WO2007037428A1 - 感染性ｃ型肝炎ウイルス粒子高産生系 - Google Patents

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WO2007037428A1
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Jun-Ichi Tanabe
Saburo Sone
Takaji Wakita
Koji Ishii
Ryosuke Suzuki
Tetsuro Suzuki
Tatsuo Miyamura
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Japan As Represented By Director-General Of National Institute Of Infectious Diseases
Tokyo Metropolitan Organization For Medical Research
Toray Industries, Inc.
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Definitions

  • the present invention relates to a high production method of infectious human hepatitis C virus particles.
  • HCV Human hepatitis C virus
  • HCV subgenomic RNA replicons have been produced as RNA having autonomous replication ability derived from HCV (Patent Document 1, Patent Document 2, and Non-Patent Documents 1 to 3). It became possible to analyze the replication mechanism of HCV. These HCV subgenomic RNA replicons replace the structural protein present downstream of the HCV IRES in the 5 'untranslated region of the HCV genomic RNA with the neomycin resistance gene and EM CV-IRES linked downstream thereof. . By introducing this RNA replicon into human hepatoma cell Huh7 and culturing it in the presence of neomycin, it was proved that the RNA replicon replicates autonomously in Huh7 cells. However, this experimental system is an experimental system that can evaluate only viral RNA replication in the process of HCV virus propagation and replication, and does not produce virus particles. Release to new cells It is not possible to evaluate the infection and the process of infection.
  • HCV cDNA When HCV cDNA is expressed under the control of an RNA polymerase type II promoter such as CMV, a CAP structural force is added to the 5 'end of the transcribed RNA and a poly A chain is added to the 3' end. Therefore, it is used as a type of protein synthesis in the ribosome, and there is a problem that transcription of the transcribed RNA does not occur.
  • an RNA polymerase type II promoter such as CMV
  • Non-patent Document 5 a construct was prepared so that HCV RNA without a cap and poly A attached could be synthesized in the cell.
  • this method is used in a method for synthesizing hairpin RNA in a cell without capting the 5 ′ end with a ribozyme (Non-patent Document 6).
  • expression of an expression vector with an HCV construct sandwiched between two ribozymes in Huh7 produces 1 X 10 7 copies / ml HCV particles. However, whether this particle is infectious has not been studied.
  • Non-Patent Document 7 Non-Patent Document 7
  • Non-Patent Document 8 The production of HCV particles in this system is about 1 X 10 7 copies / ml. It was also shown that chimeric virus RNA, in which the nonstructural protein region of conl strain of HCV genotype lb is replaced with the gene of genotype 2a virus strain, can produce infectious HCV particles in the cell culture system. (Non-Patent Document 9). No specific numerical value of HCV particle production in this system has been disclosed.
  • Non-Patent Document 11 As a system for producing viral particles using cDNA corresponding to the genomic RNA of RNA virus, it is used for production of infnorenenoinoles (minus-strand RNA virus) in animal cell systems.
  • a system using an RNA polymerase I promoter and a terminator (Non-Patent Document 11) is also known.
  • an influenza virus particle production system using such an RNA polymerase I promoter and terminator cannot be said to be superior in production amount to a conventional influenza virus particle production system.
  • Non-patent document 11 does not describe or suggest the production system of HCV, which is a positive-strand RNA virus.
  • Patent Document 1 Japanese Patent Laid-Open No. 2001-17187
  • Patent Document 2 WO2004 / 104198A1
  • Patent Document 3 WO05080575A1
  • Non-Patent Document 1 Blight et al., Science, 290 (2000) pl972-74
  • Non-Patent Document 2 Friebe et al., J. Virol, 75 (2001) pl2047-57
  • Non-Patent Document 3 Kato, T. et al., Gastroenterology, 125 (2003) pl808-17
  • Non-Patent Document 4 Lim SP. Et al., Virology, 303 (2002) p79-p99.
  • Non-Patent Document 5 Heller, T. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 102 (2005) p2579- 83
  • Non-Patent Document 6 Shinagawa, T. & Ishii, S., Genes Dev., 17 (2003) pi 340-45
  • Non-Patent Document 7 Wakita et al. Nature Med. 11 (2005) p791-96
  • Non-Patent Document 8 Lindenbach BD. Et al., Science. 309 (2005) p623- 26
  • Non-Patent Document 9 Pietschmann T. et al., 11th International Symposium on Hepatitis C
  • Non-Patent Document 10 Blight, KJ. Et al., J. Virol, 76 (2002) pl3001-14
  • Non-Patent Document 11 Neumann, G. et al., Virology, 202 (1994) p477-479
  • An object of the present invention is to provide a method for highly producing infectious hepatitis C virus particles from recombinant DNA in a cultured cell system.
  • HCV genomic RNA capable of replication from HCV genomic cDNA in a cell
  • the present inventors have developed an HCV genome having a different genotype and a promoter / terminator for expressing it. And found a new combination that replicates HCV genomic RNA. Subsequently, cells that synthesize the HCV genomic RNA were cultured, and it was confirmed that infectious HCV particles were produced at higher levels than previously reported, and the present invention was completed.
  • the present invention relates to the following (a) to (c).
  • a method for producing infectious hepatitis C virus (HCV) particles comprising a HCV genomic cDNA derived from JFH1 strain downstream of a promoter recognized by RNA polymerase I derived from a ribosomal RNA gene.
  • a method for producing infectious HCV particles further comprising a step of introducing an expression vector containing DNA containing a terminator recognized by RNA polymerase I derived from a ribosomal RNA gene downstream into a cell allowing HCV growth,
  • a vector for producing infectious hepatitis C virus (HCV) particles comprising a HCV genomic cDNA derived from JFH1 strain downstream of a promoter recognized by RNA polymerase I derived from a ribosomal RNA gene
  • the present invention relates to a method for producing infectious hepatitis C virus (HCV) particles, comprising a 5 'untranslated region of HCV and a structural protein and optionally a non-structure downstream of an RNA polymerase I promoter.
  • An expression vector comprising a DNA sequence encoding a protein, a DNA sequence encoding a non-structural protein derived from the HCV JFH1 strain and a 3 ′ untranslated region, and further comprising an RNA polymerase I terminator downstream thereof, It also relates to a method comprising a step of introducing into a cell allowing HCV growth.
  • the present invention relates to the following methods (1) to (4).
  • the following expression vector 0 or ii) is introduced into a cell selected from the group consisting of Huh7, RCYM1RC, 5-15RC, HepG2 and cell lines derived from these cells.
  • Methods for producing infectious hepatitis C virus (HCV) particles including:
  • RNA polymerase I promoter 5 'untranslated region from HCV strain, Core protein, E1 protein, E2 protein, p7 protein, DNA sequence encoding NS2 protein, NS3, NS4A from HCV JFH1 strain An NS4B, NS5A and NS5B protein and a DNA sequence encoding a 3 ′ untranslated region, and an expression vector containing DNA containing an RNA polymerase I terminator downstream thereof, or
  • RNA polymerase I promoter Downstream of the RNA polymerase I promoter, 5 'untranslated region from HCV strain, Core protein, E1 protein, E2 protein, DNA sequence encoding p7 protein, NS2, NS3 from HCV JF HI strain, An expression vector comprising NS4A, NS4B, NS5A and NS5B proteins and a DNA sequence encoding a 3 ′ untranslated region, and further comprising DNA containing an RNA polymerase I terminator downstream thereof.
  • HCV strain with genotype 1 is selected from the group power consisting of H77c strain, 1 strain, H strain, HC-J1 strain, J1 strain, conl strain, TH strain, J strain, JT strain, BK strain The method according to (2) above.
  • genotype 2 HCV strain is also selected from the group strength consisting of J6CF strain, JFH1 strain, JCH1 strain, and HC-J8 strain.
  • the infectious HCV particles are about 60 times as much as conventional methods. High density and high production.
  • FIG. 1A shows the construction of an HCV expression vector using the RNA polymerase I promoter / terminator system.
  • FIG. 1B shows a map of pHH H77c ⁇ pHH JFH1, pHH JFH1 / GND.
  • Figure 1C shows the maps of pHH H77c (C-p7) / JFHl, pHH J6 (C—p7) / JFHl, pHH J1 (C—p7) / JFHl and pHH J1 (C-NS2) / JFH1 .
  • FIG. 2 is a photograph showing experimental results confirming that HCV RNA is transcribed in cells into which an RNA polymerase I promoter / terminator HCV expression vector has been introduced. Lanes 1 and 3 show the results when pHH JFH1 is introduced into Huh7 and HepG2, respectively. Lanes 2 and 4 show the results when pHH JFH1 / GND is introduced into Huh7 and HepG2, respectively.
  • FIG. 3 shows the sequences of the 5 and 5 ends of HCV RNA transcribed with the polymerase I promoter / terminator 1 expression vector.
  • the 5 'end of HCV RNA transcribed in cells transfected with PHH JFH1 and pHH JFH1 / GND was identical to the sequence of JFH1 genomic RNA.
  • FIG. 4 is a photograph showing the experimental results confirmed by translating the HCV protein into cells into which an RNA polymerase I promoter / terminator HCV expression vector was introduced! is there. It has been shown that the core protein and NS5A protein are translated in cells into which pHH JFH1 has been introduced. HCV protein is translated in cells transfected with pHH H77c and pHH JFH1 / GND.
  • Figure 5 shows the introduction of pHH JFH1 and pHH JFH1 / GND together with a GFP expression vector into Huh7, RC YM1RC, 5-15RC, HepG2 and 293T cells, followed by HCV tampering in those cells. It is a photograph showing the expression of the protein and the vector introduction efficiency by the expression of GFP. pHH JFH1 expressed the core protein in cells other than 293T. On the other hand, pHH JFH1 / GND did not express the core protein in any cell.
  • FIG. 6A is a photograph showing a core protein in HepG2 cells into which pHH JFH1 has been introduced.
  • FIG. 6B shows the amount of core protein in a sample obtained by fractionating a HepG2 cell culture medium into which pHH JFH1 had been introduced by sucrose density centrifugation.
  • the core protein specific gravity of pHH JFH1 culture supernatant ( ⁇ ) is found in the fraction of 1.15 g / ml, indicating that the core protein is secreted as virus particles.
  • the culture supernatant (X) of cells expressing core, El, E2, and p7 is broad.
  • FIG. 7 shows that the peak of the core protein fluctuates when the HepG2 cell culture medium into which pHH JFH1 has been treated is treated with NP40, compared to non-treated. Compared to NP40 untreated ( ⁇ ), the core protein peak shifted to 1.20 g / ml when treated with NP40 (country). Light specific gravity, surface membrane force SNP40 shows that the virus particle force was peeled off.
  • Fig. 8 shows that HepG2 cell culture solution (A) or Huh7 cell culture solution (B) introduced with pHH JFH1 concentrated with an ultrafiltration membrane was inoculated into Huh7.5.1, and 4 days later, anti-NS5A antibody was used. It is the photograph which shows the dyeing result. It shows that anti-NS5A antibody positive cells (infected cells) are detected.
  • FIG. 9 shows a map of a vector in which a cassette that expresses a Zeocin resistance gene under the control of the SV40 promoter is inserted into pHH JFH1.
  • FIG. 10 shows the DNA sequence of insert J6 (C-p7) JFHl, and FIG. 10A shows the sequence at the 5 ′ end side.
  • FIG. 10 is a view showing the DNA sequence of insert J6 (C-p7) JFHl, and FIG. 10B shows the sequence following the sequence 3 ′ of FIG. 10A.
  • FIG. 10 shows the DNA sequence of insert J6 (C-p7) JFHl
  • FIG. 10C shows the sequence following the 3 ′ side of the sequence of FIG. 10B.
  • FIG. 10 is a view showing the DNA sequence of insert J6 (C-p7) JFHl, and FIG. 10D shows the 3′-most sequence following the 3 ′ side of the sequence of FIG. 10C.
  • FIG. 11 is a view showing the DNA sequence of the inserted fragment H77c (C-p7) JFH1, and FIG. 11A shows its 5′-end sequence.
  • FIG. 11 shows the DNA sequence of insert H77c (C-p7) JFHl, and FIG. The sequence following the 3 'side of the 11A sequence is shown.
  • FIG. 11 is a view showing the DNA sequence of the insert fragment H77c (C-p7) JFH1, and FIG. 11C shows the sequence that follows the 3 ′ side of the sequence of FIG. 11B.
  • FIG. 11D is a view showing the DNA sequence of the insert fragment H77c (C-p7) JFH1, and FIG. 11D shows the 3′-end sequence following the 3 ′ side of the sequence of FIG. 11C.
  • FIG. 12 shows the DNA sequence of insert Jl (C-p7) JFH 1, and FIG. 12A shows the sequence at its 5 ′ end.
  • FIG. 12 is a view showing the DNA sequence of insert Jl (C-p7) JFHl, and FIG. 12B shows the sequence following the sequence 3 ′ of FIG. 12A.
  • FIG. 12 is a view showing the DNA sequence of insert Jl (C-p7) JFHl, and FIG. 12C shows the sequence following 3 ′ of the sequence in FIG. 12B.
  • FIG. 12 is a view showing the DNA sequence of insert Jl (C-p7) JFHl, and FIG. 12D shows the most 3 ′ end sequence following the 3 ′ side of the sequence of FIG. 12C.
  • FIG. 13 shows the DNA sequence of insert J 1 (C-NS2) JFH1, and FIG. 13A shows the sequence at the 5 ′ end side.
  • FIG. 13B is a diagram showing the DNA sequence of insert J 1 (C-NS2) JFH1, and FIG. 13B shows the sequence that continues on the 3 ′ side of the sequence of FIG. 13A.
  • FIG. 13 is a view showing the DNA sequence of insert J1 (C-NS2) JFH1, and FIG. 13C shows the sequence following the sequence 3 ′ of FIG. 13B.
  • FIG. 13 is a view showing the DNA sequence of insert J1 (C-NS2) JFH1, and FIG. 13D shows the 3 ′ most end sequence following the 3 ′ side of the sequence of FIG. 13C.
  • RNA polymerase I transcribes rRNA from the ribosomal RNA gene
  • RNA polymerase II transcribes mRNA from the gene encoding the protein
  • RNA polymerase III transcribes tRNA from the tRNA gene.
  • Genomic RNAs transcribed by RNA polymerases I and III are their respective terminators. Transcription is terminated by one terminator sequence. On the other hand, a terminator sequence is not required for transcription by RNA polymerase II. The mode of transcription termination is not clear, but it is thought that what is important for the formation of the 3 ′ end of mRNA is due to the cleavage reaction of the primary transcript rather than the transcription termination itself.
  • the transcript of the gene linked downstream of the RNA polymerase I and III promoters is different from the transcript of the gene downstream of the RNA polymerase II promoter, and has a cap at its 5 ′ and 3 ′ ends, respectively. Poly A is not attached.
  • the native HCV genomic RNA has no cap and poly A added to the 5 'and 3' ends. Because of this, it can be expected that the same RNA as HCV virus genomic RNA can be transcribed by expressing HCV genomic DNA with RNA polymerase or III promoter.
  • the promoter that can be used is not limited to the cap and poly A added to the 5 'and 3' ends of the RNA to be transcribed, but preferably the RNA polymerase I promoter is more preferred, and more preferably the rRNA gene.
  • the origin promoter is good.
  • the origin of the promoter may be derived from animals, but preferably derived from mice or humans.
  • a particularly preferred RNA polymerase I promoter is the promoter of the human ribosomal RNA (rRNA) gene.
  • the terminator sequence is preferably RNA polymerase I terminator, and preferably the terminator derived from rRNA gene.
  • the terminator 1 may be derived from an animal, but preferably derived from a mouse or a human.
  • a particularly preferred RNA polymerase I terminator is the mouse ribosomal RNA (rRNA) gene terminator.
  • RNA polymerase I promoter / terminator system has been used to reconstitute influenza virus particles (Neumann, G. et al., Virology, 202 (1994) p477-479, Neum ann, G. & Kawaoka, Y "Virology 287 (2001) p.243-250, Special Table 2003- 520573).
  • the method of the present invention involves pH H21 (Neumann G. et al., Proc, an RNA polymerase I promoter / terminator family vector). Natl. Acad. Sci.
  • pHH21 is an expression vector containing the human RNA polymerase I promoter as the promoter and the mouse RNA polymerase I terminator as the terminator. is there. [0034] After the restriction enzyme BsmBI recognition sequence was attached to the 5 'end and 3' end of the HCV genomic cDNA respectively using PCR, digested with BsmBI, and the HCV genome was inserted into the BsmBI site of pHH21. They can be ligated without any extra nucleotide sequence between the promoter / terminator and HCV genomic cDNA.
  • an expression vector for use in the method of the present invention can be newly constructed by appropriately linking the above promoter, HCV genomic cDNA, and terminator.
  • HCV is classified into 6 types: genotype la, genotype lb, genotype 2a, genotype 2b, genotype 3a, and genotype 3b. Each of these types is classified into several subtypes. For multiple HCV genotypes, the base sequence of the entire genome has also been determined (Simmonds, P. et al., Hepatology, 10 (1994) pl321-1324, and Choo, QL et al, Science, 244 (1989) p359- 36 2, Okamoto, H et al "J. Gen. Virol, 73 (1992) p673-679, Mori, S. et al” Biochem. Biophis. Res. Commun. 183 (1992) p334— 342).
  • H77c of genotype 1 (including genotypes la and lb) (consensus sequence of H77 strain: GenBank accession number AF011751), 1 strain (GenBank Session number M62321), H strain (GenBank accession number M67463), HC-J1 strain (GenBank accession number D10749), J1 strain (GenBank accession number D89815), conl strain (GenBank accession number) AJ238799), TH strain (Wakita, T. et al., J. Biol.
  • J strain (GenBank accession number D90 208), JT strain (GenBank Accession number D01171), BK strain (GenBank accession number M58335), etc., are genotype 2 (including genotype 2a and 2b) J6CF strain (GenBank accession number AF177036), JFH1 strain ( GenBank accession number AB047639, sometimes referred to as JF H-1 strain), JCH1 strain (GenBank accession Version number AB047640), HC-J8 strain (GenBank ⁇ click session number D01221) or the like can be used.
