KR100710519B1 - 일본뇌염 바이러스의 신규한 전체-길이의 게놈 ＲＮＡ 및상기 ＪＥＶ 게놈 ＲＮＡ에 대한 감염성이 있는 ＪＥＶｃＤＮＡ 및 이것의 용도 - Google Patents
일본뇌염 바이러스의 신규한 전체-길이의 게놈 ＲＮＡ 및상기 ＪＥＶ 게놈 ＲＮＡ에 대한 감염성이 있는 ＪＥＶｃＤＮＡ 및 이것의 용도 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 일본뇌염 바이러스(Japanese encephalitis virus; JEV)의 신규한 게놈 RNA 및 이로부터 합성한 상기 JEV 게놈 RNA에 대한 감염성이 있는 JEV cDNA(infectious JEV cDNA)에 관한 것이다. 보다 구체적으로는, 본 발명은 서열번호 15로 기재되는 전체-길이(full-length)의 JEV 게놈 RNA 및 상기 JEV 게놈 RNA에 대한 감염성이 있는 JEV cDNA에 관한 것이다. 본 발명의 JEV 게놈 RNA 및 JEV 게놈 RNA에 대한 감염성이 있는 JEV cDNA는 JEV 유전자를 동정하는 것뿐만 아니라, JEV의 복제(replication), 전사(transcription) 및 번역(translation)에 관련된 분자생물학적인 메카니즘의 연구를 위하여 사용될 수 있다. 또한, 본 발명은 일본뇌염의 치료제, 백신, 진단시약 및 진단용 기구 등의 개발에도 유용하게 사용될 수 있고, 아울러, 이형 유전자의 발현 벡터로 사용될 수 있다.
Description
도 1은 일본뇌염 바이러스의 한국분리주 K87P39과 이로부터 분리된 큰 플라크를 형성하는 JEV 분리체(large-plaque forming JEV isolate) CNU/LP2을 비교한 것으로서, JEV에 mock-감염된 BHK-21 세포(Mock-infected), 혼합된 다양한 크기의 플라크들을 나타내는 JEV K87P39 한국분리주에 감염된 BHK-21 세포(K87P39-infected), 및 일정한 큰 플라크들을 나타내는 CNU/LP2에 감염된 BHK-21 세포(CNU/LP2-infected)에 대한 플라크 분석 결과(A), Vero 세포를 사용한 경우의 플라크 분석 결과(B) 및 염색된 JEV-특이적 단백질들(녹색형광)과 프로피디움 아이오다인(propidium idodine, 적색형광)으로 염색된 세포의 핵을 공초점현미경(confocal microscopy)으로 보여주는 사진으로서, BHK-21 세포를 K87P39, CNU/LP2, 또는 황열병 바이러스 YF17D(yellow fever virus 17D)로 감염 또는 mock-감염시킨 사진이다(C). 18시간 경과후, 세포를 고정하고 JEV-특이적 쥐 하이퍼이뮨(hyperimmune) 어사이트(ascite)로 염색한 후 플루오레신 이소티오시아 네이트(fluorescein isothiocyanate)가 결합된 염소(goat) 안티-마우스 면역글로불린 G를 처리하여 공초점현미경(confocal microscopy)으로 관찰하였다.
도 2의 A는 JEV의 5'-말단과 3'-말단을 제외한 전체 JEV 게놈 RNA를 나타내는 세 개의 중첩하는 cDNA 앰플리콘의 RT-PCR 증폭에 대한 개략도로써, RNA는 회색으로 cDNA는 검정색 평행선으로 나타내고, CNU/LP2 JEV 게놈 RNA(전체길이: 10,968 base pairs)를 도식적으로 윗부분에 그렸으며, 세 개의 중첩하는 cDNA인 JVF(nt 1-3,865), JVM(nt 3,266-8,170), 및 JVR(nt 7,565-10,893)는 아랫부분에 나타내었다.
도 2의 B는 CNU/LP2 JEV 게놈 RNA의 3'-말단의 염기서열을 분석하기 위한 개략도로써, 5'-말단이 인산화(phosphorylation)되고 동시에 3'-말단이 막힌(blocked) 올리고뉴클레오타이드 T(Oligo T)를 T4 RNA 접합효소(ligase)를 사용하여 JEV 게놈 RNA의 3'-말단과 접합시킨 것이며, 접합된 RNA는 화살표로 표시된 프라이머를 사용하여 cDNA 합성과 PCR 증폭을 실시하였고, 증폭된 산물은 클로닝되어지고 염기서열을 밝히는 데 사용된다.
도 2의 C는 상기 JEV 게놈 RNA로부터 합성된 JEV-특이적 앰플리콘(amplicon)을 보여주는 전기영동 사진으로써, 첫째 사슬 cDNA는 올리고 T와 상보적 결합을 하는 올리고뉴클레오타이드 TR(oligonucleotide TR)를 사용하여 합성하였고 역전사반응은 Superscript II 역전사 효소를 첨가하거나(lane 1) 또는 첨가하지 않고(lane 2) 수행하였으며, 합성된 cDNA는 올리고뉴클레오타이드 TR과 프라이머 J35를 사용하여 증폭한 후 증폭된 JEV-특이적 앰플리콘은 1.2% 아가로스 젤(agarose gel)상에서 분리하여 EtBr(ethidium bromide)로 염색하였다.
도 2의 D는 CNU/LP2 JEV 게놈 RNA의 5'-말단의 염기서열을 분석하기 위한 개략도로써, JEV 게놈 RNA의 5'-말단에 있는 캡(cap) 구조를 먼저 TAP(tobacco acid pyrophosphatase) 효소로 제거한 다음 T4 RNA 접합효소로 자가-접합을 실행한 후 cDNA 합성과 PCR 증폭에 사용되며, 증폭된 산물은 클로닝되어지고 염기서열을 밝히는 데 사용된다.
도 2의 E는 상기 JEV 게놈 RNA로부터 합성된 JEV-특이적 앰플리콘을 보여주는 전기영동 사진으로써, 첫째 사슬 cDNA는 nt 215-232와 상보적결합을 하는 프라이머를 사용하여 합성하였으며, 역전사반응은 역전사 효소를 첨가하거나(lane 1) 또는 첨가하지 않고(lane 2) 수행하였다. 합성된 cDNA는 프라이머 J35와 nt 164-181과 상보적 결합을 하는 프라이머 J39를 사용하여 증폭하였으며, 증폭된 JEV-특이적 앰플리콘은 1.2% 아가로스 젤 상에서 분리하여 EtBr로 염색하였으며, 이때 M은 100 bp DNA 사다리 마커(ladder marker)로써 염기쌍으로 나타내었다.
도 3의 A는 세균 인공 염색체(bacterial artificial chromosome)인 pBeloBAC11에 전체-길이의 JEV cDNA를 클로닝하기 위한 개략도를 보여주는 것으로, 본 발명에서 합성된 전체-길이의 JEV cDNA를 cDNA의 양쪽 말단에 굵은 줄로 표시된 JEV 게놈의 5' NTR 및 3'NTR과 바이러스의 단백질로 도식화하여 모식도로 나타내었고, 5'-말단의 SP6 및 T7 프로모터의 전사 시작부위(transcription start)와 3'-말단의 런-오프 전사(run-off transcription)를 위한 유일한 제한효소자리를 각각 나타내었다.
도 3의 B는 JEV 게놈 RNA의 뉴클레오타이드 염기서열은 굵은 소문자의 이탤 릭체로 나타내었으며, 4개의 SP6-유도된(SP6-driven) 전체-길이의 JEV cDNA 주형의 5'-말단 및 3'-말단 염기서열을 나타내며, 도 3의 C는 4개의 T7-유도된(T7-driven) 전체-길이의 JEV cDNA 주형의 5'-말단 및 3'-말단 염기서열을 나타낸다. SP6 또는 T7 RNA 폴리머라아제 런-오프 전사체를 합성하기 위해서 두 개의 SP6-유도된 (B, pBACSP6/JVFL/XhoI와 pBACSP6/JVFLx/XhoI)과 두 개의 T7-유도된 (C, pBACT7/JVFL/XhoI와 pBACT7/JVFLx/XhoI) JEV cDNA 주형은 XhoI 처리하여 바이러스와 연관되지 않은 3개의 CGA 뉴클레오타이드를 3'-말단에 선형화시킨다. 한 개의 SP6-유도된 (B, pBACSP6/JVFLx/XbaI) 및 한 개의 T7-유도된 (C, pBACT7/JVFLx/
XbaI) JEV cDNA 주형은 XbaI 처리하여 바이러스와 연관되지 않은 4개의 CTAG 뉴클레오타이드를 3'-말단에 선형화시킨다. 또한, XbaI-처리된 SP6-유도된 pBACSP6/JVFLx/XbaI과 XbaI-처리된 T7-유도된 pBACT7/JVFLx/XbaI의 JEV cDNA 3'-말단에 추가된 바이러스와 연관되지 않은 4개의 CTAG 뉴클레오타이드는 녹두 뉴클레아제(mung bean nuclease, MBN)에 의해서 제거됨으로써 pBACSP6/JVFLx/XbaIMBN과 pBACT7/JVFLx/XbaIMBN cDNA 주형을 생산한다.
도 4는 본 발명에서 합성된 전체-길이의 JEV cDNA 주형 단독으로는 감염성이 없으나, 시험관내 전사과정을 통해서 감염성이 있는 RNA의 제조를 위해서는 상기 cDNA가 반드시 필요하다는 사실을 보여주는 것으로써, 시험관내 전사과정에 사용된 전체-길이의 JEV cDNA 주형과 이로부터 전사된 합성 RNA를 나타내는 전기영동 사진(A) 및 사용된 전체-길이의 JEV cDNA 주형과 전사된 합성 RNA를 함께 BHK-21 세포에 형질전환(transfection)시켰을 때 얻어진 감염성 정도를 나타내는 그래프(B)이다. 이때 pBACSP6/JEFLx/XbaI(100-200 ng)을 Xba I으로 선형화하고 MBN 처리한 뒤 DNase I 존재(A는 레인 2에, B는 DNase I 처리됨)하에 또는 흠결(A는 레인 1에, B는 DNase 미처리됨)하에서 SP6 폴리머라제 전사에 이용한다. 합성후, 전사 반응 혼합물을 37℃, 30분동안 DNase I으로 처리(A는 레인3에, B는 DNase 처리후)하거나 RNase A으로 처리(A는 레인4에, B는 RNase 처리후)한다. 대조군으로서 반응은 SP6 RNA 폴리머라제 흠결하에 수행한다(A는 레인5에, B는 SP6 폴리머라제 미처리됨). 상기 처리 후에, 반응 혼합물의 5%를 0.6% 아가로오스 겔에서 분리하고, cDNA 주형과 RNA 전사체를 EtBr로 염색하여 시각화 하였으며(A)과 반응 혼합물을 BHK-21 세포에 형질전환에 이용하여 플라크의 감염중추를 측정하였다(B).
도 5는 감염성이 있는 JEV cDNA에서 합성된 JEV 바이러스(synthetic JEV)와 모 바이러스(parental virus) CNU/LP2를 비교한 것으로서,
도 5의 A는 감염성이 있는 JEV cDNA에서 합성된 JEV 바이러스(synthetic JEV)와 모 바이러스(parental virus) CNU/LP2를 비교한 것으로서, 합성된 JEV 및 모 바이러스 CNU/LP2의 플라크 분석을 위해 BHK-21 세포들을 모 바이러스 또는 합성 바이러스로 감염시켜 아가로오스로 덮은 후, 크리스탈 바이올렛으로 3일 뒤에 염색하여 분석한 사진이다.
도 5의 B는 0.01, 1, 및 10의 MOI(multiplicities of infection)에서 감염합성된 JEV 및 모 바이러스 CNU/LP2로 감염된 BHK-21 세포에서 생성되는 바이러스의 성장 동역학(growth kinetics)을 보여주는 그래프로서, 바이러스를 h.p.i(hour postinfection indicated)에서 수집하여 그 타이터(titer)를 플라크 어세이로 결정하여 분석한 그래프이다.
도 5의 C는 바이러스 단백질의 발현정도를 보여주는 면역블롯(immunoblot)으로, BHK-21 세포들은 1 MOI에서 합성 JEV(레인 1 내지 4) 또는 CNU/LP2(레인 5) 또는 mock(레인 6)으로 감염시킨 후 18시간 동안 배양하였다. 약 3x104 세포에서 단백질 추출물을 추출하여 10% SDS-폴리아크릴아미드 겔에서 분리한다. 바이러스 단백질을 JEV-특이적 하이퍼이뮨(hyperimmune) 어사이트(ascite)로 면역블롯 하여 관찰한다(윗 패널). 이와 평행하게, 액틴 단백질은 로딩하고 전달 대조군으로 검출한다(아래 패널). 바이러스의 단백질-관련된 절단 중간체의 위치와 액틴은 왼쪽에 화살표로 나타내었으며, kDa에 따른 분자량 마아커를 오른쪽에 나타내었다.
도 5의 D는 바이러스 RNA의 발현정도를 보여주는 노던 블롯(northern blot)으로, 약 1x105 세포에서 전체 RNA를 추출한후, 32P-표지된 안티센스 리보프로브를 nt 9143-9351을 지나는 NS5 유전자의 서열(윗 패널)과 교잡하여 노던 블롯한 전기영동 사진이다. EtBr-염색된 18S rRNA 밴드를 로딩 콘트롤(아래 패널)로 하였으며, 전체 길이의 게놈 바이러스 RNA(11kb)와 18S rRNA는 왼쪽에 나타내었다.
도 6은 pBACSP6/JVFLx/gm/XbaI 유래의 재조합된 JEV(recombinant JEV)에 존재 하는 XhoI 유전자 마커(genetic marker)의 존재를 보여주는 다이어그램과 전기영동 사진이다.
도 6의 A는 Xho I 절단 후에 기대되는 JVFLx/XbaIMBN 과 JVFLx/gm/
XbaIMBN RT-PCR 절편의 개략도이다. 도면은 RT-PCR에 사용되는 프라이머(화살표), 도입된 Xho I 위치(별표), 및 RT-PCR 생성물의 크기(2,580bp)과 2개의 Xho I 절단 생성물(1,506bp와 1,074bp)을 나타낸다.
도 6의 B에서는 BHK-21 세포를 pBACSP6/JVFLx/XbaIMBN 또는 pBACSP6/JVFLx/gm/XbaIMBN로부터 전사된 합성 RNA로 형질전환 (transfection)시킨다. 바이러스는 24시간 동안 회복시키고 0.1 MOI에서 BHK-21 세포에 순차적으로 계대하였다. 다음 단계의 계대배양을 위한 감염전에, 바이러스는 DNase I과 RNase A로 반응시켰다. 계대 1 및 3에서 얻어진 바이러스가 함유된 배양 상등액에서 바이러스 RNA를 추출하여 RT-PCR에 이용한다. 상기 PCR 생성물을 Xho I 존재(+) 또는 흠결(-)하에 반응하고, 1% 아가로오스 겔에 분리하여 EtBr로 염색한다. 절단되거나 절단되지 않은 PCR 생성물의 예상 크기를 왼쪽에 나타내었으며, 레인 M은 1-kb DNA 래더 마아커(bp로 표시)를 나타낸다.
도 7은 180 세대동안 유지되는 감염성이 있는 JEV cDNA 클론 pBACSP6/JVFLx/XbaI으로부터 전사된 합성 RNA의 감염성 정도를 보여주는 그래프이다. pBACSP6/JVFLx/XbaI를 지니는 2개의 독립적 클론(막힌 원과 개방된 원)들은 클 로람페니콜을 포함하는 2xYT에서 37℃로 밤새(overnight) 배양한다. 일차 배양은 9일동안 매일 106 배 희석하여 증식시키고, 밤새 배양하기 위해 신선한 배양액을 첨가한다. 각 계대는 약 20 세대로 하며, 나타난 계대에서 DNA 플라스미드를 정제하고, Xba I 으로 선형화한 후, MBN 처리하여, 이를 SP6 RNA 폴리머라제를 이용한 런오프 전사의 주형으로 이용한다. 그 후 전사체는 특이적 감염도를 측정하기 위해 BHK-21 세포에 형질전환시키는데 사용한다.
도 8은 JEV cDNA를 벡터로 사용하여 이형 단백질을 발현하는 것을 보여주는 것으로서, A는 SP6 RNA 중합효소를 이용한 런-오프 전사에 사용된 본 발명의 cDNA 주형에 대한 개략도이다. 이때 GFP 또는 LUC 유전자를 포함하는 엔세팔로마이오카디티스 바이러스(EMCV)의 내부 리보솜 삽입 부위(internal ribosome entry site, IRES)를 바이러스 게놈의 3'NTR 의 시작점에 삽입하고, SP6 프로모터 전사를 시작하였으며, Xba I 절단과 MBN 처리(XbaI/MBN)에 의해 런오프 위치를 생성하였다. pBACSP6/JVFLx/LUCREP-/XbaIMBN에서, 굵은 선은 nt 5596(별표)에서 바이러스 번역(translation)을 미리 종결시키는 NS3 유전자의 중앙에 있는 83-뉴클레오티드 결실(nt 5580-5563)을 나타낸다. B는 GFP 단백질의 발현을 보여주는 공초점 현미경 사진으로, BHK-21 세포를 mock-형질전환(Mock)시키거나 또는 2㎍의 합성 RNA로 형질전환시킨 것이다. 이때 합성 RNA는 pBACSP6/JVFLx/GFP/XbaIMBN 주형(JVFLx/GFP/XbaIMBN)으로부터 전사된 것이다. 그 후 30 시간동안 반응시킨 후, 고정하여 공초점 현미경으로 관찰하였다. C는 LUC 단백질의 발현을 보여주는 그래프로서, BHK-21 세포들(8x106)을 mock-형질전환시키거나 또는 pBACSP6/JVFLx/LUC/XbaIMBN (●)으로부터 전사된 2㎍의 합성 RNA 또는 pBACSP6/JVFLx/LUCREP-/XbaIMBN (○) 주형으로부터 전사된 2㎍의 합성 RNA로 형질전환시켰다. 그 후 웰 당 6x105 세포의 밀도로 6-웰 플레이트에 도말한다. 세포는 각각의 시점에서 용해시킨 뒤 LUC 활성을 측정한다. 독립된 3가지 실험결과로부터 얻어진 기준 편차를 에러 바(error bar) 에 나타내었다.
도 9는 감염성 재조합 JEV를 코딩하는 외래 유전자의 개략도 및 특성을 나타내며, 재조합 JEV는 BAC으로 제공되는 비시스트론 (bicistron) 전체 길이의 감염성 JEV cDNA에 기초한다. A는 감염성 재조합 JEV cDNA를 제조하는 과정으로, 감염성 JEV cDNA의 모가닥의 구조(pJEV/FL)은 윤 등의 문헌(Yun et al., J. Virol., 2003, 77, 6450-6465)에 나타나 있다. 바이러스의 ORF은 바이러스 게놈의 5'과 3' NTR의 양 말단의 굵은 줄과 함께 나타냈다. EMCV IRES에 의해 유도된 추가적인 발현 유니트를 단일의 Nsi I 부위를 사용하여 3'NTR의 시작점에 삽입한다. 나타난 것은 SP6 프로모터 전사 개시 부위(SP6 promoter)와 Xba I 절단 및 MBN 처리(XbaI/MBN)에 의해 생긴 런오프 위치를 나타낸다. X는 관심있는 외래 유전자를 나타낸다. B는 본 발명에서 제조된 감염성 재조합 JEV cDNA의 구조를 나타낸다. 세가지 공통으로 사용되는 리포터들( EGFP, 768 bp; LUC, 1653 bp; 및 LacZ, 3012 bp) 또는 우 성의 선택적 마아커 PAC(600bp)를 3'NTR의 시작점에 조작해 두었다. 대조군으로 사용된 복제-완전 pJEV/FL/LUC cDNA의 경우, 복제-불완전 pJEV/FL/LUCREP- cDNA는 NS3 유전자의 중앙에 있는 83-염기의 결실(■)을 도입시킨 것이다. 그 결과 상기에서 언급한 바(Yun et al., J. Virol., 2003, 77, 6450-6465)와 같이 nt 5596(*)에서 바이러스의 번역이 미성숙 종결되었다. C와 D는 감염성 재조합 JEV를 모 바이러스의 것과 비교한 것이다. C는 BHK-21 세포(8X106)는 mock-형질 전환시키거나 또는 상기 JEV cDNA로부터 전사된 모 바이러스의 JEV RNA 2 ㎍ 또는 재조합 JEV cDNA 2 ㎍으로 형질전환 시켰다. 이때 형질전환된 세포를 아가로오스로 덮은뒤 5일뒤에 크리스탈 바이올렛으로 염색하여 플라그를 시각화하였다. D에서는 형질전환된 세포들을(4X105) 각 시점에서 1X 샘플 로딩(loading) 버퍼로 용해시킨 뒤 그 단백질 추출물을 10% SDS-폴리아크릴아미드 겔로 분리시켰다. 바이러스의 단백질들은 JEV-특이적인 쥐 하이퍼이뮨 혈청(Yun et al., J. Virol., 2003, 77, 6450-6465)으로 면역블롯(immunoblotting)시켜 바이러스 단백질 축적을 나타내었다. 바이러스 단백질의 위치(E 및 NS1)와 절단-관련(cleavage-related) 중간체의 위치는 왼쪽에 화살표로 나타내었다. 분자량 마아커는 kDa 단위로 오른쪽에 나타내었다. V 는 JEV CNU/LP2-감염된 BHK-21 세포를, 그리고 N은 순수(naive) BHK-21 세포를 나타낸다.
도 10은 감염성 JEV cDNA를 벡터로 사용하는 우성 선택적 마커 및 리포터 유 전자의 발현을 나타낸 것이다. BHK-21 세포들 (8X106)을 각 플라스미드로부터 전사된 2 ㎍ 의 모가닥 또는 재조합 JEV RNA로 형질전환 시키거나 mock-형질 전환시켰다. 각 플라스미드는 pJEV/FL/EGFP(A-B), pJEV/FL/LacZ(C), pJEV/FL/LUC 또는 pJEV/FL/LUCREP-(D) 및 pJEV/FL/PAC(E)이다. A, B는 EGFP의 발현을 나타내며, 형질전환된 세포는 형질전환 36시간 후에 공초점 현미경(confocal microscopy) 분석(A) 및 유세포 분석(flow cytometric analysis)(B)에 사용하였다. -- 는 JEV/FL/EGFP RNA-형질전환된 세포들을 나타내며, …… 는 mock-형질전환된 세포들을 나타낸다. C는 LacZ의 발현을 나타내며, 형질전환된 세포들을 형질전환 36시간후에 X-gal염색하였다. D는 LUC의 발현을 나타내며, 형질전환된 세포들을 웰(well) 당 4X105 세포의 밀도로 여섯 개의 웰 플레이트에 도포(seed)한 후, 개시된 시점에서, 세포 용해한 뒤 LUC 분석을 하였다. 실험은 3번 반복하였으며 평균치는 에러 바(error bar)로 나타냈다. ●는 JEV/FL/LUC RNA-형질전환된 세포들을 나타내며, ○는 JEV/FL/LUCREP- RNA-형질전환된 세포들을 나타내며, - 는 순수(naive) 세포의 배경 루미네슨스(luminescence)의 수준을 나타낸다. E는 PAC의 발현을 나타내며, 형질전환된 세포들을 6-웰 플레이트에 플레이트하고, 완전배지(1, 3, 5, 및 7번 접시) 또는 0.5% 의 아가로스-포함하여 덮여진 배지(2, 4, 6, 및 8번 접시)에서 배양한다. 배양 2일 후에, 플레이트는 10 ㎍/ml 퓨로마이신 존재하에(5-8번 접시) 또는 미존재하에(1-4번 접시) 추가로 3일동안 배양한다. 그 후 세포들을 고정하고, 크 리스탈 바이올렛으로 염색하였다.
