CN101278042B - 新型重组人丙型肝炎病毒样颗粒及其生产方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及重组丙型肝炎病毒样颗粒的生产方法，以及由该方法生成的重组丙型肝炎病毒颗粒。所述方法是向(i)细胞中导入(ii)载体，培养该细胞，回收生成的病毒样颗粒，其中，(i)的细胞是自主复制RNA复制子的细胞，所述RNA复制子含有下述的碱基序列，该碱基序列含有来自丙型肝炎病毒株的基因组RNA上的5’非翻译区，编码NS3蛋白、NS4A蛋白、NS4B蛋白、NS5A蛋白和NS5B蛋白的碱基序列，3’非翻译区；(ii)的载体表达来源于与上述(i)相同或不同的丙型肝炎病毒株的核心蛋白、E1蛋白、E2蛋白和p7蛋白。

Description

新型重组人丙型肝炎病毒样颗粒及其生产方法

技术领域

本发明涉及人重组丙型肝炎病毒样颗粒及其生产方法。

背景技术

向动物细胞中导入基因的方法大致分为物理化学方法和生物学方法。物理化学方法有磷酸钙共沉淀法、DEAE葡聚糖法、脂转染法、显微注射法、电穿孔法等。而生物学方法有使用病毒载体的方法。

病毒载体法是利用病毒所具有的进入细胞的结构，即，利用感染能力导入基因的方法。

使用病毒载体制备的重组病毒颗粒的表面存在来自病毒的结构蛋白(核衣壳或包膜蛋白等)，经由存在于细胞表面的受体感染细胞，具有有效地导入基因的机制。因此，使用上述病毒载体制备的重组病毒颗粒不仅可以向动物细胞内导入基因、制备目标基因表达细胞，还可以在基因治疗、转基因动物的制作等方面应用。

病毒载体分类为反转录病毒载体、DNA病毒载体、RNA病毒载体三种，在由于来源病毒的种类不同可导入的基因的长度、基因是否可掺入细胞的染色体基因组、不仅对分裂细胞对未分裂细胞是否可导入基因、可感染的细胞的种类、对细胞的毒性、基因导入效率等方面各有特征。

反转录病毒具有正链的RNA基因组。该RNA具有典型的真核细胞的mRNA的性质，即，甲基化的5’末端帽结构和3’末端具有含约200个碱基的polyA。在感染的细胞内，该RNA通过病毒所具有的反转录酶的作用变换为DNA。并且病毒通过所编码的酶的作用掺入到宿主的基因组DNA中。掺入的DNA称为原病毒，在原病毒的两端产生重复序列(LTR)，通过其中的启动子合成病毒的RNA。由合成的RNA翻译成病毒蛋白，同时该基因组大小的RNA掺入到病毒颗粒中，形成子颗粒，释放到细胞外。

生产病毒颗粒所必须的RNA结构是两端的LTR，以及中间的引物结合位点、包装信号和多聚嘌呤信号。它们是必须的顺式因子。而编码病毒蛋白的基因并非必须是顺式因子，在感染细胞中，只要提供病毒蛋白即可正常复制并产生颗粒。

因此，生产重组反转录病毒时，可以制备除去了反转录病毒所编码的gag、pol、env等基因，取而代之地插入要表达的目标基因的载体(称为反转录病毒载体)，将该载体导入供给病毒蛋白的细胞(通常称为包装细胞)，则可以制备掺入了外源基因的反转录病毒颗粒(非专利文献1)。

反转录病毒例如有小鼠白血病病毒、猫白血病病毒、狒狒丙型致瘤病毒、人类免疫缺陷病毒、成人T细胞白血病病毒等。并且，已报到的重组人反转录病毒载体有：以小鼠白血病病毒为基础的载体(非专利文献1)、以人类免疫缺陷病毒为基础的载体(非专利文献2)等。

重组反转录病毒的生产系统包含两种构成单元，即，包含反转录病毒载体(重组反转录病毒DNA)和反转录病毒包装细胞，反转录病毒载体中，要导入的基因信息(目标外源基因)和病毒基因组的包装、掺入所必须的所有要素均保持顺式；反转录病毒包装细胞提供由gag、pol和env基因编码的病毒蛋白。如果只是导入了表达gag、pol和env基因的重组载体的包装细胞，是无法释放重组反转录病毒颗粒的。

为了生产重组反转录病毒颗粒，必须将gag、pol和env蛋白置于反式。因此，通过向导入了表达gag、pol和env基因的重组载体的包装细胞中导入反转录病毒载体，则可以制备保有上述载体中所含的基因信息的重组反转录病毒。接着，使用这些病毒感染细胞，其中反转录病毒载体根据天然的反转录病毒生活周期掺入细胞的染色体基因组中。

如上所述，反转录病毒载体法是以将特定的DNA有效地掺入到宿主的染色体基因组中为目的而制备的系统，目标基因的插入位置不能预测，因此不可否认会有因插入使正常基因受损、插入的附近的基因活化、目标外源基因过量表达或者表达受到抑制的可能性。为克服该问题，人们开发了瞬时表达系统，该表达系统是利用可用作染色体外基因的DNA病毒载体。

DNA病毒载体是来自DNA病毒的载体。DNA病毒在病毒颗粒内保有作为基因信息的DNA，该DNA的复制是以自身DNA为模板，使来自宿主的依赖DNA的DNA复制酶作为催化剂的至少一部分生成互补链，并将该过程反复进行。可用作染色体外基因的DNA病毒载体例如有腺病毒载体。

人腺病毒具有约36kb的线状双链DNA作为基因组，其中所含的区域大致分为早期基因E1、E2、E3、E4和晚期基因L1、L2、L3、L4、L5。早期基因主要与病毒的复制有关，晚期基因与病毒壳体等病毒的结构蛋白合成有关。用作基因导入的腺病毒载体是将早期基因E 1区(分为E1A和E1B，E1A使所有的腺病毒启动子活化)置换为所需的外源基因(目标基因)，在可反式供给E1A的细胞株293细胞(293细胞表达E1A)等中增殖。缺损E1A区的腺病毒载体无法在不表达E1A的通常的细胞中增殖。E3区域对于病毒的增殖来讲不是必须的，因此大多为了插入更大的外源基因而除去。腺病毒可以将最大为野生型基因组大小的105％的基因组包装在病毒壳体内，因此，通过使E1和E3区缺损，可以插入最大约8.1kb的外源基因(非专利文献3)。

腺病毒载体中，可以向非增殖细胞和增殖细胞两者中导入基因(非专利文献4)。由此，该方法适合体内基因导入法。该载体的缺点之一是基因的表达期间通常很短(以周为单位)。这是由于腺病毒的基因组限定于染色体外的区域存在，不能进行复制、扩增。第二个缺点是目前通常使用的腺病毒引发非特异性炎症反应，对载体本身的细胞性免疫应答也增强，因此，基因治疗中难以连续施用(非专利文献5)。

还开发了以RNA病毒为基础的病毒载体。RNA病毒的复制是以自身RNA为模板，通过来自自身的、依赖RNA的RNA复制酶催化生成互补链，并将上述过程反应进行。

RNA病毒大致分为(-)链RNA病毒和(+)链RNA病毒。代表性的(-)链RNA病毒有禽流感病毒。禽流感病毒基因组是含有8个节段的负链RNA的病毒。感染禽流感病毒，则通过禽流感颗粒中的蛋白质起始基因的转录。首先，病毒RNA聚合酶在由5’末端帽结构至十几个核苷酸的部分将宿主细胞mRNA切断，用作引物，将RNA链(正链)延伸。由该正链RNA翻译病毒蛋白。在复制过程中，合成与病毒的RNA完全互补的RNA，以其为模板进行子代及后代的病毒RNA的扩增。然后，病毒RNA与病毒蛋白一起包装，形成病毒颗粒。

因此，在细胞培养系统中生产禽流感病毒时，通过RNA聚合酶II系启动子、例如CMV或CAG启动子表达禽流感病毒所编码的蛋白质，同时通过不具有帽结构和polyA的启动子——RNA聚合酶I型启动子，例如rRNA基因的启动子表达病毒RNA，则细胞中，病毒RNA与病毒蛋白一起被包装，形成病毒颗粒(非专利文献6)。但是并未给出所生产的病毒量，在生产方面尚未建立可以充分利用的技术。

被分类为(+)链RNA病毒的病毒有新培斯病毒或丙型肝炎病毒。(+)链RNA病毒所具有的基因组RNA同时可发挥信使RNA(以下称为“mRNA”)的功能，可以与宿主细胞的翻译功能相关性地生产复制或形成颗粒所必须的蛋白质。换言之，(+)链RNA病毒的基因组RNA本身具有传播力。

来自新培斯病毒的病毒载体是在基因组RNA中，以使与病毒结构体相关的结构基因区缺失、残留病毒的转录复制蛋白基因群，和在转录启动子下游连接所需外源性基因的RNA作为基本结构。将上述RNA或可使该RNA转录的cDNA导入细胞内，则发生含有外源基因的RNA载体的自主复制、和转录启动子下游的外源性基因的转录，目标外源性基因产物在细胞内表达。并且，通过使表达结构基因的cDNA单元(辅助)和表达上述RNA载体的cDNA单元在包装细胞内共存，可以制备具有感染能力但不具有传播力的复合物(非专利文献7)。

新培斯病毒使用67kDa的高亲和性层粘连蛋白受体作为受体，高效感染神经细胞，因此，新培斯病毒载体作为神经特异性地导入基因的系统受到人们的关注(非专利文献8)。但是，新培斯病毒的感染显示诱导宿主细胞中的程序性细胞死亡(非专利文献9)，其毒性尚未明确。