  • a list of GenBank accession numbers has already been reported for other strains (Tokita, T. et al., J. Gen. Virol. (1998) 79, p.1847-1857, Instagram J. & Colina R. Virolgy Journal, (2006) 3, p.1-8), available.
  • HCV genome R to be inserted into RNA polymerase I promoter / terminator vector NA-derived cDNA can be used in any of the above genotypes, and further, a chimera thereof can be used.
  • it is derived from a genotype in which autonomous replication of HCV genomic RNA occurs when introduced into HCV-permissive cells such as Huh7 (Wakita, T., et al. Nat.
  • the genome of hepatitis C virus is a single-stranded RNA (+) strand consisting of about 9600 nucleotides.
  • This genomic RNA consists of a 5 ′ untranslated region (also referred to as 5′NTR or 5′UTR), a translated region composed of a structural region and a nonstructural region, and a 3 ′ untranslated region (3′NTR or 3 ′ (Also referred to as' UTR).
  • the structural region encodes a structural protein of HCV
  • the nonstructural region encodes a plurality of nonstructural proteins.
  • HCV structural proteins Core, El, E2 and p7
  • nonstructural proteins NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A, and NS5B
  • Core is the core protein
  • E1 and E2 are envelope proteins.
  • Nonstructural proteins are proteins involved in the replication of the virus itself.
  • NS2 is meta-protease activity
  • NS3 is serine protease activity (1/3 of the N-terminal side) and helicase activity (3 minutes of C-terminal side). 2).
  • NS4A is a cofactor for the protease activity of NS3, and NS5B has been reported to have RNA-dependent RNA polymerase activity.
  • the expression vector used in the method for producing HCV particles of the present invention comprises a 5 ′ untranslated region of HCV genomic cDNA, a core protein coding sequence, El downstream of a promoter recognized by RNA polymerase I (RNA polymerase ⁇ promoter). , E2 protein coding sequence, p7 protein coding sequence, NS2, NS3, NS4 (including NS4A and NS4B), NS5A, and NS5B protein coding sequences and 3 'untranslated region power consisting of sequences arranged in this order A terminator that contains DNA and is recognized downstream by RNA polymerase I (RNA polymerase I Including Minator! /! These sequences are translated as a series of polyproteins and then released and produced by limited degradation by proteases to produce HCV particles.
  • RNA polymerase I RNA polymerase ⁇ promoter
  • cDNA synthesized from HCV genomic RNA derived from any HCV strain is linked downstream of the RNA polymerase I promoter, and further RNA polymerase I terminator is linked downstream thereof.
  • An expression vector containing the prepared DNA fragment is used.
  • Such an HCV cDNA linked to the downstream of the RNA polymerase I promoter and the upstream of the RNA polymerase I terminator may be a genomic cDNA corresponding to genomic RNA derived from one HCV strain (preferably JFH1 strain).
  • it may be a chimeric nucleic acid in which both genomic RNA power derived from two or more HCV strains (preferably at least one of them is JFH1 strain) and synthesized cDNA power are derived.
  • Such an HCV cDNA linked between the RNA polymerase I promoter and the RNA polymerase I terminator is a 5 'untranslated region of HCV, a structural protein (Core, El, E2 and p7), a nonstructural protein ( NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A, and NS5B) and a HCV whole genome-like cDNA sequence containing DNA sequences encoding the 3 ′ untranslated region one by one in this order.
  • RNA polymerase I promoter downstream of the RNA polymerase I promoter, a DNA sequence encoding a 5 'untranslated region and a structural protein derived from an HCV strain (preferably an HCV strain of genotype 1 or 2), respectively, and further required Depending on the DNA sequence encoding the non-structural protein from the HCV strain, followed by the DNA sequence encoding the non-structural protein from the HCV JFH1 strain and the 3 'untranslated region in this order, and further downstream of the RNA A chimeric HCV expression vector containing a DNA fragment containing the polymerase I terminator is highly preferred because of its high ability to produce infectious HCV.
  • a more preferred expression vector according to the present invention is a 5 'untranslated region coding sequence of HCV genomic cDNA derived from any HCV strain (ie, DNA encoding the full length of HCV genomic RNA) downstream of the RNA polymerase I promoter.
  • Core protein coding sequence, El, E2 protein coding sequence, p7 protein coding sequence, NS2 protein coding sequence and NS3, NS4A, NS4B, NS5A and NS5B protein coding sequences and 3 'of HC V genomic cDNA derived from JFH1 strain Contains the HCV genomic cDNA sequence, which is also an untranslated region coding sequence, and further downstream It contains DNA containing RNA polymerase I terminator.
  • HCV genomic cDNA from any HCV strain, Core protein coding sequence, El, E2 protein coding sequence, p7 protein coding downstream of the RNA polymerase I promoter.
  • the arbitrary HCV strain is preferably a genotype 1 or 2 HCV strain.
  • the 5 ′ untranslated region coding sequence in the above expression vector is preferably a sequence derived from JFH1 strain or a chimeric sequence derived from two or more HCV strains selected from HCV strains of genotype 1 and genotype 2. It is more preferable that a sequence derived from the JFH1 strain is included.
  • HCV strain of genotype for example, H77c strain, 1 strain, H strain, HC-J1 strain, J1 strain, conl strain, TH strain, J strain, JT strain, BK strain and the like can be used.
  • genotype 2 HCV strain for example, J6CF strain, JFH1 strain, JCH1 strain, HC-J8 strain and the like can be used. More preferred HCV strains include JFH1 strain, J6CF strain, J1 strain, and H77c strain.
  • the region encoding the 5 'untranslated region force and NS2 protein that can be incorporated into the expression vector of the present invention is SEQ ID NO: 27 (GenBank accession number).
  • the base sequence shown in the DNA sequence of AB047639) has base numbers 1 to 3430, and the region where NS3 protein strength also encodes up to the 3 ′ untranslated region is base numbers 3431 to 9678.
  • the region encoding from the 5 ′ untranslated region to the p7 protein is the base number 1 to 2779 in the base sequence represented by SEQ ID NO: 27, and the NS2 protein strength 3 ′
  • the region encoding up to the untranslated region is base numbers 2780 to 9678.
  • the position of each region on genomic cDNA derived from other HCV strains can be determined based on the genomic cDNA sequence of this JFH1 strain.
  • Examples of particularly suitable expression vectors according to the present invention include DNA fragments J6 (C-p7) JFHl (SEQ ID NO: 29), H77c (C-p7) JFHl (SEQ ID NO: 30) shown in the Examples below. Jl (C-p7) JFHl (sequence No. 31) and an expression vector containing either J1 (C-NS2) JFH1 (SEQ ID NO: 32). These DNA fragments are preferably inserted under the control of an expression promoter in the vector.
  • the expression vector of the present invention produced as described above can be introduced into cells to transcribe HCV RNA.
  • Introduction of DNA into cells can be performed using a general method such as an electoral position method, a ribofecation method, or a phosphate phosphate method.
  • the HCV RNA transcribed from the expression vector DNA can be analyzed by a conventional molecular biological method (Molecular 3rd Edition Sambrook & Russell old Spring Harbor Laboratory Press 2001). Specifically, the amount or sequence of transcribed RNA can be analyzed using Northern blotting, ribonuclease protection assay, RT-PCR and RACE. When quantifying RNA, Northern blot method or RT-PCR method When analyzing RNA sequence, RACE method is used.
  • RNA linker of a specific sequence is ligated to HCV RNA using RNA ligase, and this is used as a saddle. Synthesis complementary to RNA Synthesize cDNA with reverse transcriptase using DNA primers. Next, PCR is performed with the sequence in the linker and the primer 5 'from the previously used primer to amplify a fragment complementary to HCV RNA, clone it into a plasmid vector, and determine the nucleotide sequence. Thus, the sequence of HCV RNA transcribed in the cell can be analyzed. If the DNA fragment is not amplified by the first PCR, it can be analyzed by the nested-PCR method.
  • HCV genomic RNA replicating cell force is extracted from the extracted protein. If HCV protein is detected, it can be determined that the cell is replicating HCV genomic RNA.
  • HCV protein can be detected by any known protein detection method, for example, by reacting an antibody against an HCV protein that also expresses the introduced HCV genomic RNA force with a protein that also extracts cellular force. Can be done. More specifically, for example, a protein sample from which cell force has also been extracted is blotted on a trocellulose film, and anti-HCV protein antibody (for example, anti-NS3-specific antibody or antiserum collected from a patient with hepatitis C). ) And then detecting the anti-HCV protein antibody.
  • anti-HCV protein antibody for example, anti-NS3-specific antibody or antiserum collected from a patient with hepatitis C.
  • the host cell for expressing the HCV protein is not particularly limited as long as it can be subcultured, but it is more preferably a human cell that is preferably a eukaryotic cell. More preferably, they are liver-derived cells, human cervical-derived cells, or human fetal kidney-derived cells.
  • the cells are preferably proliferative cells including cancer cell lines and stem cell lines, such as Huh7 cells (ATCC CCL-185), HepG2 cells (ATCC HB 8065), IMY-N9 cells (Date, T. et al. , J. Biol.
  • HeLa cells ECACC 930210 13
  • RCYMIRC cells Murakami, K., et al., Virology, 351, 381—392, 2006
  • 5-15RC cells Pietschmann T., et al., J Virol. (2001) 75, p.1252-1264
  • Particularly preferred cells include Huh7 cells, RCYM1RC cells, 5-15RC cells, HepG2 cells and cell lines derived from these cells. These cells may be commercially available, may be obtained from a cell depository, or may be any cell (for example, cancer cells or stem cells). May be.
  • Huh7.5 cells Blight, KJ. Et al "J. Virol, (2002) 76, p.13001-13014) and Huh7.5.1 cells (Zhong, J. et al” P roc. Natl. Acad. Sci USA, (2005) 102, p. 9294-9299).
  • the former is a cell whose HCV replication ability has been increased by eliminating the replicon by interferon treatment of the replicon-replicating cells established after gene transfer of the replicon into Huh7 cells, and the latter is the Huh7.5 cell
  • the replicon-replicating cells prepared in step 1 have high replicon-replication efficiency by eliminating the replicon by interferon ⁇ treatment.
  • HCV-permissive cells cells that allow HCV proliferation
  • HCV-permissive cells cells that allow HCV proliferation
  • HCV-permissive cells Huh7 cells, RCYM1RC cells, 5-15RC cells, HepG2 cells, and cell lines derived from these cells can be preferably used.
  • the hepatitis C virus (HCV) particles produced in this way retain infectivity to other cells.
  • the present invention relates to a method for producing such infectious hepatitis C virus particles.
  • the ability of cells to produce virus particles can be confirmed using any known virus detection method. For example, as a result of fractionating a culture of cells that seem to produce virus particles with a sucrose density gradient and measuring the density of each fraction, the HCV core protein concentration, and the amount of HCV genomic RNA, HCV core protein and HCV genomic RNA have the same peak, and the density of the fraction in which the peak is detected. Culture supernatant is 0.25% NP40 (Polyoxyethylene (9) Octylphenyl Ether) ), The cell can be determined to have the ability to produce virus particles. The specific gravity of free HCV particles is reported to be 1.14 to 1.16 g / ml (Kaito, M. et al., J. Gen. Virol. 75 (1994) pl755-1760). Say it with a word.
  • NP40 Polyoxyethylene (9) Octylphenyl Ether
  • the HCV virus particles released into the culture medium can also be detected using, for example, an antibody against Core protein, E1 protein, or E2 protein.
  • the presence of HCV virus particles can be indirectly detected by amplifying and detecting HCV genomic RNA contained in HCV virus particles in the culture medium by RT-PCR using specific primers. Chisaru
  • the HCV viral particles produced by the method of the present invention have the ability to infect cells (preferably HCV-permissive (sensitive) cells).
  • cells into which an HCV expression vector using an RNA polymerase I promoter / terminator system has been introduced are cultured, and virus particles in the obtained culture (preferably culture medium) are transferred to other cells (preferably HCV).
  • a method for producing hepatitis C virus-infected cells which comprises infecting susceptible cells).
  • HC V-permissive cells are cells that have the ability to replicate HCV genomic RNA and / or to infect HCV.
  • HCV-permissive cells are preferably liver cells or lymphoid cells, but are not limited thereto.
  • liver cells include primary liver cells, Huh7 cells, HepG2 cells, IMY-N9 cells, HeLa cells, and 293 cells.
  • Lymphocyte cells include Molt4 cells and HPB-Ma cells. Powers including Daudi cells are not limited to these.
  • Particularly preferred HCV-permissive cells include Huh 7 cells, RCYM1RC cells, 5-15RC cells, HepG2 cells and cell lines derived from (made) these cells. Cells derived from Huh7 cell force are also preferred, and examples of cells include Huh7.5 cells and Huh7.5.1 cells.
  • a cell for example, an HCV-permissive cell
  • a cell for example, an HCV-permissive cell
  • HCV genomic RNA is replicated and virus particles are formed.
  • HCV particles produced by the introduction of the HCV expression vector using the RNA polymerase I promoter / terminator system of the present invention is infectious is determined as follows.
  • the supernatant obtained by culturing cells into which the HCV expression vector using the RNA polymerase I promoter / terminator system of the invention was cultured was treated with HCV-permissive cells (for example, Huh7), and after 48 hours, for example, It can be determined by immunostaining with a cell anti-core antibody to count the number of infected cells, or by electrophoresing cell extracts on SDS-polyacrylamide gel and detecting the core protein by Western blot.
  • HCV-permissive cells for example, Huh7
  • Cells into which an HCV expression vector using the RNA polymerase I promoter / terminator system of the present invention has been stably introduced can continuously produce infectious HCV particles.
  • HCV expression system using the RNA polymerase I promoter / terminator system of the present invention In order to obtain a cell line that stably expresses Kuta, it is desirable to incorporate a drug resistance gene into this vector.
  • drug resistance genes include G418 resistance gene, hygromycin resistance gene, puromycin resistance gene, Zeocin resistance gene, and blasticidin resistance gene.
  • the HCV particle-producing ability of clones selected using drug resistance as an indicator is determined by Northern blot or quantitative RT-PCR based on the mass of Core protein in the culture supernatant of these clones and the amount of HCV RNA replicated in the clones. It can be estimated by detecting at.
  • HCV genomic RNA cDNA derived from JFH1 strain of Genotype 2a (Gen Bank Accession No.AB047639, Kato, T. et al. , Gastroenterology, 125 (2003) pl8 08-1817), JFH1 strain genomic RNA cDNA (Wakita, T. et al. Nat), whose DNA sequence was changed so that the GDD amino acid sequence in NS5B of JFH1 strain was GND. Med., 11 (2005) p.791-796), J6CF strain genomic RNA cDNA (GenBank accession number AF177036, Yan agi, M. et al.
  • a restriction enzyme BsmBI recognition sequence was added to the 5th, 3rd and 3rd ends of the above HCV genomic cDNA (JFHl, JFH1 / GND and H77c) using PCR, respectively.
  • the cleavage site of BsmBI A pHH21 vector (Neumann G. et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, which has the sequence of human RNA polymerase ⁇ promoter and mouse RNA polymerase I terminator) 96 (1999) p9345-9350), the HCV genome was inserted without any extra nucleotide sequence between the promoter / terminator 1 and the HCV genome (FIG. 1A). The map of each clone is shown in Fig. 1B.
  • the resulting vectors containing the HCV genomic cDNA are called pHH JFH1, pHH JFH1 / GND, and pHH H77c, respectively.
  • a chimeric HCV expression vector derived from the genomic cDNAs of J6CF and JFH1, H77c and JFH1, Jl and JFH1, respectively, was prepared by the method described below.
  • PJFHl (Wakita, T. et al. Nat. Med., 11 (2005) p791-796, a plasmid DNA constructed by cloning the cDNA corresponding to the entire genomic RNA from the JFH1 strain into the pUC19 plasmid.
  • International Publication WO2004 / 104198 was digested with Agel, and further partially digested with Bell, and the plasmid DNA fragment from which the Agel site force was removed to the first Bell site (2672 bp) was purified.
  • a 2672 bp fragment obtained by partially digesting genomic cDNA derived from J6CF strain with Agel and Bell was ligated to the above fragment to obtain pUC J6 / JFH1.
  • 10A to D contains a 5 ′ untranslated region that also has chimera power from the JFH1 and J6CF strains, DNA sequences encoding Core protein, E1 protein, E2 protein, and p7 protein from J6 CF strain, NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A and NS5B proteins and 3, untranslated region from JFH1 strain, respectively And a DNA sequence encoding each.
  • the PCR reaction was performed under the conditions of 30 cycles, with one cycle consisting of 94 ° C for 1 minute, 64 ° C for 2 minutes, and 72 ° C for 3 minutes.
  • the obtained PCR product was designated as PCR product no.
  • JFH1 genomic cDNA was used as a saddle and attached to the LA-PCR kit (Takara Bio Inc.). 10 X buffer solution was 5 ⁇ 1, 2.5 mM dNTP mixture solution was 5 1, 10 M primer.
  • 3-JFH-S (SEQ ID NO: 12: GGCATACGCATATGACGCACCTGTGCACGG) and 3-JFH-A (SEQ ID NO: 13: GCTCTGACGAAGTACGGCACATGTGTC) were each 1 ⁇ 1 calories, and finally the total amount of deionized water was 49. .
  • 1 ⁇ l of Takara LA Taq (Takara Bio Inc.) was added and PCR was performed.
  • the PCR reaction was performed under 25 cycles, with one cycle consisting of 94 ° C for 1 minute, 64 ° C for 2 minutes, and 72 ° C for 3 minutes.
  • the obtained PCR product was designated as PCR product no.
  • H77c genomic cDNA was used as a kit and attached to the LA-PCR kit (Takara Bio). 5 ⁇ l of 10 X buffer and 5 ⁇ m of primer 5 ⁇ m of 2.5 mM dNTP mixture -Add ⁇ 77- S (SEQ ID NO: 14: ACCGTGCACCATGAGCACGAATCCTAAA CC) and 5- ⁇ 77- ⁇ (SEQ ID NO: 15: GAAGCCGCACGTAAGGGTATCGATG :) to each to add 49 ⁇ l. . Next, Takara LA Taq (Takara Bio Inc.) was added, and PCR was performed.