도 11은 JEV 바이러스 레플리콘의 구조와 특성을 나타낸 것으로, A는 JEV 바이러스 레플리콘의 구조를 나타낸다. 굵은 박스(■)는 감염성 pJEV/FL/LUC 컨스트럭트의 게놈에 도입된 인-프레임 결실(in-frame deletion)을 나타낸다. 4개의 컨스트럭트 즉, pJEV/Rep/ΔCC/LUC, pJEV/Rep/ΔC/LUC, pJEV/Rep/ΔprM/LUC, 및 pJEV/Rep/ΔE/LUC은 JEV의 각 구조 유전자내에 하나의 인-프레임이 결실되어 있다. pJEV/Rep/ΔC/LUC와 달리, pJEV/Rep/ΔCC/LUC는 C 유전자의 5' 영역에서 개시된 환형(cyclization) 서열 모티프에 연장된 결실(deletion)을 갖는다. 세 가지 컨스트럭트 즉, pJEV/Rep/ΔC+ΔprM/LUC, pJEV/Rep/ΔC+ΔE/LUC, 및 pJEV/Rep/ΔprM+ΔE/LUC 은 이중(double) 인-프레임이 결실되어 있는 반면, pJEV/Rep/ΔC+ΔprM+ΔE/LUC 은 바이러스의 모든 구조단백질에 삼중(triple) 인-프레임 결실을 가지고 있다. 또한 조작된 pJEV/Rep/NS1/LUC는 C-단백질의 35 N-말단과 24 C-말단 아미노산을 암호화하고, 그 뒤로 NS1 단백질의 N-말단과 나머지 바이러스 게놈이 바로 뒤따라 존재한다. B는 LUC의 발현을 나타낸다. 순수(Naive) BHK-21 세포들을(8X106) 각 플라스미드로부터 전사된 2 ㎍ 의 모가닥 또는 재조합 JEV RNA로 형질전환 시킨 후, 웰 당 4X105 개의 세포 밀도에서 6-웰 플레이트에 도말한다. 개시된 시점에서, 세포 용해후 LUC 어세이(assay)를 수행한다. 실험은 3번 반복하였으며 평균치는 개시하였다. ● 검정색은 pJEV/FL/LUC이며; ◆ 검정색은 pJEV/FL/LUCREP- 이며; ◆ 푸른색은 pJEV/Rep/ΔCC/LUC이며; ■ 푸른색은 pJEV/Rep/ ΔC/LUC이며; ▲ 푸른색은 pJEV/Rep/ΔprM/LUC이며; ● 푸른색은 pJEV/Rep/ΔE/LUC이며; ■ 붉은색은 pJEV/Rep/ΔC+ΔprM/LUC이며; ▲ 붉은색은 pJEV/Rep/ΔC+ΔE/LUC이며; ● 붉은색은 pJEV/Rep/ΔprM+ΔE/LUC이며; ■ 초록색은 pJEV/Rep/ΔC+ΔprM+ΔE/LUC이며; ● 초록색은 pJEV/Rep/NS1/LUC이다. - 는 순수(naive) 세포의 배경 루미네슨스(luminescence)의 수준을 나타낸다. C는 바이러스 단백질의 축적을 나타낸다. 형질전환된 세포들을(4X105) 48시간 형질전환 후 1X 샘플 로딩(loading) 버퍼로 용해시키고, 그 단백질 추출물을 10% SDS-폴리아크릴아미드 겔로 용해시킨다. 단백질들을 니트로셀룰로오즈 막에 옮긴 후 JEV-특이적인 쥐 하이퍼이뮨 혈청으로 면역블롯(immunoblotting)시킨다.
도 12는 JEV 바이러스 레플리콘에 대한 포장(packaging) 시스템의 제조에 관한 것이다. A는 JEV 구조적 단백질 발현 카셋트(cassette)는 신드비스(Sindbis) 바이러스에 기한 발현벡터를 기초로 한다. pSinRep19는 이중(double) 서브게노믹 논사이토패틱(noncytopathic) RNA 벡터이다. 외부 유전자와 PAC 유전자를 화살표에 개시된 바와 같이 별도의 하부게놈(subgenomic) 프로모터를 이용하여 발현시킨다. pSinRep19/JEV C-E 카셋트는 JEV C, prM, 및 E 유전자를 암호화한다. pSinRep19/JEV C-E-BglII 카셋트는 NS1의 N말단 58 잔기가 JEV C, prM, 및 E 유전자의 뒤를이어 암호화 하는 반면, pSinRep19/JEV C-NS1은 NS1 유전자의 나머지 단편을 가진다. MCS 는 다중 클로닝 부위(multiple cloning sites)를 나타낸다. B는 세가지 JEV 구조적 단백질 발현 카셋트로부터 발현된 JEV 구조적 단백질의 웨스 턴 블롯 분석사진이다. BHK-21 세포들을 각 JEV 구조적 단백질 발현 카셋트로 형질전환 시키거나 mock-형질 전환시키고, 용해물(lasates)를 48시간 경과후에 수득한다. 세포 용해물의 등가량(equivalent amount)을 SDS-PAGE에 의해 분리시키고, JEV-특이적 하이퍼이뮨 혈청으로 프로브한다. 전기영동 사진의 오른쪽은 바이러스 단백질 E와 NS1의 위치를 나타내며 왼쪽은 분자량 마커를 kDa 단위로 나타낸다. C는 (i) JEV 바이러스 레플리콘 RNA와 JEV 구조적 단백질 발현 벡터 RNA의 동시-형질전환(co-transfection) 또는 (ii) JEV 바이러스 레플리콘 RNA를 JEV 구조적 단백질-발현 PCL에 형질전환하여 어떻게 JEV VRPs가 생기는지를 보이는 개략도이다. D 내지 E는 JEV VRPs의 생산을 나타낸다. D는 JEV VRPs의 생성을 위한 2가지 접근방법 중 하나로서, 2개의 RNA 벡터, 즉 JEV 구조적 단백질 발현 벡터 RNA와 개시된 JEV 바이러스 레플리콘 벡터 RNA를 순수(naive) BHK-21 세포에 동시-형질전환(co-transfection)함으로써 얻어지는 결과를 나타낸다. E는 JEV VRPs의 생성을 위한 다른 접근방법으로서, 개시된 JEV 바이러스 레플리콘 벡터 RNA로 형질전환된 JEV PCL로부터 얻어지는 결과를 나타낸다. JEV 바이러스 레플리콘 RNA는 다음과 같이 나타낸다: □ 초록색은 JEV/Rep/ΔC+ΔprM+ΔE/EGFP 이며; ■ 초록색은 JEV/Rep/NS1/EGFP 이며; □ 푸른색은 JEV/Rep/ΔC+ΔprM+ΔE/LacZ 이며; ■ 푸른색은 JEV/Rep/NS1/LacZ 이며; □ 검정색은 JEV/Rep/ΔC+ΔprM+ΔE/LUC 이며; ■ 검정색은 JEV/Rep/NS1/LUC 이다. 형질전환 48시간 후에 상등액(supernatant)을 수집하고, 이는 VRP의 타이트레이션 및 개개의 리포터 유전자의 발현을 조사하기 위해 순수(naive) BHK-21 세포를 감염시키는데 사용한다. - 는 순수(naive) 세포의 배경 루미네슨스(luminescence)의 수준을 나타낸다.
본 발명은 일본뇌염 바이러스(Japanese encephalitis virus, 이하 'JEV'라 약칭함)의 신규한 게놈 RNA 서열의 결정, 상기 JEV 게놈 RNA에 대한 감염성이 있는 JEV cDNA의 구성 및 치료, 백신, 진단 이용을 위한 상기 클론 또는 이들의 유도체의 이용에 관한 것이다. 추가적으로 본 발명은 또한 예를 들어, 이종기원의 유전자 발현 시스템, 유전적 면역 및 일시적 유전자 치료를 위한 JEV 벡터에 관한 것이다.
JEV는 플라비비리대(flaviviridae) 패밀리에 속하는 RNA 바이러스의 일원으로써 모기에 의해서 전파된다. JEV는 인간, 특히 어린이에게 영구적인 신경정신질환(neuropsychiatric sequelae)을 야기시키고 심지어는 사망을 일으키는 중요한 병원성 바이러스로 알려져 있다(Tsai, Vaccine, 2000, 18(Suppl 2), 1-25; Solomon, Neurological Infections and Epidemiology, 1997, 2, 191-199; Umenai et al., Bull. W.H.O., 1985, 63, 625-631). 대략 매년 50,000건의 발병 중에서 약 25%가 사망에 이르고, 생존자의 대략 반은 영구적인 신경질환에 시달린다(Vaughn and Hoke, Epidemiol. Rev., 1992, 14, 197-221; Burke and Leake, Japanese encephalitis, 1988, 63-92, CRC Press Publisher). JEV는 구소련으로 인도에 이르기까지 대부분의 아시아 지역에 분포한다. 그러나, 최근 JEV 바이러스의 전파(transmission)가 남반구(Southern Hemisphere)에서도 보고가 되었는데, 이것은 상기 JEV 바이러스가 전세계적으로 공중 보건을 위협할 수도 있음을 의미한다(Hanna, et al., Med. J. Aust., 1999, 170, 533-536; Hanna, et al., Med. J. Aust., 1996, 165, 256-260; Mackenzie et al., Arch. Virol., 1994, 136, 447-467).
JEV는 단일가닥(single-stranded)의 작은-껍질(small-enveloped) 바이러스이며 약 11 kb 길이의 양성-센스(positive-sense) RNA 게놈을 가지고 있다. 게놈은 하나의 긴 전사해독틀(open reading frame, 이하 'ORF'라 약칭함)을 가지고 있으며, ORF의 양쪽 끝 부위에 바이러스의 자가복제에 중요한 역할을 하는 시스-작용성(cis-acting) 인자들을 가진 5' 및 3' 비번역부위(nontranslated region; NTR)로 구성되어 있다. JEV의 RNA 게놈은 5'-말단에 타입 I 캡(cap) 구조를 가지고 있으나, 3'-말단에 폴리(A) 꼬리 구조는 가지고 있지 않다. ORF는 하나의 큰 다중단백질(polyprotein)로 번역되며, 이것은 번역과 동시(co) 또는 번역 후(post)에 프로세싱(processing) 되어 세 개의 구조단백질과 일곱 개의 비구조 단백질이 생산된다. 이때 상기 단백질에 해당하는 유전자들은 JEV RNA 게놈상에서 C-prM-E-NS1-NS2A-NS2B-NS3-NS4A-NS4B-NS5와 같은 배열을 가진다(Lindenbach and Rice, Flaviviridae: The viruses and their replication, 2001, 991-1041, Lippincott Williams&Wilkins Publishers; Venugopal and Gould, Vaccine, 1994, 12, 966-975; Chamber et al., Ann. Rev. Microbiol., 1990, 44, 649-688). JEV 바이러스 유전자 산물의 기능, JEV의 자가복제, 신경침입성(neurovirulence), 및 병원성(pathogenesis)에 관여하는 분자생물학적인 메카니즘과 같은 내용들은 현재까지 잘 알려져 있지 않은데, 가장 큰 이유는 신뢰할 수 있는 역상 유전자 시스템(reverse genetics system)이 존재하지 않기 때문이다.
양성-센스 RNA 바이러스에 대한 연구는 역상 유전자 시스템(reverse genetics system)의 개발과 더불어 급속도로 발전되어 왔다. 이때, 관심있는 바이러스 게놈의 감염성 cDNA 클론이 제조되고, 이것이 합성된 바이러스를 제조하는 감염성이 있는 RNA 합성을 위한 주형으로 작용한다. 역상 유전자 시스템에는 RNA-론치(RNA-launched) 접근방식과 DNA-론치(DNA-launched) 접근방식과 같은 두 가지 방법이 있다. 전통적인 "RNA-론치(RNA-launched)" 접근방법에서는, 세포들이 감염성이 있는 cDNA 클론으로부터 합성된 RNA 전사체로 형질전환(transfection)되며, 상기 세포들로부터 합성된 바이러스(synthetic virus)가 회수된다(Satyanarayana et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1999, 96, 7433-7438; van Dinten et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1997, 94, 991-996; Liljestrom and Garoff, Biotechnology, 1991, 9, 1356-1361; Rice et al., New Biol., 1989, 1, 285-296, Rice et al., J. Virol., 1987, 61, 3809-3819). 또한, "DNA-론치(DNA-launched)" 접근방법에서는 감염성이 있는 cDNA 클론을 수용 세포(susceptible cell)에 직접 형질전환시킴으로써 합성된 바이러스를 제조한다. 상기 방법은 최초로 폴리오바이 러스에 대하여 적용된 것으로(Racaniello and Baltimore, Science, 1981, 214, 916-919), 알파바이러스(alphavirus)에 대하여도 적용이 되었다(Schlesinger and Dubensky, Curr. Opin. Biotechnol., 1999, 10, 434-439).
상기 두 가지 접근방법은 가장 큰 RNA 게놈을 가지고 있는 코로나바이러스(coronavirus)(Almazan et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97, 5516-5521)를 포함하여 많은 양성-센스 RNA 바이러스 패밀리에 대하여 감염성이 있는 cDNA 클론을 제조하기 위하여 사용되어 왔다. 상기 감염성이 있는 cDNA 클론들은 양성-센스 RNA 바이러스에 대한 많은 의문점들을 해결하는데 중요하게 사용되어 왔다. 그러나, 일본뇌염 바이러스에 대해서는 아직까지 역상 유전자 시스템이 구축되지 못하였고, 이에 따라 JEV에 대한 연구는 진척되지 못하고 있다. 이는 전체-길이(full-length)의 감염성이 있는 cDNA 클론의 구축이 성공하지 못하였기 때문인데, 가장 큰 이유는 클론된 cDNA의 유전학적인 불안정성에 기인한다. 결국 많은 연구 노력에도 불구하고 현재까지 JEV에 대한 유전학적으로 안정한 전체-길이의 감염성이 있는 cDNA 분자클론(molecular clone)은 합성이 되지 못한 실정이다(Mishin et al., Virus Res., 2001, 81, 113-123; Zhang et al., J. Virol. Methods, 2001, 96, 171-182; Sumiyoshi et al., J. Infect. Dis., 1995, 171, 1144-1151; Sumiyoshi et al., J. Virol., 1992, 66, 5425-5431).
이에, 본 발명자들은 한국에 존재하는 야생 모기로부터 분리한 한국형(Korean isolate) JEV를 사용하여 바이러스 게놈 RNA의 완전한(authentic) 전체-길이의 뉴클레오타이드 염기서열을 정확하게 밝히고, 상기 JEV 게놈 RNA에 대한 전체-길이의 감염성이 있는 cDNA를 합성함으로써 역상 유전자 시스템을 개발하였다. 이렇게 개발된 상기 감염성이 있는 JEV cDNA를 이용한 역상 유전자 시스템은 JEV 유전자 산물에 대한 기능, JEV의 자가복제, 신경침입성, 및 병원성에 관여하는 분자생물학적인 메카니즘을 밝히는데 유용하게 사용될 수 있으며, 또한 상기 감염성이 있는 JEV cDNA를 이형 유전자의 발현을 위한 벡터로 유용하게 사용할 수 있음을 밝힘으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 일본뇌염 바이러스의 신규한 게놈 RNA, 상기 게놈 RNA에 대한 감염성이 있는 cDNA, 및 상기 cDNA 또는 이들의 유도체를 이용하여 제조되는 새로운 유전자 발현 벡터를 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여,
1) 본 발명은 JEV 바이러스의 신규한 게놈 RNA를 제공한다.
2) 본 발명은 자가복제를 할 수 있는 JEV RNA 전사체를 생산할 수 있는 감염성이 있는 JEV cDNA를 제공한다.
3) 본 발명은 상기 전체-길이의 JEV 게놈 RNA에 대한 cDNA를 포함하는 벡터 를 제공한다.
4) 본 발명은 상기 JEV cDNA 벡터로부터 합성된 자가복제할 수 있는 RNA 전사체를 제공한다.
5) 본 발명은 상기 JEV cDNA 벡터로부터 합성된 RNA 전사체로 형질전환된 세포로부터 얻어진 재조합된 JEV 바이러스(recombinant JEV virus)를 제공한다.
6) 본 발명은 상기 JEV cDNA를 포함하는 JEV 발현 벡터를 제공한다.
7) 본 발명은 상기 JEV 발현벡터를 이용하여 이형 유전자(heterologous gene)를 발현시키는 다양한 방법을 제공한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
Ⅰ. 본 발명은 JEV 바이러스의 신규한 게놈 RNA를 제공한다.
본 발명의 한국형 JEV 게놈 RNA는 5'-비번역 부위, 폴리펩타이드 코딩 부위, 및 3'-비번역 부위로 구성된다.
상기에서, 게놈 RNA의 전체 길이는 10,968 bp이며, 95 bp로 이루어진 5'-비번역 부위, 10,299 bp로 이루어진 폴리펩타이드 코딩 부위, 및 574 bp로 이루어진 3'-비번역 부위로 구성되어있다.
본 발명의 바람직한 실시예에 따르면, 본 발명의 JEV 바이러스의 신규한 게놈 RNA는 서열번호 15로 기재되는 서열이다. 또한, 상기 서열번호 15로 기재되는 JEV 바이러스의 게놈 RNA와 98% 이상의 상동성이 있는 서열도 본 발명의 신규한 게놈 RNA에 포함된다.
본 발명의 한국형 JEV 바이러스는 한국형 일본뇌염 바이러스인 JEV K87P39 바이러스로부터 플라크 분리정제(plaque-purification) 기술을 이용하여 다시 분리 정제된 바이러스로서 "JEV CNU/LP2"라 명명하였다(도 1 참조).
본 발명자들은 한국형 일본뇌염 바이러스인 JEV CNU/LP2 바이러스의 전체-길이의 뉴클레오타이드 염기서열을 밝히기 위해서 긴 RT-PCR(long RT-PCR) 방법으로 바이러스의 5'-말단과 3'-말단을 제외한 나머지 부위를 세 개의 중첩되는 cDNA, JVF(nt 1-3865), JVM(nt 3266-8170), 및 JVR(nt 7565-10893) cDNA로 합성 및 증폭하여 각각 약 3.9 kbp(JVF), 약 4.9 kbp(JVM), 및 약 3.3 kbp(JVR)의 절편를 얻고 이에 대한 염기서열을 밝혔다(도 2의 A 참조).
바이러스 게놈 RNA의 3'-말단의 정확한 염기서열을 밝히기 위해서는 먼저 올리고뉴클레오타이드 T를 CNU/LP2 게놈 RNA의 3'-말단에 접합(ligation)시켜야 하며(도 2의 B 참조), 이때 올리고뉴클레오타이드 T는 cDNA 합성과 PCR 증폭시 필요한 특이한 프라이머 바인딩 자리를 제공한다(도 2의 B 참조). 아가로스 겔 전기영동을 통하여, 증폭된 산물은 대략 700 bp의 커다란 밴드와 대략 450 bp의 작은 밴드인 두 종류의 밴드로 이동함이 밝혀졌다(도 2의 C 참조). 두 밴드를 정제하고 클론시켰으며, 상기 크고 작은 밴드를 포함하는 10 내지 20개의 무작위로 선택된 클론을 각각 서열을 분석하였다. 염기서열을 분석한 결과, JEV 바이러스의 전체 염기서열이 밝혀진 대부분의 분리주의 경우에서 보고된 바와 같이, 본 발명자들 은 큰 삽입체(약 700 bp)를 가진 모든 클론들의 바이러스 게놈 RNA의 3'-말단이 -GATCT10968 로 끝난다는 것을 발견하였다. 반면에, 작은 삽입체(약 450 bp)를 가진 모든 클론들은 바이러스 RNA 게놈의 염기서열 10,684번째에서 종결되어 큰 밴드보다 284 bp가 작아진 것을 알 수 있었다. 작은 삽입체의 경우 바이러스 게놈 RNA의 3'-말단에 284 뉴클레오타이드를 포함하고 있지 않기 때문에, 전체-길이의 JEV cDNA 결합(assembly) 과정 동안 본 발명자들은 큰 삽입체의 뉴클레오타이드 염기서열을 사용하였다.
CNU/LP2 바이러스 게놈 RNA의 5'-말단의 정확한 염기서열을 밝히기 위해서 먼저 5'-말단에 존재하는 캡 구조를 토바코 산 피로포스페이트(tobacco acid pyrophosphatase)와 반응시켜 제거하였다. 이때, 캡 구조가 제거된 바이러스 게놈 RNA는 자가-접합(self-ligation)이 이루어지며, 접합된 3'-5' 부위는 바이러스 3'-말단 근처의 염기서열(nt 10259-nt 10276)에 상보적으로 결합하는 RT-PCR을 위한 양성-센스 프라이머와 바이러스 5'-말단 근처의 염기서열(nt 164-nt 181)에 상보적으로 결합하는 음성-센스 프라이머를 사용하여 cDNA를 합성하고 PCR 증폭하였다(도 2의 D 참조). 아가로즈 젤을 이용한 전기영동 결과, PCR로 증폭된 산물은 약 850 bp 크기의 단일 밴드로 나타났다(도 2의 E 참조). 이렇게 증폭된 앰플리콘(amplicon)들을 클로닝한 후, 무작위로 선별된 12개의 클론들의 염기서열을 분석한 결과, 12개의 모든 클론에서 바이러스 3'-말단 염기서열의 -GATCT10968
다음에 5'-말단의 염기서열 1AGAAGT-가 연결되어 있는 것을 알 수 있었다(도 2의 B 및 도 2의 C 참조).
상기 결과로부터, 본 발명자들은 서열번호 15로 기재되는 JEV CNU/LP2 분리주(isolate)의 완전한 전체-길이의 뉴클레오타이드 염기서열을 밝혔다. JEV CNU/LP2 게놈 RNA의 전체 길이는 10,968 bp 이며, 이것은 95 bp로 이루어진 5'-비번역 부위, 10,299 bp로 이루어진 폴리펩타이드 코딩 부위, 및 574 bp로 이루어진 3'-비번역 부위의 세 부위로 구성되어있다. 본 발명자들은 CNU/LP2 분리주의 상기 전체 염기서열을 진뱅크(GenBank) 데이터베이스에서 염기서열이 모두 밝혀져 있는 공지된 26개의 JEV 바이러스의 게놈 RNA(Ishikawa, K94P05, FU, CH2195LA, CH2195SA, RP-2ms, RP-9, CH1392, T1P1, YL, JaGAr01, HVI, TC, TL, Beijing-1, Ling, Vellore P20778, p3, SA14-14-2, SA(A), SA14-12-1-7, SA14-2-8, SA14, SA(V), GP78, 및 JaOArS982 바이러스주)의 전체-길이의 뉴클레오타이드 염기서열과 비교하였다. 비교분석에 사용된 바이러스주에 대한 분리지역, 분리연도, 출처, 및 진뱅크 접근번호(GenBank accession number)에 관한 정보를 하기에 요약하였다(표 1 참조).
| 위치 | 연도 | 균주 | 출처(source) | 진뱅크 기탁번호 |
| 오스트레일리아 | 1995 | FU | 인간 혈청 | AF217620 |
| 중국 | 1954 | SA14 | 모기 | U14163 |
| SA14-14-2 | SA14 유도체 | AF315119 | ||
| SA14-12-1-7 | SA14 유도체 | AF416457 | ||
| SA14-2-8 | SA14 유도체 | U15763 | ||
| SA(V) | SA14 유도체 | D90194 | ||
| SA(A) | SA14-14-2 유도체 | D90195 | ||
| 1949 | Beijing-1 | 인간의 뇌 | L48961 | |
| 1949 | p3 | 모기 | U47032 | |
| 인도 | 1978 | GP78 | 인간의 뇌 | AF075723 |
| 1958 | Vellore P20778 | 인간의 뇌 | AF080251 | |
| 일본 | 1982 | JaOArS982 | 모기 | M18370 |
| IU | Ishikawa | IU | AB051292 | |
| 1959 | JaGAr01 | 모기 | AF069076 | |
| 한국 | 1994 | K94P05 | 모기 | AF045551 |
| 1987 | CNU/LP2 | 모기 | 본 발명 | |
| 대만 | 1997 | T1P1 | 모기 | AF254453 |
| 1994 | CH2195LA | CH2195 유도체 | AF221499 | |
| 1994 | CH2195SA | CH2195 유도체 | AF221500 | |
| 1990 | CH1392 | 모기 | AF254452 | |
| 1985 | RP-2ms | 모기 | AF014160 | |
| 1985 | RP-9 | 모기 | AF014161 | |
| 1965 | Ling | 인간의 뇌 | L78128 | |
| IU | YL | IU | AF486638 | |
| IU | TC | 모기 | AF098736 | |
| IU | TL | 모기 | AF098737 | |
| IU | HVI | 모기 | AF098735 |
IU : 정보가 없음
다른 JEV 균주의 뉴클레오타이드 염기서열을 비교한 결과, JEV 분리주 CNU/LP2 게놈은 이들 게놈과 각각 89.0%(Ishikawa), 89.1%(K94P05), 89.3%(FU), 95.8%(CH2195LA), 95.9%(CH2195SA), 97.1%(RP-2ms), 97.2%(RP-9), 97.3%(CH1392), 97.3%(T1P1), 97.0%(YL), 97.4%(JaGAr01), 97.1%(HVI), 96.9%(TC), 96.7%(TL), 96.4%(Beijing-1), 96.3%(Ling), 96.0%(Vellore P20778), 97.1%(p3), 97.4%(SA14-14-2), 97.5%(SA(A)), 97.5%(SA14-12-1-7), 97.7%(SA14-2-8), 97.9%(SA14), 97.9%(SA(V)), 96.3%(GP78), 및 97.1%(JaOArS982)의 상동성을 가진다(표 2 참조). 따라서, 본 발명의 서열번호 15로 기재되는 염기서열과 98% 이상의 상동성을 가지는 JEV 바이러스의 게놈 RNA의 염기서열은 본 발명의 권리범위에 속한다.
