JP5030065B2 - 感染性c型肝炎ウイルス粒子高産生系 - Google Patents
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Description
(b) HCVの増殖を許容する細胞が、Huh7、RCYM1RC、5-15RC、HepG2およびそれらの細胞から派生した株化細胞からなる群から選択される(a)の感染性HCV粒子を産生する方法、
(c) 感染性C型肝炎ウイルス(HCV)粒子を産生するためのベクターであって、リボソームRNA遺伝子由来のRNAポリメラーゼIが認識するプロモーターの下流にJFH1株由来のHCVゲノムcDNAを含みさらにその下流にリボソームRNA遺伝子由来のRNAポリメラーゼIが認識するターミネーターを含むDNAを含む発現ベクター。
i) RNAポリメラーゼIプロモーターの下流に、HCV株由来の5’非翻訳領域、Coreタンパク質、E1タンパク質、E2タンパク質、p7タンパク質、NS2タンパク質をコードするDNA配列と、HCV JFH1株由来のNS3、NS4A、NS4B、NS5AおよびNS5Bタンパク質ならびに3’非翻訳領域をコードするDNA配列とを含み、さらにその下流にRNAポリメラーゼIターミネーターを含むDNAを含む発現ベクター、または
ii) RNAポリメラーゼIプロモーターの下流に、HCV株由来の5’非翻訳領域、Coreタンパク質、E1タンパク質、E2タンパク質、p7タンパク質をコードするDNA配列と、HCV JFH1株由来のNS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5AおよびNS5Bタンパク質ならびに3’非翻訳領域をコードするDNA配列とを含み、さらにその下流にRNAポリメラーゼIターミネーターを含むDNAを含む発現ベクター。
RNAを転写するRNAポリメラーゼには3種類知られている。RNAポリメラーゼIはリボソームRNA遺伝子からrRNAを、RNAポリメラーゼIIはタンパク質をコードする遺伝子からmRNAを、RNAポリメラーゼIIIはtRNA遺伝子からtRNAを転写する。
上記のようにして作製される本発明の発現ベクターを細胞内に導入してHCV RNAを転写することができる。細胞へのDNAの導入はエレクトロポレーション法、リポフェクション法、リン酸カルシュウム法など一般的な方法を用いて行うことができる。
HCVが感染し、HCVゲノムRNAが複製されている細胞では、上記のHCVタンパク質が発現されている。従って、HCVゲノムRNA複製細胞から抽出したタンパク質中からHCVタンパク質が検出されれば、その細胞は、HCVゲノムRNAを複製しているものと判断することができる。HCVタンパク質の検出は、公知の任意のタンパク質検出法に従って行うことができ、例えば、導入されたHCVゲノムRNAから発現されるべきHCVタンパク質に対する抗体を、細胞から抽出したタンパク質と反応させることによって行うことができる。より具体的には、例えば、細胞から抽出したタンパク質試料をニトロセルロース膜にブロッティングし、それに対して抗HCVタンパク質抗体(例えば、抗NS3特異的抗体、又はC型肝炎患者から採取した抗血清)を反応させ、さらにその抗HCVタンパク質抗体を検出することによって行うことができる。
本発明の発現ベクターをHCV許容性細胞(HCVの増殖を許容する細胞)に導入し、その細胞を培養することにより、本発明の発現ベクターから転写されたHCVゲノムRNAを有するC型肝炎ウイルス(HCV)粒子を産生することができる。HCV許容性細胞としては、Huh7細胞、RCYM1RC細胞、5-15RC細胞、HepG2細胞およびそれらの細胞から派生した株化細胞などを好適に用いることができる。このようにして産生されたC型肝炎ウイルス(HCV)粒子は、他の細胞への感染性を保持している。本発明は、このような感染性C型肝炎ウイルス粒子の産生方法に関する。
