ES2376354T3 - Nueva part�?cula recombinante similar al virus de la hepatitis c humano y procedimiento para producir la misma. - Google Patents

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Abstract

Un procedimiento para producir una partícula recombinante similar al virus de la hepatitis C que comprende, introducirla en (i) una célula portadora de un replicón de ARN subgenómico que no incluye genes que codifican las proteínas estructurales del virus de la hepatitis C y que comprende una secuencia nucleotídica que comprende la región no traducida 5', la secuencia nucleotídica codificante para la proteína no estructural, y la región no traducida 3' de un ARN genómico obtenido a partir de una cepa del virus de la hepatitis C del genotipo 1b que es una cepa con1 o una cepa obtenida a partir del mismo en la que las proteínas no estructurales son las proteínas NS3, NS4A, NS4B, NS5A y NS5B (ii) un vector del virus vaccinia o un promotor EF-1α portador del vector que expresa las proteínas Core, E1, E2 y p7 obtenidas a partir de al menos una cepa de virus seleccionada entre el grupo que consiste en cepas del virus de la hepatitis C del genotipo 1a, 1b, 2a, 2b, 3a y 3b que es diferente de la cepa del virus de la hepatitis C que se ha definido en (i) cultivar la célula y recuperar la partícula similar al virus producida.

Description

Nueva partícula recombinante similar al virus de la hepatitis C humano y procedimiento para producir la misma
Campo técnico
La presente invención se refiere a una partícula recombinante similar al virus de la hepatitis C humano y un procedimiento para producir el mismo.
Técnica antecedente
Los productos para introducir un gen en una célula animal se clasifican en líneas generales en procedimiento fisioquímicos y procedimientos biológicos. Los ejemplos de procedimientos fisioquímicos incluyen procedimientos tales como coprecipitación con fosfato cálcico, DEAE dextrano, lipofección, microinyección y electroporación. Los ejemplos de procedimientos biológicos incluyen procedimientos que usan vectores virales.
Un procedimiento de vector viral es un procedimiento en el que un gen se introduce utilizando el mecanismo de invasión celular de un virus, es decir, la capacidad de infección.
Las proteínas estructurales derivadas de virus (nucleocápside, proteína de envoltura, etc.) existen sobre la superficie de una partícula vírica recombinante preparada usando un vector viral, que tiene un mecanismo para la introducción eficaz de un gen de forma que el virus pueda infectar una célula a través de un receptor sobre la superficie celular. Por lo tanto, una partícula recombinante viral preparada usando un vector viral de este tipo puede usarse no solo para introducir un gen en una célula animal, para generar una célula que expresa el gen de interés, sino también para realizar la terapia génica, construir un animal transgénico, y así sucesivamente.
Los vectores virales se agrupan en vectores retrovíricos, vectores de virus de ADN y vectores de virus de ARN, y se caracterizan por la longitud de un gen que puede introducirse, si el gen se incorpora en el genoma cromosómico en una célula, o si el gen se introduce únicamente a una célula de división o puede también introducirse en una célula no divisible, los tipos de células que pueden infectarse, la citotoxicidad, la eficacia de la introducción génica, y así sucesivamente, que dependen del tipo del virus original.
Los retrovirus tienen un ARN de hebra positiva como genoma. Este ARN tiene propiedades características a ARNm de células eucariotas, específicamente, una estructura casquete metilada en el extremo 5' y una cola de poliA de aproximadamente 200 nucleótidos en el extremo 3'. En una célula infectada, este ARN se convierte en ADN por transcriptasa inversa del virus. Además, el ADN se incorpora en el ADN genómico del huésped por las acciones de las enzimas codificadas por los genes virales. El ADN incorporado se denomina provirus. Aparece una secuencia repetitiva (repetición terminal larga: LTR) en cualquier extremo de un provirus, y se sintetiza ARN viral por un promotor existente en esta secuencia. Las proteínas virales se trasladan del ARN sintetizado, y se incorpora un ARN del tamaño del genoma en la partícula vírica, que se libera fuera de la célula como una partícula hija.
La estructura de ARN requerida para la producción de una partícula vírica incluye LTR en cualquier extremo, un sitio de unión al cebador intercalado entre las mismas, una señal de encapsidación y una señal de polipurina. Estos son factores cis esenciales. Por otra parte, los genes que codifican las proteínas virales no son esenciales como factores cis, y la replicación y la producción de una partícula normalmente ocurren una vez que las proteínas virales se suministran en la célula infectada.
Por lo tanto, para producir retrovirus recombinantes, se prepara un vector a partir del cual los genes codificados por el retrovirus, tales como gag, pol y env, se eliminan y en el que se inserta en su lugar un gen de interés que se va a expresar (denominado vector retrovírico), y este vector se introduce en una célula en la que se suministran proteínas virales (denominadas normalmente como una célula empaquetadora) para preparar una partícula retrovírica incorporada con un gen extraño (Documento que no corresponde a una patente 1).
Los ejemplos de retrovirus incluyen virus de la leucemia de ratón, virus de la leucemia felina, oncovirus tipo C del babuino, virus de la inmunodeficiencia humana, virus de la leucemia de linfocitos T del adulto, y así sucesivamente. Además, los ejemplos de los indicados como vectores recombinantes retrovíricos incluyeron los basados en el virus de la leucemia de ratón (Documento que no corresponde a una patente 1), los basados en el virus de la inmunodeficiencia humana (Documento que no corresponde a una patente 2), y así sucesivamente.
Un sistema para la producción de un retrovirus recombinante consiste en dos unidades de componentes, específicamente, un vector retrovírico portador de la información genética (un gen extraño de interés) que se va a introducir y todos los factores requeridos para el empaquetamiento y la incorporación del genoma viral en cis (ADN recombinante retrovírico) y una célula empaquetadora de retrovirus que suministra proteínas víricas codificadas por los genes gag, pol y env. La partícula retrovírica recombinante no puede liberarse por una célula empaquetadora en solitario en la que se introduce un vector recombinante que expresa los genes gag, pol y env.
Para producir una partícula retrovírica recombinante, las proteínas gag, pol y env han de situarse en trans. Por lo tanto, introduciendo un vector retrovírico en una célula empaquetadora en la que se introduce un vector recombinante que expresa los genes gag, pol y env, puede producirse un retrovirus recombinante portador de la información genética mantenido en el vector que se ha mencionado anteriormente. Posteriormente, cuando una célula se infecta con estos virus, el vector retrovírico se incorporará al genoma cromosomal en la célula de acuerdo con el ciclo vital del retrovirus natural.
Por lo tanto, el procedimiento del vector retrovírico es un sistema construido con el fin de incorporar de forma eficaz un ADN específico en el genoma cromosomal del huésped. Sin embargo, ya que la ubicación del gen de interés que se va a insertar puede no predecirse, no pueden descartarse las posibilidades de que el gen normal pueda dañarse por la inserción, los genes en la proximidad del sitio de inserción puedan activarse, y el gen extraño de interés pueda sobreexpresarse o bajoexpresarse. Para superar estos problemas, se promovió el desarrollo de un sistema de expresión transitorio que usaba un vector vírico de ADN que podía utilizarse como un gen extracromosómico.
Un vector del virus de ADN es un vector obtenido a partir de un virus de ADN. El virus de ADN lleva ADN en su partícula vírica como información genética. Este ADN se replica por la repetición de un procedimiento de producción de una hebra complementaria usando su propio ADN como plantilla por enzimas de replicación de ADN dependientes de ADN obtenido del huésped al menos como parte de los catalizadores. Los ejemplos de vectores del virus de ADN que pueden utilizarse como un gen extracromosómico incluyen vectores adenovirales.
Un adenovirus humano tiene ADN de doble hebra lineal con aproximadamente 36 kb como genoma, y las regiones incluidas en este genoma se dividen a grandes rasgos en los genes tempranos E1, E2, E3 y E4 y los genes tardíos L1, L2, L3, L4 y L5. Los genes tempranos están implicados principalmente en la replicación del virus, y los genes tardíos están implicados en la síntesis de proteínas estructurales víricas, tales como una cápside. Un vector adenovírico usado para la introducción de un gen se prepara reemplazando la región E1 (dividida en E1A y E1B, y todos los promotores adenovíricos se activan por E1A), un gen temprano, por un gen extraño deseado (gen de interés) y se prolifera usando 293 células, una línea celular que puede suministrar E1A en trans (293 células expresan E1A). Un vector de adenovirus deficiente en la región E1A no puede proliferar en una célula normal, lo que no expresa E1A. Ya que la región E3 no es esencial para la propagación del virus, a menudo se elimina para aumentar el tamaño de inserción de un gen extraño. Ya que los adenovirus pueden empaquetar un genoma hasta el 105% del tamaño del genoma de un tipo natural en su cápside, puede insertarse un gen extraño de hasta 8,1 kb mediante la deleción de las regiones E1 y E3 (Documento que no corresponde a una patente 3).
Un vector adenovírico puede introducir un gen en una célula no creciente o una célula de crecimiento (Documento que no corresponde a una patente 4). Por lo tanto, este procedimiento es adecuado para los procedimientos de introducción de genes in vivo. Una de las desventajas de este vector es el periodo de expresión génica (en unidades de semana) generalmente corto. Esto se debe a que el genoma adenovírico existe solo dentro de una región extracromosómica (episoma) y no se replica ni amplifica. Una segunda desventaja es que el adenovirus que se usa comúnmente en el presente provoca reacciones inflamatorias no específicas e intensifica una respuesta inmune mediada por células frente al propio vector. Por lo tanto, es difícil realizar una administración continua en terapia génica (Documento que no corresponde a una patente 5).
Se están desarrollando vectores víricos basados en virus de ARN. El virus de ARN se replica repitiendo el procedimiento de generar una hebra complementaria usando su propio ARN como plantilla por sus propias enzimas de replicación de ARN dependientes del ARN como catalizadores.
Los virus de ARN se clasifican en virus de ARN de hebra negativa y virus de ARN de hebra positiva. Los ejemplos representativos de virus de ARN de hebra negativa incluyen el virus influenza. El genoma del virus influenza consiste en ocho segmentos de ARN de hebra negativa. Cuando el virus influenza infecta una célula, se inicia la transcripción génica por proteínas en la partícula influenza. En primer lugar, el ARN polimerasa vírico escinde el ARNm de la célula huésped en una docena más o menos de nucleótidos de la estructura casquete del extremo 5' y utiliza los fragmentos como cebadores para alargar la hebra de ARN (hebra positiva). Las proteínas víricas se traducen de este ARN de hebra positiva. En el procedimiento de replicación, el ARN complementario completamente al ARN vírico se sintetiza, y se amplifica el ARN del virus progenie usando esta secuencia como plantilla. Después, el ARN vírico se empaqueta junto con proteínas víricas para formar una partícula vírica.
Por lo tanto, para producir el virus influenza en un sistema de cultivo celular, las proteínas codificadas por el virus influenza se expresan por promotores de ARN polimerasa II, tales como, por ejemplo, promotores CMV y CAG, el ARN vírico se expresa por promotores de ARN polimerasa I, promotores sin una estructura casquete y poliA, tales como, por ejemplo, promotores génicos de ARNr, y el ARN vírico se empaqueta junto con proteínas víricas en la célula para formar una partícula vírica (Documento que no corresponde a una patente 6). Sin embargo, la cantidad del virus que se va a producir no se especifica, y esta técnica no se ha establecido como una técnica que pueda utilizarse en vista de la producción en una medida satisfactoria.
Los ejemplos de virus clasificados como virus de ARN de hebra positiva incluyen el virus Sindbis y el virus de la hepatitis C. El ARN genómico de un virus de ARN de hebra positiva también funciona como ARN mensajero (en lo sucesivo en este documento denominado "ARNm") al mismo tiempo y puede producir proteínas requeridas para la replicación y la formación de partículas dependiendo de la función de traducción de la célula huésped. En otras palabras, el ARN genómico del propio virus de ARN de hebra positiva tiene capacidad de transmisión.
Los vectores víricos obtenidos del virus Sindbis tienen una estructura básica del ARN genómico a partir del cual se deleciona la región génica estructural implicada en la estructura del virus y en el que se retienen un grupo de genes para proteínas requeridas para la transcripción y la replicación del virus y ARN en el que un gen extraño deseado se liga a la dirección 3' del promotor de transcripción. Cuando dicho ARN o ADNc transcrito al este ARN se introduce en una célula, se dan la replicación autónoma del vector de ARN que incluye el gen extraño y la transcripción del gen extraño situado en la dirección 3' del promotor de transcripción, y un producto de un gen extraño de interés se expresa en la línea celular. Además, puede prepararse un complejo que tiene la capacidad de infectar pero no la capacidad de transmitir dejando que una unidad de ADNc que expresa genes estructurales (auxiliares) y una unidad de ADNc que expresa el vector de ARN que se ha mencionado anteriormente coexistan en una célula empaquetadora (Documento que no corresponde a una patente 7).
Ya que el virus Sindbis usa un receptor de laminina de alta afinidad de 67 kDa (LAMR) como receptor e infecta las células nerviosas con gran eficacia, el vector del virus Sindbis llama la atención como un sistema para introducir un gen específicamente a los nervios (Documento que no corresponde a una patente 8). Sin embargo, no se ha demostrado que la infección por el virus Sindbis induzca la apoptosis de la célula huésped (Documento que no corresponde a una patente 9), tiene que ver con la toxicidad.
El genoma del virus de la hepatitis C (VHC) es un ARN de hebra sencilla con hebra positiva de aproximadamente 9600 nucleótidos. Este ARN genómico comprende la región no traducida 5' (también expresada como 5'NTR o 5'UTR), la región traducida que incluye una región estructural y una región no estructural, y la región no traducida 3' (también expresada como 3'NTR o 3'UTR). Las proteínas estructurales del VHC se codifican en la región estructural, y múltiples proteínas no estructurales se codifican en la región no estructural.
