KR20080056194A

KR20080056194A - 신규 재조합형 인간 ｃ형 간염 바이러스 유사 입자와 그산생 방법

Info

Publication number: KR20080056194A
Application number: KR1020087008304A
Authority: KR
Inventors: 준이치 타나베; 사부로 소네; 타카지 와키타; 코지 이시이; 료스케 스즈키; 테츠로 스즈키; 타츠오 미야무라
Original assignee: 국립감염증연구소장이 대표하는 일본국; 도쿄 메트로폴리탄 오거니제이션 포 메디칼 리서치; 도레이 가부시끼가이샤
Priority date: 2005-09-30
Filing date: 2006-09-29
Publication date: 2008-06-20
Also published as: CN101278042B; CA2624130A1; AU2006295716A1; AU2006295716B2; US8183044B2; JPWO2007037429A1; US20090221028A1; WO2007037429A1; PL1930416T3; EP1930416A1; EP1930416A4; JP5035985B2; CN101278042A; KR101416143B1; CA2624130C; EP1930416B1; PT1930416E; ES2376354T3

Abstract

본 발명은, (i) C형 간염 바이러스주로부터 유래하는 게놈 RNA 상의, 5'비번역 영역과, NS3 단백질, NS4A 단백질, NS4B 단백질, NS5A 단백질 및 NS5B 단백질을 코드하는 염기서열과, 3'비번역 영역을 포함하는 염기서열을 포함하는 RNA 레플리콘을 자율 복제하는 세포에, (ii) 상기 (i)과 같거나 또는 다른 C형 간염 바이러스주 유래의 Core 단백질, E1 단백질, E2 단백질 및 p7 단백질을 발현시키는 벡터를 도입하고, 상기 세포를 배양하고, 산생된 바이러스 유사 입자를 회수하는 것을 포함하는 재조합형 C형 간염 바이러스 유사 입자를 산생하는 방법, 및 이 방법에 의해 산생되는 재조합형 C형 간염 바이러스 입자에 관한 것이다.

재조합형 인간 C형 간염 바이러스 유사 입자

Description

신규 재조합형 인간 Ｃ형 간염 바이러스 유사 입자와 그 산생 방법{NOVEL RECOMBINANT HUMAN HEPATITIS C VIRUS-LIKE PARTICLE AND METHOD FOR PRODUCING THE SAME}

본 발명은 인간 재조합형 C형 간염 바이러스 유사 입자와 그 산생 방법에 관한 것이다.

동물 세포에 유전자를 도입하는 방법으로서, 물리화학적 방법과 생물학적 방법으로 크게 구별된다. 물리화학적 방법으로서 인산 칼슘 공침전법, DEAE 덱스트란법, 리포펙션법, 마이크로인젝션법, 일렉트로포레이션법 등이 있다. 한편, 생물학적 방법으로서 바이러스 벡터를 사용하는 방법이 있다.

바이러스 벡터법이란, 바이러스가 가지고 있는 세포 진입기구, 즉 감염능을 이용해서 유전자를 도입하는 방법이다.

바이러스 벡터를 사용해서 제작된 재조합형 바이러스 입자의 표면에는 바이러스 유래의 구조단백질(뉴클레오캡시드나 엔벨로프 단백질 등)이 존재하고 있고, 세포 표면에 존재하는 수용체를 통해서 세포에 감염되어 효율적으로 유전자를 도입하는 기구를 갖고 있다. 따라서, 이러한 바이러스 벡터를 이용하여 제작된 재조합형 바이러스 입자는 동물 세포에 유전자를 도입하여 목적 유전자발현 세포를 제작 하는 목적뿐만 아니라, 유전자 치료, 트랜스제닉 동물 제작 등의 목적으로 사용하는 것이 가능하다.

바이러스 벡터는, 레트로바이러스 벡터, DNA 바이러스 벡터, RNA 바이러스 벡터의 3가지로 분류되어, 유래하는 바이러스의 종류에 따라 도입할 수 있는 유전자의 길이, 세포의 염색체 게놈에 유전자를 도입할지의 여부, 분열 세포만인지 비분열 세포에도 유전자를 도입할 수 있는지, 감염시킬 수 있는 세포의 종류, 세포에의 독성, 유전자 도입 효율 등에 관해서 특징이 있다.

레트로바이러스는 플러스쇄의 RNA를 게놈으로서 가지고 있다. 이 RNA는 전형적인 진핵세포의 mRNA의 성질, 즉 메틸화된 5'말단 캡 구조와 3'말단에는 약 200염기로 이루어지는 폴리A를 가지고 있다. 감염된 세포 내에서 이 RNA는 바이러스가 가지는 역전사 효소의 작용으로 DNA로 변환된다. 또한 바이러스가 코드하는 효소의 작용에 의해 숙주의 게놈 DNA에 도입된다. 도입된 DNA를 프로바이러스(provirus)라고 부르지만, 프로바이러스의 양단에는 반복 서열(LTR)이 생기고, 그 속에 있는 프로모터(promoter)에 의해 바이러스의 RNA가 합성된다. 합성된 RNA로부터는 바이러스 단백질이 번역됨과 아울러, 게놈 사이즈의 RNA는 바이러스 입자에 도입되어 자 입자로 되어 세포 밖으로 방출된다.

바이러스 입자를 산생하는데에 필요한 RNA의 구조는 양단의 LTR과 그것에 둘러싸여지는 프라이머 결합부위, 패키징 시그널 및 폴리퓨린 시그널이다. 이들은 시스 인자로서 필수이다. 한편, 바이러스 단백질을 코드하는 유전자는 시스 인자로서 필수가 아니라, 감염 세포 중에서 바이러스 단백질이 공급되면 복제와 입자 산생은 정상적으로 행하여진다.

따라서, 재조합형 레트로바이러스를 산생할 경우, 레트로바이러스가 코드하는 gag, pol, env 등의 유전자를 제거하고, 그 대신 발현시키고 싶은 목적 유전자를 삽입한 벡터(레트로바이러스 벡터라고 부른다)를 제작해 두고, 이 벡터를 바이러스 단백질이 공급된 세포(통상 패키징 세포(Packaging Cell)라고 부른다)에 도입하면 외래 유전자를 도입한 레트로바이러스 입자가 제작된다(비특허문헌 1).

레트로바이러스로서는, 예를 들면 마우스 백혈병 바이러스, 고양이 백혈병 바이러스, 비비 C형 온코바이러스, 인간 면역부전 바이러스, 성인 T세포 백혈병 바이러스 등을 예시할 수 있다. 또한, 재조합형 레트로바이러스 벡터로서 보고되어 있는 것에는, 마우스 백혈병 바이러스를 기본으로 한 것(비특허문헌 1), 또한 인간 면역부전 바이러스를 기본으로 한 것(비특허문헌 2) 등을 들 수 있다.

재조합형 레트로바이러스의 산생을 위한 시스템은 2개의 구성 단위, 즉, 도입하려고 하는 유전정보(목적으로 하는 외래 유전자)와 바이러스 게놈의 패키징 및 도입에 필요한 요소의 모두를 시스에(in cis) 유지하는 레트로바이러스 벡터(재조합형 레트로바이러스 DNA)와, gag, pol 및 env 유전자에 의해 코드되는 바이러스 단백질을 제공하는 레트로바이러스 패키징 세포로 이루어진다. gag, pol 및 env 유전자를 발현하는 재조합 벡터가 도입된 패키징 세포만으로는 재조합형 레트로바이러스 입자를 방출할 수 없다.

재조합형 레트로바이러스 입자를 산생하기 위해서는, gag, pol 및 env 단백질이 트랜스에(in trans) 위치할 필요가 있다. 따라서, gag, pol 및 env 유전자를 발현하는 재조합 벡터가 도입된 패키징 세포에 레트로바이러스 벡터를 도입함으로써 상기 벡터에 포함되는 유전 정보를 유지하는 재조합 레트로바이러스를 제작할 수 있다. 다음에, 이들 바이러스를 이용하여 세포를 감염시키면 그 세포 내에서 레트로바이러스 벡터는 천연의 레트로바이러스 생활환에 따라서 세포의 염색체 게놈에 도입될 것이다.

레트로바이러스 벡터법은 이와 같이, 특정의 DNA를 효율적으로 숙주의 염색체 게놈에 도입시키는 것을 목적으로 만들어진 시스템이지만, 목적 유전자의 삽입 위치를 예상할 수 없기 때문에, 삽입에 의해 정상 유전자가 손상을 받거나, 삽입된 부근의 유전자를 활성화하거나, 목적으로 하는 외래 유전자가 과잉 발현하거나 발현이 억제되거나 할 가능성을 부정할 수 없다. 이 문제점을 극복하기 위해서, 염색체외 유전자로서 이용할 수 있는 DNA 바이러스 벡터를 이용한 일시적(transient)인 발현계의 개발이 진행되었다.

DNA 바이러스 벡터는 DNA 바이러스로부터 유래하는 벡터이다. DNA 바이러스는 바이러스 입자 내에 DNA를 유전정보로서 유지하는 것이며, 그 DNA의 복제는 자기의 DNA를 주형으로 하고, 숙주 유래의 DNA 의존성 DNA 복제 효소를 촉매의 적어도 일부로 함으로써 상보쇄를 생성한다고 하는 과정의 반복에 의해 이루어진다. 염색체외 유전자로서 이용할 수 있는 DNA 바이러스 벡터로서, 예를 들면 아데노바이러스 벡터를 들 수 있다.

인간 아데노바이러스는 약 36kb의 선상 2개쇄 DNA를 게놈으로서 갖고, 그것에 포함되는 영역은 초기 유전자 E1, E2, E3, E4와 후기 유전자 L1, L2, L3, L4, L5로 크게 구별된다. 초기 유전자는 주로 바이러스의 복제에, 후기 유전자는 캡시드 등 바이러스의 구조 단백질의 합성에 관여한다. 유전자 도입용으로서 사용되는 아데노바이러스 벡터는 초기 유전자인 E1영역(E1A와 E1B로 나뉘고, E1A에 의해 모든 아데노바이러스 프로모터가 활성화된다)을 소망하는 외래 유전자(목적 유전자)로 치환하여, E1A를 트랜스에 공급할 수 있는 세포주인 293세포(293세포는 E1A를 발현하고 있다) 등에서 증식시킨다. E1A 영역을 결손한 아데노바이러스 벡터는 E1A를 발현하고 있지 않은 통상의 세포에서는 증식할 수 없다. E3 영역은 바이러스의 증식에는 필수적이지 않기 때문에, 외래 유전자의 삽입 사이즈의 증대화를 목적으로 제외되는 일이 많다. 아데노바이러스는 야생형의 게놈 사이즈의 105%까지의 게놈을 캡시드 내에 패키징할 수 있기 때문에, E1 및 E3 영역을 결손시킴으로써 최대 약 8.1kb까지의 외래 유전자를 삽입할 수 있다(비특허문헌 3).

아데노바이러스 벡터에서는 비증식 세포와 증식 세포의 양쪽에 유전자를 도입할 수 있다(비특허문헌 4). 이 것으로부터, 이 방법은 in vivo 유전자 도입법에 적합하다. 본 벡터의 결점의 하나로서, 유전자의 발현 기간이 일반적으로 짧은(주단위) 것을 들 수 있다. 이것은, 아데노바이러스의 게놈이 염색체 밖의 영역(에피솜)에 한정해서 존재하고, 복제·증폭도 행하여지지 않기 때문이다. 2번째의 결점으로서, 현재 일반적으로 사용되고 있는 아데노바이러스는 비특이적인 염증 반응을 야기하고, 벡터 자신에 대한 세포성 면역 응답도 증강되는 점에서 유전자 치료에 있어서는 연속적인 투여가 곤란한 점이 염려된다(비특허문헌 5).

RNA 바이러스를 기본으로 한 바이러스 벡터가 개발되고 있다. RNA 바이러스 의 복제는 자기의 RNA를 주형으로 하고, 자기 유래의 RNA 의존성 RNA 복제 효소를 촉매로 함으로써 상보쇄를 생성한다고 하는 과정의 반복에 의해 이루어진다.

RNA 바이러스는 (-)쇄 RNA 바이러스와 (+)쇄 RNA 바이러스로 크게 구별된다. 대표적인 (-)쇄 RNA 바이러스로서 인플루엔자 바이러스를 들 수 있다. 인플루엔자 바이러스 게놈은 8개의 분절 마이너스쇄 RNA로 이루어지는 바이러스이다. 인플루엔자 바이러스가 감염되면, 인플루엔자 입자 중의 단백질에 의해 유전자의 전사가 개시된다. 우선, 바이러스 RNA 폴리메라아제는 숙주 세포의 mRNA를 5'말단 캡구조로부터 십수 뉴클레오티드의 부분으로 절단하여 프라이머로서 이용하고, RNA쇄(플러스쇄)를 신장한다. 이 플러스쇄 RNA로부터 바이러스 단백질이 번역된다. 복제 과 정에서는 바이러스의 RNA에 완전하게 상보적인 RNA가 합성되어, 이것을 주형으로 해서 자손의 바이러스 RNA가 증폭된다. 그 후에 바이러스 RNA는 바이러스 단백질과 함께 패키징되어 바이러스 입자가 된다.

따라서, 세포 배양계에서 인플루엔자 바이러스를 산생할 경우, 인플루엔자 바이러스가 코드하는 단백질을 RNA 폴리메라아제 II계의 프로모터, 예를들면, CMV나 CAG 프로모터로 발현시킴과 아울러, 바이러스 RNA를 캡구조 및 폴리A가 붙지 않는 프로모터인 RNA 폴리메라아제 I형의 프로모터, 예를들면 rRNA 유전자의 프로모터로 발현시키면, 세포 중에서 바이러스 RNA는 바이러스 단백질과 함께 패키징되어 바이러스 입자가 된다(비특허문헌 6). 그러나, 생산되는 바이러스량이 표시되어 있지 않고, 생산면에서 충분하게 이용할 수 있는 기술로서 확립되어 있지 않다.

(+)쇄 RNA 바이러스로 분류되는 바이러스로서 신드비스 바이러스나 C형 간염 바이러스가 있다. (+)쇄 RNA 바이러스가 갖는 게놈 RNA는, 동시에 메신저 RNA(이하 「mRNA」라고 칭한다)로서도 기능하고, 복제나 입자 형성에 필요한 단백질을 숙주세포의 번역 기능에 의존해서 생산할 수 있다. 바꿔 말하면, (+)쇄 RNA 바이러스가 갖는 게놈 RNA 자체가 전파력을 갖는다.

신드비스 바이러스(Sindbis virus)로부터 유래하는 바이러스 벡터는 게놈 RNA 중, 바이러스 구조체에 관계되는 구조 유전자 영역을 결실시켜 바이러스의 전사 복제 단백질 유전자군을 남긴 것과, 전사 프로모터 하류에 원하는 외래성 유전자를 접속한 RNA를 기본적인 구조로 하고 있다. 이러한 RNA 또는 상기 RNA를 전사시킬 수 있는 cDNA를 세포 내에 도입하면, 외래 유전자를 포함하는 RNA 벡터의 자율 복제와 전사 프로모터 하류의 외래성 유전자의 전사가 일어나고, 목적으로 하는 외래성 유전자 산물이 세포 내에 발현된다. 또한, 구조 유전자를 발현하는 cDNA 유닛(헬퍼)과, 상기 RNA 벡터를 발현하는 cDNA유닛을 패키징 세포 내에서 공존시킴으로써, 감염능을 갖지만 전파력을 갖지 않는 복합체를 제작할 수 있다(비특허문헌 7).

신드비스 바이러스는 수용체로서 67키로 달톤의 고친화성 라미닌 수용체(High-affinity laminin receptor, LAMR)를 사용하여, 신경 세포에 높은 효율로 감염되기 때문에, 신드비스 바이러스 벡터는 신경특이적으로 유전자를 도입하는 시스템으로서 주목받고 있다(비특허문헌 8). 그러나, 신드비스 바이러스의 감염은 숙주세포에 있어서의 아포토시스(apoptosis)를 유도하는 것이 나타내어져 있어(비특허문헌 9), 독성이 염려된다.

C형 간염 바이러스(HCV)의 게놈은, 약 9600뉴클레오티드로 이루어지는 (+)쇄의 단일쇄 RNA이다. 이 게놈 RNA는 5'비번역 영역(5'NTR 또는 5'UTR로도 표기함), 구조 영역과 비구조 영역으로 구성되는 번역 영역, 및 3'비번역 영역(3'NTR 또는 3'UTR로도 표기함)으로 이루어진다. 그 구조 영역에는 HCV의 구조 단백질이 코드되어 있고, 비구조 영역에는 복수의 비구조 단백질이 코드되어 있다.

이러한 HCV의 구조 단백질(Core, E1, E2,및 p7)과 비구조 단백질(NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A,및 NS5B)은, 번역 영역으로부터 일련의 폴리프로테인으로서 번역된 후, 프로테아제에 의한 한정 분해를 받아서 유리, 생성된다. 이들의 구조 단백질 및 비구조 단백질(즉, HCV의 바이러스 단백질) 중, Core는 코어 단백질이며, E1 및 E2는 엔벨로프 단백질이다. 비구조 단백질은 바이러스 자신의 복제에 관여하는 단백질이며, NS2는 메탈로프로테아제 활성, NS3은 세린 프로테아제 활성(N말단측의 3분의 1)과 헬리카제 활성(C말단측의 3분의 2)을 갖는 것이 알려져 있다. 또한, NS4A는 NS3의 프로테아제 활성에 대한 보조인자이며, NS5B는 RNA 의존 RNA 폴리메라아제 활성을 갖는 것도 보고되어 있다.