丙型肝炎病毒(HCV)的基因组是含有约9600个核苷酸的(+)链的单链RNA。该基因组RNA含有5’非翻译区(可标为5’NTR或5’UTR)、由结构区和非结构区构成的翻译区、以及3’非翻译区(标记为3’NTR或3’UTR)。该结构区编码HCV的结构蛋白，非结构区编码多种非结构蛋白。

上述HCV的结构蛋白(核心、E1、E2和p7)和非结构蛋白(NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B)是由翻译区以连续的多蛋白的形式被翻译，然后通过蛋白酶进行限定分解、游离而生成。这些结构蛋白和非结构蛋白(即HCV的病毒蛋白)中，核心(Core)是核心蛋白，E1和E2是包膜蛋白。已知非结构蛋白是与病毒本身的复制相关的蛋白质，NS2具有变性蛋白酶活性，NS3已知具有丝氨酸蛋白酶活性(N末端一侧的3分之1)和解旋酶(C末端一侧的3分之2)。并且，NS4A是NS3的蛋白酶活性的辅因子，NS5B具有依赖RNA的RNA聚合酶活性。

已知HCV根据其基因型或血清型分为多种型。目前，主流HCV基因型分类方法——Simmonds等人的采用HCV株的碱基序列的系统分析法中，HCV分类为基因型1a、基因型1b、基因型2a、基因型2b、基因型3a、基因型3b共6种型，并且各类均还分为几个亚型。对于HCV的多种基因型，其基因组全长碱基序列已经确定(非专利文献10-13)。

HCV颗粒被细胞表面的硫酸多糖类捕获，经由包膜蛋白，与亲和性高的受体结合，通过胞吞作用摄取到内体中。然后，病毒膜与内体膜融合，核衣壳侵入到细胞质中。暴露的病毒基因组通过IRES起始翻译。在内质网膜上发生翻译和蛋白质的降解。核心蛋白、E1和E2蛋白、内质网中复制的病毒RNA集合，形成病毒颗粒。然后出芽到内质网腔。出芽后的颗粒通过高尔基体释放到细胞外。

最近，作为来自HCV的具有自主复制能力的RNA，人们制备了HCV次基因组RNA复制子(专利文献1、2和非专利文献14-16)，由此可以使用培养细胞进行HCV的复制机理分析。这些HCV次基因组RNA复制子是存在于HCV基因组RNA的5’非翻译区中的HCV IRES下游的结构蛋白被新霉素抗性基因及与其下游相连接的EMCV-IRES置换所得。已证明该RNA复制子通过导入人肝癌细胞Huh7并在新霉素存在下培养，可在Huh7细胞内自主复制。并且还证明了一部分HCV次基因组RNA复制子并不限于Huh7，在人子宫颈癌细胞HeLa、人肝癌细胞HepG2等细胞内也可自主复制(专利文献3)。并且专利文献2中，对于重组HCV作为基因治疗用的载体的应用，提出利用HCV全长基因组进行HCV病毒颗粒的生产。

专利文献1：特開2002-171978号公報

专利文献2：特開2001-17187号公報

专利文献3：国際公開WO2004/104198

非专利文献1：Mann，R.et al.，Cell，33(1983)p153-59

非专利文献2：Simada，T et al.，J Clin lnvest.88(1991)p1043-47

非专利文献3：Betta，A et al.，Proc.Nati.Acad.Sci.USA 91(1994)p8802-06

非专利文献4：Burden，S & Yarden，Y.，Neuron，18(1997)p847-55

非专利文献5：Crystal，R.G Science，270，(1995)p404-10

非专利文献6：Neumann，G.& Kawaoka，Y.，Virology 287(2001)p243-50

非专利文献7：Berglund，P et al.，Biotechnology，11(1993)p916-920

非专利文献8：Wang，K.S et al.，J.Virol.66(1992)p4992-5001

非专利文献9：Levine，B.et al.、Nature，361(1993)p739-42

非专利文献10：Simmonds，P.et al.，Hepatology，10(1994)p1321-24

非专利文献11：Choo，Q.L et al.，Science，244(1989)p359-362

非专利文献12：Okamoto，H et al.，J.Gen.Virol.，73(1992)p673-79

非专利文献13：Mori，S.et al.，Biochem.Biophis.Res.Commun.183(1992)p334-42

非专利文献14：Blight et al.，Science，290(2000)p1972-74

非专利文献15：Friebe et al.，J.Virol.，75(2001)p12047-57

非专利文献16：Kato，T.et al.，Gastroenterology，125(2003)p1808-17

发明内容

HCV作为病毒载体，并未象反转录病毒、腺病毒、禽流感病毒、新培斯病毒那样已进行了实际开发。如果上述HCV载体被开发，则有可能向肝脏等组织细胞中特异性导入基因。这种情况下，为了确保高度的安全性，优选HCV载体可以感染细胞但没有传播性。

本发明的目的在于开发可用作上述载体的重组丙型肝炎病毒(HCV)样颗粒。还提供高效生产该HCV样颗粒的方法。

本发明人从安全性、便利性、实用性角度考虑，尝试了在培养细胞中生产可具有产业实用性的重组HCV样颗粒。首先，将HCV的基因组分割成表达HCV结构蛋白的载体、和含有与复制相关的基因的载体。后者载体中可以包含所需外源基因和/或内部核糖体进入位点(IRES)。

本发明人将含有所需外源基因、IRES序列、HCV复制相关的基因的DNA克隆在T7启动子下游，构建载体，使用T7聚合酶，体外合成含有外源基因序列的HCV次基因组RNA复制子。将该RNA复制子导入培养动物细胞中，得到该HCV次基因组RNA复制子得以复制的细胞株。

接着，发现了可将高表达HCV结构蛋白的载体高效导入到该细胞株中的体系，并导入到可保有各种基因型HCV次基因组RNA复制子的细胞中。结果通过在细胞内表达HCV结构蛋白，成功地发现了可以将该HCV次基因组RNA复制子包装到病毒颗粒中的组合。

本发明人还确认：通过本发明的方法生产的重组HCV样颗粒可以进行感染、而感染了该重组HCV的细胞不生产病毒颗粒，没有传播性。由于上述特性，本发明的重组HCV颗粒可用作进行外源基因导入、或基因治疗的载体。

即，本发明主要具有以下特征。

本发明的第1方案中，提供生产重组丙型肝炎病毒颗粒的方法，该方法包含向(i)的细胞中导入(ii)的载体，培养该细胞，回收生成的重组丙型肝炎病毒颗粒；其中所述

(i)的细胞中保有RNA复制子，该复制子含有如下的碱基序列，所述碱基序列包含来自丙型肝炎病毒株的基因组RNA上的5’非翻译区，编码NS3蛋白质、NS4A蛋白、NS4B蛋白、NS5A蛋白和NS5B蛋白的碱基序列，以及3’非翻译区；

(ii)的载体表达来源于与上述(i)中的相同或不同的丙型肝炎病毒株的核心蛋白、E1蛋白、E2蛋白和p7蛋白。

其一个实施方案中，上述(i)和(ii)的丙型肝炎病毒株是独立地选自基因型1a、1b、2a、2b、3a和3b病毒株的至少一种病毒株。

在另一实施方案中，上述(i)和(ii)的丙型肝炎病毒株是独立地选自基因型1b和2a的病毒株的至少一种病毒株。

在又一实施方案中，上述(i)的丙型肝炎病毒株是基因型1b的病毒株。

根据优选的实施方案，上述基因型1b的病毒株是con1株或其衍生株。

在又一实施方案中，上述(ii)的丙型肝炎病毒株是基因型2a的病毒株。

根据优选实施方案，上述基因型2a的病毒株是JFHI株或其衍生株。

在又一实施方案中，上述RNA复制子可进一步含有至少一个内部核糖体进入位点序列(IRES)。

在另一实施方案中，上述RNA复制子可进一步含有至少一种外源基因。

根据优选实施方案，上述IRES和上述外源基因可位于上述5’非翻译区和上述NS3之间。

根据又一实施方案中，上述细胞为动物细胞。

根据优选实施方案，上述动物细胞为哺乳动物细胞。

上述哺乳动物细胞可列举Huh7、HepG2和由这些细胞衍生的株化细胞。

在另一实施方案中，上述表达载体是病毒载体。

根据优选实施方案，上述病毒载体是痘苗病毒载体。

将由本发明的上述方法生产并回收的重组丙型肝炎病毒颗粒进一步感染肝细胞或淋巴细胞系细胞等HCV敏感性细胞，可以使病毒颗粒增殖。本发明包含这些步骤。

本发明在第2方案中，提供通过上述本发明的方法生产的、且具有感染性但不具有传播力的重组丙型肝炎病毒颗粒。

在其一个实施方案中，外源基因可表达地导入上述重组丙型肝炎病毒颗粒中。

在另一实施方案中，上述重组丙型肝炎病毒颗粒是载体。

本发明中，用于生产重组丙型肝炎病毒颗粒的优选方法之一是下述的生产重组丙型肝炎病毒颗粒的方法，该方法包含向(i)的细胞中导入(ii)的痘苗病毒载体，培养该细胞，回收生成的重组丙型肝炎病毒颗粒；其中所述

(i)的细胞是自主复制下述RNA复制子的细胞，该复制子是含有如下的碱基序列的RNA复制子，或是进一步含有至少一种外源基因和/或至少一种IRES序列的RNA复制子，所述的碱基序列至少包含来自丙型肝炎con1株的基因组RNA上的5’非翻译区，编码NS3蛋白质、NS4A蛋白、NS4B蛋白、NS5A蛋白和NS5B蛋白的碱基序列，3’非翻译区；；