Dichas proteínas estructurales (Core, E1, E2 y p7) y proteínas no estructurales (NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A y NS5B) del VHC se traducen como poliproteína continua de la región traducida, se someten a una digestión limitada por proteasa, se liberan y se producen. De estas proteínas estructurales y proteínas no estructurales (es decir, proteínas víricas del VHC), Core es la proteína núcleo. E1 y E2 son proteínas de envoltura. Las proteínas no estructurales son proteínas víricas implicadas en la replicación del propio virus. Se sabe que NS2 tiene una actividad de metaloproteasa, y se sabe que NS3 tiene una actividad serina proteasa (1/3 en el miembro del terminal N) y actividad helicasa (2/3 en el miembro del terminal C). Además, también se indica que NS4A es un cofactor para la actividad proteasa de NS3, y que NS5B tiene una actividad ARN polimerasa dependiente de ARN.
Se ha revelado que el VHC se clasifica en muchos tipos dependiendo del genotipo o el serotipo. De acuerdo con el procedimiento de análisis filogenético de Simmonds y col., que usa secuencias nucleotídicas de cepas del VHC, que es un procedimiento de clasificación del genotipo del VHC representativo actualmente, el VHC se clasifica en seis tipos, incluyendo los genotipos 1a, 1b, 2a, 2b, 3a y 3b, y estos se subdividen además en varios subtipos. Además, se han determinado las secuencias nucleotídicas de los genomas de longitud completa de algunos genotipos del VHC (Documentos que no corresponden a una patente de 10 a 13).
Se captura una partícula del VHC por polisacáridos sulfatados sobre la superficie celular, se une a un receptor de alta afinidad a través de proteínas de envoltura, y se recoge en el endosoma por endocitosis. Después, la membrana del virus y la membrana del endosoma se condensan, y la nucleocápside invade el citoplasma. La traducción del genoma viral no envuelto se inicia por el Sitio Interno de Entrada del Ribosoma (IRES). La traducción y la escisión de una proteína ocurren sobre la membrana del retículo endoplasmático. La proteína Core, las proteínas E1 y E2, y el ARN vírico replicado sobre el retículo endoplasmático se combinan para formar una partícula vírica. Después, la partícula brota en el lumen del retículo endoplasmático. Se cree que la partícula que ha brotado se libera fuera de la célula a través del aparato de Golgi.
Recientemente, la preparación de un replicón de ARN subgenómico del VHC como ARN obtenido del VHC que tiene la capacidad de replicarse de forma autónoma (Documentos de patente 1 y 2 y Documentos que no corresponden a una patente de 14 a 16) ha permitido el análisis del mecanismo de replicación del VHC que usan las células cultivadas. Este replicón de ARN subgenómico del VHC se obtiene reemplazando las proteínas estructurales que existen en la dirección 3' del IRES del VHC en la región no traducida 5' del ARN genómico del VHC por el gen de resistencia a neomicina y el IRES del VEMC ligado en la dirección 3' del mismo. Se ha demostrado que, cuando se introduce en una célula de cáncer de hígado humana Huh7 y se cultiva en presencia de neomicina, este replicón de ARN replica de forma autónoma en la célula Huh7. Además, se ha demostrado que algunos replicones de ARN subgenómico del VHC se replican de forma autónoma no solo en Huh7, sino también en células, tales como célula de cáncer cervical humano HeLa o célula de cáncer de hígado humano HepG2 (Documento de Patente 3). Además, el Documento de Patente 2 propone la producción de una partícula vírica del VHC que utiliza el genoma del VHC de longitud completa cuando se usa un VHC recombinante como vector para terapia génica.
[Documento de Patente 1] Solicitud de Patente Japonesa (Kokai) Nº 2002-171978 A [Documento de Patente 2] Solicitud de Patente Japonesa (Kokai) Nº 2001-17187 A [Documento de Patente 3] Solicitud de Patente Internacional WO2004/104198 [Documento que no corresponde a una patente 1] Mann, R. y col., Cell, 33 (1983) pág. 153-59 [Documento que no corresponde a una patente 2] Simada, T y col., J Clin Invest. 88 (1991) pág. 1043-47 [Documento que no corresponde a una patente 3] Betta, A y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91 (1994) pág. 8802-06 [Documento que no corresponde a una patente 4] Burden, S & Yarden, Y., Neuron, 18 (1997) pág. 847-55 [Documento que no corresponde a una patente 5] Crystal, R.G Science, 270, (1995) pág. 404-10 [Documento que no corresponde a una patente 6] Neumann, G. & Kawaoka, Y., Virology 287 (2001) pág. 243-50 [Documento que no corresponde a una patente 7] Berglund, P y col., Biotechnology, 11 (1993) pág. 916-920 [Documento que no corresponde a una patente 8] Wang, K.S y col., J. Virol. 66 (1992) pág. 4992-5001 [Documento que no corresponde a una patente 9] Levine, B. y col., Nature, 361 (1993) pág. 739-42 [Documento que no corresponde a una patente 10] Simmonds, P. y col., Hepatology, 10 (1994) pág. 1321-24 [Documento que no corresponde a una patente 11] Choo, Q.L y col. Science, 244 (1989) pág. 359-362 [Documento que no corresponde a una patente 12] Okamoto, H y col., J. Gen. Virol., 73 (1992) pág. 673-79 [Documento que no corresponde a una patente 13] Mori, S. y col., Biochem. Biophis. Res. Commun. 183 (1992) pág. 334-42 [Documento que no corresponde a una patente 14] Blight y col., Science, 290 (2000) pág. 1972-74 [Documento que no corresponde a una patente 15] Friebe y col., J. Virol., 75 (2001) pág. 12047-57 [Documento que no corresponde a una patente 16] Kato, T. y col., Gastroenterology, 125 (2003) pág. 1808-17
El documento WO 2004/024904 describe procedimientos para producir partículas de pseudovíricas que contienen proteínas funcionales de, por ejemplo, el virus de la hepatitis C. El procedimiento permite la expresión de proteínas estructurales para formar partículas similares a virus. Las partículas similares a virus resultantes que son infecciosas pero incapaces de replicarse como proteínas no estructurales para controlar la replicación del virus faltan y no se expresan.
El documento WO 2005/080575 describe un procedimiento para replicar de forma eficaz una secuencia genómica del VHC de longitud completa que contiene ARN para producir partículas del virus del VHC que contienen ARN de replicón del VHC de longitud completa o ARN genómico del VHC de longitud completa usando un sistema de cultivo celular. Específicamente, un replicón de ARN que tiene capacidad de replicación autónoma y capacidad de producción de partículas víricas se construyó usando ARN genómico del VHC. La célula replicante del replicón de ARN del VHC de longitud completa puede producir partículas víricas y las partículas víricas producidas contenían el ARN replicón del VHC de longitud completa en una estructura compuesta de proteínas del virus VHC. J.R. Dubensky y col. describieron en J. Virol., Vol. 70, 1996, págs. 508-519 un sistema de vector de expresión basado en el genoma de longitud completa del virus Sindbis que implicaba la conversión de un replicón de ARN en un sistema de expresión basado en ADN segmentado. Los autores indican que fue posible producir partículas del virus Sindbis empaquetado en células co-transfectadas con el vector replicón y ADN plasmídico de DH.
T. Pietschmann y col. informan en J. Virology, Vol. 76, 2002, págs. 4008-4021 sobre la preparación de replicones subgenómicos del virus de la hepatitis C para la expresión eficaz de proteínas estructurales del VHC. El replicón de ARN se obtuvo a partir de un aislado del genotipo 1b de consenso de la cepa con1. Los autores descubrieron de D7 que a pesar de la liberación del ARN del VHC resistente a nucleasa en el sobrenadante del cultivo celular, no se encontró ninguna prueba del acoplamiento de partículas víricas.
Descripción de la invención
Actualmente, el VHC no se ha desarrollado como un vector viral como los retrovirus, adenovirus, el virus influenza y el virus Sindbis. Si se desarrolla un vector del VHC de este tipo, los genes pueden introducirse específicamente en células de tejidos del hígado o similares. En este caso, para garantizar la seguridad en mayor medida, es deseable que el vector del VHC infecte las células pero no tenga la propiedad de transmitir.
Un objeto de la presente invención es desarrollar una partícula recombinante similar al virus de la hepatitis C (VHC) que puede usarse como un vector de este tipo que se ha descrito anteriormente. Además, otro objeto de la presente invención es proporcionar un procedimiento para producir esta partícula similar al VHC de forma eficaz.
Los inventores de la presente invención intentaron permitir células cultivadas para producir una partícula recombinante similar al VHC que parece ser útil industrialmente en vista de la seguridad, comodidad y aplicabilidad. En primer lugar, el genoma del VHC se dividió en un vector que expresa las proteínas estructurales del VHC y un vector que incluye los genes implicados en la replicación. Puede incluirse un gen extraño deseado y/o IRES (Sitio Interno de Entrada del Ribosoma) en el vector posterior.
Los inventores de la presente invención construyeron un vector obtenido clonando ADN que incluía un gen extraño deseado, la secuencia de IRES, y los genes implicados en la replicación del VHC en la dirección 3' del promotor T7 y sintetizaron in vitro un replicón de ARN subgenómico del VHC que incluía la secuencia del gen extraño usando polimerasa T7. Este replicón de ARN se introdujo en una célula animal cultivada para obtener una cepa celular en la que se replicón el replicón de ARN subgenómico del VHC.
Posteriormente, descubrieron un sistema que puede introducir un vector que expresa altamente las proteínas estructurales del VHC en la cepa celular con una alta eficacia e introducirla en células portadoras de replicones de ARN subgenómico del VHC de diversos genotipos. Como resultado, expresando las proteínas estructurales del VHC en células, descubrieron con éxito combinaciones con las que el replicón de ARN subgenómico del VHC pueden empaquetarse en una partícula vírica.
Además, los inventores de la presente invención confirmaron que una partícula recombinante similar al VHC producida por el procedimiento de la presente invención infecta las células y que una célula infectada por el VHC recombinante no tiene la propiedad de transmisión, sin producir una partícula vírica hija. Debido a dichas características, la partícula recombinante del VHC de la presente invención puede usarse como un vector para la introducción de un gen extraño o para terapia génica.
Específicamente, la presente invención se caracteriza por las siguientes características en resumen.
De acuerdo con la presente invención se proporciona un procedimiento para producir una partícula recombinante del virus de la hepatitis C, que comprende las etapas de introducirla en:
(i)
una célula portadora de un replicón de ARN subgenómico que no incluye genes que codifican las proteínas estructurales del virus de la hepatitis C y que comprende una secuencia nucleotídica que comprende la región no traducida 5', la secuencia nucleotídica codificante de las proteínas no estructurales NS3, NS4A, NS4B, NS5A y NS5B, y la región no traducida 3' de un ARN genómico obtenido a partir de una cepa del virus de la hepatitis C del genotipo 1b que es una cepa con1 o una cepa obtenida a partir del mismo,
(ii)
un vector del virus vaccinia o un promotor EF-1e portador del vector que expresa las proteínas Core, E1, E2 y p7 obtenidas a partir de una cepa del virus de la hepatitis C del genotipo 1a, 1b, 2a, 2b, 3a y 3b que es diferente de la cepa del virus de la hepatitis C de (i), cultivar la célula y recuperar la partícula recombinante del virus de la hepatitis C producida.
Como se ha especificado anteriormente, la cepa del virus de la hepatitis C del punto (i) anterior es una cepa vírica de genotipo 1b.
La cepa vírica que se ha mencionado anteriormente de genotipo 1b es la cepa con1 o una cepa de la misma.
En otra realización, la cepa del virus de la hepatitis C del punto (ii) anterior es una cepa vírica de genotipo 2a.
En una realización preferida, la cepa vírica que se ha mencionado anteriormente de genotipo 2a es la cepa JFHI o una cepa derivada de la misma.
En otra realización más, el replicón de ARN que se ha mencionado anteriormente puede incluir adicionalmente al menos una secuencia IRES.
En otra realización más, el replicón de ARN que se ha mencionado anteriormente puede incluir adicionalmente al menos un gen extraño.
En una realización preferida, el IRES que se ha mencionado anteriormente y el gen extraño que se ha mencionado anteriormente pueden situarse entre la región no traducida 5' que se ha mencionado anteriormente y la NS3 que se ha mencionado anteriormente.
En otra realización más, la célula que se ha mencionado anteriormente es una célula animal.
En una realización preferida, la célula animal que se ha mencionado anteriormente es una célula de mamífero.
Los ejemplos de la célula de mamífero anterior incluyen líneas celulares Huh7, HepG2 y establecidas obtenidas de estas células.
En otra realización más, el vector de expresión que se ha mencionado anteriormente es un vector vírico.
En una realización preferida, el vector viral que se ha mencionado anteriormente es un vector del virus vaccinia.
Las partículas virales pueden proliferarse permitiendo que la partícula recombinante del virus de la hepatitis C producida y recuperada por el procedimiento de la presente invención que se ha descrito anteriormente infecte las células susceptibles al VHC, tales como células hepáticas o linfoides. Dichos procedimientos se incluyen en el alcance de la presente invención.
De acuerdo con un segundo aspecto, la presente invención también proporciona una partícula recombinante del virus de la hepatitis C producida por el procedimiento de la presente invención que se ha descrito anteriormente y caracterizada porque tiene la capacidad de infectar pero no la capacidad de transmitir.
En una realización de la misma, se introduce un gen extraño en la partícula recombinante del virus de la hepatitis C que se ha mencionado anteriormente de una manera expresable.
En otra realización, la partícula recombinante del virus de la hepatitis C que se ha mencionado anteriormente es un vector.