HCV는 유전자형 또는 혈청형에 의해 다수의 형으로 분류되는 것이 알려져 왔다. 현재 주류의 HCV 유전자형 분류법이다, Simmonds들에 의한 HCV주의 염기서열을 사용한 계통 해석법에서는, HCV는 유전자형 1a, 유전자형 1b, 유전자형 2a, 유전자형 2b, 유전자형 3a, 유전자형 3b의 6타입으로 분류되고, 또한 그들 각 타입이 몇개의 서브 타입으로 분류된다. 그리고, HCV의 복수의 유전자형에 대해서는 그 게놈 전체 길이의 염기서열도 결정되어 있다(비특허문헌 10∼13).

HCV 입자는 세포 표면의 황산 다당류에 포착되어 엔벨로프 단백질을 통해서 친화성이 높은 수용체와 결합하고, 엔도사이토시스에 의해 엔도좀 내에 받아들여진다. 그 후에 바이러스 막과 엔도좀 막이 융합하고, 뉴클레오캡시드가 세포질에 진입한다. 나(裸)로 된 바이러스 게놈은 IRES에 의해 번역을 개시한다. 소포체막 상에서 번역과 단백질의 개열이 일어난다. 코어 단백질, E1 및 E2 단백질과, 소포체에서 복제된 바이러스 RNA가 집합하여 바이러스 입자가 형성된다. 그 후에 소포체강으로 출아한다. 출아한 입자는 골지 장치(golgi apparatus)를 통과해서 세포 밖으로 방출된다고 여겨지고 있다.

최근에는, HCV 유래의 자율 복제능을 갖는 RNA로서, HCV 서브게놈 RNA 레플리콘(replicon)이 제작됨으로써(특허문헌 1, 2 및 비특허문헌 14∼16), 배양세포를 이용하여 HCV의 복제기구를 해석하는 것이 가능해졌다. 이들 HCV 서브게놈 RNA 레플리콘은 HCV 게놈 RNA의 5'비번역 영역 중의 HCV IRES의 하류에 존재하는 구조 단백질을, 네오마이신 내성 유전자 및 그 하류에 연결된 EMCV-IRES에 의해 치환한 것이다. 이 RNA 레플리콘은 인간 간암세포 Huh7에 도입해서 네오마이신 존재하에서 배양함으로써, Huh7 세포 내에서 자율 복제되는 것이 증명되었다. 또한 일부의 HCV 서브게놈 RNA 레플리콘은 Huh7에 한하지 않고 인간 자궁경부암 세포 HeLa, 인간 간암세포 HepG2 등의 세포 내에서도 자율 복제하는 것이 증명되었다(특허문헌 3). 또한, 특허문헌 2에는 유전자 치료용의 벡터로서의 재조합형 HCV의 사용에 대해서 HCV 전체 길이 게놈을 이용한 HCV 바이러스 입자의 산생이 제안되어 있다.

[특허문헌 1] 일본 특허공개 2002- 171978호 공보

[특허문헌 2] 일본 특허공개 2001- 17187호 공보

[특허문헌 3] 국제공개 WO 2004/104198

[비특허문헌 1] Mann, R. et al., Cell,33(1983) p153-59

[비특허문헌 2] Simada, T et al., J Clin Invest.88(1991) p1043-47

[비특허문헌 3] Betta, A et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 91(1994) p8802-06

[비특허문헌 4] Burden, S & Yarden, Y., Neuron,18(1997) p847-55

[비특허문헌 5] Crystal, R.G Science,270,(1995) p404-10

[비특허문헌 6] Neumann, G.& Kawaoka, Y., Virology 287(2001) p243-50

[비특허문헌 7] Berglund, P et al., Biotechnology,11(1993) p916-920

[비특허문헌 8] Wang, K.S et al., J. Virol.66(1992) p4992-5001

[비특허문헌 9] Levine, B. et al., Nature,361(1993) p739-42

[비특허문헌 10] Simmonds, P. et al., Hepatology,10(1994) p1321-24

[비특허문헌 11] Choo, Q.L et al., Science,244(1989) p359-362

[비특허문헌 12] Okamoto, H et al., J. Gen. Virol.,73(1992) p673-79

[비특허문헌 13] Mori, S. et al., Biochem. Biophis. Res. Commun.183(1992) p334-42

[비특허문헌 14] Blight et al., Science,290(2000) p1972-74

[비특허문헌 15] Friebe et al., J. Virol.,75(2001) p12047-57

[비특허문헌 16] Kato, T. et al., Gastroenterology,125(2003) p1808-17

HCV는 레트로바이러스, 아데노바이러스, 인플루엔자 바이러스, 신드비스 바이러스와 같은 바이러스 벡터로서의 개발이 실제로는 행하여지지 않고 있다. 만약 그러한 HCV 벡터가 개발되면, 간장 등의 조직 세포에 특이적으로 유전자를 도입하는 것이 가능해질 것이다. 그 경우, 보다 고도의 안전성을 확보하기 위해서 HCV 벡터는 세포에 감염되지만 전파성이 없는 것이 바람직하다.

본 발명의 목적은, 상기와 같은 벡터로서 사용 가능한 재조합형 C형 간염 바이러스(HCV) 유사 입자를 개발하는 것이다. 또한 상기 HCV 유사 입자를 효율적으로 산생하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명자들은 안전성, 편리성, 응용성의 점에서 산업상 유용하다고 생각되는 재조합형 HCV 유사 입자를 배양세포에서 산생시키는 것을 시험해 보았다. 우선, HCV의 게놈을 HCV 구조 단백질을 발현하는 벡터와, 복제에 관계되는 유전자를 포함하는 벡터로 분할했다. 후자의 벡터에는 원하는 외래 유전자 및/또는 내부 리보솜 결합부위(Internal Ribosome Entry Site; IRES)를 포함할 수 있다.

본 발명자들은 원하는 외래 유전자, IRES 서열, HCV의 복제에 관계되는 유전자로 이루어지는 DNA를 T7 프로모터의 하류에 클론화한 벡터를 구축하고, T7 폴리메라아제를 이용하여 in vitro에서 외래 유전자 서열을 함유하는 HCV 서브게놈 RNA 레플리콘을 합성했다. 이 RNA 레플리콘을 배양 동물 세포에 도입하고, 상기 HCV 서브게놈 RNA 레플리콘이 복제되어 있는 세포주를 얻었다.

다음에 HCV 구조 단백질을 고발현하는 벡터를, 높은 효율로 상기 세포주에 도입할 수 있는 계를 찾아내고, 여러 가지 유전자형의 HCV 서브게놈 RNA 레플리콘을 유지하는 세포에 도입했다. 그 결과, 세포 내에서 HCV 구조 단백질을 발현시킴으로써 상기 HCV 서브게놈 RNA 레플리콘을 바이러스 입자에 패키징할 수 있는 조합을 찾아내는 것에 성공했다.

또한 본 발명자들은, 본 발명의 방법으로 산생된 재조합형 HCV 유사 입자가 감염되는 것 및 상기 재조합형 HCV가 감염된 세포는 자 바이러스 입자를 산생하지 않고, 전파성이 없는 것을 확인했다. 이러한 특성 때문에, 본 발명의 재조합형 HCV입자는 외래 유전자 도입을 위한, 또는 유전자 치료를 위한 벡터로서 사용하는 것이 가능하다.

즉, 본 발명, 요약하면 이하의 특징을 갖는다.

본 발명은, 그 제 1 형태에 있어서, 재조합형 C형 간염 바이러스 입자를 산생하는 방법으로서,

(i) C형 간염 바이러스주로부터 유래하는 게놈 RNA 상의 5'비번역 영역과, NS3 단백질, NS4A 단백질, NS4B 단백질, NS5A 단백질 및 NS5B 단백질을 코드하는 염기서열과, 3'비번역 영역을 포함하는 염기서열을 포함하는 RNA 레플리콘을 유지하는 세포에,

(ii) 상기 (i)과 같거나 또는 다른 C형 간염 바이러스주 유래의 Core 단백질, E1 단백질, E2 단백질 및 p7 단백질을 발현시키는 벡터를 도입하고, 상기 세포를 배양하여 산생한 재조합형 C형 간염 바이러스 입자를 회수하는 것을 포함하는 상기 방법을 제공한다.

그 하나의 실시형태에 있어서, 상기 (i) 및 (ii)의 C형 간염 바이러스주는, 독립적으로 유전자형 1a, 1b, 2a, 2b, 3a 및 3b의 바이러스주로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종의 주이다.

다른 실시형태에 있어서, 상기 (i) 및 (ii)의 C형 간염 바이러스주는, 독립적으로 유전자형 1b 및 2a의 바이러스주로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종의 주이다.

또 다른 실시형태에 있어서, 상기 (i)의 C형 간염 바이러스주는 유전자형 1b의 바이러스주이다.

바람직한 실시형태에 의하면, 상기 유전자형 1b의 바이러스주는 con1주 또는 그 파생주이다.

다른 실시형태에 있어서, 상기 (ii)의 C형 간염 바이러스주는 유전자형 2a의 바이러스주이다.

바람직한 실시형태에 의하면, 상기 유전자형 2a의 바이러스주는 JFHI주 또는 그 파생주이다.

또 다른 실시형태에 있어서, 상기 RNA 레플리콘은 적어도 1개의 내부 리보솜 결합부위(IRES) 서열을 더 포함할 수 있다.

다른 실시형태에 있어서, 상기 RNA 레플리콘은 적어도 1개의 외래 유전자를 더 포함할 수 있다.

바람직한 실시형태에 의하면, 상기 IRES 및 상기 외래 유전자는 상기 5'비번역 영역과 상기 NS3 사이에 위치할 수 있다.

또 다른 실시형태에 있어서, 상기 세포는 동물 세포이다.

바람직한 실시형태에 의하면, 상기 동물 세포는 포유 동물 세포이다.

상기 포유 동물 세포로서 Huh7, HepG2 및 그들의 세포로부터 파생된 주화 세포를 예시할 수 있다.

또 다른 실시형태에 있어서, 상기 발현 벡터는 바이러스 벡터이다.

바람직한 실시형태에 의하면, 상기 바이러스 벡터는 백시니아 바이러스 벡터이다.

본 발명의 상기 방법으로 산생·회수된 재조합형 C형 간염 바이러스 입자를 또한, 간장세포 또는 림프구계 세포 등의 HCV 감수성 세포에 감염시켜서 바이러스 입자를 증식시킬 수 있다. 본 발명은 이러한 공정도 포함한다.

본 발명은 또한 제 2 형태에 있어서, 위에 기재된 본 발명의 방법에 의해 산생되고, 또한 감염성을 갖고 있지만 전파력이 없는 것을 특징으로 하는 재조합형 C형 간염 바이러스 입자를 제공한다.

그 하나의 실시형태에 있어서, 상기 재조합형 C형 간염 바이러스 입자에는 발현 가능하게 외래 유전자가 도입되어 있다.

다른 실시형태에 있어서, 상기 재조합형 C형 간염 바이러스 입자는 벡터이다.

본 발명에 있어서, 재조합형 C형 간염 바이러스 입자의 산생을 위한 바람직한 방법의 하나는,

재조합형 C형 간염 바이러스 입자를 산생하는 방법으로서,

(i) C형 간염 바이러스 con1주 유래의 게놈 RNA 상의, 5'비번역 영역과, NS3 단백질, NS4A 단백질, NS4B 단백질, NS5A 단백질 및 NS5B 단백질을 코드하는 염기서열과, 3'비번역 영역을 적어도 포함하는 염기서열로 이루어지는 RNA 레플리콘, 또는 적어도 1개의 외래 유전자 및/또는 적어도 1개의 IRES 서열을 더 포함하는 상기 RNA 레플리콘을 자율 복제하는 세포에, (ii) C형 간염 바이러스가 JFH1주 유래이며, 상기 C형 간염 바이러스의 Core 단백질, E1 단백질, E2 단백질 및 p7 단백질을 발현하는 백시니아 바이러스 벡터를 도입하고, 상기 세포를 배양하고, 산생한 재조합형 C형 간염 바이러스 입자를 회수하는 것을 포함하는, 상기 방법으로 이루어진다.

또한 본 발명에 있어서, 바람직한 재조합형 C형 간염 바이러스 입자는 상기의 바람직한 방법에 의해 산생되는 것이다.

본 발명은, 또한 이하의 [1]∼[2]를 포함한다.

[1] 재조합형 C형 간염 바이러스 유사 입자를 산생하는 방법으로서,

(i) 유전자형 1a, 1b, 2a, 2b, 3a 및 3b의 C형 간염 바이러스주로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종류의 바이러스주로부터 유래하는 게놈 RNA 상의, 5'비번역 영역과, NS3 단백질, NS4A 단백질, NS4B 단백질, NS5A 단백질 및 NS5B 단백질을 코드하는 염기서열과, 3'비번역 영역을 포함하는 염기서열을 포함하는 RNA 레플리콘을 유지하는 세포에,

(ii)유전자형 1a, 1b, 2a, 2b, 3a 및 3b의 C형 간염 바이러스주로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종류의 바이러스주이며 상기 (i)과 같거나 또는 다른 C형 간염 바이러스주 유래의 Core 단백질, E1 단백질, E2 단백질 및 p7 단백질을 발현시키는 벡터를 도입하고,

상기 세포를 배양하여 산생된 바이러스 유사 입자를 회수하는 것을 포함하는 상기 방법.

이 방법에 있어서는, 상기 (i)의 유전자형 1b의 C형 간염 바이러스주가 con1주이며, 상기 (i)의 유전자형 2a의 C형 간염 바이러스주가 JFH1주인 것이 바람직하다.

또 이 방법에서는, 상기 (ii)의 유전자형 1a의 C형 간염 바이러스주가 H77c주, 1주, H주, 및 HC-J1주인 것도 바람직하다.

이 방법에서는, 상기 (ii)의 유전자형 1b의 C형 간염 바이러스주가 J1주, con1주, TH주, J주, JT주, 및 BK주인 것도 바람직하다.

이 방법에서는, 상기 (ii)의 유전자형 2a의 C형 간염 바이러스주가 JFH1주, HC-J 6주, JCH1주, 및 J6CF주인 것도 바람직하다.

이 방법에서는, 상기 (ii)의 유전자형 3a의 C형 간염 바이러스주가 NZL 1주, K3a/650주, 452주, 및 E-b1주인 것도 바람직하다.

이 방법에서는, 상기 (ii)의 유전자형 3b의 C형 간염 바이러스주가 Tr주인 것도 바람직하다.

또한 이 방법에서는, 상기 (ii)의 벡터가 백시니아 바이러스 벡터 또는 EF-1α 프로모터 함유 벡터인 것이 바람직하다.

또한 이 방법에서는, 상기 RNA 레플리콘은 적어도 1개의 내부 리보솜 결합부위(IRES) 서열 및/또는 적어도 1개의 외래 유전자를 더 포함하는 것이 바람직하다.

그 IRES 서열 및/또는 외래 유전자는 상기 5'비번역 영역과 상기 NS3 단백질 코드 서열 사이에 위치하는 것이 바람직하다.

본 방법에서는, 상기 세포는 바람직하게는 동물 세포이다. 동물 세포로서는 Huh7 세포, HepG2 세포 또는 그들 세포로부터 파생된 주화 세포가 보다 바람직하다.

[2] 상기 [1]의 방법에 의해 산생되는 감염성을 갖고 있지만 전파력을 갖지 않는 재조합형 C형 간염 바이러스 유사 입자.

[발명의 효과]

본 발명에 의해, 원하는 외래 유전자를 포함하는 HCV 서브게놈 RNA를 패키징한 전파성이 없는 재조합형 감염성 HCV 유사 입자와 그 제조 방법을 제공하는 것이 가능해졌다. 이러한 재조합형 감염성 HCV 유사 입자는 전파성이 결여되어 있다고 하는 이점을 갖기 때문에, 특히 간장이나 림프구계의 세포 또는 조직으로의 유전자도입(예를 들면 유전자 치료)에 사용할 수 있거나, 또는 트랜스제닉 동물을 제작하기 위한 바이러스 벡터로서, 또한 약독화 백신으로서 사용할 수 있다,라고 하는 이점을 가진다.

도 1은 본 발명의 실시형태의 개략도이며, 재조합형 HCV 유사 입자의 제조공정을 나타낸다. a): HCV 서브게놈 RNA 레플리콘이 도입된 Huh7 세포 중에서는 HCV 서브게놈 RNA 레플리콘이 복제된다. 바이러스 입자는 산생되지 않는다. b): HCV 구 조 단백질 발현 벡터가 더 도입된 a)의 세포 중에서는, 발현된 HCV 구조 단백질을 이용해서 HCV 서브게놈 RNA 레플리콘이 패키징된 바이러스 유사 입자가 산생된다. c): b)에서 산생된 바이러스 유사 입자가 감염된 세포 중에서는, HCV 서브게놈 RNA 레플리콘의 복제는 일어나지만 바이러스 자 입자는 산생되지 않는다.

도 2는 HCV 게놈 RNA 및 HCV 서브게놈 RNA의 cDNA의 구조도를 나타낸다. 상단이 HCV 유전자형 2a로부터 제작한 pFH1, 중단이 pSGR-JFH1이다. 하단이 HCV 유전자형 1b로부터 제작한 I389/NS3-3'/wt이다. 도면 중의 기호는 이하와 같다. T7 : T7 RNA 프로모터, 5'UTR : 5'비번역 영역, 코어 : Core 단백질, E1, E2 : 엔벨로프 단백질, p7 : p7 단백질, NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A, NS5B : 비구조 단백질, 3'UTR : 3'비번역 영역, Age I, Pme I, Xba I : 제한 효소 Age I, Pme I 및 Xba I의 절단 부위, EMCV IRES : 뇌심근염 바이러스의 내부 리보솜 결합부위.

