEQ ID NO.13)，再进行25个循环的PCR，由此纯化扩增的嵌合DNA片段。将该片段克隆到质粒载体pCRII上，确定该DNA片段的碱基序列，确认碱基序列正确。将嵌合DNA片段克隆到pCRII上，将所得的该质粒命名为pCR3HJ。

接着，将pCR5HJ用限制酶AgeI和KpnI、将H77c基因组cDNA用限制酶KpnI和AscI、将pCR3HJ用限制酶AscI和NotI消化，将各HCVcDNA片段通过琼脂糖凝胶电泳进行分级，纯化。将该三个DNA片段与将pHH JFH1用AgeI和NotI消化得到的载体连接。将该载体命名为pHH H77c(C-p7)/JFH。该表达载体pHH H77c(C-p7)/JFH的插入片段(H77c(C-p7)/JFH；SEQ ID NO.30，图11A-D)含有分别编码来自JFH1株和H77c株的嵌合的5’非翻译区、来自H77c株的核心蛋白、E1蛋白、E2蛋白和p7蛋白的DNA序列，以及分别编码来自JFH1株的NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B蛋白和3’非翻译区的DNA序列。

PHH J1(C-p7)/JFH1的制备

以上述JFH1基因组cDNA为模板，分别加入LA-PCR试剂盒(タカラバイオ社)中所附带的10×缓冲液5μL、2.5mM dNTP混合液5μL、10μM引物5-JFH-S(SEQ ID NO.10：GCCATGGCGTTAGTATGAGTGTCGT)和5-JFH-A2(SEQ ID NO.18：TTGTGCTCATGGTGCACGGTCTACGAGACC)各1μL，最后加入去离子水，使总量为49μL。接着加入1μL Takara LA Taq(タカラバイオ社)，然后进行PCR反应。PCR反应是以含有94℃1分钟、64℃2分钟、72℃3分钟的步骤作为一个循环，进行25个循环。将所得PCR产物作为PCR产物no.5。

接着，以JFH1基因组cDNA为模板，分别加入LA-PCR试剂盒(タカラバイオ社)中所附带的10×缓冲液5μL、2.5mM dNTP混合液5μL、10μM引物3-JFH-S2(SEQ ID NO.19：AGCTTACGCCTATGACGCACCTGTGCACGG)和3-JFH-A(SEQ ID NO.13：GCTCTGACGAAGTACGGCACATGTGTC)各1μL，最后加入去离子水，使总量为49μL。接着加入1μL Takara LA Taq(タカラバイオ社)，然后进行PCR反应。PCR反应是以含有94℃1分钟、64℃2分钟、72℃3分钟的步骤作为一个循环，进行25个循环。将所得PCR产物作为PCR产物no.6。

接着，以与来自基因型1b的J1株的基因组RNA对应的cDNA(GenBank登录号D89815、Aizaki，H.等人，Hepatology，27(1998)621-627页)为模板，分别加入LA-PCR试剂盒(タカラバイオ社)中所附带的10×缓冲液5μL、2.5mM dNTP混合液5μL、10μM引物3-J1-S(SEQ IDNO.20：ACCGTGCACCATGAGCACAAATCCTAAACC)和5-J1-A(SEQ IDNO.21：AAGCGGGATGTACCCCATGAG)各1μL，最后加入去离子水，使总量为49μL。接着加入1μL Takara LA Taq(タカラバイオ社)，然后进行PCR反应。PCR反应是以含有94℃1分钟、64℃2分钟、72℃3分钟的步骤作为一个循环，进行25个循环。将所得PCR产物作为PCR产物no.7。

接着，以来自上述J1株的基因组cDNA为模板，分别加入LA-PCR试剂盒(タカラバイオ社)中所附带的10×缓冲液5μL、2.5mM dNTP混合液5μL、10μM引物3-J1-S(SEQ ID NO.22：CGGCTGTACATGGATGAATAGCACTGGGTT)和3-J1-A(SEQ ID NO.23：GTGCGTCATAGGCGTAAGCTCGTGGTGGTA)各1μL，最后加入去离子水，使总量为49μL。接着加入1μL Takara LA Taq(タカラバイオ社)，然后进行PCR反应。PCR反应是以含有94℃1分钟、64℃2分钟、72℃3分钟的步骤作为一个循环，进行25个循环。将所得PCR产物作为PCR产物no.8。

接着，将各PCR产物进行纯化，溶解于50μL水中。将PCR产物no.5和PCR产物no.7的DNA稀释100倍，各取1μL混合。以该混合液为模板，不加入引物，在上述条件下进行5个循环的PCR。然后添加引物5-JFH-S(SEQ ID NO.10)和5-J1-A(SEQ ID NO.21)，再进行25个循环的PCR，由此纯化扩增的嵌合DNA片段。将该片段克隆到质粒载体pCRII上，确定该DNA片段的碱基序列，确认碱基序列正确。将嵌合DNA片段克隆到pCRII上，将所得的该质粒命名为pCR5JJ。

再将PCR产物no.6和PCR产物no.8的DNA稀释100倍，各取1μL混合。以该混合液为模板，不加入引物，在上述条件下进行5个循环的PCR。然后添加引物3-J1-S(SEQ ID NO.22)和3-JFH-A(SEQ ID NO.13)，再进行25个循环的PCR，由此纯化扩增的嵌合DNA片段。将该片段克隆到质粒载体pCRII上，确定该DNA片段的碱基序列，确认碱基序列正确。将嵌合DNA片段克隆到pCRII上，将所得的该质粒命名为pCR3JJ。

接着，将pCR5JJ用限制酶AgeI和ClaI、将J1基因组cDNA用限制酶ClaI和AvrII、将pCR3JJ用限制酶AvII和KpnI消化，将各HCVcDNA片段通过琼脂糖凝胶电泳进行分级，纯化。将该三个DNA片段与将pHH JFH1用AgeI和KpnI消化得到的载体连接。将该载体命名为pHH J1(C-p7)/JFH。该表达载体pHH J1(C-p7)/JFH的插入片段(J1(C-p7)/JFH；SEQ ID NO.31，图12A-D)含有分别编码来自JFH1株和J1株的嵌合的5’非翻译区、来自J1株的核心蛋白、E1蛋白、E2蛋白和p7蛋白的DNA序列，以及分别编码来自JFH1株的NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B蛋白和3’非翻译区的DNA序列。

pHH J1(C-NS2)/JFH1的制备

以上述JFH1基因组cDNA为模板，分别加入LA-PCR试剂盒(タカラバイオ社)中所附带的10×缓冲液5μL、2.5mM dNTP混合液5μL、10μM引物5-JFH-S(SEQ ID NO.10：GCCATGGCGTTAGTATGAGTGTCGT)和5-JFH-A2(SEQ ID NO.18：TTGTGCTCATGGTGCACGGTCTACGAGACC)各1μL，最后加入去离子水，使总量为49μL。接着加入1μL Takara LA Taq(タカラバイオ社)，然后进行PCR反应。PCR反应是以含有94℃1分钟、64℃2分钟、72℃3分钟的步骤作为一个循环，进行25个循环。将所得PCR产物作为PCR产物no.9。

接着，以JFH1基因组cDNA为模板，分别加入LA-PCR试剂盒(タカラバイオ社)中所附带的10×缓冲液5μL、2.5mM dNTP混合液5μL、10μM引物3-JFH-NS3-S(SEQ ID NO.24：GCGACTCCTTGCTCCCATCACTGCTTATGC)和3-JFH-NS3-A(SEQ ID NO.25：TGGGAGACCTTGTAACAACGTCGAGTGT)各1μL，最后加入去离子水，使总量为49μL。接着加入1μL Takara LA Taq(タカラバイオ社)，然后进行PCR反应。PCR反应是以含有94℃1分钟、64℃2分钟、72℃3分钟的步骤作为一个循环，进行25个循环。将所得PCR产物作为PCR产物no.10。

接着，以来自基因型1b的J1株的基因组RNA的cDNA(GenBank登录号D89815、Aizaki，H.等人.Hepatology，27(1998)621-627页)为模板，分别加入LA-PCR试剂盒(タカラバイオ社)中所附带的10×缓冲液5μL、2.5mM dNTP混合液5μL、10μM引物5-J1-S(SEQ ID NO.20：ACCGTGCACCATGAGCACAAATCCTAA ACC)和5-J1-A(SEQ ID NO.21：AAGCGGGATGTACCCCATGAG)各1μL，最后加入去离子水，使总量为49μL。接着加入1μL Takara LA Taq(タカラバイオ社)，然后进行PCR反应。PCR反应是以含有94℃1分钟、64℃2分钟、72℃3分钟的步骤作为一个循环，进行25个循环。将所得PCR产物作为PCR产物no.11。

接着，以来自J1株的基因组cDNA为模板，分别加入LA-PCR试剂盒(タカラバイオ社)中所附带的10×缓冲液5μL、2.5mM dNTP混合液5μL、10μM引物3-J1-S(SEQ ID NO.22：CGGCTGTACATGGATGAATAGCACTGGGTT)和3-J1-NS3-A(SEQ ID NO.26：CATAAGCAGTGATGGGAGCAAGGAGTCGCC)各1μL，最后加入去离子水，使总量为49μL。接着加入1μL Takara LA Taq(タカラバイオ社)，然后进行PCR反应。PCR反应是以含有94℃1分钟、64℃2分钟、72℃3分钟的步骤作为一个循环，进行25个循环。将所得PCR产物作为PCR产物no.12。

将各PCR产物进行纯化，溶解于50μL水中。将PCR产物no.9和PCR产物no.11的DNA稀释100倍，各取1μL混合。以该混合液为模板，不加入引物，在上述条件下进行5个循环的PCR。然后添加5-JFH-S(SEQ ID NO.10)和5-J1-A(SEQ ID NO.21)作为引物，再进行25个循环的PCR，由此纯化扩增的嵌合DNA片段。将该片段克隆到质粒载体pCRII上，确定该DNA片段的碱基序列，确认碱基序列正确。将嵌合DNA片段克隆到pCRII上，将所得的该质粒命名为pCR5JJ。

再将PCR产物no.10和PCR产物no.12的DNA稀释100倍，各取1μL混合。以该混合液为模板，不加入引物，在上述条件下进行5个循环的PCR。然后添加3-J1-S(SEQ ID NO.22)和3-JFH-NS3-A(SEQ IDNO.25)作为引物，再进行25个循环的PCR，由此纯化扩增的嵌合DNA片段。将该片段克隆到质粒载体pCRII上，确定该DNA片段的碱基序列，确认碱基序列正确。将嵌合DNA片段克隆到pCRII上，将所得的该质粒命名为pCR3JJNS3。

接着，将pCR5JJ用限制酶AgeI和ClaI、将J1基因组cDNA用限制酶ClaI和AvrII、将pCR3JJNS3用限制酶AvII和BspDI消化，将各HCV cDNA片段通过琼脂糖凝胶电泳进行分级，纯化。将该三个DNA片段与将pHH JFH1用AgeI和BspDI消化得到的载体连接。将该载体命名为pHH J1(C-NS2)/JFH。该表达载体pHH J1(C-NS2)/JFH的插入片段(J1(C-NS2)/JFH；SEQ ID NO.32，图13A-D)含有：分别编码来自JFH1株和J1株的嵌合的5’非翻译区、来自J1株的核心蛋白、E1蛋白、E2蛋白、p7蛋白和NS2蛋白的DNA序列，以及分别编码来自JFH1株的NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B蛋白以及3’非翻译区的DNA序列。

各表达载体克隆的图谱如图1C所示。

[实施例2]

细胞内HCV RNA合成的确认

使用Fugene6(ロシユ社)，按照所附说明书，将实施例1中制备的pHH JFH1和pHH JFH1/GND导入到Huh7和HepG2细胞中。24小时后，通过Isogen(日本ジ一ン社)，按照所附说明书，由各细胞制备RNA。

以这些RNA为模板，如下通过RACE法确认是否由pHH JFH1和pHH JFH1/GND合成了HCV RNA。

通过T4RNA连接酶(Takara社)，使用所附缓冲液，将2μg上述制备的RNA和2.5μM RNA接头(SEQ ID NO.1：GCUGAUGGCGAUGAAUGAACACUGCGUUUGCUGGCUUUGAUGAAA)连接。接着，以连接有RNA接头的RNA为模板，使用与HCV RNA互补的引物(SEQID NO.2：gtaccccatgaggtcggcaaag)，通过反转录酶SuperScript III(インビトロジエン社)，按照所附说明书合成cDNA。

接着，以合成的上述cDNA为模板，使用5’末端RNA接头的正义引物(SEQ ID NO.3：GCTGATGGCGATGAATGAACACTG)和3’末端的反义引物(SEQ ID NO.4：gaccgctccgaagttttccttg)两种引物，通过PCR扩增DNA。再以扩增的DNA为模板，使用含有扩增的DNA内侧序列的5’末端的引物(SEQ ID NO.5：GAACACTGCGTTTGCTGGCTTTGATG)和3’末端的引物(SEQID NO.6：cgccctatcaggcagtaccacaag)的引物对进行第二次PCR。该PCR是使用市售的试剂盒Ex Taq(Takara)，在96℃加热处理5分钟，然后以96℃1分钟、55℃1分钟、72℃2分钟的反应循环进行35个循环，之后在4℃下保存。接着，为了确认是否得到了上述第二次的PCR产物，将反应液的一部分通过琼脂糖凝胶电泳确认。结果(图2)，在Huh7细胞和HepG2细胞中均发生了由pHH JFH1和pHH JFH1/GND转录为HCV RNA的情况。并且，将第二次的PCR产物克隆到pGEM-T Easy(Promega社)载体中。在所得质粒DNA中克隆的DNA碱基序列用DNA测序仪(ABI PRISM377)确定。结果，由pHH JFH1和pHH JFH1/GND转录的HCV RNA的5’末端序列与HCV基因组的5’末端相同。图3中给出了由pHH JFH1转录的HCV RNA的5’末端和接头序列。

[实施例3]

细胞内的HCV蛋白质表达的确认

在导入了pHH JFH1、pHH H77c和pHH JFH1/GND的细胞中，确认转录之后是否发生了HCV蛋白质的翻译。

使用Fugene6(ロシユ社)，按照所附说明书，将pHH JFH1、pHH H77c和pHH JFH1/GND导入到Huh7细胞中。培养4天后，按照常规方法制备细胞提取液。接着，通过SDS-PAGE和蛋白质印迹法对这些提取液中的蛋白质进行分析。分析时，将含有核心基因的表达质粒DNA瞬时转染Huh7细胞，以所得细胞提取液作为阳性对照。并且，将由未转染的Huh7细胞得到的细胞提取液作为阴性对照。将由各细胞克隆提取的试样进行SDS-PAGE后，转印PVDF膜(Immobilon-P，Millipore社制)，使用抗核心特异性抗体(兔多克隆抗体)、以及小鼠单克隆抗体(Austral社)和识别这些抗体的HRP标记二次抗体作为抗NS5A抗体，通过ECL(アマシヤムフアルマシア社)检测在细胞内被翻译的核心蛋白和NS5A蛋白。

结果如图4所示，在导入了pHH JFH1的细胞中，可见核心和NS5A蛋白的表达。但在导入pHH H77c和pHH JFH1/GND的细胞中未检测出这些蛋白质的表达。由该结果可认为，在导入了pHH JFH1的细胞中，由pHH JFH1转录为RNA之后，该RNA在细胞内复制，然后发生蛋白质的翻译，达到了蛋白质可检测的水平，而在导入了pHH JFH1/GND的细胞中，由pHH JFH1/GND转录RNA后，该RNA变异为NS5B，因此在细胞内无法复制，未达到可检测蛋白质的水平。另一方面，HCV基因组RNA虽然在培养细胞中自主复制(Yi，M.& Lemon ST.，J.Virol.，78(2004)7904-7915页)，但在pHH H77c中未能检测HCV蛋白的表达的原因尚不明确。

下面，对于在什么样的细胞株中表达HCV蛋白进行研究。使用Fugen6(ロシユ社)，按照所附说明书，将pHH JFH1和pHH JFH1/GND与GFP表达载体(pGreenLantern：Life Technologies Inc.)一起导入到Huh7、RCYM1RC、5-15RC、HepG2和293T细胞中。导入4天后，通过荧光显微镜观察GFP的表达，确认导入到各载体中后，由各细胞制备细胞提取液。接着，通过SDS-PAGE和蛋白质印迹法对这些提取液中的核心蛋白进行分析。核心蛋白的检测是使用抗核心特异性兔多克隆抗体和识别该抗体的HRP标记二次抗体，通过ECL(アマシヤムフアルマシア社)进行。结果如图5所示，在Huh7、RCYM1RC、5-15RC、HepG2细胞中检测出了核心蛋白。

[实施例4]

HCV颗粒的生成

接着，为了确认是否由pHH JFH1导入细胞生成了HCV颗粒，对培养上清中的核心蛋白进行分析。作为pHH JFH1和对照，使用Fugene6，向HepG2细胞中导入表达核心、E1、E2和p7的载体pCAG327JFH1，2天后除去培养上清，加入新鲜的培养基，再培养两天。接着回收细胞和培养液，由细胞提取蛋白质，按照实施例3所示的方法对细胞中的核心蛋白的表达进行分析。结果确认了核心蛋白的表达(图6A)。为了确认培养液中HCV颗粒的存在，通过蔗糖密度梯度对培养液进行分级。在10-60％(重量/重量)的密度梯度蔗糖溶液(溶解于50mM Tris pH 7.5/0.1M NaCl/1mM EDTA中)再铺0.2mL样品的培养上清。将其用ベツクマンロ一タ一S W41E、以35,000RPM、4℃离心16小时，离心结束后，从离心管底将各级分回收0.5mL。对各级分的密度、HCV核心蛋白浓度进行定量。HCV核心蛋白的测定是使用オ一ソHCV抗原IRMA测试仪进行(Aoyagi等人.，J.Clin.Microbiol.，37(1999)1802-1808页)。

如图6B所示，在1.15～1.18mg/mL的级分中可见核心蛋白的峰。与此相对，在表达核心、E1、E2和p7的细胞中未观察到核心蛋白的峰。

存在于1.15～1.18mg/mL级分中的核心蛋白和HCV RNA如果形成HCV颗粒，则应该对表面活性NP40的处理具有感受性。因此，将pHHJFH1导入HepG2中，将2～4天的培养液用0.2％的NP40处理20分钟，然后通过蔗糖密度梯度分级。如图7所示，通过进行NP40处理，在1.20mg/mL的级分中可见核心蛋白的峰。即，含有脂质的比重轻的表面膜由于NP40而从病毒颗粒上剥离，形成未保持类病毒结构的核酸和只有核心蛋白的核心颗粒，比重变重。

由以上结果可以确认，通过将pHH JFH1导入HepG2细胞，由HCV基因组cDNA转录病毒RNA后，发生病毒蛋白的合成和病毒RNA的复制，形成病毒颗粒，分泌到培养液中。

[实施例5]