  • the PCR reaction was performed under 25 cycles under the conditions of 94 ° C for 1 minute, 64 ° C for 2 minutes, and 72 ° C for 3 minutes.
  • the obtained PCR product was designated as PCR product no.
  • the H77c genomic cDNA was used as a saddle and attached to the LA-PCR kit (Takara Bio Inc.). 10 X buffer solution was 5 ⁇ 1, 2.5 mM dNTP mixture was 5 ⁇ 1, 10 ⁇ .
  • Primers 3- ⁇ 77-S SEQ ID NO: 16: CATTGTGCCCGCAAAGAGCGTGTGT) and 3-H77-A (SEQ ID NO: 17: GTGCGTCATATGCGTATGCCCGCTGAGGCA) were added in an amount of 1 ⁇ l, respectively.
  • PCR product no was designated as PCR product no.
  • the DNA of product no.3 was diluted 100 times and 1 ⁇ l of each was mixed. Using this mixed solution as a template, PCR was carried out for 5 cycles under the above-mentioned conditions without using primers. Then primer 5-J FH-S (SEQ ID NO: 10) and 5-H77-A (SEQ ID NO: 15) were added, and PCR was further performed for 25 cycles, whereby the amplified chimeric DNA fragment was purified. This fragment was cloned into the plasmid vector pCRII, the nucleotide sequence of the DNA fragment was determined, and the nucleotide sequence was confirmed to be correct.
  • This plasmid obtained by cloning a chimeric DNA fragment into pCRII was named pCR5HJ. Furthermore, PCR product no.2 and PCR product no.4 were diluted 100 times and each 1 1 was mixed into one. Using this mixed solution as a template, PCR was performed for 5 cycles under the above-mentioned conditions without using primers. Thereafter, primers 3-H77-S (SEQ ID NO: 16) and 3-JFH-A (SEQ ID NO: 13) were added, and PCR was further performed for 25 cycles, whereby the amplified chimeric DNA fragment was purified.
  • This fragment was cloned into plasmid vector pCRII, the base sequence of the DNA fragment was determined, and the base sequence was confirmed to be correct.
  • This plasmid obtained by cloning a chimeric DNA fragment into pCRII was named PCR3HJ.
  • pCR5HJ was digested with restriction enzymes Agel and Kpnl
  • H77c genomic cDNA was digested with restriction enzymes Kpnl and Ascl
  • pCR3HJ was digested with restriction enzymes Ascl and Notl
  • each HCV cDNA fragment was analyzed by agarose gel electrophoresis. And purified.
  • These three DNA fragments were ligated to a vector obtained by digesting pHH JFH1 with Agel and Notl. This vector was named pHH H77 c (C-p7) / JFH.
  • the inserted fragment of this expression vector pHH H77c (C-p7) / JFH (H77c (C-p7) JFH; SEQ ID NO: 30, FIGS. 11A to D) is a 5 ′ untranslated consisting of chimera derived from JFH1 and H77c strains. Region, DNA sequence encoding Core protein, E1 protein, E2 protein and p7 protein from H77c strain, NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A and NS5B proteins and 3 'untranslated region from JFH1 strain, respectively. Each of which contains a coding DNA sequence.
  • JFH1 genomic cDNA is used as a saddle and attached to the LA-PCR kit (Takara Bio Inc.) V, 10 X buffer 5 ⁇ 1, 2.5 mM dNTP mixture 5 1, 10 M primer 5— 1 ⁇ l each of JFH—S (SEQ ID NO: 10: GCCATGGCGTTAGTATGAGTGTCGT) and 5-JFH-A2 (SEQ ID NO: 18: TTGTGCTCATGGTGCACGGTCTACGAGACC) was added, and finally the total amount of deionized water was reduced to 49 ⁇ 1. Next, 1 ⁇ 1 of Takara LA Taq (Takara Bio Inc.) was added and PCR was performed. PCR reaction consists of 94 ° C for 1 minute, 64 ° C for 2 minutes, 72 ° C for 3 minutes The process was carried out under the condition of 25 cycles with 1 cycle. The obtained PCR product was designated as PCR product no.
  • JFH1 genomic cDNA was used as a saddle, and 10 ⁇ l buffer was added to the LA-PCR kit (Takara Bio Inc.). Add 1 ⁇ l each of primers 3-JFH-S2 (SEQ ID NO: 19: AGCTTACGCCTATGACGCACCTGTGCACGG) and 3-JFH-A (SEQ ID NO: 13: GCTCTGACGAAGTACGGCACATGTGTC), and finally add deionized water to a total volume of 49 . Next, 1 ⁇ l of Takara LA Taq (Takara Bio Inc.) was added, and PCR was performed. The PCR reaction was performed under the conditions of 25 cycles, with one cycle consisting of 94 ° C for 1 minute, 64 ° C for 2 minutes, and 72 ° C for 3 minutes. The resulting PCR product is PCR product no.
  • PCR product no was designated as PCR product no.
  • PCR product was purified and dissolved in 50 ⁇ l of 0. PCR product ⁇ .5 and PCR product ⁇ 0.7 ⁇ DNA was diluted 100 times and each 1 ⁇ l was mixed together. Using this mixed solution as a template, PCR was carried out for 5 cycles under the above-mentioned conditions without using primers. Thereafter, primers 5-J FH-S (SEQ ID NO: 10) and 5-J1-A (SEQ ID NO: 21) were added, PCR was further performed for 25 cycles, and the amplified chimeric DNA fragment was purified. This fragment was cloned into plasmid vector ⁇ CRII, the base sequence of the DNA fragment was determined, and the base sequence was confirmed to be correct. This plasmid obtained by cloning a chimeric DNA fragment into pCRII was named pCR5JJ.
  • PCR3JJ The DNA of PCR product no. 6 and PCR product no. 8 was diluted 100-fold and mixed with 1 ⁇ l of each. This mixture was used as a template, and PCR was performed for 5 cycles under the above-mentioned conditions without using primers. Thereafter, primers 3-J1-S (SEQ ID NO: 22) and 3-JFH-A (SEQ ID NO: 13) were added, and PCR was further performed for 25 cycles, whereby the amplified chimeric DNA fragment was purified. This fragment was cloned into plasmid vector pCRII, the base sequence of the DNA fragment was determined, and it was confirmed that the base sequence was correct. This plasmid obtained by cloning a chimeric DNA fragment into pCRII was named PCR3JJ.
  • pCR5JJ was digested with restriction enzymes Agel and Clal
  • J1 genomic cDNA was digested with restriction enzymes Clal and Avrll
  • pCR3JJ was digested with restriction enzymes Avrll and Kpnl
  • each HCV cDNA fragment was fractionated by agarose gel electrophoresis and purified. .
  • These three DNA fragments were ligated to a vector obtained by digesting pHH JFH1 with Agel and Kpnl. This vector was named pHH J1 (C-p7) / JFH. Insertion fragment of this expression vector pHH J1 (C-p7) / JFH (J1 (C-p7) JFH; SEQ ID NO: 31, FIGS.
  • 12A to D is a 5 'untranslated region that also has chimera power derived from JFH1 strain and J1 strain.
  • JFH1 genomic cDNA is used as a saddle and attached to the LA-PCR kit (Takara Bio Inc.) V, 10 X buffer 5 ⁇ 1, 2.5 mM dNTP mixture 5 1, 10 M primer 5— 1 ⁇ l each of JFH—S (SEQ ID NO: 10: GCCATGGCGTTAGTATGAGTGTCGT) and 5-JFH-A2 (SEQ ID NO: 18: TTGTGCTCATGGTGCACGGTCTACGAGACC) was added, and finally the total amount of deionized water was reduced to 49 ⁇ 1.
  • Takara LA Taq (Takara Bio Inc.) 1 ⁇ 1
  • PCR reaction was performed. The PCR reaction was performed under the conditions of 25 cycles, with one cycle consisting of 94 ° C for 1 minute, 64 ° C for 2 minutes, and 72 ° C for 3 minutes. The obtained PCR product was designated as PCR product no. 9.
  • Genotype lb genomic RNA cDNA derived from J1 strain (GenBank accession number D89815, Aizaki, H. et al. Hepatology, 27 (1998) p.621-627) Attached to the kit (Takara Bio Inc.), 5 x 1, 10 mM buffer solution, 5 ⁇ l, 2.5 ⁇ m dNTP mixture, 5 ⁇ l, 10 ⁇ primer 5- Jl- S (SEQ ID NO: 20: ACCGTGCACCATGAGCACAAATCCTAA ACC) 1 ⁇ l each of 5-Jl-A (SEQ ID NO: 21: AAGCGGGATGTACCCCATGAG) was added, and the total amount of deionized water was finally adjusted to 49 1.
  • PCR product was designated as PCR product no.11.
  • the genomic cDNA derived from the J1 strain was used as a saddle, and 5 ⁇ 1 of 10 X buffer solution and 51 of 2.5 mM dNTP mixture attached to the LA-PCR kit (Takara Bio Inc.) were used. Add 1 ⁇ l each of 10 M primers 3-J1-S (SEQ ID NO: 22: CGGCTGTACATGGATGAATAGCACTGGGTT) and 3-Jl-N S3-A (SEQ ID NO: 26: CATAAGCAGTGATGGGAGCAAGGAGTCGCC), and finally remove the total amount of deionized water. 49. Next, 1 ⁇ l of Takara LA Taq (Takara Bio Inc.) was added and PCR was performed.
  • PCR reaction was performed under 25 cycles under the conditions of 94 ° C for 1 minute, 64 ° C for 2 minutes, and 72 ° C for 3 minutes.
  • the obtained PCR product was designated as PCR product no.12.
  • Each PCR product was purified and dissolved in 50 ⁇ l of cocoon.
  • the DNAs of the PCR product no.lO and the PCR product no.l2 were diluted 100-fold, and each 1 ⁇ l was mixed into one. Using this mixed solution as a template, PCR was performed for 5 sites under the above conditions without adding primers. Subsequently, 3-J1-S (SEQ ID NO: 22) and 3-JFH-NS3-A (SEQ ID NO: 25) were added as primers, and PCR was further performed for 25 cycles, thereby purifying the amplified chimeric DNA fragment. . This fragment was cloned into the plasmid vector pCRII, the base sequence of the DNA fragment was determined, and the base sequence was confirmed to be correct. This plasmid obtained by cloning the chimeric DNA fragment into pCRII was named PCR3JJNS3.
  • pCR5JJ was digested with restriction enzymes Agel and Clal
  • J1 genomic cDNA was digested with restriction enzymes Clal and Avrll
  • pCR3JJNS3 was digested with restriction enzymes Avrll and BspDI
  • each HCV cDNA fragment was fractionated by agarose gel electrophoresis and purified. did.
  • These three DNA fragments were ligated to a vector obtained by digesting pHH JFH1 with Agel and BspDI. This vector was named pHH JKC-NS2) / JFH.
  • Insertion fragment of this expression vector pHH J1 (C-NS2) / JFH (J1 (C-NS2) JFH; SEQ ID NO: 32, Fig. 13A-D) is a 5 'untranslated region that also has chimera from JFH1 strain and J1 strain. Region, DNA sequence encoding Core protein, E1 protein, E2 protein, p7 protein and NS2 protein from J1 strain, NS3, NS4A, NS4B, NS5A and NS5B proteins from JFH1 strain, and 3, untranslated region Each comprising a coding DNA sequence.
  • RNA linked to the RNA linker as a saddle and using a primer complementary to HCV RNA (SEQ ID NO: 2: gtaccccatgaggtcggca aag), use the reverse transcriptase Superscript III (Invitrogen) in the attached manual. Therefore, cDNA was synthesized.
  • the synthesized cDNA was used as a cage, and a sense primer (SEQ ID NO: 3: GCTGATGGCGATGAATGAACACTG) for the 5'-end RNA linker and 3, an antisense primer (SEQ ID NO: 4: gaccgctccgaagttttccttg) on the end side were used.
  • DNA was amplified by PCR using different types of primers.
  • the amplified DNA as a saddle type, the 5 ′ end primer (SEQ ID NO: 5: GAACACTGCGTTTGCTG GCTTTGATG) and 3, the end primer (SEQ ID NO: 6: cgccctatcaggcagtaccacaag) consisting of the inner sequence of the amplified DNA
  • a second PCR was performed using the primer set.
  • EX Taq (Takara), heat treatment at 96 ° C for 5 minutes, 96 ° C for 1 minute, 55 ° C for 1 minute, 72 ° C for 2 minutes. The reaction cycle was repeated 35 times and then stored at 4 ° C.
  • pHH JFH1, pHH H77c and pHH JFH1 / GND were introduced into Huh7 cells using Fugene 6 (Roche) according to the attached manual. After 4 days of culture, a cell extract was prepared by a conventional method. Next, proteins in these extracts were analyzed by SDS-PAGE and Western plotting. In the analysis, a cell extract obtained by transiently transfecting expression plasmid DNA containing the Core gene into Huh7 cells was used as a positive control. In addition, the cell extract obtained from Huh7 cells that had not been transfected was used as a negative control.
  • Samples that have also been extracted from each cell clone are subjected to SDS-PAGE and blotted onto PVDF membrane (Immobilon-P, manufactured by Millipore) as anti-core specific antibody (usagi polyclonal antibody) and anti-NS5A antibody.
  • PVDF membrane Immobilon-P, manufactured by Millipore
  • anti-core specific antibody usagi polyclonal antibody
  • anti-NS5A antibody anti-NS5A antibody
  • Core protein was detected by ECL (Amersham Pharmacia) using an anti-core specific rabbit antibody mouth antibody and an HRP-labeled secondary antibody that recognizes this antibody. As a result, as shown in FIG. 5, Core protein could be detected in Huh7, RCYM1RC, 5-15RC, and HepG2 cells.
  • the core protein in the culture supernatant was analyzed in order to confirm whether the pHH JFH1-introduced cell force also produced HCV particles.
  • pHH JFH1 and a vector pCAG327JFHl expressing Core, El, E2 and p7 were introduced into HepG2 cells using Fugene 6, and after 2 days, the culture supernatant was removed, and a fresh medium was added and cultured for another 2 days.
  • the cells and the culture solution were collected, cellular protein was extracted, and the expression of the core protein in the cells was analyzed by the method shown in Example 3. As a result, it was confirmed that the core protein was expressed (FIG. 6A).
  • the culture solution was fractionated by a sucrose density gradient.
  • a 10-60% (weight / weight) density gradient sucrose solution (dissolved in 50 mM Tris p H7.5 / 0.1 M NaCl / lmM EDTA) was further layered with 0.2 ml of the sample culture supernatant. This was centrifuged at 35,000 RPM at 4 ° C for 16 hours with Beckman Rotor SW41E. After completion of the centrifugation, 0.5 ml fractions were collected from the bottom of the centrifuge tube. The density of each fraction and the HCV Core protein concentration were quantified. The HCV Core protein was measured using the ortho HCV antigen IRMA test (Aoyagi et al, J. Clin. Microbiol, 37 (1999) p. 1802-1808).
  • Core protein and HCV RNA present in 1.15 to 1.18 mg / ml fraction are HCV particles Given the structure, it should be sensitive to treatment with the surfactant NP40. Then, pHH JFH1 was introduced into HepG2, and the culture solution for 2 days and 4 days was treated with 0.2% NP40 for 20 minutes and fractionated by sucrose density gradient. As shown in FIG. 7, the core protein peak was observed in the 1.20 mg / ml fraction after NP40 treatment. In other words, the surface membrane force with lipid and light specific gravity is considered to have caused the virus particle force to peel off due to SNP40, resulting in the core particles consisting only of the nucleic acid and the core protein not retaining the virus-like structure, and the specific gravity increased. It was.
  • pHH JF HI was introduced into Huh7 and HepG2 cells using Fugene 6, and the culture supernatant cultured for 3 days for 5 days was concentrated 30 times using an ultrafiltration membrane (cut off 1 X 105 Da) .
  • Huh7.5.1 cells were cultured on a 15 mm coverslip in 100 ⁇ l of a culture solution containing concentrated HCV particles, and after 4 days, the cells were fluorescently stained with anti-NS5A antibody.
  • the anti-NS5A antibody staining was positive, that is, when the infected cells were counted, some infected cells were confirmed as shown in FIG. From these results, it was confirmed that by introducing pHH JFH1 into Huh7 or HepG2 cells, the HCV particles secreted into the culture medium have the ability to infect.
  • pHH JFH1 was deleted with Nhe I, and the Zeodn resistance gene was linked downstream of the SV40 promoter extracted by digesting pSV40 / Zeo2 (Invitrogen) with Nhe I and XbaI. Furthermore, a vector incorporating an expression unit (SV40 promoter / Zeo / polyA) linked to the SV40 poly A addition signal downstream was prepared. PHH / ZeoJF It was named HI ( Figure 9).
  • pHH / ZeoJFHl was introduced into HepG2 cells using Fugene 6.
  • the cells were cultured in a Zeocin-containing medium. Thereafter, the culture was continued in a medium containing Zeocin while changing the culture medium twice a week.
  • a colony of viable cells was cloned from the culture dish after 21 days of the culture and the culture was continued. By cloning such colonies, 100 cell clones were obtained.
  • the amount of Core protein in the culture supernatant of these clones was determined using the Ortho HCV antigen IRMA test (Aoyagi et al., J. Clin. Microbiol, 37 (1999) p.1802-1808). Clone HepG2 / No59 cells with a high expression level of were selected.
  • HCV genomic RNA was measured from RNA prepared for medium strength of the culture supernatant. Quantitative RT-PCR detection of HCV RNA detects RNA in the 5 'untranslated region of HCV RNA according to the method of Takeuchi et al. (Takeuchi T. et al., Gastroeterology, 116 (1999) p.636-642) It was done by doing. Specifically, HCV RNA contained in RNA extracted from cells was PCR amplified using the following synthetic primers and EZ rTth RNA PCR kit (Applied Biosystems), and ABI Prism 7700 sequence detector system (Applied Biosystems) ).
  • R6- 130- S17 5,-CGGGAGAGCCATAGTGG -3, (SEQ ID NO: 7)
  • R6-290-R19 5,-AGTACCACAAGGCCTTTCG-3, (SEQ ID NO: 8)
  • the HCV RNA in the HepG2 / No59 cell culture supernatant was 6.1 ⁇ 10 8 copies / ml. This production is about 60 times higher than previously reported.
