JP4430543B2 - 日本脳炎ウイルスの全長のゲノムRNA及び該JEVゲノムRNAに対する感染性を有するJEVcDNA及びその用途 - Google Patents
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Tsai、Vaccine、2000年、第18(Suppl 2)巻、1−25頁 Solomon、Neurological Infections and Epidemiology、1997年、第2巻、191−199頁 Umenai等,Bull.W.H.O.,1985年、第63巻、625−631頁 Vaughn and Hoke、Epidemiol.Rev.,1992年、第14巻、197−221頁 Burke and Leake、Japanese encephalitis、CRC Press Publisher、1988年、63−92頁 Hanna等,Med.J.Aust.,1999年、第170巻、533−536頁 Hanna等,Med.J.Aust.,1996年、第165巻、256−260頁 Mackenzie等,Arch.Virol.,1994年、第136巻、447−467頁 Lindenbach and Rice、Flaviviridae:The viruses and their replication、Lippincott Williams&Wilkins Publishers、2001年、991−1041頁 Venugopal and Gould、Vaccine、1994年、第12巻、966−975頁 Chamber等,Ann.Rev.Microbiol.,1990年、第44巻、649−688頁 Satyanarayana等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA、1999年、第96巻、7433−7438頁 van Dinten等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA、1997年、第94巻、991−996頁 Liljestrom and Garoff,Biotechnology、1991年、第9巻、1356−1361頁 Rice等,New Biol.,1989年、第1巻、285−296頁 Rice等,J.Virol.,1987年、第61巻、3809−3819頁 Racaniello and Baltimore、Science、1981年、第214巻、916−919頁 Schlesinger and Dubensky、Curr.Opin.Biotechnol.,1999年、第10巻、434−439頁 Almazan等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA、2000年、第97巻、5516−5521頁 Mishin等,Virus Res.,2001年、第81巻、113−123頁 Zhang等,J.Virol.Methods、2001年、第96巻、171−182頁 Sumiyoshi等,J.Infect.Dis.,1995年、第171巻、1144−1151頁 Sumiyoshi等,J.Virol.,1992年、第66巻、5425−5431頁
1)本発明は、JEVウイルスの新規なゲノムRNAを提供する。
2)本発明は、自己複製ができるJEV RNA転写物を生産可能な感染性を有するJEV cDNAを提供する。
3)本発明は、前記全長のJEVゲノムRNAに対するcDNAを含むベクターを提供する。
4)本発明は、前記JEV cDNAベクターから合成された自己複製可能なRNA転写物を提供する。
5)本発明は、前記JEV cDNAベクターから合成されたRNA転写物をトランスフェクトされた細胞から得られた組換えされたJEVウイルス(recombinant JEV virus)を提供する。
6)本発明は、前記JEV cDNAを含むJEV発現ベクターを提供する。
7)本発明は、前記JEV発現ベクターを利用して異種遺伝子(heterologous gene)を発現させる様々な方法を提供する。
I.本発明は、JEVウイルスの新規なゲノムRNAを提供する。
本発明の韓国型JEVゲノムRNAは、5’−非翻訳部位、ポリペプチドコード部位及び3’−非翻訳部位で構成される。
本発明の感染性を有するJEV cDNAは、配列番号15で表される塩基配列または配列番号15と98%以上の相同性がある全長のJEVゲノムRNAの塩基配列に基づいて合成され、試験管内転写を通じて自己複製ができるJEV RNA転写物を合成するのに鋳型として使用される。本発明の全長のJEV cDNAは、まず、5’−末端及び3’−末端を含むウイルスゲノムRNAをRT−PCRによって数々の重畳するcDNAで増幅させた後、これを連結することにより製造される。
本発明のベクターは、前記JEV全長の感染性を有するcDNAを含むことを特徴とする。本発明の好ましい実施例では、SP6プロモーターを有する配列番号43、配列番号44及び配列番号45で表されるJEV cDNAを含むpBACSP6/JVFL/XhoI、pBACSP6/JVFLx/XhoI、pBACSP6/JVFLx/XbaI及びT7プロモーターを有する配列番号46、配列番号47及び配列番号48で表されるpBACT7/JVFL/XhoI、pBACT7/JVFLx/XhoI、pBACT7/JVFLx/XbaIベクターを提供する。本発明者らは、前記ベクター中で最も効率が良いpBACT7/JVFLx/XbaI及びpBACSP6/JVFLx/XbaIを、2002年10月2日付にて韓国生命工学研究院遺伝子銀行に寄託した(アクセッション番号:KCTC 10346BP、KCTC 10347BP)。
試験管内ランオフ転写反応の場合、鋳型として使用されるJEV cDNAは、上記のようにウイルスゲノムの3’−末端すぐ後にランオフ位置としてエンジニアリングしたXhoIまたは XbaI制限酵素による消化により線形化される(図3参照)。XhoIの処理により線形化された二つプラスミド(pBACSP6/JVFL/XhoIとpBACSP6/JVFLx/XhoI)は、m7G(5’)ppp(5’)Aキャップ構造類似体の存在下でSP6ポリメラーゼランオフ転写反応を通じて5’−末端にキャップ構造を有する同時に、3’−末端にウイルスと関連しない三つのヌクレオチドCGAを有する合成RNA転写物を生産するのに鋳型として使用する(図3のB参照)。これは、Xho Iの切断により残された5’突出部位を複製した結果である。これと類似に、XbaI−線形化されたpBACSP6/JVFLx/XbaIプラスミドは、m7G(5’)ppp(5’)Aキャップ構造類似体の存在下でSP6ポリメラーゼランオフ転写反応を通じて5’−末端にキャップ構造を有すると同時に、3’−末端にウイルスと関連しない四つのヌクレオチド CTAGを有する合成RNA転写物を生産するのに鋳型として使用する(図3のB参照)。
本発明では、前記JEV全長の感染性を有するcDNAから合成されたJEV RNA転写物でトランスフェクトされた細胞から合成されたJEV(synthetic JEV)ウイルスが生産される。トランスフェクトされた細胞は、JEVウイルスの感染により誘導される強い細胞変性効果(cytopathic effect)を示し、前記トランスフェクトされた細胞から得られた合成JEV(synthetic JEV)ウイルスは、プラークの形態(plaque morphology)、細胞病原性(cytopathogenicity)、成長パターン、ウイルス蛋白質の発現及びウイルスRNA合成の観点から、最初の親ウイルス(parental virus)であるCNU/LP2ウイルスと区別できなかった(図5参照)。また、JEV cDNA上の特定部位に位置指定突然変異(site−directed mutation)を誘導し、大腸菌で感染性を有するJEV cDNAを分子遺伝学的に操作することにより、組換えウイルス突然変異体が製造可能である。したがって、本発明の感染性を有するJEV cDNAを利用した逆相遺伝子システムは、JEVゲノムの複製メカニズムに対する遺伝子分析研究に有用に使用できる。