본 발명의 염기서열은 JEV 폴리펩타이드 코딩 부위이외에도 바이러스의 자가복제, 전사, 및 번역을 조절하는 시스-작용성(cis-acting) 인자들을 가지고 있는 5'-비번역 부위와 3'-비번역 부위의 정확한 염기서열을 분자생물학적 실험방법으로 밝혔다. 이는 몇몇 연구에서 5'-말단 및 3'-말단 부위 모두가 시험관내(You and Padmanabhan, J. Biol. Chem., 1999, 274, 33714-33722) 및 생체내(Khromykh et al., J. Virol., 2001, 75, 6719-6728) 플라비바이러스(flavivirus) RNA 복제의 개시에 요구된다는 것이 알려져 있기 때문에 매우 중요한 의미를 가진다. 특히, 본 발명에서 JEV CNU/LP2의 5'-말단 및 3'-말단의 염기서열로 밝혀진 1AGAAGT- 및 -GATCT10968 은 상기 바이러스의 자가복제에 중요한 역할을 할 것으로 생각된다.
본 발명자들은 상기에서 밝혀진 JEV의 완전한 전체-길이의 염기서열을 가진 합성 RNA 전사체(synthetic RNA transcript)로 세포를 형질전환시켰을 때, 감염성이 있는 합성된 JEV(synthetic JEV) 바이러스가 생산됨을 하기에서 실험적으로 증명함으로써, JEV가 자가복제시 필요한 완전한(complete) 전체-길이의 염기서열을 기능적인 측면에서 세계 최초로 입증하였다.
Ⅱ. 본 발명은 자가복제를 할 수 있는 JEV RNA 전사체를 생산할 수 있는 감염성이 있는 JEV cDNA를 제공한다.
본 발명의 감염성이 있는 JEV cDNA는 서열번호 15로 기재되는 염기서열 또는 서열번호 15와 98% 이상의 상동성이 있는 전체-길이의 JEV 게놈 RNA의 염기서열을 토대로 합성되며, 시험관내 전사(in vitro transcription)를 통해서 자가복제를 할 수 있는 JEV RNA 전사체를 합성하는 데 주형(template)으로 사용된다. 본 발명의 전체-길이의 JEV cDNA는 먼저 5'-말단 및 3'-말단을 포함하는 바이러스 게놈 RNA를 RT-PCR에 의하여 여러 개의 중첩하는 cDNA로 증폭시킨 후 이들을 연결함으로써 제조된다.
시험관내 런-오프(run-off) 전사 반응을 통해 전체-길이의 합성 JEV RNA 전사체를 생산하기 위해서 JEV 게놈 RNA의 5'-말단 바로 앞에 SP6 또는 T7 프로모터 염기서열부위를 포함하고, JEV 게놈 RNA의 3'-말단 바로 뒤에 런-오프 자리를 인위적으로 만들 수 있도록 바이러스 게놈 RNA에 존재하지 않는 유일한 제한효소 인식 염기서열을 포함한다(도 3의 A 참조). 본 발명에서는 바람직한 실시예로써 JEV 게놈 RNA에 해당하는 세 개의 중첩하는 cDNA(JVF, JVM 및 JVR), SP6 또는 T7 프로모터 염기서열을 포함한 5'-말단부위, 및 런-오프 자리로써 XhoI과 XbaI 인식염기서열를 포함한 3'-말단부위에 해당하는 두 개의 cDNA을 이용하여 3개의 SP6-유도된(driven) 전체-길이의 JEV cDNA 와 3개의 T7-유도된(driven) 전체-길이의 JEV cDNA를 각각 제조하였다(도 3의 B 및 도 3의 C 참조). 그러나, 상기 두 가지 프로모터 이외에도 다른 프로모터를 사용할 수 있음은 당업계에 종사하는 사람에게 있어서 자명하다. 또한, 본 발명에서 개발된 전체-길이의 JEV cDNA는 런-오프 자리로써 XhoI과 XbaI를 사용하였지만, 이외에도 다른 제한효소를 사용할 수 있음은 당업계에 종사하는 사람에게 있어서 자명하다.
본 발명의 JEV cDNA 클론은 BAC(bacterial artificial chromosome)인 pBeloBAC11 플라스미드를 벡터로 사용하여 상기와 같이 여러 개의 중첩하는 cDNA를 포함하는 서브클론(subclone)을 제조한 후 이들을 서로 연결함으로써 전체-길이의 JEV cDNA를 제공한다.
본 발명자들은 바람직한 실시예에서 SP6 프로모터를 가지며 서열번호 43, 서열번호 44, 및 서열번호 45로 기재되는 JEV cDNA와 T7 프로모터를 가지며 각각 서열번호 46, 서열번호 47, 및 서열번호 48로 기재되는 JEV cDNA를 제공한다(도 3의 B 및 도 3의 C 참조). 모든 경우에 있어 런-오프 전사반응 이후에 바이러스 게놈의 3' 말단이 완전함을 입증하기 위하여, 본 발명자들은 바이러스 게놈의 말단에 Xho I 또는 Xba I의 독특한 제한효소 인식부위를 삽입시켰다(도 3의 B 또는 도 3의 C 참조).
Ⅲ. 본 발명은 상기 전체-길이의 JEV 게놈 RNA에 대한 cDNA를 포함하는 벡터를 제공한다.
본 발명의 벡터는 상기 JEV 전체-길이의 감염성이 있는 cDNA를 포함하는 것을 특징으로 한다. 본 발명의 바람직한 실시예에서는 SP6 프로모터를 가지며 서열번호 43, 서열번호 44, 및 서열번호 45로 기재되는 JEV cDNA를 포함하는 pBACSP6/JVFL/XhoI, pBACSP6/JVFLx/XhoI, pBACSP6/JVFLx/
XbaI 및 T7 프로모터를 가지며 서열번호 46, 서열번호 47, 및 서열번호 48로 기재되는 pBACT7/JVFL/XhoI, pBACT7/JVFLx/XhoI, pBACT7/JVFLx/XbaI 벡터를 제공한다. 본 발명자들은 상기 벡터 중에서 가장 효율이 좋은 pBACT7/JVFLx/XbaI 및 pBACSP6/JVFLx/XbaI을 2002년 10월 2일 자로 한국생명공학연구원 유전자은행에 기탁하였다(수탁번호 : KCTC 10346BP, KCTC 10347BP).
Ⅳ. 본 발명은 상기 JEV cDNA 벡터로부터 합성된 자가복제할 수 있는 RNA 전사체를 제공한다.
시험관내 런-오프 전사반응의 경우, 주형(template)으로 사용되는 JEV cDNA는 상기에서 기술한 것과 같이 바이러스 게놈의 3'-말단 바로 뒤에 런-오프 자리로써 엔지니어링한 XhoI 또는 XbaI 제한효소의 절단(digestion)에 의하여 선형화된다(도 3 참조). XhoI의 처리에 의하여 선형화된 두 가지 플라스미드(pBACSP6/JVFL/XhoI와 pBACSP6/JVFLx/XhoI)는 m7G(5')ppp(5')A 캡 구조 유사체의 존재하에서 SP6 폴리머라제 런-오프 전사반응을 통해서, 5'-말단에 캡 구조를 가지는 동시에 3'-말단에 바이러스와 연관되지 않은 세 개의 뉴클레오타이드 CGA를 가진 합성 RNA 전사체를 생산하는 데 주형으로 사용된다(도 3의 B 참조). 이것은 Xho I의 절단에 의하여 남겨진 5' 돌출부위를 복제한 결과이다. 이와 유사하게, XbaI-선형화된 pBACSP6/JVFLx/XbaI 플라스미드는 m7G(5')ppp(5')A 캡 구조 유사체의 존재하에서 SP6 폴리머라제 런-오프 전사반응을 통해서, 5'-말단에 캡 구조를 가지는 동시에 3'-말단에 바이러스와 연관되지 않은 네 개의 뉴클레오타이드 CTAG를 가진 합성 RNA 전사체를 생산하는 데 주형으로 사용된다(도 3의 B 참조).
본 발명자들은 합성된 JEV RNA 전사체의 특이적 감염성(specific infectivity)을 정량하기 위하여, 감염 센터 분석(infectious center assay)을 실시하였다. 그 결과, 합성된 RNA 전사체로 수용성(susceptible) BHK-21 세포를 형질전환시켰을 때, 모두 높은 감염성(3.4-4.3 x 105 PFU/㎍)을 나타내었다(표 3 참조). 이와 마찬가지로, T7 프로모터를 가지는 세 개의 전체-길이의 JEV cDNA pBACT7/JVFL/XhoI, pBACT7/JVFLx/XhoI, 및 pBACT7/JVFLx/
XbaI을 주형으로 사용하여 m7G(5')ppp(5')A 캡 구조 유사체의 존재하에서 T7 폴리머라제 런-오프 전사반응을 통해서 합성한 RNA 전사체도 높은 특이적 감염성(2.9-3.8 x 105 PFU/㎍)을 나타내었다(표 3 참조).
어떤 플라비바이러스의 경우, 감염성이 있는 cDNA로부터 전사된 합성 RNA의 3'-말단에 바이러스와 연관되지 않은 뉴클레오타이드 염기서열이 존재하면 합성된 RNA의 특이적 감염성이 감소되거나 또는 없어진다(abrogate)는 것이 보고되었다(Yamshchikov et al., Virology, 2001, 281, 294-304). 상기 보고에 근거하여, 본 발명자들은 JEV cDNA로부터 JEV의 3'-말단에 바이러스와 연관되지 않은 뉴클레오타이드 염기서열이 존재하지 않는 합성된 RNA 전사체를 제조하고 이들의 특이적 감염성을 비교하였다. 구체적으로, 본 발명자들은 전사반응에 앞서서, Xba
I 처리에 의하여 선형화된 pBACsp6/JVFLx/XbaI 플라스미드를 MBN(mung bean nuclease; 녹두 뉴클레아제)으로 처리함에 의하여 바이러스와 연관되지 않은 서열이 결실된 합성 RNA를 제조하였다. MBN 활성을 입증하기 위하여, Xba I 처리에 의하여 선형화되고 MBN으로 처리된 pBACSP6/JVFLx/XbaI plasmid는 자가-접합(self-ligation)되고, 이것의 바이러스 3' 말단의 서열을 분석한 결과 네 개의 불필요한 뉴클레오타이드인 CTAG가 제거되었음이 밝혀졌다. Xba I 처리에 의하여 선형화되고 MBN으로 처리된 pBACSP6/JVFLx/XbaIMBN(도 3의 B 참조) 및 pBACT7/JVFLx/
XbaIMBN(도 3의 C 참조)로부터 RNA 전사체는 모두 MBN으로 처리하지 않은 전사체와 비교하여 특이적 감염성이 증가하였다. 그 결과, MBN으로 처리된 pBACSP6/JVFLx/XbaIMBN cDNA 주형으로부터 전사된 RNA의 특이적 감염성은 3.1×106 PFU/㎍으로 측정되었는데, 이것은 MBN으로 처리되지 않은 pBACSP6/JVFLx/XbaI cDNA 주형으로부터 전사된 RNA의 특이적 감염성인 3.4×105 PFU/㎍보다 약 10배나 높은 것이다(표 3 참조, infectivity). 또한, pBACT7/JVFLx/XbaIMBN cDNA로부터 합성된 RNA도 MBN 처리 이후에 증가된 감염성을 보였다(2.7×106 PFU/㎍)(표 3 참조, infectivity). 따라서, 본 발명자들은 높은 감염성을 가진 합성된 JEV RNA 전사체를 생산하기 위해서는 JEV 게놈 RNA에 완전한(authentic) 3'-말단이 존재해야함을 확인하였다. 그러므 로, 본 발명의 감염성이 있는 JEV cDNA 클론은 105-106 PFU/㎍의 높은 특이적 감염성을 가지는 합성된 RNA 전사체를 생산하는 런-오프 전사반응을 위한 주형으로 사용될 수 있다.
이러한 전체-길이의 감염성이 있는 JEV cDNA를 조합하기 위한 이전 시도들의 경우(Mishin et al., Virus Res., 2001, 81, 113-123; Zhang et al., J. Virol. Methods, 2001, 96, 171-182; Sumiyoshi et al., J. Infect. Dis., 1995, 171, 1144-1151; Sumiyoshi et al., J. Virol., 1992, 66, 5425-5431), 클로닝된 JEV cDNA의 유전적 불안정성으로 인하여 모두 실패하였다. 이러한 문제를 극복하기 위하여, 주형이 두 개의 중첩하는 JEV cDNA를 시험관내 접합시켜 제조되는 시스템을 이용한 연구가 시도되었다(Sumiyoshi et al., J. Virol., 1992, 66, 5425-5431). 이후에, 상기 주형을 시험관내 감염성이 있는 RNA 전사체를 합성하기 위하여 사용하였다. 그러나, 이들 전사체의 특이적 감염성은 약 100 PFU/㎍으로 바이러스의 분자생물학적 및 유전학적 분석을 위하여 상기 시스템을 유용하게 사용하기에는 너무 낮은 감염성이다(Sumiyoshi et al., J. Virol., 1992, 66, 5425-5431).
본 발명에서는 E. coli에서 하나 내지 두 카피씩 유지되는 BAC 플라스미드에 JEV cDNA를 클로닝함으로써 유전자의 불안정성을 극복할 수 있었다. 이렇게 합성된 감염성이 있는 JEV cDNA 플라스미드의 유전적 구조 및 기능은 적어도 E. coli에서 증식되는 180 세대동안은 안정하게 유지되었다(도 7 참조). 따라서, 본 발명자 들은 BAC(bacterial artificial chromosome)을 도입함으로써 전체-길이의 감염성이 있는 cDNA의 합성시 발생하는 JEV cDNA의 유전학적 불안정성을 극복할 수 있었으며, 또한 합성된 감염성이 있는 JEV cDNA를 안정하게 다룰 수 있게 되었다.
전체-길이의 감염성이 있는 JEV cDNA를 주형으로 사용하여 시험관내 전사반응을 통해서 완전한(authentic) 5'-말단 및 3'-말단을 가지는 JEV 합성 RNA 전사체를 합성할 수 있다는 것은 매우 중요한 의미를 가지는데, 그 이유는 몇몇 연구에서 5'-말단 및 3'-말단 부위 모두가 시험관내(You and Padmanabhan, J. Biol. Chem., 1999, 274, 33714-33722) 및 생체내(Khromykh et al., J. Virol., 2001, 75, 6719-6728) 플라비바이러스 RNA 복제의 개시에 요구된다는 것이 알려져 있기 때문이다. 이러한 목적을 달성하기 위하여, 본 발명자들은 다른 플라비바이러스의 감염성이 있는 cDNA를 합성할 때 사용된 방법을 응용하였다(van der Werf et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1986, 83, 2330-2334; Rice et al., New Biol., 1989, 1, 285-296). JEV 게놈 RNA에 존재하는 캡 구조는 다이뉴클레오타이드인 AG와 연결되며, 이것은 플라비바이러스에서 매우 보존된 특성이다(Rice, Flaviviridae: The viruses and their replication, 1996, 931-960, Lippincott-Raven Publisher). 5'-말단의 완전함(authenticity)은 SP6 또는 T7 프로모터 전사 출발에 필요한 뉴클레오타이드 염기서열을 바이러스 게놈의 시작부위에 위치시킴으로써 확보되었다. SP6 또는 T7 폴리머라제에 의한 전사 반응에 있어서 m7G(5')ppp(5')A 캡 구조 유사 체를 도입함으로써(Contreras et al., Nucleic Acids Res., 1982, 10, 6353-6362), 본 발명자들은 수용성 세포내로 트랜스펙션(transfection)에 의하여 높은 감염성을 가지며 완전한 5'-말단 및 캡 구조를 가지는 RNA 전사체를 합성하였다. 아울러, SP6 또는 T7 폴리머라제-유도 전사 반응에서 m7G(5')ppp(5')G 캡 구조 유사체를 도입함에 의하여(Contreras et al., Nucleic Acids Res., 1982, 10, 6353-6362), 다이뉴클레오타이드 AG 상부에 바이러스와 연관되지 않은 추가적인 G 뉴클레오타이드를 위치시킨다. 종래에 보고된 바와 같이(Rice et al., New Biol., 1989, 1, 285-296), 본 발명자들도 추가된 뉴클레오타이드가 생성된 JEV 자손(recovered JEV progeny)의 게놈 RNA로부터 상실됨을 확인하였다. 아울러, 추가적인 G 뉴클레오타이드를 첨가한 경우에도 본 발명자들은 감염성이 있는 cDNA 주형으로부터 전사된 합성 RNA의 특이적 감염성 또는 자가복제 능력이 변화되지 않는다는 것을 관찰하였다.
JEV RNA의 3'-말단에 위치하는 다이뉴클레오타이드 CT는 플라비바이러스에서 절대적으로 보존되어 있다(Rice, Flaviviridae: The viruses and their replication, 1996, 931-960, Lippincott-Raven Publisher). 이것은 상기 다이뉴클레오타이드 CT가 바이러스의 자가복제에 있어서 매우 중요하며, 감염성이 있는 cDNA로부터 생산된 RNA 전사체는 완전한 3'-말단을 가지고 있어야 한다는 것을 제시한다. 따라서, 본 발명자들은 합성된 RNA 전사체가 완전한 3'-말단을 가지고 종결될 수 있는 방법으로 JEV에 대한 역상 유전자 시스템을 디자인하였다. 실제로 본 발명자들은 바이러스와 연관되지 않은 3개 또는 4개의 뉴클레오타이드를 3'-말단에 가지고 있는 RNA 전사체보다 완전한 3'-말단을 가지는 RNA 전사체의 특이적 감염성이 약 10배 더 높다는 것을 확인하였다.
Ⅴ. 본 발명은 상기 JEV cDNA 벡터로부터 합성된 RNA 전사체로 형질전환된 세포로부터 얻어진 재조합된 JEV 바이러스(recombinant JEV virus)를 제공한다.
본 발명에서는 상기 JEV 전체-길이의 감염성이 있는 cDNA로부터 합성된 JEV RNA 전사체로 형질전환된 세포로부터 합성된 JEV(synthetic JEV) 바이러스가 생산된다. 형질전환된 세포들은 JEV 바이러스의 감염에 의해 유도되는 강한 세포변성효과(cytopathic effect)를 보여주며, 상기 형질전환된 세포로부터 얻어진 합성 JEV(synthetic JEV)바이러스들은 플라크의 형태(plaque morphology), 세포병원성(cytopathogenicity), 성장 패턴, 바이러스 단백질의 발현, 및 바이러스 RNA 합성의 관점에서 최초의 모 바이러스(parental virus)인 CNU/LP2 바이러스와 구별할 수 없었다(도 5 참조). 또한, JEV cDNA 상의 특정 부위에 위치지정 돌연변이(site-directed mutation)를 유도하여 E. coli에서 감염성이 있는 JEV cDNA를 분자 유전학적으로 조작함으로써 재조합 바이러스 돌연변이체가 제조될 수 있다. 따라서, 본 발명의 감염성이 있는 JEV cDNA를 이용한 역상 유전자 시스템은 JEV 게놈의 복제 메카니즘에 대한 유전자 분석 연구에 유용하게 사용될 수 있다.
Ⅵ. 본 발명은 상기 JEV cDNA를 포함하는 JEV 발현 벡터를 제공한다.
본 발명은 다양한 세포 형태에서 JEV cDNA의 신규한 발현벡터로 사용될 수 있는 용도를 제공한다.
최근에 RNA 바이러스의 일원인 알파바이러스(alphavirus)는 다양한 널리 사용되는 동물세포에서 복제된다는 장점 때문에 세포배양 및 생체내에서 포유동물세포 발현벡터로 성공적으로 개발되어 사용되어 왔다(Agapov et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1998, 95, 12989-12944; Frolov et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1996, 93, 11371-11377; Schlesinger, Trends Biotechnol., 1993, 11, 18-22). 알파바이러스와 같이, JEV도 또한 인간, 마우스, 원숭이, 돼지, 및 햄스터로부터 유래된 다양한 종류의 제 1(primary) 및 연속된 세포배양에서 자가복제할 수 있음이 보고된 바 있다(Burke and Monath, Flaviviruses, 2001, 1043-1125, Lippincott Williams & Wilkins Publishers). 이러한 성질은 JEV가 다양한 다른 세포에서 이형 유전자 발현벡터로 유용하게 사용될 수 있음을 뜻한다. 즉, 전체-길이의 감염성이 있는 JEV cDNA를 발현벡터로써 사용하여 이형 유전자를 JEV cDNA상에 삽입하면, 이형 유전자가 포함된 RNA 전사체가 시험관내 전사반응과정을 통해서 생성된다. 이들 전사체로 세포를 형질전환시켰을 때 자가복제할 수 있으므로, 다량의 외래 단백질을 제조할 수 있다.
이형 유전자를 발현하기 위한 발현 카세트는 JEV 3'NTR 시작부위에 삽입하는 것이 바람직하다. 이형 유전자 발현 카세트를 JEV 3'NTR 시작부위에 삽입한 이유는 CNU/LP2 뿐만 아니라 전체 염기서열이 밝혀진 세 개의 JEV 바이러스주(Williams et al., J. Gen. Virol., 2000, 81, 2471-2480; Nam et al., Am. J. Trop. Med. Hyg., 2001, 65, 388-392; Jan et al., Am. J. Troop. Med. Hyg., 1996, 55, 603-609)에서, 9-25 bp의 작은 결실이 바이러스 3'NTR 시작부위에서 관찰되었는데, 이것은 상기 부위가 외래 유전자를 삽입시키기 위한 좋은 부위가 될 수 있음을 제시하기 때문이다. 따라서, 본 발명에서 개발된 감염성이 있는 JEV cDNA는 포유동물세포를 포함한 다양한 종류의 세포에서 원하는 이형 유전자의 신속한 발현을 위한 발현벡터로 유용하게 사용될 수 있다.
Ⅶ. 본 발명은 상기 JEV 발현벡터를 이용하여 이형 유전자(heterologous gene)를 발현시키는 다양한 방법을 제공한다.
발현벡터의 기능은 이형 유전자의 발현을 위하여, 세포 내로 목적하는 이형 유전자를 전달하는 것이다. 본 발명에서, 전체-길이의 감염성이 있는 JEV cDNA는 포유동물 세포를 포함하는 다양한 세포 형태에서 이형 유전자 발현벡터로 사용될 수 있음을 입증하였다.
또한, 본 발명에서는 BAC(Yun et al., J. Virol., 2003, 77, 6450-6465)로서 작용하는 전체-길이의 감염성이 있는 JEV cDNA에 기초한 이형 유전자의 발현 시스템을 설명하고 있다. 일시적 발현 시스템으로서, JEV는 (ⅰ) 빠르게 바이러스의 높은 역가를 생성한다, (ⅱ) 상기 바이러스는 곤충 및 포유동물 세포 형태를 포함하는 다양한 숙주세포를 감염시킬 수 있다, (ⅲ) 유전적으로 안정한 감염성이 있는 cDNA가 이용가능하고 쉽게 조작가능하다, 그리고 (ⅳ) RNA 게놈의 세포질 복제는 숙주 게놈내로 삽입될 가능성이 적고 따라서 바람직하지 못한 돌연변이가 잘 일어나지 않는다는 장점을 제공한다.
본 발명자들은 JEV에 기초한 시스템이 세 가지 다른 방식으로 외래 유전자를 발현하는데 사용될 수 있음을 입증하였다. 하나는 외래 유전자를 포함한 감염성이 있는 재조합 벡터 RNA/바이러스에 관한 것이고, 두 번째는 바이러스 복제는 가능하지만 다른 세포로 전파 능력은 결여된 JEV 바이러스 레플리콘 벡터 RNA의 생성에 관한 것이다. 세 번째는 바이러스 레플리콘 입자(VRP) 형성을 위한 패키징 시스템의 용도에 관한 것이다. 따라서, 본 발명에서는 JEV 시스템이 다양한 포유동물 세포 형태에서 목적하는 외래 유전자를 빠르게 발현시키는 JEV 바이러스/감염성이 있는 RNA/레플리콘 RNA/VRP 벡터를 생성하는데 사용될 수 있음을 나타내었다.
본 발명의 감염성이 있거나 레플리콘 JEV cDNA 벡터를 사용하여 이형 유전자를 발현시키는 기본적 방법은
1) 감염성이 있거나 레플리콘 JEV cDNA 발현벡터에 이형 유전자를 삽입시켜 재조합된 JEV cDNA 발현벡터를 제조하는 단계;
2) 상기 재조합된 JEV cDNA 발현벡터로부터 JEV RNA 전사체를 제조하는 단계;
3) 상기 JEV RNA 전사체로 숙주세포를 형질전환시켜 형질전환체를 제조하는 단계; 및
4) 상기 형질전환체를 배양하여 외래 단백질을 발현시키는 단계로 구성된다.