  • the HepG2 / No59 cell culture supernatant was concentrated 30-fold using an ultrafiltration membrane (cut off 1 X 10 5 Da), and Huh7.
  • 5.1 cells were cultured on 15 mm coverslips and after 4 days the cells were immunostained with anti-NS5A antibody.
  • anti-NS5A antibody staining was positive, that is, infected cells could be detected.
  • the HCV antigen IRMA test was used to measure the amount of Core protein (Aoyagi et al "J. Clin. Microbiol, 37 (1999) p.1802-1808).
  • As a clean and positive control we used the culture supernatant of cells transfected with pHH JFH 1. Examples of these experimental results are shown in Table 1. Core proteins were confirmed in the cell supernatants introduced with each of the chimeric HCV expression vectors. Thus, it was judged that virus particles were produced, and it was also found that pHH J6 (C-p7) / JFHl has an HCV production ability 10 times higher than that of pHH JFH1.
  • pHH J6 (C-p7) / JFHl and pHH Jl (C-p7) / JFHl were introduced into Huh7.5.1 cells by the method shown in Example 7, and the culture supernatant 3 days after introduction was ultrafiltered. Concentration was performed using a membrane (cut off 1 X 10 5 Da). The culture supernatant 100 / z 1 containing concentrated HCV particles was collected and Huh7.5.1 cells were cultured on a 15 mm cover slip, and 4 days later, the cells were immunostained with anti-NS5A antibody. The result As a result, cells that were strongly stained with the anti-NS5A antibody were observed in the cells treated with the culture supernatant in which pHH J6 (C-p7) / JFHl was introduced.
  • pHH / Zeo J1 (C-p7) / JFHl was prepared by inserting the Zeodn resistance gene expression unit into pHH Jl (C_p7) / JFHl by the method shown in Example 6.
  • pHH / Zeo Jl (C-p7) / JFH1 was introduced into Huh7.5.1, and cells capable of stably expressing virus particles that proliferated in a Zeocin-containing medium were obtained. 8 ml of the culture supernatant of the cells was concentrated using an ultrafiltration membrane (cut off 1 ⁇ 10 5 Da). The amount of HCV Core protein in the concentrated culture supernatant was 2365 ftnol / L.
  • This concentrated culture supernatant 1001 was used to infect Huh7.5.1, and 4 days later, the cells were immunostained with an anti-NS5A antibody.
  • cells that were stably expressed with pHH / Zeo Jl (C_p7) / JFHl were treated with the obtained culture supernatant, and cells that were strongly stained with anti-NS5A antibody were observed. This revealed that infectious HCV was produced from this cell.
  • infectious HCV can be produced in the cells infected with the chimeric HCV expression vector as described above.
  • sequence of SEQ ID NO: 1 represents a synthetic RNA.
  • sequences of SEQ ID NO: 2 to SEQ ID NO: 9 represent synthetic DNA.
  • sequences of SEQ ID Nos: 10 to 26 represent primers.
  • sequences of SEQ ID NOs: 29 to 32 represent chimeric DNA.
  • sequences of SEQ ID Nos: 33 to 45 represent synthetic DNA.

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Abstract

　本発明は、感染性C型肝炎ウイルス(HCV)粒子を産生する方法であって、RNAポリメラーゼIプロモーターの下流に、HCVの5’非翻訳領域および構造タンパク質および任意に非構造タンパク質をコードするDNA配列とHCV JFH1株由来の非構造タンパク質および3’非翻訳領域をコードするDNA配列とを含み、さらにその下流にRNAポリメラーゼIターミネーターを含むDNA断片を含む発現ベクターを、HCVの増殖を許容する細胞に導入する工程を含む方法に関する。

Description

感染性 c型肝炎ウィルス粒子高産生系
技術分野
[0001] 本発明は、感染性ヒト C型肝炎ウィルス粒子の高産生方法に関する。
背景技術
[0002] ヒト C型肝炎ウィルス (HCV)は持続的に感染することにより慢性肝炎を引き起こす 一本鎖の RNAウィルスである。現在、世界的規模で認められる慢性肝炎の主たる原 因が HCV持続感染である。実際、持続感染者の 50%程度が慢性肝炎を発症し、そ のうち約 20%の患者が 10年〜 20年を経て肝硬変に移行し、さらにその一部は肝癌と V、つた致死的な病態へと進展する。
[0003] このように重大な疾患の治療方法を開発するための研究を妨げて 、る主な原因は 、 HCV増殖に効率的な細胞培養系がないこと、 HCV感染に適切な小動物モデルが ないこと、低いレベルのウィルス複製、およびウィルスゲノムの遺伝的な不均一性に よる。
[0004] 従って、細胞培養系での HCVゲノムの複製系の開発は、ウィルスの複製、ウィルス と細胞の相互作用を理解し、 HCVによって引き起こされる疾患の治療薬の評価系を 提供することになると期待されている。
[0005] 最近になって、 HCV由来の自律複製能を有する RNAとして、 HCVサブゲノム RNAレ プリコンが作製されたことにより（特許文献 1、特許文献 2および非特許文献 1〜3)、 培養細胞を用いて HCVの複製機構を解析することが可能となった。これらの HCVサ ブゲノム RNAレプリコンは、 HCVゲノム RNAの 5'非翻訳領域中の HCV IRESの下流に 存在する構造タンパク質を、ネオマイシン耐性遺伝子およびその下流に連結した EM CV- IRESによって置換したものである。この RNAレプリコンを、ヒト肝癌細胞 Huh7に導 入してネオマイシン存在下で培養することにより、 Huh7細胞内で RNAレプリコンが自 律複製することが証明された。しかし、この実験系は、 HCVウィルスの増殖複製過程 における、ウィルス RNA複製のみ評価可能な実験系であり、ウィルス粒子を産生しな いので、 HCV粒子の感染細胞内での形成と細胞外への放出、さらに新たな細胞へ の感染と 、う過程を評価することはできな 、。
[0006] この課題に対して、培養細胞系でウィルス粒子を産生する方法が報告されている。
RNAレプリコンを使用せず、 HCV全ゲノム RNAの cDNAを利用した系である。
[0007] Limらは、テトラサイクリン応答プロモーターの下流に遺伝子型 lbの HCV-S1株のゲ ノム RNAの cDNAを連結した発現ベクターを Huh7細胞に導入して得た細胞株を、テト ラサイクリンで処理し、 HCV粒子の産生を試みた。彼らは、その培養上清には 1〜6 X 105コピー/ mlの HCV粒子の存在を確認した力 その HCV粒子の感染性は低!、と記 載している（非特許文献 4)。
[0008] し力し、 HCV cDNAを CMVなどの RNAポリメラーゼ II型のプロモーター制御下で発 現させると、転写された RNAの 5'末端には CAP構造力 3'末端にはポリ A鎖が付加さ れるため、リボソームにてタンパク質合成の铸型として利用されてしまい、転写された RNAの複製が起こらな 、と 、う問題もある。
[0009] この問題を解決するために、 Hellerらは、 HCVゲノムの 5'末端と 3'末端にリボザィ ム配列を連結し、細胞内で RNAポリメラーゼ IIで転写された後、リボザィムで切断させ ることにより、キャップとポリ Aが付カ卩していない HCV RNAを細胞内で合成できるような コンストラクトを作製した (非特許文献 5)。なお、リボザィムで 5'末端にキャップを付カロ させな 、方法はヘアピン型 RNAを細胞内で合成する方法に利用されて 、る（非特許 文献 6)。実際、 2つのリボザィムで挟まれた HCVコンストラクトをもつ発現ベクターを H uh7で発現させることにより、 1 X 107コピー/ mlの HCV粒子が産生されることが示され ている。ただし、この粒子に感染性があるかについては検討されていない。
[0010] さらに最近、 HCV全ゲノム RNAから細胞培養系で感染能を有する HCV粒子を生産 できることが示された (特許文献 3、非特許文献 7、非特許文献 8)。この系での HCV 粒子の産生量は約 1 X 107コピー/ mlである。また、 HCVの遺伝子型 lbの conl株の非 構造タンパク質領域を遺伝子型 2aのウィルス株の遺伝子に置き換えたキメラウィルス RNAにつ 、て、細胞培養系で感染能を有する HCV粒子を生産できることが示された (非特許文献 9)。この系での HCV粒子産生量の具体的数値にっ 、ては開示されて いない。
[0011] 以上の結果から、 HCV粒子の感染細胞内での形成と細胞外への放出、さらに新た な細胞への感染という過程を評価する実験系の作製が可能となった。
[0012] し力し、 Limらの系では生産性が低ぐ Hellerらの系では感染性が不明であり、 HCV 全ゲノム RNAを用いた系では、 RNAの複製時に変異が起こる可能性が考えられる。 H CVゲノムに変異が起こると、複製が起こらなくなる場合があることが知られている。実 際 HCV非構造タンパク質である NS5Bタンパク質中の GDDアミノ酸配列が GNDに変異 すると複製が起こらないことが示されている。一方、 HCV粒子の産生量については、 両者とも約 1 X 107コピー/ mlであり、さらに産生量をあげることが期待される。
[0013] HCVウィルス粒子の産生量を上げる方法として、レプリコン生産量の高い細胞の作 製が検討された。 HCVウィルスの複製にはヒト肝臓由来の Huh7細胞が使用されてい る力 この株力 派生する細胞がいくつ力クローンィ匕された。その中で Huh7.5と名付 けられた細胞は親株の約 3倍の HCV RNAレブリコンを複製することが示された (非特 許文献 10)。
[0014] 以上の状況にあって、 HCV全ゲノム RNAの cDNAを用いて感染性 HCV粒子の高産 生系を開発することが重要であることが想起される。
[0015] RNAウィルスのゲノム RNAに対応する cDNAを用いてウィルス粒子を産生させる系と しては、インフノレエンザゥイノレス（マイナス鎖の RNAウィルス）の動物細胞系での生産 に用いられて 、る RNAポリメラーゼ Iプロモーターとターミネータ一とを用いた系（非特 許文献 11)も知られている。しかしながらこのような RNAポリメラーゼ Iプロモーターとタ ーミネーターを用いたインフルエンザウイルス粒子の産生系は、従来のインフルェン ザウィルス粒子産生系よりも産生量において優れているとはいえない。また、非特許 文献 11にはプラス鎖の RNAウィルスである HCVの産生系につ 、ては記載も示唆もな い。
特許文献 1：特開 2001-17187号公報
特許文献 2： WO2004/104198A1
特許文献 3： WO05080575A1
非特許文献 1 : Blight et al.， Science, 290(2000) pl972-74
非特許文献 2 : Friebe et al.， J. Virol, 75(2001) pl2047-57
非特許文献 3 : Kato, T. et al.， Gastroenterology , 125(2003) pl808- 17 非特許文献 4: Lim SP. et al.， Virology, 303(2002)p79-p99.
非特許文献 5 : Heller, T. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 102 (2005) p2579- 83 非特許文献 6 : Shinagawa, T. & Ishii, S., Genes Dev., 17(2003) pi 340-45
非特許文献 7 :Wakita et al. Nature Med. 11 (2005) p791- 96
非特許文献 8 : Lindenbach BD. et al., Science. 309 (2005) p623- 26
非特許文献 9 : Pietschmann T. et al., 11th International Symposium on Hepatitis C
Virus and Related Viruses, (2004)
非特許文献 10 : Blight, KJ. et al., J. Virol, 76 (2002) pl3001- 14
非特許文献 11 : Neumann, G. et al., Virology, 202 (1994) p477-479
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0016] 本発明の目的は、組換え DNAから感染性 C型肝炎ウィルス粒子を培養細胞系で高 生産するための方法を提供することにある。
課題を解決するための手段
[0017] 本発明者らは、 HCVゲノム cDNAから複製能のある HCVゲノム RNAを細胞内で合成 する方法を構築するために、遺伝子型の異なる HCVゲノム、これを発現させるための プロモーター/ターミネータ一を検討し HCVゲノム RNAが複製される新規な組合せを 見出した。ついで、該 HCVゲノム RNAを合成する細胞を培養し、これまで報告されて いるよりも感染性 HCV粒子が高産生されていることを確認し、本発明を完成させるに 至った。
[0018] すなわち、本発明は、以下の（a)から (c)に関する。
[0019] (a) 感染性 C型肝炎ウィルス (HCV)粒子を産生する方法であって、リボソーム RNA遺 伝子由来の RNAポリメラーゼ Iが認識するプロモーターの下流に JFH1株由来の HCV ゲノム cDNAを含みさらにその下流にリボソーム RNA遺伝子由来の RNAポリメラーゼ I が認識するターミネータ一を含む DNAを含む発現ベクターを、 HCVの増殖を許容す る細胞に導入する工程を含む、感染性 HCV粒子を産生する方法、
(b) HCVの増殖を許容する細胞力 Huh7、 RCYM1RC、 5- 15RC、 HepG2およびそ れらの細胞から派生した株化細胞からなる群から選択される (a)の感染性 HCV粒子 を産生する方法、
(c) 感染性 C型肝炎ウィルス (HCV)粒子を産生するためのベクターであって、リボソ ーム RNA遺伝子由来の RNAポリメラーゼ Iが認識するプロモーターの下流に JFH1株 由来の HCVゲノム cDNAを含みさらにその下流にリボソーム RNA遺伝子由来の RNA ポリメラーゼ Iが認識するターミネータ一を含む DNAを含む発現ベクター。
[0020] さらに本発明は、感染性 C型肝炎ウィルス (HCV)粒子を産生する方法であって、 RN Aポリメラーゼ Iプロモーターの下流に、 HCVの 5'非翻訳領域および構造タンパク質 および任意に非構造タンパク質をコードする DNA配列と、 HCV JFH1株由来の非構 造タンパク質および 3'非翻訳領域をコードする DNA配列とを含み、さらにその下流に RNAポリメラーゼ Iターミネータ一を含む DNAを含む発現ベクターを、 HCVの増殖を許 容する細胞に導入する工程を含む方法にも関する。
[0021] より具体的には、本発明は、以下の（1)〜(4)の方法に関する。
[0022] (1) 以下の 0または ii)の発現ベクターを、 Huh7、 RCYM1RC、 5- 15RC、 HepG2およ びそれらの細胞から派生した株化細胞からなる群から選択される細胞に導入するェ 程を含む、感染性 C型肝炎ウィルス (HCV)粒子を産生する方法：
0 RNAポリメラーゼ Iプロモーターの下流に、 HCV株由来の 5'非翻訳領域、 Coreタン パク質、 E1タンパク質、 E2タンパク質、 p7タンパク質、 NS2タンパク質をコードする DNA 配列と、 HCV JFH1株由来の NS3、 NS4A、 NS4B、 NS5Aおよび NS5Bタンパク質ならび に 3'非翻訳領域をコードする DNA配列とを含み、さらにその下流に RNAポリメラーゼ I ターミネータ一を含む DNAを含む発現ベクター、または
ii) RNAポリメラーゼ Iプロモーターの下流に、 HCV株由来の 5'非翻訳領域、 Coreタン パク質、 E1タンパク質、 E2タンパク質、 p7タンパク質をコードする DNA配列と、 HCV JF HI株由来の NS2、 NS3、 NS4A、 NS4B、 NS5Aおよび NS5Bタンパク質ならびに 3'非翻 訳領域をコードする DNA配列とを含み、さらにその下流に RNAポリメラーゼ Iターミネ 一ターを含む DNAを含む発現ベクター。
[0023] (2) 前記 HCV株が遺伝子型 1または遺伝子型 2の HCV株である、上記（1)の方法。
[0024] (3) 遺伝子型 1の HCV株が H77c株、 1株、 H株、 HC- J1株、 J1株、 conl株、 TH株、 J 株、 JT株、 BK株よりなる群力 選択されるものである上記（2)の方法。 [0025] (4) 遺伝子型 2の HCV株が J6CF株、 JFH1株、 JCH1株、 HC-J8株よりなる群力も選 択されるものである上記（2)の方法。
発明の効果
[0026] 本発明によれば、組換え DNAから感染性 C型肝炎ウィルス粒子を培養細胞系で生 産するための方法において、従来の方法に対して、感染性を有する HCV粒子を約 60 倍の高密度で高産生できる。
図面の簡単な説明
[0027] [図 1A]図 1Aは RNAポリメラーゼ Iプロモーター/ターミネータ一系を用いた HCV発現 ベクターの構築図を示す。
[図 1B]図 1Bは pHH H77cゝ pHH JFH1, pHH JFH1/GNDのマップを示す。
[図 1C]図 1Cは pHH H77c(C-p7)/JFHl, pHH J6(C— p7)/JFHl、 pHH J1(C— p7)/JFHl および pHH J1(C- NS2)/JFH1のマップを示す。