도 3은 본 발명의 HCV 구조 단백질을 발현시키기 위한 벡터의 맵을 나타낸다. 구체적으로는, 상단이 CAG 프로모터의 하류에 JFH 구조 영역 유전자를 삽입해서 제작한 플러스미드 클론 pGAGC-p7JFH1, 하단이 신장인자(elogation factor) 1α 프로모터 서열의 하류에 JFH 구조 영역 유전자를 삽입해서 제작한 플러스미드 클론 pEF4C-p7JFH1의 구조를 나타낸다. 도면 중의 기호는 하기와 같다. CAG : CAG 프로모터, pA : 폴리A 부가 서열, EcoRI : 제한 효소 EcoRI의 절단 부위, EF-1α: 신장인자 1α 프로모터, BGH pA : 소 성장인자 폴리A 부가 서열.

도 4는 벡터 pDIsHJFHst, pDIsH77st, pDIsJ1st, pDIsJ1(c)/JFH(E1-p7)st 및 pDIsJFH(c)/J1(E1-p7)st에 삽입되어 있는 HCV 구조 유전자의 맵을 나타낸다. 유래 하는 바이러스주의 차이를, 프레임 내의 빗금으로 나타내고 있다.

도 5는 레플리콘 유지 세포주 IH4.1에 pEF4C-p7JFH1을 도입시켜, 그 세포의 배양 상청(sup)을 자당 밀도구배에 의해 분획한 각 획분에 있어서의, HCV 레플리콘RNA의 양(A) 및 HCV Core 단백질의 양을 나타내는 그래프(B)이다. □:실험1, ◆:실험2.

도 6은 레플리콘 유지 세포주 5-15에 백시니아 바이러스 벡터인 DIsJFHst를 감염시켜, 그 세포의 배양 상청(sup)을 자당 밀도구배에 의해 분획한 각 획분(가로축)에 있어서의, HCV Core 단백질의 양(세로축)을 나타내는 그래프이다. 검은 칠을 한 원은 HCV Core(Core) 단백질, 검은 칠을 한 사각은 NP40 처리한 배양 상청을 사용한 결과를 나타낸다. 실험1은 미처리만의 결과(도 6A), 실험2는 미처리와 NP40 처리의 결과(도 6B)를 나타낸다.

1.정의

본 명세서 중에서 사용되는 용어는 이하의 의미를 갖는다.

「RNA 레플리콘」이란 HCV 바이러스 게놈을 개변해서 제작되는 자율 복제능을 갖는 RNA를 가리킨다.

「자율 복제능」이란 플러스미드 DNA와 같이 세포 내에서 자율적으로 핵산의 카피를 재생(즉 복제)할 수 있는 능력을 말한다.

「감염능」또는 「감염성」이란 세포로의 접착능 및 막융합능 등을 유지하고 있음으로써, 세포 내에 바이러스 내부의 핵산 등을 도입할 수 있는 능력을 가리킨 다.

「재조합형 C형 간염 바이러스」란, 본래의 HCV 바이러스가 가지는 성질을 유전자 재조합 기술에 의해 질적/양적으로 변화시킨 바이러스를 의미하고, 예를 들면 본래의 바이러스가 발현하는 이외의 외래 유전자를 발현시키는 능력을 가지는 바이러스, 본래의 바이러스가 가지는 전파성이나 바이러스 게놈의 복제능을 결손시킨 바이러스 등을 들 수 있고, 광의로는 같은 바이러스의 타입간 또는 서브 타입간에서 유전자를 재조합한 바이러스도 포함하는 것으로 한다.

「전파성」 또는 「전파력」이란, 감염이나 인공적인 방법으로 핵산이 세포 내에 도입된 후, 세포 내에 존재하는 상기 핵산이 복제 후, 감염성 입자 또는 그것에 준하는 복합체를 형성하고, 별도의 세포로 전파할 수 있는 능력을 의미한다.

「Core」는 HVC의 코어구조 단백질이다.

「E1」 및 「E2」는 모두 엔벨로프 구조 단백질이다.

「NS」는 HCV의 비구조 단백질을 가리키고, 바이러스 자신의 복제에 관여하는 단백질이다. 「NS2」는 메탈로프로테아제 활성을 갖는다. 「NS3」은 세린 프로테아제 활성(N말단측의 3분의 1)과 헬리카제 활성(C말단측의 3분의 2)을 갖는다. 「NS4A」는 NS3의 프로테아제 활성에 대한 보조인자이다. 「NS4B」는 기능이 명확하지 않다. 「NS5A」는 숙주세포의 정보 전달을 제어하는 활성을 갖는다고 여겨지고 있다. 「NS5B」는 RNA 의존 RNA 폴리메라아제 활성을 갖는다.

「IRES 서열」이란 RNA의 내부에 리보솜을 결합시켜서 번역을 개시시키는 것이 가능한 내부 리보솜 결합부위를 의미한다.

「발현 가능하게」란 프로모터, 엔한서(enhancer) 등의 조절 서열에 의해 목적 유전자의 전사·번역이 가능한 상태를 가리킨다.

2. HCV 서브게놈 RNA 레플리콘 유지 세포

야생형의 HCV 게놈은 약 3,000 아미노산의 전구체 단백질을 코드하는 약 9.6kb 길이의 단일쇄 RNA로 이루어진다. HCV 게놈은 5'비번역 영역(5'UTR), Core, E1, E2, p7, NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A, NS5B, 3'비번역 영역(3'UTR)의 순으로 구성되어 있다. 본 발명의 방법에서 사용되는 HCV 서브게놈 RNA 레플리콘은 5'비번역 영역, NS3, NS4A, NS4B, NS5A, NS5B, 3'비번역 영역의 순서로 구성된 개변 RNA를 포함한다. 이 RNA 레플리콘은 프로모터 등의 조절인자의 작용 하에서 복제 가능하게 특정의 세포에 도입된다.

RNA 레플리콘에는 또한, 외래 유전자 및/또는 IRES 서열이 포함되어도 좋다. 외래 유전자 및 IRES 서열은, 바람직하게는 5'비번역 영역과 NS3코드 서열과의 사이에 외래 유전자, IRES 서열의 순서로 위치할 수 있다.

IRES 서열의 바람직한 예로서는, 이하에 한정하는 것은 아니지만 EMCV IRES(뇌심근염 바이러스의 내부 리보솜 결합부위), FMDV IRES, HCV IRES 등을 들 수 있지만, EMCV IRES 및 HCV IRES가 보다 바람직하고, EMCV IRES가 가장 바람직하다.

외래 유전자로서 약제내성을 나타내는 유전자(즉, 이 유전자는 세포의 선택을 가능하게 하는 유전자이며, 상기 유전자를 갖는 세포는 그 약제에 대하여 내성을 가지게 된다.), 예를 들면 네오마이신, 하이그로마이신, 퓨로마이신, 제오신, 블라스티사이딘(Blasticidin), 티미딘 키나제(thymidine kinase), 카나마이신(kanamycin) 등을 코드하는 유전자; 리포터 유전자(즉, 이 유전자는 유전자 발현의 지표가 되는 유전자 산물을 코드하는 마커 유전자이다.), 예를 들면 루시페라아제(luciferase), 녹색형광 단백질(GFP), β-갈락토시다아제 등의 발광 반응이나 정색 반응을 촉매하는 효소를 코드하는 유전자; 또한, 유전자 치료용의 표적 유전자 또는 치료용 핵산, 예를 들면 인간을 포함하는 포유 동물에 있어서 치료를 필요로 하는 질환의 치료에 도움이 되는 여러 가지의 단백질, 예를 들면 효소, 사이토카인(cytokine), 케모카인(kemokine), 호르몬, 항체, 면역조절분자, 종상억제 단백질, 성장인자, 막 단백질 및 혈관 작동성 단백질을 코드하는 유전자, 안티센스 RNA, siRNA 등의 치료용 핵산 등이 사용된다.

HCV 서브게놈 RNA 레플리콘의 구체적인 예로서, pSGR-JFH1(도 2 중단), I₃₈₉/NS3-3'/wt(도 2 하단) 등을 들 수 있다. 이러한 HCV 서브게놈 RNA 레플리콘은, 예를 들면 본 발명자들의 간행물인 Kato, T. et al. Gastroenterology, 2003 125:1808-1817, 국제공개 WO2004/104198(특허문헌 3) 등에 기재되는 방법을 사용해서 제작할 수 있다.

HCV주의 염기서열을 사용한 계통 해석법에서는, HCV는 유전자형 1a, 유전자형 1b, 유전자형 2a, 유전자형 2b, 유전자형 3a, 유전자형 3b의 6타입으로 분류되고, 또한 그들 각 타입이 몇개의 서브 타입으로 분류된다. 그리고, HCV의 복수의 유전자형에 대해서는 그 게놈 전체 길이의 염기서열도 결정되어 있다(Simmonds, P. et al., Hepatology, 10(1994) p1321-1324, 및 Choo, Q.L et al., Science, 244(1989) p359-362, Okamoto, H et al., J. Gen. Virol.,73(1992) p673-679, Mori, S. et al., Biochem. Biophis. Res. Commun.183(1992) p334-342, 국제공개 WO2004/104198).

구체적으로는, 유전자형 1a의 HCV주로서는, H77c주(H77주의 공통염기서열(consensus sequence): GenBank 수납번호 AF011751), 1주(GenBank 수납번호 M62321), H주(GenBank 수납번호 M67463), HC-J1주(GenBank 수납번호 D10749) 등이 알려져 있다. 또 유전자형 1b의 HCV주로서는 J1주(GenBank 수납번호 D89815), con1주(GenBank 수납번호 AJ238799, Con-1주라고 칭하는 일도 있다), TH주(Wakita, T. et al., J. Biol. Chem.,(1994)269, p.14205-14210), J주(GenBank 수납번호 D90208), JT주(GenBank 수납번호 D01171), BK주(GenBank 수납번호 M58335) 등이 알려져 있다. 유전자형 2a의 HCV주로서는 JFH1주(GenBank 수납번호 AB047639, JFH-1주라고 칭하는 일도 있다), HC-J6주(GenBank 수납번호 D00944), JCH1주(GenBank 수납번호 AB047640), J6CF주(GenBank 수납번호 AF177036) 등이 알려져 있다. 또한 유전자형 2b의 HCV주로서는 HC-J8주(GenBank 수납번호 D01221) 등이, 유전자형 3a의 HCV주로서는 NZL1주(GenBank 수납번호 D17763), K3a/650주(GenBank 수납번호 D28917), 452주(GenBank 수납번호 DQ437509), E-b1주(Chan, S. et al., J. Gen. Virol.,73 p1131-1141(1992)) 등이, 유전자형 3b의 HCV주로서는 Tr주(Chayama, K. et al., J. Gen. Virol.,75 p3623-3628(1994)) 등이 알려져 있다. 또한 그 밖의 주 에 대해서도 이미 GenBank 수납번호 리스트가 보고되어 있다(Tokita, T. et al., J. Gen. Virol.79,1847-1857,1998, Cristina J.& Colina R. Virolgy Journal,3,1-8,2006).

본 발명에 사용되는 HCV 서브게놈 RNA 레플리콘을 구성하는 엘리먼트(즉, 5'비번역 영역, NS3, NS4A, NS4B, NS5A, NS5B 및 3'비번역 영역)는, 세포 내에서 복제가능도록 HCV 서브게놈 RNA 레플리콘을 구성할 수 있는 한, 상기 어떠한 유전자형 또는 그들의 서브 타입의 주로부터 유래해도 좋다. 또한, 본 발명은 감염성을 갖지만 전파성을 갖지 않는 재조합형 C형 간염 바이러스 유사 입자를 산생하는 방법이며, 산생된 바이러스 유사 입자의 전파성을 결여시키기 위해서, 본 발명의 RNA 레플리콘은 HCV의 구조 단백질(Core, E1, E2 및 p7)의 각각을 코드하는 유전자를 포함하지 않는 것이 바람직하다.

상기 엘리먼트의 각각은 동일한 HCV주로부터 유래해도 좋고, 2이상의 다른 HCV주로부터 유래하는 혼성(키메라)의 형태를 취해도 좋다. 바람직한 HCV주는 유전자형 1b 및 2a의 HCV주로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종의 주, 보다 바람직하게는 유전자형 1b의 HCV주인 con1주, 또는 유전자형 2a의 HCV주인 JFHI주이다. 또한, 본 발명에 있어서의 HCV주는, 예를 들면 친주로서의 con1주 또는 JFHI주에 있어서 자연히 또는 인위적으로 돌연변이가 생겨서 얻어진 단리주이며, 적어도 유전자형이 친주인 것으로부터 변화되어 있는 주(파생주)라도 좋다. 이 때 표현형 형질은 친주와 같거나 달라도 되지만, 형질적으로 동일한 주가 바람직하다.

HCV 서브게놈 RNA 레플리콘의 예는, JFH1주(유전자형 2a) 이외의 HCV주 게놈 유래의, 5'비번역 영역, NS3 단백질, NS4A 단백질, NS4B 단백질, NS5A 단백질을 코 드하는 서열 및 JFH1주의 NS5B 단백질을 코드하는 서열 및 3'비번역 영역으로 이루어지는 HCV 서브게놈 RNA 레플리콘; JFH1주의 5'비번역 영역, NS3 단백질, NS4A 단백질, NS4B 단백질, NS5A 단백질, NS5B 단백질을 코드하는 서열 및 3'비번역 영역으로 이루어지는 HCV 서브게놈 RNA 레플리콘; HCV-con1주(유전자형 1b, GenBank 수납번호 AJ238799, Lohmann,V. et al., Science 285(1999) p.110-113)의 5'비번역 영역, NS3 단백질, NS4A 단백질, NS4B 단백질, NS5A 단백질 및 NS5B 단백질을 코드하는 서열 및 3'비번역 영역으로 이루어지는 HCV 서브게놈 RNA 레플리콘 등이다. 또한 이들 HCV 서브게놈 RNA 레플리콘의 5'비번역 영역과 NS3 단백질 코드 서열의 사이에 원하는 외래 유전자와 IRES 서열을 함유해도 좋다.

HCV 게놈 RNA 상의 5'비번역 영역, 구조 단백질(Core, E1, E2 및 p7), 비구조 단백질(NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A,및 NS5B), 3'비번역 영역, 및 그 밖의 부위는, 예를 들면 유전자형 2a의 HCV JFH1주(일본 특허공개2002-171978호 공보)의 게놈 RNA에 대응하는 전체 길이 게놈 cDNA 서열(GenBank 수납번호 AB047639, Kato, T. et al., Gastroenterology,125(2003) p.1808-1817;서열번호 10. 코드되는 아미노산 서열도 서열번호 11로 나타낸다)을 기준으로 해서 규정할 수 있다.

일례로서, JFH1주 유래의 전체 길이 게놈 cDNA에 대해서, 본 발명에 있어서 HCV 서브게놈 RNA 레플리콘의 구성 요소로서 사용되는 5'비번역 영역은, 서열번호 10의 염기서열에 있어서의 염기번호 1∼340이며, 또 Core(코어) 단백질로부터 p7 단백질까지(Core, E1, E2, p7)를 코드하는 영역은, 염기번호 341∼2779이며, NS3 단백질로부터 3'비번역 영역까지(NS3, NS4A, NS4B, NS5A, NS5B, 3'UTR)를 코드하는 영역은 염기번호 3431∼9678이다. 이 JFH1주 유래의 각 영역의 서열과의 비교에 의해, 다른 HCV주 유래의 게놈 cDNA에 대해서도 각 영역을 특정할 수 있다.

HCV 서브게놈 RNA 레플리콘을 얻기 위해서, DNA 서열로부터 RNA를 전사하는 프로모터의 하류에 상기 HCV 서브게놈 RNA의 상보적인 DNA를 클론화한 벡터를 이용하여 DNA 의존적 RNA 폴리메라아제에 의해 합성할 수 있다. DNA 서열로부터 RNA를 전사하는 프로모터로서, T7, T3, SP6 등이 예시되지만, T7 프로모터가 바람직하고, T7 폴리메라아제에 의해 HCV 서브게놈 RNA를 합성할 수 있다. 이렇게 해서 합성된 HCV 서브게놈 RNA를 HCV의 증식을 허용하는 세포에 도입함으로써 상기 HCV 서브게놈 RNA 레플리콘을 자율 복제하는 세포를 제작할 수 있다.

세포로서는, 동물 세포, 예를 들면 어류, 파충류, 양서류, 조류 및 포유 동물 세포 등의 척추동물 세포가 바람직하고, 포유 동물 세포가 가장 바람직하다. 또한 예시하면, 세포에는 간장, 자궁 경부, 태아 콩팥 유래의 정상 세포, 종양 세포, 그들의 주화 세포 등이 포함되고, 예를 들면 Huh7, HepG2, IMY-N9, HeLa, HEK293 등의 세포(Date, T. et al., J. Biol. Chem.,279, p.22371-22376,(2004), Ito, T. et al., Hepatology 34, p.566-572,(2001)), 바람직하게는 Huh7, HepG2 또는 이들 세포로부터 파생되는 클론을 들 수 있다.

배양세포에서 상기 HCV 서브게놈 RNA를 복제시키는 별도의 방법으로서, RNA 레플리콘을 사용하지 않고 HCV cDNA를 이용한 계를 들 수 있다. HCV cDNA를 RNA 폴리메라아제 II형의 프로모터로 발현시키면, 전사된 RNA의 5'말단에는 CAP 구조가, 3'말단에는 폴리A쇄가 부가되어, 리보솜에서 단백질 합성의 주형으로서 이용되어 버려 HCV 게놈 RNA의 복제가 일어나지 않는다. 이 문제를 해결하기 위해서, Heller등은 HCV 게놈의 5'말단과 3'말단에 리보자임 서열을 연결하고, 세포 내에서 RNA 폴리메라아제 II에서 전사된 후, 리보자임에서 절단시킴으로써 캡과 폴리A가 부가 되지 않는 HCV RNA를 세포 내에서 합성을 할 수 있도록 DNA 벡터를 제작했다 (Heller T et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA.,102, p.2579-2583, 2005). 이 벡터를 세포 내에 도입함으로써 HCV 서브게놈 RNA 레플리콘을 복제하는 세포를 얻을 수 있다.