본 발명자들은 상기에서 기술한 방법으로 GFP(green fluorescent protein; 녹색형광 단백질), EGFP(enhanced version of GFP; 증진된 GFP 단백질), LUC(luciferase; 루시페라제), 및 LacZ 유전자 및 항생제 퓨로마이스(puromycin)에 대한 저항성을 부여하는 우성의 선택 마커인 PAC(puromycin N-acetyltransferase; 퓨로마이신 N-아세틸트랜스퍼라제)를 발현하는 전체-길이의 감염성이 있는 재조합 JEV cDNA를 제조하였다(도 8 및 도 9 참조). 이렇게 재조합된 JEV cDNA로부터 전사된 JEV RNA 전사체로 BHK-21 세포를 형질전환시켰다. GFP, EGFP, LUC, LacZ 및 PAC 발현을 도 8 및 도10에 제시한다. 아울러, 상기 이형 유전자를 포함하는 재조합 감염성이 있는 JEV 바이러스 입자를 배양 상등액으로부터 제조하였다. 추가적으로 일반적으로 생명과학 및 의학분야에서 많이 사용되는 다양한 동물 세포주(BHK-21, Vero, NIH/3T3, ST, HeLa, MDCK, CRFK, B103, 및 SHSY-5Y)를 재조합 바이러스로 감염시켜서 상기 이형 유전자의 발현을 연구하였다. 그 결과, 바이러스 게놈 RNA에 삽입된 GFP 또는 LUC 유전자는 테스트한 모든 종류의 세포에서 발현되었다(표 4 참조). 따라서, 재조합된 JEV cDNA, JEV RNA 전사체, 및 재조합된 JEV 바이러스 입자는 다양한 종류의 세포 형태에서 외래 이형 유전자의 발현을 위한 벡터로써 유용하게 사용될 수 있음을 확인하였다.
JEV RNA 복제 기구를 사용하여 외래 유전자를 독립적으로 발현시키기 위하여, 본 발명자들은 엄격한 안전 기준을 충족시키는 바이러스 구조 유전자의 하나, 둘 또는 모든 유전자를 결실시켜서 자가복제 가능한 자가-제한된 바이러스 레플리콘의 패널을 제조하였다(도 11의 A 참조). 이들 바이러스 레플리콘은 RNA 트랜스펙션(transfection)시에 복제 및 유전자 발현을 시작할 수 있었다(도 11의 B 및 도 11의 C 참조).
JEV 레플리콘-기초한 발현벡터의 이용은 트랜스 작용시에 모든 JEV 바이러스 구조 단백질(C, prM, 및 E)을 연속적으로 발현시키는 안정한 레플리콘 PCL(packaging cell line; 패키징 세포주)의 패널을 개발함에 의하여 더욱 정교화되었다(도 12 참조). 이들 PCL은 JEV 바이러스 레플리콘의 효율적인 패키징의 트랜스-보완(complementation)을 가능하게 하였다. 그러므로, 이들 PCL은 JEV 바이러스 레를리콘의 도입시에 효율적으로 높은 역가의 바이러스 VRP를 생성하는데 사용될 수 있음을 나타낸다(도 12 참조).
또한, 본 발명자들은 3 kb까지 이형 유전자를 포함할 수 있는 감염성이 있는 JEV 재조합 바이러스 RNA가 바이러스 입자내로 패키징될 수 있음을 나타내었다. JEV/Rep/ΔC+ΔprM+ΔE 및 JEV/Rep/NS1와 같은 JEV 바이러스 레플리콘 벡터를 선택한다면, 적어도 5 kb의 외래 유전자를 JEV VRP내로 패키징시킬 수 있다고 측정되었다. JEV 비리온(virion) 내에 패키징될 수 있는 외래 유전자의 크기 제한을 조사하는 것은 중요하다. 코딩 서열이 대략 4.5 kb인 포낭 섬유증 막투과 전도성 조절인자(cystic fibrosis transmembrane conductance regulator)(Flotte et al., J. Biol. Chem., 1993, 268, 3781-3790)와 같은 길이가 긴 유전자를 발현하기 원한다면 이것은 중요한 문제일 수 있다. 아울러, 두 개 또는 그 이상의 발현 단위를 추가하고자 한다면, JEV 바이러스 레플리콘의 커다란 패키징 능력은 유용할 것이다(Thiel et al., J. Virol., 2003, 77, 9790-9798; Agapov et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1998, 95, 12989-12994). 아데노-연관 바이러스에 기초한 벡터(adeno-associated virus-based vector)의 경우에는 본래의 크기 제한을 우회하여 패키징 능력을 확장시켰고(Duan et al., Nat. Med., 2000, 6, 595-598; Yan et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97, 6716-6721), 이것은 유사한 방식으로 JEV 바이러스 레플리코의 패키징 능력을 확장시키는 것이 가능함을 나타낸다.
또한 다른 RNA 바이러스-유도 벡터(Agapov et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1998, 95, 12989-12994; Pushko et al., Virology, 1997, 239, 389-401; Berglund et al., Nat. Biotechnol., 1998, 16, 562-565; Basak et al., J. Interferon Cytokine Res., 1998, 18, 305-313; Barclay et al., J. Gen. Virol., 1998, 79, 1725-1734; Khromykh and Westaway, J. Virol., 1997, 71, 1497-1505; Molenkamp et al., J. Virol., 2003, 77, 1644-1648; Shi et al., Virology, 2002, 296, 219-233; Varnavski and Khromykh, Virology, 1999, 255, 366-375; Perri et al., J. Virol., 2000, 74, 9802-9807; Curtis et al., J. Virol., 2002, 76, 1422-1434)에서와 같이, 본 발명자들은 일본뇌염바이러스의 구조 단백질이 알파바이러스에 기초한 발현 시스템을 사용하여 트랜스 작용으로 제공될 때 패키징될 수 있는 다양한 JEV 바이러스 레플리콘 벡터 RNA를 엔지니어링할 수 있었다(Agapov et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1998, 95, 12989-12994). 따라서, 본 발명에서는 생물학적으로 안전한 JEV 벡터를 효율적으로 생성할 수 있는 패키징 시스템을 명확하게 입증하였다. 알파바이러스(Frolova et al., J. Virol., 1997, 71, 248-258; White et al., J. Virol., 1998, 72, 4320-4326) 및 레트로바이러스(Rein, Arch. Virol. Suppl., 1994, 9, 513-522)와 달리, JEV를 포함한 플라비바이러스에 의해 이용되는 패키징 신호에 관하여는 거의 알려져 있지 않다. JEV에 대한 본 발명의 트랜스-보완 시스템(trans-complementation system)은 전체 JEV 구조 부위가 패키징에 별다른 역할을 하지 못한다는 증거를 제시한다. 따라서, 상기 시스템은 JEV RNA에서 패키징 신호와 RNA의 단백질막화(encapsidation) 및 형태형성(morphogenesis)과 연관된 구조 단백질 부위를 규명하는데 유용할 것이다. 추가적으로 상기 정보는 본 발명의 JEV 발현 시스템의 유용성을 증진시킬 것이다.
요약하면, 본 발명의 전체-길이의 JEV 게놈 RNA 및 상기 게놈 RNA에 대한 감염성이 있는 JEV cDNA는 신경침입성(neurovirulence) 및 병원성에 관여하는 JEV 유전자를 동정하는 것뿐만 아니라, JEV의 복제, 전사 및 번역에 관련된 분자생물학적인 메카니즘의 연구에 사용될 수 있다. 또한 일본 뇌염의 치료제, 치료용 또는 예방용 백신, 진단시약 및 진단용 기구 등의 개발에도 유용하게 사용될 수 있고, 아울러 진핵세포에서 이형 유전자의 발현 벡터로 유용하게 사용될 수 있다. 또한, 전체-길이의 JEV 게놈 RNA 및 감염성이 있는 JEV cDNA는 일본 뇌염의 치료제, 백 신, 진단시약 및 진단키트, 및 또한 진핵세포내 목적하는 이형 유전자의 발현벡터의 개발을 위하여 효과적으로 사용될 수 있다. 아울러, DNA 면역 및 일시적 유전자 치료를 위하여, 본 발명에서 설명된 JEV 벡터 시스템은 시험관내 조건 및 생체내 조건에서 외래 유전자를 세포내로 운송할 수 있는 유망한 시스템이다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> JEV 바이러스의 분리
<1-1> 사용한 세포주 및 바이러스
BHK-21 세포주는 로크펠러 대학의 찰스 엠 라이스(Charles M. Rice) 박사로부터 제공받았으며, 10% fetal bovine serum(FBS), 2 mM L-글루타민, 비타민 및 항생제를 포함하는 α-MEM(minimum essential medium)에서 배양 유지되었다. 세포의 배양에 사용되는 모든 시약들은 Gibco/BRL 사(Gibco/BRL Life Technologies, Inc., Gaithersburg, MD)로부터 구입하였다. JEV의 한국분리주인 K87P39(Chung et al., Am. J. Trop. Med. Hyg., 1996, 55, 91-97)는 국립보건원(Korean National Institute of Health)으로부터 분주받았다. JEV K87P39 바이러스주는 1987년 한국의 야생 모기로부터 분리된 것이며 새끼(suckling) 마우스의 뇌에서 5차례 계대배양(passage) 되었다. 황열병 바이러스(yellow fever virus) YF17D 바이러스주는 감염성이 있는 cDNA pACNR/YF17D(Charles M. Rice로부터 제공받음)로부터 하기에 기술된 방법과 같이 SP6 RNA 폴리머라제를 이용한 시험관내 런-오프(run-off) 전사반응에 의하여 제조되었다.
<1-2> 플라크의 분리 정제(plaque purification)
JEV K87P39 바이러스에 감염된 수용성 BHK-21 세포 위에 10% FBS 및 0.5% SeaKem LE 아가로즈(FMC BioProducts, Rockland, Maine)를 포함하는 MEM 배양액으로 덮은 후 5% CO2, 37℃가 유지되는 배양기에서 3 내지 4일 동안 배양하였다. 3 내지 4일 동안 배양한 후 감염된 세포들은 3.7% 포름알데하이드로 실온에서 4시간 고정시킨 다음 덮혀있는 아가로즈를 제거하고 크리스탈 바이오레잇(crystal violet)으로 염색하여 플라크를 나타내었다. 상기에 언급한 플라크 에세이(plaque assay) 결과, K87P39 바이러스는 혼합된 다양한 크기의 플라크들을 나타내었다(도 1의 A, K87P39-infected).
따라서, 본 발명자들은 JEV K87P39 바이러스로부터 일정한 크기의 큰 플라크로 나타나는 JEV 바이러스주를 분리하기 위해서 BHK-21 세포를 사용하여 하기에 설명한 플라크 정제(plaque purification) 방법으로 분리하였으며, CNU/LP2라 명명하였다. K87P39 바이러스에 감염된 수용성 BHK-21 세포위에 10% FBS 및 0.5% SeaKem LE 아가로즈(FMC BioProducts, Rockland, Maine)를 포함하는 MEM 배양액으로 덮은 후 5% CO2, 37℃가 유지되는 배양기에서 3 내지 4일 동안 배양하였다. 배양 후, 각 각의 플라크를 멸균된 파스퇴르 피펫으로 선택한(pick) 후 1 ㎖의 α-MEM 배양액과 함께 4℃에서 2시간 동안 아가로즈로부터 바이러스를 용리(elution)하였다. 용리된 바이러스(elute)는 한차례만 BHK-21 세포에서 증폭하여 JEV CNU/LP2 바이러스의 스탁(stock)으로 사용할 때까지 -80℃에 보관하였다.
BHK-21 세포를 이렇게 분리된 JEV CNU/LP2 바이러스로 감염시켰을 때 나타나는 플라크 형태를 JEV K87P39와 비교하기 위해서 상기에서 언급한 플라크 에세이(plaque assay)를 수행하였다. 그 결과, JEV K87P39 바이러스가 감염된 BHK-21 세포에서는 혼합된 다양한 크기의 플라크들을 관찰할 수 있었다(도 1의 A, K87P39-infected). 반면에, CNU/LP2 바이러스가 감염된 BHK-21 세포에서는 일정한 크기의 큰 플라크들을 관찰할 수 있었다(도 1의 A, CNU/LP2-infected). 또한, JEV K87P39 및 JEV CNU/LP2 균주로 감염된 Vero 세포를 이용하여 플라크 형태를 비교하였을 때에도 유사한 결과를 관찰할 수 있었다(도 1의 B).
<1-3> 면역형광(immunofluorescence)
감염된 BHK-21 세포에서 JEV 바이러스 단백질의 발현을 동초점 현미경(confocal microscopy)으로 조사하기 위하여, 본 발명자들은 2×105 세포를 4-웰 챔버 슬라이드에 분주하여 12시간동안 배양시킨 후, 목(mock)-감염시키거나 또는 원래의(original) JEV K87P39 바이러스주, JEV CNU/LP2 분리주(isolate) 또는 YF17D 바이러스주로 1 MOI(multiplicity of infection)에서 18시간 동안 감염시켰 다. JEV 바이러스 단백질에 대한 면역염색을 위하여, 먼저 0.37%(v/v)의 포름알데히드가 첨가된 PBS와 함께 25℃에서 30분간 배양함으로써 세포를 고정화시켰다. 다음으로 PBS를 이용하여 세포를 세척한 후, 0.2%(v/v) 트리톤 X-100가 첨가된 PBS로 37℃에서 10분간 침투시켰다(permeabilized). 다시 PBS로 세포를 네 차례 세척한 후 PBS에서 15분간 재수화시키고(rehydrated), 5%(w/v) BSA를 포함하는 PBS로 37℃에서 1시간동안 블록시켰다. 다음으로, 1:500 희석된 JEV에 특이적인 마우스 과면역 복수액으로 세포를 25℃에서 2시간동안 배양시키고 PBS로 세차례 세척한 후, 1:500 희석된 FITC-결합된 염소 항-마우스 IgG(Jackson ImmunoResearch Labs Inc.)로 25℃에서 2시간동안 배양시킨 후 PBS로 다시 세 차례 세척하였다. 그 후, 세포의 핵을 시각화하기 위하여 5 ㎍/㎖의 프로피디움 아이오다인 및 5 ㎍/㎖의 RNase A를 포함하는 PBS로 37℃에서 30분간 세포를 배양시킨 후, 80% 글리세롤로 마운팅(mounting)을 실시하였다. 63X 대물렌즈(objective)가 장착된 Zeiss Axioskop 동초점 현미경에서 Bio-Rad MRC 1024 및 LaserSharp 소프트웨어를 이용하여 이미지를 얻었다.
그 결과, CNU/LP2-감염된 BHK-21 세포의 핵 주변막(perinuclear membrane) 에서 JEV 바이러스 단백질의 발현을 관찰하였고(도 1의 C, CNU/LP2-infected), K87P39-감염된 BHK-21 세포의 경우에도 유사하였다(도 1의 C, K87P39-infected). 상기 형광염색은 목-감염된 BHK-21 세포(도 1의 C, Mock-infected) 또는 음성대조군인 JEV와 매우 유사한 플라비바이러스인 황열병 바이러스 YF17D로 감염된 BHK-21 세포(도 1의 C, YF17D-infected)에서는 관찰되지 않았다. 신경세포주인 SHSY-5Y( 인간) 및 B103(마우스), 비신경세포주인 Vero(원숭이) 및 MDCK(개)을 포함하는 다양한 동물 세포주에 대한 CNU/LP2 감염 결과, 배양 상등액에서 높은 바이러스 타이터(106-107 PFU/㎖)가 관찰되었다. 따라서, 본 발명자들은 JEV CNU/LP2를 전체-길이의 감염성이 있는 JEV cDNA의 합성을 위한 모 바이러스주(parental strain)로 사용하였다.
<실시예 2> 완전한 JEV CNU/LP2 게놈 RNA의 뉴클레오타이드 염기서열 분석
본 발명자들은 제조사의 지침에 따라 300 ㎕의 TRIzol LS 시약(Gibco/BRL)을 사용하여 100 ㎕의 바이러스를 포함하는 배양액으로부터 바이러스 게놈 RNA를 추출한 후, 20 ㎕의 RNase가 제거된 물에 재부유시켰다. 바이러스 게놈 RNA의 완전한 염기서열을 분석하기 위하여, 5'-말단 및 3'-말단을 포함하는 전체 바이러스 게놈RNA을 긴(long) RT-PCR 방법을 이용하여 다섯 개의 중첩하는 cDNA(JVF, JVM, JVR, JV3NTR, 및 JV35NTR)로 증폭시켰다(도 2). cDNA 합성 및 PCR 증폭에 사용된 올리고뉴클레오타이드는 진뱅크(GenBank) 데이터베이스에 염기서열이 모두 밝혀져 있는 16개의 JEV 바이러스 게놈 RNA(CH2195LA, CH2195SA, FU, GP78, HVI, JaGAr01, JaOArS982, K94P05, Vellore P20778, p3, SA(A), SA(V), SA14, SA14-14-2, TC, 및 TL 바이러스주)에 공통적인(consensus) 염기서열에 기초하여 디자인하였다.
<2-1> JEV CNU/LP2 게놈 RNA의 염기서열 분석
1-3,865 뉴클레오타이드의 JVF 앰플리콘(amplicon)을 증폭하기 위하여, JEV 게놈의 3,986-4,003 뉴클레오타이드와 상보적인 서열번호 1로 기재되는 프라이머 J7을 cDNA 합성에 사용하였다(도 2의 A). JVF PCR 증폭을 위한 프라이머들은 하기와 같다: 1-18 뉴클레오타이드에 상보적인 서열번호 2로 기재되는 프라이머 J8; 및 3,845-3,865 뉴클레오타이드에 상보적인 서열번호 3으로 기재되는 프라이머 J6. 3,266-8,170 뉴클레오타이드의 JVM 앰플리콘의 경우에는 8,150-8,170에 상보적인 서열번호 4로 기재되는 프라이머 J4가 cDNA 합성을 위하여 사용되었다. JVM PCR 증폭을 위한 프라이머는 하기와 같다: 3,266-3,283 뉴클레오타이드에 상보적인 서열번호 5로 기재되는 프라이머 J20; 및 프라이머 J4. 7,565-10,893 뉴클레오타이드의 JVR 앰플리콘의 경우에는 cDNA 합성을 위하여 10,947-10,967 뉴클레오타이드에 상보적인 서열번호 6으로 기재되는 프라이머 J1이 사용되었다. JVR PCR 증폭을 위한 프라이머는 하기와 같다: 7,565-7,582 뉴클레오타이드에 상보적인 서열번호 7로 기재되는 프라이머 J12; 및 10,870-10,893 뉴클레오타이드에 상보적인 서열번호 8로 기재되는 프라이머 J2. 표준 RT 반응은 10 ㎕의 추출된 바이러스 RNA, 5 p㏖의 상기에서 언급한 적당한 프라이머, 100 U의 Superscript Ⅱ RT(Gibco/BRL), 40 U의 RNaseOUT(Gibco/BRL), 0.1 mM의 DTT, 10 mM의 dNTP 혼합액 및 제조사로부터 공급된 RT 버퍼(Gibco/BRL)를 포함하는 20 ㎕의 반응 혼합액에서 수행되었다. 반응 혼합액은 37℃에서 1시간동안 배양되었으며, 이후 70℃에서 15분간 가열시켰다. 5 ㎕ 당량(aliquot)의 RT 혼합액을 Pyrobest DNA 중합효소(Takara Bio Inc., Shiga, Japan) 및 상기에서 언급한 적당한 프라이머 쌍을 PCR 증폭을 위하여 사용 하였다. PCR 반응은 94℃에서 30초간 변성(denaturaton)시키고, 60℃에서 30초간 어닐링(annealing) 시킨 후 72℃에서 5분간 중합(polymerization) 시키는 과정을 30회 반복 실시한 후, 72℃에서 10분간 최종적으로 연장시켰다. 클로닝하는 동안에 일어날 수 있는 선택 편향(selection bias)을 피하기 위하여, PCR 증폭산물의 클로닝되지 않은 앰플리콘을 사용하여 직접적으로 자동 3700 DNA 서열분석기를 사용하여 양쪽 방향 모두 시퀀싱함으로써 염기서열분석을 수행되었다.
그 결과, 3'-말단 및 5'-말단 염기서열을 제외한 서열번호 9로 기재되는 JEV CNU/LP2 바이러스 게놈의 전체 염기서열을 결정하였다.
<2-2> JEV CNU/LP2 게놈 RNA의 3'-말단 염기서열의 결정
JEV CNU/LP2 게놈 RNA의 3'-말단의 염기서열을 분석하기 위하여, 본 발명자들은 서열번호 10으로 기재되는 합성 올리고뉴클레오타이드 T를 바이러스 게놈 RNA의 3'-말단에 접합시킴으로써 cDNA 합성 및 PCR 증폭을 위한 프라이머 결합 부위를 제공하였다(Kolykhalov et al., J. Virol., 1996, 70, 3363-3371). 이 방법은 C형 간염 바이러스 게놈 RNA의 매우 보존된 3'-말단의 염기서열을 분석하기 위하여 성공적으로 사용되었다(Kolykhalov et al., J. Virol., 1996, 70, 3363-3371). 올리고뉴클레오타이드 T의 3'-말단은 말단(terminal) 데옥시뉴클레오타이딜트랜스퍼라제(Takara)를 이용하여 ddATP를 삽입함으로써 최초에 변형되었으며, 이렇게 함으로써 올리고뉴클레오타이드 T의 분자내(intramolecular) 및 분자간(intermolecular) 접합이 일어나지 않도록 하였다. 또한, 올리고뉴클레오타이드 T의 5'-말단은 T4 폴리뉴클레오타이드 인산화효소(Takara)에 의하여 인산화되었다. 이후, T4 RNA 접합효소(ligase, New England Biolabs, Inc., Beverly, MA)를 이용하여 5'-인산화되고 3'-변형된 올리고뉴클레오타이드 T를 바이러스 게놈 RNA의 3'- 말단에 접합시켰다. 20 ㎕의 접합 반응 혼합액은 10 U의 T4 RNA 접합효소, 40 U의 RNaseOUT, 10 p㏖의 올리고뉴클레오타이드 T, 바이러스 게놈 RNA 및 제조사(NEB)로부터 제공된 버퍼를 포함한다. 16℃에서 12시간동안 배양한 후, 접합된 바이러스 RNA를 페놀로 추출하고 에탄올로 침전시킨 후 20 ㎕의 RNase가 제거된 물에 재부유시켰다. 순차적으로, 올리고뉴클레오타이드 T와 상보적인 서열번호 11로 기재되는 올리고뉴클레오타이드 TR을 사용하여 이전에 기술된 방법에 따라 10 ㎕의 올리고뉴클레오타이드와 접합된 바이러스 RNA를 cDNA 합성에 사용하였다. 합성된 cDNA의 증폭은 뉴클레오타이드 10,259-10,276에 상보적인 서열번호 12로 기재되는 프라이머 J35 및 프라이머 TR을 사용하여 수행하였다. PCR을 위하여, 5 ㎕ 당량(aliquot)의 RT 혼합액을 Pyrobest DNA 중합효소를 사용하여 94℃에서 30초, 60℃에서 30초, 72℃에서 1분간 30회 반복 실시한 후, 최종적으로 72℃에서 10분간 연장시켰다. PCR 반응 혼합액의 조성은 상기에서 기재한 조성과 동일하게 사용하였다. 양성-센스 및 음성-센스 프라이머에 각각 도입된 HindⅢ및 EcoRI 인식 부위를 사용하여 pRS2 벡터(Charles M. Rice로부터 제공받음)에 상기에서 합성된 cDNA JV3NTR 앰플리콘을 클로닝시켰다(도 2의 B).
아가로즈 젤 전기영동 결과, 상기에서 증폭된 PCR 산물은 두 개의 밴드로 이동하였으며, 큰 밴드는 약 700 bp, 작은 밴드는 약 450 bp의 크기를 가졌다(도 2의 C). 두 밴드 모두 정제한 후 클로닝하였으며, 각각 큰 밴드 및 작은 밴드를 포함하는 20 내지 10개의 무작위로 선별된 클론들을 이용하여 JEV CNU/LP2의 3'-말단 염기서열을 분석하였다. 전체 서열이 밝혀진 대부분의 JEV 분리주의 경우에서 보고된 것과 마찬가지로, 본 발명자들은 큰 삽입체(약 700 bp)를 가진 모든 클론들의 바이러스 게놈이 -GATCT10968 로 끝난다는 것을 발견하였다. 반면에, 작은 삽입체(약 450 bp)를 가진 모든 클론들은 뉴클레오타이드 10,684에서 종결되어 큰 밴드보다 284 bp 더 짧은 밴드를 가졌다. 작은 삽입체(약 450 bp)의 경우 바이러스 게놈 RNA의 3'-말단에 284개의 뉴클레오타이드를 포함하고 있지 않기 때문에, 전체-길이의 JEV cDNA의 결합(assembly) 과정 동안 본 발명자들은 큰 삽입체(약 700 bp)의 뉴클레오타이드 염기서열을 사용하였다.