[図 2]図 2は RNAポリメラーゼ Iプロモーター/ターミネータ一系の HCV発現ベクターを 導入した細胞において、 HCV RNAが転写されていることを確認した実験結果を示す 写真である。レーン 1, 3は pHH JFH1をそれぞれ Huh7および HepG2に導入したとき、 レーン 2, 4は pHH JFH1/GNDをそれぞれ Huh7および HepG2に導入したときの結果 である。
[図 3]図 3はポリメラーゼ Iプロモーター/ターミネータ一系の発現ベクターで転写され た HCV RNAの 5，末端の配列を示している。 PHH JFH1および pHH JFH1/GNDを導 入した細胞で転写される HCV RNAの 5'末端は JFH1ゲノム RNAの配列と同一であつ た。
[図 4]図 4は RNAポリメラーゼ Iプロモーター/ターミネータ一系の HCV発現ベクターを 導入した細胞にお!、て、 HCVタンパク質が翻訳されて 、るかにっ 、て確認した実験 結果を示す写真である。 pHH JFH1を導入した細胞では、コアタンパク質および NS5A タンパク質が翻訳されていることが示されている。 pHH H77cおよび pHH JFH1/GND を導入した細胞では HCVタンパク質は翻訳されて 、な 、。
[図 5]図 5は pHH JFH1および pHH JFH1/GNDを GFP発現ベクターと共に、 Huh7、 RC YM1RC、 5- 15RC、 HepG2および 293T細胞に導入後、それらの細胞での HCVタンパ ク質の発現とベクターの導入効率を GFPの発現によって示す写真である。 pHH JFH1 は 293T以外の細胞でコアタンパク質を発現した。一方 pHH JFH1/GNDはいずれの 細胞でもコアタンパク質を発現しな力つた。
[図 6]図 6Aは pHH JFH1を導入した HepG2細胞中のコアタンパク質を示す写真である 。図 6Bは、 pHH JFH1を導入した HepG2細胞培養液をショ糖密度遠心にて分画した 試料のコアタンパク質量を示す。 pHH JFH1培養上清（▲)のコアタンパク質の比重が 1.15g/mlの分画に見出されコアタンパク質がウィルス粒子として分泌されることが示さ れている。一方コア、 El、 E2、 p7を発現させた細胞の培養上清 (X)はブロードとなる。
[図 7]図 7は pHH JFH1を導入した HepG2細胞培養液を NP40処理した場合、非処理と 比較して、コアタンパク質のピークが変動することを示す。 NP40非処理（♦)と比較し て、 NP40で処理すると（國）コアタンパク質のピークは、比重 1.20g/mlへシフトした。比 重の軽 、表面膜力 SNP40によりウィルス粒子力 剥離したことを示して 、る。
[図 8]図 8は限外濾過膜で濃縮した pHH JFH1を導入した HepG2細胞培養液 (A)また は Huh7細胞培養液 (B)を Huh7.5.1に接種し、 4日後に抗 NS5A抗体で染色した結果 を示す写真である。抗 NS5A抗体陽性細胞 (感染細胞）が検出されることを示す。
[図 9]図 9は pHH JFH1に SV40プロモーター制御下で Zeocin耐性遺伝子を発現する カセットが挿入されたベクターのマップを示す。
[図 10A]図 10は挿入断片 J6(C-p7)JFHlの DNA配列を示す図であり、図 10Aはその 最も 5'末端側の配列を示す。
[図 10B]図 10は挿入断片 J6(C-p7)JFHlの DNA配列を示す図であり、図 10Bは図 10 Aの配列の 3'側に続く配列を示す。
[図 10C]図 10は挿入断片 J6(C-p7)JFHlの DNA配列を示す図であり、図 10Cは図 10 Bの配列の 3'側に続く配列を示す。
[図 10D]図 10は挿入断片 J6(C-p7)JFHlの DNA配列を示す図であり、図 10Dは図 10 Cの配列の 3'側に続く、最も 3'末端側の配列を示す。
[図 11 A]図 11は挿入断片 H77c(C-p7)JFH 1の DNA配列を示す図であり、図 11 Aはそ の最も 5'末端側の配列を示す。
[図 11B]図 11は挿入断片 H77c(C-p7)JFHlの DNA配列を示す図であり、図 11Bは図 11Aの配列の 3'側に続く配列を示す。
[図 11C]図 11は挿入断片 H77c(C-p7)JFHlの DNA配列を示す図であり、図 11Cは図 11Bの配列の 3'側に続く配列を示す。
[図 11D]図 11は挿入断片 H77c(C-p7)JFHlの DNA配列を示す図であり、図 11Dは図 11Cの配列の 3'側に続ぐ最も 3'末端側の配列を示す。
[図 12A]図 12は挿入断片 J l(C-p7)JFH 1の DNA配列を示す図であり、図 12Aはその 最も 5'末端側の配列を示す。
[図 12B]図 12は挿入断片 Jl(C-p7)JFHlの DNA配列を示す図であり、図 12Bは図 12 Aの配列の 3'側に続く配列を示す。
[図 12C]図 12は挿入断片 Jl(C-p7)JFHlの DNA配列を示す図であり、図 12Cは図 12 Bの配列の 3'側に続く配列を示す。
[図 12D]図 12は挿入断片 Jl(C-p7)JFHlの DNA配列を示す図であり、図 12Dは図 12 Cの配列の 3'側に続く、最も 3'末端側の配列を示す。
[図 13A]図 13は挿入断片 J 1(C- NS2)JFH1の DNA配列を示す図であり、図 13Aはその 最も 5'末端側の配列を示す。
[図 13B]図 13は挿入断片 J 1(C- NS2)JFH1の DNA配列を示す図であり、図 13Bは図 1 3Aの配列の 3'側に続く配列を示す。
[図 13C]図 13は挿入断片 J1(C- NS2)JFH1の DNA配列を示す図であり、図 13Cは図 1 3Bの配列の 3'側に続く配列を示す。
[図 13D]図 13は挿入断片 J1(C- NS2)JFH1の DNA配列を示す図であり、図 13Dは図 1 3Cの配列の 3'側に続く、最も 3'末端側の配列を示す。
発明を実施するための最良の形態
[0028] 1. RNAポリメラーゼ Iプロモーター/ターミネータ一系を用いた HCV発現ベクターの構 鎏
RNAを転写する RNAポリメラーゼには 3種類知られて!/、る。 RNAポリメラーゼ Iはリボソ ーム RNA遺伝子から rRNAを、 RNAポリメラーゼ IIはタンパク質をコードする遺伝子から mRNAを、 RNAポリメラーゼ IIIは tRNA遺伝子から tRNAを転写する。
[0029] RNAポリメラーゼ Iおよび IIIによって転写されるゲノム RNAはそれぞれのターミネータ 一を持ち、そのターミネータ一配列によって転写が終結する。一方 RNAポリメラーゼ II による転写ではターミネータ一配列は必要とされない。その転写終結の様式は明らか ではないが、 mRNAの 3 '末端の形成に重要なのは転写終結そのものではなぐ一次 転写産物の切断反応によるものと考えられて 、る。
[0030] RNAポリメラーゼ Iおよび IIIプロモーターの下流に連結された遺伝子の転写産物に は、 RNAポリメラーゼ IIプロモーターの下流にある遺伝子の転写産物とは異なり、その 5'および 3'末端にそれぞれ、キャップ、ポリ Aが付カ卩されない。天然の HCVゲノム RN Aは 5'および 3'末端には、キャップおよびポリ Aが付加されていない。このこと力 、 H CVゲノム DNAを、 RNAポリメラーゼほたは IIIプロモーターにて発現させることにより、 HCVウィルスゲノム RNAと同じ RNAを転写することができると期待できる。
[0031] 利用できるプロモーターは転写される RNAの 5'および 3'末端にそれぞれ、キャップ 、ポリ Aが付加されないものであれば良いが、好ましくは RNAポリメラーゼ Iプロモータ 一が良ぐさらに好ましくは rRNA遺伝子由来のプロモーターがよい。また、プロモータ 一の由来は、動物由来のものであればよいが、好ましくはマウス、ヒト由来のものがよ い。特に好ましい RNAポリメラーゼ Iプロモーターは、ヒトリボソーム RNA (rRNA)遺伝 子のプロモーターである。
[0032] さらに、ターミネータ一の配列も RNAポリメラーゼ Iターミネータ一が良ぐ好ましくは r RNA遺伝子由来のターミネータ一がよい。また、ターミネータ一の由来は、動物由来 のものであればよいが、好ましくはマウス、ヒト由来のものがよい。特に好ましい RNAポ リメラーゼ Iターミネータ一は、マウスリボソーム RNA (rRNA)遺伝子のターミネータ一で ある。
[0033] RNAポリメラーゼ Iプロモーター/ターミネータ一系はインフルエンザウイルス粒子の 再構成に使用されている（Neumann, G. et al.， Virology, 202(1994) p477- 479、 Neum ann, G. & Kawaoka, Y" Virology 287 (2001) p.243- 250、特表 2003- 520573)。本発 明の方法には、 RNAポリメラーゼ Iプロモーター/ターミネータ一系ベクターである pH H21 (Neumann G. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96 (1999) p9345— 9350)を使用 できる。 pHH21は、プロモーターとしてヒト RNAポリメラーゼ Iプロモーターを含み、ター ミネ一ターとしてマウス RNAポリメラーゼ Iターミネータ一を含む発現ベクターである。 [0034] HCVゲノム cDNAの 5 '端および 3 '端に、 PCRを用いて制限酵素 BsmBI認識配列を それぞれ付カ卩した後、 BsmBIで消化し、 pHH21の BsmBI部位に HCVゲノムを挿入する と、プロモーター/ターミネータ一と HCVゲノム cDNAの間に余分な塩基配列を含む ことなくそれらを連結できる。
[0035] また、上記プロモーター、 HCVゲノム cDNAおよびターミネータ一を適切に連結させ ることにより、本発明の方法に用いる発現ベクターを新たに構築することができる。
[0036] HCV株の塩基配列を用いた系統解析法では、 HCVは遺伝子型 la、遺伝子型 lb、 遺伝子型 2a、遺伝子型 2b、遺伝子型 3a、遺伝子型 3bの 6タイプに分類され、さらにそ れら各タイプがいくつかのサブタイプに分類される。そして、 HCVの複数の遺伝子型 についてはそのゲノム全長の塩基配列も決定されている（Simmonds, P. et al.， Hepat ology, 10 (1994) pl321- 1324、および Choo, Q.L et al, Science, 244 (1989) p359- 36 2, Okamoto, H et al" J. Gen. Virol, 73(1992) p673- 679、 Mori, S. et al" Biochem. Biophis. Res. Commun. 183 (1992) p334— 342)。
[0037] 本発明では、 HCV株として、具体的には、遺伝子型 1 (遺伝子型 laおよび lbが含ま れる）の H77c (H77株のコンセンサス配列： GenBankァクセッション番号 AF011751)、 1 株（GenBankァクセッション番号 M62321)、 H株（GenBankァクセッション番号 M67463) 、 HC-J1株（GenBankァクセッション番号 D10749)、 J1株（GenBankァクセッション番号 D89815)、 conl株（GenBankァクセッション番号 AJ238799)、 TH株（Wakita, T. et al., J. Biol. Chem., (1994) 269, p.14205- 14210)、、 J株（GenBankァクセッション番号 D90 208)、 JT株（GenBankァクセッション番号 D01171)、 BK株（GenBankァクセッション番 号 M58335)などが、遺伝子型 2 (遺伝子型 2aおよび 2bが含まれる）の J6CF株 (GenBan kァクセッション番号 AF177036)、 JFH1株（GenBankァクセッション番号 AB047639、 JF H-1株と称することもある）、 JCH1株（GenBankァクセッション番号 AB047640)、 HC-J8 株（GenBankァクセッション番号 D01221)などを用いることができる。また、その他の 株についても既に GenBankァクセッション番号のリストが報告されており（Tokita, T. et al., J. Gen. Virol. (1998) 79, p.1847—1857、 Cristina J. & Colina R. Virolgy Journal, (2006) 3, p.1-8)、入手可能である。
[0038] RNAポリメラーゼ Iプロモーター/ターミネータ一系ベクターに挿入する HCVゲノム R NA由来の cDNAは上記遺伝型のどのタイプでも利用でき、さらにはそれらのキメラか らなるものも利用できる。好ましくは、 Huh7等の HCV許容性の細胞に導入した場合に HCVゲノム RNAの自律複製が起こる遺伝子型由来のものであり（Wakita, T., et al. N at. Med., 11, (2005) p791— 796、 Lindenbach BD., et al., Science, 309(2005) p623— 62 6)、さらに好ましくは遺伝子型 2aの JFH1株（特開 2002-171978号公報）のゲノム RNA に対応するゲノム cDNA配列（GenBankァクセッション番号 AB047639、 Kato, T. et al., Gastroenterology, 125 (2003) pl808- 1817 ;配列番号 27)が挙げられる。
[0039] C型肝炎ウィルス (HCV)のゲノムは、約 9600ヌクレオチドからなる (+)鎖の一本鎖 RN Aである。このゲノム RNAは、 5'非翻訳領域 (5'NTR又は 5'UTRとも表記する）、構造領 域と非構造領域とから構成される翻訳領域、および 3'非翻訳領域 (3'NTR又は 3'UTR とも表記する）力 なる。その構造領域には HCVの構造タンパク質がコードされており 、非構造領域には複数の非構造タンパク質がコードされている。
[0040] このような HCVの構造タンパク質（Core、 El、 E2および p7)と非構造タンパク質（NS2 、 NS3、 NS4A、 NS4B、 NS5A、および NS5B)は、翻訳領域から一続きのポリプロテイン として翻訳された後、プロテアーゼによる限定分解を受けて遊離、生成される。これら の構造タンパク質および非構造タンパク質 (すなわち、 HCVのウィルスタンパク質)の うち、 Coreはコアタンパク質であり、 E1および E2はエンベロープタンパク質である。非 構造タンパク質はウィルス自身の複製に関与するタンパク質であり、 NS2はメタ口プロ テアーゼ活性、 NS3はセリンプロテアーゼ活性 (N末端側の 3分の 1)とへリカーゼ活 性（C末端側の 3分の 2)を有することが知られている。さらに、 NS4Aは NS3のプロテア ーゼ活性に対するコファクターであり、 NS5Bは RNA依存 RNAポリメラーゼ活性を有す ることち報告されている。
[0041] 本発明の HCV粒子を産生する方法に用いる発現ベクターは、 RNAポリメラーゼ Iが 認識するプロモーター（RNAポリメラーゼ〖プロモーター）の下流に HCVゲノム cDNAの 5'非翻訳領域、 Coreタンパク質コード配列、 El、 E2タンパク質コード配列、 p7タンパク 質コード配列、 NS2、 NS3、 NS4 (NS4Aおよび NS4Bを含む）、 NS5A、および NS5Bタン ノ ク質コード配列および 3 '非翻訳領域力この順で並んだ配列からなる DNAを有し、 さらにその下流に RNAポリメラーゼ Iが認識するターミネータ一（RNAポリメラーゼ Iター ミネ一ター）を含んで!/、ればよ 、。これらの配列は一続きのポリプロテインとして翻訳 された後に、プロテアーゼによる限定分解を受けて遊離、生成され HCV粒子が産生 される。
[0042] 本発明の HCV粒子を産生する方法では、 RNAポリメラーゼ Iプロモーターの下流に 、任意の HCV株由来の HCVゲノム RNAから合成した cDNAを連結し、さらにその下流 に RNAポリメラーゼ Iターミネータ一を連結した DNA断片を含む発現ベクターを用いる 。 RNAポリメラーゼ Iプロモーターの下流および RNAポリメラーゼ Iターミネータ一の上 流に連結するそのような HCV cDNAは、 1種の HCV株（好ましくは JFH1株）由来のゲノ ム RNAに対応するゲノム cDNAであってもよいし、 2種以上の HCV株（好ましくは、少な くともその 1種が JFH1株である）由来のゲノム RNA力も合成した cDNA力も誘導される キメラ核酸であってもよ 、。 RNAポリメラーゼ Iプロモーターと RNAポリメラーゼ Iターミネ 一ターの間に連結されるそのような HCV cDNAは、 HCVの 5'非翻訳領域、構造タン パク質（Core、 El、 E2および p7)、非構造タンパク質（NS2、 NS3、 NS4A、 NS4B、 NS5A 、および NS5B)および 3'非翻訳領域をコードする DNA配列をこの順番に 1つずつ含 む HCV全ゲノム様 cDNA配列であることが好ましい。
[0043] 特に、 RNAポリメラーゼ Iプロモーターの下流に、 HCV株 (好ましくは、遺伝子型 1ま たは 2の HCV株）由来の 5'非翻訳領域および構造タンパク質をそれぞれコードする D NA配列、さらに必要に応じて HCV株由来の非構造タンパク質をコードする DNA配列 、続いて HCV JFH1株由来の非構造タンパク質および 3'非翻訳領域をそれぞれコー ドする DNA配列をこの順番で含み、さらにその下流に RNAポリメラーゼ Iターミネータ 一を含む DNA断片を含むキメラ HCV発現ベクターは、感染性 HCV産生能が高 ヽた め、非常に好ましい。
[0044] 本発明に係るより好ましい発現ベクターは、 RNAポリメラーゼ Iプロモーターの下流 に任意の HCV株由来の HCVゲノム cDNA (すなわち、 HCVゲノム RNA全長をコードす る DNA)の 5'非翻訳領域コード配列、 Coreタンパク質コード配列、 El、 E2タンパク質コ ード配列、 p7タンパク質コード配列、 NS2タンパク質コード配列と、 JFH1株由来の HC Vゲノム cDNAの NS3、 NS4A、 NS4B、 NS5Aおよび NS5Bタンパク質コード配列ならびに 3'非翻訳領域コード配列と力もなる HCVゲノム cDNA配列を含み、さらにその下流に RNAポリメラーゼ Iターミネータ一を含む DNAを含有するものである。また他の好まし い発現ベクターは、 RNAポリメラーゼ Iプロモーターの下流に任意の HCV株由来の H CVゲノム cDNAの 5'非翻訳領域、 Coreタンパク質コード配列、 El、 E2タンパク質コー ド配列、 p7タンパク質コード配列と、 JFH1株由来の HCVゲノム cDNAの NS2、 NS3、 NS 4A、 NS4B、 NS5Aおよび NS5Bタンパク質コード配列ならびに 3'非翻訳領域コード配 列と力もなる HCVゲノム cDNA配列を含み、さらにその下流に RNAポリメラーゼ Iターミ ネーターを含む DNAを含有するものである。
[0045] 上記発現ベクターにおいて、任意の HCV株としては、好ましくは遺伝子型 1または 2 の HCV株である。また上記発現ベクターにおける 5'非翻訳領域コード配列は、 JFH1 株由来の配列または遺伝子型 1及び遺伝子型 2の HCV株力 選ばれる 2種以上の H CV株由来のキメラ配列である事が好ましぐキメラ配列である場合、 JFH1株由来の配 列が含まれることがさらに好ましい。遺伝子型 1の HCV株としては、例えば H77c株、 1 株、 H株、 HC-J1株、 J1株、 conl株、 TH株、 J株、 JT株、 BK株などを用いることができ る。遺伝子型 2の HCV株としては、例えば J6CF株、 JFH1株、 JCH1株、 HC-J8株など を用いることもできる。より好ましい HCV株として、 JFH1株、 J6CF株、 J1株、 H77c株が 挙げられる。
[0046] 一例として、 JFH1株由来の全長ゲノム cDNAにおいて、本発明の発現ベクターに組 み込まれうる 5'非翻訳領域力も NS2タンパク質までをコードする領域は、配列番号 27 (GenBankァクセッション番号 AB047639の DNA配列）で示される塩基配列にお!、て塩 基番号 1〜3430であり、また NS3タンパク質力も 3'非翻訳領域までをコードする領域 は塩基番号 3431〜9678である。同様に、 JFH1株由来の全長ゲノム cDNAにおいて、 5 '非翻訳領域から p7タンパク質までをコードする領域は、配列番号 27で示される塩基 配列において塩基番号 1〜2779であり、また NS2タンパク質力 3'非翻訳領域までを コードする領域は塩基番号 2780〜9678である。他の HCV株由来のゲノム cDNA上の 各領域の位置にっ 、ても、この JFH1株のゲノム cDNA配列を基準として定めることが できる。
