JPWO2007037429A1 - 新規組換え型ヒトｃ型肝炎ウイルス様粒子とその産生方法 - Google Patents

Abstract

本発明は、（i）Ｃ型肝炎ウイルス株に由来するゲノムRNA上の、5'非翻訳領域と、NS3タンパク質、NS4Aタンパク質、NS4Bタンパク質、NS5Aタンパク質及びNS5Bタンパク質をコードする塩基配列と、3'非翻訳領域とを含む塩基配列を含むRNAレプリコンを自律複製する細胞に、（ii）上記（i）と同じ又は異なるＣ型肝炎ウイルス株由来のCoreタンパク質、E1タンパク質、E2タンパク質及びp7タンパク質を発現するベクターを導入し、該細胞を培養し、産生されたウイルス様粒子を回収することを含む組換え型Ｃ型肝炎ウイルス様粒子を産生する方法、並びにこの方法によって産生される組換え型Ｃ型肝炎ウイルス粒子に関する。

Description

本発明は、ヒト組換え型Ｃ型肝炎ウイルス様粒子とその産生方法に関する。

動物細胞に遺伝子を導入する方法として、物理化学的方法と生物学的方法に大別される。物理化学的方法として、リン酸カルシウム共沈殿法、DEAEデキストラン法、リポフェクション法、マイクロインジェクション法、エレクトロポレーション法などがある。一方、生物学的方法として、ウイルスベクターを用いる方法がある。

ウイルスベクター法とは、ウイルスが持っている細胞進入機構、すなわち感染能を利用して遺伝子を導入する方法である。

ウイルスベクター用いて作製された組換え型ウイルス粒子の表面には、ウイルス由来の構造蛋白質（ヌクレオキャプシドやエンベロープ蛋白質等）が存在しており、細胞表面に存在する受容体を介して細胞に感染し、効率よく遺伝子を導入する機構を有している。したがって、このようなウイルスベクターを用いて作製された組換え型ウイルス粒子は、動物細胞に遺伝子を導入し目的遺伝子発現細胞を作製する目的のみならず、遺伝子治療、トランスジェニック動物作製等の目的に使用することが可能である。

ウイルスベクターは、レトロウイルスベクター、DNAウイルスベクター、RNAウイルスベクターの３者に分類され、由来するウイルスの種類によって導入できる遺伝子の長さ、細胞の染色体ゲノムに遺伝子を組込むかどうか、分裂細胞のみか非分裂細胞にも遺伝子を導入できるか、感染できる細胞の種類、細胞への毒性、遺伝子導入効率などに関して特徴がある。

レトロウイルスはプラス鎖のRNAをゲノムとして持っている。このRNAは典型的な真核細胞のmRNAの性質、すなわちメチル化された5’末端キャップ構造と3’末端には約200塩基からなるポリAを持っている。感染した細胞内でこのRNAはウイルスの持つ逆転写酵素の働きで、DNAに変換される。さらにウイルスがコードする酵素の作用により宿主のゲノムDNAに組み込まれる。組み込まれたDNAをプロウイルスと呼ぶが、プロウイルスの両端には繰り返し配列（LTR）が生じ、その中にあるプロモーターによりウイルスのRNAが合成される。合成されたRNAからはウイルスタンパク質が翻訳されると共に、ゲノムサイズのRNAはウイルス粒子に組み込まれ、子粒子となり細胞外に放出される。

ウイルス粒子を産生するのに必要なRNAの構造は両端のLTRとそれに囲まれるプライマー結合部位、パッケージングシグナル及びポリプリンシグナルである。これらはシス因子として必須である。一方、ウイルスタンパク質をコードする遺伝子はシス因子として必須ではなく、感染細胞の中でウイルスタンパク質が供給されれば複製と粒子産生は正常に行われる。

従って、組換え型レトロウイルスを産生する場合、レトロウイルスがコードするgag、pol、envなどの遺伝子を除き、その代わり発現させたい目的遺伝子を挿入したベクター（レトロウイルスベクターと呼ぶ）を作製しておき、このベクターをウイルスタンパク質が供給された細胞（通常パッケージング細胞と呼ぶ）に導入すれば外来遺伝子を組み込んだレトロウイルス粒子が作製される（非特許文献１）。

レトロウイルスとしては、例えばマウス白血病ウイルス、ネコ白血病ウイルス、ヒヒC型オンコウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、成人T細胞白血病ウイルス等を例示することができる。さらには、組換え型レトロウイルスベクターとして報告されているものには、マウス白血病ウイルスを基本としたもの（非特許文献１）、また、ヒト免疫不全ウイルスを基本としたもの（非特許文献２）等が挙げられる。

組換え型レトロウイルスの産生のためのシステムは、２つの構成単位、すなわち、導入しようとする遺伝情報（目的とする外来遺伝子）とウイルスゲノムのパッケージング及び組込みに必要な要素の全てとをシスに（in cis）保持するレトロウイルスベクター（組換え型レトロウイルスDNA）と、gag、pol及びenv遺伝子によってコードされるウイルスタンパク質を提供するレトロウイルスパッケージング細胞とからなる。gag、pol及びenv遺伝子を発現する組換えベクターを導入されたパッケージング細胞のみでは組換え型レトロウイルス粒子を放出することができない。

組換え型レトロウイルス粒子を産生するには、gag、pol及びenvタンパク質がトランスに（in trans）位置する必要がある。したがって、gag、pol及びenv遺伝子を発現する組換えベクターを導入されたパッケージング細胞に、レトロウイルスベクターを導入することで、前記ベクターに含まれる遺伝情報を保持する組換えレトロウイルスが作製できる。次に、これらのウイルスを用いて細胞を感染させれば、その細胞内で、レトロウイルスベクターは天然のレトロウイルス生活環に従って細胞の染色体ゲノムに組込まれるだろう。

レトロウイルスベクター法はこのように、特定のDNAを効率よく宿主の染色体ゲノムに組込むことを目的に作出されたシステムであるが、目的遺伝子の挿入位置が予想できないため、挿入により正常遺伝子が損傷を受けたり、挿入された近辺の遺伝子を活性化したり、目的とする外来遺伝子が過剰発現したり発現が抑制されたりする可能性を否定できない。この問題点を克服するために、染色体外遺伝子として利用できるDNAウイルスベクターを利用した一時的（transient）な発現系の開発が進められた。

DNAウイルスベクターは、DNAウイルスに由来するベクターである。DNAウイルスは、ウイルス粒子内にDNAを遺伝情報として保持するものであり、そのDNAの複製は、自己のDNAを鋳型とし、宿主由来のDNA依存性DNA複製酵素を触媒の少なくとも一部とすることにより、相補鎖を生成するという過程の繰り返しによりなされる。染色体外遺伝子として利用できるDNAウイルスベクターとして、例えばアデノウイルスベクターが挙げられる。

ヒトアデノウイルスは約３６ｋｂの線状２本鎖DNAをゲノムとして持ち、それに含まれる領域は初期遺伝子E1、E2、E3、E4と後期遺伝子のL1、L2、L3、L4、L5に大別される。初期遺伝子は、主にウイルスの複製に、後期遺伝子はカプシドなどウイルスの構造タンパク質の合成に関与する。遺伝子導入用として用いられるアデノウイルスベクターは、初期遺伝子であるE1領域（E1AとE1Bとに分けられ、E1Aによりすべてのアデノウイルスプロモーターが活性化される）を所望する外来遺伝子（目的遺伝子）に置き換え、E1Aをトランスに供給できる細胞株である293細胞（293細胞はE1Aを発現している）などで増殖させる。E1A領域を欠損したアデノウイルスベクターは、E1Aを発現していない通常の細胞では増殖できない。E3領域はウイルスの増殖には必須でないため、外来遺伝子の挿入サイズの増大化を目的に除かれることが多い。アデノウイルスは野生型のゲノムサイズの105%までのゲノムをカプシド内にパッケージングすることができるため、E1及びE3領域を欠損させることで、最大約8.1kbまでの外来遺伝子を挿入することができる（非特許文献３）。

アデノウイルスベクターでは、非増殖細胞と増殖細胞の両方に遺伝子を導入することができる（非特許文献４）。このことから、この方法は in vivo遺伝子導入法に適している。本ベクターの欠点の一つとして、遺伝子の発現期間が一般的に短い（週単位）ことがあげられる。これは、アデノウイルスのゲノムが染色体外の領域（エピゾーム）に限定して存在し、複製・増幅も行われないためである。２つめの欠点として、現在一般的に使用されているアデノウイルスは非特異的な炎症反応を引き起こし、ベクター自身に対する細胞性免疫応答をも増強されることから、遺伝子治療においては、連続的な投与が困難な点が懸念される（非特許文献５）。

RNAウイルスを基本としたウイルスベクターが開発されつつある。RNAウイルスの複製は、自己のRNAを鋳型とし、自己由来のRNA依存性RNA複製酵素を触媒とすることにより、相補鎖を生成するという過程の繰り返しによりなされる。

RNAウイルスは（-）鎖RNAウイルスと（＋）鎖RNAウイルスとに別けられる。代表的な（-）鎖RNAウイルスとして、インフルエンザウイルスが挙げられる。インフルエンザウイルスゲノムは8本の分節マイナス鎖RNAからなるウイルスである。インフルエンザウイルスが感染すると、インフルエンザ粒子中のタンパク質によって、遺伝子の転写が開始する。まず、ウイルスRNAポリメラーゼは、宿主細胞のmRNAを5’末端キャップ構造から十数ヌクレオチドの部分で切断し、プライマーとして利用し、RNA鎖（プラス鎖）を伸長する。このプラス鎖RNAからウイルスタンパク質が翻訳される。複製過程では、ウイルスのRNAに完全に相補的なRNAが合成され、これを鋳型として、子孫のウイルスRNAが増幅される。その後、ウイルスRNAはウイルス蛋白とともにパッケージングされウイルス粒子となる。

従って、細胞培養系でインフルエンザウイルスを生産する場合、インフルエンザウイルスがコードするタンパク質をRNAポリメラーゼII系のプロモーター、たとえば、CMVやCAGプロモーターで発現させると共に、ウイルスRNAをキャップ構造及びポリAが付かないプロモーターであるRNAポリメラーゼI型のプロモーター、たとえばrRNA遺伝子のプロモーターで発現すれば、細胞中でウイルスRNAはウイルス蛋白とともにパッケージングされウイルス粒子となる（非特許文献６）。しかし、生産されるウイルス量が示されておらず、生産面から十分に利用できる技術として確立していない。

（＋）鎖RNAウイルスに分類されるウイルスとして、シンドビスウイルスやＣ型肝炎ウイルスがある。（＋）鎖RNAウイルスが有するゲノムRNAは、同時にメッセンジャーRNA（以下「mRNA」と称する）としても機能し、複製や粒子形成に必要な蛋白質を宿主細胞の翻訳機能に依存して生産することができる。言い換えれば、（＋）鎖RNAウイルスが有するゲノムRNA自体が伝播力を有する。

シンドビスウイルス(Sindbis virus)に由来するウイルスベクターは、ゲノムRNAのうち、ウイルス構造体に関わる構造遺伝子領域を欠失させ、ウイルスの転写複製蛋白質遺伝子群を残したものと、転写プロモーター下流に所望の外来性遺伝子を接続したRNAを基本的な構造としている。このようなRNA又は該RNAを転写せしめうるcDNAを細胞内に導入すると、外来遺伝子を含むRNAベクターの自律複製と転写プロモーター下流の外来性遺伝子の転写とが起こり、目的とする外来性遺伝子産物が細胞内に発現する。さらに、構造遺伝子を発現するcDNAユニット（ヘルパー）と、上記のRNAベクターを発現するcDNAユニットとをパッケージング細胞内で共存させることにより、感染能を有するが、伝播力を有しない複合体を作製することができる（非特許文献７）。