또한 별도의 방법으로서, 상기 HCV 서브게놈 RNA의 상보적인 DNA를 RNA 폴리메라아제 I 프로모터/터미네이터계의 벡터에 클론화하고, 상기 벡터를 HCV의 증식을 허용하는 세포에 도입함으로써 상기 HCV 서브게놈 RNA 레플리콘을 복제하는 세포를 얻을 수 있다. 보다 구체적으로는, pHH21(Neumann G. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA,96(1999) p9345-9350)을 사용할 수 있다. pHH21은 프로모터에 인간 RNA 폴리메라아제 I 프로모터, 터미네이터에 마우스 RNA 폴리메라아제 I 터미네이터로 이루어지는 벡터이다. HCV 서브게놈 레플리콘 RNA에 대한 cDNA의 5'단 및 3'단에, PCR을 이용하여 제한 효소 BsmBI 인식 서열을 각각 부가한 후, BsmBI에서 소화하고, pHH21의 BsmBI 부위에 HCV 게놈을 삽입하면, 프로모터/터미네이터와 HCV 게놈 사이에 여분의 염기서열을 포함하지 않고 연결할 수 있다.

HCV 서브게놈 RNA 레플리콘, 또는 HCV 서브게놈 RNA 레플리콘을 발현하는 벡터 등을 비롯한 벡터의 세포 내 도입은, 당업자에게 공지인 임의의 기술을 사용해서 행할 수 있다. 그러한 도입방법으로서는, 예를 들면 일렉트로포레이션, 파티클 건법, 리포펙션법, 인산칼슘법, 마이크로인젝션법, DEAE 덱스트란법 등을 들 수 있다.

본 발명에서는, 이상의 기재에 따라 본 발명에 따른 HCV 서브게놈 RNA 레플리콘을 세포 내에서 복제하고 있는 세포를 제작할 수 있다. 그러한 RNA 레플리콘은, 해당 세포 중에서 지속적으로 자율 복제하고 있기 때문에, RNA 분해를 받는 세포 내에서도 어느 정도의 양으로 유지된다. 따라서, 상기한 바와 같이 본 발명에 따른 HCV 서브게놈 RNA 레플리콘, 또는 HCV 서브게놈 RNA 레플리콘을 발현하는 벡터 등이 세포 내에 도입된 세포는, 그 RNA 레플리콘을 유지할 수 있다. 본 발명에 있어서 「RNA 레플리콘을 유지하는 세포」란, 상기 RNA 레플리콘이 그 자율 복제능에 의해 유의한 양으로 일과성이 아니라 지속적으로 세포 내에 존재하고 있는 것을 의미한다.

본 발명의 방법에서는, 본 발명의 HCV 서브게놈 RNA 레플리콘을 유지하는 세포에 후술하는 HCV 구조 단백질 발현 벡터를 도입해 발현시킴으로써, HCV 서브게놈 RNA 레플리콘이 패키징된 바이러스 유사 입자를 산생시킬 수 있다.

3. HCV 구조 단백질 발현 벡터의 구축

본 발명의 방법에 있어서는, HCV 서브게놈 RNA 레플리콘을 유지하는 세포 내에서 HCV 구조 단백질 유전자를 발현시켜서 HCV 구조 단백질을 공급하는 것이 바람직하다.

HCV 구조 단백질은 Core, E1, E2, p7로 이루어진다. HCV 구조 단백질을 공급하기 위한 이들의 단백질을 코드하는 유전자는, HCV의 유전자형에 한정되는 것은 아니고, 상기 유전자의 각각은 동일한 HCV주로부터 유래해도 좋고, 또는 2이상의 다른 HCV주로부터 유래해서 혼성(키메라)의 형태를 취해도 좋다. HCV 구조 단백질 유전자의 유래로서는, 1a, 1b, 2a, 2b, 3a 및 3b의 HCV주로부터 선택되는 적어도 1종류의 바이러스주이면 되지만, 바람직한 HCV주는 1a, 2a, 3a 및 3b으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종류의 바이러스주이며, 보다 바람직한 HCV주는 유전자형 1b 및 2a의 HCV주로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종류의 바이러스주이다. 더욱 바람직하게는 유전자형 1a의 H77c주, 1주, H주 및 HC-J1주 등, 유전자형 1b의 J1주, con1주, TH주, J주, JT주 및 BK주 등, 또는 유전자형 2a의 JFH1주, HC-J6주, JCH1주 및 J6CF주 등으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종류의 바이러스주이다. 특히 바람직하게는 유전자형 1a의 H77주, 유전자형 1b의 J1주 또는 유전자형 2a의 JFH1주, 가장 바람직하게는 JFH1주(GenBank 수납번호 AB047639, Kato, T. et al., Gastroenterology,125(2003) p1808-1817)이다.

이들 단백질을 발현시키는 방법으로서, 세포, 바람직하게는 동물 세포, 보다 바람직하게는 포유 동물 세포에서 발현할 수 있는 방법이면 어느 방법이라도 좋다. 바람직한 방법은 상기 유전자를 도입시킨 발현 벡터를 사용하는 방법이다.

본 발명의 바람직한 방법에 있어서는, HCV 구조 단백질을 공급하기 위해서 HCV 구조 단백질 발현 벡터(바람직하게는 HCV 구조 단백질 유전자를 프로모터 제어하에 발현되어질 수 있는 형태로 포함하는 발현 벡터)를, 상기 2에 기재한 HCV 서브게놈 RNA 레플리콘을 유지하는 세포에 도입하여 발현시킨다.

발현시키는 벡터로서, CDM8, pEF1/Myc-His1,2,3, pEF4/Myc-His1,2,3, pcDNA3.1, pREP4, pCEP(모두 인비트로젠사), pCl-neo(프로메가사) 등을 들 수 있다. 테트라사이클린으로 프로모터의 발현을 조정할 수 있는 프로모터를 포함하는 pcDNA5/TO(인비트로겐사)도 사용할 수 있다. 프로모터로서는, 동물 세포 중에서 발현할 수 있는 것이면 되고, 거대세포바이러스(cytomegalovirus)의 IE(immediate early) 프로모터, SV40 초기 또는 후기 프로모터, 메탈로티오네인 프로모터, 레트로바이러스 프로모터, 열쇼크 프로모터, SRα 프로모터, 신장인자 1α 프로모터, 알부민 프로모터 등을 들 수 있다.

또한, 이용가능한 벡터로서 바이러스 벡터를 들 수 있다. 동물 세포에 감염시켜서 원하는 외래 유전자를 발현시킬 수 있는 바이러스 벡터이면 좋지만, 바람직하게는, 레트로바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 신드비스 바이러스 벡터, 백시니아 바이러스 벡터를 들 수 있고, 특히 백시니아 바이러스 벡터는 대량의 유전자 산물을 발현시킬 수 있기 때문에(Elroy-Stein, O., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA,86(1989) p6126-6130), 백시니아 바이러스 벡터가 바람직하다.

본 발명의 방법에서 사용하는 HCV 구조 단백질 발현 벡터는, HCV 구조 단백질 유전자로서 Core 단백질 유전자, E1 단백질 유전자, E2 단백질 유전자, 및 p7 단백질 유전자를, 숙주세포 내에서 발현되어질 수 있는 상태로 포함하는 것이 바람직하다. 본 발명에 따른 그러한 HCV 구조 단백질 발현 벡터의 예는, Core 단백질 유전자, E1 단백질 유전자, E2 단백질 유전자, 및 p7 단백질 유전자를, 삽입 유전자의 발현을 가능하게 하는 프로모터의 제어하에 포함하는 벡터이다. 본 발명에서는, Core 단백질 유전자, E1 단백질 유전자, E2 단백질 유전자, 및 p7 단백질 유전 자를, 신장인자 1α(EF-1α) 프로모터의 제어하에 삽입한, 신장인자 1α 프로모터 함유 벡터를, 특히 바람직한 HCV 구조 단백질 발현 벡터로서 사용할 수 있다. 여기에서 「신장인자 1α 프로모터 함유 벡터」란, 신장인자 1α 유전자의 프로모터 서열(EF-1α 프로모터;Mizushima et. al., Nucleic Acids Res.,1990,18,5322)을, 그 제어하에 있는 유전자를 숙주세포 내에서 발현시킬 수 있는 배치로 함유하는 벡터를 의미한다. 예로서는, pEF1/Myc-His1,2,3, pEF4/Myc-His1,2,3 (모두 인비트로젠사)이 있다.

본 발명에 따른 HCV 구조 단백질 발현 벡터의 다른 바람직한 예는, Core 단백질 유전자, E1 단백질 유전자, E2 단백질 유전자, 및 p7 단백질 유전자를 발현가능한 상태에서 포함하는, 백시니아 바이러스 벡터(재조합형 백시니아 바이러스 벡터)이다. 재조합형 백시니아 바이러스 벡터의 제작에는, 예를 들면 DIs주, WR주, IBTd주(Meis, RJ & Condit, RC. Virol.182,442-454,(1992)) 등의 백시니아 바이러스주를 적합하게 사용할 수 있다. 재조합형 백시니아 바이러스 벡터의 제작 방법에 대해서는, 후술의 실시예에도 상세하게 설명되어 있다. 간단하게 설명하면, 백시니아 바이러스·트랜스퍼 벡터 중의 p.7.5 등의 백시니아 바이러스 프로모터의 제어하에 상기 HCV 구조 단백질 유전자를 클로닝하고, 또한 그 트랜스퍼 벡터를, 백시니아 바이러스를 감염시킨 세포에 전기천공법 등에 의해 도입하고, 그 세포를 배양해서 바이러스 입자를 산생시키며, 더욱 바람직하게는 그 바이러스를 선발해 순화함으로써, 원하는 재조합형 백시니아 바이러스 벡터를 제조할 수 있다. 이러한 백시니아 바이러스 벡터는 재조합 바이러스 유사 입자의 형태로 조제할 수 있다.

HCV의 구조 단백질(Core, E1, E2, p7)과 비구조 단백질(NS3, NS4A, NS4B, NS5A, 및 NS5B)은, 번역 영역으로부터 일련의 폴리프로테인으로서 번역된 후, 프로테아제에 의한 한정 분해를 받아서 유리, 생성되므로, 이들 HCV 구조 단백질을 발현시킬 경우, Core, E1, E2, p7의 일련의 폴리프로테인 단백질로서 발현시키는 것이 바람직하지만, 이들 단백질을 각각의 발현 벡터에서 발현시켜도 좋다.

구조 단백질 발현 벡터를 도입한 세포가 구조 단백질을 발현하고 있는지의 확인은, 세포배양액 또는 세포로부터 추출한 단백질을 구조 단백질에 대한 항체와 반응시킴으로써 검출할 수 있다(국제공개 WO2004/104198).

구체적으로는, 예를 들면 세포로부터 추출한 단백질 시료를 SDS-폴리아미드 겔 전기영동으로 분획한 후, 니트로셀루로오스막에 플롯팅하고, 그것에 대해서 항HCV 단백질 항체(예를 들면 항코어 특이적 항체, 또는 C형 간염환자로부터 채취한 항혈청)를 반응시키며, 또한 그 항체를 검출함(웨스턴블롯법)으로써 행할 수 있다.

또는, 같은 항체를 이용하여 HCV 단백질을 발현시키고 있는 세포를 면역염색 하고, 이들 단백질의 발현과 세포내 국재를 확인할 수 있다.

4. HCV 서브게놈 RNA 레플리콘의 입자에의 패키징

본 발명의 방법에서는, HCV 서브게놈 RNA 레플리콘을 유지하는 세포 내에 HCV 구조 단백질을 발현시키는 벡터를 공급함으로써, 그 세포 내에서 HCV 서브게놈 RNA 레플리콘이 구조 단백질에 의해 패키징된 바이러스 유사 입자를 산생시킨다.

HCV 서브게놈 RNA 레플리콘을 복제하고 있는 세포의 HCV 서브게놈 RNA 레플리콘을 바이러스 입자에 패키징하기 위해서는, 상기 세포에 구조 단백질(Core, E1, E2, p7) 발현 벡터를 도입해 발현시키면 된다. 또는, 구조 단백질(Core, E1, E2, p7)을 안정적으로 발현시킨 세포에 HCV 서브게놈 RNA를 도입해도 좋다.

그러한 도입방법으로서는, 예를 들면 일렉트로포레이션, 파티클건법, 리포펙션법, 인산칼슘법, 마이크로인젝션법, DEAE 덱스트란법 등의 공지의 방법을 들 수 있다.

5. 재조합형 HCV 바이러스 유사 입자의 산생

상기와 같이 해서 제작되는 HCV 서브게놈 RNA 레플리콘을 유지하는 세포에 있어서 HCV 구조 단백질(Core, E1, E2, p7) 유전자를 도입해 발현시킨 세포(재조합형 HCV 유사 입자 산생 세포)는, 재조합형 바이러스 유사 입자를 산생할 수 있다. 산생된 재조합형 HCV 유사 입자는 감염능을 가지고, HCV 서브게놈 RNA를 복제하는 능력을 가지지만, 감염 세포에서 자(子) 바이러스 입자를 산생할 수 없으므로, 결과적으로 전파성(전파력)을 가지지 않는다.

따라서, 본 발명의 재조합형 HCV 입자 산생 세포를 배양함으로써, 재조합형 HCV 유사 입자를 세포 배양계에서 제작할 수 있다. 바람직하게는, 재조합형 HCV 유사 입자 산생 세포를 배양하고, 그 배양물(바람직하게는 배양액) 속에 산생된 바이러스 유사 입자를 회수함으로써 HCV 유사 입자를 취득할 수 있다. 바이러스 유사 입자는, 예를 들면 상기 배양액으로부터 자당 밀도구배 원심분리 등의 방법에 의해 회수할 수 있다.

본 발명의 재조합형 HCV 유사 입자 산생 세포의 바이러스 입자 산생능은, 당업자에게 공지인 임의의 바이러스 검출법에 따라서 확인하면 된다. 예를 들면, 바 이러스 유사 입자를 산생하고 있다고 생각되는 세포의 배양액을 자당 밀도구배에 의해 분획하고, 각 분획의 밀도와 그 분획의 HCV 코어 단백질 농도 혹은 HCV 레플리콘 RNA 농도를 측정함으로써, 종래 알려져 있는 HCV의 비중과 일치하는지의 여부로 판단할 수 있다. 또한, 코어 단백질의 피크가 검출되는 획분의 밀도가, 0.25％ NP40(폴리옥시에틸렌(9)옥틸페닐에테르[Polyoxyethylene(9)Octylphenyl Ether])로 처리하고나서 분획했을 경우의 동 획분의 밀도와 비교해서 가벼운 경우에는, 상기세포는 바이러스 유사 입자 산생능을 갖는다고 판정할 수 있다.

또한 재조합형 HCV 유사 입자 산생 세포의 바이러스 유사 입자가 감염능을 가지는지의 여부는, 상기 바이러스 입자에 패키징된 HCV 서브게놈 RNA에 존재하는 외래 유전자의 표현형을 검출하면 된다. 예를 들면, 외래 유전자가 약제 저항성의 유전자이면 HCV 허용성 세포에 상기 바이러스 입자를 접종하고, 상기 약제 존재하에서 통상 2∼3주간 배양하고, 약제 저항성의 클론을 카운트하는 것으로 평가할 수 있다.

또한 재조합형 HCV 유사 입자 산생 세포의 바이러스 유사 입자가 감염 세포에서 자 바이러스 입자를 산생하지 않는 것을 확인하기 위해서는, 감염 세포의 추출물, 바람직하게는 감염 세포 배양 상청 중의 시료에 HCV 구조 단백질이 존재하는지의 여부를 상술한 웨스턴블롯법 등에 의해 판단할 수 있다.

본 발명의 방법으로 산생되는 재조합형 HCV 유사 바이러스 입자는, 세포(바람직하게는 HCV 허용성 세포)로의 감염능을 갖는다. 재조합형 HCV 유사 입자 산생 세포를 배양하고, 얻어진 배양물(바람직하게는, 배양액) 중의 바이러스 유사 입자 를 다른 세포(바람직하게는 HCV 허용성 세포)에 감염시키는 것을 포함하는, 재조합형 C형 간염 바이러스 감염 세포의 제조 방법도 제공한다. 여기에서, HCV 허용 세포란, HCV 게놈 RNA의 복제능 및/또는 HCV에 감염되는 능력을 갖는 세포이며, 이들에 한정되는 것은 아니다. 구체적으로는, 간장세포로서는 초대 간장세포나, Huh7 세포, HepG2 세포, IMY-N9 세포, HeLa 세포 등을 들 수 있고, 림프구계 세포로서는 Molt4 세포, HPB-Ma 세포, Daudi 세포 등을 들 수 있지만, 이들에 한정되는 것은 아니다.

또한, 이해하기 쉽도록, 상기 2절로부터 5절에서 설명한 재조합형 HCV 유사 입자의 산생 공정을, 개설적으로 도 1에 예시했다.

6. 유전자 도입용 벡터

본 발명의 방법으로 산생된 본 발명의 재조합형 HCV 유사 입자는, 그 RNA 게놈 상에, 상기 HCV주(유전자형 1a, 1b, 2a, 2b, 3a 및 3b, 바람직하게는 1b 및 2a로부터 선택되는 적어도 1종류의 바이러스주, 예를 들면 유전자형 1b의 con1주 또는 유전자형 2a의 JFH1주) 유래의, 5'비번역 영역과, NS3 단백질, NS4A 단백질, NS4B 단백질, NS5A 단백질 및 NS5B 단백질을 코드하는 염기서열과, 3'비번역 영역을 포함하는 염기서열을 포함한다,고 하는 특징을 갖는다.

