JPWO2007037429A1 - 新規組換え型ヒトc型肝炎ウイルス様粒子とその産生方法 - Google Patents
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Abstract
Description
(i)C型肝炎ウイルス株に由来するゲノムRNA上の、5'非翻訳領域と、NS3タンパク質、NS4Aタンパク質、NS4Bタンパク質、NS5Aタンパク質及びNS5Bタンパク質をコードする塩基配列と、3'非翻訳領域とを含む塩基配列を含むRNAレプリコンを保持する細胞に、
(ii)上記(i)と同じ又は異なるC型肝炎ウイルス株由来のCoreタンパク質、E1タンパク質、E2タンパク質及びp7タンパク質を発現するベクターを導入し、該細胞を培養し、産生した組換え型C型肝炎ウイルス粒子を回収することを含む、前記方法を提供する。
組換え型C型肝炎ウイルス粒子を産生する方法であって、
(i)C型肝炎ウイルスcon1株由来のゲノムRNA上の、5'非翻訳領域と、NS3タンパク質、NS4Aタンパク質、NS4Bタンパク質、NS5Aタンパク質及びNS5Bタンパク質をコードする塩基配列と、3'非翻訳領域とを少なくとも含む塩基配列からなるRNAレプリコン、或いは少なくとも1つの外来遺伝子及び/又は少なくとも1つのIRES配列をさらに含む前記RNAレプリコンを自律複製する細胞に、(ii)C型肝炎ウイルスがJFH1株由来であって、該C型肝炎ウイルスのCoreタンパク質、E1タンパク質、E2タンパク質及びp7タンパク質を発現するワクチニアウイルスベクターを導入し、該細胞を培養し、産生した組換え型C型肝炎ウイルス粒子を回収することを含む、前記方法からなる。
(i)遺伝子型1a、1b、2a、2b、3a及び3bのC型肝炎ウイルス株からなる群から選択される少なくとも1種類のウイルス株に由来するゲノムRNA上の、5'非翻訳領域と、NS3タンパク質、NS4Aタンパク質、NS4Bタンパク質、NS5Aタンパク質及びNS5Bタンパク質をコードする塩基配列と、3'非翻訳領域とを含む塩基配列を含むRNAレプリコンを保持する細胞に、
(ii)遺伝子型1a、1b、2a、2b、3a及び3bのC型肝炎ウイルス株からなる群から選択される少なくとも1種類のウイルス株であって上記(i)と同じ又は異なるC型肝炎ウイルス株由来のCoreタンパク質、E1タンパク質、E2タンパク質及びp7タンパク質を発現するベクターを導入し、
該細胞を培養し、産生されたウイルス様粒子を回収することを含む、前記方法。
本明細書中で使用される用語は以下の意味を有する。
野生型のHCVゲノムは、約3,000アミノ酸の前駆体タンパク質をコードする約9.6kb長の一本鎖RNAよりなる。HCVゲノムは5'非翻訳領域(5'UTR)、Core、E1、E2、p7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A、NS5B、3'非翻訳領域(3'UTR)の順で構成されている。本発明の方法で使用されるHCVサブゲノムRNAレプリコンは、5'非翻訳領域、NS3、NS4A、NS4B、NS5A、NS5B、3'非翻訳領域の順に構成された改変RNAを含む。このRNAレプリコンは、プロモーターなどの調節因子の作用下で複製可能に特定の細胞に導入される。
本発明の方法においては、HCVサブゲノムRNAレプリコンを保持する細胞内でHCV構造タンパク質遺伝子を発現させて、HCV構造タンパク質を供給することが好ましい。
本発明の方法では、HCVサブゲノムRNAレプリコンを保持する細胞内に、HCV構造タンパク質を発現するベクターを供給することにより、その細胞内で、HCVサブゲノムRNAレプリコンが構造タンパク質によってパッケージングされたウイルス様粒子を産生させる。
上記のようにして作製される、HCVサブゲノムRNAレプリコンを保持する細胞においてHCV構造タンパク質(Core、E1、E2、p7)遺伝子を導入し発現させた細胞(組換え型HCV様粒子産生細胞)は、組換え型ウイルス様粒子を産生することができる。産生された組換え型HCV様粒子は感染能をもち、HCVサブゲノムRNAを複製する能力をもつが、感染細胞で子ウイルス粒子を産生できないので、結果として伝搬性(伝搬力)を持たない。