シンドビスウイルスは、受容体として67キロダルトンの高親和性ラミニン受容体（High-affinity laminin receptor、LAMR）を使用し、神経細胞に高い効率で感染することから、シンドビスウイルスベクターは、神経特異的に遺伝子を導入するシステムとして注目されている（非特許文献８）。しかし、シンドビスウイルスの感染は、宿主細胞におけるアポトーシスを誘導することが示されており(非特許文献９)、毒性が懸念される。

Ｃ型肝炎ウイルス（HCV）のゲノムは、約9600ヌクレオチドからなる(＋)鎖の一本鎖RNAである。このゲノムRNAは、5'非翻訳領域（5'NTR又は5'UTRとも表記する）、構造領域と非構造領域とから構成される翻訳領域、及び3'非翻訳領域（3'NTR又は3'UTRとも表記する）からなる。その構造領域にはHCVの構造タンパク質がコードされており、非構造領域には複数の非構造タンパク質がコードされている。

このようなHCVの構造タンパク質（Core、E1、E2、及びp7）と非構造タンパク質（NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A、及びNS5B）は、翻訳領域から一続きのポリプロテインとして翻訳された後、プロテアーゼによる限定分解を受けて遊離、生成される。これらの構造タンパク質及び非構造タンパク質（すなわち、HCVのウイルスタンパク質）のうち、Coreはコアタンパク質であり、E1及びE2はエンベロープタンパク質である。非構造タンパク質はウイルス自身の複製に関与するタンパク質であり、NS2はメタロプロテアーゼ活性、NS3はセリンプロテアーゼ活性（Ｎ末端側の３分の１）とヘリカーゼ活性（Ｃ末端側の３分の２）を有することが知られている。さらに、NS4AはNS3のプロテアーゼ活性に対するコファクターであり、NS5BはRNA依存RNAポリメラーゼ活性を有することも報告されている。

HCVは遺伝子型又は血清型により多数の型に分類されることが分かってきた。現在主流のHCV遺伝子型分類法である、SimmondsらによるHCV株の塩基配列を用いた系統解析法では、HCVは遺伝子型1a、遺伝子型1b、遺伝子型2a、遺伝子型2b、遺伝子型3a、遺伝子型3bの６タイプに分類され、さらにそれら各タイプがいくつかのサブタイプに分類される。そして、HCVの複数の遺伝子型についてはそのゲノム全長の塩基配列も決定されている（非特許文献１０〜１３）。

HCV粒子は細胞表面の硫酸多糖類に捕捉され、エンベロープタンパク質を介して親和性の高い受容体と結合し、エンドサイトーシスによりエンドソーム内に取り込まれる。その後、ウイルス膜とエンドソーム膜が融合し、ヌクレオキャプシドが細胞質に進入する。裸になったウイルスゲノムはIRESによって翻訳を開始する。小胞体膜上で翻訳とタンパク質の開裂が起こる。コアタンパク質、E1及びE2タンパク質と、小胞体で複製されたウイルスRNAとが集合し、ウイルス粒子が形成される。その後、小胞体腔へ出芽する。出芽した粒子はゴルジ装置を通過して細胞外に放出されると考えられている。

最近になって、HCV由来の自律複製能を有するRNAとして、HCVサブゲノムRNAレプリコンが作製されたことにより（特許文献１、２及び非特許文献１４〜１６）、培養細胞を用いてHCVの複製機構を解析することが可能となった。これらのHCVサブゲノムRNAレプリコンは、HCVゲノムRNAの5'非翻訳領域中のHCV IRESの下流に存在する構造タンパク質を、ネオマイシン耐性遺伝子及びその下流に連結したEMCV-IRESによって置換したものである。このRNAレプリコンは、ヒト肝癌細胞Huh7に導入してネオマイシン存在下で培養することにより、Huh7細胞内で自律複製することが証明された。さらに一部のHCVサブゲノムRNAレプリコンは、Huh7に限らずヒト子宮頸部癌細胞HeLa、ヒト肝癌細胞HepG2などの細胞内でも自律複製することが証明された（特許文献３）。さらに、特許文献２には、遺伝子治療用のベクターとしての組換え型HCVの使用について、HCV全長ゲノムを利用したHCVウイルス粒子の産生が提案されている。
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HCVは、レトロウイルス、アデノウイルス、インフルエンザウイルス、シンドビスウイルスのようなウイルスベクターとしての開発が実際には行われていない。もしそのようなHCVベクターが開発されるならば、肝臓などの組織の細胞に特異的に遺伝子を導入することが可能となるだろう。その場合、より高度の安全性を確保するために、HCVベクターは、細胞に感染するが伝搬性がないことが望ましい。

本発明の目的は、上記のようなベクターとして使用可能な組換え型C型肝炎ウイルス（HCV）様粒子を開発することである。また、該HCV様粒子を効率よく産生する方法を提供することである。

本発明者らは、安全性、利便性、応用性の点から、産業上有用であると考えられる組換え型HCV様粒子を培養細胞で産生させることを試みた。まず、HCVのゲノムを、HCV構造タンパク質を発現するベクターと、複製に関係する遺伝子を含むベクターとに分割した。後者のベクターには、所望の外来遺伝子及び/又は内部リボゾーム結合部位（Internal Ribosome Entry Site; IRES）を含むことができる。

本発明者らは、所望の外来遺伝子、IRES配列、HCVの複製に関係する遺伝子からなるDNAをT7プロモーターの下流にクローン化したベクターを構築し、T7ポリメラーゼを用いてin vitroで外来遺伝子配列を含有するHCVサブゲノムRNAレプリコンを合成した。このRNAレプリコンを培養動物細胞に導入し、該HCVサブゲノムRNAレプリコンが複製されている細胞株を得た。

次にHCV構造タンパク質を高発現するベクターを、高い効率で該細胞株に導入できる系を見出して、種々の遺伝子型のHCVサブゲノムRNAレプリコンを保持する細胞に導入した。その結果、細胞内でHCV構造タンパク質を発現させることで、該HCVサブゲノムRNAレプリコンをウイルス粒子にパッケージングすることができる組合せを見出すことに成功した。

さらに本発明者らは、本発明の方法で産生された組換え型HCV様粒子が感染すること及び該組換え型HCVが感染した細胞は子ウイルス粒子を産生せず、伝播性がないことを確認した。このような特性のために、本発明の組換え型HCV粒子は、外来遺伝子導入のための、或いは遺伝子治療のための、ベクターとして使用することが可能である。

すなわち、本発明は、要約すると、以下の特徴を有する。

本発明は、その第１の態様において、組換え型Ｃ型肝炎ウイルス粒子を産生する方法であって、
（i）Ｃ型肝炎ウイルス株に由来するゲノムRNA上の、5'非翻訳領域と、NS3タンパク質、NS4Aタンパク質、NS4Bタンパク質、NS5Aタンパク質及びNS5Bタンパク質をコードする塩基配列と、3'非翻訳領域とを含む塩基配列を含むRNAレプリコンを保持する細胞に、
（ii）上記(i)と同じ又は異なるＣ型肝炎ウイルス株由来のCoreタンパク質、E1タンパク質、E2タンパク質及びp7タンパク質を発現するベクターを導入し、該細胞を培養し、産生した組換え型Ｃ型肝炎ウイルス粒子を回収することを含む、前記方法を提供する。

その一の実施形態において、前記(i)及び(ii)のＣ型肝炎ウイルス株は、独立に、遺伝子型1a, 1b, 2a, 2b, 3a及び3bのウイルス株からなる群から選択される少なくとも１種の株である。

別の実施形態において、前記(i)及び(ii)のＣ型肝炎ウイルス株は、独立に、遺伝子型1b及び2aのウイルス株からなる群から選択される少なくとも１種の株である。

さらに別の実施形態において、前記(i)のＣ型肝炎ウイルス株は、遺伝子型1bのウイルス株である。

好適実施形態によれば、前記遺伝子型1bのウイルス株はcon1株又はその派生株である。

別の実施形態において、前記(ii)のＣ型肝炎ウイルス株は、遺伝子型2aのウイルス株である。

好適実施形態によれば、前記遺伝子型2aのウイルス株はJFHI株又はその派生株である。

さらに別の実施形態において、前記RNAレプリコンは、少なくとも１つの内部リボゾーム結合部位（IRES）配列をさらに含むことができる。

別の実施形態において、前記RNAレプリコンは、少なくとも１つの外来遺伝子をさらに含むことができる。

好適実施形態によれば、前記IRES及び前記外来遺伝子は、前記5'非翻訳領域と前記NS3との間に位置することができる。

さらに別の実施形態において、前記細胞は動物細胞である。

好適実施形態によれば、前記動物細胞は哺乳動物細胞である。

前記哺乳動物細胞として、Huh7、HepG2及びそれらの細胞から派生した株化細胞を例示することができる。

さらに別の実施形態において、前記発現ベクターはウイルスベクターである。

好適実施形態によれば、前記ウイルスベクターはワクチニアウイルスベクターである。

本発明の上記方法で産生・回収された組換え型Ｃ型肝炎ウイルス粒子をさらに、肝臓細胞又はリンパ球系細胞などのHCV感受性細胞に感染させて、ウイルス粒子を増殖させることができる。本発明は、このような工程も包含する。

本発明はまた、第２の態様において、上に記載の本発明の方法によって産生される、かつ感染性を有しているが伝搬力のない、ことを特徴とする組換え型Ｃ型肝炎ウイルス粒子を提供する。

その一の実施形態において、前記組換え型Ｃ型肝炎ウイルス粒子には、発現可能に外来遺伝子が導入されている。

別の実施形態において、前記組換え型Ｃ型肝炎ウイルス粒子はベクターである。

本発明において、組換え型Ｃ型肝炎ウイルス粒子の産生のための好適な方法の１つは、
組換え型Ｃ型肝炎ウイルス粒子を産生する方法であって、
（i）Ｃ型肝炎ウイルスcon1株由来のゲノムRNA上の、5'非翻訳領域と、NS3タンパク質、NS4Aタンパク質、NS4Bタンパク質、NS5Aタンパク質及びNS5Bタンパク質をコードする塩基配列と、3'非翻訳領域とを少なくとも含む塩基配列からなるRNAレプリコン、或いは少なくとも１つの外来遺伝子及び/又は少なくとも１つのIRES配列をさらに含む前記RNAレプリコンを自律複製する細胞に、（ii）Ｃ型肝炎ウイルスがJFH1株由来であって、該Ｃ型肝炎ウイルスのCoreタンパク質、E1タンパク質、E2タンパク質及びp7タンパク質を発現するワクチニアウイルスベクターを導入し、該細胞を培養し、産生した組換え型Ｃ型肝炎ウイルス粒子を回収することを含む、前記方法からなる。