<2-3> JEV CNU/LP2 게놈 RNA의 5'-말단 염기서열의 결정
JEV CNU/LP2 게놈 RNA의 5'-말단의 염기서열은 자가-접합(self-ligation)된 바이러스 RNA를 이용하여 결정하였다(Campbell and Pletnev, Virology, 2000, 269, 225-237). 먼저, 담배 산 파이로포스파타제(tobacco acid pyrophosphatase; TAP)를 사용하여 바이러스 게놈 RNA의 캡 구조를 절단하였다. 20 ㎕의 절단 반응액은 10 U의 TAP(Epicentre Technol. Co., Madison, WI), 10 ㎕의 바이러스 RNA 및 제조사(Epicentre Technol. Co.)로부터 공급된 버퍼를 포함한다. 37℃에서 1시간동안 배양한 후, TAP 처리된 바이러스 RNA를 페놀로 추출하고 에탄올로 침전시킨 후, RNase가 제거된 20 ㎕의 물에 재부유시켰다. 캡이 제거된(decapped) 바이러스 RNA의 절반(10 ㎕)을 상기에서 기술한 바와 같이 T4 RNA 접합효소를 이용하여 20 ㎕의 반응 혼합액에서 자가-접합시켰다. cDNA 합성을 위하여 자가-접합된 바이러스 RNA의 1/4(5 ㎕)를 사용하였으며, 이때 뉴클레오타이드 215-232와 상보적인 서열번호 13으로 기재되는 프라이머 J40을 사용하였다. 이렇게 합성된 첫 번째 사슬(first-strand) cDNA는 뉴클레오타이드 164-181에 상보적인 서열번호 14로 기재되는 프라이머 J39 및 프라이머 J35를 사용하여 PCR 증폭하였다(도 2의 D). 아가로즈 젤 전기영동 결과, 증폭된 산물은 약 850 bp의 단일 밴드임을 확인하였다(도 2의 E). 증폭된 cDNA JV35NTR 앰플리콘을 ApoI 및 SpeI을 사용하여 절단시킨 후, ApoI 및 XbaI으로 절단된 pRS2 벡터에 접합시켜 pRS2/JV3'5'을 제조하였다.
JEV CNU/LP2 게놈 RNA의 5'-말단의 염기서열을 분석하기 위하여, 무작위로 선택된 12개 클론의 염기서열을 분석하였다. 12개의 모든 클론에서, 본 발명자들은 바이러스 3'-말단의 염기서열 -GATCT10968 다음에 5'-말단의 염기서열 1AGAAGT- 가 연결되어있음을 알 수 있었다(도 2의 B 및 도 2의 C). 또한, 클로닝되지 않은 PCR 앰플리콘의 직접적인 염기서열분석에 의해서도 동일한 결과를 얻을 수 있었다. 따라서, 본 발명자들은 CNU/LP2 분리주(isolate)의 완전한 뉴클레오타이드 염기서열이 서열번호 15로 기재되는 것을 확인하였다.
<실시예 3> 전체-길이의 감염성이 있는 JEV cDNA의 제조
JEV CNU/LP2 게놈 RNA에 대한 전체-길이의 감염성이 있는 cDNA를 클로닝하기 위한 과정에서, 크론된 DNA가 유전자 재배열(genetic rearrangement)이 일어나기 때문에 바이러스 게놈의 특정한 부위는 E. coli의 높은-카피-수(high-copy-number)의 플라스미드로 클로닝하기에 적합하지 않았다. 또한, 상기와 같은 어려움은 다른 플라비바이러스의 경우에도 존재하는 것으로 보고된 바 있다(Campbell and Pletnev, Virology, 2000, 269, 225-237; Polo et al., J. Virol., 1997, 71, 5366-5374; Gritsun and Gould, Virology, 1995, 214, 611-618; Sumiyoshi et al., J. Infect. Dis., 1995, 171, 1144-1151; Sumiyoshi et al., J. Virol., 1992, 66, 5425-5431; Rice et al., New Biol., 1989, 1, 285-296). 또한, 상기 부위를 낮은-카피-수(low-copy-number)의 박테리아 플라스미드로 클론시키려 한 경우에도 낮은 DNA 수율과 함깨 유전적 불안정 때문에 성공적이지 못했다. 따라서, 본 발명자들은 BAC(bacterial artificial chromosome)인 pBeloBAC11 플라스미드를 벡터로 사용함으로써 JEV 전체-길이의 감염성이 있는 cDNA를 합성하고자 하였다.
<3-1> 세 개의 긴 중첩된 JEV cDNA 앰플리콘의 서브클로닝
본 발명자들은 표준 절차에 따른 재조합 DNA 기술을 사용하였다(Sambrook et al., Molecular cloning, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory). 먼저, 완전한 뉴클레오타이드 염기서열을 분석하기 위하여 사용된 세 개의 중첩하는 cDNA 앰플리콘(JVF, JVM 및 JVR)을 pBeloBAC11 플라스미드의 유도체인 서열번호 42로 기재되는 pBAC/SV에 각각 서브클론(subclone)하였다. pBAC/SV 플라스미드는 pACNR/NADL (Mendez et al., J. Virol., 1998, 72, 4737-4745)의 491 bp Not I-Aat Ⅱ(T4 DNA 폴리머라제(polymerase)-처리) 절편, pSINrep19(Frolov et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA., 1996, 93, 11371-11377)의 9,215 bp Sac I(T4 DNA 폴리머라제-처리)-Ssp I(T4 DNA 폴리머라제-처리) 절편, 및 pBeloBAC11의 6,875 bp Sfi I(T4 DNA 폴리머라제-처리)-Not I 절편을 포함한다. 그러므로, 3,863 bp 크기의 JVF 앰플리콘의 RsrⅡ-AvrⅡ 절편, 4,717 bp의 JVM 앰플리콘의 BspEI-MluI 절편 및 3,326 bp의 JVR 앰플리콘의 RsrⅡ-BglⅡ 절편을 동일한 제한효소로 절단시킨 후 pBAC/SV 플라스미드에 각각 삽입시켰다. 그 결과, 각각 pBAC/JVF, pBAC/JVM, 및 pBAC/JVR 서브클론이 제조되었다. 상기 BAC 플라스미드를 E. coli DH10B 세포에서 성장시킨 후 삽입된 세 개의 JEV cDNA 앰플리콘들의 염기서열을 각각 분석하였다. 세 개의 서브클론에 클로닝된 모든 JEV cDNA의 뉴클레오타이드 염기서열은 pBAC/JVR에 존재하는 NS5 유전자의 염기 치환(T8906 → C)을 제외하고는 모바이러스(parental virus)인 CNU/LP2의 것과 동일하였다. 상기 치환은 단백질 번역의 관점에서는 침묵(silent)하며, 무작위로 선별된 8가지 개별 클론의 염기서열이 8,906 뉴클레오타이드 위치에서 모두 T 잔기를 보였기 때문에 클로닝 과정에서 이러한 염기 치환이 발생한 것으로 추측된다. T8906 → C 치환이 대응하는 아미노산의 서열을 변형시키지는 않지만, 이러한 뉴클레오타이드 서열의 변화가 바이러스의 복제에 영향을 미칠 수는 있기 때문에(van Dinten et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1997, 94, 991-996), 본 발명자들은 다시 T 잔기로 치환시켜 원래의 염기서열을 가지도록 하였다. T8906
→ C 치환을 8,827-9,142에 대응하는 315 bp ApaI-HindⅢ 절편을 재클로닝함으로써 교정(correct)하였으며, 그 결과 pBAC/JVRR이 제조되었다. E.coli DH10B 균주에서의 조작 및 증식과정에서, 모두 세 가지의 서브클론 JEV cDNA는 유전학적으로 안정한 채로 유지되었다.
<3-2> 전체-길이의 JEV cDNA의 5'-말단에 SP6 프로모터의 도입
박테리오파지 SP6 프로모터 전사 출발점(start)을 전체-길이의 JEV cDNA 5'-말단에 정확하게 삽입시키기 위하여, 본 발명자들은 pBAC/JVF를 변형시켰다. 먼저, 서열번호 16으로 기재되는 프라이머 J41 및 SP6 프로모터의 음성-센스 서열에 해당하는 서열번호 17로 기재되는 프라이머 J43을 사용하여 pBAC/SV를 PCR하고, 또한 서열번호 18로 기재되는 프라이머 J42 및 서열번호 19로 기재되는 프라이머 J40을 사용하여 pBAC/JVF를 PCR함으로써 두 개의 절편을 분리하였다. 상기 두 개의 절편을 프라이머 J41 및 J40을 사용하여 PCR을 수행함으로써 융합시켰다. 그 결과로 생성된 앰플리콘을 PacI 및 PmeI을 사용하여 절단시킨 후 동일한 PacI 및 Pme
I 효소로 절단된 pBAC/JVF에 접합시켜서 pBACSP6/JVF를 생성하였다.
<3-3> SP6 프로모터를 포함하는 전체-길이의 JEV cDNA 제조
바이러스 게놈의 3' 말단에서 선형화된 플라스미드의 런-오프 전사반응 동안에 완전하거나 거의 완전한(authentic) 3' 말단을 제조하기 위하여, 본 발명자들은 pBAC/JVRR을 변형시켜 JEV 바이러스 완전한 3'-말단의 뉴클레오타이드 염기서열이 XhoI 또는 XbaI의 유일한(unique) 제한효소 인식 부위를 가지도록 하였다. 바이러스 게놈 RNA의 3'-말단에 유일한 XhoI 인식 부위를 포함하는 pBAC/JVRR/XhoI 서브클론을 제조하기 위하여, pRS2/JV3'5'을 서열번호 20으로 기재되는 프라이머 J90 및 XhoI 인식 부위를 포함하는 서열번호 21로 기재되는 프라이머 J45를 사용하여 PCR을 수행함으로써 절편 I을 합성하였다. 298-bp SfiI-SpeI 부위의 절편 I 앰플리콘을 SfiI 및 NheI으로 절단시킨 pBAC/JVRR에 접합시켰다. 바이러스 게놈의 3'-말단에 XbaI 인식 부위를 가지는 pBAC/JVRRx/XbaI 서브클론을 제조하기 위하여, 먼저 PCR을 이용하여 NS5 유전자의 뉴클레오타이드 9,131-9,136에 이미 존재하는 XbaI 인식 부위에 침묵(silent) 점 돌연변이(A9134 → T)를 도입함으로써 제한효소의 인식 부위를 제거하였다. 이러한 pBAC/JVRRx/XbaI 서브클론 구조에서, "x" 표시는 본래의 XbaI 인식 부위를 제거시킨 침묵 점 돌연변이(A9134 → T)를 나타낸다. 구체적으로, pBAC/JVRR을 서열번호 22로 기재되는 프라이머 J31 및 A9134 → T 치환을 도입시키는 서열번호 23으로 기재되는 프라이머 J47을 이용하여 증폭시켰다. 뉴클레오타이드 8,828-9,143에 대응하는 cDNA 앰플리콘의 315 bp ApaI-HindⅢ 부위를 pBAC/JVRR에 클로닝시켜 pBAC/JVRRx를 제조하였다. 다음으로, pBAC/JVRR/XhoI의 경우와 동일한 방법을 사용하여 pBAC/JVRRx/XbaI 서브클론을 제조하였다. 따라서, 프라이머 J90 및 XbaI 부위를 포함하는 서열번호 24로 기재되는 프라이머 J46을 사용하여 pRS2/JV3'5'을 PCR에 의해 증폭함으로써 절편 Ⅱ를 얻었다. 절편 Ⅱ 앰플 리콘의 298 bp SfiI-SpeI 부위를 SfiI 및 NheI으로 절단시킨 pBAC/JVRRx에 접합시켜서 pBAC/JVRRx/XbaI 서브클론을 제조하였다. 단일한 XhoI 부위 및 A9134 → T 치환부위를 포함하는 pBAC/JVRRx/XhoI 서브클론을 제조하기 위하여, 절편 I 앰플리콘의 298 bp SfiI-SpeI 부위를 SfiI 및 NheI으로 절단시킨 pBAC/JVRRx에 접합시켜서 pBAC/JVRRx/XhoI 서브클론을 제조하였다.
상기와 같은 방법으로, 본 발명자들은 pBACSP6/JVF, pBAC/JVM, pBAC/JVRR/XhoI, pBAC/JVRRx/XbaI 및 pBAC/JVRRx/XhoI의 다섯 가지 플라스미드를 제조하였다. 상기 플라스미드들은 JEV 게놈 RNA를 중첩하여 포함하며, 하기에 기술한 것과 같이 전체-길이의 감염성이 있는 JEV cDNA를 합성하는 데 사용되었다(도 3). 먼저, pBAC/JVM의 4,717 bp BspEI-MluI 절편, pBACSP6/JVF의 8,970 bp Bsp
EI-XbaI 절편, 및 pBAC/SV의 3,670 bp XbaI-MluI 절편을 접합시킴으로써 pBACSP6/JVFM 서브클론을 제조하였다. 순차적으로, pBACSP6/JVFM의 두 가지 절편( 8,142 bp의 PacI-SapI 절편과 4,801 bp의 PacI-BsrGI 절편)을 i) pBACSP6/JVFL/
XhoI을 제조하기 위하여 pBAC/JVRR/XhoI의 5,620 bp SapI-BsrGI 절편과, ii) pBACSP6/JVFLx/
XbaI을 제조하기 위하여 pBAC/JVRRx/XbaI의 5,622 bp SapI-BsrGI 절편과, 또는 iii) pBACSP6/JVFLx/XhoI을 제조하기 위하여 pBAC/JVRRx/XhoI의 5,620 bp SapI-
BsrGI 절편과 각각 접합시켰다. 최종적으로 생성된 세 개의 전체-길이의 JEV cDNA 플라스미 드는 각각 pBACSP6/JVFL/XhoI, pBACSP6/JVFLx/XhoI 및 pBACSP6
/JVFLx/XbaI으로 명명하였으며, 서열번호 43, 서열번호 44, 및 서열번호 45로 기재하였다(도 3의 B). 상기 cDNA 클론들은 모두 바이러스 게놈의 처음(beginning) 부위에 SP6 프로모터 전사출발(transcription start) 부위를 가지며, SP6 RNA 폴리머라제를 사용한 시험관내 전사반응을 통해서 완전한(authentic) 5'-말단을 가지는 합성 RNA 전사체가 생산될 수 있다(도 3의 B, 회색 박스). 런-오프(run-off) 전사 후 바이러스 게놈의 3'-말단을 완전하거나 또는 완전한 것에 가깝게 하기 위하여, 본 발명자들은 바이러스 게놈의 말단에 XhoI 또는 XbaI 제한효소 인식 부위를 위치시켰다(도 3의 B, 밑줄). 따라서, pBACSP6/JVFL/XhoI은 바이러스 게놈의 말단에 XhoI 인식 부위를 가진다. 바이러스 게놈의 NS5 유전자에 이미 XbaI 인식 부위가 존재하기 때문에, 바이러스 게놈의 바로 말단에 XbaI 인식 부위를 가지게 하기 위하여 NS5 유전자에 존재하는 XbaI 인식 부위에 침묵(silent) 점 돌연변이(A9134 → T)를 도입하여 XbaI 인식 부위를 제거하였다. 상기 콘스트럭트(construct)를 pBACSP6/JVFLx/XbaI으로 명명하였으며, 여기에서 'x' 표시는 본래의(original) XbaI 인식 부위가 제거된 침묵 점 돌연변이가 존재한다는 것을 의미한다. 세 번째 클론인 pBACSP6/JVFLx/XhoI은 바이러스 게놈의 말단에 런-오프 자리로써 XhoI 인식 부위와 A9134 → T 치환을 모두 포함한다.
본 발명자들은 JEV cDNA를 포함하는 pBACSP6/JVFLx/XbaI을 2002년 10월 2일 부로 한국생명공학연구원 유전자은행에 기탁하였다(수탁번호 ; KCTC 10347BP).
<3-4> T7 프로모터를 포함하는 전체-길이의 JEV cDNA 제조
상기 실시예 <3-3>과 같은 방법으로, 본 발명자들은 SP6-유도된(driven) JEV cDNA와 더불어 세 개의 T7-유도된 전체-길이의 JEV cDNA의 세트를 제조하였다. 먼저, 서열번호 25로 기재되는 프라이머 J81 및 서열번호 26으로 기재되는 프라이머 J80을 사용하여 pBAC/NADLcIn-/PAC(Charles M. Rice로부터 제공받음) 유래의 절편을 PCR에 의하여 합성하였다. 또한, 서열번호 27로 기재되는 J42 프라이머 및 서열번호 28로 기재되는 J82 프라이머를 사용하여 pBACSP6/JVFLx/XbaI 유래의 절편을 합성하였다. 상기 두 개의 절편을 프라이머 J81 및 J82를 사용하여 PCR의 두 번째 실행으로써 융합시켰다. 그 결과 생성된 앰플리콘의 793-bp EcoRI-SpeI 절편을 EcoRI 및 XbaI으로 절단시킨 pRS2 벡터에 삽입시켜 pRS2T7/5'JV를 제조하였다. pRS2T7/5'JV의 675 bp PvuI-PmeI 절편을 i) pBACT7/JVFL/XhoI을 제조하기 위하여 pBACSP6/JVFL/XhoI의 18,364 bp PacI-PmeI 절편과, ii) pBACT7/JVFLx/
XhoI을 제조하기 위하여 pBACSP6/JVFLx/XhoI의 18,364 bp PacI-PmeI 절편과, 또는 iii) pBACT7/JVFLx/XbaI을 제조하기 위하여 pBACSP6/JVFLx/XbaI의 18,366 bp PacI-PmeI 절 편과 각각 접합시켰다. 최종적으로, 세 가지의 생성된 전체-길이의 JEV cDNA는 각각 pBACT7/JVFL/XhoI, pBACT7/JVFLx/XhoI, 및 pBACT7/JVFLx/
XbaI으로 명명하였으며, 서열번호 46, 서열번호 47, 및 서열번호 48로 기재하였다(도 3의 C). 각각의 클로닝 단계에서, 제한효소 및 뉴클레오타이드 서열 분석을 광범위하게 실시하여 클로닝된 cDNA의 구조를 분석하였다. 그 결과, 결실 또는 재배열에 따른 삽입체의 구조상의 유전학적 불안정성은 관찰되지 않았다.
본 발명자들은 JEV cDNA를 포함하는 pBACT7/JVFLx/XbaI을 2002년 10월 2일 부로 한국생명공학연구원 유전자은행에 기탁하였다(수탁번호 ; KCTC 10346BP).
<실시예 4> 전사 및 형질전환
본 발명자들은 상기에서 합성한 전체-길이의 JEV cDNA를 주형으로 사용하여 시험관내 전사반응에 의하여 합성 JEV RNA 전사체를 생산하였다. 이를 위하여, 100-200 ng의 주형 DNA를 XhoI 또는 XbaI으로 절단시켜 선형화시킨 후, 제조사(Gibco/BRL)에 의하여 제공된 버퍼, 0.6 mM 캡 유사체 [m7G(5')ppp(5')A 또는 m7G(5')ppp(5')G, NEB Inc.], 0.5 μM의 [3H]UTP(1.0 mCi/㎖, 50 Ci/m㏖, New England Nuclear Corp., Boston, MA), 10 mM의 DTT, 각각 1 mM의 UTP, GTP, CTP 및 ATP, 40 U의 RNaseOUT 및 15 U의 SP6 RNA 폴리머라제(Gibco/BRL)로 구성된 25 ㎕의 반응 혼합액에 첨가하였다. 상기 반응 혼합액은 37℃에서 1시간 동안 배양하였다. DE-81 여과지(Whatman, Maidstone, UK)에 RNA가 흡수되는 [3H]UTP 함입(incorporation)에 기초하여 RNA를 정량하였다(Sambrook et al., Molecular cloning, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory). 그 후, 1 내지 1.5 ㎕ 당량의 반응 혼합액을 이용하여 아가로즈 젤 전기영동을 실시하였고, 실험 전까지는 반응 혼합액을 -80℃에 보관하였다.
상기에서 합성된 RNA 전사체를 세포내로 형질전환 시키기 위하여, ECM 830 일렉트로포레이터(BTX Inc., San Diego, CA)를 사용하여 제조사의 지침에 따라 세포에 합성 RNA를 일렉트로포레이션시켰다. 간략하게 설명하면, 아포화(subconfluent) 상태의 세포에 트립신을 처리하고 RNase가 제거된 차가운 PBS를 이용하여 세 차례 세척한 후, 2 ×107 세포/㎖의 농도로 PBS에 재부유시켰다. 400 ㎕ 당량의 부유물을 2 ㎍의 합성 RNA와 혼합한 후, 이전 실험에서 최적의 조건으로 결정된 조건(980 V, 99-㎲ 펄스 길이, 및 5 펄스)에서 세포를 즉시 일렉트로포레이션시켰다. 그리고 나서, 일렉트로포레이션된 혼합액을 10 ㎖의 신선한 배양액으로 옮겼다.
또한, 합성 RNA의 특이적 감염성(specific infectivity)을 정량하기 위하여, 감염 센터 분석(infectious center assay)을 실시하였다. 구체적으로, 런-오프 전사의 경우 JEV cDNA 주형은 XhoI 또는 XbaI 제한효소의 절단에 의하여 선형화되었다. m7G(5')ppp(5')A 캡 구조 유사체의 존재하에서 XhoI의 처리에 의하여 선형화된 두 개의 플라스미드(pBACSP6/JVFL/XhoI와 pBACSP6/JVFLx/XhoI)는 SP6 폴리머라제 런-오프 전사로부터 5'-말단에 캡 구조를 가지고 있으며, 3'-말단에 바이러스와 연관되지 않은 CGA 뉴클레오타이드 염기서열을 가지고 있는 합성 RNA가 생산되었다(도 3의 B). 이러한 결과는 Xho I 절단에 의하여 남겨진 5' 돌출 부위가 복제되었기 때문이다. 이와 유사하게, XbaI-선형화된 pBACSP6/JVFLx/XbaI 플라스미드는 SP6 폴리머라제 런-오프 전사로부터 5'-말단에 캡 구조를 가지고 있으며, 3'-말단에 바이러스와 연관되지 않은 CTAG 뉴클레오타이드 염기서열을 가지고 있는 합성 RNA가 생산되었다(도 3의 B). 일렉트로포레이션된 세포들을 순차적으로 10배씩 희석하여 6-웰 플레이트에서 성장하는 감염되지 않은 단층 세포(5×105)에 분주하였다. 6시간동안 배양하여 플레이트에 세포를 부착시킨 후, 0.5%의 SeaKem LE 아가로즈를 포함하는 MEM 배지에 상기에서 기술한 방법으로 세포를 배양하였다. 세포를 37℃, 5% CO2 조건에서 3 내지 4일간 배양시킨 후, 감염 플라크 센터를 크리스탈 바이오레잇(crystal violet) 염색에 의하여 시각화시켰다.
그 결과, 수용성(susceptible) BHK-21 세포가 상기의 합성 RNA로 형질전환되었을 때, 모두 높은 특이적 감염성을 나타내었다(표 3). 즉, 최적의 일렉트로포레이션 조건에서 형질전환된 pBACSP6/JVFL/XhoI, pBACSP6/JVFLx/XhoI 및 pBACSP6/JVFLx/XbaI으로부터 얻은 합성 RNA의 경우, 특이적 감염성이 각각 3.5×105
, 4.3×105 및 3.4×105 PFU/㎍이었다(표 3, infectivity). 이와 유사한 결과가 T7 폴리머라제 런-오프 전사에 의하여 T7-유도된 JEV cDNA로부터 전사된 합성 RNA에서도 관찰되었다(표 3, infectivity).
| 전사에 사용된 주형a | 감염성b (PFU/㎍ of RNA) | 바이러스 역가C(PFU/㎖) | |
| 24 시간 | 48 시간 | ||
| pBACSP6/JVFL/XhoI pBACT7/JVFL/XhoI | 3.5×105 2.9×105 | 4.4×105 2.0×105 | 3.6×106 2.3×106 |
| pBACSP6/JVFLx/XhoI pBACT7/JVFLx/XhoI | 4.3×105 3.8×105 | 2.1×105 3.3×105 | 5.2×106 4.1×106 |
| pBACSP6/JVFLx/XbaI pBACT7/JVFLx/XbaI | 3.4×105 3.0×105 | 3.5×105 2.4×105 | 3.2×106 2.7×106 |
| pBACSP6/JVFLx/XbaIMBN pBACT7/JVFLx/XbaIMBN | 3.1×106 2.7×106 | 6.2×106 5.6×106 | 1.4×106 2.4×106 |
a : 모든 전체-길이 JEV cDNA는 cDNA 이름내에 표시한 런-오프 전사에 적합한 제한효소 처리에 의하여 선형화되었다. pBACSP6/JVFLx/XbaIMBN 및 pBACT7/JVFLx/XbaIMBN에 있어서, XbaI 절단 및 MBN 처리에 의하여 이들 cDNA 주형을 선형화시켜 제조하였다.
b : 기재한 바와 같이, SP6 또는 T7 RNA 중합효소를 사용하여 시험관내 전사 후, BHK-21 세포를 일레트로포레이션하기 위하여 샘플을 사용하고, 감염 플라크 센 터를 측정하였다.
c: 일레트로포레이션 후 24 및 48 시간 뒤의 바이러스 역가
<4-1> JEV cDNA로부터 합성된 JEV RNA 전사체의 3'-말단에 바이러스와 연관되지 않은 뉴클레오타이드 염기서열이 결여된 JEV RNA 전사체의 합성
어떤 플라비바이러스의 경우, 감염성이 있는 cDNA로부터 전사된 합성 RNA의 3'-말단에 바이러스와 연관되지 않은 서열이 존재하면 특이적 감염성이 감소되거나 또는 없어진다(abrogate)는 것이 보고되었다(Yamshchikov et al., Virology, 2001, 281, 294-304). 상기 보고에 근거하여, 본 발명자들은 3' 말단에 바이러스와 연관되지 않은 서열이 결여된 합성 RNA를 제조하고 특이적 감염성을 비교하였다. 구체적으로, 본 발명자들은 추가로 존재하는 CTAG 뉴클레오타이드를 전사반응 전에 제거하기 위하여 XbaI-선형화된 pBACSP6/JVFLx/XbaI 플라스미드를 녹두 뉴클레아제(mung bean nuclease; MBN)로 처리함으로써 바이러스와 연관되지 않은 뉴클레오타이드 염기서열을 가지고 있지 않는 합성 JEV RNA를 제조하고자 하였다. XbaI-선형화되고 MBN-처리된 pBACSP6/JVFLx/XbaI으로부터 합성된 pBACSP6/JVFLx/XbaIMBN(도 3의 B) 및 pBACT7/JVFLx/XbaI으로부터 합성된 pBACT7/JVFLx/XbaIMBN(도 3의 C)는 모두 MBN으로 처리하지 않은 전사체와 비교하였을 때 특이적 감염성이 증가하였다. 정확하게는, MBN-처리된 pBACSP6/JVFLx/XbaIMBN
으로 부터 전사된 RNA의 특이적 감염성은 3.1×106 PFU/㎍으로 측정되었는데, 이것은 변형되지 않은 주형으로부터 전사된 RNA의 특이적 감염성인 3.4×105 PFU/㎍보다 약 10배나 높은 것이다(표 3, infectivity). 또한, pBACT7/JVFLx/XbaI(3.0×105 PFU/㎍) 유래의 RNA들도 MBN 처리 이후에 증가된 특이적 감염성을 보였다(2.7×106 PFU/㎍)(표 3, infectivity). 따라서, 본 발명자들은 높은 감염성을 지닌 합성 JEV RNA 전사체가 생산되기 위해서는 JEV 게놈 RNA에 완전한(authentic) 3'-말단이 존재해야함을 확인하였다.