本発明の方法で産生された本発明の組換え型HCV様粒子は、そのRNAゲノム上に、上記HCV株(遺伝子型1a, 1b, 2a, 2b, 3a及び3b、好ましくは1b及び2aから選択される少なくとも1種類のウイルス株、例えば遺伝子型1bのcon1株又は遺伝子型2aのJFH1株)由来の、5'非翻訳領域と、NS3タンパク質、NS4Aタンパク質、NS4Bタンパク質、NS5Aタンパク質及びNS5Bタンパク質をコードする塩基配列と、3'非翻訳領域とを含む塩基配列を含む、という特徴を有する。
レプリコン保持細胞の作製
劇症肝炎の患者から分離したC型肝炎ウイルスであるJFH-1株(遺伝子型2a)のゲノム全長cDNAを含むDNA(JFH-1クローン:GenBankアクセッション番号AB047639)をpUC19プラスミド中のT7プロモーターの下流に挿入したpJFH1から、構造領域と非構造領域の一部を、ネオマイシン耐性遺伝子(neo;ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子とも称する)及びEMCV-IRES(脳心筋炎ウイルスの内部リボゾーム結合部位)で置換して、プラスミドDNA pSGR-JFH1を構築した(図2の中段)。この構築手順は、既報(Lohmann et al., Science, (1999) 285, p. 110-113)に従った。
構造タンパク質発現ベクターの作製
1)構造タンパク質発現プラスミドベクター
劇症肝炎から分離したJFH1株(GenBankアクセッション番号AB047639)(Kato T. et al., J. Med. Viol. 2001, 64:334-339)の構造領域遺伝子(塩基配列番号249〜2781)を含む領域をPCRで増幅した。このDNA断片をNheIとEcoRIで消化して得られる構造遺伝子を含む断片をアガロースゲル電気泳動で精製し、DNAポリメラーゼにて平滑末端とした。この平滑末端化したcDNAをプラスミドベクター中のCAGプロモーター配列(CAG)の下流に挿入した。同様に、前記NheIとEcoRIで消化して得られた構造領域遺伝子を含むcDNAを、エロンゲーションファクター1α遺伝子プロモーター配列(EF-1αプロモーター;Mizushima et. al., Nucleic Acids Res., 1990, 18, 5322)を持つベクターであるpEF4/Myc-His(インビトロジェン社)のSpeIとEcoRI間に挿入した。その結果得られたプラスミドをそれぞれpCAGC-p7JFH1、pEF4C-p7JFH1と命名した(図3)。
JFH1株の構造遺伝子を含有し、それがコードするタンパク質を発現可能なベクターを作製するために、まず図3上段に示したpEF4C-p7JFH1を制限酵素BamHIとEcoRIで消化し、Coreタンパク質、E1タンパク質、E2タンパク質及びp7タンパク質をコードする領域をアガロースゲル電気泳動にて分取した。次にこの断片を、目的とする外来遺伝子と共にXGPRT遺伝子が挿入されるように設計されたワクチニアウイルストランスファーベクターpDIsgptmH5に連結した(Ohnishi, K. et al., Jap. J. Infect. Dis. 58 (2005) p88-94、Ishii, K. et al., Virology 302 (2002) p.433-444)。このpDIsgptmH5は、pUc/DIsベクターのクローニングサイトに挿入されたワクチニアウイルスp7.5プロモーターの制御下に大腸菌(Escherichia coli)のキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(XGPRT)遺伝子が組み込まれたトランスファーベクターである(Ishii, K. et al., Virology 302 (2002) p.433-444)。得られたベクターをpDIsJFHstと名付けた。
レプリコン保持細胞への構造蛋白質発現ベクター導入と構造タンパク質の産生
レプリコン保持細胞でHCV構造タンパク質を発現させるため、実施例2で作製したHCV構造タンパク質発現ベクターpCAGC-p7JFH1又はpEF4C-p7JFH1をリポフェクション法等によりレプリコン保持細胞に導入した。さらに実施例2で作製したHCV構造タンパク質を発現するウイルスベクターDIsJFHst、DIsH77st、DIsJ1st、DIsJ1(c)/JFH(E1-p7)st又はDIsJFH(c)/J1(E1-p7)stをレプリコン保持細胞に感染させた。