また、本発明において、好適な組換え型C型肝炎ウイルス粒子は、上記の好適な方法によって産生されるものである。

本発明は、さらに、以下の[1]〜[2]を包含する。

[1] 組換え型Ｃ型肝炎ウイルス様粒子を産生する方法であって、
（i）遺伝子型1a、1b、2a、2b、3a及び3bのＣ型肝炎ウイルス株からなる群から選択される少なくとも１種類のウイルス株に由来するゲノムRNA上の、5'非翻訳領域と、NS3タンパク質、NS4Aタンパク質、NS4Bタンパク質、NS5Aタンパク質及びNS5Bタンパク質をコードする塩基配列と、3'非翻訳領域とを含む塩基配列を含むRNAレプリコンを保持する細胞に、
（ii）遺伝子型1a、1b、2a、2b、3a及び3bのＣ型肝炎ウイルス株からなる群から選択される少なくとも１種類のウイルス株であって上記（i）と同じ又は異なるＣ型肝炎ウイルス株由来のCoreタンパク質、E1タンパク質、E2タンパク質及びp7タンパク質を発現するベクターを導入し、
該細胞を培養し、産生されたウイルス様粒子を回収することを含む、前記方法。

この方法においては、前記（i）の遺伝子型1bのＣ型肝炎ウイルス株がcon1株であり、前記（i）の遺伝子型2aのＣ型肝炎ウイルス株がJFH1株であることが好ましい。

またこの方法では、前記（ii）の遺伝子型1aのＣ型肝炎ウイルス株がH77c株、1株、H株、及びHC-J1株であることも好ましい。

この方法では、前記（ii）の遺伝子型1bのＣ型肝炎ウイルス株がJ1株、con1株、TH株、J株、JT株、及びBK株であることも好ましい。

この方法では、前記（ii）の遺伝子型2aのＣ型肝炎ウイルス株がJFH1株、HC-J6株、JCH1株、及びJ6CF株であることも好ましい。

この方法では、前記（ii）の遺伝子型3aのＣ型肝炎ウイルス株がNZL1株、K3a/650株、452株、及びE-b1株であることも好ましい。

この方法では、前記（ii）の遺伝子型3bのＣ型肝炎ウイルス株がTr株であることも好ましい。

さらにこの方法では、前記（ii）のベクターがワクチニアウイルスベクター又はEF-1αプロモーター含有ベクターであることが好ましい。

さらにこの方法では、前記RNAレプリコンは、少なくとも１つの内部リボゾーム結合部位（IRES）配列及び／又は少なくとも１つの外来遺伝子をさらに含むことが好ましい。

そのIRES配列及び／又は外来遺伝子は、前記5'非翻訳領域と前記NS3タンパク質コード配列との間に位置することが好適である。

本方法では、前記細胞は好ましくは動物細胞である。動物細胞としては、Huh7細胞、HepG2細胞又はそれらの細胞から派生した株化細胞がより好ましい。

[2] 上記[1]の方法によって産生される、感染性を有しているが伝搬力を有しない組換え型Ｃ型肝炎ウイルス様粒子。

本発明によって、所望の外来遺伝子を含むHCVサブゲノムRNAをパッケージングした伝搬性のない組換え型感染性HCV様粒子とその製造方法を提供することが可能となった。このような組換え型感染性HCV様粒子は、伝播性が欠如しているという利点を有するために、特に肝臓やリンパ球系の細胞又は組織への遺伝子導入（例えば、遺伝子治療）に使用することができるし、或いはトランスジェニック動物を作製するためのウイルスベクターとして、さらには弱毒化ワクチンとして使用できる、という利点をもつ。

図１は本発明の実施形態の概略図であり、組換え型HCV様粒子の製造工程を示す。a)：HCVサブゲノムRNAレプリコンが導入されたHuh7細胞中では、HCVサブゲノムRNAレプリコンが複製される。ウイルス粒子は産生されない。b)：HCV構造タンパク質発現ベクターがさらに導入されたa)の細胞中では、発現されたHCV構造タンパク質を利用してHCVサブゲノムRNAレプリコンがパッケージングされたウイルス様粒子が産生される。c)：b)で産生されたウイルス様粒子が感染した細胞中では、HCVサブゲノムRNAレプリコンの複製は起こるが、ウイルス子粒子は産生されない。 図２はHCV ゲノムRNA及びHCVサブゲノムRNAのcDNAの構造図を示す。上段がHCV遺伝子型2aから作製したpFH1、中段がpSGR-JFH1である。下段がHCV遺伝子型1bから作製したI389/NS3-3’/wtである。図中の記号は以下のとおりである。T7: T7 RNAプロモーター。5'UTR: 5'非翻訳領域。コア: Coreタンパク質。E1、E2: エンベロープタンパク質。p7: p7タンパク質。NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A、NS5B: 非構造タンパク質。3'UTR: 3'非翻訳領域。Age I、Pme I、Xba I: 制限酵素Age I、Pme I及びXba Iの切断部位。EMCV IRES：脳心筋炎ウイルスの内部リボゾーム結合部位。 図３は本発明のHCV構造タンパク質を発現するためのベクターのマップを示す。具体的には、上段がCAGプロモーターの下流にJFH構造領域遺伝子を挿入して作製したプラスミドクローンpGAGC-p7JFH1、下段がエロンゲーションファクター1αプロモーター配列の下流にJFH構造領域遺伝子を挿入して作製したプラスミドクローンpEF4C-p7JFH1の構造を示す。図中の記号は下記の通りである。CAG：CAGプロモーター、pA：ポリA付加配列、EcoRI：制限酵素EcoRIの切断部位、EF-1α: エロンゲーションファクター1αプロモーター、BGH pA：ウシ成長因子ポリA付加配列。 図４はベクターpDIsHJFHst、pDIsH77st、pDIsJ1st、pDIsJ1(c)/JFH(E1-p7)st及びpDIsJFH(c)/J1(E1-p7)stに挿入されているHCV構造遺伝子のマップを示す。由来するウイルス株の違いを、枠内の網掛けで示している。 図５はレプリコン保持細胞株IH4.1にpEF4C-p7JFH1を導入させ、その細胞の培養上清(sup)をショ糖密度勾配により分画した各画分における、HCV レプリコンRNAの量（A）及びHCV Coreタンパク質の量を示すグラフ(B)である。□：実験１，◆：実験２。 図６はレプリコン保持細胞株5-15にワクチニアウイルスベクターであるDIsJFHstを感染させ、その細胞の培養上清（sup）をショ糖密度勾配により分画した各画分（横軸）における、HCV Coreタンパク質の量（縦軸）を示すグラフである。黒塗りの円はHCV Core（Core）タンパク質、黒塗りの四角はNP40処理した培養上清を用いた結果を示す。実験１は未処理のみの結果（図６Ａ）、実験２は未処理とNP40処理の結果（図６Ｂ）を示す。

１．定義
本明細書中で使用される用語は以下の意味を有する。

「RNAレプリコン」とは、HCVウイルスゲノムを改変して作製される自律複製能を有するRNAを指す。

「自律複製能」とは、プラスミドDNAのように細胞内で自律的に核酸のコピーを再生（すなわち複製）することができる能力をいう。

「感染能」又は「感染性」とは、細胞への接着能及び膜融合能等を保持していることにより、細胞内にウイルス内部の核酸等を導入することのできる能力を指す。

「組換え型Ｃ型肝炎ウイルス」とは、本来のHCVウイルスの持つ性質を遺伝子組換え技術により質的/量的に変化させたウイルスを意味し、例えば本来のウイルスが発現する以外の外来遺伝子を発現する能力を持つウイルス、本来のウイルスが持つ伝搬性やウイルスゲノムの複製能を欠損させたウイルス等が挙げられ、広義には、同じウイルスのタイプ間又はサブタイプ間で遺伝子を組換えたウイルスも含むものとする。

「伝搬性」又は「伝搬力」とは、感染や人工的な手法で核酸が細胞内に導入された後、細胞内に存在する該核酸が複製後、感染性粒子又はそれに準ずる複合体を形成し、別の細胞に伝播することのできる能力を意味する。

「Core」は、HVCのコア構造タンパク質である。

「E1」及び「E2」は、ともにエンベロープ構造タンパク質である。

「NS」は、HCVの非構造タンパク質を指し、ウイルス自身の複製に関与するタンパク質である。「NS2」はメタロプロテアーゼ活性を有する。「NS3」はセリンプロテアーゼ活性（Ｎ末端側の３分の１）とヘリカーゼ活性（Ｃ末端側の３分の２）を有する。「NS4A」はNS3のプロテアーゼ活性に対するコファクターである。「NS4B」は機能が明らかでない。「NS5A」は宿主細胞の情報伝達を制御する活性を有すると考えられている。「NS5B」はRNA依存RNAポリメラーゼ活性を有する。

「IRES配列」とは、RNAの内部にリボゾームを結合させて翻訳を開始させることが可能な内部リボゾーム結合部位を意味する。

「発現可能に」とは、プロモーター、エンハンサーなどの調節配列によって目的遺伝子の転写・翻訳が可能な状態を指す。

２．HCVサブゲノムRNAレプリコン保持細胞
野生型のHCVゲノムは、約3,000アミノ酸の前駆体タンパク質をコードする約9.6kb長の一本鎖RNAよりなる。HCVゲノムは5'非翻訳領域（5'UTR）、Core、E1、E2、p7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A、NS5B、3'非翻訳領域（3'UTR）の順で構成されている。本発明の方法で使用されるHCVサブゲノムRNAレプリコンは、5'非翻訳領域、NS3、NS4A、NS4B、NS5A、NS5B、3'非翻訳領域の順に構成された改変RNAを含む。このRNAレプリコンは、プロモーターなどの調節因子の作用下で複製可能に特定の細胞に導入される。

RNAレプリコンにはさらに、外来遺伝子及び/又はIRES配列が含まれてもよい。外来遺伝子及びIRES配列は、好ましくは、5'非翻訳領域とNS3コード配列との間に外来遺伝子、IRES配列の順に位置することができる。

IRES配列の好適な例としては、以下に限定するものではないがEMCV IRES（脳心筋炎ウイルスの内部リボゾーム結合部位）、FMDV IRES、HCV IRES等が挙げられるが、EMCV IRES及びHCV IRESがより好ましく、EMCV IRESが最も好ましい。

外来遺伝子として、薬剤耐性を示す遺伝子（すなわち、この遺伝子は細胞の選択を可能にする遺伝子であり、該遺伝子を有する細胞はその薬剤に対して耐性をもつようになる。）、例えばネオマイシン、ハイグロマイシン、ピューロマイシン、ゼオシン、ブラストサイジン、チミジンキナーゼ、カナマイシンなどをコードする遺伝子；レポーター遺伝子（すなわち、この遺伝子は遺伝子発現の指標となる遺伝子産物をコードするマーカー遺伝子である。）、例えばルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質（GFP）、β-ガラクトシダーゼなどの発光反応や呈色反応を触媒する酵素をコードする遺伝子；さらには、遺伝子治療用の標的遺伝子又は治療用核酸、例えばヒトを含む哺乳動物において治療を要する疾患の治療に役立つ種々のタンパク質、例えば酵素、サイトカイン、ケイモカイン、ホルモン、抗体、免疫調節分子、腫瘍抑制タンパク質、成長因子、膜タンパク質及び血管作動性タンパク質をコードする遺伝子、アンチセンスRNA、siRNAなどの治療用核酸などが用いられる。

HCVサブゲノムRNAレプリコンの具体的な例として、pSGR-JFH1（図２中段）、I₃₈₉/NS3-3'/wt（図２下段）などが挙げられる。このようなHCVサブゲノムRNAレプリコンは、例えば本発明者らの刊行物であるKato, T. et al. Gastroenterology, 2003 125:1808-1817、国際公開WO 2004/104198（特許文献３）などに記載される方法を使用して作製することができる。