本発明は、様々な細胞形態でJEV cDNAの新規な発現ベクターとして使用できる用途を提供する。
発現ベクターの機能は、異種遺伝子の発現のために、細胞内に目的とする異種遺伝子を伝達することである。本発明で、全長の感染性を有するJEV cDNAは、哺乳動物細胞を含む様々な細胞形態で異種遺伝子発現ベクターとして使用できることを立証した。
1)感染性があるかまたはレプリコンJEV cDNA発現ベクターに異種遺伝子を挿入させ組換えられたJEV cDNA発現ベクターを製造する工程;
2)前記組換えられたJEV cDNA発現ベクターからJEV RNA転写物を製造する工程;
3)前記JEV RNA転写物で宿主細胞を形質転換させ、形質転換体を製造する工程;及び
4)前記形質転換体を培養して外来蛋白質を発現させる工程で構成される。
但、下記実施例は、本発明を例示するだけで、本発明の内容が下記実施例に限定されるものではない。
<1−1>使用した細胞株及びウイルス
BHK−21細胞株は、ロックフェラ−大学のカルス・エム・ライス(Charles M.Rice)博士から提供受け、10% FBS(fetal bovine serum)、2mM L−グルタミン、ビタミン及び抗生剤を含むα−MEM(minimum essential medium)で培養維持した。細胞の培養に使用する全ての試薬は、Gibco/BRL社(Gibco/BRL Life Technologies,Inc.,Gaithersburg,MD)から購入した。JEVの韓国分離株であるK87P39(Chung等,Am.J.Trop.Med.Hyg.,1996年,第55巻,91−97頁)は、国立保健院(Korean National Institute of Health)から分株を受けた。JEV K87P39ウイルス株は、1987年に韓国の野生の蚊から分離されたもので、マウスの子(suckling)の脳で5回継代培養(passage)した。黄熱病ウイルス(yellow fever virus)YF17Dウイルス株は、感染性を有するcDNA pACNR/YF17D(Charles M.Riceから提供受けた)から下記の方法のように、SP6 RNAポリメラーゼを利用した試験管内ランオフ(run−off)転写反応により製造した。
JEV K87P39ウイルスに感染した敏感なBHK−21細胞上に、10%FBS及び0.5% SeaKem LEアガロース(FMC BioProducts,Rockland,Maine)を含むMEM培養液で覆った後、5%CO2、37℃が維持される培養器で3〜4日間培養した。3〜4日間培養した後、感染した細胞は、3.7%ホルムアルデヒドで室温で4時間固定させた後、覆われているアガロースを除去し、クリスタルバイオレット(crystal violet)で染色してプラークを示した。上記のプラーク分析(plaque assay)の結果、K87P39ウイルスは、混合した多様な大きさのプラークを示した(図1のA、K87P39−infected)。
感染したBHK−21細胞でJEVウイルス蛋白質の発現を共焦点顕微鏡(confocal microscopy)で調査するため、本発明者らは、2×105細胞を4−ウェルチャンバースライドに分株して12時間培養させた後、モック(mock)−感染させるかまたは本来の(original)JEV K87P39ウイルス株、JEV CNU/LP2分離株(isolate)またはYF17Dウイルス株で1 MOI(multiplicity of infection)で18時間感染させた。JEVウイルス蛋白質に対する免疫染色のため、まず、0.37%(v/v)のホルムアルデヒドが添加されたPBSと共に25℃で30分間培養することにより、細胞を固定化させた。次に、PBSを利用して細胞を洗浄した後、0.2%(v/v)トリトンX−100が添加されたPBSで37℃で10分間浸透させた(permeabilized)。再びPBSで細胞を四回洗浄した後、PBSで15分間再水和させ(rehydrated)、5%(w/v)BSAを含むPBSで37℃で1時間ブロックさせた。次に、1:500に稀釈したJEVに特異的なマウス過免疫腹水液で細胞を25℃で2時間培養し、PBSで三回洗浄した後、1:500に稀釈されたFITC結合した塩素抗マウスIgG(Jackson ImmunoResearch Labs Inc.)で25℃で2時間培養した後、PBSで再び三回洗浄した。その後、細胞の核を視覚化するため、5μg/mlのヨウ化プロピディウム及び5μg/mlのRNase Aを含むPBSで37℃で30分間細胞を培養させた後、80%グリセロールでマウンティング(mounting)を実施した。63倍対物レンズ(objective)を装着したゼイスアキシオスコープ(Zeiss Axioskop)共焦点顕微鏡でBio−Rad MRC 1024及びレーザーシャープ(LaserSharp)ソフトウェアを利用してイメージを得た。
本発明者らは、製造社の指針により300μlのTRIzol LS試薬(Gibco/BRL)を使用し、100μlのウイルスを含む培養液からウイルスゲノムRNAを抽出した後、20μlのRNaseが除去された水に再浮游させた。ウイルスゲノムRNAの完全な塩基配列を分析するため、5’−末端及び3’−末端を含む全体ウイルスゲノムRNAを、長い(long)RT−PCR方法を利用して五つの重畳するcDNA(JVF、JVM、JVR、JV3NTR及びJV35NTR)で増幅させた(図2)。cDNA合成及びPCR増幅に使用したオリゴヌクレオチドは、ジェンバンク(GenBank)データベースに塩基配列が全て証明されている16個のJEVウイルスゲノムRNA(CH2195LA、CH2195SA、FU、GP78、HVI、JaGAr01、JaOArS982、K94P05、Vellore P20778、p3、SA(A)、SA(V)、SA14、SA14−14−2、TC及びTLウイルス株)に共通する(consensus)塩基配列に基づいてデザインした。
1−3,865ヌクレオチドのJVFアンプリコン(amplicon)を増幅するため、JEVゲノムの3,986−4,003ヌクレオチドと相補的な配列番号1で表されるプライマーJ7をcDNA合成に使用した(図2のA)。JVF PCR増幅のためのプライマーは、下記のとおりである:1−18ヌクレオチドに相補的な配列番号2で表されるプライマーJ8;及び3,845−3,865ヌクレオチドに相補的な配列番号3で表されるプライマーJ6。3,266−8,170ヌクレオチドのJVMアンプリコンの場合には、8,150−8,170に相補的な配列番号4で表されるプライマーJ4をcDNA合成のために使用した。JVM PCR増幅のためのプライマーは、下記のとおりである:3,266−3,283ヌクレオチドに相補的な配列番号5で表されるプライマーJ20;及びプライマーJ4。7,565−10,893ヌクレオチドのJVRアンプリコンの場合には、cDNA合成のために10,947−10,967ヌクレオチドに相補的な配列番号6で表されるプライマーJ1を使用した。JVR PCR増幅のためのプライマーは、下記のとおりである:7,565−7,582ヌクレオチドに相補的な配列番号7で表されるプライマーJ12;及び10,870−10,893ヌクレオチドに相補的な配列番号8で表されるプライマーJ2。標準RT反応は、10μlの抽出されたウイルスRNA、5pmolの上記の適当なプライマー、100Uのスーパークリプト(Superscript)II RT(Gibco/BRL)、40UのRNaseOUT(Gibco/BRL)、0.1mMのDTT、10mMのdNTP混合液及び製造社から供給されたRTバッファー(Gibco/BRL)を含む20μlの反応混合液で遂行した。反応混合液は、37℃で1時間培養し、以後70℃で15分間加熱させた。5μl当量(aliquot)のRT混合液をピロベスト(Pyrobest)DNA重合酵素(Takara Bio Inc.,Shiga,日本)及び上記の適当なプライマー対をPCR増幅のために使用した。PCR反応は、94℃で30秒間変性(denaturaton)させ、60℃で30秒間アニーリング(annealing)させた後、72℃で5分間重合(polymerization)させる過程を30回反復実施した後、72℃で10分間最終的に延長させた。クローニングする間に起こり得る選択偏向(selection bias)を避けるため、PCR増幅産物のクローニングされないアンプリコンを使用して直接的に自動3700DNA 配列分析機を使用して両方向をすべてシーケンスすることにより、塩基配列分析を遂行した。