이것에 더해서, 본 발명의 방법으로 재조합형 HCV 유사 입자 산생 세포에 있어서 산생된 HCV 유사 입자를 세포(예를 들면 상기 예시의 HCV 허용성 세포)에 감염시키면, 그 감염 세포 중에서는 상기와 같은 HCV 서브게놈 RNA가 복제되지만, 자 바이러스 입자는 형성되지 않는다,라고 하는 흥미깊은 특징을 갖는다.

본 발명의 재조합형 HCV 유사 입자에는, 그것에 패키징되는 HCV 서브게놈 RNA 레플리콘에 원하는 외래 유전자를 삽입함으로써, 유전자 도입/발현용의 벡터로서 사용할 수 있다. 그러한 외래 유전자를 포함하는 본 발명의 재조합형 HCV 유사 바이러스 입자는, 상기 외래 유전자를 5'비번역 영역과 IRES 서열 사이에 삽입한 HCV 서브게놈 RNA 레플리콘을 제작하고, 그것을 상기 본 발명의 방법으로 패키징함으로써 제작할 수 있다. 재조합형 HCV 입자 산생 세포에 있어서 산생된 HCV 입자는 전파력이 없으므로, 예를 들면 간장이나 림프구계 세포 또는 조직을 타깃으로 한 유전자 도입을 위한 벡터로서도 사용 가능하다.

본 발명의 바이러스 입자 산생의 방법으로 바이러스 입자 중에 패키징한 HCV 서브게놈 RNA는, 본 발명의 바이러스 유사 입자에 의해 감염된 HCV 허용성 세포 내에서는 염색체 게놈에 도입되는 일이 없으므로 유전자의 삽입에 의해 정상 유전자가 손상을 받거나 삽입된 부근의 유전자를 활성화하거나 하는 일이 없어 유리하다.

상기 특성 때문에, 본 발명의 벡터는 외래 유전자를 도입하고, 예를 들면 유전자 치료나 트랜스제닉 동물의 제작을 위해서 사용할 수 있다.

HCV 서브게놈 RNA 레플리콘에 도입해서 바이러스 입자에 패키징되는 외래 유전자(또는 외래 핵산)로서는, 인간을 포함하는 포유 동물 유래의 단백질, 예를 들면 질환에 따른 여러가지의 단백질, 예를 들면 효소, 사이토카인, 케모카인, 호르몬, 항체, 면역조절분자, 종상억제 단백질, 성장인자, 막 단백질 및 혈관작동성 단백질 등의 단백질, 폴리펩티드 또는 펩티드를 코드하는 유전자, 단백질의 번역을 저지 또는 억제하는 안티센스 RNA, siRNA 등의 치료용 핵산 등을 들 수 있지만, 특 별하게 한정되는 것은 아니다.

표적 HCV 감수성 세포 또는 조직은, 포유 동물 세포 또는 조직, 바람직하게는 인간 세포 또는 조직, 예를 들면 인간 간장 및 림프구계의 세포 또는 조직이다. 표적 세포 또는 조직에 대하여, 본 발명의 벡터를 in vivo, in vitro 또는 ex vivo 조건하에서 작용시킨다. 바람직하게는, 인간의 치료, 예를 들면 유전자 치료, 암 (예를 들면 간암, 임파종 등)의 치료 등을 위해, 본 발명의 벡터를 사용할 수 있다.

본 명세서는 본원의 우선권주장의 기초로 하는 일본국 특허출원 2005-287825호의 명세서 및/또는 도면에 기재되는 내용을 포함한다.

본 명세서에서 인용한 모든 간행물, 특허 및 특허출원의 전체가 참조에 의해 본 명세서에 포함되는 것으로 한다.

[실시예]

이하에 실시예를 들어 본 발명을 보다 구체적으로 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 설명을 위한 것이고, 본 발명의 범위를 제한하는 것은 아니다.

(실시예 1)

레플리콘 유지 세포의 제작

극증 간염의 환자로부터 분리한 C형 간염 바이러스인 JFH-1주(유전자형 2a)의 게놈 전체 길이 cDNA를 포함하는 DNA(JFH-1 클론:GenBank 수납번호 AB047639)를 pUC19 플러스미드 중의 T7 프로모터의 하류에 삽입한 pJFH1로부터, 구조 영역과 비구조 영역의 일부를 네오마이신 내성 유전자(neo;네오마이신 포스포 트랜스페라아 제 유전자라고도 칭한다) 및 EMCV-IRES(뇌심근염 바이러스의 내부 리보솜 결합부위)로 치환하고, 플러스미드 DNA pSGR-JFH1을 구축했다(도 2의 중단). 이 구축 순서는, 기보(Lohmann et al., Science,(1999)285, p.110-113)에 따랐다.

구체적으로는, 플러스미드 pJFH1을 제한 효소 AgeI 및 ClaI로 절단하고, 그 절단 부위에 pJFH1 유래의 5'NTR로부터 Core 영역에 미치는 서열과 pRSV5NEO 유래의 네오마이신 내성 유전자를 PCR 증폭에 의해 결합해 제한 효소 AgeI와 PmeI로 절단한 단편, 및 EMCV IRES로부터 NS3영역에 미치는 서열을 PCR 증폭에 의해 결합해 제한 효소 PmeI와 ClaI로 절단한 단편을, 삽입해 연결했다.

다음에, pSGR-JFH1을 제한 효소 XbaI로 절단했다. 이어서, 이들 XbaI 절단 단편의 각각 10∼20㎍을, Mung Bean Nuclease 20유닛(총 반응액량 50μl)을 이용하여 30℃에서 30분간 인큐베이트하고, 또한 처리했다. Mung Bean Nuclease는, 이중쇄 DNA 중의 단일쇄 부분을 선택적으로 분해하는 반응을 촉매하는 효소이다. 통상, 상기 XbaI 절단 단편을 그대로 주형으로서 사용해서 RNA 합성을 행하면, XbaI의 인식 서열의 일부인 CTGA의 4염기가 3'말단에 여분으로 부가된 레플리콘 RNA가 합성되어 버린다. 그래서 본 실시예에서는, XbaI 절단 단편을 Mung Bean Nuclease로 처리함으로써, XbaI 절단 단편으로부터 CTGA의 4염기를 제거했다. 이 후, XbaI 절단 단편을 포함하는 Mung Bean Nuclease 처리 후의 용액에 대해서, 통상법에 따른 단백질 제거처리에 의해 CTGA의 4염기가 제거된 XbaI 절단 단편을 정제하고, 이것을 주형 DNA로 했다.

다음에, 이 주형 DNA로부터, T7 RNA 폴리메라아제를 이용하여 RNA를 in vitro 합성했다. 이 RNA 합성에는 Ambion사의 MEGAscript를 사용했다. 주형 DNA를 0.5∼1.0㎍ 함유하는 반응액 20μl를 제조업자의 사용 설명서에 따라서 반응시켰다.

RNA 합성 종료 후, 반응 용액에 DNase(2유닛)을 첨가해서 37℃에서 15분간 반응시킨 후, 또한 산성 페놀에 의한 RNA 추출을 행하여 주형 DNA를 제거했다.

이 RNA(레플리콘 RNA) 0.01ng∼10㎍을 Huh7 세포로부터 추출한 토털 세포성 RNA와 혼합하고, RNA 총량이 10㎍가 되도록 조정했다. 이어서, 그 혼합 RNA를 일렉트로포레이션법에 의해 Huh7 세포에 도입했다. 일렉트로포레이션 처리를 행한 Huh7 세포를 배양접시에 파종하고, 16시간에서 24시간 배양한 후에, 배양접시에 G418(네오마이신)을 여러가지 농도로 첨가했다. 그 후에 주에 2회 배양액을 교환하면서 배양을 계속했다. 상기의 배양 21일 후의 배양접시로부터 생존 세포의 콜로니를 클론화하고, 배양을 계속했다. 이러한 콜로니의 클로닝에 의해 세포 클론을 복수주 수립할 수 있었다. HCV 서브게놈 RNA 레플리콘을 보유하는 하나의 세포주를 1H4.1이라고 명명했다.

또한, HCV 유전자형 1b의 Con-1주 유래의 게놈 전체 길이 cDNA로부터 상기와 같은 방법으로 제작된 HCV 서브게놈 RNA 레플리콘(GenBank 수납번호 :AJ242654;도 2의 하단의 I₃₈₉/NS3-3'/wt)이 Huh7 세포주에 도입되어서 제작된 상기 RNA 레플리콘을 유지하고 있는 세포주인 5-15세포(Lohmann et al., Science,(1999)285, p.110-113)도 실험에 사용했다.

(실시예 2)

구조 단백질 발현 벡터의 제작

1) 구조 단백질 발현 플러스미드 벡터

극증 간염으로부터 분리한 JFH1주(GenBank 수납번호 AB047639)(Kato T. et al., J. Med. Viol.2001,64:334-339)의 구조 영역 유전자(염기서열 번호 249∼2781)를 포함하는 영역을 PCR에서 증폭했다. 이 DNA 단편을 NheI와 EcoRI로 소화해서 얻어지는 구조 유전자를 포함하는 단편을 아가로스 겔 전기영동으로 정제하고, DNA 폴리메라아제에서 평활 말단으로 했다. 이 평활 말단화한 cDNA를 플러스미드 벡터 중의 CAG 프로모터 서열(CAG)의 하류에 삽입했다. 마찬가지로, 상기 NheI와 EcoRI로 소화해서 얻어진 구조 영역 유전자를 포함하는 cDNA를, 신장인자 1α 유전자 프로모터 서열(EF-1α프로모터;Mizushima et. al., Nucleic Acids Res.,1990,18,5322)을 가지는 벡터인 pEF4/Myc-His(인비트로젠사)의 SpeI와 EcoRI 사이에 삽입했다. 그 결과 얻어진 플러스미드를 각각 pCAGC-p7JFH1, pEF4C-p7JFH1이라 명명했다(도 3).

2) 구조 단백질을 발현하는 재조합 백시니아 바이러스 벡터

JFH1주의 구조 유전자를 함유하고, 그것이 코드하는 단백질을 발현할 수 있는 벡터를 제작하기 위해서, 우선 도 3 상단에 나타낸 pEF4C-p7JFH1을 제한효소 BamHI와 EcoRI로 소화하고, Core 단백질, E1 단백질, E2 단백질 및 p7 단백질을 코드하는 영역을 아가로스 겔 전기영동으로 분취했다. 다음에 이 단편을, 목적으로 하는 외래 유전자와 함께 XGPRT 유전자가 삽입되도록 설계된 백시니아 바이러스 트 랜스퍼 벡터 pDIsgptmH5에 연결했다(Ohnishi, K. et al., Jap. J. Infect. Dis.58(2005) p88-94, Ishii, K. et al., Virology 302(2002) p.433-444). 이 pDIsgptmH5는 pUc/DIs 벡터의 클로닝 사이트에 삽입된 백시니아 바이러스 p7.5 프로모터의 제어하에 대장균(Escherichia coli)의 크산틴-구아닌 포스포 리보실 트랜스페라아제(XGPRT) 유전자가 도입된 트랜스퍼 벡터이다(Ishii, K. et al., Virology 302(2002) p.433-444). 얻어진 벡터를 pDIsJFHst라고 명명했다.

H77c주의 구조 유전자를 함유하고, 그것이 코드하는 단백질을 발현할 수 있는 벡터를, 이하의 방법으로 제작했다. 우선 H77c주의 HCV 게놈 cDNA(GenBank 수납번호 AF011751)을 클론화한 벡터를 주형으로 해서, LA-PCR 키트(다카라 바이오사)에 첨부되어 있던, 10×완충액을 5μl, 2.5mM dNTP 혼합액을 5μl, 10μM의 프라이머H77/J1 forward(AAAGATCTGCGAAAGGCCTTGTGGTACTGC: 서열번호 1) 및 H77 reverse(AAGAGCTCTCATAACCCGACAAGAACAACGCCGCC: 서열번호 2)을 각각 1μl 첨가하고, 최종적으로 탈이온수를 첨가하여 전량을 49μl로 했다. 다음에 Takara LA Taq(다카라 바이오사)를 1μl 첨가하고나서 PCR 반응을 행하였다. PCR 반응은 98℃ 20초, 68℃ 5분으로 이루어지는 공정을 1사이클로 해서 25사이클의 조건으로 행하였다. 이 PCR 산물의 일부에 대해서 아가로스 겔로 전기영동을 행한 결과, 약 2.5kb의 증폭 산물이 확인되었다.

그래서, 이 PCR 산물 2μl를 이용하여, 증폭 산물을 플러스미드 벡터 중에 연결하는 라이게이션 반응을 행하였다. 이 라이게이션 반응물을 이용하여 상법에 따라 대장균을 형질 전환하고, 얻어진 형질 전환체로부터 플러스미드 DNA를 조제했 다. 이 플러스미드 DNA에 삽입된 DNA 단편을 잘라낼 수 있는 제한 효소로 소화하여 아가로스 겔 전기영동에 제공하고, 그 플러스미드 DNA에 약 2.5kb의 DNA 단편이 삽입되어 있는 것을 확인했다. 삽입되어 있는 DNA 단편의 염기서열은 상법에 의해 결정했다. 그 결과 결정된 염기서열은, GenBank 수납번호 AF011751의 염기서열의 271번으로부터 2819번까지의 서열과 일치하고 있었다. 이어서 이 플러스미드 DNA를, BglII와 SacI로 소화하여 아가로스 전기영동에 제공하고, H77c주의 구조유전자 영역을 포함하는 DNA 단편을 단리하여 백시니아 바이러스 트랜스퍼 벡터 pDIsgptmH5(Ohnishi, K. et al., Jap. J. Infect. Dis.58(2005) p88-94, Ishii, K. et al., Virology 302(2002) p433-444)에 연결했다. 그 결과 얻어진 벡터를 pDIsH77st라고 명명했다.

JI주의 구조 유전자를 함유하고, 그것이 코드하는 단백질을 발현할 수 있는벡터를, 이하의 방법으로 제작했다. J1주의 HCV 게놈 cDNA(GenBank 수납번호 D89815)를 클론화한 벡터를 주형으로 해서, LA-PCR 키트(다카라 바이오사)에 첨부되어 있던, 10×완충액을 5μl, 2.5mM dNTP 혼합액을 5μl, 10μM의 프라이머 H77/J1 forward(AAAGATCTGCGAAAGGCCTTGTGGTACTGC: 서열번호 1) 및 J1 reverse(AAGAGCTCTCATAGACCTACAAAAACCCCGCCTCC: 서열번호 3)을 각각 1μl 첨가하고, 최종적으로 탈이온수를 첨가하여 전량을 49μl로 했다. 다음에 Takara LA Taq(다카라 바이오사)를 1μl 첨가하고나서 PCR 반응을 행하였다. PCR 반응은 98℃ 20초, 68℃ 5분으로 이루어지는 공정을 1사이클로 해서 25사이클의 조건으로 행하였다. 이 PCR 산물의 일부에 대해서 아가로스 겔로 전기영동을 행한 결과, 약 2.5kb의 증폭 산물이 확인되었다. 여기서, 이 PCR 산물 2μl를 이용하여, 증폭 산물을 플러스미드 벡터 중에 연결하는 라이게이션 반응을 행하였다. 이 라이게이션반응물을 이용하여 상법에 따라 대장균을 형질 전환하고, 얻어진 형질전환체로부터 플러스미드 DNA를 조제했다. 이 플러스미드 DNA에 삽입된 DNA 단편을 잘라낼 수 있는 제한 효소로 소화하여 아가로스 겔 전기영동에 제공하고, 그 플러스미드 DNA에 약 2.5kb의 DNA 단편이 삽입되어 있는 것을 확인했다. 삽입되어 있는 DNA 단편의 염기서열은 상법에 의해 결정했다. 그 결과 결정된 염기서열은 GenBank 수납번호 D89815의 염기서열의 271번으로부터 2819번까지의 서열과 일치하고 있었다. 이어서 이 플러스미드 DNA를, BglII와 SacI로 소화하여 아가로스 전기영동에 제공하고, J1주의 구조 유전자 영역을 포함하는 DNA 단편을 단리하여 백시니아 바이러스 트랜스퍼 벡터 pDIsgptmH5(Ohnishi, K. et al., Jap. J. Infect. Dis.58(2005) p88-94, Ishii, K. et al., Virology 302(2002) p.433-444)에 연결했다. 그 결과 얻어진 벡터를 pDIsJ1st라고 명명했다.