En la presente invención, uno de los procedimientos preferidos para producir una partícula recombinante del virus de la hepatitis C es un procedimiento para producir una partícula recombinante del virus de la hepatitis C, en la que dicho procedimiento comprende las etapas de introducirla en (i) una célula en la que un replicón de ARN subgenómico como se define en la reivindicación 1, la región no traducida 5', la secuencia nucleotídica que codifica las proteínas NS3, NS4A, NS4B, NS5A y NS5B, y la región no traducida 3' de un ARN genómico obtenido a partir de la cepa con1 del virus de la hepatitis C, o un replicón de ARN que contiene adicionalmente al menos un gen extraño y/o al menos una secuencia de IRES, además de la secuencia nucleotídica, se replica de forma autónoma (ii) un vector del virus vaccinia que expresa las proteínas Core, E1, E2 y p7 del virus de la hepatitis C obtenidas a partir de la cepa JFH1, cultivar la célula y recuperar la partícula recombinante del virus de la hepatitis C producida.
Además, en la presente invención, se produce una partícula recombinante del virus de la hepatitis C preferida mediante el procedimiento preferido que se ha descrito anteriormente.
El procedimiento de la invención en el que la cepa del virus de la hepatitis C de genotipo 1b que se define en el punto (i) que se ha mencionado anteriormente es la cepa con1.
Además, también es preferible en este procedimiento que la cepa del virus de la hepatitis C de genotipo 1a que se define en el punto (ii) que se ha mencionado anteriormente sea la cepa H77c, 1, H o HC-J1.
También es preferible en este procedimiento que la cepa del virus de la hepatitis C de genotipo 1b que se define en el punto (ii) que se ha mencionado anteriormente sea la cepa J1, con1, TH, J, JT y BK.
También es preferible en este procedimiento que la cepa del virus de la hepatitis C de genotipo 2a que se define en el (ii) que se ha mencionado anteriormente sea la cepa JFH1, HC-J6, JCH1 o J6CF.
También es preferible en este procedimiento que la cepa del virus de la hepatitis C de genotipo 3a que se define en el punto (ii) que se ha mencionado anteriormente sea la cepa NZL1, K3a/650, 452 o E-b1.
También es preferible en este procedimiento que la cepa del virus de la hepatitis C de genotipo 3b que se define en el punto (ii) que se ha mencionado anteriormente sea la cepa Tr.
Además, en el procedimiento de la invención el vector del punto (ii) que se ha mencionado anteriormente es un vector del virus vaccinia o un vector portador del promotor EF-1e.
Además, es preferible en este procedimiento que el replicón de ARN que se ha mencionado anteriormente comprenda adicionalmente al menos una secuencia del sitio de entrada interno del ribosoma (IRES) y/o al menos un gen extraño.
Es preferible que la secuencia del IRES y/o el gen extraño se sitúe entre la región no traducida 5' que se ha mencionado anteriormente y la secuencia codificante de la proteína NS3 que se ha mencionado anteriormente.
En este procedimiento, la célula que se ha mencionado anteriormente es preferiblemente una célula animal. Los ejemplos preferidos de células animales incluyen la célula Huh7, la célula HepG2 y líneas células establecidas obtenidas a partir de estas células.
Una partícula recombinante similar al virus de la hepatitis C producida por el procedimiento que se ha descrito anteriormente tiene la propiedad de infectar pero no la propiedad de transmitir.
Una partícula recombinante infecciosa similar al VHC en la que un ARN subgenómico del VHC que incluye un gen extraño deseado se empaqueta y que no tiene la propiedad de transmitir y un procedimiento de producción de la misma pueden proporcionarse por la presente invención. Ya que una partícula recombinante infecciosa similar al VHC de este tipo tiene la ventaja de no tener la propiedad de transmitir, puede usarse para la introducción de genes (por ejemplo, terapia génica), en particular, en células o tejidos hepáticos o linfoides o puede usarse como un vector viral para producir un animal transgénico o como una vacuna atenuada.
Breve descripción de los dibujos
La figura 1 es una vista esquemática de una realización de la presente invención, que muestra los procedimientos de producción de una partícula recombinante similar al VHC. a): los replicones de ARN subgenómico del VHC se replican en la célula Huh7 en la que se introduce el replicón de ARN subgenómico del VHC. No se produce una partícula vírica. b): En la célula de a) en la que se introduce un vector que expresa la proteína estructural del VHC, se producen partículas similares a virus en las que se empaqueta el replicón de ARN subgenómico del VHC utilizando proteínas estructurales del VHC. c): En una célula infectada por la partícula similar al virus producida en b), se replican el replicón de ARN subgenómico del VHC, pero no se produce una partícula vírica hija.
La figura 2 muestra dibujos estructurales de ARN genómico del VHC y ADNc del ARN subgenómico del VHC. El diagrama superior y el diagrama del centro muestran pJFH1 y pSGR-JFH1, respectivamente, preparados a partir del VHC de genotipo 2a. El diagrama inferior muestra I389/NS3-3'/wt preparado a partir del VHC de genotipo 1b. Los símbolos de la figura representan lo que se indica a continuación: T7, promotor de ARN T7; 5'UTR, región no traducida 5'; Core, proteína Core; E1 y E2, proteínas de envoltura; p7, proteína p7; NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A y NS5B, proteínas no estructurales; 3'UTR, región no traducida 3'; Agel, Pmel y Xbal, sitios de escisión de enzimas de restricción Agel, Pmel y Xbal; IRES del VEMC, sitio de entrada interno del ribosoma del virus de la encefalomiocarditis.
La figura 3 muestra mapas de vectores que expresan las proteínas estructurales del VHC de la presente invención. Específicamente, el diagrama superior muestra pGAGC-p7JFH1, un clon plasmídico preparado insertando los genes de la región estructural JFH en la dirección 3' del promotor CAG. El diagrama inferior muestra la estructura de pEF4C-p7JFH1, un clon plasmídico preparado insertando los genes de la región estructural JFH en la dirección 3' de la secuencia promotora del factor de elongación 1e. Los símbolos de la figura representan lo que se indica a continuación: CAG, promotor CAG, pA, secuencia poliA adicional; EcoRI, sitio de escisión de la enzima de restricción EcoRI; EF-1e, promotor del factor de elongación 1e, BGH pA, secuencia poliA adicional del factor de crecimiento bovino.
La figura 4 muestra mapas de los genes estructurales del VHC insertados en los vectores pDIsHJFHst, pDIsH77st, pDIsJ1st, pDIsJ1 (c)/JFH(E1-p7)st y pDIsJFH(c)/J1(E1-p7)st. Las diferencias en las cepas víricas a partir de las cuales se obtienen los vectores se representan por áreas sombreadas en el marco;
La figura 5 muestra gráficos que muestran la cantidad de replicón de ARN del VHC (A) y la cantidad de la proteína Core del VHC (B) en cada fracción obtenida introduciendo pEF4C-p7JFH1 en una cepa celular IH4.1 portadora de replicón y fraccionando el sobrenadante del cultivo celular (sup) por un gradiente de densidad de sacarosa. D, Experimento 1; ., Experimento 2.
La figura 6 muestra gráficos que muestran la cantidad de la proteína Core del VHC (eje vertical) en cada fracción (eje horizontal) obtenida permitiendo que DlsJFHst, un vector del virus vaccinia, infecta una cepa celular 5-15 portadora de replicón y fraccionando el sobrenadante del cultivo celular (sup) por gradiente de densidad de sacarosa. El círculo cerrado representa la proteína Core del VHC, y el cuadrado cerrado representa los resultados usando un sobrenadante de cultivo tratado con NP40. El Experimento 1 muestra los resultados de únicamente el cultivo no tratado (figura 6 A), y el Experimento 2 muestra los resultados de los sobrenadantes de cultivo no tratados y tratados con NP40 (figura 6 B).
Mejor modo para la realización de la invención
1. Definición
Los términos usados en la presente memoria descriptiva tienen los siguientes significados.
La expresión "replicón de ARN" se refiere al ARN que se prepara modificando el genoma del virus VHC y tiene capacidad de replicación de forma autónoma.
La expresión "capacidad de replicación de forma autónoma" significa la capacidad de reproducir copias de forma autónoma de un ácido nucleico (es decir, replicación) en una célula, tal como ADN plasmídico.
La expresión "capacidad de infectar" o "propiedad de infectar" se refiere a la capacidad de introducir un ácido nucleico y similares de virus a una célula debido a la capacidad de adhesión a una célula, la fusión con una membrana celular y similares.
La expresión "virus de la hepatitis C recombinante" significa un virus obtenido cambiando las propiedades del virus VHC original cualitativamente/cuantitativamente usando técnicas de ingeniería genética. Los ejemplos del mismo incluyen un virus capaz de expresar un gen extraño, además de genes expresados por el virus original, un virus con deficiencias en la propiedad de transmisión o la capacidad de replicar un genoma vírico del virus original, y así sucesivamente. En el sentido amplio, se incluyen los virus obtenidos por recombinación de genes entre diferentes tipos o subtipos del mismo virus.
La expresión "propiedad de transmisión" o "capacidad de transmitir" significa una capacidad de formar una partícula infecciosa o un complejo similar a la misma y transmitirla a otra célula después de la introducción de un ácido nucleico a una célula por infección o una técnica artificial y replicación del ácido nucleico existente en la célula.
"Core" es una proteína estructura núcleo del VHC.
"E1" y "E2" son ambos proteínas estructurales de envoltura.
"NS" se refiere a una proteína no estructural del VHC, que está implicada en la replicación del propio virus. "NS2" tiene una actividad de metaloproteasa. "NS3" tiene una actividad de serina proteasa (1/3 en el miembro terminal N) y una actividad de helicasa (2/3 en el miembro terminal C). "NS4A" es un cofactor para la actividad de proteasa de NS3. La función de "NS4B" no está clara. Se cree que "NS5A" tiene actividad para regular la transferencia de información de la célula huésped. **NS5B" tiene actividad de ARN polimerasa dependiente de ARN.
La expresión "secuencia del IRES" significa un sitio de entrada interno del ribosoma, que puede unirse con el ribosoma en el ARN para iniciar la traducción.
La expresión "de una manera expresable" significa un estado en el que un gen de interés puede transcribirse y traducirse mediante secuencias reguladoras, tales como un promotor y un potenciador.
2. Célula portadora del replicón de ARN subgenómico del VHC
El genoma del VHC de tipo natural consiste en un ARN de hebra sencilla de aproximadamente 9,6 kb que codifica una proteína precursora de aproximadamente 3000 aminoácidos. El genoma del VHC se constituye por la región no traducida 5' (5'UTR), Core, E1, E2, p7, NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A, NS5B y la región no traducida 3' (3'UTR) en este orden. El replicón de ARN subgenómico del VHC usado en el procedimiento de la presente invención incluye ARN modificado constituido por la región no traducida 5', NS3, NS4A, NS4B, NSSA, NS5B y la región no traducida 3' en este orden. Este replicón de ARN se introduce en una célula específica de una manera expresable de forma que pueda replicarse con acciones de factores reguladores, tales como un promotor.
El replicón de ARN puede comprender adicionalmente un gen extraño y/o una secuencia del IRES. El gen extraño y la secuencia del IRES pueden situarse preferiblemente entre la región no traducida 5' ya la secuencia que codifica NS3 en el orden del gen extraño y la secuencia del IRES.
Los ejemplos preferidos de la secuencia del IRES incluyen, pero sin limitación, IRES del VEMC (sitio de entrada interno del ribosoma del virus de la encefalomiocarditis), IRES del VFMD, IRES del VHC, y así sucesivamente. Se prefieren IRES del VEMC e IRES del VHC, y es más preferido IRES del VEMC.
Los ejemplos del gen extraño usados incluyen genes que muestran resistencia a fármacos (es decir, estos genes permiten la selección celular; las células que tienen este gen tendrán resistencia al fármaco) tales como, por ejemplo, un gen que codifica neomicina, higromicina, puromicina, zeocina, blasticidina, timidina cinasa, kanamicina,
o similares; genes informadores (es decir, estos genes son genes marcadores que codifican un producto génico usado como un indicador de la expresión génica) tales como, por ejemplo, genes que codifican una enzima que cataliza una reacción luminiscente o una reacción de color de un gen informador, tales como, por ejemplo, luciferasa, proteína verde fluorescente (GFP), 1-galactosidasa, y similares; además, genes diana de terapia génica y ácidos nucleicos terapéuticos, tales como, por ejemplo, genes que codifican diversas proteínas útiles para el tratamiento de enfermedades que requieren tratamiento en mamíferos, incluyendo seres humanos, tales como, por ejemplo, enzimas, citocinas, quimicinas, hormonas, anticuerpos, moléculas inmunorreguladoras, proteínas supresoras de tumor, factores de crecimiento, proteínas de membranas y proteínas vasoactivas, ácidos nucleicos terapéuticos, tales como ARN antisentido y ARNsi, y así sucesivamente.
Los ejemplos específicos del replicón de ARN subgenómico del VHC incluyen pSGR-JFH1 (diagrama del centro de la figura 2), I389/NS3-3'/wt (diagrama inferior de la figura 2), y así sucesivamente. Dichos replicones de ARN subgenómicos del VHC pueden prepararse mediante procedimientos descritos en, por ejemplo, Kato, T. y col. Gastroenterology, 125 (2003) pág. 1808-1817, una publicación de los inventores de la presente invención, la Solicitud de Patente Internacional WO2004/104198 (Documento de Patente 3), y así sucesivamente.