JEV CNU/LP2ゲノムRNAの3’−末端の塩基配列を分析するため、本発明者らは、配列番号10で表される合成オリゴヌクレオチドTをウイルスゲノムRNAの3’−末端に接合させることにより、cDNA合成及びPCR増幅のためのプライマー結合部位を提供した(Kolykhalov等,J.Virol.,1996年,第70巻,3363−3371頁)。この方法は、C型肝炎ウイルスゲノムRNAの非常に保存された3’−末端の塩基配列を分析するために成功的に使用された(Kolykhalov等,J.Virol.,1996年,第70巻,3363−3371頁)。オリゴヌクレオチドTの3’−末端は、末端(terminal)デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ(Takara)を利用してddATPを挿入することにより最初に変形され、このようにすることにより、オリゴヌクレオチドTの分子内(intramolecular)及び分子間(intermolecular)接合が起きないようにした。また、オリゴヌクレオチドTの5’−末端は、T4ポリヌクレオチドリン酸化酵素(Takara)によりリン酸化された。以後、T4 RNA接合酵素(ligase,New England Biolabs,Inc.,Beverly,MA)を利用し、5’−リン酸化され3’−変形されたオリゴヌクレオチドTをウイルスゲノムRNAの3’−末端に接合させた。20μlの接合反応混合液は、10UのT4 RNA接合酵素、40UのRNaseOUT、10pmolのオリゴヌクレオチドT、ウイルスゲノムRNA及び製造社(NEB)から提供されたバッファーを含む。16℃で12時間培養した後、接合されたウイルスRNAをフェノールで抽出してエタノールで沈澱させた後、20μlのRNaseが除去された水に再浮游させた。順次的に、オリゴヌクレオチドTと相補的な配列番号11で表されるオリゴヌクレオチドTRを使用し、以前に記述された方法により10μlのオリゴヌクレオチドと接合したウイルスRNAをcDNA合成に使用した。合成されたcDNAの増幅は、ヌクレオチド10,259−10,276に相補的な配列番号12で表されるプライマーJ35及びプライマーTRを使用して遂行した。PCRのため、5μl当量(aliquot)のRT混合液をピロベスト(Pyrobest)DNA重合酵素を使用して94℃で30秒、60℃で30秒、72℃で1分間30回反復実施した後、最終的に72℃で10分間延長させた。PCR反応混合液の組成は、上記の組成と同じく使用した。陽性−センス及び陰性−センスプライマーに各々導入されたHindIII及びEcoRI認識部位を使用し、pRS2ベクター(Charles M.Riceから提供受けた)に上記で合成されたcDNA JV3NTRアンプリコンをクローニングさせた(図2のB)。
JEV CNU/LP2ゲノムRNAの5’−末端の塩基配列は、自家接合(self−ligation)されたウイルスRNAを利用して決定した(Campbell and Pletnev,Virology,2000年,第269巻,225−237頁)。まず、タバコ酸ピロホスファターゼ(tobacco acid pyrophosphatase;TAP)を使用してウイルスゲノムRNAのキャップ構造を切断した。20μlの切断反応液は、10UのTAP(Epicentre Technol.社,Madison,WI)、10μlのウイルスRNA及び製造社(Epicentre Technol.社)から供給されたバッファーを含む。37℃で1時間培養した後、TAP処理されたウイルスRNAをフェノールで抽出してエタノールで沈澱させた後、RNaseが除去された20μlの水に再浮游させた。キャップが除去された(decapped)ウイルスRNAの半分(10μl)を、上記のようにT4 RNA接合酵素を利用して20μlの反応混合液で自家接合させた。cDNA合成のために自家接合されたウイルスRNAの1/4(5μl)を使用し、ここで、ヌクレオチド215−232と相補的な配列番号13で表されるプライマーJ40を使用した。このように合成した一番目鎖(first−strand)cDNAは、ヌクレオチド164−181に相補的な配列番号14で表されるプライマーJ39及びプライマーJ35を使用してPCR増幅した(図2のD)。アガロースゲル電気泳動結果、増幅された産物は、約850bpの単一バンドであることを確認した(図2のE)。増幅されたcDNA JV35NTRアンプリコンを、ApoI及びSpeIを使用して切断した後、ApoI及びXbaIで切断されたpRS2ベクターに接合させてpRS2/JV3’5’を製造した。
JEV CNU/LP2ゲノムRNAに対する全長の感染性を有するcDNAをクローニングするための過程で、クローンされたDNAが遺伝子再配列(genetic rearrangement)が起こるため、ウイルスゲノムの特定の部位は、大腸菌の高いコピー数(high−copy−number)のプラスミドでクローニングするのに適当ではなかった。また、上記の難しさは、他のフラビウイルスの場合にも存在することが報告されたことがある(Campbell and Pletnev,Virology,2000年,第269巻,225−237頁;Polo等,J.Virol.,1997年,第71巻,5366−5374;Gritsun and Gould,Virology,1995年,第214,611−618頁;非特許文献22、非特許文献23、非特許文献15)。また、前記部位を低いコピー数(low−copy−number)のバクテリアプラスミドでクローンさせようとした場合にも、低いDNA収率と共に遺伝的不安定のため成功的ではなかった。したがって、本発明者らは、BACであるpBeloBAC11プラスミドをベクターとして使用することにより、JEV全長の感染性を有するcDNAを合成しようとした。
本発明者らは、標準手順による組換えDNA技術を使用した(Sambrook等,Molecular cloning,1989年,Cold Spring Harbor Laboratory)。まず、完全なヌクレオチド塩基配列を分析するために使用された三つの重畳するcDNAアンプリコン(JVF、JVM及びJVR)を、pBeloBAC11プラスミドの誘導体である配列番号42で表されるpBAC/SVに各々サブクローン(subclone)した。pBAC/SVプラスミドは、pACNR/NADL(Mendez等,J.Virol.,1998年,第72巻,4737−4745頁)の491bp Not I−AatII(T4 DNAポリメラーゼ(polymerase)処理)切片、pSINrep19(Frolov等,Proc.Natl.Acad.Sci.,USA.,1996年,第93巻,11371−11377頁)の9,215bp Sac I(T4 DNAポリメラーゼ処理)−Ssp I(T4 DNAポリメラーゼ処理)切片及びpBeloBAC11の6,875bp Sfi I(T4 DNAポリメラーゼ処理)−Not I切片を含む。それで、3,863bpの大きさのJVFアンプリコンのRsrII−AvrII切片、4,717bpのJVMアンプリコンのBspEI−MluI切片及び3,326bpのJVRアンプリコンのRsrII−BglII切片を同一の制限酵素で切断させた後、pBAC/SVプラスミドに各々挿入させた。その結果、各々pBAC/JVF、pBAC/JVM及びpBAC/JVRサブクローンが製造された。前記BACプラスミドを大腸菌DH10B細胞で成長させた後、挿入された三つのJEV cDNAアンプリコンの塩基配列を各々分析した。三つのサブクローンにクローニングされた全てのJEV cDNAのヌクレオチド塩基配列は、pBAC/JVRに存在するNS5遺伝子の塩基置換(T8906→C)を除いては、親ウイルス(parental virus)であるCNU/LP2のものと同一であった。前記置換は、蛋白質翻訳の観点では沈黙(silent)し、無作為で選別した八つの個別クローンの塩基配列が8,906ヌクレオチド位置で全てT残基を示したため、クローニング過程でこのような塩基置換が発生したと推測される。T8906→C置換が対応するアミノ酸の配列を変形させないが、このようなヌクレオチド配列の変化がウイルスの複製に影響を及ぼすため(van Dinten等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1997年,第94巻,991−996頁)、本発明者らは、再びT残基に置換させて本来の塩基配列を有するようにした。T8906→C置換を8,827−9,142に対応する315bp ApaI−HindIII切片を再クローニングすることにより矯正(correct)し、その結果pBAC/JVRRが製造された。大腸菌DH10B菌株での造作及び増殖過程で、三つのサブクローンJEV cDNAは、遺伝学的に安定したまま維持された。