HCV颗粒的感染性确认

对实施例4所得的HCV颗粒是否具有感染性进行研究。使用Fugene6将pHH JFH1导入到Huh7细胞和HepG2细胞中，将培养3～5天的培养上清用超滤膜(截留分子量1×105Da)浓缩30倍。接着，在100μL浓缩的含有HCV颗粒的培养液中将Huh7.5.1细胞在15mm盖玻片上培养，4天后，将细胞用抗NS5A抗体荧光染色。记数抗NS5A抗体染色阳性，即感染细胞数，结果如图8所示，可见部分感染细胞。由这些结果可知，通过将pHH JFH1导入到Huh7或HepG2细胞中，分泌到培养液中的HCV颗粒具有感染的能力。

[实施例6]

感染性HCV颗粒产生细胞株的获得

利用上述实施例所示的系统，尝试建立持续生产感染性HCV颗粒的细胞株。

将pHH JFH1用NheI消化，将pSV40/Zeo2(Invitrogen)用Nhe I和Xba I消化，获得SV40启动子，在SV40启动子下游连接Zeocin抗性基因，再在其下游连接附加有SV40polyA的信号，将所得的表达单元(SV40启动子/Zeo/polyA)整合到上述pHH JFH1用NheI消化的位点，制备载体。将该载体命名为pHH/ZeoJFH1(图9)。

通过Fugene6，将pHH/ZeoJFH1导入到HepG2细胞中。用含有Zeocin的培养基培养。然后每周更换两次培养液，用含有Zeocin的培养基继续培养。上述培养21天后，由培养皿克隆存活细胞的细胞集落，继续培养。通过上述集落的克隆获得了100个细胞克隆。这些克隆的培养上清中的核心蛋白质量是使用オ一ソHCV抗原IRMA测试仪进行(Aoyagi等人.，J.Clin.Microbiol.，37(1999)1802-1808页)，筛选出核心蛋白表达量多的克隆HepG2/No59细胞。

使用10cm的培养皿，用8mL的培养基培养2×10⁶个HepG2/No59细胞。48小时后回收培养上清。

测定培养上清中的核心蛋白，结果可以确认：HepG2/No59细胞产生了1,400fmol/L的核心蛋白。

由培养上清制备RNA，由该RNA进行HCV基因组RNA量的测定。HCV RNA的定量RT-PCR检测是按照Takeuchi等人的方法(Takeuchi T等人.，Gastroenterology，116(1999)636-642页)，检测HCV RNA的5’非翻译区的RNA来进行。具体来说，使用以下的合成引物和EZ rTth RNAPCR试剂盒(Applied Biosystems)，对由细胞提取的RNA中所含的HCVRNA进行PCR扩增，通过ABI Prism 7700测序系统(Applied Biosystems)检测。探针

R6-130-S17：5’-CGGGAGAGCCATAGTGG-3’(SEQ ID No.7)

R6-290-R19：5’-AGTACCACAAGGCCTTTCG-3’(SEQ ID No.8)

TaqMan探针，R6-148-S21FT：5’-CTGCGGAACCGGTGAGTACAC-3’

(SEQ ID No.9)

结果可知，HepG2/No59细胞培养上清中的HCV RNA为6.1×10⁸拷贝/mL。该产生量比目前报道的量高约60倍。

进一步使用超滤膜(截留分子量1×10⁵Da)，将HepG2/No59细胞培养上清浓缩30倍，用100μL浓缩的含有HCV颗粒的培养液，在15mm盖玻片上培养Huh7.5.1细胞，4天后，将细胞用抗NS5A抗体免疫染色。结果，可检测出抗NS5A抗体染色阳性、即感染细胞。由以上可以确认，分泌到HepG2/No59细胞培养液中的HCV颗粒具有感染能力。

[实施例7]

通过嵌合HCV表达载体制备HCV颗粒

使用Fugene6(ロシユ社)，按照所附说明书，将实施例1中制备的嵌合HCV表达载体pHH H77c(C-p7)/JFH1、pHH J6(C-p7)/JFH1、pHHJ1(C-p7)/JFH1和pHH J1(C-NS2)/JFH1导入到由Huh7细胞派生的细胞株Huh7.5.1细胞(Zhong，J.等人.，Proc.Natl.Acad.Sci USA，102，9294-9299页(2005))中。导入3天后回收这些培养上清，测定培养上清中所含的核心蛋白的量。核心蛋白质量的测定是使用オ一ソHCV抗原IRMA测试仪(Aoyagi等人.，J.Clin.Microbiol.，37(1999)1802-1808页)。使用未导入载体的细胞的培养上清作为阴性对照，使用导入了pHH JFH1的细胞的培养上清作为阳性对照。其实验结果的一个例子如表1所示。导入了各嵌合HCV表达载体的细胞上清中可见核心蛋白，由此判断生成了病毒颗粒。还证实pHH J6(C-p7)/JFH1具有比pHH JFH1高10倍以上的HCV产生能力。

[表1]

表达载体	导入载体3天后的核心蛋白质量(fmol/L)
		未导入	0
pHH JFH1	252.164
		pHH J6(C-p7)/JFH1	2272.878
pHH H77c(C-p7)/JFH1	29.555
		pHH J1(C-p7)/JFH1	0.403
pHH J1(C-NS2)/JFH1	11.004

[实施例8]

将pHH J6(C-p7)/JFH1和pHH J1(C-p7)/JFH1按照实施例7所示的方法导入到Huh7.5.1细胞中，将导入3天后的培养上清用超滤膜(截留分子量1×10⁵Da)浓缩。加入100μL浓缩的含有HCV颗粒的培养上清，将Huh7.5.1细胞在15mm盖玻片上培养，4天后用抗NS5A抗体进行免疫染色。结果，用由导入了pHH J6(C-p7)/JFH1的细胞得到的培养上清处理的细胞中可见被抗NS5A抗体强烈染色的细胞。另一方面，用由导入了pHH J1(C-p7)/JFH1的细胞得到的培养上清处理的细胞中，与pHHJ6(C-p7)/JFH1比较，抗NS5A抗体染色强度弱，但与对照细胞比较则明显被染色。以上表明，导入了pHH J6(C-p7)/JFH1和pHH J1(C-p7)/JFH1的细胞中产生了感染性HCV。

按照实施例6所示的方法，向pHH J1(C-p7)/JFH1中插入Zeocin抗性基因表达单元，制备pHH/Zeo J1(C-p7)/JFH1。接着，将pHH/ZeoJ1(C-p7)/JFH1导入Huh7.5.1，得到在含有Zeocin的培养基中增殖、可稳定表达病毒颗粒的细胞。将8mL该细胞的培养上清用超滤膜(截留分子量1×10⁵Da)浓缩。该浓缩的培养上清中的HCV核心蛋白质量是2365fmol/L。使用100μL该浓缩培养上清，使Huh7.5.1感染，4天后将细胞用抗NS5A抗体免疫染色。结果，由导入了pHH/Zeo J1(C-p7)/JFH1的稳定表达性细胞得到培养上清，在用该培养细胞处理的细胞中可见被抗NS5A抗体强烈染色的细胞。由此表明由本细胞产生了感染性HCV。

上述嵌合HCV表达载体显示可在其所感染的细胞内产生感染性HCV。

序列表自由文本

SEQ ID NO.1的序列表示合成RNA。

SEQ ID NO.2～SEQ ID NO.9的序列表示合成DNA。

SEQ ID NO.10～26的序列表示引物。

SEQ ID NO.29～32的序列表示嵌合DNA。

SEQ ID NO.33～45的序列表示合成DNA。

序列表

<110>Director General of National Institute of Infectious Diseases

Tokyo Metropol itan Organization for Medical Research

TORAY Industries，Inc.

<120>感染性丙型肝炎病毒颗粒高效生产体系

<130>PH-2922-PCT

<150>JP 2005-287646

<151>2005-09-30

<160>45

<170>PatentIn Ver.2.1

<210>1

<211>45

<212>RNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223>人工序列说明：合成的(synthetic)

<220>

<223>发明人：Tanabe，Jun-ichi；Sone，Saburo；Wakita，Takaji

发明人：Ishii，Takashi；Suzuki，Ryosuke；Suzuki，Tetsurou

发明人：Miyamura Tatsuo

<400>1

gcugauggcg augaaugaac acugcguuug cuggcuuuga ugaaa 45

<210>2

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：合成的

<400>2

gtaccccatg aggtcggcaa ag 22

<210>3

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：合成的

<400>3

gctgatggcg atgaatgaac actg 24

<210>4

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：合成的

<400>4

gaccgctccg aagttttcct tg 22

<210>5

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：合成的

<400>5

gaacactgcg tttgctggct ttgatg 26

<210>6

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：合成的

<400>6

cgccctatca ggcagtacca caag 24

<210>7

<211>17

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：合成的

<400>7

cgggagagcc atagtgg 17

<210>8

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：合成的

<400>8

agtaccacaa ggcctttcg 19

<210>9

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：合成的

<400>9

ctgcggaacc ggtgagtaca c 21

<210>10

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：引物

<400>10

gccatggcgt tagtatgagt gtcgt 25

<210>11

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：引物

<400>11

tcgtgctcat ggtgcacggt ctacgagacc 30

<210>12

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：引物

<400>12

ggcatacgca tatgacgcac ctgtgcacgg 30

<210>13

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：引物

<400>13

gctctgacga agtacggcac atgtgtc 27

<210>14

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：引物

<400>14

accgtgcacc atgagcacga atcctaaacc 30

<210>15

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：引物

<400>15

gaagccgcac gtaagggtat cgatg 25

<210>16

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：引物

<400>16

cattgtgccc gcaaagagcg tgtgt 25

<210>17

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：引物

<400>17

gtgcgtcata tgcgtatgcc cgctgaggca 30

<210>18

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：引物

<400>18

ttgtgctcat ggtgcacggt ctacgagacc 30

<210>19

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：引物

<400>19

agcttacgcc tatgacgcac ctgtgcacgg 30

<210>20

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：引物

<400>20

accgtgcacc atgagcacaa atcctaaacc 30

<210>21

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：引物

<400>21

aagcgggatg taccccatga g 21

<210>22

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：引物

<400>22

cggctgtaca tggatgaata gcactgggtt 30

<210>23

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：引物

<400>23

gtgcgtcata ggcgtaagct cgtggtggta 30

<210>24

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：引物

<400>24

gcgactcctt gctcccatca ctgcttatgc 30

<210>25

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：引物

<400>25

tgggagacct tgtaacaacg tcgagtgt 28

<210>26

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：引物

<400>26

cataagcagt gatgggagca aggagtcgcc 30

<210>27

<211>9678

<212>DNA

<213>丙型肝炎病毒

<220>

<221>CDS

<222>(341)..(9442)