J1주 유래의 Core 유전자와 JFH1주 유래의 E1, E2, p7 유전자로 이루어지는 키메라 구조 유전자 서열을 함유하고, 그들이 코드하는 단백질을 발현할 수 있는 벡터를, 이하의 방법으로 제작했다. 우선 J1주의 Core 유전자를 증폭하기 위해서, J1주의 HCV 게놈 cDNA(GenBank 수납번호 D89815)를 클론화한 벡터를 주형으로 해서, LA-PCR 키트(다카라 바이오사)에 첨부되어 있던, 10×완충액을 5μl, 2.5mM dNTP혼합액을 5μl, 10μM의 프라이머 H77/J1 forward(서열번호 1) 및 J1/JFH1 reverse(GTAGCTGCTACTGGTATTCTTCACCTGGGCAGCGGAAGCTGGGATGGTCAAACAGGACAG: 서열번 호 4)를 각각 1μl 첨가하고, 최종적으로 탈이온수를 첨가하여 전량을 49μl로 했다. 다음에 Takara LA Taq(다카라 바이오사)를 1μl 첨가하고나서 PCR 반응을 행하였다. PCR 반응은 98℃ 20초, 68℃ 5분으로 이루어지는 공정을 1사이클로 해서 25사이클의 조건으로 행하였다. JFH1주의 E1, E2, p7 유전자를 증폭하기 위해서, JFH1주의 HCV 게놈 cDNA(GenBank 수납번호 AB047639)를 클론화한 벡터를 주형으로 해서, LA-PCR 키트(다카라 바이오사)에 첨부되어 있던, 10×완충액을 5μl, 2.5mM dNTP 혼합액을 5μl, 10μM의 프라이머 J1/JFH1 forward(CTGTCCTGTTTGACCATCCCAGCTTCCGCTGCCCAGGTGAAGAATACCAGTAGCAGCTAC: 서열번호 5) 및 JFH1 reverse(AAGAGCTCTCAATCAATATCAACAAACCCACGCCT: 서열번호 6)을 각각 1μl 첨가하고, 최종적으로 탈이온수를 첨가하여 전량을 49μl로 했다. 다음에 Takara LA Taq(다카라 바이오사)를 1μl 첨가하고나서 PCR 반응을 행하였다. PCR 반응은 98℃ 20초, 68℃ 5분으로 이루어지는 공정을 1사이클로 해서 25사이클의 조건으로 행하였다. 얻어진 각각의 증폭 단편을 정제하고, 50μl 의 H₂O에 녹이고, 각각 1μl를 100배 희석해서 각 1μl를 하나로 혼합했다. 이 혼합액을 템플릿으로 해서 프라이머를 첨가하지 않고 상기의 조건으로 LA-PCR을 5사이클 행하였다. 그 후에 프라이머 H77/J1 forward(서열번호 1) 및 JFH1 reverse(서열번호 6)를 첨가하고, 또한 LA-PCR를 10사이클 행하여 증폭된 키메라 DNA 단편을 정제했다. 이 단편을 플러스미드 벡터에 클론화하고, 그 DNA 단편의 염기서열을 결정했다. 그 결과, 그 DNA 단편이 J1주 유래의 Core 유전자와 JFH1주 유래의 E1, E2, p7 유전자로 이 루어지는 키메라 구조 유전자 서열인 것이 확인되었다. 다음에 이 플러스미드를 BglII와 SacI로 소화해서 얻어지는 단편을 백시니아 바이러스 트랜스퍼 벡터pDIsgptmH5(Ohnishi, K. et al., Jap. J. Infect. Dis.58(2005) p88-94, Ishii, K. et al., Virology 302(2002) p433-444)에 연결했다. 그 결과 얻어진 벡터를 pDIsJ1(c)/JFH1(E1-p7)st라고 명명했다.

JFH1주 유래의 Core 유전자와 J1주 유래의 E1, E2, p7 유전자로 이루어지는 키메라 구조 유전자 서열을 함유하고, 그들이 코드하는 단백질을 발현할 수 있는 벡터를, 이하의 방법으로 제작했다. 우선 JFH1주의 Core 유전자를 증폭하기 위해서, JFH1주의 HCV 게놈 cDNA(GenBank 수납번호 AB047639)를 클론화한 벡터를 주형으로 해서, LA-PCR 키트(다카라 바이오사)에 첨부되어 있던, 10×완충액을 5μl, 2.5mM dNTP 혼합액을 5μl, 10μM의 프라이머 JFH1 forward(AAAGATCTGCGAAAGGCCTTGTGGTACTGC: 서열번호 7) 및 JFH1/J1 reverse(GGTATATCCCGGACACGTTGCGCACTTCATAAGCAGAGACCGGAACGGTGATGCAGGAC: 서열번호 8)을 각각 1μl 첨가하고, 최종적으로 탈이온수를 첨가하여 전량을 49μl로 했다. 다음에 Takara LA Taq(다카라 바이오사)를 1μl 첨가하고나서 PCR 반응을 행하였다. PCR 반응은, 98℃ 20초, 68℃ 5분으로 이루어지는 공정을 1사이클로 해서 25사이클의 조건으로 행하였다. J1주의 E1, E2, p7 유전자를 증폭하기 위해서, J1주의 HCV 게놈 cDNA(GenBank 수납번호 D89815)를 클론화한 벡터를 주형으로 해서, LA-PCR 키트(다카라 바이오사)에 첨부되어 있던, 10×완충액을 5μl, 2.5mM dNTP 혼합액을 5μl, 10μM의 프라이머 JFH1/J1 forward(GTCCTGCATCACCGTTCCGGTCTCTGCTTATGAAGTGCGCAACGTGTCCGGGATATACC: 서열번호 9) 및 J1 reverse(AAGAGCTCTCATAGACCTACAAAAACCCCGCCTCC: 서열번호 3)을 각각 1μl 첨가하고, 최종적으로 탈이온수를 첨가하여 전량을 49μl로 했다. 다음에 Takara LA Taq를 1μl 첨가하고나서 PCR 반응을 행하였다. PCR 반응은 98℃ 20초, 68℃ 5분으로 이루어지는 공정을 1사이클로 해서 25사이클의 조건으로 행하였다. 얻어진 각각의 증폭 단편을 정제하여 50μl의 H₂O에 녹이고, 각각 1μl를 100배 희석해서 각 1μl를 하나로 혼합했다. 이 혼합액을 템플릿으로 해서 프라이머를 첨가하지 않고 상기의 조건으로 LA-PCR를 5사이클 행하였다. 그 후에 프라이머 JFH1 forward(서열번호 7) 및 J1 reverse(서열번호 3)을 첨가하고, 또한 LA-PCR을 10사이클 행하여 증폭한 키메라 DNA 단편을 정제했다. 이 단편을 플러스미드 벡터에 클론화하고, 그 DNA 단편의 염기서열을 결정했다. 그 결과, 그 DNA 단편이 JFH1주 유래의 Core 유전자와 J1주 유래의 E1, E2, p7 유전자로 이루어지는 키메라 구조 유전자 서열인 것이 확인되었다. 다음에 이 플러스미드를 BglII와 SacI로 소화해서 얻어지는 단편을 백시니아 바이러스 트랜스퍼 벡터 pDIsgptmH5(Ohnishi, K. et al., Jap. J. Infect. Dis.58(2005) p88-94, Ishii, K. et al., Virology 302(2002) p433-444)에 연결했다. 그 결과 얻어진 벡터를 pDIsJFH(c)/J1(E1-p7)st라고 명명했다.

상기와 같이 해서 제작한 벡터 pDIsJFHst, pDIsH77st, pDIsJ1st, pDIsJ1(c)/JFH(E1-p7)st, 및 pDIsJFH(c)/J1(E1-p7)st에 삽입되어 있는 HCV 구조 유 전자 서열(키메라 구조 유전자 서열)의 맵을 도 4에 나타냈다.

상기 각 벡터를 갖는 재조합형 백시니아 바이러스 벡터 DIs주는, 예를 들면 이하와 같이 제작하고, 선택했다.

백시니아 바이러스 DIs주 약 10⁶ pfu(plaque forming unit)를 포함하는 500μl의 바이러스 액을, CEF(chick embryo fibroblast) 세포 약 10⁷개가 뿌려진 80mm샤알레에 접종하고, 15분마다 8회 진탕함으로써 바이러스를 세포에 감염시켰다. 그 후에 1ml의 10% FCS(fetal calf serum)를 포함하는 DMEM(Dalbecco-modified Eagle배지)을 첨가하여 37℃, 5% CO₂ 조건하에서 2시간 배양했다. 배지를 제거하고, PBS (phosphate-buffered serine)로 세정하고나서 0.05% 트립신 용액 0.5ml를 첨가하여 세포를 유리시킨 후, 세포 현탁액을 2000rpm으로 3분 원심해서 세포를 회수하고, 400μl의 PBS로 현탁했다. 이 세포 현탁액에 상기 트랜스퍼 벡터 10㎍을 용해하고, Gene Pulser II(Bio Rad사)를 이용하여 0.4cm 큐벳 중, 250v, 500μFD에서 1회 전압을 가해 전기천공법을 행하였다. 세포를 10% FCS를 포함하는 DMEM 2ml로 현탁하고, 35mm 샤알레에 뿌려서 37℃,5% CO₂ 조건하에서 7일간 배양했다. 감염 세포를 배지와 함께 회수하고, 동결 건조를 3회, 초음파 처리를 2분 행한 후, 같은 배지에서 10, 100, 1000배 희석했다. 35mm 샤알레에 10⁶개의 세포를 뿌리고, 배지(10% FCS를 포함하는 DMEM)에 MPA, 크산틴(xantine), 히포크산틴(hypoxantine)을 각각 25㎍/ml, 250㎍/ml, 15㎍/ml 첨가해서 밤새 배양한 후, 상기 희석 세포액을 접종했다. 15분마다 8회 진탕함으로써 바이러스를 세포에 감염시켜 희석 세포액을 제거하고나서, 1% 연한천 첨가 배지(10% FCS를 포함하는 DMEM, MPA, 크산틴, 히포크산틴을 포함한다) 2ml를 더해, 고화시키고나서 37℃, 5% CO₂ 조건하에서 7일간 배양했다. 형성된 플라크 부분을 파스츄어 피펫(Pasteur Pipette)으로 픽업하고, 200μl 의 10% FCS를 포함하는 DMEM에 현탁하고, 2분간 초음파 처리를 행해서 바이러스를 한천으로부터 방출시켰다. 이 배양액을 같은 배지에서 10, 100, 1000배 희석하고, 상기와 같은 플라크 분석(plaque assay) 조작을 또한 2회 반복해서 재조합 바이러스를 순화한 후, CEF 세포에 감염시켜서 스케일업을 행하였다.

이상과 같이 해서 pDIsJFHst, pDIsH77st, pDIsJ1st, pDIsJ1(c)/JFH(E1-p7)st, pDIsJFH(c)/J1(E1-p7)st로부터 각각 제작된 바이러스 벡터(재조합 바이러스 유사 입자)를, DIsJFHst, DIsH77st, DIsJ1st, DIsJ1(c)/JFH(E1-p7)st, DIsJFH(c)/J1(E1-p7)st라고 명명했다.

(실시예 3)

레플리콘 유지 세포로의 구조 단백질 발현 벡터 도입과 구조 단백질의 산생

레플리콘 유지 세포에서 HCV 구조 단백질을 발현시키기 위해서, 실시예 2에서 제작한 HCV 구조 단백질 발현 벡터 pCAGC-p7JFH1 또는 pEF4C-p7JFH1을 리포펙션법 등에 의해 레플리콘 유지 세포에 도입했다. 또한 실시예 2에서 제작한 HCV 구조 단백질을 발현하는 바이러스 벡터 DIsJFHst, DIsH77st, DIsJ1st, DIsJ1(c)/JFH(E1-p7)st 또는 DIsJFH(c)/J1(E1-p7)st를 레플리콘 유지 세포에 감염시켰다.

1) 구조 단백질 발현 플러스미드 벡터의 도입

pCAGC-p7JFH1을 리포펙션법으로 레플리콘 유지 세포 5-15에 도입한 후, 8ml의 배양액에서 배양을 계속하고, 4일 후에 배양 상청을 회수하여 HCV Core 단백질의 측정을 행하였지만 검출 한계 이하이었다.

한편, pEF4C-p7JFH1을 리포펙션법으로 레플리콘 유지 세포 IH4.1에 도입했다. 그 결과, 웨스턴블롯법으로 그 배양 상청에 HCV Core 단백질을 검출할 수 있었다. 그래서, pEF4C-p7JFH1을 도입한 레플리콘 유지 세포 IH4.1을 4일간 배양 후, 배양액(8ml)을 회수하고, 8,000g으로 60분간, 4℃에서 간원심하여 배양 상청을 모았다. 다음에 이 상청을 SW20 로터(베크만)로 25,000rpm, 4시간, 4℃에서 원심 하고, 펠릿을 1ml의 버퍼에 서스펜드했다. 샘플을 SW41E 로터(베크만)용의 튜브로 제작한 10∼60% 자당 밀도구배에 중층하고, 35,000 회전으로 16시간 4℃에서 원심했다. 10∼60% 자당 밀도구배는 60%(중량/중량) 자당 용액(50mM Tris pH7.5/0.1M NaCl/1mM EDTA에 용해) 2ml, 50% 자당 용액 1ml, 40% 자당 용액 1ml, 30% 자당 용액 1ml, 20% 자당 용액 1ml, 10% 자당 용액 1ml를 원심 튜브에 중층함으로써 조제했다.

원심 종료 후, 튜브의 밑바닥으로부터 0.5ml씩 획분을 회수했다. 각 획분의 밀도, HCV Core 단백질 농도 및 RNA 농도를 정량했다. HCV Core 단백질의 측정은 오르소 HCV 항원 IRMA 테스트를 사용해 행하였다(Aoyagi et al., J. Clin. Microbiol.,37(1999) p.1802-1808). HCV의 레플리콘 RNA의 정량은 Takeuchi(Takeuchi et al., Gastroenterology 116(1999) p.636-642)에 따랐다. 도 5에 나타내는 바와 같이, 2회의 실험에서 레플리콘 RNA와 Core 단백질의 피크는 어느 것이나 획분 8에 있어 양자는 일치했다. 이 획분의 밀도는 약 1.17g/ml이며, 보고되어 있는 HCV 입자의 밀도와 일치했다. 이것으로부터 바이러스 입자가 산생된 것이 나타내어졌다.

2) HCV 구조 단백질 발현 재조합형 백시니아 바이러스 벡터의 도입

레플리콘 유지 세포주 5-15를 10cm의 접시에 2×10⁶개 뿌리고, 다음날, 0.5pfu(plaque forming units)/cell의 DIsJFHst를 레플리콘 유지 세포주에 감염시켰다. 8ml의 배양액에서 배양을 계속했다. 4일간 배양 후 배양액을 회수하고, 8,000g으로 60분간, 4℃에서 원심하고, 배양 상청을 모았다. 다음에 이 상청을 SW20 로터(베크만)에서 25,000rpm, 4시간, 4℃로 원심하고, 세포 배양액 8ml분의 펠릿을 1ml의 0.2%의 NP40을 함유 버퍼 및 미함유 버퍼에서 현탁했다. 4℃에서 20분간 인큐베이션하고, 샘플을 SW41E로터(베크만)용의 튜브로 제작한 10∼60% 자당 밀도구배에 중층하고, 35,000 회전으로 16시간 4℃에서 원심했다. 10∼60% 자당 밀도구배는 60%(중량/중량) 자당 용액(50mM Tris pH7.5/0.1M NaCl/1mM EDTA에 용해) 2ml, 50% 자당 용액 1ml, 40% 자당 용액 1ml, 30% 자당 용액 1ml, 20% 자당 용액 1ml, 10% 자당 용액 1ml를 원심 튜브에 중층하는 것으로 제작했다.

원심종료 후, 튜브의 밑바닥으로부터 획분을 0.5ml씩 회수했다. 각 획분의 밀도, HCV Core 단백질 농도를 정량했다. HCV Core 단백질의 측정은 오르소 HCV 항원IRMA 테스트를 사용해 행하였다(Aoyagi et al., J. Clin. Microbiol.,37(1999) p.1802-1808).

2회의 독립된 실험 결과를 도 6에 나타냈다. NP40 비처리군(PBS처리)에서는, 코어 단백질을 함유하는 입자의 밀도(density)가 1.16g/ml(획분 7), NP40 처리한 군에서는, 코어 단백질을 함유하는 입자의 밀도가 1.21g/ml(획분 9)로 되었다. 이 것은 지방질을 포함해 비중이 가벼운 표면막이 NP40에 의해 바이러스 입자로부터 박리하고, 바이러스 유사 구조를 유지하지 않는 핵산과 Core 단백질만의 Core 입자가 되어 비중이 무거워진 것이라 생각되었다. 이 것으로부터, 본 실험계에서 완전한 바이러스 입자가 산생된 것은 시사되었다.

또한, 레플리콘 유지 세포주 5-15에, 바이러스 벡터 DIsJ1st, DIsJ1(c)/JFH(E1-p7)st, 또는 DIsJFH(c)/J1(E1-p7)st를, 각각 상기와 같은 방법으로 감염시켰다. 감염 후, 4일간 배양한 상청 8ml를 한외 여과막에서 농축하고, 상기에 기재한 자당 밀도구배 원심법으로 분획하였다. 각 획분의 밀도, HCV Core 단백질 농도를 정량했다. HCV Core 단백질의 밀도분포 패턴으로부터, DIsJ1st, DIsJ1(c)/JFH(E1-p7)st, 또는 DIsJFH(c)/J1(E1-p7)st를 감염시킨 배양 상청에는 산생된 바이러스 유사 입자가 포함되는 것이 나타내어졌다.

(실시예 4)

재조합형 HCV 유사 입자의 감염능의 확인

상기 실시예에서 제작한 재조합형 HCV입자는 도 1에 나타나 있는 바와 같이, 약제내성 마커로서 neo 유전자를 가지고 있다. 따라서, 실시예 3에서 얻어진 입자에 감염능이 있는지를 확인하기 위해서는, 본 입자를 Huh7 세포에 감염시켜 G418 (네오마이신) 내성 콜로니를 얻을 수 있는지를 조사하면 된다.

레플리콘 유지 세포주 5-15에 DIsJFHst를 감염시켜서 4일간 배양해서 얻은 배양 상청을 한외 여과막(cut off 1×10⁵ Da)에서 30배로 농축하고, Huh7 세포에 감염시켰다. 감염 후, 배양접시에 G418을 1mg/ml로 첨가했다. 그 후에 주에 2회 배양액을 교환하면서 배양을 계속했다. 파종시부터 21일간 배양한 후, 크리스탈 바이올렛에서 생존 세포를 염색했다. 그 결과, 콜로니 형성을 확인할 수 있었다.