バクテリオファージSP6プロモーター転写出発点(start)を全長のJEV cDNA5’−末端に正確に挿入させるため、本発明者らはpBAC/JVFを変形させた。まず、配列番号16で表されるプライマーJ41及びSP6プロモーターの陰性センス配列に当たる配列番号17で表されるプライマーJ43を使用してpBAC/SVをPCRし、また、配列番号18で表されるプライマーJ42及び配列番号19で表されるプライマーJ40を使用してpBAC/JVFをPCRすることにより二つの切片を分離した。前記二つの切片をプライマーJ41及びJ40を使用してPCRを遂行することにより融合させた。その結果生成されたアンプリコンをPacI及びPmeIを使用して切断した後、同一のPacI及びPmeI酵素で切断されたpBAC/JVFに接合させてpBACSP6/JVFを生成した。
ウイルスゲノムの3’末端で線形化されたプラスミドのランオフ転写反応の間に、完全かほぼ完全な(authentic)3’末端を製造するため、本発明者らは、pBAC/JVRRを変形させてJEVウイルス完全な3’−末端のヌクレオチド塩基配列がXhoIまたはXbaIの唯一の(unique)制限酵素認識部位を有するようにした。ウイルスゲノムRNAの3’−末端に唯一のXhoI認識部位を含むpBAC/JVRR/XhoIサブクローンを製造するため、pRS2/JV3’5’を配列番号20で表されるプライマーJ90及びXhoI認識部位を含む配列番号21で表されるプライマーJ45を使用してPCRを遂行することにより切片Iを合成した。298−bp SfiI−SpeI部位の切片IアンプリコンをSfiI及びNheIで切断したpBAC/JVRRに接合させた。ウイルスゲノムの3’−末端にXbaI認識部位を有するpBAC/JVRRx/XbaIサブクローンを製造するため、まず、PCRを利用してNS5遺伝子のヌクレオチド9,131−9,136に既に存在するXbaI認識部位に沈黙(silent)点突然変異(A9134→T)を導入することにより制限酵素の認識部位を除去した。このようなpBAC/JVRRx/XbaIサブクローン構造で、「x」表示は、本来のXbaI認識部位を除去させた沈黙点突然変異(A9134→T)を示す。具体的に、pBAC/JVRRを配列番号22で表されるプライマーJ31及びA9134→T置換を導入させる配列番号23で表されるプライマーJ47を利用して増幅させた。ヌクレオチド8,828−9,143に対応するcDNAアンプリコンの315bp ApaI−HindIII部位をpBAC/JVRRにクローニングさせてpBAC/JVRRxを製造した。次に、pBAC/JVRR/XhoIの場合と同一の方法を使用してpBAC/JVRRx/XbaIサブクローンを製造した。したがって、プライマーJ90及びXbaI部位を含む配列番号24で表されるプライマーJ46を使用してpRS2/JV3’5’をPCRによって増幅することにより切片IIを得た。切片IIアンプリコンの298bp SfiI−SpeI部位をSfiI及びNheIで切断したpBAC/JVRRxに接合させてpBAC/JVRRx/XbaIサブクローンを製造した。単一のXhoI部位及びA9134→T置換部位を含むpBAC/JVRRx/XhoIサブクローンを製造するため、切片Iアンプリコンの298bp SfiI−SpeI部位をSfiI及びNheIで切断したpBAC/JVRRxに接合させてpBAC/JVRRx/XhoIサブクローンを製造した。
前記実施例<3−3>と同一の方法で、本発明者らは、SP6−誘導された(driven)JEV cDNAと共に、三つのT7−誘導された全長のJEV cDNAのセットを製造した。まず、配列番号25で表されるプライマーJ81及び配列番号26で表されるプライマーJ80を使用してpBAC/NADLcIn−/PAC(Charles M.Riceから提供された)由来の切片をPCRにより合成した。また、配列番号27で表されるJ42プライマー及び配列番号28で表されるJ82プライマーを使用してpBACSP6/JVFLx/XbaI由来の切片を合成した。前記二つの切片をプライマーJ81及びJ82を使用してPCRの二回目の実行で融合させた。その結果、生成されたアンプリコンの793−bp EcoRI−SpeI切片をEcoRI及びXbaIで切断させたpRS2ベクターに挿入させてpRS2T7/5’JVを製造した。pRS2T7/5’JVの675bp PvuI−PmeI切片を、i)pBACT7/JVFL/XhoIを製造するためにpBACSP6/JVFL/XhoIの18,364bp PacI−PmeI切片と、ii)pBACT7/JVFLx/XhoIを製造するためにpBACSP6/JVFLx/XhoIの18,364bp PacI−PmeI切片と、またはiii)pBACT7/JVFLx/XbaIを製造するためにpBACSP6/JVFLx/XbaIの18,366bp PacI−PmeI切片と各々接合させた。最終的に、三つの生成された全長のJEV cDNAは、各々pBACT7/JVFL/XhoI、pBACT7/JVFLx/XhoI及びpBACT7/JVFLx/XbaIと命名し、配列番号46、配列番号47及び配列番号48と記載した。(図3のC)。各々のクローニング工程で、制限酵素及びヌクレオチド配列分析を広範囲に実施してクローニングされたcDNAの構造を分析した。その結果、欠失または再配列による挿入体の構造上の遺伝学的不安定性は観察されなかった。
本発明者らは、上記で合成した全長のJEV cDNAを鋳型として使用し、試験管内転写反応により合成JEV RNA転写物を生産した。これのため、100−200ngの鋳型DNAをXhoIまたはXbaIで切断して線形化させた後、製造社(Gibco/BRL)によって提供されたバッファー、0.6mM キャップ類似体[m7G(5’)ppp(5’)Aまたはm7G(5’)ppp(5’)G,NEB Inc.]、0.5μMの[3H]UTP(1.0mCi/ml,50Ci/mmol,New England Nuclear Corp.,Boston,MA)、10mMのDTT、各々1mMのUTP、GTP、CTP及びATP、40UのRNaseOUT及び15UのSP6 RNAポリメラーゼ(Gibco/BRL)で構成された25μlの反応混合液に添加した。前記反応混合液は、37℃で1時間培養した。DE−81濾過紙(Whatman,Maidstone,UK)にRNAが吸収される[3H]UTP陥入(incorporation)に基づきRNAを定量した(Sambrook等,Molecular cloning,1989年,Cold Spring Harbor Laboratory)。その後、1〜1.5μl当量の反応混合液を利用してアガロースゲル電気泳動を実施し、実験の前までは反応混合液を−80℃に保管した。
全長のJEV cDNAから合成されたRNA転写物の試験管内特異的感染性及びウイルス力価
a:全ての全長のJEV cDNAは、cDNA名前内に表示したランオフ転写に適当な制限酵素処理により線形化された。pBACSP6/JVFLx/XbaIMBN及びpBACT7/JVFLx/XbaIMBNにおいて、XbaI切断及びMBN処理により、これらcDNA鋳型を線形化させて製造した。