En el procedimiento de análisis filogenético que usa secuencias nucleotídicas de una cepa del VHC, el VHC se clasifica en seis tipos: genotipos 1a, 1b, 2a, 2b, 3a y 3b. Cada uno de estos tipos se clasifica adicionalmente en varios subtipos. Se han determinado las secuencias nucleotídicas de longitud completa de los genomas del VHC de algunos genotipos (Simmonds, P. y col., Hepatology, 10 (1994) pág. 1321-1324; Choo, Q.L y col., Science, 244 (1989) pág. 359-362; Okamoto, H. y col., J. Gen. Virol., 73 (1992) pág. 673-679; Mori, S. y col., Biochem. Biophis. Res. Commun. 183 (1992) pág. 334-342; y la Solicitud de Patente Internacional WO2004/104198).
Los ejemplos específicos de las cepas del VHC de genotipo 1a incluyen la cepa H77c (secuencia consenso de la cepa H77: número de acceso del GenBank AF011751), la cepa 1 (número de acceso del GenBank M62321), la cepa H (número de acceso del GenBank M67463), la cepa HC-J1 (número de acceso del GenBank D10749), y así sucesivamente. Los ejemplos específicos de las cepas del VHC de genotipo 1b incluyen la cepa J1 (número de acceso del GenBank D89815), la cepa con1 (número de acceso del GenBank AJ238799, puede denominarse como la cepa Con-1), la cepa TH (Wakita, T. y col., J. Biol. Chem., 269 (1994) pág. 14205-14210), la cepa J (número de acceso del GenBank D90208), la cepa JT (número de acceso del GenBank D01171), la cepa BK (número de acceso del GenBank M58335), y así sucesivamente. Los ejemplos específicos de las cepas del VHC de genotipo 2a incluyen la cepa JFH1 (número de acceso del GenBank AB047639, puede denominarse como la cepa JFH-1), la cepa HC-J6 (número de acceso del GenBank D00944), la cepa JCH1 (número de acceso del GenBank AB047640), la cepa J6CF (número de acceso del GenBank AF177036), y así sucesivamente. Los ejemplos específicos de las cepas del VHC de genotipo 2b incluyen la cepa HC-J8 (número de acceso del GenBank D01221) y así sucesivamente. Los ejemplos específicos de las cepas del VHC de genotipo 3a incluyen la cepa NZL1 (número de acceso del GenBank D17763), la cepa K3a/650 (número de acceso del GenBank D28917), la cepa 452 (número de acceso del GenBank DQ437509), la cepa E-b1 (Chan, S. y col., J. Gen. Virol., 73 (1992) pág. 1131-1141), y así sucesivamente. Los ejemplos específicos de las cepas del VHC de genotipo 3b incluyen la cepa Tr (Chayama, K. y col., J. Gen. Virol., 75 (1994) pág. 3623-3629) y así sucesivamente. Además, también se ha indicado ya una lista de números de acceso del GenBank para otras cepas (Tokita, T. y col., J. Gen. Virol. 79 (1998) pág. 1847-1857; Cristina J. & Colina R. Virolgy Journal, 3 (2006) pág. 1-8).
Los elementos que constituyen el replicón de ARN subgenómico del VHC usado en la presente invención (específicamente, la región no traducida 5', NS3, NS4A, NS4B, NSSA, NS5B y la región no traducida 3') se obtienen a partir de una cepa con1 de genotipo 1b o subtipos de la misma, de manera que el replicón de ARN subgenómico del VHC pueda construirse de forma que pueda replicarse en una célula. Se aprecia que la presente invención es un procedimiento para producir una partícula recombinante similar al virus de la hepatitis C que tiene la propiedad de infectar pero la propiedad de transmitir, y el replicón de ARN de la presente invención no incluye genes que codifiquen las proteínas estructurales del VHC (Core, E1, E2 y p7) para eliminar la propiedad de transmisión de la partícula similar al virus producida.
Los elementos que se han mencionado anteriormente pueden obtenerse a partir de la misma cepa del VHC o pueden estar en forma combinada, es decir, una quimera obtenida a partir de dos o más cepas del VHC diferentes. Las cepas del VHC preferidas para el punto (ii) anterior incluyen al menos una cepa seleccionada entre el grupo que consiste en cepas del VHC de genotipos 1b y 2a, y son más preferidas la cepa con1, una cepa del VHC de genotipo 1b, y la cepa JFHI, una cepa del VHC de genotipo 2a. La cepa del VHC en la presente invención puede ser una cepa aislada resultado de la mutación natural o artificial en la cepa con1 o la cepa JFHI como una cepa parental en la que se cambia al menos el genotipo de la de la cepa parental (derivado). En este momento, el rasgo fenotípico puede ser el mismo que o diferente del rasgo de la cepa parental, pero se prefiere una cepa que tenga el mismo rasgo.
Los ejemplos del replicón de ARN subgenómico del VHC incluyen un replicón de ARN subgenómico del VHC que tiene la región no traducida 5', la secuencia que codifica las proteínas NS3, NS4A, NS4B, NS5A y NS5B, y la región no traducida 3' de la cepa con1 del VHC (genotipo 1b, número de acceso del GenBank AJ238799, Lohmann, V. y col., Science 285 (1999) pág. 110-113), Además, pueden incluirse un gen extraño deseado y una secuencia del IRES entre la región no traducida 5' y la secuencia que codifica la proteína NS3 de estos replicones de ARN subgenómicos del VHC.
La región no traducida 5', la secuencia de proteínas estructurales (Core, E1, E2 y p7), las proteínas no estructurales (NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A y NS5B), la región no traducida 3', y otros sitios en el ARN genómico del VHC pueden definirse usando la secuencia de ADNc genómico de longitud completa, por ejemplo, correspondiente al ARN genómico de la cepa JFH1, una cepa del VHC de genotipo 2a (Solicitud de Patente Japonesa (Kokai) Nº 2002171978 A) (número de acceso del GenBank AB047639, Kato, T. y col., Gastroenterology, 125 (2003) pág. 18081817, SEC ID Nº: 10. La secuencia aminoacídica codificada también se muestra en la SEC ID Nº: 11) como referencia.
Por ejemplo, en el ADNc genómico de longitud completa obtenido a partir de la cepa JFH1, la región no traducida 5' que puede usarse como un elemento del replicón de ARN subgenómico del VHC de la presente invención se muestra por las posiciones de los nucleótidos 1 a 340 de la secuencia nucleotídica de la SEC ID Nº: 10, la región codificante de la proteína Core a la proteína p7 (Core, E1, E2 y p7) se muestra por las posiciones de los nucleótidos 341 a 2779, y la región codificante de la proteína NS3 a la región no traducida 3' (NS3, NS4A, NS4B, NS5A, NS5B y 3'UTR) se muestra por los números de nucleótidos 3431 a 9678. La región dentro del ADNc genómico obtenido a partir de otras cepas del VHC puede identificarse por comparación con las secuencias de estas regiones obtenidas a partir de la cepa JFH1.
Un replicón de ARN subgenómico del VHC puede sintetizarse con una ARN polimerasa dependiente de ADN usando un vector en el que el ADN complementario al ARN subgenómico del VHC se clona en la dirección 3' de un promotor para la transcripción de ARN de la secuencia de ADN. Los ejemplos del promotor para la transcripción de ARN de la secuencia de ADN incluyen T7, T3, SP6, y así sucesivamente, y se prefiere el promotor T7. Un ARN subgenómico del VHC puede sintetizarse por polimerasa T7. Una célula en la que un replicón de ARN subgenómico del VHC se replica de forma autónoma puede prepararse introduciendo el ARN subgenómico del VHC sintetizado de esta manera en una célula que permite la propagación del VHC.
Los ejemplos preferidos de la célula incluyen células animales, tales como, por ejemplo, células de vertebrados que incluyen células de peces, reptiles, anfibios, aves y mamíferos, y son las más preferidas las células de mamíferos. Los ejemplos adicionales de la célula incluyen células normales obtenidas del hígado, el cuello del útero y los riñones fetales, células de tumor, líneas celulares establecidas de las mismas, y así sucesivamente. Los ejemplos de las mismas incluyen células, tales como Huh7, HepG2, IMY-N9, HeLa y HEK293 (Date, T. y col., J. Biol. Chem., 279 (2004) pág. 22371-22376, Ito, T. y col., Hepatology 34 (2001) pág. 566-572), y Huh7, HepG2, y se prefieren clones obtenidos a partir de estas células.
Los ejemplos de otros procedimientos para replicar el ARN subgenómico del VHC en células cultivadas incluyen sistemas que utilizan ADNc del VHC sin usar un replicón de ARN. Cuando se expresa ADNc del VHC usando un promotor de ARN polimerasa de tipo 11, la estructura CASQUETE se añade al extremo 5' del ARN transcrito, y la cadena poliA se añade al extremo 3'. Por lo tanto, el ARN transcrito se usa como una plantilla para la síntesis de proteínas en el ribosoma, y la replicación del ARN genómico del VHC no tiene lugar. Para resolver este problema, Heller y col. prepararon un vector de ADN ligando una secuencia de ribozimas a los extremos 5' y 3' del genoma del VHC y que permitía que la ribozima escindiera el ADN transcrito por el ARN polimerasa II en una célula, de forma que el ARN del VHC al que no se añade CASQUETE o poliA pueda sintetizarse en la célula (Heller T y col. Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 102 (2005) pág. 2579-2583). Una célula en la que un replicón de ARN subgenómico del VHC se replica puede obtenerse introduciendo este vector en una célula.
De acuerdo con otro procedimiento, una célula en la que se replica un replicón de ARN subgenómico del VHC puede obtenerse clonando el ADN complementario al ARN subgenómico del VHC en un vector que tenga un sistema promotor/terminador de ARN polimerasa I e introduciendo el vector en una célula que permita la propagación del VHC. Más específicamente, puede usarse pHH21 (Neumann G. y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96 (1999) pág. 9345-9350). pHH21 es un vector que comprende el promotor de ARN polimerasa I humano como promotor, y el terminador de ARN polimerasa I de ratón como terminador. Cuando se añade la secuencia de reconocimiento de la enzima de restricción BsmBI a los extremos 5' y 3' del ADNc complementario a un replicón de ARN subgenómico del VHC por PCR, el ADNc se digiere con BsmBI, el genoma del VHC se inserta en el sitio BsmBI de pHH21, y el genoma del VHC puede ligarse sin secuencias nucleotídicas adicionales entre el promotor/terminador y el genoma del VHC.
Un replicón de ARN subgenómico del VHC o un vector, tal como un vector que expresa el replicón de ARN subgenómico del VHC puede introducirse en una célula usando cualquier técnica conocida por los expertos en la técnica. Los ejemplos de dichas técnicas de introducción incluyen electroporación, pistola de partículas, lipofección, procedimiento de fosfato cálcico, microinyección, procedimiento de DEAE dextrano, y así sucesivamente.
En la presente invención, una célula en la que se replica el replicón de ARN subgenómico del VHC de la presente invención puede prepararse de acuerdo con las descripciones anteriores. Ya que un replicón de ARN de este tipo se replica de forma autónoma continuamente en la célula, una cierta cantidad del mismo se mantiene incluso en una célula sujeta a degradación de ARN. Por lo tanto, el replicón de ARN puede mantenerse en una célula en la que se introduce el replicón de ARN subgenómico del VHC de la presente invención, un vector que expresa el replicón de ARN subgenómico del VHC como se ha descrito anteriormente. En la presente invención, "célula portadora de un replicón de ARN" significa que el replicón de ARN existe en la célula de forma no transitoria pero continuamente en una cantidad significativa debido a la capacidad de replicación de manera autónoma del mismo.
De acuerdo con el procedimiento de la presente invención, puede producirse una partícula similar al virus en la que se empaqueta un replicón de ARN subgenómico del VHC, introduciendo un vector que expresa las proteínas estructurales del VHC descritas a continuación en una célula portadora del replicón de ARN subgenómico del VHC de la presente invención.
3. Construcción del vector que expresa la proteína estructural del VHC
En el procedimiento de la presente invención, es preferible expresar los genes de las proteínas estructurales del VHC en una célula portadora de un replicón de ARN subgenómico del VHC para suministrar la proteína estructural del VHC.
Las proteínas estructurales del VHC consisten en Core, E1, E2 y p7. Los genes que codifican estas proteínas para suministrar la proteína estructural del VHC no se limitan por los genotipos del VHC, y cada uno de los genes puede obtenerse a partir de la misma cepa del VHC o pueden estar en forma combinada (quimera) obtenidos a partir de dos o más cepas del VHC diferentes. Es suficiente con que los genes de las proteínas estructurales del VHC se definan de acuerdo con la reivindicación 1. Las cepas del VHC preferidas para el punto (ii) anterior son al menos una cepa vírica seleccionada entre el grupo que consiste en 1a, 2a, 3a y 3b, y las cepas más preferidas del VHC son al menos una cepa vírica seleccionada entre el grupo que consiste en cepas del VHC de genotipo 1b y 2a. Las cepas víricas más preferidas incluyen aquellas de al menos un tipo seleccionado entre el grupo que consiste en cepas de genotipo 1a, tales como H77c, 1, H y HC-J1, cepas de genotipo 1b, tales como J1, con1, TH, J, JT y BK, y cepas de genotipo 2a, tales como JFH1, HC-J6, JCH1 y J6CF. Son más preferidas la cepa H77 de genotipo 1a, la cepa J1 de genotipo 1b y la cepa JFH1 de genotipo 2a. Es mucho más preferida la cepa JFH1 (número de acceso del GenBank AB047639, Kato, T. y col., Gastroenterology, 125 (2003) pág. 1808-1817).
El procedimiento para expresar estas proteínas puede ser cualquier procedimiento, siempre y cuando sea un procedimiento mediante el cual puedan expresarse en una célula, preferiblemente una célula animal, más preferiblemente una célula de mamífero. Se prefiere un procedimiento que usa un vector de expresión en el que se incorporen los genes que se han mencionado anteriormente.