감염 세포 중에 HCV 구조 단백질이 검출되지 않으면, 감염 세포에서는 자 입자가 산생되어 있지 않게 된다. 따라서, 본 실험에서 형성된 콜로니를 증식시켜 그 세포 추출액을 조제했다. 이어서, 이들 추출액 중의 단백질을 SDS-PAGE 및 웨스턴블롯법에 의해 해석했다. 해석에 있어서 Core 유전자를 포함하는 발현 플러스미드 DNA를 Huh7 세포에 일과성으로 트랜스펙션해서 얻어진 세포 추출액을 양성 대조로 했다. 또한, 트랜스펙션하지 않은 Huh7 세포로부터 얻어진 세포 추출액을 음성 대조로 했다. 각각의 세포 클론으로부터 추출한 시료를 SDS-PAGE를 행한 후, PVDF막(Immobilon- P ,Millipore사제)에 블롯팅하고, 항Core 특이적 항체(클론 2H9 항체)와 이들 항체를 인식하는 HRP 표식 2차 항체를 이용하여, ECL(아마샴팔마시아사)에서 세포 내에서 번역된 Core 단백질을 분석한 결과, 감염 세포에 코어 단백질을 검출할 수 없었다. 따라서, 감염 세포에서는 자 바이러스 입자는 산생되어 있지 않다고 판단했다. 이 것은, 본 발명의 방법으로 제작한 재조합 HCV 유사 입자는, 일단 다른 세포에 감염된 후는 또한 입자로서 재산생되지 않고, 따라서 다른 세포 에 그 이상감염을 확산시키는 능력(전파력)을 가지지 않는 것을 의마하고 있다.

본 발명에 의해, 원하는 외래 유전자를 포함하는 HCV 서브게놈 RNA를 패키징한 전파성이 없는 재조합형 감염성 HCV 유사 입자와 그 제조 방법을 제공하는 것이 가능해졌다. 이러한 재조합형 감염성 HCV 유사 입자는 전파성이 결여되어 있다고 하는 이점을 갖기 때문에, 포유 동물, 특히 인간의 간장이나 림프구계의 세포 또는 조직으로의 in vivo 또는 ex vivo 유전자 도입을 개재하는 유전자 치료에 사용할 수 있거나, 또는 트랜스제닉 동물을 제작하기 위한 바이러스 벡터로서, 또한 약독화 백신으로서 사용할 수 있다.

SEQUENCE LISTING <110> Director General of National Institute of Infectious Diseases Tokyo Metropolitan Organization for Medical Research Toray Industries, Inc. <120> New recombinant human hepatitis C virus particle and method for production of same <130> PH-2921-PCT <150> JP 2005-287825 <151> 2005-09-30 <160> 14 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <220> <223> Inventor: Tanabe, Jun-ichi; Sone, Saburo; Wakita, Takaji Inventor: Ishii, Takashi; Suzuki, Ryosuke; Suzuki, Tetsurou Inventor: Miyamura Tatsuo <400> 1 aaagatctgc gaaaggcctt gtggtactgc 30 <210> 2 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 2 aagagctctc ataacccgac aagaacaacg ccgcc 35 <210> 3 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 3 aagagctctc atagacctac aaaaaccccg cctcc 35 <210> 4 <211> 60 <212> DNA <213> 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ata ttg atc acc ctc ttc aca ctc acc ccg 2851 Ile Gly Val Gly Leu Leu Ile Leu Ile Thr Leu Phe Thr Leu Thr Pro 825 830 835 ggg tat aag acc ctc ctc ggc cag tgt ctg tgg tgg ttg tgc tat ctc 2899 Gly Tyr Lys Thr Leu Leu Gly Gln Cys Leu Trp Trp Leu Cys Tyr Leu 840 845 850 ctg acc ctg ggg gaa gcc atg att cag gag tgg gta cca ccc atg cag 2947 Leu Thr Leu Gly Glu Ala Met Ile Gln Glu Trp Val Pro Pro Met Gln 855 860 865 gtg cgc ggc ggc cgc gat ggc atc gcg tgg gcc gtc act ata ttc tgc 2995 Val Arg Gly Gly Arg Asp Gly Ile Ala Trp Ala Val Thr Ile Phe Cys 870 875 880 885 ccg ggt gtg gtg ttt gac att acc aaa tgg ctt ttg gcg ttg ctt ggg 3043 Pro Gly Val Val Phe Asp Ile Thr Lys Trp Leu Leu Ala Leu Leu Gly 890 895 900 cct gct tac ctc tta agg gcc gct ttg aca cat gtg ccg tac ttc gtc 3091 Pro Ala Tyr Leu Leu Arg Ala Ala Leu Thr His Val Pro Tyr Phe Val 905 910 915 aga gct cac gct ctg ata agg gta tgc gct ttg gtg aag cag ctc gcg 3139 Arg Ala His Ala Leu Ile Arg Val Cys Ala Leu Val Lys Gln Leu Ala 920 925 930 ggg ggt agg tat gtt cag gtg gcg cta ttg gcc ctt ggc agg tgg act 3187 Gly Gly Arg Tyr Val Gln Val Ala Leu Leu Ala Leu Gly Arg Trp Thr 935 940 945 ggc acc tac atc tat gac cac ctc aca cct atg tcg gac tgg gcc gct 3235 Gly Thr Tyr Ile Tyr Asp His Leu Thr Pro Met Ser Asp Trp Ala Ala 950 955 960 965 agc ggc ctg cgc gac tta gcg gtc gcc gtg gaa ccc atc atc ttc agt 3283 Ser Gly Leu Arg Asp Leu Ala Val Ala Val Glu Pro Ile Ile Phe Ser 970 975 980 ccg atg gag aag aag gtc atc gtc tgg gga gcg gag acg gct gca tgt 3331 Pro Met Glu Lys Lys Val Ile Val Trp Gly Ala Glu Thr Ala Ala Cys 985 990 995 ggg gac att cta cat gga ctt ccc gtg tcc gcc cga ctc ggc cag gag 3379 Gly Asp Ile Leu His Gly Leu Pro Val Ser Ala Arg Leu Gly Gln Glu 1000 1005 1010 atc ctc ctc ggc cca gct gat ggc tac acc tcc aag ggg tgg aag ctc 3427 Ile Leu Leu Gly Pro Ala Asp Gly Tyr Thr Ser Lys Gly Trp Lys Leu 1015 1020 1025 ctt gct ccc atc act gct tat gcc cag caa aca cga ggc ctc ctg ggc 3475 Leu Ala Pro Ile Thr Ala Tyr Ala Gln Gln Thr Arg Gly Leu 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ggc cgc ttg cac gtc aac cag cga gtc gtc gtt gcg ccg gat 5443 Ile Ile Gly Arg Leu His Val Asn Gln Arg Val Val Val Ala Pro Asp 1690 1695 1700 aag gag gtc ctg tat gag gct ttt gat gag atg gag gaa tgc gcc tct 5491 Lys Glu Val Leu Tyr Glu Ala Phe Asp Glu Met Glu Glu Cys Ala Ser 1705 1710 1715 agg gcg gct ctc atc gaa gag ggg cag cgg ata gcc gag atg ttg aag 5539 Arg Ala Ala Leu Ile Glu Glu Gly Gln Arg Ile Ala Glu Met Leu Lys 1720 1725 1730 tcc aag atc caa ggc ttg ctg cag cag gcc tct aag cag gcc cag gac 5587 Ser Lys Ile Gln Gly Leu Leu Gln Gln Ala Ser Lys Gln Ala Gln Asp 1735 1740 1745 ata caa ccc gct atg cag gct tca tgg ccc aaa gtg gaa caa ttt tgg 5635 Ile Gln Pro Ala Met Gln Ala Ser Trp Pro Lys Val Glu Gln Phe Trp 1750 1755 1760 1765 gcc aga cac atg tgg aac ttc att agc ggc atc caa tac ctc gca gga 5683 Ala Arg His Met Trp Asn Phe Ile Ser Gly Ile Gln Tyr Leu Ala Gly 1770 1775 1780 ttg tca aca ctg cca ggg aac ccc gcg gtg gct tcc atg atg gca ttc 5731 Leu Ser Thr Leu Pro Gly Asn Pro Ala Val Ala 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atc tct tgt caa aag ggg tac aag ggt 6403 Lys Leu Pro Gly Leu Pro Phe Ile Ser Cys Gln Lys Gly Tyr Lys Gly 2010 2015 2020 gtg tgg gcc ggc act ggc atc atg acc acg cgc tgc cct tgc ggc gcc 6451 Val Trp Ala Gly Thr Gly Ile Met Thr Thr Arg Cys Pro Cys Gly Ala 2025 2030 2035 aac atc tct ggc aat gtc cgc ctg ggc tct atg agg atc aca ggg cct 6499 Asn Ile Ser Gly Asn Val Arg Leu Gly Ser Met Arg Ile Thr Gly Pro 2040 2045 2050 aaa acc tgc atg aac acc tgg cag ggg acc ttt cct atc aat tgc tac 6547 Lys Thr Cys Met Asn Thr Trp Gln Gly Thr Phe Pro Ile Asn Cys Tyr 2055 2060 2065 acg gag ggc cag tgc gcg ccg aaa ccc ccc acg aac tac aag acc gcc 6595 Thr Glu Gly Gln Cys Ala Pro Lys Pro Pro Thr Asn Tyr Lys Thr Ala 2070 2075 2080 2085 atc tgg agg gtg gcg gcc tcg gag tac gcg gag gtg acg cag cat ggg 6643 Ile Trp Arg Val Ala Ala Ser Glu Tyr Ala Glu Val Thr Gln His Gly 2090 2095 2100 tcg tac tcc tat gta aca gga ctg acc act gac aat ctg aaa att cct 6691 Ser Tyr Ser Tyr Val Thr Gly Leu Thr Thr Asp Asn Leu Lys Ile Pro 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8323 Leu Leu Lys Ala Trp Ala Glu Lys Lys Asp Pro Met Gly Phe Ser Tyr 2650 2655 2660 gat acc cga tgc ttc gac tca acc gtc act gag aga gac atc agg acc 8371 Asp Thr Arg Cys Phe Asp Ser Thr Val Thr Glu Arg Asp Ile Arg Thr 2665 2670 2675 gag gag tcc ata tac cag gcc tgc tcc ctg ccc gag gag gcc cgc act 8419 Glu Glu Ser Ile Tyr Gln Ala Cys Ser Leu Pro Glu Glu Ala Arg Thr 2680 2685 2690 gcc ata cac tcg ctg act gag aga ctt tac gta gga ggg ccc atg ttc 8467 Ala Ile His Ser Leu Thr Glu Arg Leu Tyr Val Gly Gly Pro Met Phe 2695 2700 2705 aac agc aag ggt caa acc tgc ggt tac aga cgt tgc cgc gcc agc ggg 8515 Asn Ser Lys Gly Gln Thr Cys Gly Tyr Arg Arg Cys Arg Ala Ser Gly 2710 2715 2720 2725 gtg cta acc act agc atg ggt aac acc atc aca tgc tat gtg aaa gcc 8563 Val Leu Thr Thr Ser Met Gly Asn Thr Ile Thr Cys Tyr Val Lys Ala 2730 2735 2740 cta gcg gcc tgc aag gct gcg ggg ata gtt gcg ccc aca atg ctg gta 8611 Leu Ala Ala Cys Lys Ala Ala Gly Ile Val Ala Pro Thr Met Leu Val 2745 2750 2755 tgc ggc gat gac cta gta 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Arg Gly Asp Arg Cys 645 650 655 Asp Leu Glu Asp Arg Asp Arg Ser Gln Leu Ser Pro Leu Leu His Ser 660 665 670 Thr Thr Glu Trp Ala Ile Leu Pro Cys Thr Tyr Ser Asp Leu Pro Ala 675 680 685 Leu Ser Thr Gly Leu Leu His Leu His Gln Asn Ile Val Asp Val Gln 690 695 700 Tyr Met Tyr Gly Leu Ser Pro Ala Ile Thr Lys Tyr Val Val Arg Trp 705 710 715 720 Glu Trp Val Val Leu Leu Phe Leu Leu Leu Ala Asp Ala Arg Val Cys 725 730 735 Ala Cys Leu Trp Met Leu Ile Leu Leu Gly Gln Ala Glu Ala Ala Leu 740 745 750 Glu Lys Leu Val Val Leu His Ala Ala Ser Ala Ala Asn Cys His Gly 755 760 765 Leu Leu Tyr Phe Ala Ile Phe Phe Val Ala Ala Trp His Ile Arg Gly 770 775 780 Arg Val Val Pro Leu Thr Thr Tyr Cys Leu Thr Gly Leu Trp Pro Phe 785 790 795 800 Cys Leu Leu Leu Met Ala Leu Pro Arg Gln Ala Tyr Ala Tyr Asp Ala 805 810 815 Pro Val His Gly Gln Ile Gly Val Gly Leu Leu Ile Leu Ile Thr Leu 820 825 830 Phe Thr Leu Thr Pro Gly Tyr Lys Thr Leu Leu Gly Gln Cys Leu Trp 835 840 845 Trp Leu Cys Tyr Leu Leu Thr Leu Gly Glu Ala Met Ile Gln Glu Trp 850 855 860 Val Pro Pro Met Gln Val Arg Gly Gly Arg Asp Gly Ile Ala Trp Ala 865 870 875 880 Val Thr Ile Phe Cys Pro Gly Val Val Phe Asp Ile Thr Lys Trp Leu 885 890 895 Leu Ala Leu Leu Gly Pro Ala Tyr Leu Leu Arg Ala Ala Leu Thr His 900 905 910 Val Pro Tyr Phe Val Arg Ala His Ala Leu Ile Arg Val Cys Ala Leu 915 920 925 Val Lys Gln Leu Ala Gly Gly Arg Tyr Val Gln Val Ala Leu Leu Ala 930 935 940 Leu Gly Arg Trp Thr Gly Thr Tyr Ile Tyr Asp His Leu Thr Pro Met 945 950 955 960 Ser Asp Trp Ala Ala Ser Gly Leu Arg Asp Leu Ala Val Ala Val Glu 965 970 975 Pro Ile Ile Phe Ser Pro Met Glu Lys Lys Val Ile Val Trp Gly Ala 980 985 990 Glu Thr Ala Ala Cys Gly Asp Ile Leu His Gly Leu Pro Val Ser Ala 995 1000 1005 Arg Leu Gly Gln Glu Ile Leu Leu Gly Pro Ala Asp Gly Tyr Thr Ser 1010 1015 1020 Lys Gly Trp Lys Leu Leu Ala Pro Ile Thr Ala Tyr Ala Gln Gln Thr 1025 1030 1035 1040 Arg Gly Leu Leu Gly Ala Ile Val Val Ser Met Thr Gly Arg Asp Arg 1045 1050 1055 Thr Glu Gln Ala Gly Glu Val Gln Ile Leu Ser Thr Val Ser Gln Ser 1060 1065 1070 Phe Leu Gly Thr Thr Ile Ser Gly Val Leu Trp Thr Val Tyr His Gly 1075 1080 1085 Ala Gly Asn Lys Thr Leu Ala Gly Leu Arg Gly Pro Val Thr Gln Met 1090 1095 1100 Tyr Ser Ser Ala Glu Gly Asp Leu Val Gly Trp Pro Ser Pro Pro Gly 1105 1110 1115 1120 Thr Lys Ser Leu Glu Pro Cys Lys Cys Gly Ala Val Asp Leu Tyr Leu 1125 1130 1135 Val Thr Arg Asn Ala Asp Val Ile Pro Ala Arg Arg Arg Gly Asp Lys 1140 1145 1150 Arg Gly Ala Leu Leu Ser Pro Arg Pro Ile Ser Thr Leu Lys Gly Ser 1155 1160 1165 Ser Gly Gly Pro Val Leu Cys Pro Arg Gly His Val Val Gly Leu Phe 1170 1175 1180 Arg Ala Ala Val Cys Ser Arg Gly Val Ala Lys Ser Ile Asp Phe Ile 1185 1190 1195 1200 Pro Val Glu Thr Leu Asp Val Val Thr Arg Ser Pro Thr Phe Ser Asp 1205 1210 1215 Asn Ser Thr Pro Pro Ala Val Pro Gln Thr Tyr Gln Val Gly Tyr Leu 1220 1225 1230 His Ala Pro Thr Gly Ser Gly Lys Ser Thr Lys Val Pro Val Ala Tyr 1235 1240 1245 Ala Ala Gln Gly Tyr Lys Val Leu Val Leu Asn Pro Ser Val Ala Ala 1250 1255 1260 Thr Leu Gly Phe Gly Ala Tyr Leu Ser Lys Ala His Gly Ile Asn Pro 1265 1270 1275 1280 Asn Ile Arg Thr Gly Val Arg Thr Val Met Thr Gly Glu Ala Ile Thr 1285 1290 1295 Tyr Ser Thr Tyr Gly Lys Phe Leu Ala Asp Gly Gly Cys Ala Ser Gly 1300 1305 1310 Ala Tyr Asp Ile Ile Ile Cys Asp Glu Cys His Ala Val Asp Ala Thr 1315 1320 1325 Ser Ile Leu Gly Ile Gly Thr Val Leu Asp Gln Ala Glu Thr Ala Gly 1330 1335 1340 Val Arg Leu Thr Val Leu Ala Thr Ala Thr Pro Pro Gly Ser Val Thr 1345 1350 1355 1360 Thr Pro His Pro Asp Ile Glu Glu Val Gly Leu Gly Arg Glu Gly Glu 1365 1370 1375 Ile Pro Phe Tyr Gly Arg Ala Ile Pro Leu Ser Cys Ile Lys Gly Gly 1380 1385 1390 Arg His Leu Ile Phe Cys His Ser Lys Lys Lys Cys Asp Glu Leu Ala 1395 1400 1405 Ala Ala Leu Arg Gly Met Gly Leu Asn Ala Val Ala Tyr Tyr Arg Gly 1410 1415 1420 Leu Asp Val Ser Ile Ile Pro Ala Gln Gly Asp Val Val Val Val Ala 1425 1430 1435 1440 Thr Asp Ala Leu Met Thr Gly Tyr Thr Gly Asp Phe Asp Ser Val Ile 1445 1450 1455 Asp Cys Asn Val Ala Val Thr Gln Ala Val Asp Phe Ser Leu Asp Pro 1460 1465 1470 Thr Phe Thr Ile Thr Thr Gln Thr Val Pro Gln Asp Ala Val Ser Arg 1475 1480 1485 Ser Gln Arg Arg Gly Arg Thr Gly Arg Gly Arg Gln Gly Thr Tyr Arg 1490 1495 1500 Tyr Val Ser Thr Gly Glu Arg Ala Ser Gly Met Phe Asp Ser Val Val 1505 1510 1515 1520 Leu Cys Glu Cys Tyr Asp Ala Gly Ala Ala Trp Tyr Asp Leu Thr Pro 1525 1530 1535 Ala Glu Thr Thr Val Arg Leu Arg Ala Tyr Phe Asn Thr Pro Gly Leu 1540 1545 1550 Pro Val Cys Gln Asp His Leu Glu Phe Trp Glu Ala Val Phe Thr Gly 1555 1560 1565 Leu Thr His Ile Asp Ala His Phe Leu Ser Gln Thr Lys Gln Ala Gly 1570 1575 1580 Glu Asn Phe Ala Tyr Leu Val Ala Tyr Gln Ala Thr Val Cys Ala Arg 1585 1590 1595 1600 Ala Lys Ala Pro Pro Pro Ser Trp Asp Ala Met Trp Lys Cys Leu Ala 1605 1610 1615 Arg Leu Lys Pro Thr Leu Ala Gly Pro Thr Pro Leu Leu Tyr Arg Leu 1620 1625 1630 Gly Pro Ile Thr Asn Glu Val Thr Leu Thr His Pro Gly Thr Lys Tyr 1635 1640 1645 Ile Ala Thr Cys Met Gln Ala Asp Leu Glu Val Met Thr Ser Thr Trp 1650 1655 1660 Val Leu Ala Gly Gly Val Leu Ala Ala Val Ala Ala Tyr Cys Leu Ala 1665 1670 1675 1680 Thr Gly Cys Val Ser Ile Ile Gly Arg Leu His Val Asn Gln Arg Val 1685 1690 1695 Val Val Ala Pro Asp Lys Glu Val Leu Tyr Glu Ala Phe Asp Glu Met 1700 1705 1710 Glu Glu Cys Ala Ser Arg Ala Ala Leu Ile Glu Glu Gly Gln Arg Ile 1715 1720 1725 Ala Glu Met Leu Lys Ser Lys Ile Gln Gly Leu Leu Gln Gln Ala Ser 1730 1735 1740 Lys Gln Ala Gln Asp Ile Gln Pro Ala Met Gln Ala Ser Trp Pro Lys 1745 1750 1755 1760 Val Glu Gln Phe Trp Ala Arg His Met Trp Asn Phe Ile Ser Gly Ile 1765 1770 1775 Gln Tyr Leu Ala Gly Leu Ser Thr Leu Pro Gly Asn Pro Ala Val Ala 1780 1785 1790 Ser Met Met Ala Phe Ser Ala Ala Leu Thr Ser Pro Leu Ser Thr Ser 1795 1800 1805 Thr Thr Ile Leu Leu Asn Ile Met Gly Gly Trp Leu Ala Ser Gln Ile 1810 1815 1820 Ala Pro Pro Ala Gly Ala Thr Gly Phe Val Val Ser Gly Leu Val Gly 1825 1830 1835 1840 Ala Ala Val Gly Ser Ile Gly Leu Gly Lys Val Leu Val Asp Ile Leu 1845 1850 1855 Ala Gly Tyr Gly Ala Gly Ile Ser Gly Ala Leu Val Ala Phe Lys Ile 1860 1865 1870 Met Ser Gly Glu Lys Pro Ser Met Glu Asp Val Ile Asn Leu Leu Pro 1875 1880 1885 Gly Ile Leu Ser Pro Gly Ala Leu Val Val Gly Val Ile Cys Ala Ala 1890 1895 1900 Ile Leu Arg Arg His Val Gly Pro Gly Glu Gly Ala Val Gln Trp Met 1905 1910 1915 1920 Asn Arg Leu Ile Ala Phe Ala Ser Arg Gly Asn His Val Ala Pro Thr 1925 1930 1935 His Tyr Val Thr Glu Ser Asp Ala Ser Gln Arg Val Thr Gln Leu Leu 1940 1945 1950 Gly Ser Leu Thr Ile Thr Ser Leu Leu Arg Arg Leu His Asn Trp Ile 1955 1960 1965 Thr Glu Asp Cys Pro Ile Pro Cys Ser Gly Ser Trp Leu Arg Asp Val 1970 1975 1980 Trp Asp Trp Val Cys Thr Ile Leu Thr Asp Phe Lys Asn Trp Leu Thr 1985 1990 1995 2000 Ser Lys Leu Phe Pro Lys Leu Pro Gly Leu Pro Phe Ile Ser Cys Gln 2005 2010 2015 Lys Gly Tyr Lys Gly Val Trp Ala Gly Thr Gly Ile Met Thr Thr Arg 2020 2025 2030 Cys Pro Cys Gly Ala Asn Ile Ser Gly Asn Val Arg Leu Gly Ser Met 2035 2040 2045 Arg Ile Thr Gly Pro Lys Thr Cys Met Asn Thr Trp Gln Gly Thr Phe 2050 2055 2060 Pro Ile Asn Cys Tyr Thr Glu Gly Gln Cys Ala Pro Lys Pro Pro Thr 2065 2070 2075 2080 Asn Tyr Lys Thr Ala Ile Trp Arg Val Ala Ala Ser Glu Tyr Ala Glu 2085 2090 2095 Val Thr Gln His Gly Ser Tyr Ser Tyr Val Thr Gly Leu Thr Thr Asp 2100 2105 2110 Asn Leu Lys Ile Pro Cys Gln Leu Pro Ser Pro Glu Phe Phe Ser Trp 2115 2120 2125 Val Asp Gly Val Gln Ile His Arg Phe Ala Pro Thr Pro Lys Pro Phe 2130 2135 2140 Phe Arg Asp Glu Val Ser Phe Cys Val Gly Leu Asn Ser Tyr Ala Val 2145 2150 2155 2160 Gly Ser Gln Leu Pro Cys Glu Pro Glu Pro Asp Ala Asp Val Leu Arg 2165 2170 2175 Ser Met Leu Thr Asp Pro Pro His Ile Thr Ala Glu Thr Ala Ala Arg 2180 2185 2190 Arg Leu Ala Arg Gly Ser Pro Pro Ser Glu Ala Ser Ser Ser Val Ser 2195 2200 2205 Gln Leu Ser Ala Pro Ser Leu Arg Ala Thr Cys Thr Thr His Ser Asn 2210 2215 2220 Thr Tyr Asp Val Asp Met Val Asp Ala Asn Leu Leu Met Glu Gly Gly 2225 2230 2235 2240 Val Ala Gln Thr Glu Pro Glu Ser Arg Val Pro Val Leu Asp Phe Leu 2245 2250 2255 Glu Pro Met Ala Glu Glu Glu Ser Asp Leu Glu Pro Ser Ile Pro Ser 2260 2265 2270 Glu Cys Met Leu Pro Arg Ser Gly Phe Pro Arg Ala Leu Pro Ala Trp 2275 2280 2285 Ala Arg Pro Asp Tyr Asn Pro Pro Leu Val Glu Ser Trp Arg Arg Pro 2290 2295 2300 Asp Tyr Gln Pro Pro Thr Val Ala Gly Cys Ala Leu Pro Pro Pro Lys 2305 2310 2315 2320 Lys Ala Pro Thr Pro Pro Pro Arg Arg Arg Arg Thr Val Gly Leu Ser 2325 2330 2335 Glu Ser Thr Ile Ser Glu Ala Leu Gln Gln Leu Ala Ile Lys Thr Phe 2340 2345 2350 Gly Gln Pro Pro Ser Ser Gly Asp Ala Gly Ser Ser Thr Gly Ala Gly 2355 2360 2365 Ala Ala Glu Ser Gly Gly Pro Thr Ser Pro Gly Glu Pro Ala Pro Ser 2370 2375 2380 Glu Thr Gly Ser Ala Ser Ser Met Pro Pro Leu Glu Gly Glu Pro Gly 2385 2390 2395 2400 Asp Pro Asp Leu Glu Ser Asp Gln Val Glu Leu Gln Pro Pro Pro Gln 2405 2410 2415 Gly Gly Gly Val Ala Pro Gly Ser Gly Ser Gly Ser Trp Ser Thr Cys 2420 2425 2430 Ser Glu Glu Asp Asp Thr Thr Val Cys Cys Ser Met Ser Tyr Ser Trp 2435 2440 2445 Thr Gly Ala Leu Ile Thr Pro Cys Ser Pro Glu Glu Glu Lys Leu Pro 2450 2455 2460 Ile Asn Pro Leu Ser Asn Ser Leu Leu Arg Tyr His Asn Lys Val Tyr 2465 2470 2475 2480 Cys Thr Thr Ser Lys Ser Ala Ser Gln Arg Ala Lys Lys Val Thr Phe 2485 2490 2495 Asp Arg Thr Gln Val Leu Asp Ala His Tyr Asp Ser Val Leu Lys Asp 2500 2505 2510 Ile Lys Leu Ala Ala Ser Lys Val Ser Ala Arg Leu Leu Thr Leu Glu 2515 2520 2525 Glu Ala Cys Gln Leu Thr Pro Pro His Ser Ala Arg Ser Lys Tyr Gly 2530 2535 2540 Phe Gly Ala Lys Glu Val Arg Ser Leu Ser Gly Arg Ala Val Asn His 2545 2550 2555 2560 Ile Lys Ser Val Trp Lys Asp Leu Leu Glu Asp Pro Gln Thr Pro Ile 2565 2570 2575 Pro Thr Thr Ile Met Ala Lys Asn Glu Val Phe Cys Val Asp Pro Ala 2580 2585 2590 Lys Gly Gly Lys Lys Pro Ala Arg Leu Ile Val Tyr Pro Asp Leu Gly 2595 2600 2605 Val Arg Val Cys Glu Lys Met Ala Leu Tyr Asp Ile Thr Gln Lys Leu 2610 2615 2620 Pro Gln Ala Val Met Gly Ala Ser Tyr Gly Phe Gln Tyr Ser Pro Ala 2625 2630 2635 2640 Gln Arg Val Glu Tyr Leu Leu Lys Ala Trp Ala Glu Lys Lys Asp Pro 2645 2650 2655 Met Gly Phe Ser Tyr Asp Thr Arg Cys Phe Asp Ser Thr Val Thr Glu 2660 2665 2670 Arg Asp Ile Arg Thr Glu Glu Ser Ile Tyr Gln Ala Cys Ser Leu Pro 2675 2680 2685 Glu Glu Ala Arg Thr Ala Ile His Ser Leu Thr Glu Arg Leu Tyr Val 2690 2695 2700 Gly Gly Pro Met Phe Asn Ser Lys Gly Gln Thr Cys Gly Tyr Arg Arg 2705 2710 2715 2720 Cys Arg Ala Ser Gly Val Leu Thr Thr Ser Met Gly Asn Thr Ile Thr 2725 2730 2735 Cys Tyr Val Lys Ala Leu Ala Ala Cys Lys Ala Ala Gly Ile Val Ala 2740 2745 2750 Pro Thr Met Leu Val Cys Gly Asp Asp Leu Val Val Ile Ser Glu Ser 2755 2760 2765 Gln Gly Thr Glu Glu Asp Glu Arg Asn Leu Arg Ala Phe Thr Glu Ala 2770 2775 2780 Met Thr Arg Tyr Ser Ala Pro Pro Gly Asp Pro Pro Arg Pro Glu Tyr 2785 2790 2795 2800 Asp Leu Glu Leu Ile Thr Ser Cys Ser Ser Asn Val Ser Val Ala Leu 2805 2810 2815 Gly Pro Arg Gly Arg Arg Arg Tyr Tyr Leu Thr Arg Asp Pro Thr Thr 2820 2825 2830 Pro Leu Ala Arg Ala Ala Trp Glu Thr Val Arg His Ser Pro Ile Asn 2835 2840 2845 Ser Trp Leu Gly Asn Ile Ile Gln Tyr Ala Pro Thr Ile Trp Val Arg 2850 2855 2860 Met Val Leu Met Thr His Phe Phe Ser Ile Leu Met Val Gln Asp Thr 2865 2870 2875 2880 Leu Asp Gln Asn Leu Asn Phe Glu Met Tyr Gly Ser Val Tyr Ser Val 2885 2890 2895 Asn Pro Leu Asp Leu Pro Ala Ile Ile Glu Arg Leu His Gly Leu Asp 2900 2905 2910 Ala Phe Ser Met His Thr Tyr Ser His His Glu Leu Thr Arg Val Ala 2915 2920 2925 Ser Ala Leu Arg Lys Leu Gly Ala Pro Pro Leu Arg Val Trp Lys Ser 2930 2935 2940 Arg Ala Arg Ala Val Arg Ala Ser Leu Ile Ser Arg Gly Gly Lys Ala 2945 2950 2955 2960 Ala Val Cys Gly Arg Tyr Leu Phe Asn Trp Ala Val Lys Thr Lys Leu 2965 2970 2975 Lys Leu Thr Pro Leu Pro Glu Ala Arg Leu Leu Asp Leu Ser Ser Trp 2980 2985 2990 Phe Thr Val Gly Ala Gly Gly Gly Asp Ile Phe His Ser Val Ser Arg 2995 3000 3005 Ala Arg Pro Arg Ser Leu Leu Phe Gly Leu Leu Leu Leu Phe Val Gly 3010 3015 3020 Val Gly Leu Phe Leu Leu Pro Ala Arg 3025 3030 <210> 12 <211> 13 <212> DNA <213> Hepatitis C virus <400> 12 ctagccgagt agc 13 <210> 13 <211> 26 <212> DNA <213> Hepatitis C virus <400> 13 ccccggcagg cttatgccta gaattc 26 <210> 14 <211> 6 <212> PRT <213> Hepatitis C virus <400> 14 Pro Arg Gln Ala Tyr Ala 1 5