b:記載したように、SP6またはT7RNA重合酵素を使用して試験管内転写後、BHK−21細胞をエレクトロポレーションするためにサンプルを使用し、感染プラークセンターを測定した。
c:エレクトロポレーション後、24及び48時間後のウイルス力価
ある種のフラビウイルスの場合、感染性を有するcDNAから転写された合成RNAの3’−末端にウイルスと関連しない配列が存在すると、特異的感染性が減少されるかまたはなくなる(abrogate)といることが報告されたことがある(Yamshchikov等,Virology,2001年,第281巻,294−304頁)。前記報告に基づき、本発明者らは、3’末端にウイルスと関連しない配列が欠如した合成RNAを製造して特異的感染性を比較した。具体的に、本発明者らは、追加に存在するCTAGヌクレオチドを転写反応前に除去するため、XbaI−線形化されたpBACSP6/JVFLx/XbaIプラスミドをリョクトウヌクレアーゼ(MBN)で処理することにより、ウイルスと関連しないヌクレオチド塩基配列を有していない合成JEV RNAを製造しようとした。XbaI−線形化されてMBN−処理されたpBACSP6/JVFLx/XbaIから合成されたpBACSP6/JVFLx/XbaIMBN(図3のB)及びpBACT7/JVFLx/XbaIから合成されたpBACT7/JVFLx/XbaIMBN(図3のC)は、全てMBNで処理していない転写物と比較した時、特異的感染性が増加した。正確には、MBN−処理されたpBACSP6/JVFLx/XbaIMBNから転写されたRNAの特異的感染性は、3.1×106PFU/μgと測定されたが、これは変形されていない鋳型から転写されたRNAの特異的感染性である3.4×105PFU/μgより約10倍も高い(表3、infectivity)。また、pBACT7/JVFLx/XbaI(3.0×105PFU/μg)由来のRNAもMBN処理以後に増加した特異的感染性を示した(2.7×106PFU/μg)(表3、infectivity)。したがって、本発明者らは、高い感染性を有する合成JEV RNA転写物が生産されるためには、JEVゲノムRNAに完全な(authentic)3’−末端が存在しなければならないことを確認した。
本発明者らは、全長のcDNAクローンpBACSP6/JVFLx/XbaIMBNを使用し、特異的感染性は全長のJEV cDNA鋳型からRNA転写を必要とすることを確認した(図4)。cDNA鋳型自体では感染性がなかったが(図4のA、レーン5及びB、SP6 Pol除外)、試験管内転写反応の間DNase Iを処理すると感染性がなくなるため、転写反応の間には完全なcDNA鋳型が要求されることを確認した(図4のA、レーン2及びB、DNase処理中)。完全な反応混合液と比較した時(図4のA、レーン 1及びB、未処理)、転写反応後にDNase Iを添加することは、影響を及ぼさなかった(図4のA、レーン3及びB、DNase I処理後)。しかし、反応後にRNase Aを処理すると、転写された合成RNAの感染性が除去された(図4のA、レーン4及びB、RNase A処理後)。
本発明者らは、全長の感染性を有するJEV cDNA(pBACSP6/JVFL/XhoI、pBACSP6/JVFLx/XhoI、pBACSP6/JVFLx/XbaI及びpBACSP6/JVFLx/XbaIMBN)鋳型から生産された合成JEVウイルス(synthetic JEV)と、最初にcDNAに製造のため使用した親ウイルス(parental virus)であるCNU/LP2を、プラーク形態、ウイルス成長キネティクス(growth kinetics)、ウイルス蛋白質の合成及びウイルスゲノムRNAの合成を各々比較した。
本発明者らは、BHK−21細胞に上記の全長の感染性を有するJEV cDNA(pBACSP6/JVFL/XhoI、pBACSP6/JVFLx/XhoI、pBACSP6/JVFLx/XbaI及びpBACSP6/JVFLx/XbaIMBN)鋳型から得られた合成JEVウイルスと親ウイルスCNU/LP2を感染させ、10%FBS及び0.5%SeaKem LEアガロース(FMC BioProducts、Rockland、Maine)を含むMEM培養液で覆った後、5%CO2、37℃が維持された培養器で培養した。3乃至4日間培養し、感染した細胞は、3.7%ホルムアルデヒドで室温で4時間固定させた後、覆われているアガロースを除去してクリスタルバイオレット(crystal violet)で染色してプラークを視覚化した。その結果、図5のAから確認できるように、pBACSP6/JVFL/XhoI(プレート1)、BACSP6/JVFLx/XhoI(プレート2)、pBACSP6/JVFLx/XbaI(プレート3)及びpBACSP6/JVFLx/XbaIMBN(プレート4)から生産された合成JEVで感染したBHK−21細胞は、CNU/LP2で感染した細胞(プレート5)の場合と類似に、同一の大きさの(homogeneous)大きいプラークを形成した。
本発明者らは、BHK−21細胞に上記の全長の感染性を有するJEV cDNA(pBACSP6/JVFL/XhoI、pBACSP6/JVFLx/XhoI、pBACSP6/JVFLx/XbaI及びpBACSP6/JVFLx/XbaIMBN)鋳型から得られた合成JEVウイルスと親ウイルスCNU/LP2を低い(0.01PFU/細胞)、中間(1.0PFU/細胞)及び高い(10PFU/細胞)MOI(multiplicities of infection)で感染させた後、時間が経過することによって感染したBHK−21細胞で生産される感染性を有するJEVウイルスの成長キネティクス(kinetics)を分析するため、細胞培養液を周期的に収集した。具体的に、指示された時点でウイルスを収穫し、上記のプラーク分析を通じてウイルス力価を測定した。その結果、図5のBで見られるように、時間によって蓄積されるウイルス力価は、本発明で実施した三つのMOI(0.01、1.0及び10)で、四つの合成JEVウイルス(pBACSP6/JVFL/XhoI、pBACSP6/JVFLx/XhoI、pBACSP6/JVFLx/XbaI及びpBACSP6/JVFLx/XbaIMBN)及び親ウイルスCNU/LP2の場合に全て類似であった。
本発明者らは、上記の全長の感染性を有するJEV cDNA(pBACSP6/JVFL/XhoI、pBACSP6/JVFLx/XhoI、pBACSP6/JVFLx/XbaI及びpBACSP6/JVFLx/XbaIMBN)鋳型から得られた合成JEVウイルスと親ウイルスCNU/LP2で感染したBHK−21細胞で発現されるJEVウイルスの蛋白質を比較した。具体的に、1MOIで感染した3×105BHK−21細胞を、200μlのサンプルローディングバッファー(80mM Tri−HCl(pH 6.8)、2.0%SDS、10%グリセロール、0.1M DTT、0.2%ブロモフェニルブルー)を利用して溶解させ、溶解された細胞(lysate)の1/10を5分間沸かした後、SDS−ポリアクリルアミドゲルで分留させた(fractionated)。トランスブロット(trans−blot)SD電気泳動伝達細胞機械(electrophoretic transfer cell machine、Bio−Rad Labs Inc.Hercules、CA)を利用し、SDS−ポリアクリルアミドゲルからメタノルで活性化させたポリビニリデンジフルオライド膜に蛋白質を電気的に移した後、洗浄溶液(0.2%ツイーン20が添加されたPBS)に溶解させた5%非脂肪粉乳を利用して室温で1時間膜をブロックさせた。洗浄溶液で3回洗浄した後、アクチン蛋白質の全ての同素体(isoform)のC−末端に保存されているエピトーフ(epitope)を認識する単クローン抗アクチン抗体(A4700,Sigma,St.Louis,MO)またはJEVに特異的なマウス過免疫性(hyperimmune)腹水液(ascites fluid)(ATCC VR−1259AF)で、室温で2時間膜を培養した。洗浄溶液で膜を3回洗浄した後、AP(alkaline phosphatase)と結合したヤギ抗マウスIgG(Jackson ImmunoResearch Labs Inc.,West Grove,PA)で、室温で2時間培養した。膜を洗浄溶液で3回洗浄した後、PBSで1回洗浄した。膜に存在するアクチンまたはJEV蛋白質バンドは、基質である5−ブロモ−4−クロロ−3−インドリル−ホスファート及びニトロブルーテトラゾリウムを、膜と共に培養することにより視覚化させた。その結果、合成JEVウイルス及び親ウイルス全てが類似の量と同一のパターンのJEVウイルス特異的蛋白質を生産することを確認した(図5のC、上パネル)。サンプルローディング対照群としては、アクチン(actin)蛋白質を使用し、同一の量のアクチン蛋白質がmock−感染した細胞と合成JEVウイルス及び親ウイルスで感染した細胞に存在することを確認した(図5のC、下パネル)。