<400>27

acctgcccct aataggggcg acactccgcc atgaatcact cccctgtgag gaactactgt 60

cttcacgcag aaagcgccta gccatggcgt tagtatgagt gtcgtacagc ctccaggccc 120

ccccctcccg ggagagccat agtggtctgc ggaaccggtg agtacaccgg aattgccggg 180

aagactgggt cctttcttgg ataaacccac tctatgcccg gccatttggg cgtgcccccg 240

caagactgct agccgagtag cgttgggttg cgaaaggcct tgtggtactg cctgataggg 300

cgcttgcgag tgccccggga ggtctcgtag accgtgcacc atg agc aca aat cct 355

Met Ser Thr Asn Pro

1 5

aaa cct caa aga aaa acc aaa aga aac acc aac cgt cgc cca gaa gac 403

Lys Pro Gln Arg Lys Thr Lys Arg Asn Thr Asn Arg Arg Pro Glu Asp

10 15 20

gtt aag ttc ccg ggc ggc ggc cag atc gtt ggc gga gta tac ttg ttg 451

Val Lys Phe Pro Gly Gly Gly Gln Ile Val Gly Gly Val Tyr Leu Leu

25 30 35

ccg cgc agg ggc ccc agg ttg ggt gtg cgc acg aca agg aaa act tcg 499

Pro Arg Arg Gly Pro Arg Leu Gly Val Arg Thr Thr Arg Lys Thr Ser

40 45 50

gag cgg tcc cag cca cgt ggg aga cgc cag ccc atc ccc aaa gat cgg 547

Glu Arg Ser Gln Pro Arg Gly Arg Arg Gln Pro Ile Pro Lys Asp Arg

55 60 65

cgc tcc act ggc aag gcc tgg gga aaa cca ggt cgc ccc tgg ccc cta 595

Arg Ser Thr Gly Lys Ala Trp Gly Lys Pro Gly Arg Pro Trp Pro Leu

70 75 80 85

tat ggg aat gag gga ctc ggc tgg gca gga tgg ctc ctg tcc ccc cga 643

Tyr Gly Asn Glu Gly Leu Gly Trp Ala Gly Trp Leu Leu Ser Pro Arg

90 95 100

ggc tct cgc ccc tcc tgg ggc ccc act gac ccc cgg cat agg tcg cgc 691

Gly Ser Arg Pro Ser Trp Gly Pro Thr Asp Pro Arg His Arg Ser Arg

105 110 115

aac gtg ggt aaa gtc atc gac acc cta acg tgt ggc ttt gcc gac ctc 739

Asn Val Gly Lys Val Ile Asp Thr Leu Thr Cys Gly Phe Ala Asp Leu

120 125 130

atg ggg tac atc ccc gtc gta ggc gcc ccg ctt agt ggc gcc gcc aga 787

Met Gly Tyr Ile Pro Val Val Gly Ala Pro Leu Ser Gly Ala Ala Arg

135 140 145

gct gtc gcg cac ggc gtg aga gtc ctg gag gac ggg gtt aat tat gca 835

Ala Val Ala His Gly Val Arg Val Leu Glu Asp Gly Val Asn Tyr Ala

150 155 160 165

aca ggg aac cta ccc ggt ttc ccc ttt tct atc ttc ttg ctg gcc ctg 883

Thr Gly Asn Leu Pro Gly Phe Pro Phe Ser Ile Phe Leu Leu Ala Leu

170 175 180

ttg tcc tgc atc acc gtt ccg gtc tct gct gcc cag gtg aag aat acc 931

Leu Ser Cys Ile Thr Val Pro Val Ser Ala Ala Gln Val Lys Asn Thr

185 190 195

agt agc agc tac atg gtg acc aat gac tgc tcc aat gac agc atc act 979

Ser Ser Ser Tyr Met Val Thr Asn Asp Cys Ser Asn Asp Ser Ile Thr

200 205 210

tgg cag ctc gag gct gcg gtt ctc cac gtc ccc ggg tgc gtc ccg tgc 1027

Trp Gln Leu Glu Ala Ala Val Leu His Val Pro Gly Cys Val Pro Cys

215 220 225

gag aga gtg ggg aat acg tca cgg tgt tgg gtg cca gtc tcg cca aac 1075

Glu Arg Val Gly Asn Thr Ser Arg Cys Trp Val Pro Val Ser Pro Asn

230 235 240 245

atg gct gtg cgg cag ccc ggt gcc ctc acg cag ggt ctg cgg acg cac 1123

Met Ala Val Arg Gln Pro Gly Ala Leu Thr Gln Gly Leu Arg Thr His

250 255 260

atc gat atg gtt gtg atg tcc gcc acc ttc tgc tct gct ctc tac gtg 1171

Ile Asp Met Val Val Met Ser Ala Thr Phe Cys Ser Ala Leu Tyr Val

265 270 275

ggg gac ctc tgt ggc ggg gtg atg ctc gcg gcc cag gtg ttc atc gtc 1219

Gly Asp Leu Cys Gly Gly Val Met Leu Ala Ala Gln Val Phe Ile Val

280 285 290

tcg ccg cag tac cac tgg ttt gtg caa gaa tgc aat tgc tcc atc tac 1267

Ser Pro Gln Tyr His Trp Phe Val Gln Glu Cys Asn Cys Ser Ile Tyr

295 300 305

cct ggc acc atc act gga cac cgc atg gca tgg gac atg atg atg aac 1315

Pro Gly Thr Ile Thr Gly His Arg Met Ala Trp Asp Met Met Met Asn

310 315 320 325

tgg tcg ccc acg gcc acc atg atc ctg gcg tac gtg atg cgc gtc ccc 1363

Trp Ser Pro Thr Ala Thr Met Ile Leu Ala Tyr Val Met Arg Val Pro

330 335 340

gag gtc atc ata gac atc gtt agc ggg gct cac tgg ggc gtc atg ttc 1411

Glu Val Ile Ile Asp Ile Val Ser Gly Ala His Trp Gly Val Met Phe

345 350 355

ggc ttg gcc tac ttc tct atg cag gga gcg tgg gcg aag gtc att gtc 1459

Gly Leu Ala Tyr Phe Ser Met Gln Gly Ala Trp Ala Lys Val Ile Val

360 365 370

atc ctt ctg ctg gcc gct ggg gtg gac gcg ggc acc acc acc gtt gga 1507

Ile Leu Leu Leu Ala Ala Gly Val Asp Ala Gly Thr Thr Thr Val Gly

375 380 385

ggc gct gtt gca cgt tcc acc aac gtg att gcc ggc gtg ttc agc cat 1555

Gly Ala Val Ala Arg Ser Thr Asn Val Ile Ala Gly Val Phe Ser His

390 395 400 405

ggc cct cag cag aac att cag ctc att aac acc aac ggc agt tgg cac 1603

Gly Pro Gln Gln Asn Ile Gln Leu Ile Asn Thr Asn Gly Ser Trp His

410 415 420

atc aac cgt act gcc ttg aat tgc aat gac tcc ttg aac acc ggc ttt 1651

Ile Asn Arg Thr Ala Leu Asn Cys Asn Asp Ser Leu Asn Thr Gly Phe

425 430 435

ctc gcg gcc ttg ttc tac acc aac cgc ttt aac tcg tca ggg tgt cca 1699

Leu Ala Ala Leu Phe Tyr Thr Asn Arg Phe Asn Ser Ser Gly Cys Pro

440 445 450

ggg cgc ctg tcc gcc tgc cgc aac atc gag gct ttc cgg ata ggg tgg 1747

Gly Arg Leu Ser Ala Cys Arg Asn Ile Glu Ala Phe Arg Ile Gly Trp

455 460 465

ggc acc cta cag tac gag gat aat gtc acc aat cca gag gat atg agg 1795

Gly Thr Leu Gln Tyr Glu Asp Asn Val Thr Asn Pro Glu Asp Met Arg

470 475 480 485

ccg tac tgc tgg cac tac ccc cca aag ccg tgt ggc gta gtc ccc gcg 1843

Pro Tyr Cys Trp His Tyr Pro Pro Lys Pro Cys Gly Val Val Pro Ala

490 495 500

agg tct gtg tgt ggc cca gtg tac tgt ttc acc ccc agc ccg gta gta 1891

Arg Ser Val Cys Gly Pro Val Tyr Cys Phe Thr Pro Ser Pro Val Val

505 510 515

gtg ggc acg acc gac aga cgt gga gtg ccc acc tac aca tgg gga gag 1939

Val Gly Thr Thr Asp Arg Arg Gly Val Pro Thr Tyr Thr Trp Gly Glu

520 525 530

aat gag aca gat gtc ttc cta ctg aac agc acc cga ccg ccg cag ggc 1987

Asn Glu Thr Asp Val Phe Leu Leu Asn Ser Thr Arg Pro Pro Gln Gly

535 540 545

tca tgg ttc ggc tgc acg tgg atg aac tcc act ggt ttc acc aag act 2035

Ser Trp Phe Gly Cys Thr Trp Met Asn Ser Thr Gly Phe Thr Lys Thr

550 555 560 565

tgt ggc gcg cca cct tgc cgc acc aga gct gac ttc aac gcc agc acg 2083

Cys Gly Ala Pro Pro Cys Arg Thr Arg Ala Asp Phe Asn Ala Ser Thr

570 575 580

gac ttg ttg tgc cct acg gat tgt ttt agg aag cat cct gat gcc act 2131

Asp Leu Leu Cys Pro Thr Asp Cys Phe Arg Lys His Pro Asp Ala Thr

585 590 595

tat att aag tgt ggt tct ggg ccc tgg ctc aca cca aag tgc ctg gtc 2179

Tyr Ile Lys Cys Gly Ser Gly Pro Trp Leu Thr Pro Lys Cys Leu Val

600 605 610

cac tac cct tac aga ctc tgg cat tac ccc tgc aca gtc aat ttt acc 2227

His Tyr Pro Tyr Arg Leu Trp His Tyr Pro Cys Thr Val Asn Phe Thr

615 620 625

atc ttc aag ata aga atg tat gta ggg ggg gtt gag cac agg ctc acg 2275

Ile Phe Lys Ile Arg Met Tyr Val Gly Gly Val Glu His Arg Leu Thr

630 635 640 645

gcc gca tgc aac ttc act cgt ggg gat cgc tgc gac ttg gag gac agg 2323

Ala Ala Cys Asn Phe Thr Arg Gly Asp Arg Cys Asp Leu Glu Asp Arg

650 655 660

gac agg agt cag ctg tct cct ctg ttg cac tct acc acg gaa tgg gcc 2371

Asp Arg Ser Gln Leu Ser Pro Leu Leu His Ser Thr Thr Glu Trp Ala

665 670 675

atc ctg ccc tgc acc tac tca gac tta ccc gct ttg tca act ggt ctt 2419

Ile Leu Pro Cys Thr Tyr Ser Asp Leu Pro Ala Leu Ser Thr Gly Leu

680 685 690

ctc cac ctt cac cag aac atc gtg gac gta caa tac atg tat ggc ctc 2467

Leu His Leu His Gln Asn Ile Val Asp Val Gln Tyr Met Tyr Gly Leu

695 700 705

tca cct gct atc aca aaa tac gtc gtt cga tgg gag tgg gtg gta ctc 2515

Ser Pro Ala Ile Thr Lys Tyr Val Val Arg Trp Glu Trp Val Val Leu

710 715 720 725

tta ttc ctg ctc tta gcg gac gcc aga gtc tgc gcc tgc ttg tgg atg 2563

Leu Phe Leu Leu Leu Ala Asp Ala Arg Val Cys Ala Cys Leu Trp Met

730 735 740

ctc atc ttg ttg ggc cag gcc gaa gca gca ttg gag aag ttg gtc gtc 2611

Leu Ile Leu Leu Gly Gln Ala Glu Ala Ala Leu Glu Lys Leu Val Val

745 750 755

ttg cac gct gcg agt gcg gct aac tgc cat ggc ctc cta tat ttt gcc 2659

Leu His Ala Ala Ser Ala Ala Asn Cys His Gly Leu Leu Tyr Phe Ala

760 765 770

atc ttc ttc gtg gca gct tgg cac atc agg ggt cgg gtg gtc ccc ttg 2707

Ile Phe Phe Val Ala Ala Trp His Ile Arg Gly Arg Val Val Pro Leu

775 780 785

acc acc tat tgc ctc act ggc cta tgg ccc ttc tgc cta ctg ctc atg 2755

Thr Thr Tyr Cys Leu Thr Gly Leu Trp Pro Phe Cys Leu Leu Leu Met

790 795 800 805

gca ctg ccc cgg cag gct tat gcc tat gac gca cct gtg cac gga cag 2803

Ala Leu Pro Arg Gln Ala Tyr Ala Tyr Asp Ala Pro Val His Gly Gln

810 815 820

ata ggc gtg ggt ttg ttg ata ttg atc acc ctc ttc aca ctc acc ccg 2851

Ile Gly Val Gly Leu Leu Ile Leu Ile Thr Leu Phe Thr Leu Thr Pro

825 830 835

ggg tat aag acc ctc ctc ggc cag tgt ctg tgg tgg ttg tgc tat ctc 2899

Gly Tyr Lys Thr Leu Leu Gly Gln Cys Leu Trp Trp Leu Cys Tyr Leu

840 845 850

ctg acc ctg ggg gaa gcc atg att cag gag tgg gta cca ccc atg cag 2947

Leu Thr Leu Gly Glu Ala Met Ile Gln Glu Trp Val Pro Pro Met Gln

855 860 865

gtg cgc ggc ggc cgc gat ggc atc gcg tgg gcc gtc act ata ttc tgc 2995

Val Arg Gly Gly Arg Asp Gly Ile Ala Trp Ala Val Thr Ile Phe Cys

870 875 880 885

ccg ggt gtg gtg ttt gac att acc aaa tgg ctt ttg gcg ttg ctt ggg 3043

Pro Gly Val Val Phe Asp Ile Thr Lys Trp Leu Leu Ala Leu Leu Gly

890 895 900

cct gct tac ctc tta agg gcc gct ttg aca cat gtg ccg tac ttc gtc 3091

Pro Ala Tyr Leu Leu Arg Ala Ala Leu Thr His Val Pro Tyr Phe Val

905 910 915

aga gct cac gct ctg ata agg gta tgc gct ttg gtg aag cag ctc gcg 3139

Arg Ala His Ala Leu Ile Arg Val Cys Ala Leu Val Lys Gln Leu Ala

920 925 930

ggg ggt agg tat gtt cag gtg gcg cta ttg gcc ctt ggc agg tgg act 3187

Gly Gly Arg Tyr Val Gln Val Ala Leu Leu Ala Leu Gly Arg Trp Thr

935 940 945

ggc acc tac atc tat gac cac ctc aca cct atg tcg gac tgg gcc gct 3235

Gly Thr Tyr Ile Tyr Asp His Leu Thr Pro Met Ser Asp Trp Ala Ala

950 955 960 965

agc ggc ctg cgc gac tta gcg gtc gcc gtg gaa ccc atc atc ttc agt 3283

Ser Gly Leu Arg Asp Leu Ala Val Ala Val Glu Pro Ile Ile Phe Ser

970 975 980

ccg atg gag aag aag gtc atc gtc tgg gga gcg gag acg gct gca tgt 3331

Pro Met Glu Lys Lys Val Ile Val Trp Gly Ala Glu Thr Ala Ala Cys

985 990 995

ggg gac att cta cat gga ctt ccc gtg tcc gcc cga ctc ggc cag gag 3379

Gly Asp Ile Leu His Gly Leu Pro Val Ser Ala Arg Leu Gly Gln Glu

1000 1005 1010

atc ctc ctc ggc cca gct gat ggc tac acc tcc aag ggg tgg aag ctc 3427

Ile Leu Leu Gly Pro Ala Asp Gly Tyr Thr Ser Lys Gly Trp Lys Leu

1015 1020 1025

ctt gct ccc atc act gct tat gcc cag caa aca cga ggc ctc ctg ggc 3475

Leu Ala Pro Ile Thr Ala Tyr Ala Gln Gln Thr Arg Gly Leu Leu Gly

1030 1035 1040 1045

gcc ata gtg gtg agt atg acg ggg cgt gac agg aca gaa cag gcc ggg 3523

Ala Ile Val Val Ser Met Thr Gly Arg Asp Arg Thr Glu Gln Ala Gly

1050 1055 1060

gaa gtc caa atc ctg tcc aca gtc tct cag tcc ttc ctc gga aca acc 3571

Glu Val Gln Ile Leu Ser Thr Val Ser Gln Ser Phe Leu Gly Thr Thr

1065 1070 1075

atc tcg ggg gtt ttg tgg act gtt tac cac gga gct ggc aac aag act 3619

Ile Ser Gly Val Leu Trp Thr Val Tyr His Gly Ala Gly Asn Lys Thr

1080 1085 1090

cta gcc ggc tta cgg ggt ccg gtc acg cag atg tac tcg agt gct gag 3667

Leu Ala Gly Leu Arg Gly Pro Val Thr Gln Met Tyr Ser Ser Ala Glu

1095 1100 1105

ggg gac ttg gta ggc tgg ccc agc ccc cct ggg acc aag tct ttg gag 3715

Gly Asp Leu Val Gly Trp Pro Ser Pro Pro Gly Thr Lys Ser Leu Glu

1110 1115 1120 1125

ccg tgc aag tgt gga gcc gtc gac cta tat ctg gtc acg cgg aac gct 3763

Pro Cys Lys Cys Gly Ala Val Asp Leu Tyr Leu Val Thr Arg Asn Ala

1130 1135 1140

gat gtc atc ccg gct cgg aga cgc ggg gac aag cgg gga gca ttg ctc 3811

Asp Val Ile Pro Ala Arg Arg Arg Gly Asp Lys Arg Gly Ala Leu Leu

1145 1150 1155

tcc ccg aga ccc att tcg acc ttg aag ggg tcc tcg ggg ggg ccg gtg 3859

Ser Pro Arg Pro Ile Ser Thr Leu Lys Gly Ser Ser Gly Gly Pro Val

1160 1165 1170

ctc tgc cct agg ggc cac gtc gtt ggg ctc ttc cga gca gct gtg tgc 3907

Leu Cys Pro Arg Gly His Val Val Gly Leu Phe Arg Ala Ala Val Cys

1175 1180 1185

tct cgg ggc gtg gcc aaa tcc atc gat ttc atc ccc gtt gag aca ctc 3955

Ser Arg Gly Val Ala Lys Ser Ile Asp Phe Ile Pro Val Glu Thr Leu

1190 1195 1200 1205

gac gtt gtt aca agg tct ccc act ttc agt gac aac agc acg cca ccg 4003

Asp Val Val Thr Arg Ser Pro Thr Phe Ser Asp Asn Ser Thr Pro Pro

1210 1215 1220

gct gtg ccc cag acc tat cag gtc ggg tac ttg cat gct cca act ggc 4051

Ala Val Pro Gln Thr Tyr Gln Val Gly Tyr Leu His Ala Pro Thr Gly

1225 1230 1235

agt gga aag agc acc aag gtc cct gtc gcg tat gcc gcc cag ggg tac 4099

Ser Gly Lys Ser Thr Lys Val Pro Val Ala Tyr Ala Ala Gln Gly Tyr

1240 1245 1250

aaa gta cta gtg ctt aac ccc tcg gta gct gcc acc ctg ggg ttt ggg 4147

Lys Val Leu Val Leu Asn Pro Ser Val Ala Ala Thr Leu Gly Phe Gly

1255 1260 1265

gcg tac cta tcc aag gca cat ggc atc aat ccc aac att agg act gga 4195

Ala Tyr Leu Ser Lys Ala His Gly Ile Asn Pro Asn Ile Arg Thr Gly

1270 1275 1280 1285

gtc agg acc gtg atg acc ggg gag gcc atc acg tac tcc aca tat ggc 4243

Val Arg Thr Val Met Thr Gly Glu Ala Ile Thr Tyr Ser Thr Tyr Gly

1290 1295 1300

aaa ttt ctc gcc gat ggg ggc tgc gct agc ggc gcc tat gac atc atc 4291

Lys Phe Leu Ala Asp Gly Gly Cys Ala Ser Gly Ala Tyr Asp Ile Ile

1305 1310 1315

ata tgc gat gaa tgc cac gct gtg gat gct acc tcc att ctc ggc atc 4339

Ile Cys Asp Glu Cys His Ala Val Asp Ala Thr Ser Ile Leu Gly Ile

1320 1325 1330

gga acg gtc ctt gat caa gca gag aca gcc ggg gtc aga cta act gtg 4387

Gly Thr Val Leu Asp Gln Ala Glu Thr Ala Gly Val Arg Leu Thr Val

1335 1340 1345

ctg gct acg gcc aca ccc ccc ggg tca gtg aca acc ccc cat ccc gat 4435

Leu Ala Thr Ala Thr Pro Pro Gly Ser Val Thr Thr Pro His Pro Asp

1350 1355 1360 1365

ata gaa gag gta ggc ctc ggg cgg gag ggt gag atc ccc ttc tat ggg 4483

Ile Glu Glu Val Gly Leu Gly Arg Glu Gly Glu Ile Pro Phe Tyr Gly

1370 1375 1380

agg gcg att ccc cta tcc tgc atc aag gga ggg aga cac ctg att ttc 4531

Arg Ala Ile Pro Leu Ser Cys Ile Lys Gly Gly Arg His Leu Ile Phe

1385 1390 1395

tgc cac tca aag aaa aag tgt gac gag ctc gcg gcg gcc ctt cgg ggc 4579

Cys His Ser Lys Lys Lys Cys Asp Glu Leu Ala Ala Ala Leu Arg Gly

1400 1405 1410

atg ggc ttg aat gcc gtg gca tac tat aga ggg ttg gac gtc tcc ata 4627

Met Gly Leu Asn Ala Val Ala Tyr Tyr Arg Gly Leu Asp Val Ser Ile

1415 1420 1425

ata cca gct cag gga gat gtg gtg gtc gtc gcc acc gac gcc ctc atg 4675

Ile Pro Ala Gln Gly Asp Val Val Val Val Ala Thr Asp Ala Leu Met

1430 1435 1440 1445

acg ggg tac act gga gac ttt gac tcc gtg atc gac tgc aat gta gcg 4723

Thr Gly Tyr Thr Gly Asp Phe Asp Ser Val Ile Asp Cys Asn Val Ala

1450 1455 1460

gtc acc caa gct gtc gac ttc agc ctg gac ccc acc ttc act ata acc 4771

Val Thr Gln Ala Val Asp Phe Ser Leu Asp Pro Thr Phe Thr Ile Thr

1465 1470 1475

aca cag act gtc cca caa gac gct gtc tca cgc agt cag cgc cgc ggg 4819

Thr Gln Thr Val Pro Gln Asp Ala Val Ser Arg Ser Gln Arg Arg Gly

1480 1485 1490

cgc aca ggt aga gga aga cag ggc act tat agg tat gtt tcc act ggt 4867

Arg Thr Gly Arg Gly Arg Gln Gly Thr Tyr Arg Tyr Val Ser Thr Gly

1495 1500 1505

gaa cga gcc tca gga atg ttt gac agt gta gtg ctt tgt gag tgc tac 4915

Glu Arg Ala Ser Gly Met Phe Asp Ser Val Val Leu Cys Glu Cys Tyr

1510 1515 1520 1525

gac gca ggg gct gcg tgg tac gat ctc aca cca gcg gag acc acc gtc 4963

Asp Ala Gly Ala Ala Trp Tyr Asp Leu Thr Pro Ala Glu Thr Thr Val

1530 1535 1540

agg ctt aga gcg tat ttc aac acg ccc ggc cta ccc gtg tgt caa gac 5011

Arg Leu Arg Ala Tyr Phe Asn Thr Pro Gly Leu Pro Val Cys Gln Asp

1545 1550 1555

cat ctt gaa ttt tgg gag gca gtt ttc acc ggc ctc aca cac ata gac 5059

His Leu Glu Phe Trp Glu Ala Val Phe Thr Gly Leu Thr His Ile Asp

1560 1565 1570

gcc cac ttc ctc tcc caa aca aag caa gcg ggg gag aac ttc gcg tac 5107

Ala His Phe Leu Ser Gln Thr Lys Gln Ala Gly Glu Asn Phe Ala Tyr

1575 1580 1585

cta gta gcc tac caa gct acg gtg tgc gcc aga gcc aag gcc cct ccc 5155

Leu Val Ala Tyr Gln Ala Thr Val Cys Ala Arg Ala Lys Ala Pro Pro

1590 1595 1600 1605

ccg tcc tgg gac gcc atg tgg aag tgc ctg gcc cga ctc aag cct acg 5203

Pro Ser Trp Asp Ala Met Trp Lys Cys Leu Ala Arg Leu Lys Pro Thr

1610 1615 1620

ctt gcg ggc ccc aca cct ctc ctg tac cgt ttg ggc cct att acc aat 5251

Leu Ala Gly Pro Thr Pro Leu Leu Tyr Arg Leu Gly Pro Ile Thr Asn

1625 1630 1635

gag gtc acc ctc aca cac cct ggg acg aag tac atc gcc aca tgc atg 5299

Glu Val Thr Leu Thr His Pro Gly Thr Lys Tyr Ile Ala Thr Cys Met

1640 1645 1650

caa gct gac ctt gag gtc atg acc agc acg tgg gtc cta gct gga gga 5347

Gln Ala Asp Leu Glu Val Met Thr Ser Thr Trp Val Leu Ala Gly Gly

1655 1660 1665

gtc ctg gca gcc gtc gcc gca tat tgc ctg gcg act gga tgc gtt tcc 5395

Val Leu Ala Ala Val Ala Ala Tyr Cys Leu Ala Thr Gly Cys Val Ser

1670 1675 1680 1685

atc atc ggc cgc ttg cac gtc aac cag cga gtc gtc gtt gcg ccg gat 5443

Ile Ile Gly Arg Leu His Val Asn Gln Arg Val Val Val Ala Pro Asp

1690 1695 1700

aag gag gtc ctg tat gag gct ttt gat gag atg gag gaa tgc gcc tct 5491

Lys Glu Val Leu Tyr Glu Ala Phe Asp Glu Met Glu Glu Cys Ala Ser

1705 1710 1715

agg gcg gct ctc atc gaa gag ggg cag cgg ata gcc gag atg ttg aag 5539

Arg Ala Ala Leu Ile Glu Glu Gly Gln Arg Ile Ala Glu Met Leu Lys

1720 1725 1730

tcc aag atc caa ggc ttg ctg cag cag gcc tct aag cag gcc cag gac 5587

Ser Lys Ile Gln Gly Leu Leu Gln Gln Ala Ser Lys Gln Ala Gln Asp

1735 1740 1745

ata caa ccc gct atg cag gct tca tgg ccc aaa gtg gaa caa ttt tgg 5635

Ile Gln Pro Ala Met Gln Ala Ser Trp Pro Lys Val Glu Gln Phe Trp

1750 1755 1760 1765

gcc aga cac atg tgg aac ttc att agc ggc atc caa tac ctc gca gga 5683

Ala Arg His Met Trp Asn Phe Ile Ser Gly Ile Gln Tyr Leu Ala Gly

1770 1775 1780

ttg tca aca ctg cca ggg aac ccc gcg gtg gct tcc atg atg gca ttc 5731

Leu Ser Thr Leu Pro Gly Asn Pro Ala Val Ala Ser Met Met Ala Phe

1785 1790 1795

agt gcc gcc ctc acc agt ccg ttg tcg acc agt acc acc atc ctt ctc 5779