(ii)的痘苗病毒载体表达丙型肝炎病毒的核心蛋白、E1蛋白、E2蛋白和p7蛋白，该丙型肝炎病毒来自JFH1株。

本发明中，优选的重组丙型肝炎病毒颗粒通过上述优选方法生产。

本发明进一步包含以下的[1]-[2]。

生产重组丙型肝炎病毒样颗粒的方法，该方法包含向(i)细胞中导入(ii)病毒载体，培养该细胞，并回收生成的病毒样颗粒，其中所述

(i)的细胞保有RNA复制子，该RNA复制子含有如下的碱基序列，所述的碱基序列包含来源于选自基因型1a、1b、2a、2b、3a和3b的丙型肝炎病毒株的至少一种病毒株的基因组RNA上的5’非翻译区，编码NS3蛋白、NS4A蛋白、NS4B蛋白、NS5A蛋白和NS5B蛋白的碱基序列，3’非翻译区；

(ii)的载体表达下述丙型肝炎病毒株的核心蛋白、E1蛋白、E2蛋白和p7蛋白，所述的丙型肝炎病毒株是选自基因型1a、1b、2a、2b、3a和3b的丙型肝炎病毒株的至少一种的、与上述(i)的中的相同或不同的丙型肝炎病毒株。

该方法中，优选上述(i)的基因型1b的丙型肝炎病毒株是con1株，优选上述(i)的基因型2a的丙型肝炎病毒株是JFH1株。

该方法中，优选上述(ii)的基因型1a的丙型肝炎病毒株是H77c株、1株、H株和HC-J1株。

该方法中，优选上述(ii)的基因型1b的丙型肝炎病毒株是J1株、con1株、TH株、J株、JT株和BK株。

该方法中，优选上述(ii)的基因型2a的丙型肝炎病毒株是JFH1株、HC-J6株、JCH1株和J6CF株。

该方法中，优选上述(ii)的基因型3a的丙型肝炎病毒株是NZL1株、K3a/650株、452株和E-b1株。

该方法中，优选上述(ii)的基因型3b的丙型肝炎病毒株是Tr株。

该方法中，优选上述(ii)的载体是痘苗病毒载体或含有EF-1α启动子的载体。

该方法中，优选上述RNA复制子进一步含有至少一种内部核糖体进入位点(IRES)序列和/或至少一种外源基因。

该IRES序列和/或外源基因优选位于上述5’非翻译区和上述NS3蛋白编码序列之间。

本方法中，上述细胞优选为动物细胞。动物细胞更优选为Huh7细胞、HepG2细胞或由这些细胞衍生的株化细胞。

重组丙型肝炎病毒样颗粒，其由上述[1]的方法生产，具有感染性但不具有传播力。

发明效果

本发明可提供将含有所需外源基因的HCV次基因组RNA进行包装得到的、不具有传播性的重组感染性HCV样颗粒及其制备方法。上述重组感染性HCV样颗粒具有缺乏传播性的优点，因此特别可以用于向肝脏或淋巴细胞系的细胞中或组织中导入基因(例如基因治疗)，或者用作制备转基因动物的病毒载体，还可用作弱毒化疫苗。

附图简述

图1是本发明的实施方案的概略图，表示重组HCV样颗粒的制备步骤。a)：导入了HCV次基因组RNA复制子的Huh7细胞中，HCV次基因组RNA复制子得到复制。未生成病毒颗粒。b)：进一步导入了HCV结构蛋白表达载体的a)的细胞中，运用得到表达的HCV结构蛋白包装HCV次基因组RNA复制子，生成病毒样颗粒。c)：在由b)生产的病毒样颗粒感染的细胞中，发生HCV次基因组RNA复制子的复制，但未生成病毒子颗粒。

图2是表示HCV基因组RNA和HCV次基因组RNA的cDNA的结构图。上段是由HCV基因型2a制备的pFH1，中段是pSGR-JFH1。下段是由HCV基因型1b制备的I389/NS3-3’wt。图中的符号如下。T7：T7RNA启动子。5’UTR：5’非翻译区。核心：核心蛋白。E1、E2：包膜蛋白。p7：p7蛋白。NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A、NS5B：非结构蛋白。3’UTR：3’非翻译区。Age I、Pme I、Xba I：限制酶Age I、Pme I和Xba I的酶切位点。EMCV IRES：脑心肌炎病毒的内部核糖体进入位点。

图3表示用于表达本发明的HCV结构蛋白的载体的图谱。具体来说，上段表示在CAG启动子下游插入JFH结构区基因而制备的质粒克隆pGAGC-p7JFH1，下段表示在延伸因子1α启动子序列的下游插入JFH结构区基因而制备的质粒克隆pEF4C-p7JFH1的结构。图中符号如下所示。CAG：CAG启动子，pA：polyA附加序列，EcoRI：限制酶EcoRI的酶切位点，EF-1α：延伸因子1α启动子，BGH pA：牛生长因子polyA附加序列。

图4表示在载体pDIsHJFHst、pDIsH77st、pDIsJ1st、pDIsJ1(c)/JFH(E1-p7)st和pDIsJFH(c)/J1(E1-p7)st中插入的HCV结构基因的图谱。方框内的网状表示来源病毒株的不同。

图5是表示向保有复制子的细胞株中IH4.1中导入pEF4C-p7JFH1，将该细胞的培养上清(sup)通过蔗糖密度梯度进行分组得到的各组分中HCV复制子RNA的量(A)和HCV核心蛋白的量的图表(B)。□：实验1，◆：实验2

图6是表示使痘苗病毒载体DIsJFHst感染保有复制子的细胞株5-15，将该细胞培养上清(sup)通过蔗糖密度梯度进行分组得到的各组分(横轴)中HCV核心蛋白的量(纵轴)的图。涂黑的圆表示HCV核心蛋白，涂黑的方框表示使用NP40处理的培养上清得到的结果。实验1只是未处理的结果(图6A)，实验2是未处理和NP40处理结果(图6B)。

实施发明的最佳方式

1.定义

本说明书中使用的术语具有以下含义。

“RNA复制子”是指改变HCV病毒基因组而制备的具有自主复制能力的RNA。

“自主复制能力”是指如质粒DNA，在细胞内可以自主地再生核酸的拷贝(即复制)的能力。

“感染能力”或“感染性”是指通过保持与细胞的粘合能力和膜融合能力等，可将病毒内部的核酸等导入细胞内的能力。

“重组丙型肝炎病毒”是指通过基因重组技术，使原本HCV病毒所具有的性质进行质/量的变化而得到的病毒，例如有：具有表达原本的病毒所表达的以外的外源基因的能力的病毒、使原本的病毒所具有的传播性或病毒基因组的复制能力缺损的病毒等，广义来说，也包含基因在相同的病毒型之间或亚型之间重组所得的病毒。

“传播性”或“传播能力”是指通过感染或人工方法使核酸导入细胞内，存在于细胞内的该核酸经复制后形成感染性颗粒或与其类似的复合物，可以传播其它细胞等能力。

“核心”是HVC的核心结构蛋白。

“E1”和“E2”均为包膜结构蛋白。

“NS”是指HCV的非结构蛋白，是与病毒本身复制相关的蛋白质。“NS2”具有变性蛋白酶活性。“NS3”具有丝氨酸蛋白酶活性(N末端一侧的3分之1)和解旋酶活性(C末端一侧的3分之2)。“NS4A”是NS3蛋白酶活性的辅因子。“NS4B”的功能尚未明确。“NS5A”具有控制宿主细胞信息传递的活性。“NS5B”具有依赖RNA的RNA聚合酶活性。

“IRES序列”是指在RNA的内部结合核糖体，可起始翻译的内部核糖体进入位点。

“可表达”是指通过启动子、增强子等调控序列可进行目标基因的转录、翻译的状态。

2.保有HCV次基因组RNA复制子的细胞

野生型HCV基因组由编码约3000个氨基酸的前体蛋白质的约9.6kb长度的单链RNA构成。HCV基因组按照5’非翻译区(5’UTR)、核心、E1、E2、p7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A、NS5B、3’非翻译区(3’UTR)的顺序构成。本发明的方法中使用的HCV次基因组RNA复制子包括按照5’非翻译区、NS3、NS4A、NS4B、NS5A、NS5B、3’非翻译区的顺序构成的变异RNA。该RNA复制子在启动子等调控因子的作用下可复制地导入到特定的细胞中。

RNA复制子还可包含外源基因和/或IRES序列。外源基因和IRES序列可优选以外源基因、IRES序列的顺序位于5’非翻译区和NS3编码序列之间。

IRES序列的优选例子包括但不限于：EMCV IRES(脑心肌炎病毒的内部核糖体进入位点)、FMDV IRES、HCV IRES等，更优选EMCVIRES和HCV IRES，最优选EMCV IRES。

作为外源基因，可以使用显示抗药性的基因(即，该基因是可以进行细胞选择的基因，具有该基因的细胞对该药物具有抗性)、例如编码新霉素、潮霉素、嘌呤霉素、零霉素、杀稻瘟素、胸苷激酶、卡那霉素等的基因；报道基因(即，该基因是编码成为基因表达指标的基因产物的标志基因)，例如编码萤光素酶、绿色荧光蛋白(GFP)、β-半乳糖苷酶等催化发光反应或显色反应的酶的基因；还有基因治疗用的靶基因治疗用核酸，例如编码在包括人的哺乳动物中对要治疗的疾病的治疗起作用的各种蛋白质，例如酶、细胞因子、趋化因子、激素、抗体、免疫调节分子、肿瘤抑制蛋白、生长因子、膜蛋白和血管激动性蛋白质的基因、反义RNA、siRNA等治疗用核酸等。