本発明者らは、上記の全長の感染性を有するJEV cDNA(pBACSP6/JVFL/XhoI、pBACSP6/JVFLx/XhoI、pBACSP6/JVFLx/XbaI及びpBACSP6/JVFLx/XbaIMBN)鋳型から得られた合成JEVウイルスと親ウイルスCNU/LP2で感染したBHK−21細胞で発現されるJEVウイルスのRNAを比較した。具体的に、1mlのTRIzol試薬(Gibco/BRL)を使用して3×105の感染したBHK−21細胞から全体RNAを抽出した。JEV−特異的RNAを分析するため、抽出された全体RNAの1/3に対してノーザンブロット分析を実施した(Sambrook等,Molecular cloning,1989年,Cold Spring Harbor Laboratory)。2.2Mホルムアルデヒド−1%アガロースゲルでRNAを電気泳動した後、ナイロン膜(Amersham Biosciences Inc.,Piscataway,NJ)に伝達した。254nm光源(Stratalinker UV cross−linker,Stratagene,La Jolla,CA)を使用して膜に存在するRNAを膜と相互連結(cross−link)させた後、JEVゲノムの9,143−9,351ヌクレオチド塩基配列に相補的に結合する[32P]CTP−標識されたアンチセンスリボプローブ(riboprobe)と共に培養させることによりJEV−特異的RNAを検出した。pBACSP6/JVFLx/XbaIの209bp HindIII−SacI切片を同一の酵素で切断したpGEM3Zf(+)に挿入させてpGEM3Zf(+)/JV9143を製造した。前記pGEM3Zf(+)/JV9143をBamHI酵素で切断してBamHI−線形化されたcDNAクローンから、試験管内転写反応を通じて前記リボプローブを合成した。T7−MEGAscriptキット(Ambion、Austin、TX)を使用して3.12μMの[α−32P]CTP(800Ci/mmol、Amersham)を含む20μlの反応混合液から製造社の指針に従い、前記BamHI−線形化されたpGEM3Zf(+)/JV9143クローンを転写させた。DNase Iを処理した後、転写反応に含まれていない(unincorporated)リボヌクレオサイドトリホスファ−トを除去するため、反応混合液をQuick Spin G−50セパドクスカラム(Boehringer mannheim)に適用させた。培養溶液[5×SSPE(0.9M NaCl、50mM NaH2PO4及び5mM EDTA pH7.7)、5×Denhardt’s試薬、0.5%SDS、100μg/mlの変性されたサケ精子DNA、50%ホルムアミド]で、55℃で6時間膜を前培養させた後、1×107cpmの標識されたリボプローブを含む培養溶液で、55℃で一晩培養させた。1×SSPE、0.5%SDSを使用して55℃で10分間3回膜を洗浄した後、0.1×SSPE、0.5%SDSを使用して10分間1回洗浄した。ウイルスRNAバンドを自家放射線写真(autoradiography)で視覚化させた後、Molecular Imager(Bio−Rad Lab)を利用して定量した。その結果、全ての場合において、ウイルスRNAの発現程度が類似であった(図5のD)。前記ブロットをイメージ分析機で定量した結果、ウイルスゲノムRNA(図5のD、上パネル)と18S rRNA(図5のD、下パネル)の比率に大きい差はなく、このような事実から、全ての場合にウイルスゲノムRNAが類似の程度で発現されることを確認した。
上記の結果は、JEV cDNAクローンがSP6またはT7ポリメラーゼによる転写後に、高い感染性を有した合成RNA転写物を生産可能であることを強く提示するが、形質転換された培養液が親ウイルスCNU/LP2に汚染された可能性を完全に排除できない。したがって、そのような可能性を完全に排除するため、本発明者らは、遺伝子マーカー(genetic marker、gm)をpBACSP6/JVFLx/XbaIベクターに導入するためにPCRを利用した位置指定突然変異(site−directed mutagenesis)を実施した。具体的に、PCRによる位置指定突然変異(site−directed mutagenesis)誘導により、pBACSP6/JVFLx/XbaIに存在するNS5遺伝子内部に点突然変異A8171→C(silence)を導入してpBACSP6/JVFLx/gm/XbaIを製造した(図6のA)。点突然変異によってNS5遺伝子内部に新しいXhoI制限酵素認識部位が生成される。まず、A8171 →C置換によってXhoI認識部位が生成される配列番号29で表されるプライマーJ48及び配列番号30で表されるプライマーJ3を使用し、PCRによってpBACSP6/JVFLx/XbaI由来の切片を製造した。その結果生成されたアンプリコンの665bp MluI−ApaI切片を、pBACSP6/JVFLx/XbaIの4,802bp ApaI−BsrGI切片及び5,874bp BsrGI−MluI切片と共に接合させてpBACSP6/JVFLx/gm/XbaIを製造した。XbaI−線形化されてMBN−処理されたpBACSP6/JVFLx/gm/XbaIMBNから合成されたRNA転写物でトランスフェクトされたBHK−21細胞は、遺伝子マーカーを含む感染性を有する合成JEVウイルス(JVFLx/gm/XbaIMBNと標記)を生産した(図6のA)。JVFLx/gm/XbaIMBNの表現型的特性は、最初のウイルスJVFLx/XbaIMBNの場合と異なっていなかった。これは、A8171→C置換がウイルス自己複製に影響を及ぼさないことを示す。
以前の全長のJEV cDNAを合成しようとする研究では、構造蛋白質prM及びEをコードする部位で時々ナンセンス(nonsense)突然変異が発生するということが報告されたことがある(非特許文献23)。JEVに対する分子生物学的研究には信頼できる感染性を有するJEV cDNAクローンが必須的に要求されるため、本発明者らはpBACSP6/pJVFLx/XbaIの遺伝子構造及び機能に関して幾つかの方法で深く分析した。
以前に報告されたように(Burke and Monath,Flaviviruses,2001年,1043−1125頁,Lippincott Williams&Wilkins Publishers)、本発明者らは、JEVはヒト、マウス、サル、ブタ、犬、猫及びハムスターを含む様々な種類の真核細胞で自己複製できることを発見した。前記結果は、JEVが様々な種類の細胞で異種遺伝子の発現のためのベクターに有用に使用できることを意味する。これをテストするため、EMCV IRES(internal ribosome entry site of encephalomyocarditis virus)elementによって誘導される発現ベクターに、pBACSP6/JVFLx/XbaI上のウイルス3’NTR開始部位に一般的に使用される二つのリポーター遺伝子であるエクエオリアビクトリア(Aequeorea victoria)GFP(green fluorescent protein)及び北アメリカホタル(Photinus pyralis)LUC(ルシフェラーゼ)を挿入させた(図8のA)。
a:組換えられたJEV JVFLx/GFP/XbaIMBNで細胞を感染させた後、GFPの発現を分析した。