Ser Ala Ala Leu Thr Ser Pro Leu Ser Thr Ser Thr Thr Ile Leu Leu

1800 1805 1810

aac atc atg gga ggc tgg tta gcg tcc cag atc gca cca ccc gcg ggg 5827

Asn Ile Met Gly Gly Trp Leu Ala Ser Gln Ile Ala Pro Pro Ala Gly

1815 1820 1825

gcc acc ggc ttt gtc gtc agt ggc ctg gtg ggg gct gcc gtg ggc agc 5875

Ala Thr Gly Phe Val Val Ser Gly Leu Val Gly Ala Ala Val Gly Ser

1830 1835 1840 1845

ata ggc ctg ggt aag gtg ctg gtg gac atc ctg gca gga tat ggt gcg 5923

Ile Gly Leu Gly Lys Val Leu Val Asp Ile Leu Ala Gly Tyr Gly Ala

1850 1855 1860

ggc att tcg ggg gcc ctc gtc gca ttc aag atc atg tct ggc gag aag 5971

Gly Ile Ser Gly Ala Leu Val Ala Phe Lys Ile Met Ser Gly Glu Lys

1865 1870 1875

ccc tct atg gaa gat gtc atc aat cta ctg cct ggg atc ctg tct ccg 6019

Pro Ser Met Glu Asp Val Ile Asn Leu Leu Pro Gly Ile Leu Ser Pro

1880 1885 1890

gga gcc ctg gtg gtg ggg gtc atc tgc gcg gcc att ctg cgc cgc cac 6067

Gly Ala Leu Val Val Gly Val Ile Cys Ala Ala Ile Leu Arg Arg His

1895 1900 1905

gtg gga ccg ggg gag ggc gcg gtc caa tgg atg aac agg ctt att gcc 6115

Val Gly Pro Gly Glu Gly Ala Val Gln Trp Met Asn Arg Leu Ile Ala

1910 1915 1920 1925

ttt gct tcc aga gga aac cac gtc gcc cct act cac tac gtg acg gag 6163

Phe Ala Ser Arg Gly Asn His Val Ala Pro Thr His Tyr Val Thr Glu

1930 1935 1940

tcg gat gcg tcg cag cgt gtg acc caa cta ctt ggc tct ctt act ata 6211

Ser Asp Ala Ser Gln Arg Val Thr Gln Leu Leu Gly Ser Leu Thr Ile

1945 1950 1955

acc agc cta ctc aga aga ctc cac aat tgg ata act gag gac tgc ccc 6259

Thr Ser Leu Leu Arg Arg Leu His Asn Trp Ile Thr Glu Asp Cys Pro

1960 1965 1970

atc cca tgc tcc gga tcc tgg ctc cgc gac gtg tgg gac tgg gtt tgc 6307

Ile Pro Cys Ser Gly Ser Trp Leu Arg Asp Val Trp Asp Trp Val Cys

1975 1980 1985

acc atc ttg aca gac ttc aaa aat tgg ctg acc tct aaa ttg ttc ccc 6355

Thr Ile Leu Thr Asp Phe Lys Asn Trp Leu Thr Ser Lys Leu Phe Pro

1990 1995 2000 2005

aag ctg ccc ggc ctc ccc ttc atc tct tgt caa aag ggg tac aag ggt 6403

Lys Leu Pro Gly Leu Pro Phe Ile Ser Cys Gln Lys Gly Tyr Lys Gly

2010 2015 2020

gtg tgg gcc ggc act ggc atc atg acc acg cgc tgc cct tgc ggc gcc 6451

Val Trp Ala Gly Thr Gly Ile Met Thr Thr Arg Cys Pro Cys Gly Ala

2025 2030 2035

aac atc tct ggc aat gtc cgc ctg ggc tct atg agg atc aca ggg cct 6499

Asn Ile Ser Gly Asn Val Arg Leu Gly Ser Met Arg Ile Thr Gly Pro

2040 2045 2050

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Lys Thr Cys Met Asn Thr Trp Gln Gly Thr Phe Pro Ile Asn Cys Tyr

2055 2060 2065

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2070 2075 2080 2085

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Ile Trp Arg Val Ala Ala Ser Glu Tyr Ala Glu Val Thr Gln His Gly

2090 2095 2100

tcg tac tcc tat gta aca gga ctg acc act gac aat ctg aaa att cct 6691

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2105 2110 2115

tgc caa cta cct tct cca gag ttt ttc tcc tgg gtg gac ggt gtg cag 6739

Cys Gln Leu Pro Ser Pro Glu Phe Phe Ser Trp Val Asp Gly Val Gln

2120 2125 2130

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2135 2140 2145

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Ser Phe Cys Val Gly Leu Asn Ser Tyr Ala Val Gly Ser Gln Leu Pro

2150 2155 2160 2165

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Cys Glu Pro Glu Pro Asp Ala Asp Val Leu Arg Ser Met Leu Thr Asp

2170 2175 2180

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Pro Pro His Ile Thr Ala Glu Thr Ala Ala Arg Arg Leu Ala Arg Gly

2185 2190 2195

tca cct cca tct gag gcg agc tcc tca gtg agc cag cta tca gca ccg 6979

Ser Pro Pro Ser Glu Ala Ser Ser Ser Val Ser Gln Leu Ser Ala Pro

2200 2205 2210

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Ser Leu Arg Ala Thr Cys Thr Thr His Ser Asn Thr Tyr Asp Val Asp

2215 2220 2225

atg gtc gat gcc aac ctg ctc atg gag ggc ggt gtg gct cag aca gag 7075

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2230 2235 2240 2245

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2250 2255 2260

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2265 2270 2275

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2280 2285 2290

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Asn Pro Pro Leu Val Glu Ser Trp Arg Arg Pro Asp Tyr Gln Pro Pro

2295 2300 2305

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2310 2315 2320 2325

ccc cca agg aga cgc cgg aca gtg ggt ctg agc gag agc acc ata tca 7363

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2330 2335 2340

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Glu Ala Leu Gln Gln Leu Ala Ile Lys Thr Phe Gly Gln Pro Pro Ser

2345 2350 2355

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Ser Gly Asp Ala Gly Ser Ser Thr Gly Ala Gly Ala Ala Glu Ser Gly

2360 2365 2370

ggt ccg acg tcc cct ggt gag ccg gcc ccc tca gag aca ggt tcc gcc 7507

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2375 2380 2385

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Ser Ser Met Pro Pro Leu Glu Gly Glu Pro Gly Asp Pro Asp Leu Glu

2390 2395 2400 2405

tct gat cag gta gag ctt caa cct ccc ccc cag ggg ggg ggg gta gct 7603

Ser Asp Gln Val Glu Leu Gln Pro Pro Pro Gln Gly Gly Gly Val Ala

2410 2415 2420

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2425 2430 2435

acc acc gtg tgc tgc tcc atg tca tac tcc tgg acc ggg gct cta ata 7699

Thr Thr Val Cys Cys Ser Met Ser Tyr Ser Trp Thr Gly Ala Leu Ile

2440 2445 2450

act ccc tgt agc ccc gaa gag gaa aag ttg cca atc aac cct ttg agt 7747

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2455 2460 2465

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Asn Ser Leu Leu Arg Tyr His Asn Lys Val Tyr Cys Thr Thr Ser Lys

2470 2475 2480 2485

agc gcc tca cag agg gct aaa aag gta act ttt gac agg acg caa gtg 7843

Ser Ala Ser Gln Arg Ala Lys Lys Val Thr Phe Asp Arg Thr Gln Val

2490 2495 2500

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2505 2510 2515

tcc aag gtc agc gca agg ctc ctc acc ttg gag gag gcg tgc cag ttg 7939

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2520 2525 2530

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2535 2540 2545

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2550 2555 2560 2565

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Lys Asp Leu Leu Glu Asp Pro Gln Thr Pro Ile Pro Thr Thr Ile Met

2570 2575 2580

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2585 2590 2595

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2600 2605 2610

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2615 2620 2625

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2680 2685 2690

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2695 2700 2705

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2710 2715 2720 2725

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2730 2735 2740

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2745 2750 2755

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2760 2765 2770

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2775 2780 2785

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2790 2795 2800 2805

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2810 2815 2820

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2825 2830 2835

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2840 2845 2850

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2855 2860 2865

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2870 2875 2880 2885

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2890 2895 2900

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2905 2910 2915

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2920 2925 2930

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2935 2940 2945

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2950 2955 2960 2965

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2970 2975 2980

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2985 2990 2995

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3000 3005 3010

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3030

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<210>28

<211>3033

<212>PRT

<213>丙型肝炎病毒

<400>28

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Arg Arg Pro Glu Asp Val Lys Phe Pro Gly Gly Gly Gln Ile Val Gly

20 25 30

Gly Val Tyr Leu Leu Pro Arg Arg Gly Pro Arg Leu Gly Val Arg Thr

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Thr Arg Lys Thr Ser Glu Arg Ser Gln Pro Arg Gly Arg Arg Gln Pro

50 55 60

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65 70 75 80

Arg Pro Trp Pro Leu Tyr Gly Asn Glu Gly Leu Gly Trp Ala Gly Trp

85 90 95

Leu Leu Ser Pro Arg Gly Ser Arg Pro Ser Trp Gly Pro Thr Asp Pro

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Arg His Arg Ser Arg Asn Val Gly Lys Val Ile Asp Thr Leu Thr Cys

115 120 125

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Gly Val Asn Tyr Ala Thr Gly Asn Leu Pro Gly Phe Pro Phe Ser Ile

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195 200 205

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Asp Met Met Met Asn Trp Ser Pro Thr Ala Thr Met Ile Leu Ala Tyr

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Val Met Arg Val Pro Glu Val Ile Ile Asp Ile Val Ser Gly Ala His

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Trp Gly Val Met Phe Gly Leu Ala Tyr Phe Ser Met Gln Gly Ala Trp

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Ala Lys Val Ile Val Ile Leu Leu Leu Ala Ala Gly Val Asp Ala Gly

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Thr Thr Thr Val Gly Gly Ala Val Ala Arg Ser Thr Asn Val Ile Ala

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Gly Val Phe Ser His Gly Pro Gln Gln Asn Ile Gln Leu Ile Asn Thr

405 410 415

Asn Gly Ser Trp His Ile Asn Arg Thr Ala Leu Asn Cys Asn Asp Ser

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Leu Asn Thr Gly Phe Leu Ala Ala Leu Phe Tyr Thr Asn Arg Phe Asn

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Ser Ser Gly Cys Pro Gly Arg Leu Ser Ala Cys Arg Asn Ile Glu Ala

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Pro Glu Asp Met Arg Pro Tyr Cys Trp His Tyr Pro Pro Lys Pro Cys

485 490 495

Gly Val Val Pro Ala Arg Ser Val Cys Gly Pro Val Tyr Cys Phe Thr

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Pro Ser Pro Val Val Val Gly Thr Thr Asp Arg Arg Gly Val Pro Thr

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530 535 540

Arg Pro Pro Gln Gly Ser Trp Phe Gly Cys Thr Trp Met Asn Ser Thr

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Ala Cys Leu Trp Met Leu Ile Leu Leu Gly Gln Ala Glu Ala Ala Leu

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Glu Lys Leu Val Val Leu His Ala Ala Ser Ala Ala Asn Cys His Gly

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Leu Ala Leu Leu Gly Pro Ala Tyr Leu Leu Arg Ala Ala Leu Thr His

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Val Pro Tyr Phe Val Arg Ala His Ala Leu Ile Arg Val Cys Ala Leu

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Val Thr Arg Asn Ala Asp Val Ile Pro Ala Arg Arg Arg Gly Asp Lys

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Arg Gly Ala Leu Leu Ser Pro Arg Pro Ile Ser Thr Leu Lys Gly Ser

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Ser Gly Gly Pro Val Leu Cys Pro Arg Gly His Val Val Gly Leu Phe

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Arg Ala Ala Val Cys Ser Arg Gly Val Ala Lys Ser Ile Asp Phe Ile

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Leu Cys Glu Cys Tyr Asp Ala Gly Ala Ala Trp Tyr Asp Leu Thr Pro

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Ala Lys Ala Pro Pro Pro Ser Trp Asp Ala Met Trp Lys Cys Leu Ala

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Arg Leu Lys Pro Thr Leu Ala Gly Pro Thr Pro Leu Leu Tyr Arg Leu

1620 1625 1630

Gly Pro Ile Thr Asn Glu Val Thr Leu Thr His Pro Gly Thr Lys Tyr

1635 1640 1645

Ile Ala Thr Cys Met Gln Ala Asp Leu Glu Val Met Thr Ser Thr Trp

1650 1655 1660

Val Leu Ala Gly Gly Val Leu Ala Ala Val Ala Ala Tyr Cys Leu Ala

1665 1670 1675 1680

Thr Gly Cys Val Ser Ile Ile Gly Arg Leu His Val Asn Gln Arg Val

1685 1690 1695

Val Val Ala Pro Asp Lys Glu Val Leu Tyr Glu Ala Phe Asp Glu Met

1700 1705 1710

Glu Glu Cys Ala Ser Arg Ala Ala Leu Ile Glu Glu Gly Gln Arg Ile

1715 1720 1725

Ala Glu Met Leu Lys Ser Lys Ile Gln Gly Leu Leu Gln Gln Ala Ser

1730 1735 1740

Lys Gln Ala Gln Asp Ile Gln Pro Ala Met Gln Ala Ser Trp Pro Lys

1745 1750 1755 1760

Val Glu Gln Phe Trp Ala Arg His Met Trp Asn Phe Ile Ser Gly Ile

1765 1770 1775

Gln Tyr Leu Ala Gly Leu Ser Thr Leu Pro Gly Asn Pro Ala Val Ala

1780 1785 1790

Ser Met Met Ala Phe Ser Ala Ala Leu Thr Ser Pro Leu Ser Thr Ser

1795 1800 1805

Thr Thr Ile Leu Leu Asn Ile Met Gly Gly Trp Leu Ala Ser Gln Ile

1810 1815 1820

Ala Pro Pro Ala Gly Ala Thr Gly Phe Val Val Ser Gly Leu Val Gly

1825 1830 1835 1840

Ala Ala Val Gly Ser Ile Gly Leu Gly Lys Val Leu Val Asp Ile Leu

1845 1850 1855

Ala Gly Tyr Gly Ala Gly Ile Ser Gly Ala Leu Val Ala Phe Lys Ile

1860 1865 1870

Met Ser Gly Glu Lys Pro Ser Met Glu Asp Val Ile Asn Leu Leu Pro

1875 1880 1885

Gly Ile Leu Ser Pro Gly Ala Leu Val Val Gly Val Ile Cys Ala Ala

1890 1895 1900

Ile Leu Arg Arg His Val Gly Pro Gly Glu Gly Ala Val Gln Trp Met

1905 1910 1915 1920

Asn Arg Leu Ile Ala Phe Ala Ser Arg Gly Asn His Val Ala Pro Thr

1925 1930 1935

His Tyr Val Thr Glu Ser Asp Ala Ser Gln Arg Val Thr Gln Leu Leu

1940 1945 1950

Gly Ser Leu Thr Ile Thr Ser Leu Leu Arg Arg Leu His Asn Trp Ile

1955 1960 1965

Thr Glu Asp Cys Pro Ile Pro Cys Ser Gly Ser Trp Leu Arg Asp Val

1970 1975 1980

Trp Asp Trp Val Cys Thr Ile Leu Thr Asp Phe Lys Asn Trp Leu Thr

1985 1990 1995 2000

Ser Lys Leu Phe Pro Lys Leu Pro Gly Leu Pro Phe Ile Ser Cys Gln

2005 2010 2015

Lys Gly Tyr Lys Gly Val Trp Ala Gly Thr Gly Ile Met Thr Thr Arg

2020 2025 2030

Cys Pro Cys Gly Ala Asn Ile Ser Gly Asn Val Arg Leu Gly Ser Met

2035 2040 2045

Arg Ile Thr Gly Pro Lys Thr Cys Met Asn Thr Trp Gln Gly Thr Phe

2050 2055 2060

Pro Ile Asn Cys Tyr Thr Glu Gly Gln Cys Ala Pro Lys Pro Pro Thr

2065 2070 2075 2080

Asn Tyr Lys Thr Ala Ile Trp Arg Val Ala Ala Ser Glu Tyr Ala Glu

2085 2090 2095

Val Thr Gln His Gly Ser Tyr Ser Tyr Val Thr Gly Leu Thr Thr Asp

2100 2105 2110

Asn Leu Lys Ile Pro Cys Gln Leu Pro Ser Pro Glu Phe Phe Ser Trp

2115 2120 2125

Val Asp Gly Val Gln Ile His Arg Phe Ala Pro Thr Pro Lys Pro Phe

2130 2135 2140

Phe Arg Asp Glu Val Ser Phe Cys Val Gly Leu Asn Ser Tyr Ala Val

2145 2150 2155 2160

Gly Ser Gln Leu Pro Cys Glu Pro Glu Pro Asp Ala Asp Val Leu Arg

2165 2170 2175

Ser Met Leu Thr Asp Pro Pro His Ile Thr Ala Glu Thr Ala Ala Arg

2180 2185 2190

Arg Leu Ala Arg Gly Ser Pro Pro Ser Glu Ala Ser Ser Ser Val Ser

2195 2200 2205

Gln Leu Ser Ala Pro Ser Leu Arg Ala Thr Cys Thr Thr His Ser Asn

2210 2215 2220

Thr Tyr Asp Val Asp Met Val Asp Ala Asn Leu Leu Met Glu Gly Gly

2225 2230 2235 2240

Val Ala Gln Thr Glu Pro Glu Ser Arg Val Pro Val Leu Asp Phe Leu

2245 2250 2255

Glu Pro Met Ala Glu Glu Glu Ser Asp Leu Glu Pro Ser Ile Pro Ser

2260 2265 2270

Glu Cys Met Leu Pro Arg Ser Gly Phe Pro Arg Ala Leu Pro Ala Trp

2275 2280 2285

Ala Arg Pro Asp Tyr Asn Pro Pro Leu Val Glu Ser Trp Arg Arg Pro

2290 2295 2300

Asp Tyr Gln Pro Pro Thr Val Ala Gly Cys Ala Leu Pro Pro Pro Lys

2305 2310 2315 2320

Lys Ala Pro Thr Pro Pro Pro Arg Arg Arg Arg Thr Val Gly Leu Ser

2325 2330 2335

Glu Ser Thr Ile Ser Glu Ala Leu Gln Gln Leu Ala Ile Lys Thr Phe

2340 2345 2350

Gly Gln Pro Pro Ser Ser Gly Asp Ala Gly Ser Ser Thr Gly Ala Gly

2355 2360 2365

Ala Ala Glu Ser Gly Gly Pro Thr Ser Pro Gly Glu Pro Ala Pro Ser

2370 2375 2380

Glu Thr Gly Ser Ala Ser Ser Met Pro Pro Leu Glu Gly Glu Pro Gly

2385 2390 2395 2400

Asp Pro Asp Leu Glu Ser Asp Gln Val Glu Leu Gln Pro Pro Pro Gln

2405 2410 2415

Gly Gly Gly Val Ala Pro Gly Ser Gly Ser Gly Ser Trp Ser Thr Cys

2420 2425 2430

Ser Glu Glu Asp Asp Thr Thr Val Cys Cys Ser Met Ser Tyr Ser Trp

2435 2440 2445

Thr Gly Ala Leu Ile Thr Pro Cys Ser Pro Glu Glu Glu Lys Leu Pro

2450 2455 2460

Ile Asn Pro Leu Ser Asn Ser Leu Leu Arg Tyr His Asn Lys Val Tyr

2465 2470 2475 2480

Cys Thr Thr Ser Lys Ser Ala Ser Gln Arg Ala Lys Lys Val Thr Phe

2485 2490 2495

Asp Arg Thr Gln Val Leu Asp Ala His Tyr Asp Ser Val Leu Lys Asp

2500 2505 2510

Ile Lys Leu Ala Ala Ser Lys Val Ser Ala Arg Leu Leu Thr Leu Glu

2515 2520 2525

Glu Ala Cys Gln Leu Thr Pro Pro His Ser Ala Arg Ser Lys Tyr Gly

2530 2535 2540

Phe Gly Ala Lys Glu Val Arg Ser Leu Ser Gly Arg Ala Val Asn His

2545 2550 2555 2560

Ile Lys Ser Val Trp Lys Asp Leu Leu Glu Asp Pro Gln Thr ProIle

2565 2570 2575

Pro Thr Thr Ile Met Ala Lys Asn Glu Val Phe Cys Val Asp Pro Ala

2580 2585 2590

Lys Gly Gly Lys Lys Pro Ala Arg Leu Ile Val Tyr Pro Asp Leu Gly

2595 2600 2605

Val Arg Val Cys Glu Lys Met Ala Leu Tyr Asp Ile Thr Gln Lys Leu

2610 2615 2620

Pro Gln Ala Val Met Gly Ala Ser Tyr Gly Phe Gln Tyr Ser Pro Ala

2625 2630 2635 2640

Gln Arg Val Glu Tyr Leu Leu Lys Ala Trp Ala Glu Lys Lys Asp Pro

2645 2650 2655

Met Gly Phe Ser Tyr Asp Thr Arg Cys Phe Asp Ser Thr Val Thr Glu

2660 2665 2670

Arg Asp Ile Arg Thr Glu Glu Ser Ile Tyr Gln Ala Cys Ser Leu Pro

2675 2680 2685

Glu Glu Ala Arg Thr Ala Ile His Ser Leu Thr Glu Arg Leu Tyr Val

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Gly Gly Pro Met Phe Asn Ser Lys Gly Gln Thr Cys Gly Tyr Arg Arg