HCV次基因组RNA复制子的具体例子有pSGR-JFH1(图2中段)、I₃₈₉/NS3-3’/wt(图2下段)等。上述HCV次基因组RNA复制子例如可以采用本发明人在发行刊物Kato，T.等人.Gastroenterology，2003125：1808-1817、国际公开WO 2004/104198(专利文献3)中所记述的方法制备。

使用HCV株的碱基序列进行的系统分析法中，HCV被分类为基因型1a、因型1b、基因型2a、因型2b、基因型3a、因型3b共6个型，并且各型还分类为几个亚型。HCV的多个基因型的基因组全长碱基序列均已确定(Simmonds，P.等人.，Hepatology，10(1994)1321-1324页、以及Choo，Q.L等人.，Science，244(1989)359-362页，Okamoto，H等人.，J.Gen.Virol.，73(1992)673-679页、Mori，S.等人.，Biochem.Biophis.Res.Commun.183(1992)334-342页、国际公开WO 2004/104198)。

具体来说，基因型1a的HCV株已知有H77c株(H77株的共同序列：GenBank检索号AF011751)、1株(GenBank检索号M62321)、H株(GenBank检索号M67364)、HC-J1株(GenBank检索号D10749)等。基因型1b的HCV株已知有J1株(GenBank检索号D89815)、con1株(GenBank检索号AJ238799，也称为Con-1株)、TH株(Wakita，T.等人.，J.Biol.Chem.，(1994)269，14205-14210页)、J株(GenBank检索号D90208)、JT株(GenBank检索号D01171)、BK株(GenBank检索号M58335)等。基因型2a的HCV株已知有JFH1株(GenBank检索号AB047639，也称为JFH-1株)、HC-J6株(GenBank检索号D00944)、JCH1株(GenBank检索号AB047640)、J6CF株(GenBank检索号AF177036)等。基因型2b的HCV株已知有HC-J8株(GenBank检索号D01221)，基因型3a的HCV株已知有NZL1株(GenBank检索号D17763)、K3a/650株(GenBank检索号D28917)、452株(GenBank检索号DQ437509)、E-b1株(Chan，S.等人.，J.Gen.Virol.，731131-1141页(1992))等，基因型3b的HCV株已知有Tr株(Chayama，K.等人.，J.Gen.Virol.，753623-3628页(1994))等。其它的病毒株在GenBank的检索号清单中也已报道(Tokita，T.等人.，J.Gen.Virol.79，1847-1857，1998、Cristina J.&Colina R.Virolgy Journal，3，1-8，2006)。

构成本发明中使用的HCV次基因组RNA复制子的元件(即5’非翻译区、NS3、NS4A、NS4B、NS5A、NS5B和3’非翻译区)只要是在细胞内可复制，可构成HCV次基因组RNA复制子即可，可以来自上述任意的基因型或它们的亚型病毒株。本发明是生产具有感染性但不具有传播性的重组丙型肝炎病毒样颗粒的方法，所生产的病毒样颗粒的传播性缺损，因此优选本发明的RNA复制子不含有分别编码HCV结构蛋白(核心、E1、E2和p7)的基因。

上述各元件可来自相同的HCV株，也可以是来自两种或以上不同的HCV株的混合(嵌合)的形态。优选的HCV株是选自基因型1b和2a的HCV株的至少一种病毒株，更优选基因型1b的HCV株con1株、或基因型为2a的HCV株JFHI株。本发明中的HCV株例如可以是在作为亲株的con1株或JFHI株中自然或人为地产生突变得到的分离株，至少基因型是由亲株变化而成的株(衍生株)。此时，表现型可与亲株相同也可以不同，优选为相同的株。

HCV次基因组RNA复制子的例子有：含有来自JFH1株(基因型2a)以外的HCV株基因组的5’非翻译区，编码NS3蛋白、NS4A蛋白、NS4B蛋白、NS5A蛋白的序列以及编码JFH1株的NS5B蛋白的序列，3’非翻译区的HCV次基因组RNA复制子；含有JFH1株的5’非翻译区，编码NS3蛋白、NS4A蛋白、NS4B蛋白、NS5A蛋白、NS5B蛋白的序列，以及3’非翻译区的HCV次基因组RNA复制子；含有HCV-con1株(基因型1b，GenBank检索号AJ238799，Lohmann，V.等人.，Science 285(1999)110-113页)的5’非翻译区，编码NS3蛋白、NS4A蛋白、NS4B蛋白、NS5A蛋白和NS5B蛋白的序列，以及3’非翻译区的HCV次基因组RNA复制子等。另外，这些HCV次基因组RNA复制子的5’非翻译区和NS3蛋白质编码序列之间可以含有所需外源基因和IRES序列。

HCV基因组RNA上的5’非翻译区、结构蛋白(核心、E1、E2和p7)、非结构蛋白(NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B)、3’非翻译区、以及其它部位可以以例如基因型2a的HCV JFH1株(日本特开2002-171978号公报)的基因组RNA所对应的全长基因组cDNA序列GenBank检索号AB047639，Kato，T.等人.，Gastroenterology，125(2003)1808-1817页；SEQ ID NO.10所编码的氨基酸序列也表示为SEQ IDNO.11)为基准规定。

一个例子是，在来自JFH1株的全长基因组cDNA中，在本发明中可作为HCV次基因组RNA复制子的构成要素使用的5’非翻译区是SEQ ID NO.10的碱基序列中碱基序号1-340，编码核心蛋白质至p7蛋白(核心、E1、E2、p7)的区是碱基序号341-2779，编码NS3蛋白至3’非翻译区(NS3、NS4A、NS4B、NS5A、NS5B、3’UTR)的区是碱基序号3431-9678。通过与该来自JFH1株各区域的序列进行比较，对来自其它的HCV株的基因组cDNA也可以确定各区域。

为了获得HCV次基因组RNA复制子，将该HCV次基因组RNA的互补DNA克隆到可以由DNA序列转录RNA的启动子的下游，使用由此获得的载体，通过依赖DNA的RNA聚合酶合成。作为由DNA序列转录RNA的启动子，有T7、T3、SP6等，优选T7启动子，可通过T7聚合酶可以合成HCV次基因组RNA。上述合成的HCV次基因组RNA导入到将允许HCV增殖的细胞中，由此可以制备自主复制该HCV次基因组RNA复制子的细胞。

细胞优选动物细胞，例如鱼类、爬行动物类、两栖类、鸟类和哺乳动物细胞的脊椎动物细胞，最优选哺乳动物细胞。进一步举例，如来自肝脏、子宫颈、胚胎肾的正常细胞、肿瘤细胞、它们的株化细胞等，例如有Huh7、HepG2、IMY-N9、HeLa、HEK293等细胞(Date，T.等人.，J.Biol.Chem.，279，p.22371-22376，(2004)、Ito，T.等人.，Hepatology 34，566-572页，(2001))，优选Huh7、HepG2或由这些细胞衍生的克隆。

在培养细胞中使该HCV次基因组RNA复制的另外的方法可列举不使用RNA复制子而利用HCV cDNA的体系。使HCV cDNA通过RNA聚合酶II型启动子表达，则在转录的RNA的5’末端附加帽结构，在3’末端附加polyA链，核糖体用作蛋白质合成的模板，因此不会发生HCV基因组RNA的复制。为解决该问题，Heller等人在HCV基因组的5’末端和3’末端连接核酶序列，在细胞内通过RNA聚合酶II进行转录，然后用核酶切断，由此制备DNA载体，该DNA载体可在细胞内合成不附加帽和polyA的HCV RNA(Heller T等人.Proc.Natl.Acad.Sci.USA.，102，2579-2583页，2005)。将该载体导入细胞内，则可以获得复制HCV次基因组RNA复制子的细胞。

另外一种方法是将该HCV次基因组RNA的互补的DNA克隆到RNA聚合酶I启动子/终止子系的载体中，将该载体导入到允许HCV增殖的细胞中，由此可以获得复制该HCV次基因组RNA复制子的细胞。更具体地说，可以使用pHH21(Neumann G.等人.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，96(1999)9345-9350页)。pHH21是其中的启动子为人RNA聚合酶I启动子、其中的终止子为小鼠RNA聚合酶I终止子的载体。使用PCR，在对应HCV次基因组复制子RNA的cDNA 5’端和3’端分别附加限制酶BsmBI识别序列，然后用BsmBI消化，将HCV基因组插入到pHH21的BsmBI位点，由此可以在启动子/终止子和HCV基因组之间不含有多余的碱基序列地连接。

以表达HCV次基因组RNA复制子或HCV次基因组RNA复制子的载体等为代表的载体对细胞内的导入可采用本领域技术人员所公知的任意技术进行。上述导入方法例如有电穿孔法、基因枪法、脂转染法、磷酸钙法、显微注射法、BEAE葡聚糖法等。

本发明中，根据以上记载，可以制备在细胞内可复制本发明的HCV次基因组RNA复制子的细胞。上述RNA复制子在该细胞中持续地自主复制，因此即使是进行RNA分解的细胞内也可以保持一定的量。因此，如上所述，本发明的HCV次基因组RNA复制子、或者表达HCV次基因组RNA复制子的载体等导入到细胞内所得的细胞可以保有该RNA复制子。本发明中，“保有RNA复制子的细胞”是指该RNA复制子通过其自主复制能力，以显著的量、并且非瞬时地存在于细胞内。

本发明的方法中，向保有本发明的HCV次基因组RNA复制子的细胞中导入后述的HCV结构蛋白表达载体并使其表达，由此可以生产包装了HCV次基因组RNA复制子的病毒样颗粒。