b:組換えられたJEV JVFLx/LUC/XbaIMBNで細胞を感染させた後、LUC蛋白質の発現を分析した。
本発明者らは、追加的に目的とする外来遺伝子を発現するJEV発現システムの用途を研究した。まず、本発明者らは、三つの多く使用される様々な大きさの異形リポーター遺伝子、即ちEGFP(an improved version of the Aequorea victoria GFP gene,768 bp)、北アメリカホタル(Photinus pyralis)のLUC遺伝子(1653bp)及びLacZ遺伝子(3012bp)を発現させるため、全長のウイルスゲノムをエンジニアリングした(図9のB)。本発明者らは、また、抗生剤ピュウーロマイシンに抵抗性を付与する優性選択マーカーPAC(600bp)を導入させた(図9のB)。
<10−1−1>感染性を有する組換えJEVベクターのプラスミド製造
標準分子生物学プロトコールによって全てのプラスミドを製造し(Sambrook等,Molecular cloning:a laboratory manual,2nd ed.Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,N.Y.,1989年)、PCRによって増幅された全ての部位は配列分析で確認した。本発明で使用された全ての組換えJEVベクターをpBACSP6/JVFLx/XbaIに基礎して製造し(Yun等,J.Virol.,2003年,第77巻,6450−6465頁)、以後、前記ベクターをpJEV/FLと命名する(図9のA)。
トランスフェクトされた細胞を36−48時間、四つのウェルチャンバースライド内でシード培養した。培養した後、0.37%(v/v)ホルムアルデヒドを含むPBSで培養することによって細胞を固定させ、0.2ml80%グリセロールでマウンティングを実施した。適当なフィルターを利用した共焦点顕微鏡(confocal microscope)で細胞を観察した。EGFPの発現をフローサイトメーター分析で調査した。具体的に、細胞をトリプシン処理してPBSで1回洗浄し、PBS内で0.37%(v/v)ホルムアルデヒドで再懸濁した後、FACScanフローサイトメーターFACSCalibur(Becton Dickinson)で分析した。適当な正方向及び側面光分散計(forward and side light−scattering gates)によって死滅された細胞を排除した。生きている一万個の細胞を分析に使用した。
PBSで細胞を1回洗浄して0.05%(v/v)グルタルアルデヒドを含んだPBSで、室温で15分間固定させた後、またPBSで注意して3回洗浄した。5−ブロモ−4−クロロ−3−インドリル−β−ガラクトピラノシド(Sigma)と染色溶液[5mMフェリシアン化カリウム、2mM MgCl2含有したPBS]を37℃で共に反応させて細胞のβ−gal活性を測定した。
上記の方法(Yun等,J.Virol.,2003年,第77巻,6450−6465頁)によって基質にルシフェリン(Promega)を使用して細胞のLUC活性を測定した。各実験は、3回反復して遂行して平均値を提示した。
細胞を37℃で6時間の間6−ウェルプレートでシード培養した。PurRfoci形成を測定するため、0.5%SeaKem LEアガロース(FMC BioProducts,Rockland,Maine)、加熱によって非活性化された10%FBS及びペニシリン/ストレプトマイシンを含んだMEM培養液で細胞を覆った後、2日間37℃で培養した。その以後に、ピュウーロマイシン(10μg/ml)を添加するか排除させて追加的に3日間培養した。セレクション以後に、ホルムアルデヒド固定された細胞をクリスタルバイオレット染色によってPurR fociを観察した(Yun等,J.Virol.,2003年,第77巻,6450−6465頁)。PurR細胞培養のため、細胞をアガロースプラグで覆わないまま、2日間37℃で完全培地で培養した。続いて、セレクションのため10μg/mlピュウーロマイシンを含んだ完全培地で24−48時間の間培養し、生きて残った細胞をクリスタルバイオレットで染色して観察した。
発現カセットの挿入がベクターの特異的な感染性/複製を変形させるかどうかを調査するため、本発明者らは、四つのSP6−誘導された外来遺伝子を含有した感染性を有するJEV cDNAコンストラクトから転写された合成RNAの特異的な試験管内感染性を調査した(表5)。精製されたpJEV/FL及びその誘導体プラスミドをXba I処理によって線形化させてMBNで処理した。上記のように、線形化されたプラスミドをSP6 RNAポリメラーゼを利用した試験管内転写反応(25μl)に使用した。転写後に、反応混合液を追加的に10UのDNase Iと30分間反応させ、フェノールクロロホルムイソアミルアルコールでRNAを抽出した。DE−81濾過紙(Whatman、Maidstone、UK)にRNAが吸収される[3H]UTP取り込みを基にしてRNAを定量した。上記の方法によるエレクトロポレーションによって細胞内に流入されたRNA(2μg)で細胞を形質転換させた(Yun等,J.Virol.,2003年,第77巻,6450−6465頁)。
a:試験管内転写反応に使用された全てのJEV cDNA鋳型は、Xba I切断で線形化された後に、MBNで処理して製造した。
b:SP6 RNAポリメラーゼを使用した試験管内転写反応以後に、サンプルを使用してBHK−21細胞をエレクトロポレーションし、感染性を有するプラークセンタを測定した(Yun等,J.Virol.,2003年,第77巻,6450−6465頁)。
c:エレクトロポレーション後、48時間及び72時間後のウイルス力価。
d:全長のJEV cDNA誘導体から生成されたRNA転写物でエレクトロポレーション以後にウイルス−誘導されたCPEを観察した。エレクトロポレーションしてから24時間後に、親ベクターpJEV/FLで「++++」と表示した強いCPEを観察した。エレクトロポレーションしてから60時間後に、pJEV/FL/PAC及びpJEV/FL/EGFPにおいては、「++」と表示したCPEを観察した。pJEV/FL/LacZにおいては、「+」と表示したようにエレクトロポレーションしてから72時間後に明確なCPEが現われ始めた。「−」は、どのようなCPEも現わさないことを示す。
構造蛋白質のコード配列内にインフレーム(in−frame)欠失をエンジニアリングするため、全てのJEVウイルスレプリコンのためのプラスミドは、pJEV/FL/LUCに基礎して製造した。二つのアミノ酸残基、即ちLeu及びGluの挿入を誘発させる新規なXho I部位によって全ての欠失を区別した。第1に、本発明者らは、各構造蛋白質内に単一インフレーム欠失を含んだ四つのJEVウイルスレプリコンベクターセットを製造した。C遺伝子に273個ヌクレオチド欠失(nt 132−404)を含むpJEV/Rep/ΔCC/LUCを製造するため、pJEV/FLのPCR増幅によって二つの切片を合成した。即ち、配列番号53で表されるDelFプライマー及び配列番号54で表されるC1Rプライマーを使用して切片C1を合成し、配列番号55で表されるC2Fプライマー及び配列番号56で表されるDelRプライマーを使用して切片C2を合成した。二つの切片(C1切片アンプリコンの267bp Pac I−Xho I部位及びC2切片アンプリコンの226bp Xho I−BsiW I部位)をpJEV/FL/LUCの20,073bp BsiW I−Pac I切片と接合させてpJEV/Rep/ΔCC/LUCコンストラクトを製造した。C遺伝子に204−ヌクレオチド欠失(nt 201−404)を含むpJEV/Rep/ΔC/LUCを製造するため、pJEV/FLから切片C3をDelFプライマー及び配列番号57で表されるC3Rプライマーを使用してPCR増幅させた。その結果、生成されたアンプリコン336bp Pac I−Xho I切片をpJEV/Rep/ΔCC/LUCの12,850bp Xho I−Rsr II及び7,449bp Rsr II−Pac I切片と接合させてpJEV/Rep/ΔC/LUCコンストラクトを製造した。prM遺伝子に282−ヌクレオチド欠失(nt 531−812)を含むpJEV/Rep/ΔprM/LUCを製造するため、pJEV/FLのPCR増幅によって二つの切片を製造した。