本発明の方法で産生されるHCVウイルス粒子は、細胞(好ましくはHCV許容性(感受性)細胞)への感染能を有する。本発明は、RNAポリメラーゼIプロモーター/ターミネーター系を用いたHCV発現ベクターを導入した細胞を培養し、得られた培養物(好ましくは、培養液)中のウイルス粒子を他の細胞(好ましくはHCV感受性細胞)に感染させることを含む、C型肝炎ウイルス感染細胞の製造方法も提供する。ここで、HCV許容性細胞とは、HCVゲノムRNAの複製能および/またはHCVに感染する能力を有する細胞である。HCV許容性細胞は、好ましくは肝臓細胞又はリンパ球系細胞であるが、これらに限定されるものではない。具体的には、肝臓細胞としては初代肝臓細胞や、Huh7細胞、HepG2細胞、IMY-N9細胞、HeLa細胞、293細胞などが挙げられ、リンパ球系細胞としてはMolt4細胞や、HPB-Ma細胞、Daudi細胞などが挙げられるが、これらに限定されるものでは無い。特に好ましいHCV許容性細胞としては、Huh7細胞、RCYM1RC細胞、5-15RC細胞、HepG2細胞およびそれらの細胞から派生した(作製された)株化細胞が挙げられる。Huh7細胞から派生した細胞で好ましい細胞として、Huh7.5細胞およびHuh7.5.1細胞が挙げられる。
本発明のRNAポリメラーゼIプロモーター/ターミネーター系を用いたHCV発現ベクターが安定的に導入された細胞は、感染性HCV粒子を持続的に生産することができる。本発明のRNAポリメラーゼIプロモーター/ターミネーター系を用いたHCV発現ベクターを安定的に発現する細胞株を得るためには、本ベクター内に薬剤抵抗性遺伝子を組み込んで置くことが望ましい。薬剤抵抗性遺伝子として、G418抵抗性遺伝子、ハイグロマイシン抵抗性遺伝子、ピューロマイシン抵抗性遺伝子、Zeocin抵抗性遺伝子、ブラストサイジン抵抗性遺伝子などが挙げられる。また、薬剤抵抗性を指標として選別されたクローンのHCV粒子産生能は、それらのクローンの培養上清中のCoreタンパク質量やクローンで複製されるHCV RNA量をノーザンブロットや定量的RT-PCRにて検出することで推定できる。
RNAポリメラーゼIプロモーター/ターミネーター系を用いたHCV発現ベクターの構築
HCVゲノムRNAのcDNAとして、遺伝子型2aのJFH1株由来ゲノムRNAのcDNA(GenBankアクセッション番号AB047639、Kato, T. et al., Gastroenterology, 125(2003) p1808-1817)、JFH1株のNS5B中のGDDアミノ酸配列がGNDとなるようにDNA配列を変換したJFH1株由来ゲノムRNAのcDNA(Wakita, T. et al. Nat. Med., 11 (2005) p.791-796)、J6CF株由来ゲノムRNAのcDNA(GenBankアクセッション番号AF177036、Yanagi, M. et al. Virology, 262 (1999) p.250-263)、遺伝子型1aのH77c株由来のゲノムRNAのcDNA(GenBankアクセッション番号AF011751、Yanagi, M. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94 (1997) p.8738-8743)、および遺伝子型1bのJ1株由来のゲノムRNAのcDNA(GenBankアクセッション番号D89815、Aizaki, H. et al. Hepatology, 27 (1998) p.621-627)を使用した。
JFH1株由来ゲノムRNA全領域に対応するcDNAをpUC19プラスミド中にクローニングすることにより構築されたプラスミドDNAであるpJFH1(Wakita, T. et al. Nat. Med., 11 (2005) p791-796、国際公開WO2004/104198)をAgeIで消化後、さらにBclIで部分消化し、AgeI部位から最初のBclI部位までの断片(2672 bp)が除去されたプラスミドDNA断片を精製した。一方、J6CF株由来ゲノムcDNAをAgeIとBclIで部分消化して得られる2672 bpの断片を上記の断片に連結し、pUC J6/JFH1を得た。