HCV株の塩基配列を用いた系統解析法では、HCVは遺伝子型1a、遺伝子型1b、遺伝子型2a、遺伝子型2b、遺伝子型3a、遺伝子型3bの６タイプに分類され、さらにそれら各タイプがいくつかのサブタイプに分類される。そして、HCVの複数の遺伝子型についてはそのゲノム全長の塩基配列も決定されている（Simmonds, P. et al., Hepatology, 10 (1994) p1321-1324、及びChoo, Q.L et al., Science, 244 (1989) p359-362, Okamoto, H et al., J. Gen. Virol., 73(1992) p673-679、Mori, S. et al., Biochem. Biophis. Res. Commun. 183 (1992) p334-342、国際公開WO 2004/104198）。

具体的には、遺伝子型1aのHCV株としては、H77c株（H77株のコンセンサス配列：GenBankアクセッション番号AF011751）、1株（GenBankアクセッション番号M62321）、H株（GenBankアクセッション番号M67463）、HC-J1株（GenBankアクセッション番号D10749）などが知られている。また遺伝子型1bのHCV株としては、J1株（GenBankアクセッション番号D89815）、con1株（GenBankアクセッション番号AJ238799、Con-1株と称することもある）、TH株（Wakita, T. et al., J. Biol. Chem., (1994) 269, p.14205-14210）、J株（GenBankアクセッション番号D90208）、JT株（GenBank アクセッション番号D01171）、BK株（GenBankアクセッション番号M58335）などが知られている。遺伝子型2aのHCV株としては、JFH1株（GenBankアクセッション番号AB047639、JFH-1株と称することもある）、HC-J6株（GenBankアクセッション番号D00944）、JCH1株（GenBankアクセッション番号AB047640）、J6CF株（GenBankアクセッション番号AF177036）などが知られている。さらに遺伝子型2bのHCV株としては、HC-J8株（GenBankアクセッション番号D01221）などが、遺伝子型3aのHCV株としてはNZL1株（GenBankアクセッション番号D17763）、K3a/650株（GenBankアクセッション番号D28917）、452株（GenBankアクセッション番号DQ437509）、E-b1株（Chan, S. et al., J. Gen. Virol., 73 p1131-1141 (1992)）などが、遺伝子型3bのHCV株としてはTr株（Chayama, K. et al., J. Gen. Virol., 75 p3623-3628 (1994)）などが知られている。また、その他の株についても既にGenBankアクセッション番号のリストが報告されている（Tokita, T. et al., J. Gen. Virol. 79, 1847-1857,1998、Cristina J. & Colina R. Virolgy Journal, 3, 1-8, 2006）。

本発明に使用されるHCVサブゲノムRNAレプリコンを構成するエレメント（すなわち、5'非翻訳領域、NS3、NS4A、NS4B、NS5A、NS5B及び3’非翻訳領域）は、細胞内で複製可能であるようにHCVサブゲノムRNAレプリコンを構成できる限り、上記のいずれの遺伝子型又はそれらのサブタイプの株に由来してもよい。なお、本発明は感染性を有するが伝搬性を有しない組換え型Ｃ型肝炎ウイルス様粒子を産生する方法であり、産生されたウイルス様粒子の伝搬性を欠如させるために、本発明のRNAレプリコンはHCVの構造タンパク質（Core、E1、E2及びp7）のそれぞれをコードする遺伝子を含まないことが好ましい。

上記エレメントの各々は、同一のHCV株に由来してもよいし、２以上の異なるHCV株に由来する混成（キメラ）の形態をとってもよい。好ましいHCV株は、遺伝子型1b及び2aのHCV株からなる群から選択される少なくとも１種の株、より好ましくは遺伝子型1bのHCV株であるcon1株、或いは遺伝子型2aのHCV株であるJFHI株である。なお、本発明におけるHCV株は、例えば親株としてのcon1株又はJFHI株において自然に又は人為的に突然変異が生じて得られた単離株であって、少なくとも遺伝子型が親株のものから変化している株（派生株）であってもよい。このとき表現型形質は親株と同じであっても異なっていてもよいが、形質的に同じ株が好ましい。

HCVサブゲノムRNAレプリコンの例は、JFH1株（遺伝子型2a）以外のHCV株ゲノム由来の、5'非翻訳領域、NS3タンパク質、NS4Aタンパク質、NS4Bタンパク質、NS5Aタンパク質をコードする配列及びJFH1株のNS5Bタンパク質をコードする配列及び3’非翻訳領域からなるHCVサブゲノムRNAレプリコン；JFH1株の5'非翻訳領域、NS3タンパク質、NS4Aタンパク質、NS4Bタンパク質、NS5Aタンパク質、NS5Bタンパク質をコードする配列及び3’非翻訳領域からなるHCVサブゲノムRNAレプリコン；HCV-con1株（遺伝子型1b、GenBank アクセッション番号AJ238799、Lohmann,V. et al., Science 285 (1999) p 110-113）の5'非翻訳領域、NS3タンパク質、NS4Aタンパク質、NS4Bタンパク質、NS5Aタンパク質及びNS5Bタンパク質をコードする配列及び3’非翻訳領域からなるHCVサブゲノムRNAレプリコンなどである。また、これらHCVサブゲノムRNAレプリコンの5'非翻訳領域とNS3タンパク質コード配列の間に所望の外来遺伝子とIRES配列を含有してもよい。

HCV ゲノムRNA上の5’非翻訳領域、構造タンパク質（Core、E1、E2及びp7）、非構造タンパク質（NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A、及びNS5B）、3’非翻訳領域、並びにその他の部位は、例えば遺伝子型2aのHCV JFH1株（特開2002-171978号公報）のゲノムRNAに対応する全長ゲノムcDNA配列（GenBankアクセッション番号AB047639、Kato, T. et al., Gastroenterology, 125 (2003) p.1808-1817；配列番号10。コードされるアミノ酸配列も配列番号11に示す）を基準として規定することができる。

一例として、JFH1株由来の全長ゲノムcDNAについて、本発明においてHCVサブゲノムRNAレプリコンの構成要素として用いられうる5’非翻訳領域は、配列番号10の塩基配列における塩基番号1〜340であり、またCore（コア）タンパク質からp7タンパク質まで（Core、E1、E2、p7）をコードする領域は、塩基番号341〜2779であり、NS3タンパク質から3’非翻訳領域まで（NS3、NS4A、NS4B、NS5A、NS5B、3'UTR）をコードする領域は塩基番号3431〜9678である。このJFH1株由来の各領域の配列との比較により、他のHCV株由来のゲノムcDNAについても各領域を特定することができる。

HCVサブゲノムRNAレプリコンを得るために、DNA配列からRNAを転写するプロモーターの下流に該HCVサブゲノムRNAの相補的なDNAをクローン化したベクターを用いて、DNA依存的RNAポリメラーゼにより合成することができる。DNA配列からRNAを転写するプロモーターとして、T7，T3，SP6などが挙げられるが、T7プロモーターが好適であり、T7ポリメラーゼによりHCVサブゲノムRNAを合成することができる。このようして合成されたHCVサブゲノムRNAをHCVの増殖を許容する細胞に導入することで、該HCVサブゲノムRNAレプリコンを自律複製する細胞を作製することができる。

細胞としては、動物細胞、例えば魚類、爬虫類、両生類、鳥類及び哺乳動物細胞などの脊椎動物細胞が好ましく、哺乳動物細胞が最も好ましい。さらに例示すると、細胞には、肝臓、子宮頸、胎児腎由来の正常細胞、腫瘍細胞、それらの株化細胞などが含まれ、例えばHuh7, HepG2, IMY-N9, HeLa, HEK293などの細胞（Date, T. et al., J. Biol. Chem., 279, p.22371-22376, (2004)、Ito, T. et al., Hepatology 34, p.566-572, (2001)）好ましくはHuh7、HepG2又はこれらの細胞から派生するクローンが挙げられる。

培養細胞で該HCVサブゲノムRNAを複製させる別の方法として、RNAレプリコンを使用せず、HCV cDNAを利用した系を挙げることができる。HCV cDNAをRNAポリメラーゼII型のプロモーターで発現させると、転写されたRNAの5’末端にはCAP構造が、3’末端にはポリA鎖が付加され、リボゾームにてタンパク質合成の鋳型として利用されてしまい、HCVゲノム RNAの複製が起こらない。この問題を解決するために、Hellerらは、HCV ゲノムの5’末端と3’末端にリボザイム配列を連結し、細胞内でRNAポリメラーゼIIにて転写された後、リボザイムで切断させることにより、キャップとポリAが付加していないHCV RNAを細胞内で合成ができるようなDNAベクターを作製した（Heller T et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 102, p.2579-2583, 2005）。このベクターを細胞内に導入することで、HCVサブゲノムRNAレプリコンを複製する細胞を得ることができる。

さらに別の方法として、該HCVサブゲノムRNAの相補的なDNAをRNAポリメラーゼI プロモーター/ターミネーター系のベクターにクローン化し、該ベクターをHCVの増殖を許容する細胞に導入することで、該HCVサブゲノムRNAレプリコンを複製する細胞を得ることができる。より具体的には、pHH21（Neumann G. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96 (1999) p9345-9350）を使用できる。pHH21は、プロモーターにヒトRNAポリメラーゼIプロモーター、ターミネーターにマウスRNAポリメラーゼIターミネーターからなるベクターである。HCVサブゲノムレプリコンRNAに対するcDNAの５’端及び３’端に、PCRを用いて制限酵素BsmBI認識配列をそれぞれ付加した後、BsmBIで消化し、pHH21のBsmBI部位にHCVゲノムを挿入すると、プロモーター／ターミネーターとHCVゲノムの間に余分な塩基配列を含むことなく連結できる。

HCVサブゲノムRNAレプリコン、又はHCVサブゲノムRNAレプリコンを発現するベクター等を始めとするベクターの細胞内導入は、当業者に公知の任意の技術を使用して行うことができる。そのような導入方法としては、例えば、エレクトロポレーション、パーティクルガン法、リポフェクション法、リン酸カルシウム法、マイクロインジェクション法、DEAEデキストラン法等が挙げられる。

本発明では、以上の記載に従い、本発明にかかるHCVサブゲノムRNAレプリコンを細胞内で複製している細胞を作製することができる。そのようなRNAレプリコンは、当該細胞中で持続的に自律複製しているため、RNA分解を受ける細胞内でもある程度の量で維持される。従って、上記のように本発明にかかるHCVサブゲノムRNAレプリコン、又はHCVサブゲノムRNAレプリコンを発現するベクター等が細胞内導入された細胞は、そのRNAレプリコンを保持することができる。本発明において「RNAレプリコンを保持する細胞」とは、当該RNAレプリコンが、その自律複製能により、有意な量で一過性でなく持続的に細胞内に存在していることを意味する。

本発明の方法では、本発明のHCVサブゲノムRNAレプリコンを保持する細胞に後述するHCV構造タンパク質発現ベクターを導入し発現させることにより、HCVサブゲノムRNAレプリコンがパッケージングされたウイルス様粒子を産生させることができる。

３．HCV構造タンパク質発現ベクターの構築
本発明の方法においては、HCVサブゲノムRNAレプリコンを保持する細胞内でHCV構造タンパク質遺伝子を発現させて、HCV構造タンパク質を供給することが好ましい。