2705 2710 2715 2720

Cys Arg Ala Ser Gly Val Leu Thr Thr Ser Met Gly Asn Thr Ile Thr

2725 2730 2735

Cys Tyr Val Lys Ala Leu Ala Ala Cys Lys Ala Ala Gly Ile Val Ala

2740 2745 2750

Pro Thr Met Leu Val Cys Gly Asp Asp Leu Val Val Ile Ser Glu Ser

2755 2760 2765

Gln Gly Thr Glu Glu Asp Glu Arg Asn Leu Arg Ala Phe Thr Glu Ala

2770 2775 2780

Met Thr Arg Tyr Ser Ala Pro Pro Gly Asp Pro Pro Arg Pro Glu Tyr

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Asp Leu Glu Leu Ile Thr Ser Cys Ser Ser Asn Val Ser Val Ala Leu

2805 2810 2815

Gly Pro Arg Gly Arg Arg Arg Tyr Tyr Leu Thr Arg Asp Pro Thr Thr

2820 2825 2830

Pro Leu Ala Arg Ala Ala Trp Glu Thr Val Arg His Ser Pro Ile Asn

2835 2840 2845

Ser Trp Leu Gly Asn Ile Ile Gln Tyr Ala Pro Thr Ile Trp Val Arg

2850 2855 2860

Met Val Leu Met Thr His Phe Phe Ser Ile Leu Met Val Gln Asp Thr

2865 2870 2875 2880

Leu Asp Gln Asn Leu Asn Phe Glu Met Tyr Gly Ser Val Tyr Ser Val

2885 2890 2895

Asn Pro Leu Asp Leu Pro Ala Ile Ile Glu Arg Leu His Gly Leu Asp

2900 2905 2910

Ala Phe Ser Met His Thr Tyr Ser His His Glu Leu Thr Arg Val Ala

2915 2920 2925

Ser Ala Leu Arg Lys Leu Gly Ala Pro Pro Leu Arg Val Trp Lys Ser

2930 2935 2940

Arg Ala Arg Ala Val Arg Ala Ser Leu Ile Ser Arg Gly Gly Lys Ala

2945 2950 2955 2960

Ala Val Cys Gly Arg Tyr Leu Phe Asn Trp Ala Val Lys Thr Lys Leu

2965 2970 2975

Lys Leu Thr Pro Leu Pro Glu Ala Arg Leu Leu Asp Leu Ser Ser Trp

2980 2985 2990

Phe Thr Val Gly Ala Gly Gly Gly Asp Ile Phe His Ser Val Ser Arg

2995 3000 3005

Ala Arg Pro Arg Ser Leu Leu Phe Gly Leu Leu Leu Leu Phe Val Gly

3010 3015 3020

Val Gly Leu Phe Leu Leu Pro Ala Arg

3025 3030

<210>29

<211>9678

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：嵌合DNA

<400>29

acctgcccct aataggggcg acactccgcc atgaatcact cccctgtgag gaactactgt 60

cttcacgcag aaagcgccta gccatggcgt tagtatgagt gtcgtacagc ctccaggccc 120

ccccctcccg ggagagccat agtggtctgc ggaaccggtg agtacaccgg aattgccggg 180

aagactgggt cctttcttgg ataaacccac tctatgcccg gccatttggg cgtgcccccg 240

caagactgct agccgagtag cgttgggttg cgaaaggcct tgtggtactg cctgataggg 300

tgcttgcgag tgccccggga ggtctcgtag accgtgcacc atgagcacaa atcctaaacc 360

tcaaagaaaa accaaaagaa acaccaaccg tcgcccacaa gacgttaagt ttccgggcgg 420

cggccagatc gttggcggag tatacttgtt gccgcgcagg ggccccaggt tgggtgtgcg 480

cgcgacaagg aagacttcgg agcggtccca gccacgtgga aggcgccagc ccatccctaa 540

agatcggcgc tccactggca aatcctgggg aaaaccagga tacccctggc ccctatacgg 600

gaatgaggga ctcggctggg caggatggct cctgtccccc cgaggttccc gtccctcttg 660

gggccccaat gacccccggc ataggtcgcg caacgtgggt aaggtcatcg ataccctaac 720

gtgcggcttt gccgacctca tggggtacat ccctgtcgtg ggcgccccgc tcggcggcgt 780

cgccagagct ctcgcgcatg gcgtgagagt cctggaggac ggggttaatt ttgcaacagg 840

gaacttaccc ggttgctcct tttctatctt cttgctggcc ctgctgtcct gcatcaccac 900

cccggtctcc gctgccgaag tgaagaacat cagtaccggc tacatggtga ctaacgactg 960

caccaatgac agcattacct ggcagctcca ggctgctgtc ctccacgtcc ccgggtgcgt 1020

cccgtgcgag aaagtgggga atgcatctca gtgctggata ccggtctcac cgaatgtggc 1080

cgtgcagcgg cccggcgccc tcacgcaggg cttgcggacg cacatcgaca tggttgtgat 1140

gtccgccacg ctctgctctg ccctctacgt gggggacctc tgcggtgggg tgatgctcgc 1200

agcccaaatg ttcattgtct cgccgcagca ccactggttt gtccaagact gcaattgctc 1260

catctaccct ggtaccatca ctggacaccg catggcatgg gacatgatga tgaactggtc 1320

gcccacggct accatgatct tggcgtacgc gatgcgtgtc cccgaggtca ttatagacat 1380

cattagcggg gctcattggg gcgtcatgtt cggcttggcc tacttctcta tgcagggagc 1440

gtgggcgaaa gtcgttgtca tccttctgtt ggccgccggg gtggacgcgc gcacccatac 1500

tgttgggggt tctgccgcgc agaccaccgg gcgcctcacc agcttatttg acatgggccc 1560

caggcagaaa atccagctcg ttaacaccaa tggcagctgg cacatcaacc gcaccgccct 1620

gaactgcaat gactccttgc acaccggctt tatcgcgtct ctgttctaca cccacagctt 1680

caactcgtca ggatgtcccg aacgcatgtc cgcctgccgc agtatcgagg ccttccgggt 1740

gggatggggc gccttgcaat atgaggataa tgtcaccaat ccagaggata tgagacccta 1800

ttgctggcac tacccaccaa ggcagtgtgg cgtggtctcc gcgaagactg tgtgtggccc 1860

agtgtactgt ttcaccccca gcccagtggt agtgggcacg accgacaggc ttggagcgcc 1920

cacttacacg tggggggaga atgagacaga tgtcttccta ttgaacagca ctcgaccacc 1980

gctggggtca tggttcggct gcacgtggat gaactcttct ggctacacca agacttgcgg 2040

cgcaccaccc tgccgtacta gagctgactt caacgccagc acggacctgt tgtgccccac 2100

ggactgtttt aggaagcatc ctgataccac ttacctcaaa tgcggctctg ggccctggct 2160

cacgccaagg tgcctgatcg actaccccta caggctctgg cattacccct gcacagttaa 2220

ctataccatc ttcaaaataa ggatgtatgt gggaggggtt gagcacaggc tcacggctgc 2280

atgcaatttc actcgtgggg atcgttgcaa cttggaggac agagacagaa gtcaactgtc 2340

tcctttgttg cactccacca cggaatgggc cattttacct tgctcttact cggacctgcc 2400

cgccttgtcg actggtcttc tccacctcca ccaaaacatc gtggacgtac aattcatgta 2460

tggcctatca cctgccctca caaaatacat cgtccgatgg gagtgggtaa tactcttatt 2520

cctgctctta gcggacgcca gggtttgcgc ctgcttatgg atgctcatct tgttgggcca 2580

ggccgaagca gcactagaga agctggtcat cttgcacgct gcgagcgcag ctagctgcaa 2640

tggcttccta tattttgtca tctttttcgt ggctgcttgg tacatcaagg gtcgggtagt 2700

ccccttagct acctattccc tcactggcct gtggtccttt agcctactgc tcctagcatt 2760

gccccaacag gcttatgctt atgacgcatc tgtgcatggc cagataggag cggctctgct 2820

ggtaatgatc accctcttca cactcacccc ggggtataag accctcctcg gccagtgtct 2880

gtggtggttg tgctatctcc tgaccctggg ggaagccatg attcaggagt gggtaccacc 2940

catgcaggtg cgcggcggcc gcgatggcat cgcgtgggcc gtcactatat tctgcccggg 3000

tgtggtgttt gacattacca aatggctttt ggcgttgctt gggcctgctt acctcttaag 3060

ggccgctttg acacatgtgc cgtacttcgt cagagctcac gctctgataa gggtatgcgc 3120

tttggtgaag cagctcgcgg ggggtaggta tgttcaggtg gcgctattgg cccttggcag 3180

gtggactggc acctacatct atgaccacct cacacctatg tcggactggg ccgctagcgg 3240

cctgcgcgac ttagcggtcg ccgtggaacc catcatcttc agtccgatgg agaagaaggt 3300

catcgtctgg ggagcggaga cggctgcatg tggggacatt ctacatggac ttcccgtgtc 3360

cgcccgactc ggccaggaga tcctcctcgg cccagctgat ggctacacct ccaaggggtg 3420

gaagctcctt gctcccatca ctgcttatgc ccagcaaaca cgaggcctcc tgggcgccat 3480

agtggtgagt atgacggggc gtgacaggac agaacaggcc ggggaagtcc aaatcctgtc 3540

cacagtctct cagtccttcc tcggaacaac catctcgggg gttttgtgga ctgtttacca 3600

cggagctggc aacaagactc tagccggctt acggggtccg gtcacgcaga tgtactcgag 3660

tgctgagggg gacttggtag gctggcccag cccccctggg accaagtctt tggagccgtg 3720

caagtgtgga gccgtcgacc tatatctggt cacgcggaac gctgatgtca tcccggctcg 3780

gagacgcggg gacaagcggg gagcattgct ctccccgaga cccatttcga ccttgaaggg 3840

gtcctcgggg gggccggtgc tctgccctag gggccacgtc gttgggctct tccgagcagc 3900

tgtgtgctct cggggcgtgg ccaaatccat cgatttcatc cccgttgaga cactcgacgt 3960

tgttacaagg tctcccactt tcagtgacaa cagcacgcca ccggctgtgc cccagaccta 4020

tcaggtcggg tacttgcatg ctccaactgg cagtggaaag agcaccaagg tccctgtcgc 4080

gtatgccgcc caggggtaca aagtactagt gcttaacccc tcggtagctg ccaccctggg 4140

gtttggggcg tacctatcca aggcacatgg catcaatccc aacattagga ctggagtcag 4200

gaccgtgatg accggggagg ccatcacgta ctccacatat ggcaaatttc tcgccgatgg 4260

gggctgcgct agcggcgcct atgacatcat catatgcgat gaatgccacg ctgtggatgc 4320

tacctccatt ctcggcatcg gaacggtcct tgatcaagca gagacagccg gggtcagact 4380

aactgtgctg gctacggcca caccccccgg gtcagtgaca accccccatc ccgatataga 4440

agaggtaggc ctcgggcggg agggtgagat ccccttctat gggagggcga ttcccctatc 4500

ctgcatcaag ggagggagac acctgatttt ctgccactca aagaaaaagt gtgacgagct 4560

cgcggcggcc cttcggggca tgggcttgaa tgccgtggca tactatagag ggttggacgt 4620

ctccataata ccagctcagg gagatgtggt ggtcgtcgcc accgacgccc tcatgacggg 4680

gtacactgga gactttgact ccgtgatcga ctgcaatgta gcggtcaccc aagctgtcga 4740

cttcagcctg gaccccacct tcactataac cacacagact gtcccacaag acgctgtctc 4800

acgcagtcag cgccgcgggc gcacaggtag aggaagacag ggcacttata ggtatgtttc 4860

cactggtgaa cgagcctcag gaatgtttga cagtgtagtg ctttgtgagt gctacgacgc 4920

aggggctgcg tggtacgatc tcacaccagc ggagaccacc gtcaggctta gagcgtattt 4980

caacacgccc ggcctacccg tgtgtcaaga ccatcttgaa ttttgggagg cagttttcac 5040

cggcctcaca cacatagacg cccacttcct ctcccaaaca aagcaagcgg gggagaactt 5100

cgcgtaccta gtagcctacc aagctacggt gtgcgccaga gccaaggccc ctcccccgtc 5160

ctgggacgcc atgtggaagt gcctggcccg actcaagcct acgcttgcgg gccccacacc 5220

tctcctgtac cgtttgggcc ctattaccaa tgaggtcacc ctcacacacc ctgggacgaa 5280

gtacatcgcc acatgcatgc aagctgacct tgaggtcatg accagcacgt gggtcctagc 5340

tggaggagtc ctggcagccg tcgccgcata ttgcctggcg actggatgcg tttccatcat 5400

cggccgcttg cacgtcaacc agcgagtcgt cgttgcgccg gataaggagg tcctgtatga 5460

ggcttttgat gagatggagg aatgcgcctc tagggcggct ctcatcgaag aggggcagcg 5520

gatagccgag atgttgaagt ccaagatcca aggcttgctg cagcaggcct ctaagcaggc 5580

ccaggacata caacccgcta tgcaggcttc atggcccaaa gtggaacaat tttgggccag 5640

acacatgtgg aacttcatta gcggcatcca atacctcgca ggattgtcaa cactgccagg 5700

gaaccccgcg gtggcttcca tgatggcatt cagtgccgcc ctcaccagtc cgttgtcgac 5760

cagtaccacc atccttctca acatcatggg aggctggtta gcgtcccaga tcgcaccacc 5820

cgcgggggcc accggctttg tcgtcagtgg cctggtgggg gctgccgtgg gcagcatagg 5880

cctgggtaag gtgctggtgg acatcctggc aggatatggt gcgggcattt cgggggccct 5940

cgtcgcattc aagatcatgt ctggcgagaa gccctctatg gaagatgtca tcaatctact 6000

gcctgggatc ctgtctccgg gagccctggt ggtgggggtc atctgcgcgg ccattctgcg 6060

ccgccacgtg ggaccggggg agggcgcggt ccaatggatg aacaggctta ttgcctttgc 6120

ttccagagga aaccacgtcg cccctactca ctacgtgacg gagtcggatg cgtcgcagcg 6180

tgtgacccaa ctacttggct ctcttactat aaccagccta ctcagaagac tccacaattg 6240

gataactgag gactgcccca tcccatgctc cggatcctgg ctccgcgacg tgtgggactg 6300

ggtttgcacc atcttgacag acttcaaaaa ttggctgacc tctaaattgt tccccaagct 6360

gcccggcctc cccttcatct cttgtcaaaa ggggtacaag ggtgtgtggg ccggcactgg 6420

catcatgacc acgcgctgcc cttgcggcgc caacatctct ggcaatgtcc gcctgggctc 6480

tatgaggatc acagggccta aaacctgcat gaacacctgg caggggacct ttcctatcaa 6540

ttgctacacg gagggccagt gcgcgccgaa accccccacg aactacaaga ccgccatctg 6600

gagggtggcg gcctcggagt acgcggaggt gacgcagcat gggtcgtact cctatgtaac 6660

aggactgacc actgacaatc tgaaaattcc ttgccaacta ccttctccag agtttttctc 6720

ctgggtggac ggtgtgcaga tccataggtt tgcacccaca ccaaagccgt ttttccggga 6780

tgaggtctcg ttctgcgttg ggcttaattc ctatgctgtc gggtcccagc ttccctgtga 6840

acctgagccc gacgcagacg tattgaggtc catgctaaca gatccgcccc acatcacggc 6900

ggagactgcg gcgcggcgct tggcacgggg atcacctcca tctgaggcga gctcctcagt 6960

gagccagcta tcagcaccgt cgctgcgggc cacctgcacc acccacagca acacctatga 7020

cgtggacatg gtcgatgcca acctgctcat ggagggcggt gtggctcaga cagagcctga 7080

gtccagggtg cccgttctgg actttctcga gccaatggcc gaggaagaga gcgaccttga 7140

gccctcaata ccatcggagt gcatgctccc caggagcggg tttccacggg ccttaccggc 7200

ttgggcacgg cctgactaca acccgccgct cgtggaatcg tggaggaggc cagattacca 7260

accgcccacc gttgctggtt gtgctctccc cccccccaag aaggccccga cgcctccccc 7320

aaggagacgc cggacagtgg gtctgagcga gagcaccata tcagaagccc tccagcaact 7380

ggccatcaag acctttggcc agcccccctc gagcggtgat gcaggctcgt ccacgggggc 7440

gggcgccgcc gaatccggcg gtccgacgtc ccctggtgag ccggccccct cagagacagg 7500

ttccgcctcc tctatgcccc ccctcgaggg ggagcctgga gatccggacc tggagtctga 7560

tcaggtagag cttcaacctc ccccccaggg ggggggggta gctcccggtt cgggctcggg 7620

gtcttggtct acttgctccg aggaggacga taccaccgtg tgctgctcca tgtcatactc 7680

ctggaccggg gctctaataa ctccctgtag ccccgaagag gaaaagttgc caatcaaccc 7740

tttgagtaac tcgctgttgc gataccataa caaggtgtac tgtacaacat caaagagcgc 7800

ctcacagagg gctaaaaagg taacttttga caggacgcaa gtgctcgacg cccattatga 7860

ctcagtctta aaggacatca agctagcggc ttccaaggtc agcgcaaggc tcctcacctt 7920

ggaggaggcg tgccagttga ctccacccca ttctgcaaga tccaagtatg gattcggggc 7980

caaggaggtc cgcagcttgt ccgggagggc cgttaaccac atcaagtccg tgtggaagga 8040

cctcctggaa gacccacaaa caccaattcc cacaaccatc atggccaaaa atgaggtgtt 8100

ctgcgtggac cccgccaagg ggggtaagaa accagctcgc ctcatcgttt accctgacct 8160

cggcgtccgg gtctgcgaga aaatggccct ctatgacatt acacaaaagc ttcctcaggc 8220

ggtaatggga gcttcctatg gcttccagta ctcccctgcc caacgggtgg agtatctctt 8280

gaaagcatgg gcggaaaaga aggaccccat gggtttttcg tatgataccc gatgcttcga 8340

ctcaaccgtc actgagagag acatcaggac cgaggagtcc atataccagg cctgctccct 8400

gcccgaggag gcccgcactg ccatacactc gctgactgag agactttacg taggagggcc 8460

catgttcaac agcaagggtc aaacctgcgg ttacagacgt tgccgcgcca gcggggtgct 8520

aaccactagc atgggtaaca ccatcacatg ctatgtgaaa gccctagcgg cctgcaaggc 8580

tgcggggata gttgcgccca caatgctggt atgcggcgat gacctagtag tcatctcaga 8640