En el procedimiento preferido de la presente invención, se introduce un vector que expresa las proteínas estructurales del VHC (preferiblemente, un vector de expresión que incluye los genes de las proteínas estructurales del VHC de manera expresable bajo el control de un promotor) en una célula portadora del replicón de ARN subgenómico del VHC que se ha descrito en la sección 2 anterior, y se expresa para suministrar las proteínas estructurales del VHC.
Los ejemplos del vector de expresión incluyen CDM8, pEF1/Myc-His1,2,3, pEF4/Myc-His1,2,3, pcDNA3.1, pREP4, pCEP (todos disponibles en Invitrogen Corporation), pCl-neo (Promega Corporation), y así sucesivamente. También puede usarse pcDNA5/TO (Invitrogen Corporation), que incluye un promotor cuya expresión puede regularse por tetraciclina. El promotor no se limita, siempre y cuando pueda expresar los genes en una célula animal, y los ejemplos del mismo incluyen el promotor temprano inmediato (IE) del citomegalovirus, el promotor temprano o tardío de SV40, el promotor de la metalotioneína, el promotor retrovírico, el promotor de choque térmico, el promotor SRa, promotor del factor de elongación 1e, promotor de la albúmina, y así sucesivamente.
Además, los ejemplos de vectores disponibles incluyen vectores víricos. Los vectores víricos no se limitan siempre y cuando puedan infectar una célula animal y expresar un gen extraño deseado, y los ejemplos preferidos de los mismos incluyen un vector retroviral, un vector de adenovirus, un vector del virus Sindbis, y un vector del virus vaccinia. En particular, se prefiere el vector del virus vaccinia, ya que el vector del virus vaccinia puede expresar una gran cantidad de producto génico (Elroy-Stein, O., y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86 (1989) pág. 6126-6130).
Es preferible que el vector que expresa la proteína estructural del VHC usado en el procedimiento de la presente invención incluya el gen de la proteína Core, el gen de la proteína E1, el gen de la proteína E2 y el gen de la proteína p7 como genes de proteínas estructurales del VHC de manera que puedan expresarse en la célula huésped. Los ejemplos un vector que expresa una proteína estructural del VHC de este tipo de la presente invención incluyen vectores que incluyen el gen de la proteína Core, el gen de la proteína E1, el gen de la proteína E2 y el gen de la proteína p7 bajo el control de un promotor que puede expresar los genes insertados. En la presente invención, el vector portador de un promotor del factor de elongación 1e, en el que se insertan el gen de la proteína Core, el gen de la proteína E1, el gen de la proteína E2 y el gen de la proteína p7 bajo el control del promotor del factor de elongación 1e (EF-1e), puede usarse como un vector que expresa una proteína estructural del VHC particularmente preferida. Aquí, la expresión "vector portador del promotor del factor de elongación 1e" significa un vector que incluye la secuencia promotora del gen del factor de elongación 1e (promotor de EF-1e: Mizushima y col., Nucleic Acids Res., 18 (1990) pág. 5322) situada de manera que los genes bajo el control del mismo pueda expresarse en la célula huésped. Los ejemplos de los mismos incluyen pEFI/Myc-His1,2,3 y pEF4/Myc-His1,2,3 (ambos disponibles en Invitrogen Corporation).
Otro ejemplo preferido del vector que expresa la proteína estructural del VHC de la presente invención es un vector del virus vaccinia que comprende el gen de la proteína Core, el gen de la proteína E1, el gen de la proteína E2 y el gen de la proteína p7 de manera expresable (vector recombinante del virus vaccinia). Preferiblemente, pueden usarse cepas del virus vaccinia, tales como, por ejemplo, las cepas DIs, WR y IBTd (Meis, RJ & Condit, RC. Virol. 182 (1992) pág. 442-454) para la preparación de un vector recombinante del virus vaccinia. El procedimiento para preparar un vector recombinante del virus vaccinia también se describe en detalle en los ejemplos descritos más adelante. En resumen, un vector recombinante del virus vaccinia deseado puede producirse clonando los genes de proteínas estructuras del VHC que se han mencionado anteriormente bajo el control de un promotor del virus vaccinia, tal como p.7.5 en un vector de transferencia del virus vaccinia, introduciendo adicionalmente el vector de transferencia en una célula infectada por el virus vaccinia mediante electroporación o similares, cultivando la célula para producir partículas víricas, y además seleccionando preferiblemente el virus y purificándolo. Un vector del virus vaccinia de este tipo puede prepararse en forma de una partícula recombinante similar al virus.
Ya que las proteínas estructurales del VHC (Core, E1, E2, p7) y las proteínas no estructurales (NS3, NS4A, NS4B, NS5A y NS5B) se traducen desde la región traducida como una poliproteína, se someten a una digestión limitada con proteasa, se liberan y se producen, es preferible expresar estas proteínas estructurales del VHC como una poliproteína de Core, E1, E2 y p7 en un tramo continuo, pero estas proteínas pueden expresarse por vectores de expresión separados.
Si las proteínas estructurales se expresan en una célula en la que se introducen un vector que expresa una proteína estructural pueden detectarse haciendo reaccionar una solución de cultivo celular o proteínas extraídas de las células con anticuerpos contra las proteínas estructurales (documento WO2004/104198).
Específicamente, por ejemplo, una muestra de proteínas extraída de las células se fracciona por electroforesis en gel de poliacrilamida SDS, se somete a transferencia sobre una membrana de nitrocelulosa, y se hace reaccionar con un anticuerpo de proteína anti-VHC (por ejemplo, anticuerpo o antisuero específico anti-Core recogido de un paciente con hepatitis C), y el anticuerpo puede detectarse (mediante transferencia de western).
Como alternativa, las células que expresan las proteínas del VHC se inmunotiñen usando un anticuerpo similar, y puede confirmarse la expresión y la localización intracelular de estas proteínas.
4. Empaquetamiento del replicón de ARN subgenómico del VHC en una partícula
En el procedimiento de la presente invención, una partícula similar a un virus, en la que un replicón de ARN subgenómico del VHC se empaqueta por las proteínas estructurales, se produce en una célula suministrando: un vector que expresa las proteínas estructurales del VHC en una célula portadora del replicón de ARN subgenómico del VHC.
Para empaquetar en una partícula vírica un replicón de ARN subgenómico del VHC en una célula en la que el replicón de ARN subgenómico del VHC se replica, un vector que expresa las proteínas estructurales (Core, E1, E2 y p7) puede introducirse en la célula y puede expresarse. Como alternativa, el ARN subgenómico del VHC puede introducirse en una célula en la que las proteínas estructurales (Core, E1, E2 y p7) se expresan de forma estable.
Los ejemplos de un procedimiento de introducción de este tipo incluyen procedimientos conocidos, tales como electroporación, pistola de partículas, lipofección, procedimiento de fosfato cálcico, microinyección y procedimiento de DEAE dextrano.
5. Producción de la partícula recombinante similar al virus VHC
La célula portadora de un replicón de ARN subgenómico del VHC preparada como se ha descrito anteriormente en la que los genes de la proteína estructural del VHC (Core, E1, E2 y p7) se introducen y se expresan (célula productora de una partícula recombinante similar al VHC) puede producir una partícula recombinante similar al virus. La partícula recombinante similar al VHC producida tiene capacidad de infectar y capacidad de replicar el ARN subgenómico del VHC. Sin embargo, no tiene la propiedad de transmisión (capacidad de transmisión), ya que la célula infectada no puede producir una partícula vírica hija.
Por lo tanto, una partícula recombinante similar al VHC puede prepararse en un sistema de cultivo celular cultivando la célula productora de la partícula recombinante del VHC de la presente invención. La partícula similar al VHC puede obtenerse preferiblemente cultivando células productoras de la partícula recombinante similar al VHC y recuperando la partícula similar al virus producida en el cultivo (preferiblemente una solución de cultivo). Puede recuperarse una partícula similar al virus de la solución de cultivo que se ha mencionado anteriormente mediante técnicas tales como, por ejemplo, centrifugación por gradiente de densidad de sacarosa.
La capacidad de producción de la partícula vírica de la célula productora de la partícula recombinante similar al VHC de la presente invención puede confirmarse por cualquier procedimiento de detección de virus conocido por los expertos en la técnica. Por ejemplo, la capacidad de producir una partícula vírica puede determinarse fraccionando una solución de cultivo de células que aparecen para producir una partícula similar al virus por gradiente de densidad de sacarosa, y midiendo la densidad de cada fracción y la concentración de la proteína Core del VHC o el replicón de ARN del VHC en la fracción para observar si la gravedad específica coincide con la gravedad especifica conocida del VHC. Además, cuando la densidad de una fracción en la que se detecta un pico de la proteína Core es inferior a la densidad de la fracción obtenida fraccionando la solución de cultivo después del tratamiento con NP40 al 0,25% (polioxietilen(9) octilfenil éter), puede determinarse que la célula tiene la capacidad de producir una partícula similar al virus.
Además, puede determinarse si una partícula similar al virus en una célula productora de la partícula recombinante similar al VHC tiene la capacidad de infectar mediante la detección del fenotipo de un gen extraño que exista en un ARN subgenómico del VHC empaquetado en la partícula vírica. Por ejemplo, puede evaluarse si el gen extraño es un gen de resistencia al fármaco inoculando la partícula vírica en una célula permisiva del VHC, cultivando normalmente durante 2 a 3 semanas en presencia de este fármaco, y contando los clones resistentes al fármaco.
Además, esto puede confirmar que una partícula similar al virus en una célula productora de la partícula recombinante similar al VHC no produce una partícula vírica hija en una célula infectada, mediante la transferencia de western que se ha descrito anteriormente o similares, si las proteínas estructurales del VHC existen en un extracto de la célula infectada, preferiblemente una muestra de sobrenadante del cultivo celular infectado.
Una partícula vírica recombinante similar al VHC producida por el procedimiento de la presente invención tiene la capacidad de infectar una célula (preferiblemente una célula permisiva del VHC). También se proporciona un procedimiento para producir una célula infectada con el virus de la hepatitis C recombinante que comprende las etapas de cultivar una célula productora de la partícula recombinante similar al VHC y dejar que una partícula similar al virus en el cultivo obtenido (preferiblemente caldo de cultivo) infecte a otra célula (preferiblemente célula permisiva del VHC). Aquí, la célula permisiva del VHC es una célula que tiene la capacidad de replicar ARN genómico del VHC y/o de infectarse por el VHC, y no se limita a estos ejemplos. Los ejemplos específicos de células hepáticas incluyen hepatocitos primarios, célula Huh7, célula HepG2, célula IMY-N9, célula HeLa, y así sucesivamente. Los ejemplos específicos de células linfoides incluyen la célula Molt4, la célula HPB-Ma, la célula Daudi, y así sucesivamente. Sin embargo, las células hepáticas y linfoides no se limitan a estos ejemplos.
Para un entendimiento más fácil, los procedimientos de producción de la partícula recombinante similar al VHC que se han explicado en las secciones 2 a 5 anteriores se muestran esquemáticamente en la figura 1.
6. Vector para introducción génica
La partícula recombinante similar al VHC de la presente invención producida por el procedimiento de la presente invención se caracteriza porque tiene en el genoma de ARN una secuencia nucleotídica que comprende la región no traducida 5', la secuencia nucleotídica que codifica las proteínas NS3, NS4A, NS4B, NS5A y NS5B, y la región no traducida 3', obtenida a partir de las cepas del VHC que se han mencionado anteriormente (al menos una cepa vírica seleccionada entre los genotipos 1a, 1b, 2a, 2b, 3a y 3b, preferiblemente 1b y 2a, tales como, por ejemplo, la cepa con1 de genotipo 1b y la cepa JFH1 de genotipo 2a).
Además, la partícula recombinante similar al VHC de la presente invención tiene una característica de interés, que cuando se deja que la partícula similar al VHC producida en una célula productora de la partícula recombinante similar al VHC mediante el procedimiento de la presente invención infecte una célula (por ejemplo, una célula permisiva del VHC que se ha descrito anteriormente como ejemplo), el ARN subgenómico del VHC que se ha mencionado anteriormente se replica en la célula infectada, pero no se forma una partícula vírica hija.
La partícula recombinante similar al VHC de la presente invención puede usarse como un vector para la introducción/expresión génica insertando un gen extraño deseado en un replicón de ARN subgenómico del VHC empaquetado en el mismo. Dicha partícula vírica recombinante similar al VHC de la presente invención que comprende un gen extraño puede prepararse preparando un replicón de ARN subgenómico del VHC en el que el gen extraño se inserta entre la región no traducida 5' y la secuencia del IRES y se empaqueta mediante el procedimiento que se ha mencionado anteriormente de la presente invención. Ya que la partícula del VHC producida en la célula productora de la partícula recombinante del VHC no tiene capacidad de transmisión, puede usarse como un vector para la introducción génica dirigida a células o tejidos hepáticos o linfoides.
Debido a que no se incorpora un ARN subgenómico del VHC empaquetado en una partícula vírica mediante el procedimiento de producción de la partícula vírica de la presente invención en el genoma cromosómico en una célula permisiva del VHC infectada por la partícula similar al virus de la presente invención, esto tiene la ventaja de que los genes normales no se dañan o los genes en la proximidad del sitio de inserción no se activan por la inserción génica.
Debido a las características que se han mencionado anteriormente, el vector de la presente invención puede usarse, por ejemplo, para terapia génica o construcción de animales transgénicos introduciendo un gen extraño.
Los ejemplos del gen extraño (o ácido nucleico extraño) que se van a introducir en un replicón de ARN subgenómico del VHC y se van a empaquetar en una partícula vírica incluyen, pero sin limitación, genes que codifican proteínas obtenidas a partir de mamíferos, incluyendo seres humanos, por ejemplo, diversas proteínas implicadas en enfermedades, tales como proteínas, polipéptidos, o péptidos, incluyendo, por ejemplo, enzimas, citocinas, quimicinas, hormonas, anticuerpos, moléculas inmunorreguladoras, proteínas supresoras de tumor, factores de crecimiento, proteínas de membrana y proteínas vasoactivas; ácidos nucleicos terapéuticos, tales como ARN antisentido y ARNsi que inhiben o suprimen la traducción de proteínas, y así sucesivamente.