HCV構造タンパク質はCore、E1、E2、p7からなる。HCV構造タンパク質を供給するためのこれらのタンパク質をコードする遺伝子は、HCVの遺伝子型に限定されるものではなく、該遺伝子の各々は、同一のHCV株に由来してもよいし、或いは２以上の異なるHCV株に由来して混成（キメラ）の形態をとってもよい。HCV構造タンパク質遺伝子の由来としては、1a、1b、2a、2b、3a及び3bのHCV株から選択される少なくとも１種類のウイルス株であればよいが、好ましいHCV株は、1a、2a、3a及び3bからなる群から選択される少なくとも１種類のウイルス株であり、より好ましいHCV株は、遺伝子型1b及び2aのHCV株からなる群から選択される少なくとも１種類のウイルス株である。さらに好ましくは遺伝子型1aのH77c株、1株、H株及びHC-J1株など、遺伝子型1bのJ1株、con1株、TH株、J株、JT株及びBK株など、または遺伝子型2aのJFH1株、HC-J6株、JCH1株及びJ6CF株などからなる群から選択される少なくとも１種類のウイルス株である。さらに好ましくは遺伝子型1aのH77株、遺伝子型1bのJ1株または遺伝子型2aのJFH1株、最も好ましくはJFH1株（GenBank アクセッション番号AB047639、Kato, T. et al., Gastroenterology, 125 (2003) p1808-1817）である。

これらのタンパク質を発現させる方法として、細胞、好ましくは動物細胞、より好ましくは哺乳動物細胞で発現できる方法であればいずれの方法であってもよい。好ましい方法は、上記遺伝子を組み込んだ発現ベクターを使用する方法である。

本発明の好適な方法においては、HCV構造タンパク質を供給するために、HCV構造タンパク質発現ベクター（好ましくは、HCV構造タンパク質遺伝子をプロモーター制御下に発現されうる形で含む発現ベクター）を、上記２に記載したHCVサブゲノムRNAレプリコンを保持する細胞に導入し、発現させる。

発現させるベクターとして、CDM8、pEF1/Myc-His1,2,3、pEF4/Myc-His1,2,3、pcDNA3.1、pREP4、pCEP(いずれもインビトロジェン社)、pCl-neo（プロメガ社）などが挙げられる。テトラサイクリンでプロモーターの発現を調整できるプロモーターを含むpcDNA5/TO（インビトロゲン社）も使用できる。プロモーターとしては、動物細胞中で発現できるものであればよく、サイトメガロウイルスのIE(immediate early)プロモーター、SV40初期又は後期プロモーター、メタロチオネインプロモーター、レトロウイルスプロモーター、ヒートショックプロモーター、SRαプロモーター、エロンゲーションファクター1αプロモーター、アルブミンプロモーター等があげられる。

さらに、利用可能なベクターとしてウイルスベクターを挙げることができる。動物細胞に感染して、所望の外来遺伝子を発現させることが出来るウイルスベクターであればよいが、好ましくは、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、シンドビスウイルスベクター、ワクチニアウイルスベクターが挙げられ、特にワクチニアウイルスベクターは大量の遺伝子産物を発現することができることから（Elroy-Stein, O., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86 (1989) p6126-6130）、ワクチニアウイルスベクターが好適である。

本発明の方法で用いるHCV構造タンパク質発現ベクターは、HCV構造タンパク質遺伝子として、Coreタンパク質遺伝子、E1タンパク質遺伝子、E2タンパク質遺伝子、及びp7タンパク質遺伝子を、宿主細胞内で発現されうる状態で含むことが好ましい。本発明にかかるそのようなHCV構造タンパク質発現ベクターの例は、Coreタンパク質遺伝子、E1タンパク質遺伝子、E2タンパク質遺伝子、及びp7タンパク質遺伝子を、挿入遺伝子の発現を可能にするプロモーターの制御下に含むベクターである。本発明では、Coreタンパク質遺伝子、E1タンパク質遺伝子、E2タンパク質遺伝子、及びp7タンパク質遺伝子を、エロンゲーションファクター1α（EF-1α）プロモーターの制御下に挿入した、エロンゲーションファクター1αプロモーター含有ベクターを、特に好適なHCV構造タンパク質発現ベクターとして用いることができる。ここで「エロンゲーションファクター1αプロモーター含有ベクター」とは、エロンゲーションファクター1α遺伝子のプロモーター配列（EF-1αプロモーター；Mizushima et. al., Nucleic Acids Res., 1990, 18, 5322）を、その制御下にある遺伝子を宿主細胞内で発現させることができるような配置で含有するベクターを意味する。例としては、pEF1/Myc-His1,2,3、pEF4/Myc-His1,2,3（いずれもインビトロジェン社）がある。

本発明にかかるHCV構造タンパク質発現ベクターの別の好適な例は、Coreタンパク質遺伝子、E1タンパク質遺伝子、E2タンパク質遺伝子、及びp7タンパク質遺伝子を発現可能な状態で含む、ワクチニアウイルスベクター（組換え型ワクチニアウイルスベクター）である。組換え型ワクチニアウイルスベクターの作製には、例えば、DIs株、WR株、IBTd株（Meis, RJ & Condit, RC. Virol. 182, 442-454, (1992)）などのワクチニアウイルス株を好適に使用することができる。組換え型ワクチニアウイルスベクターの作製方法については、後述の実施例にも詳述されている。簡単に説明すると、ワクチニアウイルス・トランスファーベクター中のp.7.5などのワクチニアウイルスプロモーターの制御下に上記HCV構造タンパク質遺伝子をクローニングし、さらにそのトランスファーベクターを、ワクチニアウイルスを感染させた細胞に電気穿孔法等により導入し、その細胞を培養してウイルス粒子を産生させ、さらに好ましくはそのウイルスを選抜し純化することにより、目的の組換え型ワクチニアウイルスベクターを製造することができる。このようなワクチニアウイルスベクターは、組換えウイルス様粒子の形態で調製することができる。

HCVの構造タンパク質（Core、E1、E2、p7）と非構造タンパク質（NS3、NS4A、NS4B、NS5A、及びNS5B）は、翻訳領域から一続きのポリプロテインとして翻訳された後、プロテアーゼによる限定分解を受けて遊離、生成されるので、これらHCV構造タンパク質を発現させる場合、Core、E1、E2、p7の一続きのポリプロプロテインとして発現させるのが望ましいが、これらのタンパク質を別々の発現ベクターで発現させてもよい。

構造タンパク質発現ベクターを導入した細胞が構造タンパク質を発現しているかの確認は、細胞培養液若しくは細胞から抽出したタンパク質を構造タンパク質に対する抗体と反応させることによって検出することができる（国際公開WO 2004/104198）。

具体的には、例えば、細胞から抽出したタンパク質試料をSDS-ポリアミドゲル電気泳動にて分画後、ニトロセルロース膜にブロッティングし、それに対して抗HCVタンパク質抗体（例えば、抗コア特異的抗体、又はＣ型肝炎患者から採取した抗血清）を反応させ、さらにその抗体を検出する（ウエスタンブロット法）ことによって行うことができる。

或いは、同様の抗体を用いて、HCVタンパク質を発現している細胞を免疫染色し、これらのタンパク質の発現と細胞内局在を確認することができる。

４．HCVサブゲノムRNAレプリコンの粒子へのパッケージング
本発明の方法では、HCVサブゲノムRNAレプリコンを保持する細胞内に、HCV構造タンパク質を発現するベクターを供給することにより、その細胞内で、HCVサブゲノムRNAレプリコンが構造タンパク質によってパッケージングされたウイルス様粒子を産生させる。

HCVサブゲノムRNAレプリコンを複製している細胞のHCVサブゲノムRNAレプリコンをウイルス粒子にパッケージングするには、該細胞に構造タンパク質（Core、E1、E2、p7）発現ベクターを導入し発現させればよい。あるいは、構造タンパク質（Core、E1、E2、p7）を安定的に発現させた細胞にHCVサブゲノムRNAを導入してもよい。

そのような導入方法としては、例えば、エレクトロポレーション、パーティクルガン法、リポフェクション法、リン酸カルシウム法、マイクロインジェクション法、DEAEデキストラン法などの公知の方法が挙げられる。

５．組換え型HCVウイルス様粒子の産生
上記のようにして作製される、HCVサブゲノムRNAレプリコンを保持する細胞においてHCV構造タンパク質（Core、E1、E2、p7）遺伝子を導入し発現させた細胞（組換え型HCV様粒子産生細胞）は、組換え型ウイルス様粒子を産生することができる。産生された組換え型HCV様粒子は感染能をもち、HCVサブゲノムRNAを複製する能力をもつが、感染細胞で子ウイルス粒子を産生できないので、結果として伝搬性（伝搬力）を持たない。

従って、本発明の組換え型HCV粒子産生細胞を培養することにより、組換え型HCV様粒子を細胞培養系にて作製することができる。好ましくは、組換え型HCV様粒子産生細胞を培養し、その培養物（好ましくは培養液）中に産生されたウイルス様粒子を回収することにより、HCV様粒子を取得できる。ウイルス様粒子は、例えば前記培養液からショ糖密度勾配遠心分離などの手法によって回収することができる。

本発明の組換え型HCV様粒子産生細胞のウイルス粒子産生能は、当業者に公知の任意のウイルス検出法に従って確認すればよい。例えば、ウイルス様粒子を産生していると思われる細胞の培養液をショ糖密度勾配により分画し、各分画の密度とその分画のHCVコアタンパク質濃度あるいはHCVレプリコンRNA濃度を測定することにより、従来知られているHCVの比重と一致するか否かで判断できる。さらに、コアタンパク質のピークが検出される画分の密度が、0.25％ NP40（ポリオキシエチレン(9)オクチルフェニルエーテル[Polyoxyethylene(9)Octylphenyl Ether]）で処理してから分画した場合の同画分の密度と比較して軽い場合には、該細胞はウイルス様粒子産生能を有すると判定することができる。

また、組換え型HCV様粒子産生細胞のウイルス様粒子が感染能を持つか否かは、該ウイルス粒子にパッケージングされたHCVサブゲノムRNAに存在する外来遺伝子の表現型を検出すればよい。例えば、外来遺伝子が薬剤抵抗性の遺伝子であれば、HCV許容性細胞に、該ウイルス粒子を接種し、該薬剤存在下で、通常２〜３週間培養し、薬剤抵抗性のクローンをカウントすることで評価できる。

さらに組換え型HCV様粒子産生細胞のウイルス様粒子が感染細胞で子ウイルス粒子を生産しないことを確認するには、感染細胞の抽出物、好ましくは感染細胞培養上清中の試料にHCV構造タンパク質が存在するか否かを上述した、ウエスタンブロット法等により判断できる。

本発明の方法で産生される組換え型HCV様ウイルス粒子は、細胞（好ましくはHCV許容性細胞）への感染能を有する。組換え型HCV様粒子産生細胞を培養し、得られた培養物（好ましくは、培養液）中のウイルス様粒子を他の細胞（好ましくはHCV許容性細胞）に感染させることを含む、組換え型Ｃ型肝炎ウイルス感染細胞の製造方法も提供する。ここで、HCV許容細胞とは、HCVゲノムRNAの複製能及び/又はHCVに感染する能力を有する細胞であり、これらに限定されるものではない。具体的には、肝臓細胞としては初代肝臓細胞や、Huh7細胞、HepG2細胞、IMY-N9細胞、HeLa細胞、などが挙げられ、リンパ球系細胞としてはMolt4細胞、HPB-Ma細胞、Daudi細胞などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。

なお、理解し易いように、上記２節から５節で説明した組換え型HCV様粒子の産生工程を、慨説的に図１に例示した。

６．遺伝子導入用ベクター
本発明の方法で産生された本発明の組換え型HCV様粒子は、そのRNAゲノム上に、上記HCV株（遺伝子型1a, 1b, 2a, 2b, 3a及び3b、好ましくは1b及び2aから選択される少なくとも１種類のウイルス株、例えば遺伝子型1bのcon1株又は遺伝子型2aのJFH1株）由来の、5'非翻訳領域と、NS3タンパク質、NS4Aタンパク質、NS4Bタンパク質、NS5Aタンパク質及びNS5Bタンパク質をコードする塩基配列と、3'非翻訳領域とを含む塩基配列を含む、という特徴を有する。