aagccagggg actgaggagg acgagcggaa cctgagagcc ttcacggagg ccatgaccag 8700

gtactctgcc cctcctggtg atccccccag accggaatat gacctggagc taataacatc 8760

ctgttcctca aatgtgtctg tggcgttggg cccgcggggc cgccgcagat actacctgac 8820

cagagaccca accactccac tcgcccgggc tgcctgggaa acagttagac actcccctat 8880

caattcatgg ctgggaaaca tcatccagta tgctccaacc atatgggttc gcatggtcct 8940

aatgacacac ttcttctcca ttctcatggt ccaagacacc ctggaccaga acctcaactt 9000

tgagatgtat ggatcagtat actccgtgaa tcctttggac cttccagcca taattgagag 9060

gttacacggg cttgacgcct tttctatgca cacatactct caccacgaac tgacgcgggt 9120

ggcttcagcc ctcagaaaac ttggggcgcc acccctcagg gtgtggaaga gtcgggctcg 9180

cgcagtcagg gcgtccctca tctcccgtgg agggaaagcg gccgtttgcg gccgatatct 9240

cttcaattgg gcggtgaaga ccaagctcaa actcactcca ttgccggagg cgcgcctact 9300

ggacttatcc agttggttca ccgtcggcgc cggcgggggc gacatttttc acagcgtgtc 9360

gcgcgcccga ccccgctcat tactcttcgg cctactccta cttttcgtag gggtaggcct 9420

cttcctactc cccgctcggt agagcggcac acactaggta cactccatag ctaactgttc 9480

cttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt ttttcttttt tttttttttc 9540

cctctttctt cccttctcat cttattctac tttctttctt ggtggctcca tcttagccct 9600

agtcacggct agctgtgaaa ggtccgtgag ccgcatgact gcagagagtg ccgtaactgg 9660

tctctctgca gatcatgt 9678

<210>30

<211>9666

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：嵌合DNA

<400>30

acctgcccct aataggggcg acactccgcc atgaatcact cccctgtgag gaactactgt 60

cttcacgcag aaagcgccta gccatggcgt tagtatgagt gtcgtacagc ctccaggccc 120

ccccctcccg ggagagccat agtggtctgc ggaaccggtg agtacaccgg aattgccagg 180

acgaccgggt cctttcttgg ataaacccgc tcaatgcctg gagatttggg cgtgcccccg 240

caagactgct agccgagtag tgttgggtcg cgaaaggcct tgtggtactg cctgataggg 300

tgcttgcgag tgccccggga ggtctcgtag accgtgcacc atgagcacga atcctaaacc 360

tcaaagaaaa accaaacgta acaccaaccg tcgcccacag gacgtcaagt tcccgggtgg 420

cggtcagatc gttggtggag tttacttgtt gccgcgcagg ggccctagat tgggtgtgcg 480

cgcgacgagg aagacttccg agcggtcgca acctcgaggt agacgtcagc ctatccccaa 540

ggcacgtcgg cccgagggca ggacctgggc tcagcccggg tacccttggc ccctctatgg 600

caatgagggt tgcgggtggg cgggatggct cctgtctccc cgtggctctc ggcctagctg 660

gggccccaca gacccccggc gtaggtcgcg caatttgggt aaggtcatcg atacccttac 720

gtgcggcttc gccgacctca tggggtacat accgctcgtc ggcgcccctc ttggaggcgc 780

tgccagggcc ctggcgcatg gcgtccgggt tctggaagac ggcgtgaact atgcaacagg 840

gaaccttcct ggttgctctt tctctatctt ccttctggcc ctgctctctt gcctgactgt 900

gcccgcttca gcctaccaag tgcgcaattc ctcggggctt taccatgtca ccaatgattg 960

ccctaactcg agtattgtgt acgaggcggc cgatgccatc ctgcacactc cggggtgtgt 1020

cccttgcgtt cgcgagggta acgcctcgag gtgttgggtg gcggtgaccc ccacggtggc 1080

caccagggac ggcaaactcc ccacaacgca gcttcgacgt catatcgatc tgcttgtcgg 1140

gagcgccacc ctctgctcgg ccctctacgt gggggacctg tgcgggtctg tctttcttgt 1200

tggtcaactg tttaccttct ctcccaggcg ccactggacg acgcaagact gcaattgttc 1260

tatctatccc ggccatataa cgggtcatcg catggcatgg gatatgatga tgaactggtc 1320

ccctacggca gcgttggtgg tagctcagct gctccggatc ccacaagcca tcatggacat 1380

gatcgctggt gctcactggg gagtcctggc gggcatagcg tatttctcca tggtggggaa 1440

ctgggcgaag gtcctggtag tgctgctgct atttgccggc gtcgacgcgg aaacccacgt 1500

caccggggga aatgccggcc gcaccacggc tgggcttgtt ggtctcctta caccaggcgc 1560

caagcagaac atccaactga tcaacaccaa cggcagttgg cacatcaata gcacggcctt 1620

gaattgcaat gaaagcctta acaccggctg gttagcaggg ctcttctatc aacacaaatt 1680

caactcttca ggctgtcctg agaggttggc cagctgccga cgccttaccg attttgccca 1740

gggctggggt cctatcagtt atgccaacgg aagcggcctc gacgaacgcc cctactgctg 1800

gcactaccct ccaagacctt gtggcattgt gcccgcaaag agcgtgtgtg gcccggtata 1860

ttgcttcact cccagccccg tggtggtggg aacgaccgac aggtcgggcg cgcctaccta 1920

cagctggggt gcaaatgata cggatgtctt cgtccttaac aacaccaggc caccgctggg 1980

caattggttc ggttgtacct ggatgaactc aactggattc accaaagtgt gcggagcgcc 2040

cccttgtgtc atcggagggg tgggcaacaa caccttgctc tgccccactg attgcttccg 2100

caaacatccg gaagccacat actctcggtg cggctccggt ccctggatta cacccaggtg 2160

catggtcgac tacccgtata ggctttggca ctatccttgt accatcaatt acaccatatt 2220

caaagtcagg atgtacgtgg gaggggtcga gcacaggctg gaagcggcct gcaactggac 2280

gcggggcgaa cgctgtgatc tggaagacag ggacaggtcc gagctcagcc cgttgctgct 2340

gtccaccaca cagtggcagg tccttccgtg ttctttcacg accctgccag ccttgtccac 2400

cggcctcatc cacctccacc agaacattgt ggacgtgcag tacttgtacg gggtagggtc 2460

aagcatcgcg tcctgggcca ttaagtggga gtacgtcgtt ctcctgttcc ttctgcttgc 2520

agacgcgcgc gtctgctcct gcttgtggat gatgttactc atatcccaag cggaggcggc 2580

tttggagaac ctcgtaatac tcaatgcagc atccctggcc gggacgcacg gtcttgtgtc 2640

cttcctcgtg ttcttctgct ttgcgtggta tctgaagggt aggtgggtgc ccggagcggt 2700

ctacgccctc tacgggatgt ggcctctcct cctgctcctg ctggcgttgc ctcagcgggc 2760

atacgcatat gacgcacctg tgcacggaca gataggcgtg ggtttgttga tattgatcac 2820

cctcttcaca ctcaccccgg ggtataagac cctcctcggc cagtgtctgt ggtggttgtg 2880

ctatctcctg accctggggg aagccatgat tcaggagtgg gtaccaccca tgcaggtgcg 2940

cggcggccgc gatggcatcg cgtgggccgt cactatattc tgcccgggtg tggtgtttga 3000

cattaccaaa tggcttttgg cgttgcttgg gcctgcttac ctcttaaggg ccgctttgac 3060

acatgtgccg tacttcgtca gagctcacgc tctgataagg gtatgcgctt tggtgaagca 3120

gctcgcgggg ggtaggtatg ttcaggtggc gctattggcc cttggcaggt ggactggcac 3180

ctacatctat gaccacctca cacctatgtc ggactgggcc gctagcggcc tgcgcgactt 3240

agcggtcgcc gtggaaccca tcatcttcag tccgatggag aagaaggtca tcgtctgggg 3300

agcggagacg gctgcatgtg gggacattct acatggactt cccgtgtccg cccgactcgg 3360

ccaggagatc ctcctcggcc cagctgatgg ctacacctcc aaggggtgga agctccttgc 3420

tcccatcact gcttatgccc agcaaacacg aggcctcctg ggcgccatag tggtgagtat 3480

gacggggcgt gacaggacag aacaggccgg ggaagtccaa atcctgtcca cagtctctca 3540

gtccttcctc ggaacaacca tctcgggggt tttgtggact gtttaccacg gagctggcaa 3600

caagactcta gccggcttac ggggtccggt cacgcagatg tactcgagtg ctgaggggga 3660

cttggtaggc tggcccagcc cccctgggac caagtctttg gagccgtgca agtgtggagc 3720

cgtcgaccta tatctggtca cgcggaacgc tgatgtcatc ccggctcgga gacgcgggga 3780

caagcgggga gcattgctct ccccgagacc catttcgacc ttgaaggggt cctcgggggg 3840

gccggtgctc tgccctaggg gccacgtcgt tgggctcttc cgagcagctg tgtgctctcg 3900

gggcgtggcc aaatccatcg atttcatccc cgttgagaca ctcgacgttg ttacaaggtc 3960

tcccactttc agtgacaaca gcacgccacc ggctgtgccc cagacctatc aggtcgggta 4020

cttgcatgct ccaactggca gtggaaagag caccaaggtc cctgtcgcgt atgccgccca 4080

ggggtacaaa gtactagtgc ttaacccctc ggtagctgcc accctggggt ttggggcgta 4140

cctatccaag gcacatggca tcaatcccaa cattaggact ggagtcagga ccgtgatgac 4200

cggggaggcc atcacgtact ccacatatgg caaatttctc gccgatgggg gctgcgctag 4260

cggcgcctat gacatcatca tatgcgatga atgccacgct gtggatgcta cctccattct 4320

cggcatcgga acggtccttg atcaagcaga gacagccggg gtcagactaa ctgtgctggc 4380

tacggccaca ccccccgggt cagtgacaac cccccatccc gatatagaag aggtaggcct 4440

cgggcgggag ggtgagatcc ccttctatgg gagggcgatt cccctatcct gcatcaaggg 4500

agggagacac ctgattttct gccactcaaa gaaaaagtgt gacgagctcg cggcggccct 4560

tcggggcatg ggcttgaatg ccgtggcata ctatagaggg ttggacgtct ccataatacc 4620

agctcaggga gatgtggtgg tcgtcgccac cgacgccctc atgacggggt acactggaga 4680

ctttgactcc gtgatcgact gcaatgtagc ggtcacccaa gctgtcgact tcagcctgga 4740

ccccaccttc actataacca cacagactgt cccacaagac gctgtctcac gcagtcagcg 4800

ccgcgggcgc acaggtagag gaagacaggg cacttatagg tatgtttcca ctggtgaacg 4860

agcctcagga atgtttgaca gtgtagtgct ttgtgagtgc tacgacgcag gggctgcgtg 4920

gtacgatctc acaccagcgg agaccaccgt caggcttaga gcgtatttca acacgcccgg 4980

cctacccgtg tgtcaagacc atcttgaatt ttgggaggca gttttcaccg gcctcacaca 5040

catagacgcc cacttcctct cccaaacaaa gcaagcgggg gagaacttcg cgtacctagt 5100

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gtggaagtgc ctggcccgac tcaagcctac gcttgcgggc cccacacctc tcctgtaccg 5220

tttgggccct attaccaatg aggtcaccct cacacaccct gggacgaagt acatcgccac 5280

atgcatgcaa gctgaccttg aggtcatgac cagcacgtgg gtcctagctg gaggagtcct 5340

ggcagccgtc gccgcatatt gcctggcgac tggatgcgtt tccatcatcg gccgcttgca 5400

cgtcaaccag cgagtcgtcg ttgcgccgga taaggaggtc ctgtatgagg cttttgatga 5460

gatggaggaa tgcgcctcta gggcggctct catcgaagag gggcagcgga tagccgagat 5520

gttgaagtcc aagatccaag gcttgctgca gcaggcctct aagcaggccc aggacataca 5580

acccgctatg caggcttcat ggcccaaagt ggaacaattt tgggccagac acatgtggaa 5640

cttcattagc ggcatccaat acctcgcagg attgtcaaca ctgccaggga accccgcggt 5700

ggcttccatg atggcattca gtgccgccct caccagtccg ttgtcgacca gtaccaccat 5760

ccttctcaac atcatgggag gctggttagc gtcccagatc gcaccacccg cgggggccac 5820

cggctttgtc gtcagtggcc tggtgggggc tgccgtgggc agcataggcc tgggtaaggt 5880

gctggtggac atcctggcag gatatggtgc gggcatttcg ggggccctcg tcgcattcaa 5940

gatcatgtct ggcgagaagc cctctatgga agatgtcatc aatctactgc ctgggatcct 6000

gtctccggga gccctggtgg tgggggtcat ctgcgcggcc attctgcgcc gccacgtggg 6060

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cttgacagac ttcaaaaatt ggctgacctc taaattgttc cccaagctgc ccggcctccc 6360

cttcatctct tgtcaaaagg ggtacaaggg tgtgtgggcc ggcactggca tcatgaccac 6420

gcgctgccct tgcggcgcca acatctctgg caatgtccgc ctgggctcta tgaggatcac 6480

agggcctaaa acctgcatga acacctggca ggggaccttt cctatcaatt gctacacgga 6540

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ctcggagtac gcggaggtga cgcagcatgg gtcgtactcc tatgtaacag gactgaccac 6660

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tgtgcagatc cataggtttg cacccacacc aaagccgttt ttccgggatg aggtctcgtt 6780

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cgcagacgta ttgaggtcca tgctaacaga tccgccccac atcacggcgg agactgcggc 6900

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atcggagtgc atgctcccca ggagcgggtt tccacgggcc ttaccggctt gggcacggcc 7200

tgactacaac ccgccgctcg tggaatcgtg gaggaggcca gattaccaac cgcccaccgt 7260

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tatgcccccc ctcgaggggg agcctggaga tccggacctg gagtctgatc aggtagagct 7560

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ttgctccgag gaggacgata ccaccgtgtg ctgctccatg tcatactcct ggaccggggc 7680

tctaataact ccctgtagcc ccgaagagga aaagttgcca atcaaccctt tgagtaactc 7740

gctgttgcga taccataaca aggtgtactg tacaacatca aagagcgcct cacagagggc 7800

taaaaaggta acttttgaca ggacgcaagt gctcgacgcc cattatgact cagtcttaaa 7860

ggacatcaag ctagcggctt ccaaggtcag cgcaaggctc ctcaccttgg aggaggcgtg 7920

ccagttgact ccaccccatt ctgcaagatc caagtatgga ttcggggcca aggaggtccg 7980

cagcttgtcc gggagggccg ttaaccacat caagtccgtg tggaaggacc tcctggaaga 8040

cccacaaaca ccaattccca caaccatcat ggccaaaaat gaggtgttct gcgtggaccc 8100

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tgaggaggac gagcggaacc tgagagcctt cacggaggcc atgaccaggt actctgcccc 8700

tcctggtgat ccccccagac cggaatatga cctggagcta ataacatcct gttcctcaaa 8760

tgtgtctgtg gcgttgggcc cgcggggccg ccgcagatac tacctgacca gagacccaac 8820

cactccactc gcccgggctg cctgggaaac agttagacac tcccctatca attcatggct 8880

gggaaacatc atccagtatg ctccaaccat atgggttcgc atggtcctaa tgacacactt 8940

cttctccatt ctcatggtcc aagacaccct ggaccagaac ctcaactttg agatgtatgg 9000

atcagtatac tccgtgaatc ctttggacct tccagccata attgagaggt tacacgggct 9060

tgacgccttt tctatgcaca catactctca ccacgaactg acgcgggtgg cttcagccct 9120

cagaaaactt ggggcgccac ccctcagggt gtggaagagt cgggctcgcg cagtcagggc 9180

gtccctcatc tcccgtggag ggaaagcggc cgtttgcggc cgatatctct tcaattgggc 9240

ggtgaagacc aagctcaaac tcactccatt gccggaggcg cgcctactgg acttatccag 9300

ttggttcacc gtcggcgccg gcgggggcga catttttcac agcgtgtcgc gcgcccgacc 9360

ccgctcatta ctcttcggcc tactcctact tttcgtaggg gtaggcctct tcctactccc 9420

cgctcggtag agcggcacac actaggtaca ctccatagct aactgttcct tttttttttt 9480

tttttttttt tttttttttt tttttttttt ttcttttttt tttttttccc tctttcttcc 9540

cttctcatct tattctactt tctttcttgg tggctccatc ttagccctag tcacggctag 9600

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tcatgt 9666

<210>31

<211>9666

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：合成DNA

<400>31

acctgcccct aataggggcg acactccgcc atgaatcact cccctgtgag gaactactgt 60

cttcacgcag aaagcgccta gccatggcgt tagtatgagt gtcgtacagc ctccaggccc 120

ccccctcccg ggagagccat agtggtctgc ggaaccggtg agtacaccgg aattgccagg 180

acgaccgggt cctttcttgg atcaacccgc tcaatgcctg gagatttggg cgtgcccccg 240

cgagactgct agccgagtag tgttgggtcg cgaaaggcct tgtggtactg cctgataggg 300

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ccaaagaaaa accaaacgta acaccaaccg tcgcccacag gacgttaagt tcccgggcgg 420