또한, 3 또는 4개의 JEV 바이러스와 연관되지 않은 뉴클레오타이드가 3'-말단에 존재함으로 인하여 변형된 RNA 전사체의 특이적 감염성은 형질전환된 BHK-21 세포의 배양 상등액에서 수집한 바이러스 역가(titer)에도 영향을 미쳤다. MBN이 처리되지 않은 pBACSP6/JVFL/XhoI, pBACSP6/JVFLx/XhoI 및 pBACSP6
/JVFLx/XbaI 유래의 RNA 전사체로 형질전환된 BHK-21 세포로부터 방출된 바이러스 역가는 형질전환 후 24시간이 경과했을 때 2.1-4.4×105 PFU/㎖ 범위였다(표 3, virus titer 24hr). 이 시점에서 형질전환된 세포의 절반만이 여전히 배양 접시에 부착되어 있었는데, 이것은 바이러스에 의해 유도되는 강한 세포변성효과(cytopathic effect)를 보여준다. 상기 역가는 형질전환 후 48시간이 경과했을 때 3.2-5.2×106 PFU/㎖ 범위로 약 10배 증가하였는데(표 3, virus titer 48hr), 이 시점에서 대부분의 세포는 죽 어서 배양 접시의 바닥에서 떨어졌다. 하지만, MBN-처리된 pBACSP6/JVFLx/XbaIMBN
유래의 RNA 전사체로 형질전환된 BHK-21 세포로부터 방출된 바이러스 역가는 형질전환 후 24시간이 경과했을 때 이미 6.2×106 PFU/㎖에 도달하였고, 이때 대다수의 형질전환된 세포들이 죽었다(표 3, virus titer 24hr). 상기 역가는 형질전환후 48시간에 1.4×106 PFU/㎖로 약간 감소하였다(표 3, virus titer 48hr). 또한, 상기에서 합성된 T7 폴리머라제를 이용한 RNA 전사체의 경우에도 유사한 팬턴의 바이러스 생산이 관찰되었다(표 3).
<실시예 5> 합성 RNA 전사체의 특이적 감염성 확인
본 발명자들은 전체-길이의 cDNA 클론 pBACSP6/JVFLx/XbaIMBN을 사용하여 특이적 감염성은 전체-길이의 JEV cDNA 주형으로부터 RNA 전사를 필요로 한다는 것을 확인하였다(도 4). cDNA 주형 자체로는 감염성이 없었으나(도 4의 A, 레인 5 및 B, without SP6 Pol), 시험관내 전사반응 동안 DNase I을 처리하면 감염성이 없어지기 때문에 전사 반응 동안에는 완전한 cDNA 주형이 요구된다는 것을 확인하였다(도 4의 A, 레인 2 및 B, DNase During). 완전한 반응 혼합액과 비교하였을 때(도 4의 A, 레인 1 및 B, without treatment), 전사 반응 후에 DNase I을 첨가하는 것은 영향을 미치지 않았다(도 4의 A, 레인 3 및 B, DNase I after). 그러나, 반응 후 RNase A를 처리하면 전사된 합성 RNA의 감염성이 제거되었다(도 4의 A, 레인 4 및 B, RNase A after).
<실시예 6> 전체-길이의 감염성이 있는 JEV cDNA로부터 생산된 합성 JEV 바이러스(synthetic JEV)와 모 바이러스(parental virus) CNU/LP2와의 특성 비교
본 발명자들은 전체-길이의 감염성이 있는 JEV cDNA(pBACSP6/JVFL/XhoI, pBACSP6/JVFLx/XhoI, pBACSP6/JVFLx/XbaI, 및 pBACSP6/JVFLx/
XbaIMBN) 주형으로부터 생산된 합성 JEV 바이러스(synthetic JEV)와 최초에 cDNA의 제조를 위하여 사용한 모 바이러스(parental virus)인 CNU/LP2를 플라크 형태, 바이러스 성장 키네틱스(growth kinetics), 바이러스 단백질의 합성, 및 바이러스 게놈 RNA의 합성을 각각 비교하였다.
<6-1> 플라크 에세이(plaque assay)에 의한 플라크 형태 비교
본 발명자들은 BHK-21 세포에 상기의 전체-길이의 감염성이 있는 JEV cDNA(pBACSP6/JVFL/XhoI, pBACSP6/JVFLx/XhoI, pBACSP6/JVFLx/
XbaI, 및 pBACSP6/JVFLx/XbaIMBN) 주형으로부터 얻어진 합성 JEV 바이러스와 모 바이러스 CNU/LP2를 감염시킨 후 10% FBS 및 0.5% SeaKem LE 아가로즈(FMC BioProducts, Rockland, Maine)를 포함하는 MEM 배양액으로 덮어서 5% CO2, 37℃가 유지되는 배양기에서 배양하였다. 3 내지 4일 동안 배양한 후, 감염된 세포들은 3.7% 포름알데 하이드로 실온에서 4시간 고정시킨 다음 덮혀있는 아가로즈를 제거하고 크리스탈 바이오레잇(crystal violet)으로 염색하여 플라크를 시각화하였다. 그 결과, 도 5의 A에서 볼 수 있는 바와 같이, pBACSP6/JVFL/XhoI(접시 1), pBACSP6/JVFLx/
XhoI(접시 2), pBACSP6/JVFLx/XbaI(접시 3) 및 pBACSP6/JVFLx/XbaIMBN
(접시 4)로부터 생산된 합성 JEV로 감염된 BHK-21 세포는 CNU/LP2로 감염된 세포(접시 5)의 경우와 유사하게 동일한 크기의(homogeneous) 큰 플라크를 형성하였다.
<6-2> 바이러스의 성장 키네틱스 비교
본 발명자들은 BHK-21 세포에 상기의 전체-길이의 감염성이 있는 JEV cDNA(pBACSP6/JVFL/XhoI, pBACSP6/JVFLx/XhoI, pBACSP6/JVFLx/
XbaI, 및 pBACSP6/JVFLx/XbaIMBN) 주형으로부터 얻어진 합성 JEV 바이러스와 모 바이러스 CNU/LP2를 낮은(0.01 PFU/세포), 중간(1.0 PFU/세포), 및 높은(10 PFU/세포) MOI(multiplicities of infection)로 감염시킨 후, 시간이 경과함에 따라 감염된 BHK-21 세포에서 생산되는 감염성이 있는 JEV 바이러스의 성장 키네틱스(kinetics)를 분석하기 위하여 세포 배양액을 주기적으로 수집하였다. 구체적으로, 지시된 시점에서 바이러스를 수확하고, 상기에 기술한 플라크 에세이를 통해 바이러스 역가를 측정하였다. 그 결과, 도 5의 B에서 볼 수 있는 바와 같이, 시간에 따라 축적되는 바이러스 역가는 본 발명에서 실시한 세 가지 모든 MOI(0.01, 1.0, 및 10) 에서 네 가지의 합성 JEV 바이러스(pBACSP6/JVFL/XhoI, pBACSP6/JVFLx/Xho
I, pBACSP6/JVFLx/XbaI, 및 pBACSP6/JVFLx/XbaIMBN) 및 모 바이러스 CNU/LP2의 경우에 모두 유사하였다.
<6-3> 웨스턴 블롯 분석을 통한 바이러스 단백질의 합성 비교
본 발명자들은 상기의 전체-길이의 감염성이 있는 JEV cDNA(pBACSP6/JVFL/XhoI, pBACSP6/JVFLx/XhoI, pBACSP6/JVFLx/
XbaI, 및 pBACSP6/JVFLx/XbaIMBN) 주형으로부터 얻어진 합성 JEV 바이러스와 모 바이러스 CNU/LP2로 감염된 BHK-21 세포에서 발현되는 JEV 바이러스의 단백질을 비교하였다. 구체적으로, 1 MOI로 감염된 3×105 BHK-21 세포를 200 ㎕의 샘플 로딩 버퍼(80 mM Tri-HCl(pH 6.8), 2.0% SDS, 10% 글리세롤, 0.1 M DTT, 0.2% 브로모페놀 블루)를 이용하여 용해시킨 후, 용해된 세포(lysate)의 1/10을 5분간 끓인 후 SDS-폴리아크릴아마이드 젤에서 분획화시켰다(fractionated). 트랜스-블롯(trans-blot) SD 전기영동 전달 세포 기계(electrophoretic transfer cell machine, Bio-Rad Labs Inc. Hercules, CA)를 이용하여 SDS-폴리아크릴아마이드 젤로부터 메탄올로 활성화시킨 폴리비닐리딘 다이플루오라이드 막으로 단백질을 전기적으로 옮긴 후, 세척 용액(0.2% 트윈 20이 첨가된 PBS)에 용해시킨 5% 비지방 분유를 이용하여 실온에서 1시간 동안 막을 블록시켰다. 세척 용액으로 세 차례 세척한 후, 액틴 단백질의 모든 동소체(isoform)의 C-말단에 보존되어 있는 에피토프(epitope)를 인식하는 단클론 항-액틴 항체(A4700, Sigma, St. Louis, MO) 또는 JEV에 특이적인 마우스 과면역성(hyperimmune) 복수액(ascites fluid)(ATCC VR-1259AF)으로 실온에서 2시간동안 막을 배양하였다. 세척 용액으로 막을 세 차례 세척한 후, alkaline phosphatase(AP)와 결합된 염소 항-마우스 IgG(Jackson ImmunoResearch Labs Inc., West Grove, PA)로 실온에서 2시간동안 배양하였다. 막을 세척용액으로 세 차례 세척한 후 PBS로 한번 세척하였다. 막에 존재하는 액틴 또는 JEV 단백질 밴드는 기질인 5-브로모-4-클로로-3-인돌릴-포스페이트 및 니트로블루 테트라졸리움을 막과 함께 배양함으로써 시각화시켰다. 그 결과, 합성 JEV 바이러스 및 모 바이러스 모두 유사한 양과 동일한 패턴의 JEV 바이러스-특이적 단백질을 생산한다는 것을 확인하였다(도 5의 C, 위 패널). 샘플 로딩 대조군으로는 액틴(actin) 단백질을 사용하였으며, 동일한 양의 액틴 단백질이 목-감염된 세포와 합성 JEV 바이러스 및 모 바이러스로 감염된 세포에 존재함을 확인하였다(도 5의 C, 아래 패널).
<6-4> 노던 블롯 분석을 통한 바이러스 게놈 RNA의 합성 비교
본 발명자들은 상기의 전체-길이의 감염성이 있는 JEV cDNA(pBACSP6/JVFL/XhoI, pBACSP6/JVFLx/XhoI, pBACSP6/JVFLx/
XbaI, 및 pBACSP6/JVFLx/XbaIMBN) 주형으로부터 얻어진 합성 JEV 바이러스와 모 바이러스 CNU/LP2로 감염된 BHK-21 세포에서 발현되는 JEV 바이러스의 RNA를 비교하였다. 구체적으로, 1 ㎖의 TRIzol 시약(Gibco/BRL)을 사용하여 3×105의 감염된 BHK-21 세포로부터 전체 RNA를 추출하였다. JEV-특이적 RNA를 분석하기 위하여, 추출된 전체 RNA의 1/3에 대하여 노던 블롯 분석을 실시하였다(Sambrook et al., Molecular cloning, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory). 2.2 M 포름알데히드-1% 아가로즈 젤에서 RNA를 전기영동한 후 나일론 막(Amersham Biosciences Inc., Piscataway, NJ)으로 전달하였다. 254 nm 광원( Stratalinker UV cross-linker, Stratagene, La Jolla, CA)을 사용하여 막에 존재하는 RNA를 막과 상호-연결(cross-link)시킨 후, JEV 게놈의 9,143-9,351 뉴클레오타이드 염기서열에 상보적으로 결합하는 [32P]CTP-표지된 안티센스 리보프로브(riboprobe)와 함께 배양시킴으로써 JEV-특이적 RNA를 검출하였다. pBACSP6/JVFLx/XbaI의 209 bp HindIII-SacI 절편을 같은 효소로 절단한 pGEM3Zf(+)에 삽입시켜 pGEM3Zf(+)/JV9143을 제조하였다. 상기 pGEM3Zf(+)/JV9143를 BamHI 효소로 절단시켜서 BamHI-선형화된 cDNA 클론으로부터 시험관내 전사반응을 통해서 상기 리보프로브를 합성하였다. T7-MEGAscript 키트(Ambion, Austin, TX)를 사용하여 3.12 μM의 [α-32P]CTP(800 Ci/m㏖, Amersham)를 포함하는 20 ㎕의 반응 혼합액으로부터 제조사의 지침에 따라 상기 BamHI-선형화된 pGEM3Zf(+)/JV9143 클론을 전사시켰다. DNase I을 처리한 후, 전사반응에 포함되지 않은(unincorporated) 리보뉴클레오사이드 트리포스페이트를 제거하기 위하여 반응 혼합액을 Quick Spin G-50 세파덱스 칼럼(Boehringer mannheim)에 적용시켰다. 배양 용액[5×SSPE(0.9 M NaCl, 50 mM NaH2PO4 및 5 mM EDTA pH 7.7), 5×Denhardt's 시약, 0.5% SDS, 100 ㎍/㎖의 변성된 연어 정충 DNA, 50% 포름아마이드]에서 55℃에서 6시간 동안 막을 전배양시킨 후, 1×107 cpm의 표지된 리보프로브를 포함하는 배양 용액에서 55℃에서 밤새 배양시켰다. 1×SSPE, 0.5% SDS를 사용하여 55℃에서 10분간 세 차례 막을 세척한 후, 0.1×SSPE, 0.5% SDS를 사용하여 10분간 한차례 세척하였다. 바이러스 RNA 밴드를 자가방사선사진(autoradiography)으로 시각화시킨 후, Molecular Imager(Bio-Rad Lab)를 이용하여 정량하였다. 그 결과, 모든 경우에 있어서 바이러스 RNA의 발현 정도가 유사하였다(도 5의 D). 상기 블롯을 이미지 분석기로 정량한 결과 바이러스 게놈 RNA(도 5의 D, 위 패널)와 18S rRNA(도 5의 D, 아래 패널)의 비율이 의미있는 정도로 다르지는 않았으며, 이러한 사실로부터 모든 경우에 바이러스 게놈 RNA가 유사한 정도로 발현된다는 것을 확인하였다.
상기의 결과로부터, 모든 전체-길이의 감염성이 있는 JEV cDNA(pBACSP6/JVFL/XhoI, pBACSP6/JVFLx/XhoI, pBACSP6/JVFLx/
XbaI, 및 pBACSP6/JVFLx/XbaIMBN) 주형으로부터 얻어진 합성 JEV 바이러스는 플라크 형태, 세포병원성(cytopathogenicity), 바이러스 성장 패턴, 바이러스 단백질의 합성, 및 바이러스 게놈 RNA의 합성의 관점에서 모 바이러스 CNU/LP2와 구별할 수 없었다. 아울러 3' 말단 서열의 분석의 결과, 어떤 합성 바이러스로부터 유도된 바이러스 RNA 게놈의 3' 말단에서도 바이러스와 연관되지 않는 서열인 추가적인 세 개(CGA) 또는 네 개(CTAG) 뉴클레오타이드는 발견되지 않았다. 상기 결과로부터 본 발명에서 개발된 감염성이 있는 JEV cDNA 클론을 분자 유전학적 용도로 사용할 수 있음을 확인하였다.
<실시예 7> 형질전환된 배양액의 모 바이러스(parental virus)에 의한 오염 여부 확인
상기의 결과들은 JEV cDNA 클론이 SP6 또는 T7 폴리머라제에 의한 전사 후에 높은 감염성을 가진 합성 RNA 전사체를 생산할 수 있다는 것을 강하게 제시하지만, 형질전환된 배양액이 모 바이러스 CNU/LP2에 오염되었을 가능성을 완전히 배제할 수 없다. 따라서, 그러한 가능성을 완전히 배제하기 위하여 본 발명자들은 유전자 마커(genetic marker, gm)를 pBACSP6/JVFLx/XbaI 벡터에 도입하기 위하여 PCR을 이용한 위치 지정 돌연변이(site-directed mutagenesis)를 실시하였다. 구체적으로, PCR에 의한 위치 지정 돌연변이(site-directed mutagenesis)유도에 의하여 pBACSP6/JVFLx/XbaI에 존재하는 NS5 유전자 내부에 점 돌연변이 A8171 → C(silence)를 도입하여 pBACSP6/JVFLx/gm/XbaI을 제조하였다(도 6의 A). 점 돌연변이에 의하여 NS5 유전자 내부에 새로운 XhoI 제한효소 인식 부위가 생성된다. 먼저, A8171 → C 치환에 의하여 XhoI 인식 부위가 생성되는 서열번호 29로 기재되는 프라이머 J48 및 서열번호 30으로 기재되는 프라이머 J3을 사용하여 PCR에 의하여 pBACSP6/JVFLx/XbaI 유래의 절편을 제조하였다. 그 결과 생성된 앰플리콘의 665 bp MluI-ApaI 절편을 pBACSP6/JVFLx/XbaI의 4,802 bp ApaI-BsrGI 절편 및 5,874 bp BsrGI-MluI 절편과 함께 접합시켜 pBACSP6/JVFLx/gm/XbaI을 제조하였다. XbaI-선형화되고 MBN-처리된 pBACSP6/JVFLx/gm/XbaIMBN으로부터 합성된 RNA 전사체로 형질전환된 BHK-21 세포는 유전자 마커를 포함하는 감염성이 있는 합성 JEV 바이러스(JVFLx/gm/XbaIMBN으로 표기)를 생산하였다(도 6의 A). JVFLx/gm/XbaI
MBN의 표현형적 특성은 최초의 바이러스 JVFLx/XbaIMBN의 경우와 다르지 않았는데, 이것은 A8171 → C 치환이 바이러스 자가복제에 영향을 미치지 않았음을 나타낸다.
JVFLx/gm/XbaIMBN 바이러스가 pBACSP6/JVFLx/gm/XbaIMBN의 cDNA 주형으로부터 유래된 것임을 증명하기 위하여, 본 발명자들은 BHK-21 세포에서 생산된 바이러스를 0.1 MOI로 순차적으로 계대배양하였다. 각각의 계대배양에서 얻은 바이러스는 입력(input) RNA 전사체와 주형 cDNA 플라스미드의 오염을 피하기 위하여 RNase A 및 DNase I을 각각 처리한 후 계대배양하였다(Mendez et al., J. Virol., 1998, 72, 4737-4745). A8171 → C 치환을 포함하는 2,580 bp PCR 산물을 증폭하기 위하여, 1 및 3 계대배양에서 방출된 JVFLx/gm/XbaIMBN 및 JVFLx/XbaIMBN 바이러스로부터 추출된 바이러스 RNA를 RT-PCR에 사용하였다(도 6의 B, 레인 1, 3 및 5). JVFLx/gm/XbaIMBN으로부터 증폭된 RT-PCR 산물을 XhoI으로 처리했을 경우 1,506 bp 및 1,074 bp의 두 개의 절편이 생성되었다(도 6의 B, 레인 2 및 4). 반면에, JVFLx/XbaIMBN 으로부터 증폭된 RT-PCR 산물은 XhoI에 의해서 절단되지 않았다(도 6의 B, 레인 5 및 레인 6 비교). 상기 결과는 A8171 → C 치환이 실제로 JVFLx/gm/XbaIMBN 바이러스 RNA에 존재한다는 것을 의미한다. 따라서, 본 발명자들은 합성된 JVFLx/gm/XbaIMBN 바이러스는 전체-길이의 감염성이 있는 JEV cDNA pBACSP6/JVFLx/gm/XbaIMBN으로부터 유래된 것임을 확인하였다.
<실시예 8> 전체-길이의 감염성이 있는 JEV cDNA의 유전학적 안정성 분석
이전의 전체-길이의 JEV cDNA를 합성하려는 연구에서는 구조 단백질 prM 및 E를 코딩하는 부위에서 종종 난센스(nonsense) 돌연변이가 발생한다는 것이 보고된 바 있다(Sumiyoshi et al., J. Virol., 1992, 66, 5425-5431). JEV에 대한 분자 생물학적 연구에는 신뢰할 수 있는 감염성이 있는 JEV cDNA 클론이 필수적으로 요구되기 때문에, 본 발명자들은 pBACSP6/pJVFLx/XbaI의 유전자 구조 및 기능에 관해서 몇 가지 방법으로 심도있게 분석하였다.
구체적으로, 감염성이 있는 JEV cDNA의 유전자 구조 및 기능을 하기와 같이 분석하였다. E.coli DH10B 균주를 pBACSP6/JVFLx/XbaI으로 형질전환 시킨 후, 독립적으로 유래된 두 개의 클론을 12.5 ㎍/㎖의 클로람페니콜을 포함하는 10 ㎖의 2xYT 배양액에 접종한 후 37℃에서 밤새 배양하였다. 상기 일차 배양 세포들을 매일 106배씩 희석시키면서 9일간 유지시켰다(Almazan et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97, 5516-5521). 본 발명의 실험 조건에서, 각각의 계대배양은 약 20세대를 나타내며, 이것은 이전 보고에서 관찰된 것과 부합된다(Alamzan et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97, 5516-5521). 3번, 6번 및 9번의 계대배양 후에, SDS-알칼라인(alkaline) 방법에 의하여 큰-규모(large-scale)의 감염성이 있는 cDNA 플라스미드를 DH10B로부터 분리하였고, 세시움 클로라이드 밀도 경사 원심분리(cesium chloride density gradient centrifugation)로 플라스미드를 정제하였다(Sambrook et al., Molecular cloning, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory). 플라스미드 DNA의 유전자 구조를 제한효소 인식 부위 패턴에 의하여 조사하였다. 0번, 3번, 6번 및 9번의 계대배양 후에 분리 정제된 플라스미드를 제한효소 분석으로 플라스미드의 유전자 구조를 조사하였다. 3, 6, 및 9번 계대배양에서의 제한효소 패턴은 0번 계대배양시와 비교하였을 때 시각적으로는 차이가 나지 않았다. 따라서, 아가로즈 젤 전기영동 분석의 해상도 범위 내에서, 두 가지 감염성이 있는 cDNA 클론은 구조적으로 안정한 것으로 보인다.
또한, XbaI 절단 및 녹두 뉴클레아제(MBN) 처리에 의하여 선형화된 cDNA 주형으로부터 전사된 합성 RNA 전사체의 특이적 감염성(specific infectivity)을 측 정함으로써 계대배양된 JEV cDNA 플라스미드의 유전학적 안정성을 기능적인 측면에서 분석하였다. 그 결과, 두 개의 독립적으로 분리 및 정제된 cDNA로부터 제조된 RNA 전사체의 특이적 감염성은 0번 계대배양과 9번 계대배양사이에서 큰 차이를 보이지 않았다(도 7). 상기 결과로부터, 감염성이 있는 JEV cDNA는 E. coli에서의 계대배양 과정에서 구조적 및 기능적으로 안정하게 유지되고 있음을 확인하였다.