Las células o tejidos susceptibles al VHC diana son células o tejidos de mamíferos, tales como, por ejemplo, células
o tejidos hepáticos y linfoides humanos. El vector de la presente invención se deja actuar sobre las células o tejidos diana en condiciones in vivo, in vitro o ex vivo. Preferiblemente, el vector de la presente invención puede usarse para el tratamiento de seres humanos, por ejemplo, terapia génica, tratamiento de cáncer (por ejemplo, cáncer de hígado, linfoma, etc.), y similares.
El contenido de la memoria descriptiva y/o los dibujos de la Solicitud Japonesa Nº 2005-287825, a la que la presente solicitud reivindica prioridad, se incluyen en la presente memoria descriptiva.
Ejemplos
La presente invención se explicará más específicamente con referencia a los siguientes ejemplos. Sin embargo, estos ejemplos son únicamente para ilustración, y el alcance de la presente invención no se limita a estos ejemplos.
Ejemplo 1
Preparación de la célula portadora de un replicón
El ADN plasmídico pSGR-JFH1 (diagrama del medio de la figura 2) se construyó reemplazando parte de las regiones estructurales y las regiones no estructurales con el gen de resistencia a neomicina (neo: también denominado como gen de neomicina fosfotransferasa) y IRES del VEMC (sitio de entrada interno del ribosoma del virus de la encefalomiocarditis) en pJFH1 que se ha preparado insertando ADN que contiene ADNc genómico de longitud completa de la cepa JFH-1 (genotipo 2a), una cepa del virus de la hepatitis C aislada de un paciente con hepatitis fulminante (clone JFH-1: número de acceso del GenBank AB047639) en el promotor en la dirección 3' del promotor T7 en el plásmido pUC19. Este procedimiento de construcción se realizó de acuerdo con un informe previo (Lohmann y col., Science, 285 (1999) pl 10-113).
Específicamente, el plásmido pJFH1 se digirió con enzimas de restricción AgeI y ClaI, y una secuencia 5'NTR derivada de pJFH1 para la región Core y el gen de resistencia a neomicina derivado de pRSV5NEO se ligaron a los sitios de escisión mediante amplificación por PCR, un fragmento digerido con las enzimas de restricción AgeI y PmeI y una secuencia de IRES del VEMC a la región NS3 se ligaron mediante amplificación por PCR, y un fragmento digerido con las enzimas de restricción PmeI y ClaI se insertó y se ligó.
Posteriormente, pSGR-JFH1 se digirió con la enzima de restricción XbaI. Después, se trataron adicionalmente de 10 a 20 !g de estos fragmentos digeridos con XbaI por incubación usando 20 unidades nucleasa S1 de Aspergillus (volumen total de la mezcla de reacción, 50 !l) a 30 ºC durante 30 minutos. Nucleasa S1 de Aspergillus es una enzima que cataliza una reacción para degradar selectivamente una porción de hebra sencilla en un ADN de doble hebra. Normalmente, cuando se sintetiza ARN usando el fragmento digerido con XbaI que se ha mencionado anteriormente, ya que es como una plantilla, se sintetiza un replicón de ARN con cuatro nucleótidos extra de CTGA, que es una parte de la secuencia de reconocimiento de XbaI, añadidos al extremo 3'. Por consiguiente, en este ejemplo, tratando los fragmentos digeridos con XbaI con nucleasa S1 de Aspergillus, se eliminaron cuatro nucleótidos de CTGA del fragmento digerido con XbaI. Posteriormente, para obtener una plantilla de ADN, una solución que contenía el fragmento digerido con XbaI tratado con nucleasa S1 de Aspergillus se sometió a un tratamiento de eliminación de proteínas de acuerdo con un procedimiento convencional para purificar el fragmento digerido con XbaI a partir del cual se eliminaron cuatro nucleótidos de CTGA.
Posteriormente, se sintetizó ARN in vitro mediante T7 ARN polimerasa usando esta plantilla de ADN. Para esta síntesis de ARN, se usó el MEGAscript de Ambion. Se hicieron reaccionar 20 !l de la mezcla de reacción que contenía de 0,5 a 1,0 !g de plantilla de ADN de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Después de la finalización de la síntesis de ARN, a la solución de reacción se le añadió DNasa (2 unidades), se hizo reaccionar a 37 ºC durante 15 minutos, y después la extracción de ARN se realizó adicionalmente con fenol ácido para eliminar la plantilla de ADN.
Se mezclaron de 0,01 ng a 10 !g de este ARN (replicón de ARN) con un ARN celular total extraído de la célula Huh7 y se ajustó de forma que la cantidad de ARN total fuera 10 !g. Después, el ARN mezclado se introduce en la célula Huh7 por electroporación. Las células Huh7 electroporadas se sembraron en una placa de cultivo y se cultivaron durante 16 a 24 horas, y después a la placa de cultivo se le añadió G418 (neomicina) a diversas concentraciones. Después, el cultivo continuó mientras se reemplazaba el medio de cultivo dos veces a la semana. Las colonias de células viables se clonaron de la placa de cultivo después de 21 días del cultivo que se ha mencionado anteriormente, y el cultivo continuó. Pueden establecerse algunas cepas de clones de células clonando dichas colonias. Una cepa celular potadora del replicón de ARN subgenómico del VHC se denominó como 1H4.1.
Además, también se usó para los experimentos la célula 5-15, una cepa celular portadora de un replicón de ARN subgenómico del VHC (número de acceso del GenBank, AJ242654; I389/NS3-3'/wt en la columna inferior de la figura 2) preparada a partir del ADNc del genoma de longitud completa de la cepa Con-1 del genotipo 1b del VHC de la misma manera que se ha descrito anteriormente, que se preparó introduciendo este replicón de ARN en la cepa celular Huh7 (Lohmann y col., Science, 285 (1999) pág. 110-113).
Ejemplo 2
Preparación de un vector que expresa una proteína estructural
1) Vector plasmídico que expresa una proteína estructural
Una región que incluye genes de región estructural (posiciones de los nucleótidos: 249 a 2781) de la cepa JFH1 aislada de un paciente con hepatitis fulminante (número de acceso del GenBank AB047639) (Kato T. y col., J. Med. Viol. 64 (2001) pág. 334-339) se amplificó por PCR. Este fragmento de ADN se digirió con NheI y EcoRI y, por lo tanto, un fragmento obtenido que contenía los genes estructurales se purificó por electroforesis en gel de agarosa y se cortó con los extremos romos por ADN polimerasa. Este ADNc de extremos romos se insertó en la dirección 3' de la secuencia promotora CAG (CAG) en un vector plasmídico. De forma análoga, el ADNc que se ha mencionado anteriormente que contenía los genes de región estructural obtenidos mediante la digestión con Nhel y EcoRI se insertó entre los sitios de reconocimiento Spel y EcoRI en pEF4/Myc-His (Invitrogen Corporation), un vector portador de la secuencia promotora génica del factor de elongación 1e (promotor EF-1e: Mizushima y col., Nucleic Acids Res., 18 (1990) pág. 5322). Los plásmidos obtenidos resultantes se denominaron como pCAGC-p7JFH1 y pEF4Cp7JFH1, respectivamente (figura 3).
2) Proteínas estructurales que expresan el vector recombinante del virus vaccinia
Para preparar un vector que contiene los genes estructurales de la cepa JFH1 y que puede expresar las proteínas codificadas mediante estos genes, en primer lugar, pEF4C-p7JFH1 mostrado en el diagrama superior de la figura 3 se digirió con enzimas de restricción BamHI y EcoRI, y la región codificante de las proteínas Core, E1 E2 y p7 se fraccionó mediante electroforesis en gel de agarosa. Posteriormente, este fragmento se ligó a un vector de transferencia del virus vaccinia pDIsgptmH5 que se designa para que el gen xantina-guanina fosforribosil transferasa (XGPRT) se inserte junto con un gen extraño de interés (Ohnishi, K. y col., Jap. J. Infect. Dis. 58 (2005) pág. 88-94; Ishii, K. y col., Virology 302 (2002) pág. 433-444). Este pDIsgptmH5 es un vector de transferencia en el que el gen XGPRT de Escherichia coli se incorpora bajo el control del promotor p7.5 del virus vaccinia insertado en un sitio de clonación del vector pUc/DIs (Ishii, K. y col., Virology 302 (2002) pág. 433-444). El vector obtenido se denominó como pDIsJFHst.
Se preparó un vector que comprende los genes estructurales de la cepa H77c y que puede expresar las proteínas codificadas por estos genes mediante el siguiente procedimiento. En primer lugar, se clonó un vector en el que el ADNc genómico del VHC de la cepa H77c (número de acceso del GenBank AF011751) como plantilla, se añadieron 5 !l de tampón 10 x acompañados por el kit LA-PCR (Takara Bio Inc.), 5 !l de una mezcla dNTP 2,5 mM, y 1 !l de cada uno del cebador directo H77/J1 10 !M (AAAGATCTGCGAAAGGCCTTGTGGTACTGC: SEC ID Nº: 1) y el cebador inverso H77 (AAGAGCTCTCATAACCCGACAAGAACAACGCCGCC: SEC ID Nº: 2), y finalmente se añadió agua desionizada para preparar 49 !l de volumen total. Después, se añadió 1 !l de Takara LA Taq (Takara Bio Inc.) y se realizó la reacción por PCR. La reacción por PCR se realizó en las siguientes condiciones: 25 ciclos de 98 ºC durante 20 segundos y 68 ºC durante 5 minutos (por un ciclo). Cuando una parte de los productos por PCR se sometió a electroforesis sobre un gel de agarosa, se confirmó un producto de amplificación de aproximadamente 2,5 kb.
Por consiguiente, se realizó una reacción de ligación usando 2 !l de productos de PCR para ligar un producto de amplificación a un vector plasmídico. Se transformó Escherichia coli con este producto de ligación de acuerdo con un procedimiento convencional, y se preparó ADN plasmídico usando el transformante obtenido. Este ADN plasmídico se digirió con enzimas de restricción que pueden eliminar el fragmento de ADN insertado en el ADN plasmídico y se sometió a electroforesis en gel de agarosa para confirmar que se insertó un fragmento de ADN de 2,5 kb en el ADN plasmídico. La secuencia nucleotídica del fragmento de ADN insertado se determinó mediante un procedimiento convencional. Como resultado, se descubrió que la secuencia nucleotídica determinada coincidía con la secuencia de las posiciones nucleotídicas 271 a 2819 en la secuencia nucleotídica con el número de acceso del GenBank AF011751. Posteriormente, este ADN plasmídico se digirió con Bgll y Sacl y se sometió a electroforesis de agarosa para aislar un fragmento de ADN que contenía la región génica estructural de la cepa H77c, que se ligó al vector de transferencia del virus vaccinia pDIsgptmH5 (Ohnishi, K. y col., Jap. J. Infect Dis. 58 (2005) pág. 88-94; Ishii, K. y col., Virology 302 (2002) pág. 433-444). El vector obtenido como resultado se denominó pDIsH77st.
Se preparó un vector que comprende los genes estructurales de la cepa J1 y que puede expresar las proteínas codificadas por estos genes mediante el siguiente procedimiento. En primer lugar, se clonó un vector en el que el ADNc genómico del VHC de la cepa J1 (número de acceso del GenBank D89815) como plantilla, se añadieron 5 !l de tampón 10 x acompañados por el kit LA-PCR (Takara Bio Inc.), 5 !l de una mezcla dNTP 2,5 mM, y 1 !l de cada uno del cebador directo H77/J1 10 !M (AAAGATCTGCGAAAGGCCTTGTGGTACTGC: SEC ID Nº: 1) y el cebador inverso J1 (AAGAGCTCTCATAGACCTACAAAAACCCCGCCTCC: SEC ID Nº: 3), y finalmente se añadió agua desionizada para preparar 49 !l de volumen total. Después, se añadió 1! de Takara LA Taq (Takara Bio Inc.) y se realizó la reacción por PCR. La reacción por PCR se realizó en las siguientes condiciones: 25 ciclos de 98 ºC durante 20 segundos y 68 ºC durante 5 minutos (por un ciclo). Cuando una parte de los productos de PCR se sometieron a electroforesis sobre un gel de agarosa, se confirmó un producto de amplificación de aproximadamente 2,5 kb. Por consiguiente, una reacción de ligación se realizó usando 2 !l de los productos de PCR para ligar un producto de amplificación al vector plasmídico. Se transformó Escherichia coli con este producto de ligación de acuerdo con un procedimiento convencional, y se preparó ADN plasmídico usando el transformante obtenido. Este ADN plasmídico se digirió con enzimas de restricción que pueden eliminar el fragmento de ADN insertado en el ADN plasmídico y se sometió a electroforesis en gel de agarosa para confirmar que se insertó un fragmento de ADN de 2,5 kb en el ADN plasmídico. La secuencia nucleotídica del fragmento de ADN insertado se determinó mediante un procedimiento convencional. Como resultado, se descubrió que la secuencia nucleotídica determinada coincidía con la secuencia de las posiciones nucleotídicas 271 a 2819 en la secuencia nucleotídica con el número de acceso del GenBank D89815. Posteriormente, este ADN plasmídico se digirió con Bg/ll y Sacl y se sometió a electroforesis de agarosa para aislar un fragmento de ADN que contenía la región génica estructural de la cepa J1, que se ligó al vector de transferencia del virus vaccinia pDIsgptmH5 (Ohnishi, K. y col., Jap. J. Infect. Dis. 58 (2005) pág. 88-94; Ishii, K. y col., Virology 302 (2002) pág. 433-444). El vector obtenido resultante se denominó pDIsJ1st.