tggtcagatc gtcggtggag tttacttgtt gccgcgcagg ggccccaggt tgggtgtgcg 480

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ggctcgccgg cccgagggca ggacctgggc tcagcctggg tatccttggc ccctctatgg 600

caatgagggc ttggggtggg caggatggct cctgtcaccc cgcggctctc ggcctagttg 660

gggccctaat gacccccggc gtaggtcgcg taatttgggt aaggtcatcg atacccttac 720

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ctccaactca agcattgtgt atgaggcggc ggacgtgatc atgcatgccc ccgggtgcgt 1020

gccctgcgtt cgggagaaca attcctcccg ttgctgggta gcgctcactc ccacgctcgc 1080

ggccaggaat gccagcgtcc ccactacgac attacgacgc cacgtcgact tgctcgttgg 1140

gacggctgct ttctgctccg ctatgtacgt gggggatctc tgcggatctg ttttcctcat 1200

ctcccagctg ttcaccttct cgcctcgccg gcatgagaca gtacaggact gcaactgctc 1260

aatctatccc ggccacgtat caggccatcg tatggcttgg gatatgatga tgaactggtc 1320

gcccacggca gccttagtgg tgtcgcagtt actccggatc ccacaagctg tcatggacat 1380

ggtggcgggg gcccactggg gagtcctagc gggccttgcc tactattcca tggtggggaa 1440

ctgggctaag gttttgattg tgatgctact ctttgccggc gttgacgggc atacccgcgt 1500

gacggggggg gtgcaaggcc atgtcacctc tacactcacg tccctcttta gacctggggc 1560

gtcccagaaa attcagcttg taaacaccaa tggcagttgg catatcaaca ggactgccct 1620

gaactgcaat gactccctca aaactgggtt tcttgccgcg ctgttctaca cacacaagtt 1680

caacgcgtcc ggatgcccgg agcgcatggc cagctgtcgc tccattgaca agttcgacca 1740

gggatggggt cccatcacct atgctcaacc tgacaactcg gaccagaggc cgtattgctg 1800

gcactacgca cctcgacagt gtggtatcgt acccgcgtcg caggtgtgcg gtccagtgta 1860

ttgcttcacc ccaagccctg ttgtagtggg gacgaccgat cgtttcggcg cccctacgta 1920

taactggggg gacaatgaga cggacgtgct gctcctaaac aacacgcggc cgccgcatgg 1980

caactggttc ggctgtacat ggatgaatag cactgggttc accaagacgt gcggaggccc 2040

cccgtgtaac atcagggggg tcggcaacaa caccttgacc tgccccacgg actgcttccg 2100

gaagcacccc gacgccactt acacaaaatg tggttcgggc ccttggttga cacctaggtg 2160

cttggttgac tacccataca ggctctggca ctacccctgc actgtcaact ttaccatctt 2220

caaggttagg atgtatgtgg ggggcgtgga gcacaggctt gatgctgcat gcaactggac 2280

tcgaggagag cgttgcgact tggaggacag ggatagagca gagctcagcc cgctattgct 2340

gtctacaaca gagtggcaga tactgccctg ttcctacacc accctaccgg ctctgtccac 2400

tggtttaatc cacctccacc agaacatcgt ggacatacaa tacctgtacg gtatagggtc 2460

ggcggtcgtc tccattgcca tcaagtggga gtatgtcgtg ctgctcttcc ttctcctggc 2520

ggacgcgcgc gtctgtgcct gcttgtggat gatgctgctg atagcccagg ccgaggctgc 2580

cttagagaac ttggtggtcc tcaatgcggc gtccgtggtc ggagcgcatg gcatgctccc 2640

cttctttatg ttcttctgtg ccgcctggta catgaagggc aggctggtcc ctggagcggc 2700

atacgctttc tacggtgtat ggccgctgct cctgctcctg ctagcattac caccacgagc 2760

ttacgcctat gacgcacctg tgcacggaca gataggcgtg ggtttgttga tattgatcac 2820

cctcttcaca ctcaccccgg ggtataagac cctcctcggc cagtgtctgt ggtggttgtg 2880

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cggcggccgc gatggcatcg cgtgggccgt cactatattc tgcccgggtg tggtgtttga 3000