<실시예 9> 감염성이 있는 JEV cDNA를 이형 유전자의 발현을 위한 벡터로의 응용
이전에 보고된 바와 같이(Burke and Monath, Flaviviruses, 2001, 1043-1125, Lippincott Williams&Wilkins Publishers), 본 발명자들은 JEV는 인간, 마우스, 원숭이, 돼지, 개, 고양이 및 햄스터를 포함하는 다양한 종류의 진핵세포에서 자가복제될 수 있음을 발견하였다. 상기 결과는 JEV가 다양한 종류의 세포에서 이형 유전자의 발현을 위한 벡터로 유용하게 사용될 수 있음을 의미한다. 이를 테스트하기 위하여, EMCV IRES(internal ribosome entry site of encephalomyocarditis virus) element에 의하여 유도되는 발현벡터에 pBACSP6/JVFLx/XbaI상의 바이러스 3' NTR 시작 부위에 일반적으로 사용되는 두 가지 리포터 유전자인 Aequeorea victoria GFP(green fluorescent protein) 및 Photinus pyralis LUC(luciferase)을 삽입시켰다(도 8의 A).
이를 위하여, 먼저 pBACSP6/JVFLx/GFP/XbaI(도 8의 A)을 제조하기 위하여, pBACSP6/JVFLx/XbaI 유래의 절편을 서열번호 31로 기재되는 프라이머 J72 및 서열번 호 32로 기재되는 프라이머 J73을 사용한 PCR에 의하여 증폭시켰다. 또한, 서열번호 33으로 기재되는 프라이머 J74 및 서열번호 34로 기재되는 프라이머 J75를 사용하여 pRSGFP-C1의 절편을 증폭하였다. J72 및 J75 프라이머를 사용한 PCR의 두 번째 실행에 의하여 상기 두 가지 절편을 융합시켰다. 그 결과 생성된 앰플리콘의 913 bp KpnI-NsiI 절편을 pBACSP6/JVFLx/XbaI의 8,011 bp NsiI-Pac
I 및 11,021 bp PacI-KpnI 절편에 접합시켜 pBACSP6/JVFLx/GFP/XbaI을 제조하였다.
다음으로, pBACSP6/JVFLx/LUC/XbaI(도 8의 A)을 제조하기 위하여, pBACSP6/JVFLx/XbaI 유래의 절편을 프라이머 J72 및 서열번호 35로 기재되는 프라이머 J76을 사용한 PCR에 의하여 증폭시켰다. 또한, 서열번호 36으로 기재되는 프라이머 J77 및 서열번호 37로 기재되는 프라이머 J78을 사용하여 pACNR/NADLcIn-/LUC(Charles M. Rice로부터 받음)의 절편을 증폭하였다. J72 및 J78 프라이머를 사용한 PCR의 두 번째 실행에 의하여 상기 두 가지 절편을 융합시켰다. 그 결과 생성된 앰플리콘의 1,801 bp KpnI-NsiI 절편을 pBACSP6/JVFLx/XbaI의 8,011 bp NsiI-PacI 및 11,021 bp PacI-KpnI 절편에 접합시켜 pBACSP6/JVFLx/LUC/
XbaI을 제조하였다.
NS3 유전자의 가운데 부분에 83개의 5,581-5,663 뉴클레오타이드가 결실되어 5,596 뉴클레오타이드에서 바이러스 번역이 조기종결(pretermination)되는 pBACSP6/JVFLx/LUCREP-/XbaI 벡터(도 8의 A)를 제조하기 위하여, pBACSP6/JVFLx/LUC/XbaI 절편을 서열번호 38로 기재되는 프라이머 J89 및 서열번호 39로 기재되는 프라이머 J91을 사용하여 PCR에 의하여 증폭시켰다. 또한, 서열번호 40으로 기재되는 프라이머 J92 및 서열번호 41로 기재되는 프라이머 J93을 사용하여 pBACSP6/JVFLx/LUC/XbaI의 절편을 증폭하였다. J89 및 J93 프라이머를 사용한 PCR의 두 번째 실행에 의하여 상기 두 가지 절편을 융합시켰다. 그 결과 생성된 앰플리콘의 3,960 bp SfiI-EagI 절편을 pBACSP6/JVFLx/LUC/XbaI의 6,493 bp EagI-SfiI 및 10,297 bp SfiI-SfiI 절편에 접합시켜 pBACSP6/JVFLx/LUCREP-
/XbaI을 제조하였다.
CNU/LP2 뿐만 아니라 전체 서열이 밝혀진 세 개의 JEV 바이러스주(Williams et al., J. Gen. Virol., 2000, 81, 2471-2480; Nam et al., Am. J. Trop. Med. Hyg., 2001, 65, 388-392; Jan et al., Am. J. Troop. Med. Hyg., 1996, 55, 603-609)에서, 9-25 bp의 작은 결실이 바이러스 3'NTR 시작부위에서 관찰되었는데, 이것은 상기 부위가 이형 유전자를 삽입시키기 위한 좋은 부위가 될 수 있음을 제시한다. 따라서, 상기와 같이 합성된 pBACSP6/JVFLx/GFP/XbaI와 pBACSP6/JVFLx/LUC/XbaI cDNA를 주형으로해서 만들어진 합성 RNA 전사체로 BHK-21 세포를 형질전환시켰을 때, 이형 유전자의 삽입으로 인해서 합성 RNA 전사체의 특이 적 감염성이 변화하지는 않았다.
GFP 발현을 조사하기 위하여, pBACSP6/JVFLx/GFP/XbaIMBN cDNA 주형에서 전사된 감염성이 있는 합성 RNA 전사체로 순수한(naive) BHK-21 세포를 형질전환시킨 후, 동초점 현미경으로 조사하였다. 구체적으로, BHK-21 세포를 목-형질전환 (mock-transfection)시키거나 또는 2 ㎍의 JVFLx/GFP/XbaIMBN RNA를 사용하여 형질전환시켰다. 1×105의 형질전환된 세포를 4-웰 챔버 슬라이드에서 30시간 동안 배양시켰다. PBS를 사용하여 세포를 두차례 세척한 후 0.37%(v/v) 포름알데하이드(formaldehyde)가 첨가된 PBS에 25℃에서 30분간 배양시켜 고정하였고, 0.2 ㎖의 80% 글리세롤로 마운팅을 실시하였다. 마운팅된 세포는 동초점 현미경으로 관찰하였다. 그 결과, GFP는 핵과 세포질 사이에 확산될 수 있을 정도로 충분히 작기 때문에(약 30 kDa), GFP를 발현하는 BHK-21 세포는 핵과 세포질 모두에서 초록색 형광이 나타났다(도 8의 B, JVFLx/GFP/XbaIMBN). 예상된 바와 같이, 이러한 형광은 목-형질전환된 세포(도 8의 B, Mock)뿐만 아니라 pBACSP6/JVFLx/XbaIMBN
유래의 RNA 전사체로 형질전환된 세포에서는 관찰이 되지 않았다.
시간에 따른 LUC의 유도(induction)를 정량적으로 분석하기 위하여, 본 발명자들은 pBACSP6/JVFLx/LUC/XbaIMBN 유래의 복제-수용성(replication-competent) RNA 전사체 뿐만 아니라, pBACSP6/JVFLx/LUCREP-/XbaIMBN 유래의 복제-비수용성 (replication-incompetent) RNA 전사체도 제조하였다(도 8의 A). pBACSP6/JVFLx/LUCREP-/XbaIMBN 주형은 NS3 유전자의 가운데 부위인 뉴클레오타이드 5,581-5,663에 83개 뉴클레오타이드가 결실되어있다. 따라서 뉴클레오타이드 5,596에서 바이러스의 번역이 미리종결(pretermination) 됨으로 바이러스 RNA의 자가복제가 일어나지 않는다(도 8의 A의 * 참조, pBACSP6/JVFLx/LUCREP-/XbaI
MBN).
pBACSP6/JVFLx/LUC/XbaIMBN상의 바이러스 cDNA에 엔지니어링된 LUC 유전자로부터 발현되어지는 루시퍼라제 양을 분석하기 위해서, 8×106의 BHK-21 세포를 목-형질전환(mock-transfection)시키거나, 2 ㎍의 JVFLx/LUC/XbaIMBN RNA 또는 JVFLx/LUCREP-/XbaIMBN RNA로 형질전환시켰다. 6×105 세포/웰의 농도로 세포를 6-웰 플레이트에 분주한 후 배양하였다. 정해진 시점에서, Ca2+ 및 Mg2+가 제거된 PBS 용액으로 세포를 세척한 후 0.2 ㎖의 용해 버퍼[25 mM Tris-phosphate pH 7.8, 2 mM DTT, 2 mM 1,2-diaminocyclohexane-N,N,N',N'-tetraacetic acid, 10% glycerol, 1% Triton X-100(v/v)]를 각각의 웰에 첨가시켜 세포를 용해시켰다. 세포 용해물(lysate)을 실온에서 10분간 배양시킨 후, 세포 침전물(debris)을 원심분리로 제거하였다. 상등액을 신속하게 실험전까지 -80℃에 보관하였다. 루시퍼라제 활성을 측정하기 위하여, 20 ㎕의 세포 용해물을 100 ㎕의 루시퍼라제 분석 시약[20 mM Tricine, 1.07 mM(MgCO3)4Mg(OH)2·5H2O, 2.67 mM MgSO4, 0.1 mM EDTA, 33.3 mM DTT, 270 μM coenzyme A, 470 μM luciferin(Promega), 530 μM ATP]이 포함되어 있는 발광측정기(luminometer) 튜브에 위치시켰다(placed). 루시퍼라제 활성은 10 초간 측정하였다. 각각의 데이터는 세 번의 독립적인 실험의 결과를 나타낸다.
그 결과, 복제-수용성 JVFLx/LUC/XbaIMBN RNA로 형질전환된 BHK-21 세포에서는(도 8의 C, 검은 원), 형질전환후 6시간에 최초 루시퍼라제 활성이 2.4±0.2×103 RLU(relative light units) 이었다. 이러한 활성은 형질전환후 30시간에 5.3±0.1×104 RLU로 극적으로 증가되었으며, 형질전환후 54시간에는 7.8±0.1×105 RLU에 이르렀고, 이 시점에서 >50%의 세포가 죽었다. 반면에, 복제-비수용성 JVFLx/LUCREP-/XbaIMBN RNA로 형질전환된 BHK-21 세포에서는, 형질전환후 6시간에 최초 루시퍼라제 활성이 1.9±0.4×103 RLU로서(도 8의 C, 흰 원) JVFLx/LUC/XbaIMBN-로 형질전환된 세포의 경우와 유사하였으나(도 8의 C, 검은 원), 시간이 경과함에 따라 활성이 점진적으로 감소하여 형질전환후 54시간에는 16±1.2 RLU로 감소하였다. 이러한 수치는 순수한(naive) 세포의 배경(background) 루시퍼라제 활성 수준이다(도 8의 C, 흰 원). 따라서, 시간에 따라 발현되는 루시퍼라제 활성의 정도는 바이러스 복제의 유무에 따라 다르게 나타난다.
또한, 본 발명자들은 상기에서 기술한 것과 같이 GFP와 LUC 유전자를 가진 전체-길이의 감염성이 있는 재조합 JEV cDNA를 제조하였다. 재조합 JEV cDNA로부 터 합성한 JEV RNA 전사체로 BHK-21 세포를 형질전환시킨 후, 배양 상등액으로부터 GFP와 LUC 유전자를 포함한 재조합된 JEV JVFLx/GFP/XbaIMBN 및 JVFLx/LUC/XbaI
MBN를 제조하였다. 이렇게 생산된 재조합 JEV 바이러스(recombinant JEV)로부터 GFP와 LUC 유전자의 발현여부는 일반적으로 생명과학 및 의학분야에서 많이 사용되는 다양한 동물 세포주(BHK-21, Vero, NIH/3T3, ST, HeLa, MDCK, CRFK, B103, 및 SHSY-5Y)를 상기 바이러스로 감염시킴으로써 관찰하였다. 그 결과, 바이러스 게놈 RNA에 삽입된 GFP 또는 LUC 유전자는 분석한 모든 종류의 세포에서 발현됨을 관찰할 수 있었다(표 4). 따라서, 재조합된 JEV cDNA, JEV RNA 전사체, 및 JEV 바이러스 입자는 다양한 종류의 세포내에서 외래 이형 유전자의 발현을 위한 벡터로써 유용하게 사용될 수 있음을 확인하였다.
| 감염에 사용된 세포주 | GFP의 발현a | LUC의 유도b |
| BHK-21 | 발현됨 | 발현됨 |
| Vero | 발현됨 | 발현됨 |
| HeLa | 발현됨 | 발현됨 |
| MDCK | 발현됨 | 발현됨 |
| CRFK | 발현됨 | 발현됨 |
| NIH/3T3 | 발현됨 | 발현됨 |
| ST | 발현됨 | 발현됨 |
| B103 | 발현됨 | 발현됨 |
| SHSY-5Y | 발현됨 | 발현됨 |
a : 재조합된 JEV JVFLx/GFP/XbaIMBN으로 세포를 감염시킨 후 GFP의 발현을 분석하였다.
b : 재조합된 JEV JVFLx/LUC/XbaIMBN으로 세포를 감염시킨 후 LUC 단백질의 발현을 분석하였다.
<실시예 10> 감염성이 있는 JEV cDNA의 신규한 이형 유전자 발현 시스템으로 용도
본 발명자들은 추가적으로 목적하는 외래 유전자를 발현하는 JEV 발현 시스템의 용도를 연구하였다. 먼저, 본 발명자들은 세 가지의 흔히 사용되는 다양한 크기의 이형 리포터 유전자, 즉 EGFP(an improved version of the Aequorea victoria GFP gene, 768 bp), 포티누스 피라리스(Photinus pyralis)의 LUC 유전자(1653 bp), 및 LacZ 유전자(3012 bp)를 발현시키기 위하여 전체-길이의 바이러스 게놈을 엔지니어링하였다(도 9의 B). 본 발명자들은 또한 항생제 퓨로마이신(puromycin)에 저항성을 부여하는 우성 선택 마커 PAC(600 bp)를 도입시켰다(도 9의 B)
<실시예 10> BAC로 작용하는 비시스트론(bicistron) 전체-길이의 감염성이 있는 JEV cDNA에 기초한 이형 유전자를 코딩하는 감염성이 있는 재조합 JEV의 제조 및 특성 분석
<10-1-1> 감염성이 있는 재조합 JEV 벡터의 플라스미드 제조
표준 분자생물학 프로토콜에 따라 모든 플라스미드를 제조하였고(Sambrook et al., Molecular cloning: a laboratory manual, 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989), PCR에 의하여 증폭된 모든 부위는 서열분석으로 확인하였다. 본 발명에서 사용된 모든 재조합 JEV 벡터를 pBACSP6/JVFLx/XbaI에 기초하여 제조하였고(Yun et al., J. Virol., 2003, 77, 6450-6465), 이후부터 상기 벡터를 pJEV/FL로 명명한다(도 9의 A).
본 발명자들은 LUC, EGFP, LacZ, 및 PAC 유전자를 발현하는 4 개의 감염성이 있는 재조합 JEV 벡터 세트를 제조하였다. pJEV/FL/LUC는 상기의 실시예 9에서 기술된 pBACSP6/JVFLx/LUC/XbaI로 명명된 컨스트럭트와 동일하다(도 9의 B). pJEV/FL/LacZ를 제조하기 위하여, 먼저 pJEV/FL/LUC의 2,409 bp Kpn I-Avr Ⅱ 절편을 Kpn I 및 Xba I으로 절단한 pGEM3Zf(+)내로 서브클론하여 pGEM/LUC를 제조하였다. pSinRep3/LacZ(Charles Rice 박사로부터 분양받음)의 3,177 bp Nco I-Stu I 절편을 pGEM/LUC의 3,935 bp Nco I-Nsi I(T4 DNA 폴리머라제-처리) 절편과 접합시켜 pGEM/LacZ를 제조하였다. pGEM/LacZ의 3,873 bp Kpn I-Not I 절편을 pJEV/FL/LUC의 7,456 bp Not I-Pac I 및 11,021 bp Pac I-Kpn I 절편과 접합시켜 pJEV/FL/LacZ를 제조하였다(도 9의 B). 서열번호 49로 기재되는 EGFPF 프라이머 및 서열번호 50으로 기재되는 EGFPR 프라이머를 사용하여 pEGFP-C1의 PCR 증폭에 의하여 EGFP를 코딩하는 서열 절편을 제조하였다. EGFP 절편 앰플리콘의 773 bp Nco I-Stu I 부위를 pRS/LacZ의 3,241 bp EcoR V-Sac Ⅱ 및 2,062 bp Sac
Ⅱ-Nco I 절편과 접합시켜 pRS/EGFP를 제조하였다. pRS/EGFP의 3,406 bp Sac Ⅱ-Not I 절 편을 pJEV/FL/LUC의 7,456 bp Not I-Pac I 및 9,102 bp Pac I-Sac Ⅱ 절편과 접합시켜 pJEV/FL/EGFP를 제조하였다(도 9의 B). pJEV/FL/PAC를 제조하기 위하여, pACNR/NADLcIns-/PAC(Charles Rice 박사로부터 분양받음) 절편을 서열번호 51로 기재되는 PACF 프라이머 및 서열번호 52로 기재되는 PACR로 PCR-증폭시켰다. 그 결과 생산된 앰플리콘의 881 bp Dra Ⅲ-Nsi I 부위를 pJEV/FL/LUC의 8,011 bp Nsi I-Pac I, 10,096 bp Pac I-Nde I, 및 842 bp Nde I-Dra Ⅲ과 접합시켜 pJEV/FL/PAC를 제조하였다(도 9의 B). EMCV IRES에 의하여 유도된 발현 카세트를 pJEV/FL의 바이러스 3' NTR의 시작 부위에 삽입시켰다(도 9의 A 및 도 9의 B).
<10-1-2> EGFP 발현 분석
형질전환된 세포를 36-48 시간 동안 4개 웰 챔버 슬라이드(well chamber slide)내에서 시드(seed) 배양하였다. 배양 후에, 0.37%(v/v) 포름알데히드를 포함한 PBS에서 배양함에 의하여 세포를 고정시키고, 0.2 ㎖ 80% 글리세롤로 마운팅을 실시하였다. 적당한 필터를 이용한 공초점 현미경(confocal microscope)로 세포를 관찰하였다. EGFP의 발현을 플로우 사이토미터(flow cytometer) 분석으로 조사하였다. 구체적으로 세포를 트립신처리하고, PBS로 한 번 세척하고, PBS내에서 0.37%(v/v) 포름알테히드로 재현탁한 후, FACScan flow cytometer FACSCalibur(Becton Dickinson)로 분석하였다. 적당한 정방향 및 측면 광-분산계(forward and side light-scattering gates)에 의하여 사멸된 세포를 배 제시켰다. 살아있는 만 개의 세포를 분석에 사용하였다.
<10-1-3> β-갈락토시다제(galactosidase) 분석
PBS로 세포를 한 번 세척하고, 0.05%(v/v) 글루타알데히드를 포함한 PBS로 실온에서 15분 동안 고정시킨 후, 다시 PBS로 주의하여 세 번 세척하였다. 5-브로모-4-클로로-3-인도릴-β-갈락토피라노사이드(5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-galactopyranoside)(Sigma)와 염색용액[5 mM 포타슘페리시안나이드(potassium ferricyanide), 5 mM 포타슘페로시안나이드(potassium ferrocyanide), 2 mM MgCl2 함유한 PBS]을 37℃에서 함께 반응시켜서 세포의 β-gal 활성을 측정하였다.
<10-1-4> 루시페라제(luciferase) 분석
상기에서 기술한 방법(Yun et al., J. Virol., 2003, 77, 6450-6465)에 따라 기질 루시페린(luciferin)(Promega)을 사용하여 세포의 LUC 활성을 측정하였다. 각 실험은 세 번 반복하여 수행하였고, 평균값을 제시하였다.
<10-1-5> 퓨로마이신(puromycin) 셀렉션(selection)
세포를 37℃에서 6시간 동안 6-웰 플레이트에서 시드 배양하였다. PurR foci 형성을 측정하기 위하여, 0.5% SeaKem LE agarose(FMC BioProducts, Rockland, Maine), 가열에 의해 비활성화된 10% FBS 및 페니실린/스트렙토마이신을 포함한 MEM 배양액으로 세포를 덮고 이틀 동안 37℃에서 배양하였다. 그 이후에 퓨로마이신(10 ㎍/㎖)을 첨가하거나 배제시켜서 추가적으로 3일 동안 배양하였다. 셀렉션(selection) 이후에, 포름알데히드-고정된 세포를 크리스탈 바이오레잇 염색에 의하여 PurR foci를 관찰하였다(Yun et al., J. Virol., 2003, 77, 6450-6465). PurR 세포 배양을 위하여, 세포를 아가로스 플럭(agarose plug)으로 덮지 않은채 이틀 동안 37℃에서 완전 배지(complete medium)에서 배양하였다. 이어서, 셀렉션을 위해서 10 ㎍/㎖ 퓨로마이신을 포함한 완전 배지에서 24-48 시간 동안 배양하고, 살아남은 세포를 크리스탈 바이오레잇(crystal violet)으로 염색하여 관찰하였다.
<10-1-6> 추가적인 발현 단위를 포함하는 재조합 합성 JEV RNA/바이러스로 형질전환/감염된 BHK-21 세포에서 발현되는 이형 단백질
발현 카세트의 삽입이 벡터의 특이적인 감염성/복제를 변형시키는 지를 조사하기 위하여, 본 발명자들은 4 개의 SP6-유도된 외래 유전자를 함유한 감염성이 있는 JEV cDNA 컨스트럭트(construct)로부터 전사된 합성 RNA의 특이적인 시험관내 감염성을 조사하였다(표 5). 정제된 pJEV/FL 및 그 유도체 플라스미드를 Xba I 처리에 의하여 선형화시킨 뒤 MBN으로 처리하였다. 상기에서 기술한 바와 같이, 선형화된 플라스미드를 SP6 RNA 폴리머라제를 이용한 시험관내 전사반응(25 ㎕)에 사용하였다. 전사 후에, 반응 혼합액을 추가적으로 10 U의 DNase I과 30분 동안 반응시키고 페놀-클로로포름-이소아밀알콜(phenol-chloroform-isoamylalcohol)로 RNA 를 추출하였다. DE-81 여과지(Whatman, Maidstone, UK)에 RNA가 흡수되는 [3H]UTP 함입(incorporation)에 기초하여 RNA를 정량하였다. 상기에서 기술된 방법에 따른 일렉트로포레이션에 의하여 세포내로 유입된 RNA(2 ㎍)로 세포를 형질전환시켰다(Yun et al., J. Virol., 2003, 77, 6450-6465).
pJEV/FL/PAC, pJEV/FL/EGFP, pJEV/FL/LUC, 및 pJEV/FL/LacZ로부터 유도된 합성 RNA는 수용성 BHK-21 세포내로 삽입되었고, 각각 3.5x106, 2.5x106, 3.4x106
, 및 1.1x106 PFU/㎍의 특이적 감염성을 나타내었고, 이러한 결과는 모 벡터 pJEV/FL(3.2x106 PFU/㎍)의 감염성과 유사하다. 그러나, 재조합 합성 RNA로 형질전환된 BHK-21 세포는 pJEV/FL로 형질전환된 세포에 비하여 균일하며 작은 플라크를 형성하였다(도 9의 C). 이러한 결과는 재조합 RNA로 형질전환된 세포에서 관찰되는 감염성이 있는 바이러스(표 5, virus titer) 및 감소된 세포병원성(cytopathogenicity)(표 5, CPE)의 후기 생산(delayed production)과 일치한다. 또한, 본 발명자들은 재조합 RNA로 형질전환된 BHK-21 세포내 바이러스 단백질(도 9의 D)의 후기 축적(delayed accumulation)은 이전에 삽입된 외래 유전자의 길이와 상관 관계가 있음을 확인하였다(도 9의 B).