上記JFH1ゲノムcDNAを鋳型として、LA-PCRキット(タカラバイオ社)に添付されていた、10×緩衝液を5μl、2.5mM dNTP混合液を5μl、10μMのプライマー 5-JFH-S (配列番号10:GCCATGGCGTTAGTATGAGTGTCGT)および5-JFH-A(配列番号11:TCGTGCTCATGGTGCACGGTCTACGAGACC)をそれぞれ1μl加え、最終的に脱イオン水を加え全量を49μlとした。次にTakara LA Taq(タカラバイオ社)を1μl加えてから、PCR反応を行った。PCR反応は、94℃1分、64℃2分、72℃3分からなる工程を1サイクルとして30サイクルの条件で行った。得られたPCR産物をPCR産物no.1とした。次に、JFH1ゲノムcDNAを鋳型として、LA-PCRキット(タカラバイオ社)に添付されていた、10×緩衝液を5μl、2.5mM dNTP混合液を5μl、10μMのプライマー 3-JFH-S(配列番号12:GGCATACGCATATGACGCACCTGTGCACGG)および3-JFH-A(配列番号13:GCTCTGACGAAGTACGGCACATGTGTC)をそれぞれ1μl加え、最終的に脱イオン水を加え全量を49μlとした。次にTakara LA Taq(タカラバイオ社)を1μl加えてから、PCR反応を行った。PCR反応は、94℃1分、64℃2分、72℃3分からなる工程を1サイクルとして25サイクルの条件で行った。得られたPCR産物をPCR産物no.2とした。さらに、上記H77cゲノムcDNAを鋳型として、LA-PCRキット(タカラバイオ社)に添付されていた、10×緩衝液を5μl、2.5mM dNTP混合液を5μl、10μMのプライマー 5-H77-S(配列番号14:ACCGTGCACCATGAGCACGAATCCTAAACC)および5-H77-A(配列番号15:GAAGCCGCACGTAAGGGTATCGATG:)をそれぞれ1μl加え、最終的に脱イオン水を加え全量を49μlとした。次にTakara LA Taq(タカラバイオ社)を1μl加えてから、PCR反応を行った。PCR反応は、94℃1分、64℃2分、72℃3分からなる工程を1サイクルとして25サイクルの条件で行った。得られたPCR産物をPCR産物no.3とした。次に、H77cゲノムcDNAを鋳型として、LA-PCRキット(タカラバイオ社)に添付されていた、10×緩衝液を5μl、2.5mM dNTP混合液を5μl、10μMのプライマー 3-H77-S(配列番号16:CATTGTGCCCGCAAAGAGCGTGTGT)および3-H77-A(配列番号17:GTGCGTCATATGCGTATGCCCGCTGAGGCA)をそれぞれ1μl加え、最終的に脱イオン水を加え全量を49μlとした。次にTakara LA Taq(タカラバイオ社)を1μl加えてから、PCR反応を行った。PCR反応は、94℃1分、64℃2分、72℃3分からなる工程を1サイクルとして25サイクルの条件で行った。得られたPCR産物をPCR産物no.4とした。
上記JFH1ゲノムcDNAを鋳型として、LA-PCRキット(タカラバイオ社)に添付されていた、10×緩衝液を5μl、2.5mM dNTP混合液を5μl、10μMのプライマー5-JFH-S(配列番号10:GCCATGGCGTTAGTATGAGTGTCGT)および5-JFH-A2(配列番号18:TTGTGCTCATGGTGCACGGTCTACGAGACC)をそれぞれ1μl加え、最終的に脱イオン水を加え全量を49μlとした。次にTakara LA Taq(タカラバイオ社)を1μl加えてから、PCR反応を行った。PCR反応は、94℃1分、64℃2分、72℃3分からなる工程を1サイクルとして25サイクルの条件で行った。得られたPCR産物をPCR産物no.5とした。