Se preparó un vector que comprende una secuencia génica estructural quimérica del gen Core obtenido a partir de la cepa J1 y los genes E1, E2 y p7 obtenidos a partir de la cepa JFH1 y que puede expresar las proteínas codificadas por estos genes mediante el siguiente procedimiento. En primer lugar, para amplificar el gen Core de la cepa J1, se clonó un vector en el que el ADNc genómico del VHC de la cepa J1 l (número de acceso del GenBank D89815) como plantilla, se añadieron 5 !l de tampón 10 x acompañados por el kit LA-PCR (Takara Bio Inc.), 5 !l de una mezcla dNTP 2,5 mM, y 1 !l de cada uno del cebador directo H77/J1 10 !M (AAAGATCTGCGAAAGGCCTTGTGGTACTGC: SEC ID Nº: 1) y el cebador inverso J1/JFH1 (GTAGCTGCTACTGGTATTCTTCACCTGGGCAGCGGAAGCTGGGATGGTCAAACAGGACAG: SEC ID Nº: 4), y finalmente se añadió agua desionizada para preparar 49 !l de volumen total. Después, se añadió 1 !l de Takara LA Taq (Takara Bio Inc.) y se realizó la reacción por PCR. La reacción por PCR se realizó en las siguientes condiciones: 25 ciclos de 98 ºC durante 20 segundos y 68 ºC durante 5 minutos (por un ciclo). Para amplificar los genes E1, E2 y p7 de la JFH1, se clonó un vector en el que el ADNc genómico del VHC de la cepa JFH1 (número de acceso del GenBank AB047639) como plantilla, se añadieron 5 !l de tampón 10 x acompañados por el kit LA-PCR (Takara Bio Inc.), 5 !l de una mezcla dNTP 2,5 mM, y 1 !l de cada uno del cebador directo J1/JFH1 10 !M (CTGTCCTGTTTGACCATCCCAGCTTCCGCTGCCCAGGTGAAGAATACCAGTAGCA GCTAC: SEC ID Nº: 5) y el cebador inverso JFH1 (AAGAGCTCTCAATCAATATCAACAAACCCACGCCT: SEC ID Nº: 6), y finalmente se añadió agua desionizada para preparar 49 !l de volumen total. Después, se añadió 1 !l de Takara LA Taq (Takara Bio Inc.) y se realizó la reacción por PCR. La reacción por PCR se realizó en las siguientes condiciones: 25 ciclos de 98 ºC durante 20 segundos y a 68 ºC durante 5 minutos (por un ciclo). Los fragmentos amplificados obtenidos se purificaron y se disolvieron en 50 !l de H2O. 1 !l de cada solución se diluyó 100 veces, y 1 !l de cada solución se combinó en una mezcla. Usando esta mezcla como plantilla, se realizaron 5 ciclos de LA-PCR en las condiciones que se han descrito anteriormente sin añadir cebadores. Después, se añadieron el cebador directo H77/J1 (SEC ID Nº: 1) y el cebador inverso JFH1 (SEC ID Nº: 6), se realizaron 10 ciclos más de LA-PCR, y el fragmento de ADN quimérico amplificado se purificó. Este fragmento se clonó en el vector plasmídico, y se determinó la secuencia nucleotídica del fragmento de ADN. Como resultado, se confirmó que el fragmento de ADN tenía una secuencia génica estructural quimérica del gen Core obtenido a partir de la cepa J1 y los genes E1, E2 y p7 obtenidos a partir de la cepa JFH1. Posteriormente, un fragmento obtenido digiriendo este plásmido con Bg/II y SacI se ligó al vector de transferencia del virus vaccinia pDIsgptmH5 (Ohnishi, K. y col., Jap. J. Infect. Dis. 58 (2005) pág. 88-94; Ishii, K. y col., Virology 302 (2002) pág. 433-444). El vector obtenido resultante se denominó pDIsJ1(c)/JFH1 (E1-p7)st.
Se preparó un vector que comprende una secuencia génica estructural quimérica del gen Core obtenido a partir de la cepa JFH1 y los genes E1, E2 y p7 obtenidos a partir de la cepa J1 y que puede expresar las proteínas codificadas por estos genes mediante el siguiente procedimiento. En primer lugar, para amplificar el gen Core de la cepa JFH1, se clonó un vector en el que el ADNc genómico del VHC de la cepa JFH1 (número de acceso del GenBank AB047639) como plantilla, se añadieron 5 !l de tampón 10 x acompañados por el kit LA-PCR (Takara Bio Inc.), 5 !l de una mezcla dNTP 2,5 mM, y 1 !l de cada uno del cebador directo JFH1 10 !M (AAAGATCTGCGAAAGGCCTTGTGGTACTGC: SEC ID Nº: 7) y el cebador inverso JFH1/J1 (GGTATATCCCGGACACGTTGCGCACTTCATAAGCAGAGACCGGAACGGTGATGC AGGAC: SEC ID Nº: 8), y finalmente se añadió agua desionizada para preparar 49 !l de volumen total. Después, se añadió 1 !l de Takara LA Taq (Takara Bio Inc.) y se realizó la reacción por PCR. La reacción por PCR se realizó en las siguientes condiciones: 25 ciclos de 98 ºC durante 20 segundos y 68 ºC durante 5 minutos (por un ciclo). Para amplificar los genes E1, E2 y p7 de la cepa J1, se clonó un vector en el que el ADNc genómico del VHC de la cepa J1 (número de acceso del GenBank D89815) se clonó como plantilla, se añadieron 5 !l de tampón 10 x acompañados por el kit LA-PCR (Takara Bio Inc.), 5 !l de una mezcla dNTP 2,5 mM, y 1 !l de cada uno del cebador directo JFH1/J1 10 !M (GTCCTGCATCACCGTTCCGGTCTCTGCTTATGAAGTGCGCAACGTGTCCGGGATA TACC: SEC ID Nº: 9) y el cebador inverso J1 (AAGAGCTCTCATAGACCTACAAAAACCCCGCCTCC: SEC ID Nº: 3), y finalmente se añadió agua desionizada para preparar 49 !l de volumen total. Después, se añadió 1 !l de Takara LA Taq (Takara Bio Inc.) y se realizó la reacción por PCR La reacción por PCR se realizó en las siguientes condiciones: 25 ciclos de 98 ºC durante 20 segundos y 68 ºC durante 5 minutos (por un ciclo). Los fragmentos amplificados obtenidos se purificaron y se disolvieron en 50 !l de H2O. 1 !l de cada solución se diluyó 100 veces, y 1 !l de cada solución se combinó en una mezcla. Usando esta mezcla como plantilla, se realizaron 5 ciclos de LA-PCR en las condiciones que se han descrito anteriormente sin añadir cebadores. Después, se añadieron el cebador directo JFH1 (SEC ID Nº: 7) y el cebador inverso J1 (SEC ID Nº: 3), se realizaron 10 ciclos más de LA-PCR, y el fragmento de ADN quimérico amplificado se purificó. Este fragmento se clonó en el vector plasmídico, y se determinó la secuencia nucleotídica del fragmento de ADN. Como resultado, se confirmó que el fragmento de ADN tenía una secuencia génica estructural quimérica del gen Core obtenido a partir de la cepa JFH1 y los genes E1, E2 y p7 obtenidos a partir de la cepa J1. Posteriormente, un fragmento obtenido digiriendo este plásmido con Bg/II y SacI se ligó al vector de transferencia del virus vaccinia pDIsgptmH5 (Ohnishi, K. y col., Jap. J. Infect. Dis. 58 (2005) pág. 88-94; Ishii, K. y col., Virology 302 (2002) pág. 433-444). El vector obtenido como resultado se denominó pDIsJFH(c)/J1(E1-p7)st.
Los mapas de las secuencias génicas estructurales del VHC (secuencia génica estructural quimérica) insertados en los vectores preparados como se ha descrito anteriormente, pDIsJFHst, pDIsH77st, pDIsJ1st, pDIsJ1(c)/JFH(E1p7)st y pDIsJFH(c)/J1(E1-p7)st, se muestran en la figura 4.
Por ejemplo, la cepa DIs recombinante del vector del virus vaccinia portadora de cada uno de los vectores que se han mencionado anteriormente se preparó y se seleccionado como se indica a continuación.
Se inocularon 500 !l de una solución de virus que contenía aproximadamente 106 unidades formadoras de placas (ufp) de la cepa DIs del virus vaccinia en una placa de 80 mm sobre la que se sembraron aproximadamente 107 células de fibroblastos de embriones de pollo (FEP), y se dejó que el virus infectara a las células mediante agitación cada 15 minutos 8 veces. Después, se añadió Medio de Eagle Modificado por Dulbecco (DMEM) con 1 ml de suero fetal bovino (FCS) al 10%, y la mezcla se cultivó a 37 ºC en CO2 al 5% durante 2 horas. El medio se eliminó, las células se lavaron con serina tamponada con fosfato (PBS) y se añadieron 0,5 ml de una solución al 0,05% de tripsina para liberar las células. Después, la suspensión celular se centrifugó a 2000 rpm durante 3 minutos para recuperar las células, y las células se suspendieron en 400 !l de PBS. Se disolvieron 10 !g del vector de transferencia que se ha mencionado anteriormente en esta suspensión celular, y la electroporación se realizó en una cubeta de 0,4 cm usando Gene Pulser II (Bio-Rad Laboratories, Inc.), con una tensión aplicada una vez a 250 v y 500 pFD. Las células se suspendieron en 2 ml de DMEM que contenía FCS al 10%, se sembraron en una placa de 35 mm y se cultivaron a 37 ºC en CO2 al 5% durante 7 días. Las células infectadas se recuperaron con el medio, se liofilizaron 3 veces, se ultrasonicaron durante 2 minutos y después se diluyeron 10, 100 ó 1000 veces con el mismo medio. Se sembraron 106 células sobre una placa de 35 mm seguido por la adición de 25 !g/ml de MPA, 250 !g/ml de xantina y 15 !g/ml de hipoxantina al medio (DMEM que contenía FCS al 10%) y se cultivaron durante una noche. Después, se inocularon las soluciones celulares diluidas que se han mencionado anteriormente. Se dejó que el virus infectara las células por agitación cada 15 minutos 8 veces, la solución celular diluida se eliminó, después se añadieron 2 ml de medio añadido con agar blanco al 1% (DMEM con FCS al 10%; que contenía MPA, xantina e hipoxantina), y la mezcla se solidificó y se cultivó a 37 ºC en CO2 al 5% durante 7 días. Las porciones de placas formadas se recogieron con una pipeta Pasteur, se suspendieron en 200 !l de DMEM que contenía FCS al 10%, y se ultra-sonicaron durante 2 minutos para liberar el virus del agar. Esta solución de cultivo se diluyó 10, 100 y 1000 veces con el mismo medio, el mismo procedimiento de ensayo de placas que se ha descrito anteriormente se repitió dos veces más para purificar el virus recombinante, y los procedimientos se cambiaron de escala infectando las células de FEP.
Los vectores virales (particulares recombinantes similares a virus) preparados como se ha descrito anteriormente a partir de pDIsJFHst, pDIsH77st, pDIsJ1st, pDIsJ1(c)/JFH(E1-p7)st y pDIsJFH(c)/J1(E1-p7)st se denominaron DIsJFHst, DIsH77st, DIsJ1st, DIsJ1 (c)/JFH(E1-p7)st y DIsJFH(c)/J1(E1-p7)st, respectivamente.
Ejemplo 3
Introducción de un vector que expresa una proteína estructural en la célula portadora de replicón y producción de la proteína estructural
Para expresar las proteínas estructurales del VHC en una célula portadora de replicón, el vector pCAGC-p7JFH1 o pEF4C-p7JFH1 que se ha preparado en el Ejemplo 2 que expresa la proteína estructural del VHC se introdujo en una célula portadora de replicón por lipofección y similares. Además, se dejó que los vectores virales que expresan las proteínas estructurales del VHC que se han preparado en el Ejemplo 2, DIsJHst, DIsH77st, DIsJ1st, DIsJ1(c)/JFH(E1-p7)st y DIsJFH(c)/J1(E1-p7)st, infectaran a las células portadoras de replicón.
1) Introducción de un vector plasmídico que expresa una proteína estructural
Se introdujo pCAGC-p7JFH1 en la célula 5-15 portadora de replicón por lipofección, después las células se cultivaron continuamente en una solución de cultivo de 8 ml y el sobrenadante de cultivo se recuperó a los 4 días para cuantificar la proteína Core del VHC. Sin embargo, la cantidad estaba por debajo del límite de detección.
Mientras tanto, se introdujo pEF4C-p7JFH1 en la célula IH4.1 portadora de replicón por lipofección. Como resultado, la proteína Core del VHC puedo detectarse en el sobrenadante de cultivo por transferencia de Western. Por consiguiente, las células IH4.1 portadoras de replicón en las que se introdujo pEF4C-p7JFH1 se cultivaron durante 4 días, después se recogió un medio de cultivo (8 ml) y se centrifugó a 8.000 g y a 4 ºC durante 60 minutos para recoger el sobrenadante de cultivo. Posteriormente, este sobrenadante se centrifugó usando un rotor SW20 (Beckman) a 25.000 rpm y a 4 ºC durante 4 horas, y los gránulos se suspendieron en 1 ml de tampón. La muestra se cubrió sobre gradientes de densidad de sacarosa del 10 al 60% preparados en un tubo para el rotor SW41 E (Beckman) y se centrifugaron a 35.000 rpm y a 4 ºC durante 16 horas. Los gradientes de densidad de sacarosa del 10 al 60% se prepararon por deposición de 2 ml de una solución al 60% (peso/peso) de sacarosa (disuelta en Tris 50 mM, pH 7,5/NaCl 0,1 M/EDTA 1 mM), 1 ml de una solución al 50% de sacarosa, 1 ml de una solución al 40% de sacarosa, 1 ml de una solución al 30% de sacarosa, 1 ml de una solución al 20% de sacarosa, y 1 ml de una solución al 10% de sacarosa en un tubo centrífuga.