[0047] 本発明に係る特に好適な発現ベクターの例は、後述の実施例に示す DNA断片 J6( C-p7)JFHl (配列番号 29)、 H77c(C-p7)JFHl (配列番号 30)、 Jl(C-p7)JFHl (配列 番号 31)、 J1(C-NS2)JFH1 (配列番号 32)のいずれかを含有する発現ベクターである 。これらの DNA断片は、ベクター中の発現プロモーターの制御下に挿入されることが 好ましい。
[0048] HCVの非構造タンパク質 NS5B中の GDDアミノ酸配列が GNDに変異すると自律複 製が起こらないことが示されている（Kato, T. et al.， Gastroenterology, 125(2003) pl8 08-1817)ので、実験のコントロールとして、 NS5Bタンパク質のアミノ酸配列が GNDに 変異したものを使用することができる。
[0049] 2.細朐内での HCV RNAの合成確認
上記のようにして作製される本発明の発現ベクターを細胞内に導入して HCV RNA を転写することができる。細胞への DNAの導入はエレクト口ポレーシヨン法、リボフエタ シヨン法、リン酸カルシュゥム法など一般的な方法を用いて行うことができる。
[0050] 発現ベクター DNAから転写される HCV RNAの解析は、通常の分子生物学的方法（ Molecularし loning 3rd Edition Sambrook & Russellし old Spring Harbor Laboratory P ress 2001)で解析することができる。具体的には、ノーザンブロット法、リボヌクレア一 ゼプロテクションアツセィ法、 RT-PCR法および RACE法などを用いて、転写された RN Aの量または配列を解析することができる。 RNAの定量を行う場合はノーザンブロット 法や RT-PCR法力 RNAの配列を解析する場合は RACE法が用いられる。
[0051] 細胞内で転写された HCV RNAの 5，末端の配列を解析する場合、特定の配列の合 成 RNAリンカ一を HCV RNAに RNAリガーゼを用いて連結し、これを铸型として、 HCV RNAに相補的な合成 DNAプライマーを用いて逆転写酵素にて cDNAを合成する。次 にリンカ一内の配列と先に用いたプライマーより 5'側のプライマーにて PCRを行い HC V RNAに相補的な断片を増幅し、プラスミドベクターにクローンィ匕後、塩基配列を決 定することで、細胞内で転写された HCV RNAの配列を解析することができる。最初の PCRで DNA断片が増幅されなかった場合は nested-PCR法で行えば解析を行うことが 可能となる。
[0052] 3.細朐内での HCVタンパク質の発現確認
HCVが感染し、 HCVゲノム RNAが複製されている細胞では、上記の HCVタンパク質 が発現されている。従って、 HCVゲノム RNA複製細胞力も抽出したタンパク質中から HCVタンパク質が検出されれば、その細胞は、 HCVゲノム RNAを複製しているものと 判断することができる。 HCVタンパク質の検出は、公知の任意のタンパク質検出法に 従って行うことができ、例えば、導入された HCVゲノム RNA力も発現されるべき HCVタ ンパク質に対する抗体を、細胞力も抽出したタンパク質と反応させることによって行う ことができる。より具体的には、例えば、細胞力も抽出したタンパク質試料を-トロセ ルロース膜にブロッテイングし、それに対して抗 HCVタンパク質抗体 (例えば、抗 NS3 特異的抗体、又は C型肝炎患者から採取した抗血清)を反応させ、さらにその抗 HC Vタンパク質抗体を検出することによって行うことができる。
[0053] HCVタンパク質を発現させるための宿主細胞は、継代培養可能な細胞であれば特 に限定されないが、真核細胞であることが好ましぐヒト細胞であることがより好ましぐ ヒト肝由来細胞、ヒト子宮頸由来細胞、又はヒト胎児腎由来細胞であることがさらに好 ましい。また、細胞としては、癌細胞株や幹細胞株などを含む増殖性細胞が好ましく 、 Huh7細胞（ATCC CCL- 185)、 HepG2細胞（ATCC HB 8065)、 IMY-N9細胞（Date, T. et al., J. Biol. Chem., (2004) 279, p.22371— 22376)、 HeLa細胞（ECACC 930210 13)、 RCYMIRC細胞（Murakami, K., et al., Virology, 351, 381—392, 2006)、 5- 15RC 細胞（Pietschmann T.， et al., J Virol. (2001) 75, p.1252- 1264)、およびそれらの細胞 力も派生した株化細胞等がより好ましい。特に好ましい細胞としては、 Huh7細胞、 RC YM1RC細胞、 5-15RC細胞、 HepG2細胞およびそれらの細胞から派生した株化細胞 が挙げられる。これらの細胞は、市販のものを利用してもよいし、細胞寄託機関から 入手して使用してもよ 、し、任意の細胞 (例えば癌細胞又は幹細胞)力 株化した細 胞を使用してもよい。 Huh7細胞力も派生した細胞株として、 Huh7.5細胞（Blight, KJ. Et al" J. Virol, (2002) 76, p.13001- 13014)および Huh7.5.1細胞（Zhong, J. et al" P roc. Natl. Acad. Sci USA, (2005) 102, p.9294-9299)が挙げられる。前者は、 Huh7細 胞にレプリコンを遺伝子導入した後に樹立されたレブリコン複製細胞をインターフエ口 ン処理でレブリコンを排除することにより HCV複製能が高くなつた細胞であり、後者は 、 Huh7.5細胞で作製したレプリコン複製細胞からインターフェロン γ処理でレプリコン を排除したレブリコン複製効率の良い細胞である。
[0054] 4. HCV粒子の產生確露 本発明の発現ベクターを HCV許容性細胞 (HCVの増殖を許容する細胞）に導入し 、その細胞を培養することにより、本発明の発現ベクターから転写された HCVゲノム R NAを有する C型肝炎ウィルス (HCV)粒子を産生することができる。 HCV許容性細胞 としては、 Huh7細胞、 RCYM1RC細胞、 5-15RC細胞、 HepG2細胞およびそれらの細 胞カも派生した株化細胞などを好適に用いることができる。このようにして産生された C型肝炎ウィルス (HCV)粒子は、他の細胞への感染性を保持している。本発明は、 このような感染性 C型肝炎ウィルス粒子の産生方法に関する。
[0055] 細胞のウィルス粒子産生能は、公知の任意のウィルス検出法を用いて確認すること ができる。例えば、ウィルス粒子を産生していると思われる細胞の培養液をショ糖密 度勾配により分画し、各分画の密度、 HCVコアタンパク質濃度、および HCVゲノム RN Aの量を測定した結果、 HCVコアタンパク質と HCVゲノム RNAのピークが一致し、しか もそのピークが検出される画分の密度力 培養上清を 0.25% NP40 (ポリオキシェチレ ン (9)ォクチルフエ-ルエーテル [Polyoxyethylene(9)Octylphenyl Ether])で処理して から分画した場合の同画分の密度と比較して軽い場合には、該細胞はウィルス粒子 産生能を有すると判定することができる。また、フリーの HCV粒子の比重は 1.14〜1.1 6g/mlと報告されている（Kaito, M. et al.， J. Gen. Virol. 75 (1994) pl755- 1760)ので この値と it較することちでさる。
[0056] 培養液中に放出された HCVウィルス粒子は、例えば、 Coreタンパク質、 E1タンパク 質、又は E2タンパク質に対する抗体を用いて検出することもできる。また、培養液中 の HCVウィルス粒子が含有する HCVゲノム RNAを、特異的プライマーを用いた RT-P CR法により増幅して検出することによって、 HCVウィルス粒子の存在を間接的に検 出することちでさる。
[0057] 5.本発明の HCV粒子の他の細胞への感染
本発明の方法で産生される HCVウィルス粒子は、細胞 (好ましくは HCV許容性 (感 受性)細胞)への感染能を有する。本発明は、 RNAポリメラーゼ Iプロモーター/ターミ ネーター系を用いた HCV発現ベクターを導入した細胞を培養し、得られた培養物（ 好ましくは、培養液）中のウィルス粒子を他の細胞 (好ましくは HCV感受性細胞）に感 染させることを含む、 C型肝炎ウィルス感染細胞の製造方法も提供する。ここで、 HC V許容性細胞とは、 HCVゲノム RNAの複製能および/または HCVに感染する能力を 有する細胞である。 HCV許容性細胞は、好ましくは肝臓細胞又はリンパ球系細胞で あるが、これらに限定されるものではない。具体的には、肝臓細胞としては初代肝臓 細胞や、 Huh7細胞、 HepG2細胞、 IMY-N9細胞、 HeLa細胞、 293細胞などが挙げら れ、リンパ球系細胞としては Molt4細胞や、 HPB- Ma細胞、 Daudi細胞などが挙げられ る力 これらに限定されるものでは無い。特に好ましい HCV許容性細胞としては、 Huh 7細胞、 RCYM1RC細胞、 5-15RC細胞、 HepG2細胞およびそれらの細胞から派生し た (作製された)株化細胞が挙げられる。 Huh7細胞力も派生した細胞で好ま 、細胞 として、 Huh7.5細胞および Huh7.5.1細胞が挙げられる。
[0058] 本発明の RNAポリメラーゼ Iプロモーター/ターミネータ一系を用いた HCV発現べク ターを導入した細胞にぉ 、て産生された HCV粒子を細胞 (例えば、 HCV許容性細胞 )に感染させると、その感染細胞中では HCVゲノム RNAが複製され、さらにウィルス粒 子が形成される。
[0059] 本発明の RNAポリメラーゼ Iプロモーター/ターミネータ一系を用いた HCV発現べク ターを導入した細胞にぉ 、て産生された HCVウィルス粒子は、チンパンジーなどの H CVウィルスに感染しうる動物に感染して、 HCV由来の肝炎を引き起こすことができる
[0060] 本発明の RNAポリメラーゼ Iプロモーター/ターミネータ一系を用いた HCV発現べク ターを導入した細胞にぉ 、て産生された HCV粒子が感染性を有して 、る力否かは、 本発明の RNAポリメラーゼ Iプロモーター/ターミネータ一系を用いた HCV発現べクタ 一を導入した細胞を培養して得られた上清を HCV許容性細胞 (たとえば Huh7)に処 理して、たとえば 48時間後に細胞抗コア抗体で免疫染色して感染細胞数を数えるか 、細胞の抽出物を SDS-ポリアクリルアミドゲルにて電気泳動し、ウェスタンブロットにて 、コアタンパク質を検出することで判断できる。
[0061] 6.感染性 HCV粒子産牛.細朐株の取得
本発明の RNAポリメラーゼ Iプロモーター/ターミネータ一系を用 ヽた HCV発現べク ターが安定的に導入された細胞は、感染性 HCV粒子を持続的に生産することができ る。本発明の RNAポリメラーゼ Iプロモーター/ターミネータ一系を用いた HCV発現べ クタ一を安定的に発現する細胞株を得るためには、本ベクター内に薬剤抵抗性遺伝 子を組み込んで置くことが望ましい。薬剤抵抗性遺伝子として、 G418抵抗性遺伝子、 ハイグロマイシン抵抗性遺伝子、ピューロマイシン抵抗性遺伝子、 Zeocin抵抗性遺伝 子、ブラストサイジン抵抗性遺伝子などが挙げられる。また、薬剤抵抗性を指標として 選別されたクローンの HCV粒子産生能は、それらのクローンの培養上清中の Coreタ ンパク質量やクローンで複製される HCV RNA量をノーザンブロットや定量的 RT-PCR にて検出することで推定できる。
[0062] 本明細書は本願の優先権主張の基礎とする日本国特許出願 2005-287646号の明 細書および Zまたは図面に記載される内容を包含する。
[0063] 本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願の全体が参照により本明 細書に組み入れられるものとする。
実施例
[0064] 以下に実施例を挙げて、本発明をより具体的に説明する。ただし、これらの実施例 は説明のためのものであり、本発明の技術的範囲を制限するものではない。
[0065] [実施例 1]
RNAポリメラーゼ Iプロモーター/ターミネータ一系を用いた HCV発現ベクターの構築 HCVゲノム RNAの cDNAとして、遺伝子型 2aの JFH1株由来ゲノム RNAの cDNA (Gen Bankァクセッション番号 AB047639、 Kato, T. et al., Gastroenterology, 125(2003) pl8 08-1817)、 JFH1株の NS5B中の GDDアミノ酸配列が GNDとなるように DNA配列を変 換した JFH1株由来ゲノム RNAの cDNA(Wakita, T. et al. Nat. Med., 11 (2005) p.791 - 796)、 J6CF株由来ゲノム RNAの cDNA(GenBankァクセッション番号 AF177036、 Yan agi, M. et al. Virology, 262 (1999) p.250- 263)、遺伝子型 laの H77c株由来のゲノム RNAのcDNA (GenBankァクセッション番号AF011751、 Yanagi, M. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94 (1997) p.8738-8743)、および遺伝子型 lbの Jl株由来のゲノム R NAの cDNA (GenBankァクセッション番号 D89815、 Aizaki, H. et al. Hepatology, 27 (1 998) p.621-627)を使用した。
[0066] 上記の HCVゲノム cDNA(JFHl、 JFH1/GNDおよび H77c)の 5，端および 3，端に、 PC Rを用いて制限酵素 BsmBI認識配列をそれぞれ付加した。 BsmBIの切断部位がその 酵素の認識部位から離れて ヽる性質を利用し、ヒト RNAポリメラーゼ〖プロモーターお よびマウス RNAポリメラーゼ Iターミネータ一の配列を有する pHH21ベクター（Neumann G. et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96 (1999) p9345- 9350)の BsmBI部位に、 HC Vゲノムをプロモーター/ターミネータ一と HCVゲノムの間に余分な塩基配列を含む ことなく、挿入させた（図 1A)。また、それぞれのクローンのマップは図 1Bに示した。 得られた HCVゲノム cDNAを含むベクターをそれぞれ pHH JFH1、 pHH JFH1/GNDお よび、 pHH H77cと呼ぶ。
[0067] さらに、 J6CFと JFH1、 H77cと JFH1、 Jlと JFH1のゲノム cDNAにそれぞれ由来するキ メラ HCV発現ベクターの作製は以下に示す方法で行った。
[0068] PHH T6(C- D7)/TFH1の作製
JFH1株由来ゲノム RNA全領域に対応する cDNAを pUC19プラスミド中にクローニン グすることにより構築されたプラスミド DNAである pJFHl (Wakita, T. et al. Nat. Med., 11 (2005) p791-796、国際公開 WO2004/104198)を Agelで消化後、さらに Bellで部分 消化し、 Agel部位力も最初の Bell部位までの断片（2672 bp)が除去されたプラスミド D NA断片を精製した。一方、 J6CF株由来ゲノム cDNAを Agelと Bellで部分消化して得ら れる 2672 bpの断片を上記の断片に連結し、 pUC J6/JFH1を得た。
[0069] 次に pHH JFH1を Noelで消化して得られる約 4.3kbの断片と、 pUC J6/JFH1を Noel で消化して得られる約 8.2kbの断片をリガーゼにより連結して、発現ベクター pHH J6( C- p7)/JFHlを得た。この pHH J6(C- p7)/JFHlの挿入断片 (J6(C- p7)JFHl；配列番号 29、図 10A〜D)は、 JFH1株および J6CF株由来のキメラ力もなる 5'非翻訳領域と、 J6 CF株由来の Coreタンパク質、 E1タンパク質、 E2タンパク質、および p7タンパク質をそ れぞれコードする DNA配列と、 JFH1株由来の NS2、 NS3、 NS4A、 NS4B、 NS5Aおよび NS5Bタンパク質および 3，非翻訳領域をそれぞれコードする DNA配列とを含む。
[0070] PHH H77c(C- D7)/.TFH1の作製
上記 JFH1ゲノム cDNAを铸型として、 LA-PCRキット（タカラバイオ社）に添付されて いた、 10 X緩衝液を 5 μ 1、 2.5mM dNTP混合液を 5 1、 10 Mのプライマー 5- JFH- S (配列番号 10： GCCATGGCGTTAGTATGAGTGTCGT)および 5- JFH- A (配列番号 11： TCGTGCTCATGGTGCACGGTCTACGAGACC)をそれぞれ 1 μ 1加え、最終的 に脱イオン水をカ卩ぇ全量を 49 μ 1とした。次に Takara LA Taq (タカラバイオ社）を 1 μ 1 加えてから、 PCR反応を行った。 PCR反応は、 94°C1分、 64°C2分、 72°C3分からなる 工程を 1サイクルとして 30サイクルの条件で行った。得られた PCR産物を PCR産物 no. 1とした。次に、 JFH1ゲノム cDNAを铸型として、 LA-PCRキット（タカラバイオ社）に添 付されて 、た、 10 X緩衝液を 5 μ 1、 2.5mM dNTP混合液を 5 1、 10 Mのプライマー 3-JFH-S (配列番号 12： GGCATACGCATATGACGCACCTGTGCACGG)および 3- J FH-A (配列番号 13： GCTCTGACGAAGTACGGCACATGTGTC)をそれぞれ 1 μ 1カロ え、最終的に脱イオン水をカ卩ぇ全量を 49 1とした。次に Takara LA Taq (タカラバイオ 社)を 1 μ 1カ卩えてから、 PCR反応を行った。 PCR反応は、 94°C1分、 64°C2分、 72°C3分 力 なる工程を 1サイクルとして 25サイクルの条件で行った。得られた PCR産物を PCR 産物 no.2とした。さらに、上記 H77cゲノム cDNAを铸型として、 LA- PCRキット（タカラバ ィォ社）に添付されて 、た、 10 X緩衝液を 5 μ 1、 2.5mM dNTP混合液を 5 Ι μ Μ のプライマー 5- Η77- S (配列番号 14 : ACCGTGCACCATGAGCACGAATCCTAAA CC)および 5- Η77- Α (配列番号 15： GAAGCCGCACGTAAGGGTATCGATG:)をそ れぞれ 1 μ 1加え、最終的に脱イオン水を加え全量を 49 1とした。次に Takara LA Taq (タカラバイオ社)を 1 1加えてから、 PCR反応を行った。 PCR反応は、 94°C1分、 64°C 2分、 72°C3分力もなる工程を 1サイクルとして 25サイクルの条件で行った。得られた PC R産物を PCR産物 no.3とした。次に、 H77cゲノム cDNAを铸型として、 LA-PCRキット（タ カラバイオ社）に添付されて 、た、 10 X緩衝液を 5 μ 1、 2.5mM dNTP混合液を 5 μ 1、 10 μ Μのプライマー 3- Η77- S (配列番号 16 : CATTGTGCCCGCAAAGAGCGTGTGT) および 3- H77- A (配列番号 17： GTGCGTCATATGCGTATGCCCGCTGAGGCA)を それぞれ 1 μ 1加え、最終的に脱イオン水をカ卩ぇ全量を 49 1とした。次に Takara LA T aq (タカラノィォ社)を 1 μ 1カ卩えてから、 PCR反応を行った。 PCR反応は、 94°C1分、 64 °C2分、 72°C3分力もなる工程を 1サイクルとして 25サイクルの条件で行った。得られた PCR産物を PCR産物 no.4とした。
次に、それぞれの PCR産物を精製し、 50 μ 1の Η 0に溶かした。 PCR産物 no. lと PCR
2
産物 no.3の DNAを 100倍希釈して各 1 μ 1を混合した。この混合液をテンプレートとし、 プライマーをカ卩えずに上記の条件で PCRを 5サイクル行った。その後、プライマー 5-J FH-S (配列番号 10)および 5-H77-A (配列番号 15)を添カ卩して、さらに PCRを 25サイク ル行い、それにより増幅したキメラ DNA断片を精製した。この断片をプラスミドベクタ 一 pCRIIにクローン化し、その DNA断片の塩基配列を決定し、塩基配列が正しいこと を確認した。 pCRIIにキメラ DNA断片をクローン化したこのプラスミドを pCR5HJと名付 けた。さらに、 PCR産物 no.2と PCR産物 no.4を 100倍希釈して各 1 1を 1つに混合した 。この混合液をテンプレートとし、プライマーをカ卩えずに上記の条件で PCRを 5サイク ル行った。その後、プライマー 3-H77-S (配列番号 16)および 3-JFH-A (配列番号 13) を添加し、さらに PCRを 25サイクル行い、それにより増幅したキメラ DNA断片を精製し た。この断片をプラスミドベクター pCRIIにクローンィ匕し、その DNA断片の塩基配列を 決定し、塩基配列が正しいことを確認した。 pCRIIにキメラ DNA断片をクローンィ匕した このプラスミドを PCR3HJと名付けた。