上記JFH1ゲノムcDNAを鋳型として、LA-PCRキット(タカラバイオ社)に添付されていた、10×緩衝液を5μl、2.5mM dNTP混合液を5μl、10μMのプライマー5-JFH-S(配列番号10:GCCATGGCGTTAGTATGAGTGTCGT)および5-JFH-A2(配列番号18:TTGTGCTCATGGTGCACGGTCTACGAGACC)をそれぞれ1μl加え、最終的に脱イオン水を加え全量を49μlとした。次にTakara LA Taq(タカラバイオ社)を1μl加えてから、PCR反応を行った。PCR反応は、94℃1分、64℃2分、72℃3分からなる工程を1サイクルとして25サイクルの条件で行った。得られたPCR産物をPCR産物no.9とした。
細胞内でのHCV RNAの合成確認
実施例1で作製したpHH JFH1およびpHH JFH1/GNDをHuh7およびHepG2細胞にFugene 6(ロシュ社)を用いて、添付マニュアルに従って導入した。24時間後に各細胞からRNAをIsogen(日本ジーン社)にて、添付マニュアルに従って調製した。
細胞内でのHCV タンパク質の発現確認
pHH JFH1、pHH H77cおよびpHH JFH1/GNDを導入された細胞で、転写に引き続き、HCVタンパク質の翻訳が起こっているかについて確認した。
HCV 粒子の産生
次に、pHH JFH1導入細胞からHCV粒子が産生されるかどうかを確認するため、培養上清中のCoreタンパク質の解析を行った。pHH JFH1および対照として、Core、E1、E2およびp7を発現するベクターpCAG327JFH1をHepG2細胞にFugene 6を用いて導入して2日後に培養上清を除き、新鮮な培地を加えさらに2日間培養した。次いで、細胞と培養液を回収し、細胞からタンパク質を抽出し、実施例3に示す方法で、細胞中のコアタンパク質の発現を解析した。その結果、コアタンパク質が発現していることを確認した(図6A)。培養液中のHCV粒子の存在を確認するため、培養液をショ糖密度勾配により分画した。10〜60%(重量/重量)の密度勾配ショ糖溶液(50mM Tris pH7.5/0.1M NaCl/1mM EDTAに溶解)に、さらにサンプルの培養上清を0.2ml重層した。これをベックマンローターS W41Eで35,000RPM、4℃、16時間遠心し、遠心終了後遠心チューブの底から0.5mlずつ分画回収した。各分画の密度、HCV Core蛋白濃度を定量した。HCV Coreタンパク質の測定はオーソHCV抗原IRMAテストを用いて行った(Aoyagi et al., J. Clin. Microbiol., 37 (1999) p.1802-1808)。
HCV粒子の感染性確認
実施例4で得られたHCV粒子が感染性を有しているかについて検討した。pHH JFH1をHuh7細胞およびHepG2細胞にFugene 6を用いて導入し、3日から5日間培養した培養上清を限外濾過膜(cut off 1×105 Da)を用いて30倍に濃縮した。次に、濃縮したHCV粒子を含む培養液100μlでHuh7.5.1細胞を15mmカバースリップ上で培養して、4日後に細胞を抗NS5A抗体で蛍光染色した。抗NS5A抗体染色陽性、すなわち、感染細胞を数えたところ、図8に示すように、一部の感染細胞が確認された。これらの結果から、pHH JFH1をHuh7またはHepG2細胞へ導入することにより、培養液中に分泌されたHCV粒子は、感染する能力を有することが確認された。
感染性HCV粒子産生細胞株の取得
上記実施例で示されたシステムを利用して、感染性HCV粒子を持続的に生産する細胞株の樹立を試みた。
R6-290-R19:5’-AGTACCACAAGGCCTTTCG-3’(配列番号8)
TaqMan Probe, R6-148-S21FT:5’-CTGCGGAACCGGTGAGTACAC-3’(配列番号9)
その結果、HepG2/No59細胞培養上清中のHCV RNAは6.1×108コピー/mlであることが分かった。この産生量はこれまでに報告された量より約60倍高い。
キメラHCV発現ベクターによるHCV粒子の作製