3.HCV结构蛋白表达载体的构建

本发明的方法中，优选使HCV结构蛋白质基因在保有HCV次基因组RNA复制子的细胞内表达，提供HCV结构蛋白。

HCV结构蛋白含有核心、E1、E2、p7。用于提供HCV结构蛋白的编码这些蛋白质的基因并不限于HCV的基因型，该基因可分别来自同一HCV株，或者来自两种或以上不同的HCV株，可采用混合(嵌合)的形态。作为HCV结构蛋白基因的来源，可以是选自1a、1b、2a、2b、3a和3b的HCV株的至少一种病毒株，优选的HCV株是选自1a、2a、3a和3b的至少一种病毒株，更优选的HCV株是选自基因型1b和2a的HCV株的至少一种病毒株。进一步优选选自基因型1a的H77c株、1株、H株和HC-J1株等，基因型1b的J1株、con1株、TH株、J株、JT株和BK株等，或者基因型2a的JFH1株、HC-J6株、JCH1株和J6CF株等的至少一种病毒株。进一步优选基因型1a的H77株、基因型1b的J1株或基因型2a的JFH1株，最优选JFH1株(GenBank检索号AB047639，Kato，T.等人.，Gastroenterology，125(2003)1808-1817页)。

表达这些蛋白质的方法只要是可在细胞、优选动物细胞、更优选哺乳动物细胞中表达的方法即可，可以是任意方法。优选的方法是使用掺入了上述基因的表达载体的方法。

本发明的优选方法中，为了提供HCV结构蛋白，可以将HCV结构蛋白表达载体(优选以在启动子控制下可表达的形式含有HCV结构蛋白基因的表达载体)导入到保有上述2的HCV次基因组RNA复制子的细胞中并表达。

表达载体有：CDM8、pEF1/Myc-His1，2，3、pEF4/Myc-His1，2，3、pcDNA3.1、pREP4、pCEP(均为インビトロジエン制备)、pCl-neo(プロメガ制备)等。也可以使用pcDNA5/TO，该pcDNA5/TO含有可通过四环素调节表达的启动子(インビトロジエン制备)。启动子只要是可在动物细胞中表达的启动子即可，有巨细胞病毒的IE(立即早期)启动子、SV40早期或晚期启动子、金属硫蛋白启动子、反转录病毒启动子、热休克蛋白启动子、SRα启动子、延伸因子1α启动子、白蛋白启动子等。

可利用的载体可列举病毒载体。只要可感染动物细胞、使所需外源基因表达的病毒载体即可，优选反转录病毒载体、腺病毒载体、新培斯病毒载体、痘苗病毒载体，特别是痘苗病毒载体可表达大量的基因产物(Elroy-Stein，O.，等人.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，86(1989)6126-6130页)，因此优选痘苗病毒载体。

本发明的方法中使用的HCV结构蛋白表达载体中，作为HCV结构蛋白基因，优选以在宿主细胞内可表达的状态含有核心蛋白基因、E1蛋白基因、E2蛋白基因、和p7蛋白基因。本发明的上述HCV结构蛋白表达载体的例子是：在可使插入基因表达的启动子的控制下含有核心蛋白基因、E1蛋白基因、E2蛋白基因和p7蛋白基因的载体。本发明中，特别优选使用在延伸因子1α(EF-1α)启动子的控制下插入核心蛋白基因、E1蛋白基因、E2蛋白基因和p7蛋白基因得到的含延伸因子1α启动子的载体作为特别适合的HCV结构蛋白表达载体。这里，“含有延伸因子1α启动子的载体”是指以可在宿主细胞内表达在其控制下的基因的配置方式含有延伸因子1α基因的启动子序列(EF-1α启动子；Mizushima等人.，Nucleic Acids Res.，1990，18，5322)的载体。例如有pEF1/Myc-Hisl1，2，3、pEF4/Myc-His1，2，3(均为インビトロジエン制备)。

本发明的HCV结构蛋白表达载体的另外优选例子是以可表达的状态含有核心蛋白基因、E1蛋白基因、E2蛋白基因和p7蛋白基因的痘苗病毒载体(重组痘苗病毒载体)。重组痘苗病毒载体的制备例如可优选使用DIs株、WR株、IBTd株(Meis，RJ & Condit，RC.Virol.182，442-454，(1992))等痘苗病毒株。重组痘苗病毒载体的制备方法如后述实施例所述。简单地说明，是在痘苗病毒转移载体中的p.7.5等痘苗病毒启动子的控制下克隆上述HCV结构蛋白基因，再将该转移载体通过电穿孔法等导入到感染了痘苗病毒的细胞中，培养该细胞，生成病毒颗粒，进一步优选将该病毒进行筛选、纯化，由此可制备目标重组痘苗病毒载体。上述痘苗病毒载体可以以重组病毒样颗粒的形式制备。

HCV的结构蛋白(核心、E1、E2、p7)和非结构蛋白(NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B)由翻译区以连续的多蛋白的形式被翻译，然后用蛋白酶进行限定分解，使其游离并生成，因此在表达这些HCV结构蛋白时，优选以核心、E1、E2、p7的连续的多蛋白的形式表达，也可以通过表达载体分别表达这些蛋白质。

导入了结构蛋白表达载体的细胞是否表达结构蛋白，这可以通过从细胞培养液或细胞中提取的蛋白质与结构蛋白的抗体的反应来检测(国际公开WO2004/104198)。

具体来说，例如将从细胞中提取的蛋白质试样进行SDS-聚酰胺凝胶电泳进行分组，在硝基纤维素上进行印迹，使抗HCV蛋白抗体(例如抗核心特异性抗体、或由丙型肝炎患者采集的抗血清)与其反应，再检测该抗体(蛋白质印迹法)。

或者使用同样的抗体，对表达HCV蛋白的细胞进行免疫染色，可以确认这些蛋白质的表达和在细胞内的位置。

4.HCV次基因组RNA复制子包装入颗粒

本发明的方法中，通过向保有HCV次基因组RNA复制子的细胞内供给表达HCV结构蛋白的载体，可在该细胞内生产通过结构蛋白包装HCV次基因组RNA复制子得到的病毒样颗粒。

复制HCV次基因组RNA复制子的细胞中，为了将HCV次基因组RNA复制子包装入病毒颗粒，可以向该细胞中导入结构蛋白(核心、E1、E2、p7)表达载体，并使其表达。或者是向稳定表达结构蛋白(核心、E1、E2、p7)的细胞中导入HCV次基因组RNA。

上述导入方法例如有电穿孔法、基因枪法、脂转染法、磷酸钙法、显微注射法、DEAE葡聚糖法等公知的方法。

5.重组HCV病毒样颗粒的生成

在如上制备的保有HCV次基因组RNA复制子的细胞中，导入了HCV结构蛋白(核心、E1、E2、p7)基因并使其表达的细胞(重组HCV样颗粒生成细胞)可以生产重组病毒样颗粒。产生的重组HCV样颗粒具有感染能力，具有复制HCV次基因组RNA的能力，但在被感染细胞中不生产子病毒颗粒，结果不具有传播性(传播能力)。

因此，通过培养本发明的重组HCV颗粒生成细胞，可以通过细胞培养体系制备重组HCV样颗粒。优选培养重组HCV样颗粒生成细胞，回收在该培养物(优选培养液)中生成的病毒样颗粒，由此获得HCV样颗粒。病毒样颗粒例如可通过蔗糖密度梯度离心等方法，由上述培养液中回收。

本发明的重组HCV样颗粒生成细胞的病毒颗粒生产能力可根据本领域技术人员所公知的任意的病毒检测方法确认。例如，将被认为生成病毒样颗粒的细胞培养液通过蔗糖密度梯度进行分组，测定各组分的密度、及其组分中HCV核心蛋白浓度或HCV复制子RNA浓度，由此可判断以往已知的HCV的比重是否一致。并且，当检测出核心蛋白的峰的组分的密度比用0.25％NP40(聚氧乙烯(9)辛基苯基醚)处理、然后进行分级时的同组分的密度轻时，可以判定该细胞具有病毒样颗粒生成能力。

重组HCV样颗粒生成细胞的病毒样颗粒是否具有感染能力，这可以检测包装到该病毒颗粒中的HCV次基因组RNA中所存在的外源基因的表现型。例如，如果外源基因是抗药性基因，则向接受了HCV的细胞中接种该病毒颗粒，在该药物存在下通常培养2-3周，通过计数抗药性的克隆来评价。

并且，为了确认重组HCV样颗粒生成细胞的病毒样颗粒在被感染细胞中不生产子病毒颗粒，可以通过上述的蛋白质印迹法等来判断感染细胞的提取物、优选感染细胞培养上清的试样中是否存在HCV结构蛋白。

通过本发明的方法生成的重组HCV样病毒颗粒具有对细胞(优选接受HCV的细胞)的感染能力。本发明还提供重组丙型肝炎病毒感染细胞的制备方法，该方法饱含培养重组HCV样颗粒生成细胞，将所得的培养物(优选培养液)中的病毒样颗粒感染其它细胞(优选接受HCV的细胞)。这里，接受HCV的细胞是具有HCV基因组RNA的复制能力和/或被HCV感染的能力的细胞，但并不限于此。具体来说，肝细胞有初代肝细胞、Huh7细胞、HepG2细胞、IMY-N9细胞、HeLa细胞等，淋巴细胞系细胞有Molt4细胞、HPB-Ma细胞、Daudi细胞等，但并不限于此。

为了容易理解，将上述第2节至第5节中说明的重组HCV样颗粒的生成步骤概括如图1所示。

6.用于导入基因的载体

按照本发明的方法生产的本发明的重组HCV样颗粒具有以下特征：在其RNA基因组上含有以下碱基序列：来自上述HCV株(选自基因型1a、1b、2a、2b、3a和3b，优选选自1b和2a的至少一种病毒株，例如基因型1b的Con1株或基因型2a的JFH1株)的5’非翻译区，编码NS3蛋白、NS4A蛋白、NS4B蛋白、NS5A蛋白和NS5蛋白的碱基序列，以及3’非翻译区的碱基序列。