pCAGC-p7JFH1をリポフェクション法にてレプリコン保持細胞5-15に導入後、8mlの培養液にて培養を続け、4日後に培養上清を回収し、HCV Coreタンパク質の測定を行ったが、検出限界以下であった。
レプリコン保持細胞株5-15を10cmのディッシュに2×106個播き、翌日、0.5pfu(plaque forming units)/cellのDIsJFHstをレプリコン保持細胞株に感染させた。8mlの培養液にて培養を続けた。4日間培養後、培養液を回収し、8,000gで60分間、4℃にて遠心し、培養上清を集めた。次にこの上清をSW20ローター(ベックマン)にて25,000rpm、4時間、4℃にて遠心し、細胞培養液8ml分のペレットを1mlの0.2%のNP40を含有バッファー及び不含バッファーにて懸濁した。4℃にて20分間インキュべーションし、サンプルをSW41Eローター(ベックマン)用のチューブで作製した10〜60%ショ糖密度勾配に重層し、35,000回転で16時間4℃にて遠心した。10〜60%ショ糖密度勾配は、60%(重量/重量)ショ糖溶液(50mM Tris pH7.5/0.1M NaCl/1mM EDTAに溶解)2ml、50%ショ糖溶液1ml、40%ショ糖溶液1ml、30%ショ糖溶液1ml、20%ショ糖溶液1ml、10%ショ糖溶液1mlを遠心チューブに重層することで作製した。
組換え型HCV様粒子の感染能の確認
上記実施例で作製した組換え型HCV粒子は図1に示すように、薬剤耐性マーカーとしてneo遺伝子を持っている。したがって、実施例3で得られた粒子に感染能があるかを確認するためには、本粒子をHuh7細胞に感染させ、G418(ネオマイシン)耐性コロニーが得られるかを調べればよい。
Claims (13)
- 組換え型C型肝炎ウイルス様粒子を産生する方法であって、
(i)遺伝子型1a、1b、2a、2b、3a及び3bのC型肝炎ウイルス株からなる群から選択される少なくとも1種類のウイルス株に由来するゲノムRNA上の、5'非翻訳領域と、NS3タンパク質、NS4Aタンパク質、NS4Bタンパク質、NS5Aタンパク質及びNS5Bタンパク質をコードする塩基配列と、3'非翻訳領域とを含む塩基配列を含むRNAレプリコンを保持する細胞に、
(ii)遺伝子型1a、1b、2a、2b、3a及び3bのC型肝炎ウイルス株からなる群から選択される少なくとも1種類のウイルス株であって上記(i)と同じ又は異なるC型肝炎ウイルス株由来のCoreタンパク質、E1タンパク質、E2タンパク質及びp7タンパク質を発現するベクターを導入し、
該細胞を培養し、産生されたウイルス様粒子を回収することを含む、前記方法。 - 前記(i)の遺伝子型1bのC型肝炎ウイルス株がcon1株であり、前記(i)の遺伝子型2aのC型肝炎ウイルス株がJFH1株である、請求項1に記載の方法。
- 前記(ii)の遺伝子型1aのC型肝炎ウイルス株がH77c株、1株、H株、及びHC-J1株である、請求項1に記載の方法。
- 前記(ii)の遺伝子型1bのC型肝炎ウイルス株がJ1株、con1株、TH株、J株、JT株、及びBK株である、請求項1に記載の方法。
- 前記(ii)の遺伝子型2aのC型肝炎ウイルス株がJFH1株、HC-J6株、JCH1株、及びJ6CF株である、請求項1に記載の方法。
- 前記(ii)の遺伝子型3aのC型肝炎ウイルス株がNZL1株、K3a/650株、452株、及びE-b1株である、請求項1に記載の方法。
- 前記(ii)の遺伝子型3bのC型肝炎ウイルス株がTr株である、請求項1に記載の方法。
- 前記(ii)のベクターがワクチニアウイルスベクターまたはEF-1αプロモーター含有ベクターである、請求項1に記載の方法。
- 前記RNAレプリコンが、少なくとも1つの内部リボゾーム結合部位(IRES)配列及び/又は少なくとも1つの外来遺伝子をさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 前記IRES配列及び/又は外来遺伝子が、前記5'非翻訳領域と前記NS3タンパク質コード配列との間に位置する、請求項1に記載の方法。
- 前記細胞が動物細胞である、請求項1に記載の方法。
- 前記動物細胞が、Huh7細胞、HepG2細胞またはそれらの細胞から派生した株化細胞である、請求項11に記載の方法。
- 請求項1に記載の方法によって産生される、感染性を有しているが伝搬力を有しない組換え型C型肝炎ウイルス様粒子。
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