これに加えて、本発明の方法で組換え型HCV様粒子産生細胞において産生されたHCV様粒子を細胞（例えば、上記例示のHCV許容性細胞）に感染させると、その感染細胞中では上記のようなHCVサブゲノムRNAが複製されるが、子ウイルス粒子は形成されない、という興味深い特徴を有する。

本発明の組換え型HCV様粒子には、それにパッケージングされるHCVサブゲノムRNAレプリコンに所望の外来遺伝子を挿入することにより、遺伝子導入／発現用のベクターとして用いることができる。そのような外来遺伝子を含む本発明の組換え型HCV様ウイルス粒子は、該外来遺伝子を5'非翻訳領域とIRES配列との間に挿入したHCVサブゲノムRNAレプリコンを作製し、それを上記の本発明の方法でパッケージングすることによって、作製することができる。組換え型HCV粒子産生細胞において産生されたHCV粒子は伝搬力がないので、例えば肝臓やリンパ球系細胞又は組織をターゲットとした遺伝子導入のためのベクターとしても使用可能である。

本発明のウイルス粒子産生の方法でウイルス粒子中にパッケージングしたHCVサブゲノムRNAは、本発明のウイルス様粒子によって感染されたHCV許容性細胞内では染色体ゲノムに組み込まれることがないので遺伝子の挿入により正常遺伝子が損傷を受けたり挿入された近辺の遺伝子を活性化したりすることがなく、有利である。

上記の特性のために、本発明のベクターは、外来遺伝子を導入して、例えば遺伝子治療やトランスジェニック動物の作製のために使用することができる。

HCVサブゲノムRNAレプリコンに導入してウイルス粒子にパッケージングされる外来遺伝子（又は外来核酸）としては、ヒトを含む哺乳動物由来のタンパク質、例えば疾患に関わる種々のタンパク質、例えば酵素、サイトカイン、ケイモカイン、ホルモン、抗体、免疫調節分子、腫瘍抑制タンパク質、成長因子、膜タンパク質及び血管作動性タンパク質などのタンパク質、ポリペプチド又はペプチドをコードする遺伝子、タンパク質の翻訳を阻止若しくは抑制するアンチセンスRNA、siRNAなどの治療用核酸などが挙げられるが、特に限定されるものではない。

標的HCV感受性細胞又は組織は、哺乳動物細胞又は組織、好ましくはヒト細胞又は組織、例えばヒト肝臓及びリンパ球系の細胞又は組織である。標的細胞又は組織に対し、本発明のベクターを、in vivo、in vitro或いはex vivo条件下で作用させる。好ましくは、ヒトの治療、例えば遺伝子治療、癌（例えば肝臓癌、リンパ腫など）の治療などのために、本発明のベクターを使用することができる。

本明細書は本願の優先権主張の基礎とする日本国特許出願2005-287825号の明細書及び／又は図面に記載される内容を包含する。

本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願の全体が参照により本明細書に組み入れられるものとする。

以下に実施例を挙げて、本発明をより具体的に説明する。しかし、これらの実施例は説明のためのものであり、本発明の範囲を制限するものではない。

（実施例１）
レプリコン保持細胞の作製
劇症肝炎の患者から分離したＣ型肝炎ウイルスであるJFH-1株（遺伝子型2a）のゲノム全長cDNAを含むDNA（JFH-1クローン：GenBankアクセッション番号AB047639）をpUC19プラスミド中のT7プロモーターの下流に挿入したpJFH1から、構造領域と非構造領域の一部を、ネオマイシン耐性遺伝子（neo；ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子とも称する）及びEMCV-IRES（脳心筋炎ウイルスの内部リボゾーム結合部位）で置換して、プラスミドDNA pSGR-JFH1を構築した（図２の中段）。この構築手順は、既報（Lohmann et al., Science, (1999) 285, p. 110-113）に従った。

具体的には、プラスミドpJFH1を制限酵素AgeI及びClaIで切断し、その切断部位にpJFH1由来の5'NTRからCore領域におよぶ配列とpRSV5NEO由来のネオマイシン耐性遺伝子とをPCR増幅により結合し制限酵素AgeIとPmeIで切断した断片、及びEMCV IRESからNS3領域におよぶ配列をPCR増幅により結合し制限酵素PmeIとClaIで切断した断片を、挿入し連結した。

次に、pSGR-JFH1を制限酵素XbaIで切断した。次いで、これらのXbaI切断断片のそれぞれ10〜20μgを、Mung Bean Nuclease 20ユニット（総反応液量 50μl）を用いて30℃で30分間インキュベートして、さらに処理した。Mung Bean Nucleaseは、二本鎖DNA中の一本鎖部分を選択的に分解する反応を触媒する酵素である。通常、上記XbaI切断断片をそのまま鋳型として用いてRNA合成を行うと、XbaIの認識配列の一部であるCTGAの４塩基が３'末端に余分に付加されたレプリコンRNAが合成されてしまう。そこで本実施例では、XbaI切断断片をMung Bean Nucleaseで処理することにより、XbaI切断断片からCTGAの４塩基を除去した。この後、XbaI切断断片を含むMung Bean Nuclease処理後の溶液について、通常法に従ったタンパク質除去処理により、CTGAの４塩基が除去されたXbaI切断断片を精製して、これを鋳型DNAとした。

次に、この鋳型DNAから、T7 RNAポリメラーゼを用いてRNAをin vitro合成した。このRNA合成にはAmbion社のMEGAscriptを用いた。鋳型DNAを0.5〜1.0μg含む反応液20μlを製造業者の使用説明書に従って反応させた。

RNA合成終了後、反応溶液にDNase（２ユニット）を添加して37℃で15分間反応させた後、さらに酸性フェノールによるRNA抽出を行って、鋳型DNAを除去した。

このRNA（レプリコンRNA）0.01ng〜10μgをHuh7細胞から抽出したトータル細胞性RNAと混合して、RNA総量が10μgとなるように調整した。次いで、その混合RNAをエレクトロポレーション法によりHuh7細胞に導入した。エレクトロポレーション処理を行ったHuh7細胞を培養ディッシュに播種し、16時間から24時間培養した後に、培養ディッシュにG418（ネオマイシン）を様々な濃度で添加した。その後、週に2回培養液を交換しながら培養を継続した。上記の培養21日後の培養ディッシュから生存細胞のコロニーをクローン化し、培養を継続した。このようなコロニーのクローニングにより、細胞クローンを複数株樹立することができた。HCVサブゲノムRNAレプリコンを保有する一つの細胞株を1H4.1と名付けた。

また、HCV遺伝子型1bのCon-1株由来のゲノム全長cDNAから上記と同様な方法で作製されたHCVサブゲノムRNAレプリコン（GenBankアクセッション番号：AJ242654；図２の下段のI₃₈₉/NS3-3'/wt）がHuh7細胞株に導入されて作製された、該RNAレプリコンを保持している細胞株である5-15細胞（Lohmann et al., Science, (1999) 285, p. 110-113）も実験に使用した。

（実施例２）
構造タンパク質発現ベクターの作製
１）構造タンパク質発現プラスミドベクター
劇症肝炎から分離したJFH1株（GenBankアクセッション番号AB047639）（Kato T. et al., J. Med. Viol. 2001, 64:334-339）の構造領域遺伝子（塩基配列番号249〜2781）を含む領域をPCRで増幅した。このDNA断片をNheIとEcoRIで消化して得られる構造遺伝子を含む断片をアガロースゲル電気泳動で精製し、DNAポリメラーゼにて平滑末端とした。この平滑末端化したcDNAをプラスミドベクター中のCAGプロモーター配列（CAG）の下流に挿入した。同様に、前記NheIとEcoRIで消化して得られた構造領域遺伝子を含むcDNAを、エロンゲーションファクター1α遺伝子プロモーター配列（EF-1αプロモーター；Mizushima et. al., Nucleic Acids Res., 1990, 18, 5322）を持つベクターであるpEF4/Myc-His（インビトロジェン社）のSpeIとEcoRI間に挿入した。その結果得られたプラスミドをそれぞれpCAGC-p7JFH1、pEF4C-p7JFH1と命名した（図３）。

２）構造タンパク質を発現する組換えワクチニアウイルスベクター
JFH1株の構造遺伝子を含有し、それがコードするタンパク質を発現可能なベクターを作製するために、まず図３上段に示したpEF4C-p7JFH1を制限酵素BamHIとEcoRIで消化し、Coreタンパク質、E1タンパク質、E2タンパク質及びp7タンパク質をコードする領域をアガロースゲル電気泳動にて分取した。次にこの断片を、目的とする外来遺伝子と共にXGPRT遺伝子が挿入されるように設計されたワクチニアウイルストランスファーベクターpDIsgptmH5に連結した（Ohnishi, K. et al., Jap. J. Infect. Dis. 58 (2005) p88-94、Ishii, K. et al., Virology 302 (2002) p.433-444）。このpDIsgptmH5は、pUc/DIsベクターのクローニングサイトに挿入されたワクチニアウイルスp7.5プロモーターの制御下に大腸菌（Escherichia coli）のキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（XGPRT）遺伝子が組み込まれたトランスファーベクターである（Ishii, K. et al., Virology 302 (2002) p.433-444）。得られたベクターをpDIsJFHstと名付けた。

H77c株の構造遺伝子を含有し、それがコードするタンパク質を発現可能であるベクターを、以下の方法で作製した。まずH77c株のHCVゲノムcDNA（GenBank アクセッション番号 AF011751）をクローン化したベクターを鋳型として、LA-PCRキット（タカラバイオ社）に添付されていた、10×緩衝液を5μl、2.5mM dNTP混合液を5μl、10μMのプライマーH77/J1 forward（AAAGATCTGCGAAAGGCCTTGTGGTACTGC：配列番号1）及びH77 reverse（AAGAGCTCTCATAACCCGACAAGAACAACGCCGCC：配列番号2）をそれぞれ1μl加え、最終的に脱イオン水を加え全量を49μlとした。次にTakara LA Taq（タカラバイオ社）を1μl加えてから、PCR反応を行った。PCR反応は、98℃20秒、68℃5分からなる工程を1サイクルとして25サイクルの条件で行った。このPCR産物の一部についてアガロースゲルにて電気泳動を行ったところ、約2.5kbの増幅産物が確認された。

そこで、このPCR産物2μlを用いて、増幅産物をプラスミドベクター中に連結するライゲーション反応を行った。このライゲーション反応物を用いて常法に従い大腸菌を形質転換し、得られた形質転換体よりプラスミドDNAを調製した。このプラスミドDNAに挿入されたDNA断片を切り出すことのできる制限酵素で消化し、アガロースゲル電気泳動に供して、そのプラスミドDNAに約2.5kbのDNA断片が挿入されていることを確認した。挿入されているDNA断片の塩基配列は常法により決定した。その結果決定された塩基配列は、GenBankアクセッション番号AF011751の塩基配列の271番から2819番までの配列と一致していた。次いでこのプラスミドDNAを、BglIIとSacIで消化し、アガロース電気泳動に供して、H77c株の構造遺伝子領域を含むDNA断片を単離し、ワクチニアウイルストランスファーベクターpDIsgptmH5（Ohnishi, K. et al., Jap. J. Infect. Dis. 58 (2005) p88-94、Ishii, K. et al., Virology 302 (2002) p433-444）に連結した。その結果得られたベクターをpDIsH77stと名付けた。