[0072] 次!、で、 pCR5HJを制限酵素 Agelおよび Kpnlで、 H77cゲノム cDNAを制限酵素 Kpnl および Asclで、 pCR3HJを制限酵素 Asclおよび Notlで消化し、各 HCVcDNA断片をァ ガロースゲル電気泳動にて分画し、精製した。これら 3つの DNA断片を、 pHH JFH1 を Agelおよび Notlで消化して得られたベクターに連結した。このベクターを pHH H77 c(C- p7)/JFHと名付けた。この発現ベクター pHH H77c(C- p7)/JFHの挿入断片（H77 c(C-p7)JFH ;配列番号 30、図 11A〜D)は、 JFH1株および H77c株由来のキメラから なる 5'非翻訳領域、 H77c株由来の Coreタンパク質、 E1タンパク質、 E2タンパク質、お よび p7タンパク質をそれぞれコードする DNA配列と、 JFH1株由来の NS2、 NS3、 NS4A 、 NS4B、 NS5Aおよび NS5Bタンパク質および 3'非翻訳領域をそれぞれコードする DN A配列とを含む。
[0073] PHH T1(C- D7)/.TFH1の作製
上記 JFH1ゲノム cDNAを铸型として、 LA-PCRキット（タカラバイオ社）に添付されて V、た、 10 X緩衝液を 5 μ 1、 2.5mM dNTP混合液を 5 1、 10 Mのプライマー 5— JFH— S ( 配列番号 10： GCCATGGCGTTAGTATGAGTGTCGT)および 5- JFH- A2 (配列番号 18 :TTGTGCTCATGGTGCACGGTCTACGAGACC)をそれぞれ 1 μ 1加え、最終的 に脱イオン水をカ卩ぇ全量を 49 μ 1とした。次に Takara LA Taq (タカラバイオ社）を 1 μ 1 加えてから、 PCR反応を行った。 PCR反応は、 94°C1分、 64°C2分、 72°C3分からなる 工程を 1サイクルとして 25サイクルの条件で行った。得られた PCR産物を PCR産物 no. 5とした。
[0074] 次に、 JFH1ゲノム cDNAを铸型として、 LA-PCRキット（タカラバイオ社）に添付されて いた、 10 X緩衝液を 5 μ 1、 2.5mM dNTP混合液を 5 1、 10 Mのプライマー 3- JFH- S2 (配列番号 19 : AGCTTACGCCTATGACGCACCTGTGCACGG)および 3- JFH- A ( 配列番号 13 : GCTCTGACGAAGTACGGCACATGTGTC)をそれぞれ 1 μ 1加え、最 終的に脱イオン水をカ卩ぇ全量を 49 1とした。次に Takara LA Taq (タカラバイオ社)を 1 μ 1カ卩えてから、 PCR反応を行った。 PCR反応は、 94°C1分、 64°C2分、 72°C3分から なる工程を 1サイクルとして 25サイクルの条件で行った。得られた PCR産物を PCR産物 no.6とし 7こ。
[0075] 遺伝子型 lbの J1株由来のゲノム RNAに対応する cDNA (GenBankァクセッション番 号 D89815、 Aizaki, H. et al. Hepatology, 27 (1998) p.621- 627)を铸型として、 LA- P CRキット（タカラバイオ社）に添付されていた、 10 X緩衝液を 5 1、 2.5mM dNTP混合 液を 5 μ 1、 10 μ Μのプライマー 5- Jl- S (配列番号 20： ACCGTGCACCATGAGCACAA ATCCTAAACC)および 5- Jl- A (配列番号 21： AAGCGGGATGTACCCCATGAG)を それぞれ 1 μ 1加え、最終的に脱イオン水をカ卩ぇ全量を 49 1とした。次に Takara LA T aq (タカラノィォ社)を 1 μ 1カ卩えてから、 PCR反応を行った。 PCR反応は、 94°C1分、 64 °C2分、 72°C3分力もなる工程を 1サイクルとして 25サイクルの条件で行った。得られた PCR産物を PCR産物 no.7とした。
[0076] 次に、上記の J1株由来ゲノム cDNAを铸型として、 LA-PCRキット（タカラバイオ社）に 添付されて 、た、 10 X緩衝液を 5 μ 1、 2.5mM dNTP混合液を 5 1、 10 Mのプライマ — 3-J1-S (配列番号 22： CGGCTGTACATGGATGAATAGCACTGGGTT)および 3- J 1- A (配列番号 23： GTGCGTCATAGGCGTAAGCTCGTGGTGGTA)をそれぞれ 1 μ 1 加え、最終的に脱イオン水をカ卩ぇ全量を 49 1とした。次に Takara LA Taq (タカラバイ ォ社)を 1 μ 1カ卩えてから、 PCR反応を行った。 PCR反応は、 94°C1分、 64°C2分、 72°C3 分力ゝらなる工程を 1サイクルとして 25サイクルの条件で行った。得られた PCR産物を P CR産物 no.8とした。
[0077] それぞれの PCR産物を精製し、 50 μ 1の Η 0に溶かした。 PCR産物 ηο.5と PCR産物 η 0.7の DNAを 100倍希釈して各 1 μ 1を 1つに混合した。この混合液をテンプレートとし、 プライマーをカ卩えずに上記の条件で PCRを 5サイクル行った。その後、プライマー 5-J FH-S (配列番号 10)および 5-J1-A (配列番号 21)を添加し、さらに PCRを 25サイクル 行い、それにより増幅したキメラ DNA断片を精製した。この断片をプラスミドベクター ρ CRIIにクローン化し、その DNA断片の塩基配列を決定し、塩基配列が正しいことを確 認した。 pCRIIにキメラ DNA断片をクローン化したこのプラスミドを pCR5JJと名付けた。
[0078] さらに、 PCR産物 no.6と PCR産物 no.8の DNAを 100倍希釈して各 1 μ 1を混合した。こ の混合液をテンプレートとし、プライマーをカ卩えずに上記の条件で PCRを 5サイクル行 つた。その後、プライマー 3-J1-S (配列番号 22)および 3-JFH-A (配列番号 13)を添カロ し、さらに PCRを 25サイクル行い、それにより増幅したキメラ DNA断片を精製した。この 断片をプラスミドベクター pCRIIにクローンィ匕し、その DNA断片の塩基配列を決定し、 塩基配列が正し ヽことを確認した。 pCRIIにキメラ DNA断片をクローンィ匕したこのプラ スミドを PCR3JJと名付けた。
[0079] pCR5JJを制限酵素 Agelおよび Clalで、 J1ゲノム cDNAを制限酵素 Clalおよび Avrllで 、 pCR3JJを制限酵素 Avrllおよび Kpnlで消化し、各 HCV cDNA断片をァガロースゲル 電気泳動にて分画し、精製した。これら 3つの DNA断片を pHH JFH1を Agelおよび Kp nlで消化して得られたベクターに連結した。このベクターを pHH J1(C- p7)/JFHと名付 けた。この発現ベクター pHH J1(C- p7)/JFHの挿入断片 (J1(C- p7)JFH ;配列番号 31 、図 12A〜D)は、 JFH1株および J1株由来のキメラ力もなる 5'非翻訳領域、 J1株由来 の Coreタンパク質、 E1タンパク質、 E2タンパク質、および p7タンパク質をそれぞれコー ドする DNA配列と、 JFH1株由来の NS2、 NS3、 NS4A、 NS4B、 NS5Aおよび NS5Bタンパ ク質および 3'非翻訳領域をそれぞれコードする DNA配列とを含む。
[0080] PHH T1(C- NS2)/.TFH1の作製
上記 JFH1ゲノム cDNAを铸型として、 LA-PCRキット（タカラバイオ社）に添付されて V、た、 10 X緩衝液を 5 μ 1、 2.5mM dNTP混合液を 5 1、 10 Mのプライマー 5— JFH— S ( 配列番号 10： GCCATGGCGTTAGTATGAGTGTCGT)および 5- JFH- A2 (配列番号 18 :TTGTGCTCATGGTGCACGGTCTACGAGACC)をそれぞれ 1 μ 1加え、最終的 に脱イオン水をカ卩ぇ全量を 49 μ 1とした。次に Takara LA Taq (タカラバイオ社）を 1 μ 1 加えてから、 PCR反応を行った。 PCR反応は、 94°C1分、 64°C2分、 72°C3分からなる 工程を 1サイクルとして 25サイクルの条件で行った。得られた PCR産物を PCR産物 no. 9とした。
[0081] 次に、 JFH1ゲノム cDNAを铸型として、 LA-PCRキット（タカラバイオ社）に添付されて いた、 10 X緩衝液を 5 μ 1、 2.5mM dNTP混合液を 5 1、 10 Mのプライマー 3- JFH- N S3- S (配列番号 24： GCGACTCCTTGCTCCCATCACTGCTTATGC)および 3- JFH- NS3- A (配列番号 25 :TGGGAGACCTTGTAACAACGTCGAGTGT)をそれぞれ 1 μ 1 加え、最終的に脱イオン水をカ卩ぇ全量を 49 1とした。次に Takara LA Taq (タカラバイ ォ社)を 1 μ 1カ卩えてから、 PCR反応を行った。 PCR反応は、 94°C1分、 64°C2分、 72°C3 分力ゝらなる工程を 1サイクルとして 25サイクルの条件で行った。得られた PCR産物を P CR産物 no.10とした。
[0082] 遺伝子型 lbの J1株由来のゲノム RNAの cDNA(GenBankァクセッション番号 D89815 、 Aizaki, H. et al. Hepatology, 27 (1998) p.621- 627)を铸型として、 LA- PCRキット（タ カラバイオ社）に添付されて 、た、 10 X緩衝液を 5 μ 1、 2.5mM dNTP混合液を 5 μ 1、 10 μ Μのプライマー 5- Jl- S (配列番号 20： ACCGTGCACCATGAGCACAAATCCTAA ACC)および 5- Jl- A (配列番号 21： AAGCGGGATGTACCCCATGAG)をそれぞれ 1 μ 1加え、最終的に脱イオン水をカ卩ぇ全量を 49 1とした。次に Takara LA Taq (タカラ バイオ社)を 1 μ 1カ卩えてから、 PCR反応を行った。 PCR反応は、 94°C1分、 64°C2分、 7 2°C3分力ゝらなる工程を 1サイクルとして 25サイクルの条件で行った。得られた PCR産物 を PCR産物 no.11とした。
[0083] 次に、 J1株由来のゲノム cDNAを铸型として、 LA-PCRキット (タカラバイオ社）に添付 されていた、 10 X緩衝液を 5 μ 1、 2.5mM dNTP混合液を 5 1、 10 Mのプライマー 3- J1-S (配列番号 22： CGGCTGTACATGGATGAATAGCACTGGGTT)および 3- Jl- N S3- A (配列番号 26： CATAAGCAGTGATGGGAGCAAGGAGTCGCC)をそれぞれ 1 μ 1加え、最終的に脱イオン水をカ卩ぇ全量を 49 1とした。次に Takara LA Taq (タカラ バイオ社)を 1 μ 1カ卩えてから、 PCR反応を行った。 PCR反応は、 94°C1分、 64°C2分、 72 °C3分力ゝらなる工程を 1サイクルとして 25サイクルの条件で行った。得られた PCR産物 を PCR産物 no.12とした。 [0084] それぞれの PCR産物を精製し、 50 μ 1の Η Οに溶力した。 PCR産物 ηο.9と PCR産物 η
2
0.11の DNAを 100倍希釈して各 1 μ 1を 1つに混合した。この混合液をテンプレートとし 、プライマーを加えずに上記の条件で PCRを 5サイクル行った。その後、 5-JFH-S (配 列番号 10)および 5-J1-A (配列番号 21)をプライマーとして添カ卩し、さらに PCRを 25サ イタル行い、それにより増幅したキメラ DNA断片を精製した。この断片をプラスミドべク ター pCRIIにクローンィ匕し、その DNA断片の塩基配列を決定し、塩基配列が正しいこ とを確認した。 pCRIIにキメラ DNA断片をクローン化したこのプラスミドを pCR5JJと名付 けた。
[0085] さらに、 PCR産物 no.lOとPCR産物no.l2のDNAを100倍希釈して各l μ 1を 1つに混合 した。この混合液をテンプレートとし、プライマーを加えずに上記の条件で PCRを 5サ イタル行った。その後、 3-J1-S (配列番号 22)および 3-JFH- NS3-A (配列番号 25)を プライマーとして添カ卩し、さらに PCRを 25サイクル行い、それにより増幅したキメラ DNA 断片を精製した。この断片をプラスミドベクター pCRIIにクローン化し、その DNA断片 の塩基配列を決定し、塩基配列が正しいことを確認した。 pCRIIにキメラ DNA断片をク ローン化したこのプラスミドを PCR3JJNS3と名付けた。
[0086] pCR5JJを制限酵素 Agelおよび Clalで、 J1ゲノム cDNAを制限酵素 Clalおよび Avrllで 、 pCR3JJNS3を制限酵素 Avrllおよび BspDIで消化し、各 HCV cDNA断片をァガロー スゲル電気泳動にて分画し、精製した。これら 3つの DNA断片を pHH JFH1を Agelお よび BspDIで消化して得られたベクターに連結した。このベクターを pHH JKC-NS2)/ JFHと名付けた。この発現ベクター pHH J1(C- NS2)/JFHの挿入断片 (J1(C- NS2)JFH ; 配列番号 32、図 13A〜D)は、 JFH1株および J1株由来のキメラ力もなる 5'非翻訳領 域、 J1株由来の Coreタンパク質、 E1タンパク質、 E2タンパク質、 p7タンパク質、および NS2タンパク質をそれぞれコードする DNA配列と、 JFH1株由来の NS3、 NS4A、 NS4B、 NS5Aおよび NS5Bタンパク質および 3，非翻訳領域をそれぞれコードする DNA配列と を含む。
[0087] それぞれの発現ベクタークローンのマップを図 1Cに示した。
[0088] [実施例 2]
細胞内での HCV RNAの合成確認 実施例 1で作製した pHH JFH1および pHH JFH1/GNDを Huh7および HepG2細胞に Fugene 6 (ロシュ社)を用いて、添付マニュアルに従って導入した。 24時間後に各細 胞から RNAを Isogen(日本ジーン社)にて、添付マニュアルに従って調製した。
[0089] これらの RNAを铸型として、以下の通り、 RACE法にて pHH JFH1および pHH JFH1/ GND力ら HCV RNAが合成されたかにつ!、て確認した。
[0090] 2 μ gの上記の通り調製した RNAと、 2.5 μ Μの RNAリンカ一（配列番号 1:GCUGAUG
Takara社）により、添付緩衝液を用いて連結した。次に、 RNAリンカ一が連結された R NAを铸型として、 HCV RNAに相補的なプライマー（配列番号 2:gtaccccatgaggtcggca aag)を用いて、逆転写酵素 Superscript III (インビトロジェン社）にて添付マニュアルに 従って cDNAを合成した。
[0091] 次いで、合成された上記 cDNAを铸型とし、 5'末端の RNAリンカ一に対するセンスプ ライマー（配列番号 3:GCTGATGGCGATGAATGAACACTG)と 3，末端側のアンチセ ンスプライマー（配列番号 4:gaccgctccgaagttttccttg)の 2種類のプライマーを用いて、 PCRにより DNAを増幅した。さらに、増幅された DNAを铸型として、増幅された DNAの 内側の配列からなる 5'末端側のプライマー（配列番号 5:GAACACTGCGTTTGCTG GCTTTGATG)および 3，末端側のプライマー（配列番号 6:cgccctatcaggcagtaccacaag )のプライマーセットを用いて、第 2の PCRを行った。なお、この PCRは市販のキット： E X Taq (Takara)を使用して、 96°Cで 5分間加熱処理後、 96°Cで 1分間、 55°Cで 1分間 、 72°Cで 2分間の反応のサイクルを 35回繰り返し、その後 4°Cで保存することにより行 つた。次いで、上記 2回目の PCR産物が得られたかを確認するため、反応液の一部を ァガロースゲル電気泳動にて確認した。その結果（図 2)、 Huh7細胞および HepG2細 胞の何れでも、 pHH JFH1と pHH JFH1/GND力ら HCV RNAの転写が起こっているこ とが確認できた。さらに、 2回目の PCR産物を pGEM- T Easy (Promega社）ベクターに クローン化した。得られたプラスミド DNAにクローン化された DNAの塩基配列を、 DNA シークェンサ一（ABI PRISM 377)を用いて決定した。その結果、 pHH JFH1および pH H JFH1/GND力ら転写された HCV RNAの 5'末端の配列は、 HCVゲノムの 5'末端と 同一であることが明ら力となった。図 3に、 pHH JFH1から転写された HCV RNAの 5' 末端とリンカ一の配列を示した。
[0092] [実施例 3]
細朐内での HCVタンパク質の発現確認
pHH JFH1、 pHH H77cおよび pHH JFH1/GNDを導入された細胞で、転写に引き続 き、 HCVタンパク質の翻訳が起こって!/、るかにつ!、て確認した。
[0093] pHH JFH1、 pHH H77cおよび pHH JFH1/GNDを Huh7細胞に Fugene 6 (ロシュ社） を用いて、添付マニュアルに従って導入した。培養 4日後、常法により、細胞抽出液 を調製した。次いで、これらの抽出液中のタンパク質を SDS-PAGEおよびウェスタン プロット法により解析した。解析にあたって、 Core遺伝子を含む発現プラスミド DNAを Huh7細胞にトランジェントにトランスフエクシヨンして得られた細胞抽出液を陽性対照 とした。さらに、トランスフエクシヨンしていない Huh7細胞力 得られた細胞抽出液を陰 性対照とした。それぞれの細胞クローン力も抽出した試料を SDS-PAGEを行った後、 PVDF膜（Immobilon- P, Millipore社製）にブロッテイングし、抗 Core特異的抗体（ゥサ ギポリクローナル抗体）および抗 NS5A抗体としてマウスモノクローナル (Austral社）と これらの抗体を認識する HRP標識 2次抗体を用いて、 ECL (アマシャムフアルマシア社 )にて細胞内で翻訳された Coreタンパク質および NS5Aタンパク質を検出した。
[0094] その結果、図 4に示すように、 pHH JFH1を導入した細胞では、 Coreおよび NS5Aタ ンパク質の発現が確認された。し力し、 pHH H77cおよび pHH JFH1/GNDを導入した 細胞では、これらのタンパク質の発現は検出できな力つた。この結果は、 pHH JFH1 が導入された細胞では、 pHH JFH1から RNAが転写された後、この RNAが細胞内で 複製された後、タンパク質の翻訳が起こり、タンパク質の検出可能なレベルに達する のに対し、 pHH JFH1/GNDを導入された細胞では、 pHH JFH1/GNDから RNAが転 写された後、この RNAは NS5Bに変異があるため、細胞内で複製されず、タンパク質が 検出できるレベルに達しないことを示していると考えられた。一方、 HCVゲノム RNAは 培養細胞で自律複製するにも係わらず (Yi,M. & Lemon ST., J. Virol, 78 (2004) p79 04-7915)、 pHH H77cにおいて HCVタンパク質の発現が検出できなかった原因は不 明である。
[0095] 次に、どのような細胞株で、 HCVタンパク質が発現するかにっ 、て検討した。 pHH J FH1および pHH JFH1/GNDを GFP発現ベクター（pGreenLantern: Life Technologies Inc.)と共に、 Huh7、 RCYM1RC、 5- 15RC、 HepG2および 293T細胞に Fugen 6 (ロシュ 社)を用いて添付マニュアルに従って導入した。導入 4日後、蛍光顕微鏡にて、 GFP の発現を観察し、各ベクターが導入されていることを確認後、各細胞から細胞抽出液 を調製した。次いで、これらの抽出液中の Coreタンパク質を SDS-PAGEおよびウェス タンプロット法により解析した。 Coreタンパク質の検出は、抗 Core特異的ゥサギポリク 口抗体とこの抗体を認識する HRP標識 2次抗体を用いて、 ECL (アマシャムフアルマシ ァ社)にて行った。その結果、図 5に示す様に、 Huh7、 RCYM1RC、 5- 15RC、 HepG2 細胞で Coreタンパク質を検出することができた。
[0096] [実施例 4]
HCV粒子の産牛.