除此之外还有以下很有意义的特征：用根据本发明的方法在重组HCV样颗粒生成细胞中生成的HCV样颗粒感染细胞(例如上述列举的接收HCV的细胞)，则在该感染细胞中，上述HCV次基因组RNA得以复制，但不形成子病毒颗粒。

本发明的重组HCV样颗粒中，通过向被包装的HCV次基因组RNA复制子中插入所需外源基因，可以作为基因导入/表达用的载体使用。上述包含外源基因的本发明的重组HCV样病毒颗粒可以通过将该外源基因插入到5’非翻译区和IRES序列之间制备HCV次基因组RNA复制子，将其按照上述本发明的方法进行包装来制备。在重组HCV颗粒生成细胞中生成的HCV颗粒不具有传播能力，因此可作为例如以肝脏或淋巴细胞系细胞或组织为靶的基因导入的载体使用。

根据本发明的病毒颗粒生成方法包装在病毒颗粒中的HCV次基因组RNA在被本发明的病毒样颗粒感染的、可接受HCV的细胞内并未掺入到染色体基因组中，因此基因的插入不会使正常基因受损或者插入附近的基因活化，较为有利。

由于上述特性，本发明的载体可以在导入外源基因、例如基因治疗或转基因动物的制备中使用。

导入到HCV次基因组RNA复制子中并包装成病毒颗粒的外源基因(或外源核酸)可以是包括来自包括人的哺乳动物的蛋白质、例如与疾病相关的各种蛋白质例如酶、细胞因子、趋化因子、激素、抗体、免疫调节分子、肿瘤抑制蛋白、生长因子、膜蛋白以及血管激动性蛋白等蛋白质、多肽或编码肽的基因，还有阻止或抑制蛋白质翻译的反义RNA、siRNA等治疗用核酸等，但并不限于此。

目标HCV敏感性细胞或组织是哺乳动物细胞或组织、优选人细胞或组织、例如人肝脏和淋巴细胞系的细胞或组织。本发明的载体在体内、体外或先体外后体内的条件下对靶细胞或组织起作用。优选在人的治疗、例如基因治疗、癌症(例如肝癌、淋巴瘤等)的治疗等中应用本发明的载体。

本说明书包含作为本申请的优先权基础的日本国特许出愿2005-287825号说明书和/或附图所记载的内容。

在本说明书中引用的所有刊物、专利和特许出愿的全体均通过参照引用到本说明书中。

实施例

以下给出实施例，更具体地说明本发明。但这些实施例只是用于说明，并不限制本发明的范围。

(实施例1)

保有复制子的细胞的制备

将由爆发性肝炎患者分离的丙型肝炎病毒JFH-1株(基因型2a)基因组中包含全长cDNA的DNA(JFH-1克隆：GenBank检索号AB047639)插入到pUC19质粒中的P7启动子下游，得到pJFH1，将其结构区和非结构区的一部分用新霉素抗性基因(neo，也称为新霉素磷酸转移酶基因)和EMCV-IRES(脑心肌炎病毒内部核糖体进入位点)置换，构建质粒DNA pSGR-JFH1(图2的中段)。该构建顺序按照已有报道(Lohmann等.，Science，(1999)285，110-113页)进行。

具体来说，将质粒pJFH1用限制酶AgeI和ClaI切断，在其切断位点插入两个片段并连接，其中一个片段是通过PCR扩增将来自pJFH1的5’NTR至核心区域的序列和来自pRSV5NEO的新霉素抗性基因结合、再用限制酶AgeI和PmeI切断所得的片段；另一个片段是通过PCR扩增将EMCV IRES至NS3区域的序列结合、再用限制酶PmeI和ClaI切断得到的片段。

接着，将pSGR-JFH1用限制酶XbaI切断。接着，将各10-20μg这些XbaI切断片段用绿豆核酸酶20单位(总反应液量50μl)在30℃下温育30分钟，进一步进行处理。绿豆核酸酶是催化选择性地分解双链DNA中的单链部分的反应的催化剂。通常，以上述XbaI切断片段直接作为模板进行RNA合成，则合成了XbaI识别序列的一部分——CTGA4个碱基多余地附加在3’末端的复制子RNA。因此，本实施例中，通过将XbaI切断片段用绿豆核酸酶进行处理，可由XbaI切断片段中除去CTGA4个碱基。然后，对于含有XbaI切断片段、用绿豆核酸酶处理后的溶液，按照常规方法进行蛋白质除去处理，纯化除去了CTGA4个碱基的XbaI切断片段，以此作为模板DNA。

接着，使用T7RNA聚合酶，由该模板DNA体外合成RNA。该RNA的合成是使用Ambion公司的MEGAscript。按照制造厂商的使用说明书，使用20μl含有0.5-1.0μg模板DNA的反应液进行反应。

RNA合成结束后，向反应溶液中添加Dnase(2个单位)，在37℃下反应15分钟，然后进一步通过酸性苯酚进行RNA提取，除去模板DNA。

将0.01ng-10μg该RNA(复制子RNA)与由Huh7细胞中提取的总细胞性RNA混合，调节至RNA的总量为10μg。接着，通过电穿孔法将该混合RNA导入Huh7细胞中。将进行了电穿孔处理的Huh7细胞接种于培养皿中，培养16-24小时，然后向该培养皿中以各种浓度添加G418(新霉素)。然后，每周更换两次培养液，继续培养。上述培养21天后，从培养皿中克隆存活细胞的集落，继续培养。通过上述集落的克隆，可以建立多个细胞克隆株。将保有HCV次基因组RNA复制子的一个细胞株命名为1H4.1。

按照与上述同样的方法，由来自HCV基因型1b的Con-1株的基因组全长cDNA制备HCV次基因组RNA复制子(GenBank检索号：AJ242654，图2的下段的I₃₈₉/NS3-3’/wt)，导入Huh7细胞株中，将由此制备的保有该RNA复制子的细胞株5-15细胞(Lohmann等人.，Science，(1999)285，110-113页)也用于实验。

(实施例2)

结构蛋白质表达载体的制备

1)结构蛋白表达质粒体

通过PCR扩增包含由暴发性肝炎分离JFH1株(GenBank检索号AB047639)(Kato T.等人.，J.Med.Viol.2001，64：334-339)的结构区基因(碱基序列号249-2781)的区域。将该DNA片段用NheI和EcoRI消化，将包含所得结构基因的片段通过琼脂糖凝胶电泳纯化，用DNA聚合酶制成平滑末端。将该平滑末端的cDNA插入到质粒载体CAG启动子序列(CAG)的下游。同样，将含有用上述NheI和EcoRI消化得到的结构区基因的cDNA插入到具有延伸因子1α基因启动子序列(EF-1α启动子；Mizushima等人.，Nucleic Acids Res.，1990，18，5322)的载体pEF4/Myc-His(インビトロジエン制备)的SpeI和EcoRI之间。将所得质粒分别命名为pCAGC-p7JFH1、pEF4C-p7JFH1(图3)。

2)表达结构蛋白的重组痘苗病毒载体

为了制备含有JFH1株的结构基因、可表达其所编码的蛋白质的载体，首先将图3上段所示的pEF4C-p7GJFH1用限制酶BamHI和EcoRI消化，将编码核心蛋白、E1蛋白、E2蛋白和p7蛋白的区域通过琼脂糖凝胶电泳分离制备。接着将该片段与目标外源基因一起连接到设计成插入XGPRT基因的痘苗病毒转移载体pDIsgptmH5(Ohnishi，K.等人.，Jap.J.Infect.Dis.58(2005)88-94页、Ishii，K.等人.，Virology 302(2002)433-444页)。该pDIsgptmH5是在插入到pUc/DIs载体的克隆位点的痘苗病毒p7.5启动子的控制下掺入大肠杆菌(Escherichia coli)的黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(XGPRT)基因的转移载体(Ishii，K.等人.，Virology302(2002)p.433-444)。将所得载体命名为pDIsJFHst。

按照以下方法制备含有H77c株的结构基因、可表达其所编码的蛋白质的载体。首先，以克隆H77c株的HCV基因组cDNA(GenBank检索号AF011751)得到的载体为模板，分别加入LA-PCR试剂盒(タカラバイオ制备)附属的5μl 10×缓冲液、5μl 2.5mM dNTP混合液、各1μl 10μM的引物H77/J1正向(AAAGATCTGCGAAAGGCCTTGTGGTACTGC：SEQ ID NO.1)和H77反向(AAGAGCTCTCATAACCCGACAAGAACAACGCCGC C：SEQ ID NO.2)，最终加入去离子水，使总量为49μl。接着，加入1μl Takara LA Taq(タカラバイオ制备)，然后进行PCR，PCR反应是将包含98℃20秒、68℃5分钟的步骤作为一个循环，共进行25个循环。对于该PCR产物的一部分进行琼脂糖凝胶电泳，确认有约2.5kb的扩增产物。

使用2μl该PCR产物，进行将扩增产物与质粒载体连接的连接反应。使用该连接反应产物，按照常规方法转化大肠杆菌，由所得转化体制备质粒DNA。用可以切除插入到该质粒DNA中的DNA片段的限制酶进行消化，进行琼脂糖凝胶电泳，确认在该质粒DNA中插入了约2.5kb的DNA片段。插入的DNA片段的碱基序列可按常规方法确定。结果，确定的碱基序列与GenBank检索号AF011751的碱基序列第271-2819位的序列一致。接着，将该质粒DNA用BglII和SacI消化，进行琼脂糖电泳，分离含有H77c株的结构基因区域的DNA片段，与痘苗病毒转移载体pDIsgptmH5(Ohnishi，K.等人.，Jap.J.Infect.Dis.58(2005)88-94页、Ishii，K.等人.，Virology 302(2002)p433-444)连接。结果将所得载体命名为pDIsH77st。