JI株の構造遺伝子を含有し、それがコードするタンパク質を発現可能であるベクターを、以下の方法で作製した。J1株のHCVゲノムcDNA（GenBankアクセッション番号D89815）をクローン化したベクターを鋳型として、LA-PCRキット（タカラバイオ社）に添付されていた、10×緩衝液を5μl、2.5mM dNTP混合液を5μl、10μMのプライマーH77/J1 forward（AAAGATCTGCGAAAGGCCTTGTGGTACTGC：配列番号1）及びJ1 reverse（AAGAGCTCTCATAGACCTACAAAAACCCCGCCTCC：配列番号3）をそれぞれ1μl加え、最終的に脱イオン水を加え全量を49μlとした。次にTakara LA Taq（タカラバイオ社）を1μl加えてから、PCR反応を行った。PCR反応は、98℃20秒、68℃5分からなる工程を1サイクルとして25サイクルの条件で行った。このPCR産物の一部についてアガロースゲルにて電気泳動を行ったところ、約2.5kbの増幅産物が確認された。そこで、このPCR産物2μlを用いて、増幅産物をプラスミドベクター中に連結するライゲーション反応を行った。このライゲーション反応物を用いて常法に従い大腸菌を形質転換し、得られた形質転換体よりプラスミドDNAを調製した。このプラスミドDNAに挿入されたDNA断片を切り出すことのできる制限酵素で消化し、アガロースゲル電気泳動に供して、そのプラスミドDNAに約2.5kbのDNA断片が挿入されていることを確認した。挿入されているDNA断片の塩基配列は常法により決定した。その結果決定された塩基配列は、GenBankアクセッション番号D89815の塩基配列の271番から2819番までの配列と一致していた。次いでこのプラスミドDNAを、BglIIとSacIで消化し、アガロース電気泳動に供して、J1株の構造遺伝子領域を含むDNA断片を単離し、ワクチニアウイルストランスファーベクターpDIsgptmH5（Ohnishi, K. et al., Jap. J. Infect. Dis. 58 (2005) p88-94、Ishii, K. et al., Virology 302 (2002) p.433-444）に連結した。その結果得られたベクターをpDIsJ1stと名付けた。

J1株由来のCore遺伝子とJFH1株由来のE1、E2、p7遺伝子とからなるキメラ構造遺伝子配列を含有し、それらがコードするタンパク質を発現可能であるベクターを、以下の方法で作製した。まずJ1株のCore遺伝子を増幅するために、J1株のHCVゲノムcDNA（GenBank アクセッション番号D89815）をクローン化したベクターを鋳型として、LA-PCRキット（タカラバイオ社）に添付されていた、10×緩衝液を5μl、2.5mM dNTP混合液を5μl、10μMのプライマーH77/J1 forward（配列番号1）及びJ1/JFH1 reverse（GTAGCTGCTACTGGTATTCTTCACCTGGGCAGCGGAAGCTGGGATGGTCAAACAGGACAG：配列番号4）をそれぞれ1μl加え、最終的に脱イオン水を加え全量を49μlとした。次にTakara LA Taq（タカラバイオ社）を1μl加えてから、PCR反応を行った。PCR反応は、98℃20秒、68℃5分からなる工程を1サイクルとして25サイクルの条件で行った。JFH1株のE1、E2、p7遺伝子を増幅するために、JFH1株のHCVゲノムcDNA（GenBankアクセッション番号AB047639）をクローン化したベクターを鋳型として、LA-PCRキット（タカラバイオ社）に添付されていた、10×緩衝液を5μl、2.5mM dNTP混合液を5μl、10μMのプライマーJ1/JFH1 forward（CTGTCCTGTTTGACCATCCCAGCTTCCGCTGCCCAGGTGAAGAATACCAGTAGCAGCTAC：配列番号5）及びJFH1 reverse（AAGAGCTCTCAATCAATATCAACAAACCCACGCCT：配列番号6）をそれぞれ1μl加え、最終的に脱イオン水を加え全量を49μlとした。次にTakara LA Taq（タカラバイオ社）を1μl加えてから、PCR反応を行った。PCR反応は、98℃20秒、68℃5分からなる工程を1サイクルとして25サイクルの条件で行った。得られたそれぞれの増幅断片を精製し、50μlのH₂Oに溶かし、それぞれ1μlを100倍希釈して各1μlを1つに混合した。この混合液をテンプレートとし、プライマーを加えずに上記の条件でLA-PCRを5サイクル行った。その後、プライマーH77/J1 forward（配列番号1）及びJFH1 reverse（配列番号6）を添加し、さらにLA-PCRを10サイクル行い、増幅したキメラDNA断片を精製した。この断片をプラスミドベクターにクローン化し、そのDNA断片の塩基配列を決定した。その結果、そのDNA断片が、J1株由来のCore遺伝子とJFH1株由来のE1、E2、p7遺伝子とからなるキメラ構造遺伝子配列であることが確認された。次にこのプラスミドをBglIIとSacIで消化して得られる断片をワクチニアウイルストランスファーベクターpDIsgptmH5（Ohnishi, K. et al., Jap. J. Infect. Dis. 58 (2005) p88-94、Ishii, K. et al., Virology 302 (2002) p433-444）に連結した。その結果得られたベクターをpDIsJ1(c)/JFH1(E1-p7)stと名付けた。

JFH1株由来のCore遺伝子とJ1株由来のE1、E2、p7遺伝子とからなるキメラ構造遺伝子配列を含有し、それらがコードするタンパク質を発現可能であるベクターを、以下の方法で作製した。まずJFH1株のCore遺伝子を増幅するために、JFH1株のHCVゲノムcDNA（GenBankアクセッション番号AB047639）をクローン化したベクターを鋳型として、LA-PCRキット（タカラバイオ社）に添付されていた、10×緩衝液を5μl、2.5mM dNTP混合液を5μl、10μMのプライマーJFH1 forward（AAAGATCTGCGAAAGGCCTTGTGGTACTGC：配列番号7）及びJFH1/J1 reverse（GGTATATCCCGGACACGTTGCGCACTTCATAAGCAGAGACCGGAACGGTGATGCAGGAC：配列番号8）をそれぞれ1μl加え、最終的に脱イオン水を加え全量を49μlとした。次にTakara LA Taq（タカラバイオ社）を1μl加えてから、PCR反応を行った。PCR反応は、98℃20秒、68℃5分からなる工程を1サイクルとして25サイクルの条件で行った。J1株のE1、E2、p7遺伝子を増幅するために、J1株のHCVゲノムcDNA（GenBankアクセッション番号D89815）をクローン化したベクターを鋳型として、LA-PCRキット（タカラバイオ社）に添付されていた、10×緩衝液を5μl、2.5mM dNTP混合液を5μl、10μMのプライマーJFH1/J1 forward（GTCCTGCATCACCGTTCCGGTCTCTGCTTATGAAGTGCGCAACGTGTCCGGGATATACC：配列番号9）及びJ1 reverse（AAGAGCTCTCATAGACCTACAAAAACCCCGCCTCC：配列番号3）をそれぞれ1μl加え、最終的に脱イオン水を加え全量を49μlとした。次にTakara LA Taqを1μl加えてから、PCR反応を行った。PCR反応は、98℃20秒、68℃5分からなる工程を1サイクルとして25サイクルの条件で行った。得られたそれぞれの増幅断片を精製し、50μlのH₂Oに溶かし、それぞれ1μlを100倍希釈して各1μlを1つに混合した。この混合液をテンプレートとし、プライマーを加えずに上記の条件でLA-PCRを5サイクル行った。その後、プライマーJFH1 forward（配列番号7）及びJ1 reverse（配列番号3）を添加し、さらにLA-PCRを10サイクル行い、増幅したキメラDNA断片を精製した。この断片をプラスミドベクターにクローン化し、そのDNA断片の塩基配列を決定した。その結果、そのDNA断片が、JFH1株由来のCore遺伝子とJ1株由来のE1、E2、p7遺伝子とからなるキメラ構造遺伝子配列であることが確認された。次にこのプラスミドをBglIIとSacIで消化して得られる断片をワクチニアウイルストランスファーベクターpDIsgptmH5（Ohnishi, K. et al., Jap. J. Infect. Dis. 58 (2005) p88-94、Ishii, K. et al., Virology 302 (2002) p433-444）に連結した。その結果得られたベクターをpDIsJFH(c)/J1(E1-p7)stと名付けた。

上記のようにして作製したベクターpDIsJFHst、pDIsH77st、pDIsJ1st、pDIsJ1(c)/JFH(E1-p7)st、及びpDIsJFH(c)/J1(E1-p7)stに挿入されているHCV構造遺伝子配列（キメラ構造遺伝子配列）のマップを図４に示した。

上記の各ベクターを有する組換え型ワクチニアウイルスベクターDIs株は、例えば、以下のように作製し、選択した。

ワクチニアウイルスDIs株約10⁶ pfu（plaque forming unit）を含む500μlのウイルス液を、CEF（chick embryo fibroblast）細胞約10⁷個が播かれた80mmシャーレに接種し、15分ごとに8回震盪することによりウイルスを細胞に感染させた。その後、1mlの10%FCS（fetal calf serum）を含むDMEM（Dalbecco-modified Eagle培地）を加え、37℃、5%CO₂条件下にて2時間培養した。培地を取り除き、PBS（phosphate-buffered serine）で洗浄してから0.05%トリプシン溶液0.5mlを加え、細胞を遊離させた後、細胞懸濁液を2000rpmで3分遠心して細胞を回収し、400μlのPBSに懸濁した。この細胞懸濁液に上記トランスファーベクター10μgを溶解し、Gene Pulser II（Bio Rad社）を用いて0.4cmキュベット中、250v、500μFDで１回電圧をかけ電気穿孔法を行った。細胞を10%FCSを含むDMEM 2mlに懸濁し、35mmシャーレに播いて37℃、5%CO₂条件下にて７日間培養した。感染細胞を培地とともに回収し、凍結乾燥を３回、超音波処理を２分行った後、同じ培地で10、100、1000倍希釈した。35mmシャーレに10⁶個の細胞を播き、培地（10%FCSを含むDMEM）にMPA、キサンチン（xantine）、ヒポキサンチン（hypoxantine）をそれぞれ25μg/ml、250μg/ml、15μg/ml添加して一晩培養した後、上記の希釈細胞液を接種した。15分ごとに8回震盪することによりウイルスを細胞に感染させ、希釈細胞液を除いてから、１％軟寒天添加培地（10%FCSを含むDMEM、MPA、キサンチン、ヒポキサンチンを含む）2mlを加え、固化させてから37℃、5%CO₂条件下にて７日間培養した。形成されたプラーク部分をパスツールピペットでピックアップし、200μlの10%FCSを含むDMEMに懸濁し、２分間超音波処理を行ってウイルスを寒天より放出させた。この培養液を同じ培地で10、100、1000倍希釈し、上記と同様のプラークアッセイ操作をさらに２回繰り返して組換えウイルスを純化した後、CEF細胞に感染させてスケールアップを行った。

以上のようにしてpDIsJFHst、pDIsH77st、pDIsJ1st、pDIsJ1(c)/JFH(E1-p7)st、pDIsJFH(c)/J1(E1-p7)stからそれぞれ作製されたウイルスベクター（組換えウイルス様粒子）を、DIsJFHst、DIsH77st、DIsJ1st、DIsJ1(c)/JFH(E1-p7)st、DIsJFH(c)/J1(E1-p7)stと名づけた。