次に、 pHH JFH1導入細胞力も HCV粒子が産生されるかどうかを確認するため、培 養上清中の Coreタンパク質の解析を行った。 pHH JFH1および対照として、 Core、 El 、 E2および p7を発現するベクター pCAG327JFHlを HepG2細胞に Fugene 6を用いて 導入して 2日後に培養上清を除き、新鮮な培地を加えさらに 2日間培養した。次いで 、細胞と培養液を回収し、細胞力 タンパク質を抽出し、実施例 3に示す方法で、細 胞中のコアタンパク質の発現を解析した。その結果、コアタンパク質が発現しているこ とを確認した（図 6A)。培養液中の HCV粒子の存在を確認するため、培養液をショ糖 密度勾配により分画した。 10〜60% (重量/重量）の密度勾配ショ糖溶液（50mM Tris p H7.5/0.1M NaCl/lmM EDTAに溶解）に、さらにサンプルの培養上清を 0.2ml重層し た。これをベックマンローター S W41Eで 35,000RPM、 4°C、 16時間遠心し、遠心終了 後遠心チューブの底から 0.5mlずつ分画回収した。各分画の密度、 HCV Core蛋白 濃度を定量した。 HCV Coreタンパク質の測定はォーソ HCV抗原 IRMAテストを用い て行った（Aoyagi et al, J. Clin. Microbiol, 37 (1999) p.1802- 1808)。
[0097] 図 6Bに示すように、 1.15〜1.18mg/mlのフラクションで Coreタンパク質のピークが見 られた。それに対し、 Core, El、 E2および p7を発現する細胞では、 Coreタンパク質の ピークは観察されな力つた。
[0098] 1.15〜1.18mg/mlのフラクションに存在する Coreタンパク質と HCV RNAが HCV粒子 構造を形成しているとすれば、界面活性剤 NP40での処理に感受性のはずである。そ こで次に、 pHH JFH1を HepG2に導入して、 2日力も 4日間の培養液を 0.2%の NP40で 20分間処理した後にショ糖密度勾配により分画した。図 7に示すように、 NP40処理を 行うことで、 Coreタンパク質のピークは、 1.20 mg/mlのフラクションに認められた。すな わち、脂質を含み比重の軽い表面膜力 SNP40によりウィルス粒子力 剥離して、ウィル ス様構造を保持していない核酸と Coreタンパク質のみの Core粒子となり、比重が重く なったものと考えられた。
[0099] 以上の結果から、 pHH JFH1を HepG2細胞へ導入することにより HCVゲノム cDNAか らウィルス RNAが転写された後、ウィルスタンパク質の合成とウィルス RNAの複製が起 こり、ウィルス粒子が形成され、培養液中に分泌されたことが確認された。
[0100] [実施例 5]
HCV粒早の感 件確認
実施例 4で得られた HCV粒子が感染性を有しているかについて検討した。 pHH JF HIを Huh7細胞および HepG2細胞に Fugene 6を用いて導入し、 3日力 5日間培養し た培養上清を限外濾過膜 (cut off 1 X 105 Da)を用いて 30倍に濃縮した。次に、濃縮 した HCV粒子を含む培養液 100 μ 1で Huh7.5.1細胞を 15mmカバースリップ上で培養 して、 4日後に細胞を抗 NS5A抗体で蛍光染色した。抗 NS5A抗体染色陽性、すなわ ち、感染細胞を数えたところ、図 8に示すように、一部の感染細胞が確認された。これ らの結果から、 pHH JFH1を Huh7または HepG2細胞へ導入することにより、培養液中 に分泌された HCV粒子は、感染する能力を有することが確認された。
[0101] [実施例 6]
感染件 HCV粒子 牛.細胞株の取ネ晷
上記実施例で示されたシステムを利用して、感染性 HCV粒子を持続的に生産する 細胞株の榭立を試みた。
[0102] pHH JFH1を Nhe Iにて消ィ匕し、その部位に pSV40/Zeo2 (Invitrogen社）を Nhe Iと Xb a Iで消化して取り出した SV40プロモーターの下流に Zeodn抵抗性遺伝子が連結され 、さらにその下流に SV40ポリ A付加シグナルが連結された発現ユニット（SV40プロモ 一ター/ Zeo/polyA)を組み込んだベクターを作製した。そのベクターを pHH/ZeoJF HIと名付けた（図 9)。
[0103] pHH/ZeoJFHlを HepG2細胞に Fugene 6にて導入した。 Zeocin含有培地にて培養し た。その後、週に 2回培養液を交換しながら Zeocin含有培地にて培養を継続した。上 記の培養 21日後の培養ディッシュから生存細胞のコロニーをクローンィ匕し、培養を継 続した。このようなコロニーのクロー-ングにより、 100個の細胞クローンを取得した。 それらのクローンの培養上清中の Coreタンパク質量は、ォーソ HCV抗原 IRMAテスト を用いて行い（Aoyagi et al., J. Clin. Microbiol, 37 (1999) p.1802- 1808)、 Coreタン パク質の発現量の多いクローン HepG2/No59細胞を選出した。
[0104] 2 X 106個の HepG2/No59細胞を 10cmのディッシュを用いて、 8mlの培地にて培養し た。 48時間後、培養上清を回収した。
[0105] 培養上清中の Coreタンパク質を測定した結果、 HepG2/No59細胞は l,400ftnol/Lの Coreタンパク質を産生して 、ることが確認された。
[0106] また、培養上清中力も調製した RNAから、 HCVゲノム RNA量の測定を行った。 HCV RNAの定量的 RT- PCRによる検出は、 Takeuchiらの方法（Takeuchi T. et al., Gastroe nterology, 116 (1999) p.636-642)に従い HCV RNAの 5'非翻訳領域の RNAを検出す ることにより行った。具体的には、細胞カゝら抽出した RNAに含まれる HCV RNAを、以 下の合成プライマーと EZ rTth RNA PCR kit (Applied Biosystems)を用いて PCR増幅 し、 ABI Prism 7700 sequence detector system (Applied Biosystems)により検出した。
[0107] R6- 130- S17 : 5，- CGGGAGAGCCATAGTGG -3，（配列番号 7)
R6-290-R19： 5， - AGTACCACAAGGCCTTTCG- 3，（配列番号 8)
TaqMan Probe, R6- 148- S21FT: 5，- CTGCGGAACCGGTGAGTACAC- 3，（配列 番号 9)
その結果、 HepG2/No59細胞培養上清中の HCV RNAは 6.1 X 108コピー/ mlである ことが分力つた。この産生量はこれまでに報告された量より約 60倍高 、。
[0108] さらに、 HepG2/No59細胞培養上清を限外濾過膜（cut off 1 X 105 Da)を用いて 30 倍に濃縮し、濃縮した HCV粒子を含む培養液 100 /z 1で Huh7.5.1細胞を 15mmカバー スリップ上で培養して、 4日後に細胞を抗 NS5A抗体で免疫染色した。その結果、抗 N S5A抗体染色陽性、すなわち、感染細胞を検出することができた。以上から、 HepG2/ No59細胞培養液中に分泌された HCV粒子は感染する能力を有することが確認され た。
[0109] [実施例 7]
キメラ HCV発現ベクターによる HCV粒子の作製
実施例 1で作製されたキメラ HCV発現ベクター pHH H77c(C-p7)/JFHl, pHH J6(C - p7)/JFHl、 pHH J1(C- p7)/JFHlおよび pHH J1(C- NS2)/JFH1を、 Huh7細胞から派 生した株化細胞である Huh7.5.1細胞（Zhong, J. et al, Proc. Natl. Acad. Sci USA, 1 02, 9294-9299, (2005))に Fugene 6(ロシュ社)を用いて、添付マニュアルに従って導 入した。導入 3日後にそれらの培養上清を回収し、培養上清中に含まれる Coreタン パク質の量を測定した。 Coreタンパク質量の測定にはォーソ HCV抗原 IRMAテストを 用いた（Aoyagi et al" J. Clin. Microbiol, 37 (1999) p.1802- 1808)。陰性コントロール としてベクターを導入していない細胞の培養上清、陽性コントロールとして、 pHH JFH 1を導入した細胞の培養上清を用いた。それら実験結果の一例を表 1に示す。各キメ ラ HCV発現ベクターを導入された細胞上清に Coreタンパク質が確認できたことから、 ウィルス粒子が産生されたと判断された。また、 pHH J6(C- p7)/JFHlは、 pHH JFH1よ り 10倍以上高い HCV産生能を有することも判明した。
[表 1]
Figure imgf000032_0001
[0110] [実施例 8]
pHH J6(C- p7)/JFHlおよび pHH Jl(C-p7)/JFHlを実施例 7に示した方法で Huh7.5 .1細胞に導入し、導入後 3日後の培養上清を限外濾過膜 (cut off 1 X 105 Da)を用い て濃縮した。濃縮した HCV粒子を含む培養上清 100 /z 1をカ卩えて Huh7.5.1細胞を 15m mカバースリップ上で培養して、 4日後に細胞を抗 NS5A抗体で免疫染色した。その結 果、 pHH J6(C-p7)/JFHlを導入した細胞力も得られた培養上清で処理した細胞では 、抗 NS5A抗体で強く染色される細胞が見られた。一方、 pHH Jl(C_p7)/JFHlを導入 した細胞力も得られた培養上清で処理した細胞では、 pHH J6(C-p7)/JFHlと比較す ると抗 NS5A抗体で染色される強度は弱いが、コントロールの細胞と比較して明らかに 染色されていた。以上から、 pHH J6(C- p7)/JFHlおよび pHH J1(C- p7)/JFHlが導入 された細胞では感染性 HCVが産生されたことが判明した。
[0111] また、 pHH Jl(C_p7)/JFHlに実施例 6に示した方法で、 Zeodn抵抗性遺伝子発現 ユニットを挿入した pHH/Zeo J1(C- p7)/JFHlを作製した。次に、 pHH/Zeo Jl(C-p7)/ JFH1を Huh7.5.1に導入し、 Zeocin含有培地にて増殖する、ウィルス粒子を安定的に 発現可能な細胞を得た。この細胞の培養上清 8mlを限外濾過膜 (cut off 1 X 105 Da) を用いて濃縮した。この濃縮した培養上清中の HCV Coreタンパク質量は 2365 ftnol/ Lであった。この濃縮培養上清 100 1を用いて Huh7.5.1を感染させ、 4日後に細胞を 抗 NS5A抗体で免疫染色した。その結果、 pHH/Zeo Jl(C_p7)/JFHlを導入された安 定的発現性細胞力 得られた培養上清で処理した細胞では、抗 NS5A抗体で強く染 色される細胞が見られた。このことから、本細胞から感染性 HCVが産生されたことが 判明した。
[0112] 上記のようなキメラ HCV発現ベクター力 それを感染させた細胞内で感染性 HCVを 産生できることが示された。
配列表フリーテキスト
[0113] 配列番号 1の配列は合成 RNAを示す。
[0114] 配列番号 2〜配列番号 9の配列は合成 DNAを示す。
[0115] 配列番号 10〜26の配列はプライマーを示す。
[0116] 配列番号 29〜32の配列はキメラ DNAを示す。
[0117] 配列番号 33〜45の配列は合成 DNAを示す。

Claims

請求の範囲
[1] 以下の 0または ii)の発現ベクターを、 Huh7、 RCYM1RC、 5-15RC、 HepG2およびそ れらの細胞から派生した株化細胞からなる群から選択される細胞に導入する工程を 含む、感染性 C型肝炎ウィルス (HCV)粒子を産生する方法：
0 RNAポリメラーゼ Iプロモーターの下流に、 HCV株由来の 5'非翻訳領域、 Coreタン パク質、 E1タンパク質、 E2タンパク質、 p7タンパク質、 NS2タンパク質をコードする DNA 配列と、 HCV JFH1株由来の NS3、 NS4A、 NS4B、 NS5Aおよび NS5Bタンパク質ならび に 3'非翻訳領域をコードする DNA配列とを含み、さらにその下流に RNAポリメラーゼ I ターミネータ一を含む DNAを含む発現ベクター、または
ii) RNAポリメラーゼ Iプロモーターの下流に、 HCV株由来の 5'非翻訳領域、 Coreタン パク質、 E1タンパク質、 E2タンパク質、 p7タンパク質をコードする DNA配列と、 HCV JF HI株由来の NS2、 NS3、 NS4A、 NS4B、 NS5Aおよび NS5Bタンパク質ならびに 3'非翻 訳領域をコードする DNA配列とを含み、さらにその下流に RNAポリメラーゼ Iターミネ 一ターを含む DNAを含む発現ベクター。
[2] 前記 HCV株が遺伝子型ほたは遺伝子型 2の HCV株である、請求項 1記載の方法。
[3] 前記遺伝子型 1の HCV株が H77c株、 1株、 H株、 HC- J1株、 J1株、 conl株、 TH株、 J 株、 JT株、 BK株よりなる群力 選択されるものである請求項 2記載の方法。
[4] 前記遺伝子型 2の HCV株力 SJ6CF株、 JFH1株、 JCH1株、 HC-J8株よりなる群力も選 択されるものである請求項 2記載の方法。
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