cattaccaaa tggcttttgg cgttgcttgg gcctgcttac ctcttaaggg ccgctttgac 3060

acatgtgccg tacttcgtca gagctcacgc tctgataagg gtatgcgctt tggtgaagca 3120

gctcgcgggg ggtaggtatg ttcaggtggc gctattggcc cttggcaggt ggactggcac 3180

ctacatctat gaccacctca cacctatgtc ggactgggcc gctagcggcc tgcgcgactt 3240

agcggtcgcc gtggaaccca tcatcttcag tccgatggag aagaaggtca tcgtctgggg 3300

agcggagacg gctgcatgtg gggacattct acatggactt cccgtgtccg cccgactcgg 3360

ccaggagatc ctcctcggcc cagctgatgg ctacacctcc aaggggtgga agctccttgc 3420

tcccatcact gcttatgccc agcaaacacg aggcctcctg ggcgccatag tggtgagtat 3480

gacggggcgt gacaggacag aacaggccgg ggaagtccaa atcctgtcca cagtctctca 3540

gtccttcctc ggaacaacca tctcgggggt tttgtggact gtttaccacg gagctggcaa 3600

caagactcta gccggcttac ggggtccggt cacgcagatg tactcgagtg ctgaggggga 3660

cttggtaggc tggcccagcc cccctgggac caagtctttg gagccgtgca agtgtggagc 3720

cgtcgaccta tatctggtca cgcggaacgc tgatgtcatc ccggctcgga gacgcgggga 3780

caagcgggga gcattgctct ccccgagacc catttcgacc ttgaaggggt cctcgggggg 3840

gccggtgctc tgccctaggg gccacgtcgt tgggctcttc cgagcagctg tgtgctctcg 3900

gggcgtggcc aaatccatcg atttcatccc cgttgagaca ctcgacgttg ttacaaggtc 3960

tcccactttc agtgacaaca gcacgccacc ggctgtgccc cagacctatc aggtcgggta 4020

cttgcatgct ccaactggca gtggaaagag caccaaggtc cctgtcgcgt atgccgccca 4080

ggggtacaaa gtactagtgc ttaacccctc ggtagctgcc accctggggt ttggggcgta 4140

cctatccaag gcacatggca tcaatcccaa cattaggact ggagtcagga ccgtgatgac 4200

cggggaggcc atcacgtact ccacatatgg caaatttctc gccgatgggg gctgcgctag 4260

cggcgcctat gacatcatca tatgcgatga atgccacgct gtggatgcta cctccattct 4320

cggcatcgga acggtccttg atcaagcaga gacagccggg gtcagactaa ctgtgctggc 4380

tacggccaca ccccccgggt cagtgacaac cccccatccc gatatagaag aggtaggcct 4440

cgggcgggag ggtgagatcc ccttctatgg gagggcgatt cccctatcct gcatcaaggg 4500

agggagacac ctgattttct gccactcaaa gaaaaagtgt gacgagctcg cggcggccct 4560

tcggggcatg ggcttgaatg ccgtggcata ctatagaggg ttggacgtct ccataatacc 4620

agctcaggga gatgtggtgg tcgtcgccac cgacgccctc atgacggggt acactggaga 4680

ctttgactcc gtgatcgact gcaatgtagc ggtcacccaa gctgtcgact tcagcctgga 4740

ccccaccttc actataacca cacagactgt cccacaagac gctgtctcac gcagtcagcg 4800

ccgcgggcgc acaggtagag gaagacaggg cacttatagg tatgtttcca ctggtgaacg 4860

agcctcagga atgtttgaca gtgtagtgct ttgtgagtgc tacgacgcag gggctgcgtg 4920

gtacgatctc acaccagcgg agaccaccgt caggcttaga gcgtatttca acacgcccgg 4980

cctacccgtg tgtcaagacc atcttgaatt ttgggaggca gttttcaccg gcctcacaca 5040

catagacgcc cacttcctct cccaaacaaa gcaagcgggg gagaacttcg cgtacctagt 5100

agcctaccaa gctacggtgt gcgccagagc caaggcccct cccccgtcct gggacgccat 5160

gtggaagtgc ctggcccgac tcaagcctac gcttgcgggc cccacacctc tcctgtaccg 5220

tttgggccct attaccaatg aggtcaccct cacacaccct gggacgaagt acatcgccac 5280

atgcatgcaa gctgaccttg aggtcatgac cagcacgtgg gtcctagctg gaggagtcct 5340

ggcagccgtc gccgcatatt gcctggcgac tggatgcgtt tccatcatcg gccgcttgca 5400

cgtcaaccag cgagtcgtcg ttgcgccgga taaggaggtc ctgtatgagg cttttgatga 5460

gatggaggaa tgcgcctcta gggcggctct catcgaagag gggcagcgga tagccgagat 5520

gttgaagtcc aagatccaag gcttgctgca gcaggcctct aagcaggccc aggacataca 5580

acccgctatg caggcttcat ggcccaaagt ggaacaattt tgggccagac acatgtggaa 5640

cttcattagc ggcatccaat acctcgcagg attgtcaaca ctgccaggga accccgcggt 5700

ggcttccatg atggcattca gtgccgccct caccagtccg ttgtcgacca gtaccaccat 5760

ccttctcaac atcatgggag gctggttagc gtcccagatc gcaccacccg cgggggccac 5820

cggctttgtc gtcagtggcc tggtgggggc tgccgtgggc agcataggcc tgggtaaggt 5880

gctggtggac atcctggcag gatatggtgc gggcatttcg ggggccctcg tcgcattcaa 5940

gatcatgtct ggcgagaagc cctctatgga agatgtcatc aatctactgc ctgggatcct 6000

gtctccggga gccctggtgg tgggggtcat ctgcgcggcc attctgcgcc gccacgtggg 6060

accgggggag ggcgcggtcc aatggatgaa caggcttatt gcctttgctt ccagaggaaa 6120

ccacgtcgcc cctactcact acgtgacgga gtcggatgcg tcgcagcgtg tgacccaact 6180

acttggctct cttactataa ccagcctact cagaagactc cacaattgga taactgagga 6240

ctgccccatc ccatgctccg gatcctggct ccgcgacgtg tgggactggg tttgcaccat 6300

cttgacagac ttcaaaaatt ggctgacctc taaattgttc cccaagctgc ccggcctccc 6360

cttcatctct tgtcaaaagg ggtacaaggg tgtgtgggcc ggcactggca tcatgaccac 6420

gcgctgccct tgcggcgcca acatctctgg caatgtccgc ctgggctcta tgaggatcac 6480

agggcctaaa acctgcatga acacctggca ggggaccttt cctatcaatt gctacacgga 6540

gggccagtgc gcgccgaaac cccccacgaa ctacaagacc gccatctgga gggtggcggc 6600

ctcggagtac gcggaggtga cgcagcatgg gtcgtactcc tatgtaacag gactgaccac 6660

tgacaatctg aaaattcctt gccaactacc ttctccagag tttttctcct gggtggacgg 6720

tgtgcagatc cataggtttg cacccacacc aaagccgttt ttccgggatg aggtctcgtt 6780

ctgcgttggg cttaattcct atgctgtcgg gtcccagctt ccctgtgaac ctgagcccga 6840

cgcagacgta ttgaggtcca tgctaacaga tccgccccac atcacggcgg agactgcggc 6900

gcggcgcttg gcacggggat cacctccatc tgaggcgagc tcctcagtga gccagctatc 6960

agcaccgtcg ctgcgggcca cctgcaccac ccacagcaac acctatgacg tggacatggt 7020

cgatgccaac ctgctcatgg agggcggtgt ggctcagaca gagcctgagt ccagggtgcc 7080

cgttctggac tttctcgagc caatggccga ggaagagagc gaccttgagc cctcaatacc 7140

atcggagtgc atgctcccca ggagcgggtt tccacgggcc ttaccggctt gggcacggcc 7200

tgactacaac ccgccgctcg tggaatcgtg gaggaggcca gattaccaac cgcccaccgt 7260

tgctggttgt gctctccccc cccccaagaa ggccccgacg cctcccccaa ggagacgccg 7320

gacagtgggt ctgagcgaga gcaccatatc agaagccctc cagcaactgg ccatcaagac 7380

ctttggccag cccccctcga gcggtgatgc aggctcgtcc acgggggcgg gcgccgccga 7440

atccggcggt ccgacgtccc ctggtgagcc ggccccctca gagacaggtt ccgcctcctc 7500

tatgcccccc ctcgaggggg agcctggaga tccggacctg gagtctgatc aggtagagct 7560

tcaacctccc ccccaggggg ggggggtagc tcccggttcg ggctcggggt cttggtctac 7620

ttgctccgag gaggacgata ccaccgtgtg ctgctccatg tcatactcct ggaccggggc 7680

tctaataact ccctgtagcc ccgaagagga aaagttgcca atcaaccctt tgagtaactc 7740

gctgttgcga taccataaca aggtgtactg tacaacatca aagagcgcct cacagagggc 7800

taaaaaggta acttttgaca ggacgcaagt gctcgacgcc cattatgact cagtcttaaa 7860

ggacatcaag ctagcggctt ccaaggtcag cgcaaggctc ctcaccttgg aggaggcgtg 7920

ccagttgact ccaccccatt ctgcaagatc caagtatgga ttcggggcca aggaggtccg 7980

cagcttgtcc gggagggccg ttaaccacat caagtccgtg tggaaggacc tcctggaaga 8040

cccacaaaca ccaattccca caaccatcat ggccaaaaat gaggtgttct gcgtggaccc 8100

cgccaagggg ggtaagaaac cagctcgcct catcgtttac cctgacctcg gcgtccgggt 8160

ctgcgagaaa atggccctct atgacattac acaaaagctt cctcaggcgg taatgggagc 8220

ttcctatggc ttccagtact cccctgccca acgggtggag tatctcttga aagcatgggc 8280

ggaaaagaag gaccccatgg gtttttcgta tgatacccga tgcttcgact caaccgtcac 8340

tgagagagac atcaggaccg aggagtccat ataccaggcc tgctccctgc ccgaggaggc 8400

ccgcactgcc atacactcgc tgactgagag actttacgta ggagggccca tgttcaacag 8460

caagggtcaa acctgcggtt acagacgttg ccgcgccagc ggggtgctaa ccactagcat 8520

gggtaacacc atcacatgct atgtgaaagc cctagcggcc tgcaaggctg cggggatagt 8580

tgcgcccaca atgctggtat gcggcgatga cctagtagtc atctcagaaa gccaggggac 8640

tgaggaggac gagcggaacc tgagagcctt cacggaggcc atgaccaggt actctgcccc 8700

tcctggtgat ccccccagac cggaatatga cctggagcta ataacatcct gttcctcaaa 8760

tgtgtctgtg gcgttgggcc cgcggggccg ccgcagatac tacctgacca gagacccaac 8820

cactccactc gcccgggctg cctgggaaac agttagacac tcccctatca attcatggct 8880

gggaaacatc atccagtatg ctccaaccat atgggttcgc atggtcctaa tgacacactt 8940

cttctccatt ctcatggtcc aagacaccct ggaccagaac ctcaactttg agatgtatgg 9000

atcagtatac tccgtgaatc ctttggacct tccagccata attgagaggt tacacgggct 9060

tgacgccttt tctatgcaca catactctca ccacgaactg acgcgggtgg cttcagccct 9120

cagaaaactt ggggcgccac ccctcagggt gtggaagagt cgggctcgcg cagtcagggc 9180

gtccctcatc tcccgtggag ggaaagcggc cgtttgcggc cgatatctct tcaattgggc 9240

ggtgaagacc aagctcaaac tcactccatt gccggaggcg cgcctactgg acttatccag 9300

ttggttcacc gtcggcgccg gcgggggcga catttttcac agcgtgtcgc gcgcccgacc 9360

ccgctcatta ctcttcggcc tactcctact tttcgtaggg gtaggcctct tcctactccc 9420

cgctcggtag agcggcacac actaggtaca ctccatagct aactgttcct tttttttttt 9480

tttttttttt tttttttttt tttttttttt ttcttttttt tttttttccc tctttcttcc 9540

cttctcatct tattctactt tctttcttgg tggctccatc ttagccctag tcacggctag 9600

ctgtgaaagg tccgtgagcc gcatgactgc agagagtgcc gtaactggtc tctctgcaga 9660

tcatgt 9666

<210>32

<211>9666

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：合成DNA

<400>32

acctgcccct aataggggcg acactccgcc atgaatcact cccctgtgag gaactactgt 60

cttcacgcag aaagcgccta gccatggcgt tagtatgagt gtcgtacagc ctccaggccc 120

ccccctcccg ggagagccat agtggtctgc ggaaccggtg agtacaccgg aattgccagg 180

acgaccgggt cctttcttgg atcaacccgc tcaatgcctg gagatttggg cgtgcccccg 240

cgagactgct agccgagtag tgttgggtcg cgaaaggcct tgtggtactg cctgataggg 300

tgcttgcgag tgccccggga ggtctcgtag accgtgcatc atgagcacaa atcctaaacc 360

ccaaagaaaa accaaacgta acaccaaccg tcgcccacag gacgttaagt tcccgggcgg 420

tggtcagatc gtcggtggag tttacttgtt gccgcgcagg ggccccaggt tgggtgtgcg 480

tgcgactagg aagacttccg agcggtcgca acctcgtgga aggcgacaac ctatccccaa 540

ggctcgccgg cccgagggca ggacctgggc tcagcctggg tatccttggc ccctctatgg 600

caatgagggc ttggggtggg caggatggct cctgtcaccc cgcggctctc ggcctagttg 660

gggccctaat gacccccggc gtaggtcgcg taatttgggt aaggtcatcg atacccttac 720

atgcggcttc gccgacctca tggggtacat cccgcttgtc ggcgccccct tagggggcgc 780

tgccagggcc ctggcacatg gtgtccgggt tctggaggac ggcgtgaact atgcaacagg 840

gaatttgccc ggttgctctt tctctatctt cctcttagct ctgctgtcct gtttgaccat 900

cccagcttcc gcttatgaag tgcgcaacgt gtccgggata taccatgtca caaacgactg 960

ctccaactca agcattgtgt atgaggcggc ggacgtgatc atgcatgccc ccgggtgcgt 1020

gccctgcgtt cgggagaaca attcctcccg ttgctgggta gcgctcactc ccacgctcgc 1080

ggccaggaat gccagcgtcc ccactacgac attacgacgc cacgtcgact tgctcgttgg 1140

gacggctgct ttctgctccg ctatgtacgt gggggatctc tgcggatctg ttttcctcat 1200

ctcccagctg ttcaccttct cgcctcgccg gcatgagaca gtacaggact gcaactgctc 1260

aatctatccc ggccacgtat caggccatcg tatggcttgg gatatgatga tgaactggtc 1320

gcccacggca gccttagtgg tgtcgcagtt actccggatc ccacaagctg tcatggacat 1380

ggtggcgggg gcccactggg gagtcctagc gggccttgcc tactattcca tggtggggaa 1440

ctgggctaag gttttgattg tgatgctact ctttgccggc gttgacgggc atacccgcgt 1500

gacggggggg gtgcaaggcc atgtcacctc tacactcacg tccctcttta gacctggggc 1560

gtcccagaaa attcagcttg taaacaccaa tggcagttgg catatcaaca ggactgccct 1620

gaactgcaat gactccctca aaactgggtt tcttgccgcg ctgttctaca cacacaagtt 1680

caacgcgtcc ggatgcccgg agcgcatggc cagctgtcgc tccattgaca agttcgacca 1740

gggatggggt cccatcacct atgctcaacc tgacaactcg gaccagaggc cgtattgctg 1800

gcactacgca cctcgacagt gtggtatcgt acccgcgtcg caggtgtgcg gtccagtgta 1860

ttgcttcacc ccaagccctg ttgtagtggg gacgaccgat cgtttcggcg cccctacgta 1920

taactggggg gacaatgaga cggacgtgct gctcctaaac aacacgcggc cgccgcatgg 1980

caactggttc ggctgtacat ggatgaatag cactgggttc accaagacgt gcggaggccc 2040

cccgtgtaac atcagggggg tcggcaacaa caccttgacc tgccccacgg actgcttccg 2100

gaagcacccc gacgccactt acacaaaatg tggttcgggc ccttggttga cacctaggtg 2160

cttggttgac tacccataca ggctctggca ctacccctgc actgtcaact ttaccatctt 2220

caaggttagg atgtatgtgg ggggcgtgga gcacaggctt gatgctgcat gcaactggac 2280

tcgaggagag cgttgcgact tggaggacag ggatagagca gagctcagcc cgctattgct 2340

gtctacaaca gagtggcaga tactgccctg ttcctacacc accctaccgg ctctgtccac 2400

tggtttaatc cacctccacc agaacatcgt ggacatacaa tacctgtacg gtatagggtc 2460

ggcggtcgtc tccattgcca tcaagtggga gtatgtcgtg ctgctcttcc ttctcctggc 2520

ggacgcgcgc gtctgtgcct gcttgtggat gatgctgctg atagcccagg ccgaggctgc 2580

cttagagaac ttggtggtcc tcaatgcggc gtccgtggtc ggagcgcatg gcatgctccc 2640

cttctttatg ttcttctgtg ccgcctggta catgaagggc aggctggtcc ctggagcggc 2700

atacgctttc tacggtgtat ggccgctgct cctgctcctg ctagcattac caccacgagc 2760

ttacgccatg gaccgggaga tggttgcatc ttgcggaggc ggggtttttg taggtctagc 2820

actcctgacc ttgtcaccat actgtaaagt gttcctcgct aggctcatat ggtggttaca 2880

atattttatc accaaagccg aggcgcattt gcaagtgtcg ctcccccccc tcaacgttcg 2940

aggcggacgc gatgccatca tcctcctcat gtgcgcggtc cacccagagc taatctttga 3000

catcaccaaa cttctgctct ccatactcgg tccgctcatg gtgctccaag ctagtttaat 3060

ccgagtgccg tacttcgtgc gcgctcaagg gctcattcgc gcatgcatgt tggtgcggaa 3120

agctgccggg ggccattatg tccaaatggc cttcgtgaag ctagctgcgc tgacaggcac 3180

gtacgtttat gaccacctca ctccactgca ggattgggcc catgtgggcc tacgagacct 3240

tgcggtggca gtagagcccg ttgtcttttc tgccatggag accaaggtca tcacctgggg 3300

ggcagacacc gcggcgtgtg gggacattat ctcaggtcta cccgtctccg cccgaagggg 3360

gaaggagata cttttgggac cggccgatag ttttgaaggg caggggtggc gactccttgc 3420

tcccatcact gcttatgccc agcaaacacg aggcctcctg ggcgccatag tggtgagtat 3480

gacggggcgt gacaggacag aacaggccgg ggaagtccaa atcctgtcca cagtctctca 3540

gtccttcctc ggaacaacca tctcgggggt tttgtggact gtttaccacg gagctggcaa 3600

caagactcta gccggcttac ggggtccggt cacgcagatg tactcgagtg ctgaggggga 3660

cttggtaggc tggcccagcc cccctgggac caagtctttg gagccgtgca agtgtggagc 3720

cgtcgaccta tatctggtca cgcggaacgc tgatgtcatc ccggctcgga gacgcgggga 3780

caagcgggga gcattgctct ccccgagacc catttcgacc ttgaaggggt cctcgggggg 3840

gccggtgctc tgccctaggg gccacgtcgt tgggctcttc cgagcagctg tgtgctctcg 3900

gggcgtggcc aaatccatcg atttcatccc cgttgagaca ctcgacgttg ttacaaggtc 3960

tcccactttc agtgacaaca gcacgccacc ggctgtgccc cagacctatc aggtcgggta 4020

cttgcatgct ccaactggca gtggaaagag caccaaggtc cctgtcgcgt atgccgccca 4080

ggggtacaaa gtactagtgc ttaacccctc ggtagctgcc accctggggt ttggggcgta 4140

cctatccaag gcacatggca tcaatcccaa cattaggact ggagtcagga ccgtgatgac 4200

cggggaggcc atcacgtact ccacatatgg caaatttctc gccgatgggg gctgcgctag 4260

cggcgcctat gacatcatca tatgcgatga atgccacgct gtggatgcta cctccattct 4320

cggcatcgga acggtccttg atcaagcaga gacagccggg gtcagactaa ctgtgctggc 4380

tacggccaca ccccccgggt cagtgacaac cccccatccc gatatagaag aggtaggcct 4440

cgggcgggag ggtgagatcc ccttctatgg gagggcgatt cccctatcct gcatcaaggg 4500

agggagacac ctgattttct gccactcaaa gaaaaagtgt gacgagctcg cggcggccct 4560

tcggggcatg ggcttgaatg ccgtggcata ctatagaggg ttggacgtct ccataatacc 4620

agctcaggga gatgtggtgg tcgtcgccac cgacgccctc atgacggggt acactggaga 4680

ctttgactcc gtgatcgact gcaatgtagc ggtcacccaa gctgtcgact tcagcctgga 4740

ccccaccttc actataacca cacagactgt cccacaagac gctgtctcac gcagtcagcg 4800

ccgcgggcgc acaggtagag gaagacaggg cacttatagg tatgtttcca ctggtgaacg 4860

agcctcagga atgtttgaca gtgtagtgct ttgtgagtgc tacgacgcag gggctgcgtg 4920

gtacgatctc acaccagcgg agaccaccgt caggcttaga gcgtatttca acacgcccgg 4980

cctacccgtg tgtcaagacc atcttgaatt ttgggaggca gttttcaccg gcctcacaca 5040

catagacgcc cacttcctct cccaaacaaa gcaagcgggg gagaacttcg cgtacctagt 5100

agcctaccaa gctacggtgt gcgccagagc caaggcccct cccccgtcct gggacgccat 5160

gtggaagtgc ctggcccgac tcaagcctac gcttgcgggc cccacacctc tcctgtaccg 5220

tttgggccct attaccaatg aggtcaccct cacacaccct gggacgaagt acatcgccac 5280

atgcatgcaa gctgaccttg aggtcatgac cagcacgtgg gtcctagctg gaggagtcct 5340

ggcagccgtc gccgcatatt gcctggcgac tggatgcgtt tccatcatcg gccgcttgca 5400

cgtcaaccag cgagtcgtcg ttgcgccgga taaggaggtc ctgtatgagg cttttgatga 5460

gatggaggaa tgcgcctcta gggcggctct catcgaagag gggcagcgga tagccgagat 5520

gttgaagtcc aagatccaag gcttgctgca gcaggcctct aagcaggccc aggacataca 5580

acccgctatg caggcttcat ggcccaaagt ggaacaattt tgggccagac acatgtggaa 5640

cttcattagc ggcatccaat acctcgcagg attgtcaaca ctgccaggga accccgcggt 5700

ggcttccatg atggcattca gtgccgccct caccagtccg ttgtcgacca gtaccaccat 5760

ccttctcaac atcatgggag gctggttagc gtcccagatc gcaccacccg cgggggccac 5820

cggctttgtc gtcagtggcc tggtgggggc tgccgtgggc agcataggcc tgggtaaggt 5880

gctggtggac atcctggcag gatatggtgc gggcatttcg ggggccctcg tcgcattcaa 5940

gatcatgtct ggcgagaagc cctctatgga agatgtcatc aatctactgc ctgggatcct 6000

gtctccggga gccctggtgg tgggggtcat ctgcgcggcc attctgcgcc gccacgtggg 6060

accgggggag ggcgcggtcc aatggatgaa caggcttatt gcctttgctt ccagaggaaa 6120

ccacgtcgcc cctactcact acgtgacgga gtcggatgcg tcgcagcgtg tgacccaact 6180

acttggctct cttactataa ccagcctact cagaagactc cacaattgga taactgagga 6240

ctgccccatc ccatgctccg gatcctggct ccgcgacgtg tgggactggg tttgcaccat 6300

cttgacagac ttcaaaaatt ggctgacctc taaattgttc cccaagctgc ccggcctccc 6360

cttcatctct tgtcaaaagg ggtacaaggg tgtgtgggcc ggcactggca tcatgaccac 6420

gcgctgccct tgcggcgcca acatctctgg caatgtccgc ctgggctcta tgaggatcac 6480

agggcctaaa acctgcatga acacctggca ggggaccttt cctatcaatt gctacacgga 6540

gggccagtgc gcgccgaaac cccccacgaa ctacaagacc gccatctgga gggtggcggc 6600

ctcggagtac gcggaggtga cgcagcatgg gtcgtactcc tatgtaacag gactgaccac 6660

tgacaatctg aaaattcctt gccaactacc ttctccagag tttttctcct gggtggacgg 6720

tgtgcagatc cataggtttg cacccacacc aaagccgttt ttccgggatg aggtctcgtt 6780

ctgcgttggg cttaattcct atgctgtcgg gtcccagctt ccctgtgaac ctgagcccga 6840

cgcagacgta ttgaggtcca tgctaacaga tccgccccac atcacggcgg agactgcggc 6900

gcggcgcttg gcacggggat cacctccatc tgaggcgagc tcctcagtga gccagctatc 6960

agcaccgtcg ctgcgggcca cctgcaccac ccacagcaac acctatgacg tggacatggt 7020

cgatgccaac ctgctcatgg agggcggtgt ggctcagaca gagcctgagt ccagggtgcc 7080

cgttctggac tttctcgagc caatggccga ggaagagagc gaccttgagc cctcaatacc 7140

atcggagtgc atgctcccca ggagcgggtt tccacgggcc ttaccggctt gggcacggcc 7200

tgactacaac ccgccgctcg tggaatcgtg gaggaggcca gattaccaac cgcccaccgt 7260

tgctggttgt gctctccccc cccccaagaa ggccccgacg cctcccccaa ggagacgccg 7320

gacagtgggt ctgagcgaga gcaccatatc agaagccctc cagcaactgg ccatcaagac 7380

ctttggccag cccccctcga gcggtgatgc aggctcgtcc acgggggcgg gcgccgccga 7440

atccggcggt ccgacgtccc ctggtgagcc ggccccctca gagacaggtt ccgcctcctc 7500

tatgcccccc ctcgaggggg agcctggaga tccggacctg gagtctgatc aggtagagct 7560

tcaacctccc ccccaggggg ggggggtagc tcccggttcg ggctcggggt cttggtctac 7620

ttgctccgag gaggacgata ccaccgtgtg ctgctccatg tcatactcct ggaccggggc 7680

tctaataact ccctgtagcc ccgaagagga aaagttgcca atcaaccctt tgagtaactc 7740

gctgttgcga taccataaca aggtgtactg tacaacatca aagagcgcct cacagagggc 7800

taaaaaggta acttttgaca ggacgcaagt gctcgacgcc cattatgact cagtcttaaa 7860

ggacatcaag ctagcggctt ccaaggtcag cgcaaggctc ctcaccttgg aggaggcgtg 7920

ccagttgact ccaccccatt ctgcaagatc caagtatgga ttcggggcca aggaggtccg 7980

cagcttgtcc gggagggccg ttaaccacat caagtccgtg tggaaggacc tcctggaaga 8040

cccacaaaca ccaattccca caaccatcat ggccaaaaat gaggtgttct gcgtggaccc 8100

cgccaagggg ggtaagaaac cagctcgcct catcgtttac cctgacctcg gcgtccgggt 8160

ctgcgagaaa atggccctct atgacattac acaaaagctt cctcaggcgg taatgggagc 8220

ttcctatggc ttccagtact cccctgccca acgggtggag tatctcttga aagcatgggc 8280

ggaaaagaag gaccccatgg gtttttcgta tgatacccga tgcttcgact caaccgtcac 8340

tgagagagac atcaggaccg aggagtccat ataccaggcc tgctccctgc ccgaggaggc 8400

ccgcactgcc atacactcgc tgactgagag actttacgta ggagggccca tgttcaacag 8460

caagggtcaa acctgcggtt acagacgttg ccgcgccagc ggggtgctaa ccactagcat 8520

gggtaacacc atcacatgct atgtgaaagc cctagcggcc tgcaaggctg cggggatagt 8580

tgcgcccaca atgctggtat gcggcgatga cctagtagtc atctcagaaa gccaggggac 8640

tgaggaggac gagcggaacc tgagagcctt cacggaggcc atgaccaggt actctgcccc 8700

tcctggtgat ccccccagac cggaatatga cctggagcta ataacatcct gttcctcaaa 8760

tgtgtctgtg gcgttgggcc cgcggggccg ccgcagatac tacctgacca gagacccaac 8820

cactccactc gcccgggctg cctgggaaac agttagacac tcccctatca attcatggct 8880

gggaaacatc atccagtatg ctccaaccat atgggttcgc atggtcctaa tgacacactt 8940

cttctccatt ctcatggtcc aagacaccct ggaccagaac ctcaactttg agatgtatgg 9000

atcagtatac tccgtgaatc ctttggacct tccagccata attgagaggt tacacgggct 9060

tgacgccttt tctatgcaca catactctca ccacgaactg acgcgggtgg cttcagccct 9120

cagaaaactt ggggcgccac ccctcagggt gtggaagagt cgggctcgcg cagtcagggc 9180

gtccctcatc tcccgtggag ggaaagcggc cgtttgcggc cgatatctct tcaattgggc 9240

ggtgaagacc aagctcaaac tcactccatt gccggaggcg cgcctactgg acttatccag 9300

ttggttcacc gtcggcgccg gcgggggcga catttttcac agcgtgtcgc gcgcccgacc 9360

ccgctcatta ctcttcggcc tactcctact tttcgtaggg gtaggcctct tcctactccc 9420

cgctcggtag agcggcacac actaggtaca ctccatagct aactgttcct tttttttttt 9480

tttttttttt tttttttttt tttttttttt ttcttttttt tttttttccc tctttcttcc 9540

cttctcatct tattctactt tctttcttgg tggctccatc ttagccctag tcacggctag 9600

ctgtgaaagg tccgtgagcc gcatgactgc agagagtgcc gtaactggtc tctctgcaga 9660

tcatgt 9666

<210>33

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>n is A，G，C or T

<222>(7)

<220>

<223>人工序列说明：合成的

<400>33

cgtctcntat tacctgcc 18

<210>34

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>n is A，G，C or T

<222>(12)

<220>

<223>人工序列说明：合成的

<400>34

gatcatgtcc cngagacg 18

<210>35

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>n is A，G，C or T

<222>(7)

<220>

<223>人工序列说明：合成的

<400>35

gcagagnata atggacgg 18

<210>36

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>n is A，G，C or T

<222>(12)

<220>

<223>人工序列说明：合成的

<400>36

ctagtacagg gnctctgc 18

<210>37

<211>33

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：合成的

<400>37

gggttattgg agacggtacc gtctcctccc ccc 33

<210>38

<211>33

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：合成的

<400>38

cccaataacc tctgccatgg cagaggaggg ggg 33

<210>39

<211>11

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：合成的

<400>39

tattacctgc c 11

<210>40

<211>11

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：合成的

<400>40

ctagtacagg g 11

<210>41

<211>15

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：合成的

<400>41

gggttattac ctgcc 15

<210>42

<211>14

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：合成的

<400>42

gatcatgtcc cccc 14

<210>43

<211>15

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：合成的

<400>43

cccaataatg gacgg 15

<210>44

<211>14

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：合成的

<400>44

ctagtacagg gggg 14

<210>45

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：合成的

<400>45

tgctggcttt gatgaaaacc tgcccctaat ag 32

Claims

1.生产感染性丙型肝炎病毒(HCV)颗粒的方法，该方法包含将表达载体导入由Huh7、Huh7.5.1、HepG2中选择的细胞中的步骤：

其中i)将下述表达载体引入到Huh 7.5.1细胞，该表达载体包含：pHH21载体中的人RNA聚合酶I启动子下游的、SEQ ID NO：29的DNA序列，以及在SEQ ID NQ：29的DNA序列下游的、包含小鼠RNA聚合酶I终止子的DNA，其中SEQ ID NO：29的DNA序列包含来自HCV JFH1和J6CF株的嵌合5’非翻译区，编码来自HCV J6CF株的核心蛋白、E1蛋白、E2蛋白、p7蛋白的DNA序列，和编码来自HCV JFH1株的NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B蛋白的DNA序列以及3’非翻译区；

ii)将下述表达载体引入到Huh 7.5.1细胞，该表达载体包含：在pHH21载体中人RNA聚合酶I启动子下游的、SEQ ID NO：31的DNA序列，以及在SEQ ID NO：31的DNA序列下游的、包含小鼠RNA聚合酶I终止子的DNA，其中SEQ ID NO：31的DNA序列包含来自HCV JFH1和J1株的嵌合5’非翻译区，编码来自HCV J1株的核心蛋白、E1蛋白、E2蛋白、p7蛋白的DNA序列，和编码来自HCV JFH1株的NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B蛋白的DNA序列以及3’非翻译区；或

iii)将下述表达载体引入到HepG2或Huh 7细胞，该表达载体包含：在pHH21载体中人RNA聚合酶I启动子下游的、SEQ ID NO：27的DNA序列，以及在SEQ ID NO：27的DNA序列下游的、包含小鼠RNA聚合酶I终止子的DNA，其中SEQ ID NO：27的DNA序列包含来自HCV JFH1株的嵌合5’非翻译区，编码核心蛋白、E1蛋白、E2蛋白、p7蛋白、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B蛋白的DNA序列以及3’非翻译区。

2.权利要求1所述的方法，其中所述表达载体还包含抗药性基因。

3.权利要求2所述的方法，其中所述抗药性基因是Zeocin抗性基因。