（実施例３）
レプリコン保持細胞への構造蛋白質発現ベクター導入と構造タンパク質の産生
レプリコン保持細胞でHCV構造タンパク質を発現させるため、実施例２で作製したHCV構造タンパク質発現ベクターpCAGC-p7JFH1又はpEF4C-p7JFH1をリポフェクション法等によりレプリコン保持細胞に導入した。さらに実施例２で作製したHCV構造タンパク質を発現するウイルスベクターDIsJFHst、DIsH77st、DIsJ1st、DIsJ1(c)/JFH(E1-p7)st又はDIsJFH(c)/J1(E1-p7)stをレプリコン保持細胞に感染させた。

１）構造タンパク質発現プラスミドベクターの導入
pCAGC-p7JFH1をリポフェクション法にてレプリコン保持細胞5-15に導入後、8mlの培養液にて培養を続け、４日後に培養上清を回収し、HCV Coreタンパク質の測定を行ったが、検出限界以下であった。

一方、pEF4C-p7JFH1をリポフェクション法にてレプリコン保持細胞IH4.1に導入した。その結果、ウエスタンブロット法で、その培養上清に、HCV Coreタンパク質を検出することができた。そこで、pEF4C-p7JFH1を導入したレプリコン保持細胞IH4.1を４日間培養後、培養液（8ml）を回収し、8,000gで60分間、4℃にて間遠心し、培養上清を集めた。次にこの上清をSW20ローター（ベックマン）にて25,000rpm、4時間、4℃にて遠心し、ペレットを1mlのバッファーにサスペンドした。サンプルをSW41Eローター（ベックマン）用のチューブで作製した10〜60%ショ糖密度勾配に重層し、35,000回転で16時間4℃にて遠心した。10〜60%ショ糖密度勾配は、60%（重量/重量）ショ糖溶液（50mM Tris pH7.5/0.1M NaCl/1mM EDTAに溶解）2ml、50%ショ糖溶液1ml、40%ショ糖溶液1ml、30%ショ糖溶液1ml、20%ショ糖溶液1ml、10%ショ糖溶液1mlを遠心チューブに重層することにより調製した。

遠心終了後、チューブの底から0.5mlずつ画分を回収した。各画分の密度、HCV Coreタンパク質濃度及びRNA濃度を定量した。HCV Coreタンパク質の測定はオーソHCV抗原IRMAテストを用いて行った（Aoyagi et al., J. Clin. Microbiol., 37(1999) p.1802-1808）。HCVのレプリコンRNAの定量はTakeuchi（Takeuchi et al., Gastroenterology 116 (1999) p.636-642）に従った。図５に示すように、２回の実験で、レプリコンRNAとCoreタンパク質のピークはいずれも画分８にあり両者は一致した。この画分の密度は約1.17g/mlであり、報告されているHCV粒子の密度と一致した。このことからウイルス粒子が産生されたことが示された。

２）HCV構造タンパク質発現組換え型ワクチニアウイルスベクターの導入
レプリコン保持細胞株5-15を10cmのディッシュに2×10⁶個播き、翌日、0.5pfu（plaque forming units）/cellのDIsJFHstをレプリコン保持細胞株に感染させた。8mlの培養液にて培養を続けた。４日間培養後、培養液を回収し、8,000gで60分間、4℃にて遠心し、培養上清を集めた。次にこの上清をSW20ローター（ベックマン）にて25,000rpm、4時間、4℃にて遠心し、細胞培養液8ml分のペレットを1mlの0.2%のNP40を含有バッファー及び不含バッファーにて懸濁した。4℃にて20分間インキュべーションし、サンプルをSW41Eローター（ベックマン）用のチューブで作製した10〜60%ショ糖密度勾配に重層し、35,000回転で16時間4℃にて遠心した。10〜60%ショ糖密度勾配は、60%（重量/重量）ショ糖溶液（50mM Tris pH7.5/0.1M NaCl/1mM EDTAに溶解）2ml、50%ショ糖溶液1ml、40%ショ糖溶液1ml、30%ショ糖溶液1ml、20%ショ糖溶液1ml、10%ショ糖溶液1mlを遠心チューブに重層することで作製した。

遠心終了後、チューブの底から画分を0.5mlずつ回収した。各画分の密度、HCV Coreタンパク質濃度を定量した。HCV Coreタンパク質の測定はオーソHCV抗原IRMAテストを用いて行った（Aoyagi et al., J. Clin. Microbiol., 37(1999) p.1802-1808）。

２回の独立した実験結果を図６に示した。NP40非処理群（PBS処理）では、コアタンパク質を含有する粒子の密度（density）が1.16g/ml（画分７)、NP40処理した群では、コアタンパク質を含有する粒子の密度が1.21g/ml（画分９）となった。このことは、脂質を含み比重の軽い表面膜がNP40によりウイルス粒子から剥離して、ウイルス様構造を保持していない核酸とCoreタンパク質のみのCore粒子となり、比重が重くなったものと考えられた。このことから、本実験系で、完全なウイルス粒子が産生されたことが示唆された。

さらに、レプリコン保持細胞株5-15に、ウイルスベクターDIsJ1st、DIsJ1(c)/JFH(E1-p7)st、又はDIsJFH(c)/J1(E1-p7)stを、それぞれ上記と同様にして感染させた。感染後、４日間培養した上清8mlを限外濾過膜にて濃縮し、上記に記載したショ糖密度勾配遠心法にて分画した。各画分の密度、HCV Coreタンパク質濃度を定量した。HCV Coreタンパク質の密度分布パターンから、DIsJ1st、DIsJ1(c)/JFH(E1-p7)st、又はDIsJFH(c)/J1(E1-p7)stを感染させた培養上清には産生されたウイルス様粒子が含まれることが示された。

（実施例４）
組換え型HCV様粒子の感染能の確認
上記実施例で作製した組換え型HCV粒子は図１に示すように、薬剤耐性マーカーとしてneo遺伝子を持っている。したがって、実施例３で得られた粒子に感染能があるかを確認するためには、本粒子をHuh7細胞に感染させ、G418（ネオマイシン）耐性コロニーが得られるかを調べればよい。

レプリコン保持細胞株5-15にDIsJFHstを感染させて４日間培養して得た培養上清を限外濾過膜（cut off 1×10⁵ Da）にて30倍に濃縮し、Huh7細胞に感染させた。感染後、培養ディッシュにG418を1mg/mlで添加した。その後、週に2回培養液を交換しながら培養を継続した。播種時から21日間培養した後、クリスタルバイオレットで生存細胞を染色した。その結果、コロニー形成が確認できた。

感染細胞中にHCV構造タンパク質が検出されなければ、感染細胞では子粒子が産生されていないことになる。従って、本実験で形成されたコロニーを増殖させ、その細胞抽出液を調製した。次いで、これらの抽出液中のタンパク質をSDS-PAGE及びウエスタンブロット法により解析した。解析にあたって、Core遺伝子を含む発現プラスミドDNAをHuh7細胞に一過性にトランスフェクションして得られた細胞抽出液を陽性対照とした。さらに、トランスフェクションしていないHuh7細胞から得られた細胞抽出液を陰性対照とした。それぞれの細胞クローンから抽出した試料をSDS-PAGEを行った後、PVDF膜（Immobilon- P ,Millipore社製）にブロッティングし、抗Core特異的抗体（クローン2H9 抗体）とこれらの抗体を認識するHRP標識2次抗体を用いて、ECL（アマシャムファルマシア社）にて細胞内で翻訳されたCoreタンパク質を分析した結果、感染細胞にコアタンパク質を検出できなかった。従って、感染細胞では子ウイルス粒子は生産されていないと判断した。このことは、本発明の方法で作製した組換えHCV様粒子は、一旦他の細胞に感染した後はさらに粒子として再産生されず、従って他の細胞にそれ以上感染を広げる能力（伝搬力）を持たないことを意味している。

本発明によって、所望の外来遺伝子を含むHCVサブゲノムRNAをパッケージングした伝搬性のない組換え型感染性HCV様粒子とその製造方法を提供することが可能となった。このような組換え型感染性HCV様粒子は、伝搬性が欠如しているという利点を有するために、哺乳動物、特にヒトの肝臓やリンパ球系の細胞又は組織へのin vivo又はex vivo遺伝子導入を介する遺伝子治療に使用することができるし、或いはトランスジェニック動物を作製するためのウイルスベクターとして、さらには弱毒化ワクチンとして使用することができる。

配列番号１〜９の配列はプライマーを示す。

Claims (13)

1. 組換え型Ｃ型肝炎ウイルス様粒子を産生する方法であって、
   （i）遺伝子型1a、1b、2a、2b、3a及び3bのＣ型肝炎ウイルス株からなる群から選択される少なくとも１種類のウイルス株に由来するゲノムRNA上の、5'非翻訳領域と、NS3タンパク質、NS4Aタンパク質、NS4Bタンパク質、NS5Aタンパク質及びNS5Bタンパク質をコードする塩基配列と、3'非翻訳領域とを含む塩基配列を含むRNAレプリコンを保持する細胞に、
   （ii）遺伝子型1a、1b、2a、2b、3a及び3bのＣ型肝炎ウイルス株からなる群から選択される少なくとも１種類のウイルス株であって上記（i）と同じ又は異なるＣ型肝炎ウイルス株由来のCoreタンパク質、E1タンパク質、E2タンパク質及びp7タンパク質を発現するベクターを導入し、
   該細胞を培養し、産生されたウイルス様粒子を回収することを含む、前記方法。
2. 前記（i）の遺伝子型1bのＣ型肝炎ウイルス株がcon1株であり、前記（i）の遺伝子型2aのＣ型肝炎ウイルス株がJFH1株である、請求項１に記載の方法。
3. 前記（ii）の遺伝子型1aのＣ型肝炎ウイルス株がH77c株、1株、H株、及びHC-J1株である、請求項１に記載の方法。
4. 前記（ii）の遺伝子型1bのＣ型肝炎ウイルス株がJ1株、con1株、TH株、J株、JT株、及びBK株である、請求項１に記載の方法。
5. 前記（ii）の遺伝子型2aのＣ型肝炎ウイルス株がJFH1株、HC-J6株、JCH1株、及びJ6CF株である、請求項１に記載の方法。
6. 前記（ii）の遺伝子型3aのＣ型肝炎ウイルス株がNZL1株、K3a/650株、452株、及びE-b1株である、請求項１に記載の方法。
7. 前記（ii）の遺伝子型3bのＣ型肝炎ウイルス株がTr株である、請求項１に記載の方法。
8. 前記（ii）のベクターがワクチニアウイルスベクターまたはEF-1αプロモーター含有ベクターである、請求項１に記載の方法。
9. 前記RNAレプリコンが、少なくとも１つの内部リボゾーム結合部位（IRES）配列及び／又は少なくとも１つの外来遺伝子をさらに含む、請求項１に記載の方法。
10. 前記IRES配列及び／又は外来遺伝子が、前記5'非翻訳領域と前記NS3タンパク質コード配列との間に位置する、請求項１に記載の方法。
11. 前記細胞が動物細胞である、請求項１に記載の方法。
12. 前記動物細胞が、Huh7細胞、HepG2細胞またはそれらの細胞から派生した株化細胞である、請求項１１に記載の方法。
13. 請求項１に記載の方法によって産生される、感染性を有しているが伝搬力を有しない組換え型Ｃ型肝炎ウイルス様粒子。

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