実施例1で作製されたキメラHCV発現ベクターpHH H77c(C-p7)/JFH1、pHH J6(C-p7)/JFH1、pHH J1(C-p7)/JFH1およびpHH J1(C-NS2)/JFH1を、Huh7細胞から派生した株化細胞であるHuh7.5.1細胞(Zhong, J. et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA, 102, 9294-9299, (2005))にFugene 6(ロシュ社)を用いて、添付マニュアルに従って導入した。導入3日後にそれらの培養上清を回収し、培養上清中に含まれるCoreタンパク質の量を測定した。Coreタンパク質量の測定にはオーソHCV抗原IRMAテストを用いた(Aoyagi et al., J. Clin. Microbiol., 37 (1999) p.1802-1808)。陰性コントロールとしてベクターを導入していない細胞の培養上清、陽性コントロールとして、pHH JFH1を導入した細胞の培養上清を用いた。それら実験結果の一例を表1に示す。各キメラHCV発現ベクターを導入された細胞上清にCoreタンパク質が確認できたことから、ウイルス粒子が産生されたと判断された。また、pHH J6(C-p7)/JFH1は、pHH JFH1より10倍以上高いHCV産生能を有することも判明した。
pHH J6(C-p7)/JFH1およびpHH J1(C-p7)/JFH1を実施例7に示した方法でHuh7.5.1細胞に導入し、導入後3日後の培養上清を限外濾過膜(cut off 1×105 Da)を用いて濃縮した。濃縮したHCV粒子を含む培養上清100μlを加えてHuh7.5.1細胞を15mmカバースリップ上で培養して、4日後に細胞を抗NS5A抗体で免疫染色した。その結果、pHH J6(C-p7)/JFH1を導入した細胞から得られた培養上清で処理した細胞では、抗NS5A抗体で強く染色される細胞が見られた。一方、pHH J1(C-p7)/JFH1を導入した細胞から得られた培養上清で処理した細胞では、pHH J6(C-p7)/JFH1と比較すると抗NS5A抗体で染色される強度は弱いが、コントロールの細胞と比較して明らかに染色されていた。以上から、pHH J6(C-p7)/JFH1およびpHH J1(C-p7)/JFH1が導入された細胞では感染性HCVが産生されたことが判明した。
Claims (4)
- 以下のi)またはii)の発現ベクターを、Huh7、RCYM1RC、5-15RC、HepG2およびそれらの細胞から派生した株化細胞からなる群から選択される細胞に導入する工程を含む、感染性C型肝炎ウイルス(HCV)粒子を産生する方法:
i) RNAポリメラーゼIプロモーターの下流に、HCV株由来の5’非翻訳領域、Coreタンパク質、E1タンパク質、E2タンパク質、p7タンパク質、NS2タンパク質をコードするDNA配列と、HCV JFH1株由来のNS3、NS4A、NS4B、NS5AおよびNS5Bタンパク質ならびに3’非翻訳領域をコードするDNA配列とを含み、さらにその下流にRNAポリメラーゼIターミネーターを含むDNAを含む発現ベクター、
ii) RNAポリメラーゼIプロモーターの下流に、HCV株由来の5’非翻訳領域、Coreタンパク質、E1タンパク質、E2タンパク質、p7タンパク質をコードするDNA配列と、HCV JFH1株由来のNS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5AおよびNS5Bタンパク質ならびに3’非翻訳領域をコードするDNA配列とを含み、さらにその下流にRNAポリメラーゼIターミネーターを含むDNAを含む発現ベクター。 - 前記HCV株が遺伝子型1または遺伝子型2のHCV株である、請求項1記載の方法。
- 前記遺伝子型1のHCV株がH77c株、1株、H株、HC-J1株、J1株、con1株、TH株、J株、JT株、BK株よりなる群から選択されるものである請求項2記載の方法。
- 前記遺伝子型2のHCV株がJ6CF株、JFH1株、JCH1株、HC-J8株よりなる群から選択されるものである請求項2記載の方法。
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