Después de la finalización de la centrifugación, se recogieron 0,5 ml de cada una de las fracciones del fondo del tubo. Se determinaron la densidad, la concentración de la proteína Core del VHC y la concentración de ARN para cada fracción. La proteína Core del VHC se cuantificó por el ensayo IRMA del antígeno del orto-VHC (Aoyagi y col.,
J. Clin. Microbiol., 37 (1999) pág. 1802-1808). El ARN del replicón del VHC se cuantificó de acuerdo con el procedimiento de (Takeuchi y col., Gastroenterology, 116 (1999) pág. 636-642). Como se muestra en la figura 5, los picos del replicón de ARN y la proteína Core coinciden y ambos están en la fracción 8 en dos experimentos. La densidad de esta fracción coincidían con la densidad indicada de la partícula del VHCm con aproximadamente 1,17 g/ml. Esto sugirió que se produjeron las partículas virales.
2) Introducción del vector recombinante del virus vaccinia que expresa la proteína estructural del VHC
Se sembraron 2 x 106 células de la cepa celular 5-15 portadora del replicón en una placa de 10 cm, y dejó que 0,5 ufp/célula de DIsJFHst infectaran la cepa celular portadora de replicón al día siguiente. El cultivo continuó en un medio de cultivo de 8 ml. Después de 4 días de cultivo, la solución de cultivo se recuperó, se centrifugó a 8.000 g y a 4 ºC durante 60 minutos, y el sobrenadante de cultivo se recogió. Después, este sobrenadante se centrifugó usando el rotor SW20 (Beckman) a 25.000 rpm y a 4 ºC durante 4 horas y se suspendieron gránulos equivalentes a 8 ml de la solución de cultivo celular en 1 ml de tampón con o sin NP40 al 0,2%. La muestra se incubó a 4 ºC durante 20 minutos, se cubrió sobre gradientes de densidad de sacarosa del 10 al 60% en un tubo para el rotor SW41E (Beckman) y se centrifugó a 35.000 rpm y a 4 ºC durante 16 horas. El gradiente de densidad de sacarosa del 10 al 60% se preparó por deposición de 2 ml de una solución al 60% (peso/peso) de sacarosa (disuelta en Tris 50 mM, pH 7,5/NaCl 0,1 M/EDTA 1 mM), 1 ml de una solución al 50% de sacarosa, 1 ml de una solución al 40% de sacarosa, 1 ml de una solución al 30% de sacarosa, 1 ml de una solución al 20% de sacarosa y 1 ml de una solución al 10% de sacarosa en un tubo centrífuga.
Después de la finalización de la centrifugación, se recuperaron 0,5 ml de cada una de las fracciones del fondo del tubo. Se determinaron la densidad y la concentración de proteína Core del VHC para cada fracción. La proteína Core del VHC se cuantificó por el ensayo IRMA del antígeno del orto-VHC (Aoyagi y col., J. Clin. Microbiol., 37 (1999) pág. 1802-1808).
Se muestran los resultados de dos experimentos independientes en la figura 6. En el grupo no tratado NP40 (tratado con PBS), la densidad de la partícula que contenía la proteína Core era 1,16 g/ml (fracción 7). En el grupo tratado NP40, la densidad de la partícula que contenía la proteína Core era 1,21 g/ml (fracción 9). Esto sugirió que una membrana superficial que tenía una alta gravedad específica debido a los lípidos que contenía se eliminó de la partícula vírica por NP40, formando una partícula núcleo que tenía el ácido nucleico y la partícula Core sola sin una estructura similar a un virus, y por lo tanto la gravedad específica aumento. Esto sugirió que se produjo una partícula vírica completa en este sistema experimental.
De la misma manera que se ha descrito anteriormente, se dejó que los vectores virales DIsJ1st, DIsJ1(c)JFH(E1p7)st y DIsJFH(c)/J1(E1-p7)st infectaran la cepa celular 5-15 portadora del replicón. Se concentraron 8 ml del sobrenadante obtenido mediante el cultivo de las células durante 4 días después de la infección con una membrana de ultrafiltración y se fraccionaron por la centrifugación del gradiente de densidad de sacarosa que se ha mencionado anteriormente. Se determinaron la densidad y la concentración de la proteína Core del VHC para cada fracción. El patrón de distribución de la densidad de la proteína Core del VHC mostró que la partícula similar a un virus producida es encontraba en el sobrenadante de cultivo de las células infectadas por DIsJ1st, DIsJ1(c)/JFH(E1p7)st o DIsJFH(c)/J1(E1-p7)st.
Ejemplo 4
Confirmación de la capacidad de infectar de la partícula recombinante similar al VHC
Como se muestra en la figura 1, la partícula recombinante del VHC, preparada en los ejemplos que se han descrito anteriormente, tiene el gen neo como un marcador de resistencia a fármacos. Por lo tanto, para confirmar que la partícula obtenida en el Ejemplo 3 tiene la capacidad de infectar, basta con permitir a esta partícula infectar la célula Huh7 y examinar si pueden obtenerse colonias de resistencia a G418 (neomicina).
Se dejó que DIsJFHst infectara la cepa celular 5-15 portadora del replicón, el sobrenadante de cultivo obtenido cultivando las células durante 4 días se concentró 30 veces por ultrafiltración de la membrana (límite, 1 x 103 Da) para infectar las células Huh7. Después de la infección, a la placa de cultivo se le añadió 1 mg/ml de G418. Después, el cultivo continuó mientras se reemplazaba el medio de cultivo dos veces a la semana. Después del cultivo durante 21 días después del sembrado, las células viables se tiñeron con violeta cristal. Como resultado, se confirmó la formación de colonias.
Si no se detectan proteínas estructurales del VHC en una célula infectada, esto significa que no se producen partículas hijas en la célula infectada. Por lo tanto, las colonias formadas en este experimento se propagaron, y se prepararon los extractos celulares de las mismas. Después, se analizaron las proteínas de estos extractos por SDS-PAGE y por transferencia de western. En los análisis, la célula Huh7 se transfectó de forma transitoria por el ADN
del plásmido de expresión, incluyendo el gen Core, y el extracto celular obtenido se usó como control positivo. Además, se usó un extracto celular obtenido de la célula Huh7 que no se transfectó como control negativo. Una muestra extraída de cada clon celular se sometió a SDS-PAGE y después se sometió a inmunotransferencia en una membrana PVDF (Immobilon-P, Millipore), y la proteína Core traducida en la célula se analizó por ECL (Amersham 5 Pharmacia Biotech Pharmacia) usando un anticuerpo específico anti-Core (anticuerpo 2H9 del clon) y un anticuerpo secundario marcado con HRP que reconoce el anticuerpo. Como resultado, no se detectó la proteína Core en las células infectadas. Por lo tanto, se determinó que no se produjo una partícula vírica hija en las células infectadas. Esto significa que, después de que la partícula recombinante similar al VHC producida por el procedimiento de la presente invención infecte a otra célula, ésta no se reproduce más como una partícula, sino que tiene la capacidad
10 de extender adicionalmente la infección a otras células (capacidad de transmisión).
Aplicabilidad Industrial
Una partícula recombinante similar al VHC que tiene la propiedad de infectar pero no la propiedad de transmisión, en
15 la que un ARN subgenómico del VHC que contiene un gen extraño deseado se empaqueta, y un procedimiento para producir la misma pueden proporcionarse por la presente invención. Ya que una partícula recombinante similar al VHC de este tipo que posee la propiedad de infectar tiene la ventaja de carecer de la propiedad de transmisión, puede usarse en terapia génica a través de la introducción del gen in vivo o ex vivo a células hepáticas o linfoides o tejidos de animales, en particular, seres humanos, o pueden usarse como un vector viral para construir un animal
20 transgénico o como una vacuna atenuada.
Listado de secuencias sin texto
Las secuencias de las SEC ID Nº: 1 a 9 representan cebadores.
LISTADO DE SECUENCIAS
<110> Director General of National Institute of Infectious Diseases Tokyo Metropolitan Organization for Medical Research Toray Industries, Inc.
<120> Nueva partícula recombinante similar al virus de la hepatitis C humano y procedimiento para producir la misma
<130> PH-2921-PCT
<140> PCT/JP2006/319573
<141> 2006-09-29
<150> JP 2005-287825
<151> 2005-09-30
<160> 14
<170> PatentIn Ver. 2.1
<210> 1
<211> 30
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Descripción de la Secuencia Artificial: cebador
<220>
<223> Inventor: Tanabe, Jun-ichi: Sone, Saburo: Wakita, Takaji Inventor: Ishii, Takashi; Suzuki, Ryosuke: Suzuki, Tetsurou Inventor: Miyamura Tatsuo
<400> 1 aaagatctgc gaaaggcctt gtggtactgc 30
<210> 2
<211> 35
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Descripción de la Secuencia Artificial: cebador
<400> 2 aagagctctc ataacccgac aagaacaacg ccgcc 35
<210> 3
<211> 35
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Descripción de la Secuencia Artificial: cebador
<400> 3 aagagctctc atagacctac aaaaaccccg cctcc 35
<210> 4
<211> 60
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Descripción de la Secuencia Artificial: cebador
<400> 4 gtagctgcta ctggtattct tcacctgggc agcggaagct gggatggtca aacaggacag 60
<210> 5
<211> 60
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Descripción de la Secuencia Artificial: cebador
<400> 5 ctgtcctgtt tgaccatccc agcttccgct gcccaggtga agaataccag tagcagctac 60
<210> 6
<211> 35
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Descripción de la Secuencia Artificial: cebador
<400> 6 aagagctctc aatcaatatc aacaaaccca cgcct 35
<210> 7
<211> 30
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Descripción de la Secuencia Artificial: cebador
<400> 7 aaagatctgc gaaaggcctt gtggtactgc 30
<210> 8
<211> 29
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Descripción de la Secuencia Artificial: cebador
<400> 8 ggtatatccc ggacacgttg cgcacttcat aagcagagac cggaacggtg atgcaggac 29
<210> 9
<211> 29
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Descripción de la Secuencia Artificial: cebador
<400> 9 gtcctgcatc accgttccgg tctctgctta tgaagtgcgc aacgtgtccg ggatatacc 29
<210> 10
<211> 9678
<212> ADN
<213> Virus de la hepatitis C
<220>
<221> CDS
<222> (341).. (9442)
<400> 10
<210> 11
<211> 3033
<212> PRT
<213> Virus de la hepatitis C
<400> 11
<210> 12
<211> 13
<212> ADN
5
<213> Virus de la hepatitis C
<400> 12
ctagccgagt agc
13
<210> 13
<211> 26
10
<212> ADN
<213> Virus de la hepatitis C
<400> 13
ccccggcagg cttatgccta gaattc
26
<210> 14
<211> 6
<212> PRT
<213> Virus de la hepatitis C
<400> 14

Claims (11)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Un procedimiento para producir una partícula recombinante similar al virus de la hepatitis C que comprende, introducirla en
    (i)
    una célula portadora de un replicón de ARN subgenómico que no incluye genes que codifican las proteínas estructurales del virus de la hepatitis C y que comprende una secuencia nucleotídica que comprende la región no traducida 5', la secuencia nucleotídica codificante para la proteína no estructural,
    y la región no traducida 3' de un ARN genómico obtenido a partir de una cepa del virus de la hepatitis C del genotipo 1b que es una cepa con1 o una cepa obtenida a partir del mismo en la que las proteínas no estructurales son las proteínas NS3, NS4A, NS4B, NS5A y NS5B
    (ii)
    un vector del virus vaccinia o un promotor EF-1e portador del vector que expresa las proteínas Core, E1, E2 y p7 obtenidas a partir de al menos una cepa de virus seleccionada entre el grupo que consiste en cepas del virus de la hepatitis C del genotipo 1a, 1b, 2a, 2b, 3a y 3b que es diferente de la cepa del virus de la hepatitis C que se ha definido en (i)
    cultivar la célula y recuperar la partícula similar al virus producida.
  2. 2.
    El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la cepa del virus de la hepatitis C como se ha definido en (ii) es del genotipo 1 a y es la cepa H77c, 1, H o HC-J1.
  3. 3.
    El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la cepa del virus de la hepatitis C como se ha definido en (ii) es del genotipo 1b y es la cepa J1, TH, J, JT o BK.
  4. 4.
    El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la cepa del virus de la hepatitis C como se ha definido en (ii) es del genotipo 2a y es la cepa JFH1, HC-J6, JCH1 o J6CF.
  5. 5.
    El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la cepa del virus de la hepatitis C como se ha definido en (ii) es del genotipo 3a y es la cepa NZL1, K3a/650, 452 o E-b1.
  6. 6.
    El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la cepa del virus de la hepatitis C como se ha definido en (ii) es del genotipo 3b y es la cepa Tr.
  7. 7.
    El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el replicón de ARN comprende adicionalmente al menos una secuencia del sitio de entrada interno del ribosoma (IRES) y/o al menos un gen extraño.
  8. 8.
    El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la secuencia IRES y/o el gen extraño se sitúan entre la región no traducida 5' y la secuencia codificante de la proteína NS3.
  9. 9.
    El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la célula es una célula animal.
  10. 10.
    El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 9, en el que la célula animal es la célula Huh7, la célula HepG2, o una línea celular establecida obtenida a partir de estas células.
  11. 11.
    Una partícula recombinante similar al virus de la hepatitis C producida mediante el procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, que tiene la propiedad de infectar pero no la capacidad de transmitir.
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