即ち、DelFプライマー及び配列番号58で表されるprM1Rプライマーを使用して切片prM1を製造し、配列番号59と記載されるprM2Fプライマー及びDelRプライマーを使用して切片prM2を製造した。二つの切片(prM1切片アンプリコンの666bp Pac I−Xho I部位及びprM2切片アンプリコンの1,616bp Xho I−Sfi I部位)をpJEV/FL/LUCの10,264bp Sfi I−Nsi I及び8,011bp Nsi I−Pac I切片と接合させてpJEV/Rep/ΔprM/LUCコンストラクトを製造した。E遺伝子に1,170−ヌクレオチド欠失(nt 1,032−2,201)を含むpJEV/Rep/ΔE/LUCをエンジニアリングするため、pJEV/FLのPCR増幅によって二つの切片を製造した。即ち、DelFプライマー及び配列番号60と記載されるE1Rプライマーを使用して切片E1を製造し、配列番号61と記載されるE2Fプライマー及びDelRプライマーを使用して切片E2を製造した。二つの切片(prM1切片アンプリコンの1,167bp Pac I−Xho I部位及びprM2切片アンプリコンの227bp Xho I−Sfi I部位)をpJEV/FL/LUCの10,264bp Sfi I−Nsi I及び8,011bp Nsi I−Pac I切片と接合させてpJEV/Rep/ΔE/LUCコンストラクトを製造した(図11のA)。
JEV RNA複製開始を使用して外来遺伝子を独立的に発現させるため、本発明者らは、厳しい安全基準を充足させる自己複製自己制限ウイルスレプリコンのパネルを製造した(図11のA)。最初に本発明者らは敏感で定量的な方式でウイルス複製のモニターリングが容易であるように、異種遺伝子としてLUCリポーター遺伝子を使用した。したがって、各蛋白質の膜内位置(orientation)を考慮し、ウイルスの一つ、二つまたは全ての構造遺伝子(C、prM及びE)をインフレーム欠失させてpJEV/FL/LUCのコンテクスト(context)内に注意してエンジニアリングした(図11のA)。
本発明者らは、pSinRep19(Agapov等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1998年,第95巻,12989−12994頁)に基づいたJEV構造蛋白質発現ベクターを製造した。pSinRep19/JEV C−Eを製造するため、Xba I部位(下線で表示)を挿入させた配列番号65で表されるJEVCFプライマー(5−GATTCTAGAATGACTAAAAAACCA)及びPme I部位(下線で表示)を挿入させた配列番号66で表されるJEVERプライマー(5−GATGTTTAAACTATTAAGCATGCACATTGGT)を使用してpJEV/FLの切片を増幅させた。その結果、生成されたアンプリコンの2,393bp Xba I−Pme I切片を、pSinRep19/JEV C−Eを製造するため、pSinRep19の10,864bp Xba I−Mlu I(T4 DNAポリメラーゼ−処理)切片と接合させた(図12のA)。pSinRep19/JEV C−NS1を製造するため、JEVCFプライマー及びPme I部位(下線で表示)を挿入させた配列番号67で表されるJEVNS1Rプライマー(5−GATGTTTAAACTATTAAGCATCAACCTGTGA)を使用してPCR増幅によってpJEV/FL切片を製造した。それから、その結果生成されたアンプリコンの3,449bp Xba I−Pme I切片を、pSinRep19/JEV C−NS1を製造するため、pSinRep19の10,864bp Xba I−Mlu I(T4 DNAポリメラーゼ−処理)切片と接合させた(図12のA)。pSinRep19/JEV C−E−BglIIの製造のため、pSinRep19/JEV C−NS1の2,559bp Xba I−Bgl II(T4 DNAポリメラーゼ−処理)切片をpSinRep19の10,864bp Xba I−Mlu I(T4 DNAポリメラーゼ−処理)切片と接合させた(図12のA)。
JEVの全ての構造蛋白質(C、prM及びE)を継続的に発現し、JEVウイルスレプリコンの効率的なパッケージングのトランス補完が可能なPCL(packaging cell line;パッケージ細胞株)の開発により、JEVレプリコン発現ベクターの利用効率が増進された。セレクションを増進させるサブゲノムプロモーターによって誘導されるPAC遺伝子を含むpSinRep19発現ベクター(図12のA)に基づき、本発明者らは、C−E(pSinRep19/JEV C−E)、C−E及びNS1の58N−末端残基(pSinRep19/JEV C−E−BglII)及びC−NS1(pSinRep19/JEV C−NS1)に対する配列をコードする三つの互いに違っているJEV構造蛋白質発現カセットコンストラクトを製造した。
Claims (14)
- バクテリア人工染色体(BAC)に導入され、遺伝学的に安定な日本脳炎ウイルス(JEV)の全長cDNAクローンを含む、感染性のあるJEVを生産することができるBACベクター。
- 前記全長cDNAクローンが、cDNAの5’末端の前にプロモーターを、ランオフ位置としてcDNAの3’末端の後に制限酵素認識配列を含む、請求項1に記載のBACベクター。
- 前記プロモーターが、SP6またはT7プロモーターである、請求項2に記載のBACベクター。
- 前記制限酵素認識配列が、JEVゲノムRNAに存在しないことを特徴とする、請求項2に記載のBACベクター。
- 前記制限酵素認識配列が、XhoIまたはXbaIである、請求項2に記載のBACベクター。
- SP6プロモーターを有する配列番号43、配列番号44及び配列番号45で表わされる配列及び、T7プロモーターを有する配列番号46、配列番号47及び配列番号48で表わされる配列からなる群から選択される、請求項2に記載のBACベクター。
- 前記BACプラスミドが、pBeloBAC11である、請求項1に記載のBACベクター。
- 前記全長cDNAクローンが、5’非翻訳領域(nontranslated region(NTR))、ポリペプチドコード領域及び3’NTRからなる、請求項2に記載のBACベクター。
- 前記全長cDNAクローンが、配列番号15で表わされるヌクレオチド配列、またはそれと98%相同性がある全長JEVゲノムRNAのヌクレオチド配列を有する韓国型JEVに由来した、請求項8に記載のBACベクター。
- 配列番号43で表わされるJEV cDNAを含むpBACSP6/JVFL/XhoI、配列番号44で表わされるJEV cDNAを含むpBACSP6/JVFLx/XhoI、配列番号45で表わされるpBACSP6/JVFLx/XbaI、配列番号46で表わされるJEV cDNAを含むpBACT7/JVFL/XhoI、配列番号47で表わされるJEV cDNAを含むpBACT7/JVFLx/XhoI、及び配列番号48で表わされるJEV cDNAを含むpBACT7/JVFLx/XbaIからなる群から選択される、請求項1に記載のBACベクター。
- 前記cDNAクローンが、T7プロモーターを有するpBACT7/JVFLx/XbaIである、請求項10に記載のBACベクター(寄託番号:KCTC10346BP)。
- 前記cDNAクローンが、SP6プロモーターを有するpBACSP6/JVFLx/XbaIである、請求項10に記載のBACベクター(寄託番号:KCTC10347BP)。
- 1)請求項1のBACベクターに異種遺伝子を挿入して、組換えJEV cDNA発現ベクターを調整する工程;
2)前記組換えJEV cDNA発現ベクターからJEV RNA転写物を産生する工程;
3)前記JEV RNA転写物で形質転換された細胞を産生する工程;及び
4)前記細胞を培養して外来タンパク質を発現させる工程からなる異種遺伝子を発現させる方法。 - 前記外来遺伝子が、JEV cDNAのJEV3’NTRの前に挿入する、請求項13に記載の方法。
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