按照以下方法制备含有JI株的结构基因、可表达其所编码的蛋白质的载体。以克隆J1株的HCV基因组cDNA(GenBank检索号D89815)d得到的载体作为模板，分别加入LA-PCR试剂盒(タカラバイオ制备)附属的5μl 10×缓冲液、5μl 2.5mM dNTP混合液、各1μl 10μM的引物H77/J1正向(AAAGATCTGCGAAAGGCCTTGTGGTACTGC：SEQ IDNO.1)和J1反向(AAGAGCTCTCATAGACCTACAAAAACCCCGCCTCC：SEQ IDNO.3)，最终加入去离子水，使总量为49μl。接着，加入1μl TakaraLA Taq(タカラバイオ制备)，然后进行PCR，PCR反应是将包含98℃20秒、68℃5分钟的步骤作为一个循环，共进行25个循环。对于该PCR产物的一部分进行琼脂糖凝胶电泳，确认有约2.5kb的扩增产物。使用2μl该PCR产物，进行将扩增产物与质粒载体连接的连接反应。使用该连接反应产物，按照常规方法转化大肠杆菌，由所得转化体制备质粒DNA。用可以切除插入到该质粒DNA中的DNA片段的限制酶进行消化，供给琼脂糖凝胶电泳，确认在该质粒DNA中插入了约2.5kb的DNA片段。插入的DNA片段的碱基序列可按常规方法确定。结果，确定的碱基序列与GenBank检索号D89815的碱基序列第271-2819位的序列一致。接着，将该质粒DNA用BglII和SacI消化，进行琼脂糖电泳，分离含有J1株的结构基因区域的DNA片段，与痘苗病毒转移载体pDIsgptmH5(Ohnishi，K.等人.，Jap.J.Infect.Dis.58(2005)88-94页、Ishii，K.等人.，Virology 302(2002)p433-444)连接。将所得载体命名为pDIsJ1st。

按照以下方法制备含有由来自J1株的核心基因和来自JFH1株的E1、E2、p7基因形成的嵌合结构基因序列、可表达其所编码的蛋白质的载体。首先，为了扩增J1株的核心基因，以克隆J1株的HCV基因组cDNA(GenBank检索号D89815)得到的载体作为模板，分别加入LA-PCR试剂盒(タカラバイオ制备)附属的5μl 10×缓冲液、5μl2.5mM dNTP混合液、各1μl 10μM的引物H77/J1正向(SEQ IDNO.1)和J1/JFH1反向(GTAGCTGCTACTGGTATTCTTCACCTGGGCAGCGGAAGCTGGGATGGTCAAACAGGACAG：SEQ ID NO.4)，最终加入去离子水，使总量为49μl。接着，加入1μl Takara LA Taq(タカバイオ制备)，然后进行PCR反应，PCR反应是将包含98℃20秒、68℃5分钟的步骤作为一个循环，共进行25个循环。为了扩增JFH1株的E1、E2、p7基因，以克隆JFH1株的HCV基因组cDNA(GenBank检索号AB047639)得到的载体作为模板，分别入LA-PCR试剂盒(タカバイオ制备)附属的5μl 10×缓冲液、5μl 2.5mM dNTP混合液、各1μl 10μM的引物J1/JFH1正向(CTGTCCTGTTTGACCA TCCCAGCTTCCGCTGCCCAGGTGAAGAATACCAGTAGCAGCTAC：SEQ ID NO.5)和JFH1反向(AAGAGCTCTCAATCAATATCAACAAACCCACGCCT：SEQ ID NO.6)，最终加入去离子水，使总量为49μl。接着，加入1μl Takara LA Taq(タカラバイオ制备)，然后进行PCR反应，PCR反应是将包含98℃20秒、68℃5分钟的步骤作为一个循环，共进行25个循环。纯化所得的各扩增片段，溶解于50μl的水中，分别将1μl稀释为100倍，各取1μl混合。将该混合液作为模板，不加入引物，在上述条件下进行5个循环的LA-PCR。然后添加引物H77/J1正向(SEQ ID NO.1)和JFH1反向(SEQ IDNO.6)，再进行10个循环的LA-PCR，纯化扩增的嵌合DNA片段。将该片段克隆到质粒载体中，确定该DNA片段的碱基序列。结果可以确认，该DNA片段是由来自J1株的核心基因和来自JFH1株的E1、E2、p7基因形成的嵌合结构基因序列。接着，将该质粒用BglII和SacI消化，将所得片段与痘苗病毒转移载体pDIsgptmH5(Ohnishi，K.等人.，Jap.J.Infect.Dis.58(2005)88-94页、Ishii，K.等人.，Virology 302(2002)433-444页)连接。将所得载体命名为pDIsJ1(c)/JFH1(E1-p7)st。

按照以下方法制备含有由来自JFH1株的核心基因和来自J1株的E1、E2、p7基因型形成的嵌合结构基因序列、可表达其所编码的蛋白质的载体。首先，为了扩增JFH1株的核心基因，以克隆JFH1株的HCV基因组cDNA(GenBank检索号AB047639)得到的载体作为模板，分别加入LA-PCR试剂盒(タカラバイオ制备)附属的5μl 10×缓冲液、5μl 2.5mM dNTP混合液、各1μl 10μM的引物JFH1正向(AAAGATCTGCGAAAG GCCTTGTGGTACTGC：SEQ ID NO.7)和JFH1/J1反向(GGTATATCCCGGAC ACGTTGCGCACTTCATAAGCAGAGACCGGAACGGTGATGCAGGAC：SEQ ID NO.8)，最终加入去离子水，使总量为49μl。接着，加入1μl Takara LA Taq(タカラバイオ制备)，然后进行PCR反应。PCR反应是将包含98℃20秒、68℃5分钟的步骤作为一个循环，共进行25个循环。为了扩增J1株的E1、E2、p7基因，以克隆J1株的HCV基因组cDNA(GenBank检索号D89815)得到的载体作为模板，分别加入LA-PCR试剂盒(タカラバイオ制备)附属的5μl 10×缓冲液、5μl 2.5mM dNTP混合液、各1μl 10μM的引物JFH1/J1正向(GTCCTGCATCACCGTTCCGGTCTCTGCTTATGAAGTGCG CAACGTGTCCGGGATATACC：SEQ ID NO.9)和J1反向(AAGAGCTCTCATA GACCTACAAAAACCCCGCCTCC：SEQ ID NO.3)，最终加入去离子水，使总量为49μl。接着，加入1μl Takara LA Taq(タカラバイオ制备)，然后进行PCR反应，PCR反应是将包含98℃20秒、68℃5分钟的步骤作为一个循环，共进行25个循环。纯化所得的各扩增片段，溶解于50μl的水中，分别将1μl稀释为100倍，各取1μl混合。将该混合液作为模板，不加入引物，在上述条件下进行5个循环的LA-PCR。然后添加引物JFH1正向(SEQ ID NO.7)和J1反向(SEQ IDNO.3)，再进行10个循环的LA-PCR，纯化扩增的嵌合DNA片段。将该片段克隆到质粒载体中，确定该DNA片段的碱基序列。结果可以确认，该DNA片段是由来自JFH1株的核心基因和来自J1株的E1、E2、p7基因形成的嵌合结构基因序列。接着，将该质粒用BglII和SacI消化，将所得片段与痘苗病毒转移载体pDIsgptmH5(Ohnishi，K.等人.，Jap.J.Infect.Dis.58(2005)88-94页、Ishii，K.等人.，Virology 302(2002)433-444页)连接。将所得载体命名为pDIsJFH(c)/J1(E1-p7)st。

如上所述制备的载体pDIsJFHst、pDIsH77st、pDIsJ1st、pDIsJ1(c)/JFH(E1-p7)st、和pDIsJFH(c)/J1(E1-p7)st中插入的HCV机构基因序列(嵌合结构基因序列)的图谱如图4所示。

具有上述各载体的重组痘苗病毒型载体DIs株例如可如下制备并选择。

将500μl含有约10⁶pfu(噬斑形成单位)痘苗病毒DIs株的病毒液接种于已经接种了约10⁷个CEF(鸡胚成纤维细胞)细胞的80mm培养皿中，每隔15分钟振荡8次，使病毒感染细胞。然后，加入含有1ml 10％FCS(胎牛血清)的DMEM(Dalbecco-modified Eagle培养基)，在37℃下、5％CO₂条件下培养2小时。除去培养基，用PBS(磷酸盐缓冲液)洗涤，然后加入0.5ml 0.05％胰蛋白酶溶液，使细胞游离，然后以2000rpm将细胞悬浮液离心3分钟，回收细胞，悬浮于400μl的PBS中。向该细胞悬浮液中溶解10μg上述转移载体，使用Gene Pulser II(BioRad制造)，在0.4cm的电穿孔池中以250v、500μFD施加一次电压，进行电穿孔。将细胞悬浮于2ml含有10％FCS的DMEM中，接种于35mm培养皿中，在37℃、5％CO₂的条件下培养7天。将感染细胞与培养基一起回收，进行三次冷冻干燥、2分钟的超声波处理，然后用该培养基稀释为10、100、1000倍。将10⁶个细胞接种于35mm培养皿中，在培养基(含有10％FCS的DMEM)中分别添加25μg/ml、250μg/ml、15μg/ml黄嘌呤、次黄嘌呤，培养过夜，然后接种上述稀释细胞液。每隔15分钟振荡8次，使病毒感染细胞，除去稀释细胞液，加入2ml添加了1％软琼脂的培养基(含有10％FCS的DMEM、MPA、黄嘌呤、次黄嘌呤)，使其固化，然后在37℃、5％CO₂的条件下培养7天。将形成的噬斑部分用巴氏吸管拾取，悬浮于200μl含有10％FCS的DMEM中，进行2分钟超声波处理，将病毒从琼脂中释放。将该培养液用同样的培养基稀释为10、100、1000倍，将与上述同样的噬斑测定操作再重复2次，纯化重组病毒，然后感染CEF细胞，进行放大。