Claims

(i) 유전자형 1a, 1b, 2a, 2b, 3a 및 3b의 C형 간염 바이러스주로 이루어지는 군에서 선택되는 1종류 이상의 바이러스주로부터 유래하는 게놈 RNA 상의, 5'비번역 영역과, NS3 단백질, NS4A 단백질, NS4B 단백질, NS5A 단백질 및 NS5B 단백질을 코드하는 염기서열과, 3'비번역 영역을 포함하는 염기서열을 포함하는 RNA 레플리콘을 유지하는 세포에,

(ii) 유전자형 1a, 1b, 2a, 2b, 3a 및 3b의 C형 간염 바이러스주로 이루어지는 군에서 선택되는 1종류 이상의 바이러스주이며 상기 (i)과 같거나 또는 다른 C형 간염 바이러스주 유래의 Core 단백질, E1 단백질, E2 단백질 및 p7 단백질을 발현시키는 벡터를 도입하고,

상기 세포를 배양하여 산생된 바이러스 유사 입자를 회수하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합형 C형 간염 바이러스 유사 입자를 산생하는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 (i)의 유전자형 1b의 C형 간염 바이러스주가 con1주이며, 상기 (i)의 유전자형 2a의 C형 간염 바이러스주가 JFH1주인 것을 특징으로 하는 재조합형 C형 간염 바이러스 유사 입자를 산생하는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 (ii)의 유전자형 1a의 C형 간염 바이러스주가 H77c주, 1주, H주, 및 HC-J1주인 것을 특징으로 하는 재조합형 C형 간염 바이러스 유사 입자를 산생하는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 (ii)의 유전자형 1b의 C형 간염 바이러스주가 J1주, con1주, TH주, J주, JT주, 및 BK주인 것을 특징으로 하는 재조합형 C형 간염 바이러스 유사 입자를 산생하는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 (ii)의 유전자형 2a의 C형 간염 바이러스주가 JFH1주, HC-J6주, JCH1주, 및 J6CF주인 것을 특징으로 하는 재조합형 C형 간염 바이러스 유사 입자를 산생하는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 (ii)의 유전자형 3a의 C형 간염 바이러스주가 NZL1주, K3a/650주, 452주, 및 E-b1주인 것을 특징으로 하는 재조합형 C형 간염 바이러스 유사 입자를 산생하는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 (ii)의 유전자형 3b의 C형 간염 바이러스주가 Tr주인 것을 특징으로 하는 재조합형 C형 간염 바이러스 유사 입자를 산생하는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 (ii)의 벡터가 백시니아 바이러스 벡터 또는 EF-1α프로모터 함유 벡터인 것을 특징으로 하는 재조합형 C형 간염 바이러스 유사 입자를 산생하는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 RNA 레플리콘이 1개 이상의 내부 리보솜 결합부위(IRES) 서열 및/또는 1개 이상의 외래 유전자를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합형 C형 간염 바이러스 유사 입자를 산생하는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 IRES 서열 및/또는 외래 유전자가 상기 5'비번역 영역과 상기 NS3 단백질 코드 서열 사이에 위치하는 것을 특징으로 하는 재조합형 C형 간염 바이러스 유사 입자를 산생하는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 세포는 동물 세포인 것을 특징으로 하는 재조합형 C형 간염 바이러스 유사 입자를 산생하는 방법..
제 11 항에 있어서, 상기 동물 세포는 Huh7 세포, HepG2 세포 또는 그들의 세포로부터 파생된 주화 세포인 것을 특징으로 하는 재조합형 C형 간염 바이러스 유사 입자를 산생하는 방법.
제 1 항에 기재된 방법에 의해 산생되고 감염성을 갖고 있지만 전파력을 갖지 않는 것을 특징으로 하는 재조합형 C형 간염 바이러스 유사 입자.