如上所述，由pDIsJFHst、pDIsH77st、pDIsJ1st、pDIsJ1(c)/JFH(E1-p7)st、pDIsJFH(c)/J1(E1-p7)st分别制备的病毒载体(重组病毒样颗粒)分别命名为DIsJFHst、DIsH77st、DIsJ1st、DIsJ1(c)/JFH(E1-p7)st、DIsJFH(c)/J1(E1-p7)st。

(实施例3)

向保有复制子的细胞中导入结构蛋白表达载体以及结构蛋白的生成

为了在保有复制子的细胞中表达HCV结构蛋白，通过脂转染法等向实施例2中制备的HCV结构蛋白表达载体pCAGC-p7JFH1或pEF4C-p7JFH1中导入保有复制子的细胞。再使实施例2中制备的表达HCV结构蛋白的病毒载体DIsJFHst、DIsH77st、DIsJ1st、DIsJ1(c)/JFH(E1-p7)st或DIsJFH(c)/J1(E1-p7)st感染保有复制子的细胞。

1)结构蛋白表达质粒载体的导入

通过脂转染法将pCAGC-p7JFH1导入保有复制子的细胞5-15，然后取8ml培养液继续培养，4天后回收培养上清，测定HCV核心蛋白，在检测下限或以下。

另一方面，通过脂转染法将pEF4C-p7JFH1导入保有复制子的细胞IH4.1。结果，可通过蛋白质印迹法在该培养上清中检测出HCV核心蛋白。因此，将导入了pEF4C-p7JFH1的保有复制子的细胞IH4.1培养4天，回收8ml培养液，以8,000g在4℃下离心60分钟，收集培养上清。接着，将该上清用SW20ロ一タ一(ベツクマン制造)以25,000rpm、4℃离心4小时，将颗粒悬浮于1ml缓冲液中。将样品倒入用SW41Eロ一タ一(ベツクマン制造)的管制备的10-60％蔗糖密度梯度中，以35,000转、4℃离心16小时。10-60％蔗糖密度梯度是将2ml 60％(重量/重量)蔗糖溶液(溶解于50mM Tris pH7.5/0.1M NaCl/1mM EDTA)、1ml 50％蔗糖溶液、1ml 40％蔗糖溶液、1ml 30％蔗糖溶液、1ml 20％蔗糖溶液、1ml10％蔗糖溶液倒入离心管中制备。

离心结束后，由管底各回收0.5ml组分。对各组分的密度、HCV核心蛋白浓度和RNA浓度进行定量。HCV核心蛋白的测定是使用Ortho HCV抗原IRMA测定仪进行(Aoyagi等.，J.Clin.Microbiol.，37(1999)1802-1808页)。HCV的复制子RNA的定量是按照Takeuchi(Takeuchi等人.，Gastroenterology 116(1999)页636-642)进行。如图5所示，在两次实验中，复制子RNA与核心蛋白的峰均位于组分8，两者是一致的。该组分的密度约1.17g/ml，与已经报道的HCV颗粒的密度一致。由此显示生成了病毒颗粒。

2)HCV结构蛋白表达重组痘苗病毒载体的导入

将保有复制子的细胞株5-15以2×10⁶个接种于10cm的培养皿中，第二天将0.5pfu(噬斑形成单位)/细胞的DIsJFHst感染保有复制子的细胞株。用8ml的培养液持续培养。培养4天后回收培养液，以8,000g、4℃离心60分钟，收集培养上清。接着将该上清用SW20ロ一タ一(ベツクマン制造)以25,000rpm、4℃离心4小时，将8ml的细胞培养液的颗粒悬浮于1ml含有0.2％NP40的缓冲液和不含有缓冲液中。在4℃下温育20分钟，将样品倒入用SW41Eロ一タ一(ベツクマン制造)的管中制备的10-60％蔗糖密度梯度中，以35,000转、4℃离心16小时。10-60％蔗糖密度梯度是将2ml 60％(重量/重量)蔗糖溶液(溶解于50mM TrispH7.5/0.1M NaCl/1mM EDTA)、1ml 50％蔗糖溶液、1ml 40％蔗糖溶液、1ml 30％蔗糖溶液、1ml 20％蔗糖溶液、1ml 10％蔗糖溶液倒入离心管中制备。

离心结束后，由管底各回收0.5ml组分。对各组分的密度、HCV核心蛋白浓度进行定量。HCV核心蛋白的测定是使用Ortho HCV抗原IRMA测定仪进行(Aoyagi等.，J.Clin.Microbiol.，37(1999)1802-1808页)。

两次独立的实验结果如图6所示。在NP40未处理组(PBS处理)中，含有核心蛋白的颗粒密度为1.16g/ml(组分7)；经NP40处理的组中，含有核心蛋白的颗粒密度为1.21g/ml(组分9)。这显示，含有脂肪、比重轻的表面膜通过NP40处理从病毒颗粒上剥离，形成未保持病毒样结构的核酸和只有核心蛋白的核心颗粒，比重变得较重。由此，本实验体系中可以生成完全的病毒颗粒。

使病毒载体DIsJ1St、DIsJ1(c)/JFH(E1-p7)st、或DIsJFH(c)/J1(E1-p7)st分别与上述同样地感染保有复制子的细胞株5-15。感染后将8ml培养了4天的上清通过超滤膜浓缩，通过上述蔗糖密度梯度离心法进行分组。对各组分的密度、HCV核心蛋白浓度进行定量。由HCV核心蛋白的密度分布图显示，感染了DIsJ1st、DIsJ1(c)/JFH(E1-p7)st、或DIsJFH(c)/J1(E1-p7)st的培养上清中含有所产生的病毒样颗粒。

(实施例4)

重组HCV样颗粒的感染能力的确认

上述实施例中制备的重组HCV颗粒如图1所示，具有neo基因作为抗药性标志。因此，为了确认实施例3所得的颗粒是否具有感染能力，使该颗粒感染Huh7细胞，研究是否得到了G418(新霉素)抗性集落。

使DIsJFHst感染保有复制子的细胞株5-15，培养4天，将所得培养上清通过超滤膜(截至1×10⁵Da)浓缩至30倍，感染Huh7细胞。感染后以1mg/ml将G418添加到培养皿中。然后每周更换2次培养液，同时继续培养。接种后培养21天后，用水晶紫对存活细胞进行染色，结果可确认形成了集落。

如果被感染细胞中没有检测出HCV结构蛋白，则在感染细胞中未生成子颗粒。因此，使本实验中形成的集落进行增殖，制备其细胞提取液。接着，通过SDS-PAGE和蛋白质印迹法对这些提取液中的蛋白质进行分析。分析时，含有核心基因的表达质粒DNA瞬时转染Huh7细胞，将所得的细胞提取液作为阳性对照。再将由未转染的Huh7细胞得到的细胞提取液作为阴性对照。将由各细胞克隆提取的试样进行SDS-PAGE，然后PVDF膜(Immobilon-P，Millipore制造)上进行印迹，使用抗核心特异性抗体(克隆2H9抗体)和识别这些抗体的HRP标记二次抗体，通过ECL(アマシヤムフアルマシア制备)分析在细胞内翻译的核心蛋白，结果，在被感染细胞中未能检测出核心蛋白。因此判断被感染细胞中未生产子病毒颗粒。这表明，按照本发明的方法制备的重组HCV样颗粒在感染了其它细胞后无法以颗粒的形式再生，因此，不具有对其它细胞更大地扩散感染的能力(传播力)。

产业实用性

根据本发明，可以提供将含有所需外源基因的HCV次基因组RNA进行包装得到的不具有传播性的重组感染性HCV样颗粒及其制备方法。上述重组感染性HCV样颗粒具有传播性差的优点，因此可用作哺乳动物、特别是人的肝脏或淋巴细胞系细胞或组织经由体内或来自体内的基因导入进行的基因治疗，或者作为制备转基因动物的病毒载体，还可用作弱毒化的疫苗。

序列表文本

SEQ ID NO.1-9的序列表示引物。

Claims (4)

1.生产重组丙型肝炎病毒样颗粒的方法，该方法包含向(i)的细胞中导入(ii)的载体，培养该细胞，回收生成的病毒样颗粒；其中所述

(i)的细胞为Huh7细胞或HepG2细胞，其中保有RNA复制子，该复制子由：来自基因型1b的丙型肝炎病毒株conl株的基因组RNA的5’非翻译区，编码NS3蛋白、NS4A蛋白、NS4B蛋白、NS5A蛋白和NS5B蛋白的碱基序列，3’非翻译区按以上顺序构成；

(ii)的载体为表达核心蛋白、E1蛋白、E2蛋白和p7蛋白的痘苗病毒载体或含有EF-1α启动子的载体，所述蛋白来自基因型1b的丙型肝炎病毒株J1株或基因型2a的丙型肝炎病毒株JFH1株。

2.权利要求1的方法，其中，上述RNA复制子进一步含有至少一个内部核糖体进入位点，即IRES，序列和/或至少一个外源基因。

3.权利要求2的方法，其中，上述IRES序列和/或外源基因位于上述5’非翻译区和上述NS3蛋白质编码序列之间。

4.重组丙型肝炎病毒样颗粒，该病毒样颗粒是按照权利要求1的方法生成的、具有感染性但不具有传播力的病毒样颗粒。

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