<표 5>
다양한 리포터 유전자를 포함하는 전체-길이의 JEV cDNA 유도체로부터 생성된 시험 관내 RNA 전사체의 특이적 감염성 및 재조합 바이러스 역가
| 전사를 위하여 사용된 주형a | 감염성b (PFU/RNA ㎍) | 바이러스 역가c | CPEd | |
| 48 시간 | 72 시간 | |||
| pJEV/FL | 3.2×106 | 3.0×106 | 5.1×105 | ++++ |
| pJEV/FL/PAC | 3.5×106 | 6.2×106 | 4.0×105 | ++ |
| pJEV/FL/EGFP | 2.5×106 | 9.0×104 | 2.1×105 | ++ |
| pJEV/FL/LUC | 3.4×106 | 2.0×104 | 3.2×105 | + |
| pJEV/FL/LUCREP | 0 | 0 | 0 | - |
| pJEV/FL/LacZ | 1.1×106 | 1.1×104 | 1.3×105 | + |
a : 시험관내 전사반응에 사용된 모든 JEV cDNA 주형은 Xba I 절단으로 선형화된 후에 MBN으로 처리하여 제조하였다.
b : SP6 RNA 폴리머라제를 사용한 시험관내 전사반응 이후에, 샘플을 사용하여 BHK-21 세포를 일렉트로포레이션하고, 감염성이 있는 플라크 센터를 측정하였다(Yun et al., J. Virol., 2003, 77, 6450-6465).
c : 일렉트로포레이션 후 48 시간 및 72 시간 뒤의 바이러스 역가
d : 전체-길이의 JEV cDNA 유도체로부터 생성된 RNA 전사체로 일렉트로포레이션 이후에 바이러스-유도된 CPE를 관찰하였다. 일렉트로포레이션 후 24 시간 뒤에, 모 벡터 pJEV/FL에서 '++++'로 표시한 바와 같은 강한 CPE를 관찰하였다. 일렉트로포레이션 후 60 시간 뒤에, pJEV/FL/PAC 및 pJEV/FL/EGFP에 있어서는 '++'로 표시한 바와 같은 CPE를 관찰하였다. pJEV/FL/LacZ에 있어서는 '+'로 표시한 바와 같이 일렉트로포레이션 후 72 시간 뒤에 분명한 CPE가 나타나기 시작하였다. '-'은 어떤 CPE도 나타나지 않음을 나타낸다.
감염성이 있는 JEV cDNA를 사용한 경우의 EGFP, LUC, LacZ 및 PAC 발현을 도 10에 나타내었다. 형광현미경을 사용하여 JEV/FL/EGFP RNA로 형질전환된 BHK-21 세포에서 밝은 녹색 형광을 관찰하였다(도 10의 A). 플로우 사이토미터(flow cytometer) 분석에 의한 경우, 목(mock)으로 형질전환된 세포(……)에 비교하여 녹색의 형광세포(-)는 99.7%가 상기 단백질을 포함하고 있음이 측정되었다(도 10의 B). 도 10의 C는 JEV/FL/LacZ RNA를 발현하는 BHK-21 세포의 X-gal 염색 패턴을 나타낸다. 또한, 본 발명자들은 시간 경과에 따른 복제 가능한(replication-competent) JEV/FL/LUC RNA로 형질전환된 BHK-21 세포(●) 또는 nt 5596(*)에서 바이러스 단백질의 해독을 조기 종결시키는 부위가 결여된 복제 불가능한(replication-incompetent) JEV/FL/LUCREP- RNA로 형질전환된 BHK-21 세포(○)의 LUC 활성을 모니터링하였다. 상기에서 기술된 바와 같이(Yun et al., J. Virol., 2003, 77, 6450-6465), 이러한 결과는 증가된 바이러스 복제는 증가된 LUC 활성과 상관 관계가 있음을 입증하였다(도 10의 D). 아울러, 퓨로마이신을 처리한 JEV/FL/PAC RNA로 형질전환된 BHK-21 세포의 셀렉션(도 10의 E)은 살아남은 JEV/FL/PAC RNA로 형질전환된 세포를 가리키며, 이 세포가 퓨로마이신을 함유한 배지(접시 7)를 완전히 덮거나 퓨로마이신을 함유한 배지를 덮은 반고체 한천 아래에 PurR foci를 형성하였다(접시 8). 반면에, 목(mock)으로 형질전환된 세포는 셀렉션 24 시간 뒤에 사멸하였다(접시 5-6). 예상한 바와 같이, 두 세포형 모두 퓨로마이신의 결여 배지에는 포화되도록 성장하였다(접시 1-4).
<10-2> JEV 바이러스 레플리콘의 제조 및 벡터 특성
<10-2-1> JEV 바이러스 레플리콘 벡터의 플라스미드 제조
구조 단백질의 코딩 서열내에 인-프레임(in-frame) 결실을 엔지니어링하기 위해서, 모든 JEV 바이러스 레플리콘을 위한 플라스미드는 pJEV/FL/LUC에 기초하여 제조하였다. 2 개의 아미노산 잔기, 즉 Leu 및 Glu의 삽입을 유발시키는 신규한 Xho I 부위에 의하여 모든 결실을 구별하였다. 첫째, 본 발명자들은 각 구조 단백질내에 단일 인-프레임 결실을 포함한 4 가지의 JEV 바이러스 레플리콘 벡터 세트를 제조하였다. C 유전자에 273개 뉴클레오타이드 결실(nt 132-404)을 포함하는 pJEV/Rep/ΔCC/LUC를 제조하기 위하여, pJEV/FL의 PCR 증폭에 의하여 2 개의 절편을 합성하였다. 즉, 서열번호 53으로 기재되는 DelF 프라이머 및 서열번호 54로 기재되는 C1R 프라이머를 사용하여 절편 C1를 합성하고, 서열번호 55로 기재되는 C2F 프라이머 및 서열번호 56으로 기재되는 DelR 프라이머를 사용하여 절편 C2를 합성하였다. 2 개의 절편(C1 절편 앰플리콘의 267 bp Pac I-Xho I 부위 및 C2 절편 앰플리콘의 226 bp Xho I-BsiW I 부위)을 pJEV/FL/LUC의 20,073 bp BsiW I-Pac I 절편과 접합시켜 pJEV/Rep/ΔCC/LUC 컨스트럭트를 제조하였다. C 유전자에 204-뉴클레오타이드 결실(nt 201-404)을 포함하는 pJEV/Rep/ΔC/LUC를 제조하기 위하여. pJEV/FL로부터 절편 C3를 DelF 프라이머 및 서열번호 57로 기재되는 C3R 프라이머를 사용하여 PCR 증폭시켰다. 그 결과 생성된 앰플리콘 336 bp Pac I-Xho I절 편을 pJEV/Rep/ΔCC/LUC의 12,850 bp Xho I-Rsr Ⅱ 및 7,449 bp Rsr Ⅱ-Pac I 절편과 접합시켜 pJEV/Rep/ΔC/LUC 컨스트럭트를 제조하였다. prM 유전자에 282-뉴클레오타이드 결실(nt 531-812)을 포함하는 pJEV/Rep/ΔprM/LUC를 제조하기 위하여, pJEV/FL의 PCR 증폭에 의하여 두 절편을 제조하였다. 즉, DelF 프라이머 및 서열번호 58로 기재되는 prM1R 프라이머를 사용하여 절편 prM1을 제조하였고, 서열번호 59로 기재되는 prM2F 프라이머 및 DelR 프라이머를 사용하여 절편 prM2를 제조하였다. 2 개의 절편(prM1 절편 앰플리콘의 666 bp Pac I-Xho I 부위 및 prM2 절편 앰플리콘의 1,616 bp Xho I-Sfi I 부위)을 pJEV/FL/LUC의 10,264 bp Sfi I-Nsi I 및 8,011 bp Nsi I-Pac I 절편과 접합시켜 pJEV/Rep/ΔprM/LUC 컨스트럭트를 제조하였다. E 유전자에 1,170-뉴클레오타이드 결실(nt 1,032-2,201)을 포함하는 pJEV/Rep/ΔE/LUC를 엔지니어링하기 위하여, pJEV/FL의 PCR 증폭에 의하여 2 개의 절편을 제조하였다. 즉, DelF 프라이머 및 서열번호 60으로 기재되는 E1R 프라이머를 사용하여 절편 E1을 제조하였고, 서열번호 61로 기재되는 E2F 프라이머 및 DelR 프라이머를 사용하여 절편 E2를 제조하였다. 2 개의 절편(prM1 절편 앰플리콘의 1,167 bp Pac I-Xho I 부위 및 prM2 절편 앰플리콘의 227bp Xho I-Sfi I 부위)을 pJEV/FL/LUC의 10,264 bp Sfi I-Nsi I 및 8,011 bp Nsi I-Pac I 절편과 접합시켜 pJEV/Rep/ΔE/LUC 컨스트럭트를 제조하였다(도 11의 A).
둘째, 본 발명자들은 JEV 구조 유전자내에 이중 인-프레임(double in-frame) 결실을 포함하는 3 개의 JEV 바이러스 레플리콘 벡터 패널을 제조하였다. 2 개의 pJEV/FL/LUC 절편(10,264 bp Sfi I-Nsi I 및 8,011-bp Nsi I-Pac I 절편)을 ⅰ) pJEV/Rep/ΔC+ΔprM/LUC를 제조하기 위하여 pJEV/Rep/ΔC/LUC의 438 bp Pac I-Hind Ⅲ 절편 및 pJEV/Rep/ΔprM/LUC의 1,646 bp Hind Ⅲ-Sfi I 절편과, ⅱ) pJEV/Rep/ΔC+ΔE/LUC를 제조하기 위하여 pJEV/Rep/ΔC/LUC의 866 bp Pac I-Mlu I 절편 및 pJEV/Rep/ΔE/LUC의 330 bp Mlu I-Sfi I 절편과, 또는 ⅲ) pJEV/Rep/ΔprM+ΔE/LUC를 제조하기 위하여 pJEV/Rep/ΔprM/LUC의 788 bp Pac I-Mlu I 절편 및 pJEV/Rep/ΔE/LUC의 30 bp Mlu I-Sfi I 절편과 각각 접합시켰다(도 11의 A).
셋째, 본 발명자들은 모든 JEV 구조 단백질이 결실된 2 개의 JEV 바이러스 레플리콘 벡터 세트를 제조하였다. pJEV/Rep/ΔC+ΔprM+ΔE/LUC를 제조하기 위하여, 2 개의 pJEV/FL/LUC 절편(10,264 bp Sfi I-Nsi I 및 8,011-bp Nsi I-Pac I 절편)을 pJEV/Rep/ΔC+ΔprM/LUC의 590 bp Pac I-Mlu I 절편 및 pJEV/Rep/ΔE/LUC의 330 bp Mlu I-Sfi I 절편과 접합시켰다. 또한, 본 발명자들은 C 단백질의 35 N-말단 및 24 C-말단 아미노산이 NS1 단백질의 N-말단과 이어지고 기타 나머지 바이러스 게놈을 포함하는 pJEV/Rep/NS1/LUC를 제조하였다. 먼저, pJEV/Rep/ΔC/LUC로부터의 절편을 DelF 프라이머 및 서열번호 62로 기재되는 NS1R 프라이머를 사용하여 PCR에 의하여 합성하였다. 그리고 나서, pJEV/FL로부터의 절편을 서열번호 63으로 기재되는 NS1F 프라이머 및 서열번호 64로 기재되는 PR 프라이머를 사용하여 합성하였다. 이들 2 개의 절편을 DelF 및 PR 프라이머를 사용한 PCR의 두 번째 실행으로 융합시켰다. 그 결과 얻어지는 앰플리콘의 474 bp Pac I-ApaL I 절편을 pJEV/FL/LUC의 3,038 bp ApaL I-BamH I 및 15,122 bp BamH I-Pac I 절편과 접합시켰다(도 11의 A).
pJEV/Rep/ΔC+ΔprM+ΔE/LUC 및 pJEV/Rep/NS1/LUC에 추가하여, 또한 본 발명자들은 8 개의 다른 JEV 바이러스 레플리콘 벡터를 제조하였다. pJEV/FL/EGFP의 6,797 bp BamH I-Not I 절편을 ⅰ) pJEV/Rep/ΔC+ΔprM+ΔE/EGFP를 제조하기 위하여 pJEV/Rep/ΔC+ΔprM+ΔE/LUC의 11,529 bp BamH I-Not I 절편과, 또는 ⅱ) pJEV/Rep/NS1/EGFP를 제조하기 위하여 pJEV/Rep/NS1/LUC의 10,968 bp BamH I-Not I 절편과 각각 접합시켰다. pJEV/FL/LacZ의 5,792 bp Sac Ⅱ-Not I 절편을 ⅰ) pJEV/Rep/ΔC+ΔprM+ΔE/LacZ를 제조하기 위하여 pJEV/Rep/ΔC+ΔprM+ΔE/LUC의 7,456 bp Not I-Pac I 및 7,464 bp Pac I-Sac Ⅱ 절편과, 또는 ⅱ) pJEV/Rep/NS1/LacZ를 제조하기 위하여 pJEV/Rep/NS1/LUC의 7,456-bp Not I-Pac I 및 the 6,903 bp Pac I-Sac Ⅱ 절편과 각각 접합시켰다. pJEV/FL/PAC의 6,663 bp BamH I-Not I 절편을 ⅰ) pJEV/Rep/ΔC+ΔprM+ΔE/PAC를 제조하기 위하여 pJEV/Rep/ΔC+ΔprM+ΔE/LUC의 11,529 bp BamH I-Not I 절편과, 또는 ⅱ) pJEV/Rep/NS1/PAC를 제조하기 위하여 pJEV/Rep/NS1/LUC의 10,968 bp BamH I-Not I 절편과 각각 접합시켰다.
<10-2-2> 다양한 자가복제 자가-제한 JEV 바이러스 레플리콘으로부터 발현되는 이형 단백질
JEV RNA 복제 기작을 사용하여 외래 유전자를 독립적으로 발현시키기 위하여, 본 발명자들은 엄격한 안전 기준을 충족시키는 자가복제 자가-제한 바이러스 레플리콘의 패널을 제조하였다(도 11의 A). 최초에 본 발명자들은 민감하고 정량적인 방식으로 바이러스 복제의 모니터링이 용이하도록 이형 유전자로 LUC 리포터 유전자를 사용하였다. 따라서, 각 단백질의 막내 위치(orientation)를 고려하여, 바이러스의 하나, 둘 또는 모든 구조 유전자(C, prM, 및 E)를 인-프레임 결실시켜서 pJEV/FL/LUC의 컨텍트(context)내에 주의하여 엔지니어링하였다(도 11의 A).
다양한 바이러스 레플리콘으로 형질전환된 BHK-21 세포의 LUC 활성을 시간 경과에 따라 작성하였다(도 11의 B). 양성 대조군으로 복제 가능한 JEV/FL/LUC RNA(●, black)로 형질전환된 BHK-21 세포에 있어서, 형질전환 후 6 시간 뒤 최초의 LUC 활성은 5.5±0.3 X 103 RLU 이었다. 이러한 활성은 형질전환 후 48 시간 뒤에는 2.7±0.5 X 106 RLU로 급격히 증가하고 형질전환 후 96 시간 뒤까지 유지되었다. 복제 불가능한 JEV/FL/LUCREP- RNA(◆, black)로 형질전환된 BHK-21 세포에 있어서, 형질전환 후 6 시간 뒤 입력 바이러스 RNA로부터 발현된 최초의 LUC 활성은 유사한 5.2±0.6 X 103 RLU 이었다. 그러나, 상기 활성은 형질전환 후 96 시간 뒤에는 8.8±1.0 RLU로 시간 경과에 따라 급격히 감소하였고, 이것은 순수한 세포의 배경 발광(luminescence) 정도에 상응하는 정도이다. 모든 플라비바이러스에 보존되었다고 제안된 3' NTR의 사이클리제이션(cyclization) 서열(Bredenbeek et al., J. Gen. Virol., 2003, 84, 1261-1268; Lo et al., J. Virol., 2003, 77, 10004-10014; Khromykh et al., J. Virol., 2001, 75, 6719-6728)에 상보적인 서열이 결여된 pJEV/Rep/ΔCC/LUC(◆, blue)와는 달리, 하나 또는 그 이상의 구조 단백질 유전자의 일부가 결실된 바이러스 레플리콘으로 형질전환된 BHK-21 세포의 LUC 활성은 복제 가능한 JEV/FL/LUC RNA로 형질전환된 BHK-21 세포의 형질전환 후 6-48 시간동안의 활성(●, black)과 거의 동일하였다. 그러나, 그 이후 이들 활성은 JEV/FL/LUCREP-에 유사하게 바이러스 전파의 결여에 따라 시간 경과에 따라 급격하게 감소하였다. 흥미롭게도 JEV/Rep/NS1/LUC RNA(●, green)에 기인한 LUC 활성(그러나, JEV/Rep/ΔC+ΔprM+ΔE/LUC RNA(■, green)은 영향을 미치지 못한다)은 다른 복제 가능한 바이러스 레플리콘의 활성에 비교하여 모든 시간에 걸쳐 대략 5배 정도 높았다.
JEV 특이적 과면역성 혈청을 사용한 면역블럿(immunoblotting)으로 정량한 결과, LUC 발현 형태(profile)는 바이러스 단백질 축적 방식과 일치하였다(도 11의 C). 또한, 본 발명자들은 pJEV/Rep/NS1 및 pJEV/Rep/ΔC+ΔprM+ΔE와 같은 JEV 레플리콘 벡터를 사용한 경우에 다양한 널리 사용되는 동물세포에서 리포터 유전자를 효과적으로 발현시킬 수 있음을 확인하였다.
<10-3> JEV 바이러스 레플리콘을 위한 패키징 시스템의 제조
<10-3-1> pSinRep19 벡터에 기초한 JEV 구조 단백질 발현벡터의 플라스미드 제조
본 발명자들은 pSinRep19(Agapov et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1998, 95, 12989-12994)에 기초한 JEV 구조 단백질 발현벡터를 제조하였다. pSinRep19/JEV C-E를 제조하기 위하여, Xba I 부위(밑줄로 표시)를 삽입시킨 서열번호 65로 기재되는 JEVCF 프라이머(5-GATTCTAGAATGACTAAAAAACCA) 및 Pme I 부위(밑줄로 표시)를 삽입시킨 서열번호 66으로 기재되는 JEVER 프라이머(5-GATGTTTAAACTATTAAGCATGCACATTGGT)를 사용하여 pJEV/FL의 절편을 증폭시켰다. 그 결과 생성된 앰플리콘의 2,393 bp Xba I-Pme I 절편을 pSinRep19/JEV C-E를 제조하기 위하여, pSinRep19의 10,864 bp Xba I-Mlu I(T4 DNA 폴리머라제-처리) 절편과 접합시켰다(도 12의 A). pSinRep19/JEV C-NS1을 제조하기 위하여, JEVCF 프라이머 및 Pme I 부위(밑줄로 표시)를 삽입시킨 서열번호 67로 기재되는 JEVNS1R 프라이머(5-GATGTTTAAACTATTAAGCATCAACCTGTGA)를 사용하여 PCR 증폭에 의하여 pJEV/FL 절편을 제조하였다. 그리고 나서, 그 결과 생성된 앰플리콘의 3,449 bp Xba I-Pme I 절편을 pSinRep19/JEV C-NS1을 제조하기 위하여, pSinRep19의 10,864 bp Xba I-Mlu I(T4 DNA 폴리머라제-처리) 절편과 접합시켰다(도 12의 A). pSinRep19/JEV C-E-BglⅡ의 제조를 위하여, pSinRep19/JEV C-NS1의 2,559 bp Xba I-Bgl Ⅱ(T4 DNA 폴리머라제-처리) 절편을 pSinRep19의 10,864 bp Xba I-Mlu I(T4 DNA 폴리머라제-처리) 절편과 접합시켰다(도 12의 A).
<10-3-2> JEV-유도된 레플리콘 벡터 RNA를 위한 패키징 세포주의 제조
JEV의 모든 구조 단백질(C, prM, 및 E)을 계속적으로 발현하고 JEV 바이러스 레플리콘의 효율적인 패키징의 트랜스-보완이 가능한 PCL(packaging cell line; 패키징 세포주)의 개발에 의하여, JEV 레플리콘 발현벡터의 이용 효율이 증진되었다. 셀렉션을 증진시키는 서브게놈 프로모터에 의하여 유도되는 PAC 유전자를 포함하는 pSinRep19 발현벡터(도 12의 A)에 기초하여, 본 발명자들은 C-E(pSinRep19/JEV C-E), C-E 및 NS1의 58 N-말단 잔기(pSinRep19/JEV C-E-BglⅡ), 및 C-NS1(pSinRep19/JEV C-NS1)에 대한 서열을 코딩하는 3 개의 다른 JEV 구조 단백질 발현 카세트 컨스트럭트를 제조하였다.
상기 벡터에 의하여 생성된 단백질 발현을, 상응하는 벡터로부터 시험관내 전사된 합성 RNA로 형질전환시킨 BHK-21 세포에서 측정하였다. pSinRep19 및 그 유도체를 Xho I 절단에 의하여 선형화시켰다. 상기에서 기술된 방법에 따라, 상기 선형화된 플라스미드를 SP6 RNA 폴리머라제를 사용한 시험관내 전사반응(25 ㎕)에 사용하였다. 전사 후에, 반응 혼합액을 추가적으로 10 U의 DNase I과 30분 동안 반응시키고 페놀-클로로포름-이소아밀알콜로 RNA를 추출하였다. DE-81 여과지(Whatman, Maidstone, UK)에 RNA가 흡수되는 [3H]UTP 함입(incorporation)에 기초하여 RNA를 정량하였다. 상기에서 기술된 방법에 따른 일렉트로포레이션에 의하여 세포내로 유입된 RNA(2 ㎍)로 세포를 형질전환시켰다(Yun et al., J. Virol., 2003, 77, 6450-6465). 형질전환된 세포 용해물을 JEV 특이적 과면역성 혈청으로 면역블럿(immunoblotting)에 의하여 분석하였을 때, 3 개의 벡터 각각 형질전환시킨 BHK-21 세포로부터 모두 바이러스 당단백질(glycoprotern) E의 동일한 양이 검출되었다(도 12의 B). 디자인한 바와 같이, NS1 단백질은 SinRep19/JEV C-NS1 RNA로 형질전환시킨 세포에서만 검출되었다(도 12의 B).
VRP(JEV viral replicon particle)을 생산하는 두 가지 방법을 도 12의 C에 개략화로 나타내었다. 하나는 JEV 구조 단백질을 발현하는 SinRep19 벡터 RNA를 시험관내 전사된 레플리콘 벡터 RNA와 함께 일시적으로 공동 형질전환(cotransfection)시키는 것이다. 패키지된 VRP의 역가 측정과 모니터링은 VRP로 순수한 BHK-21 세포를 감염시킨 후, 리포터 유전자 발현을 측정함으로써 가능하다. 몇 번의 실험에서 EGFP를 발현하는 JEV 바이러스 레플리콘 RNA[EV/Rep/ΔC+ΔprM+ΔE/EGFP(□, green) 또는 JEV/Rep/NS1/EGFP(■, green)]와 SinRep19/JEV C-NS1 RNA을 공동 형질전환시킨 결과, 1.1-4.3X104 IU/㎖(infectious unit/㎖) VRP를 제조하였다(도 12의 D). LacZ를 발현하는 JEV 바이러스 레플리콘. 즉 EV/Rep/ΔC+ΔprM+ΔE/LacZ(□, blue) 또는 JEV/Rep/NS1/LacZ(■, blue)를 사용한 경우에도 유사한 결과가 얻어졌다. SinRep19/JEV C-NS1 또는 SinRep19/JEV C-E-BglⅡ JEV 구조 단백질 발현 카세트가 사용될 때도 어떠한 차이도 관찰되지 않았다. 그러나, EGFP 또는 LacZ를 발현하는 바이러스 레플리콘과 SinRep19/JEV C-E 벡터 RNA의 공동 형질전환은 100배 적은 VRP를 생성하였다(도 12의 D). 이러한 관찰은 LUC를 발현하는 JEV 레플리콘 RNA, 즉 JEV/Rep/ΔC+ΔprM+ΔE/LUC(□, black) 또는 JEV/Rep/NS1/LUC(■, black)와 모든 JEV 구조 단백질 발현벡터의 공동 형질전환에 의해서도 확인되었다(도 12의 D).
JEV VRP를 생산하는 다른 방법은 JEV 구조 단백질 발현 벡터 RNA로 세포를 형질전환시킨 뒤, 퓨로마이신으로 셀렉션함에 의하여 달성되는 연속적 PCL 사용에 기초한다. 상기에 기재한 방법과 같이 BHK-21 세포를 JEV 구조 단백질 발현벡터로 형질전환시켰다. 형질전환 이후에 상기 세포를 24 시간 동안 시드 배양한 뒤, 10 ㎍/㎖의 퓨로마이신(Sigma)을 포함하는 신선한 완전 배지로 배지 교체하였다. 이후에 상기 세포를 퓨로마이신 존재하여 유지시키고, 모 BHK-21 세포와 같이 계대배양하거나 동결보관시켰다.
셀렉트된 세포는 숙주세포에 어떤 해로운 효과 없이 JEV 구조 단백질을 안정하게 발현시키고 JEV에 기초된 VRP를 생성하는데 모 BHK-21 세포보다 약간 더 효율이 높았다. 모든 경우에 있어서, 2 개의 벡터 RNA로 모 BHK-21 세포를 공동 형질전환시키는 프로토콜에 비교하여 JEV 바이러스 레플리콘 벡터 RNA로 상기 PCL를 형질전환시키는 경우에 보다 높은 VRP 역가(1.0X103-1.2X105 IU/㎖)가 생성되었다(도 12의 E).
본 발명에서 개발된 패키징 시스템에 복제 가능한 바이러스 입자가 존재하는지의 유무를 분석하기 위해서, 순수한 BHK-21 세포를 72 시간 동안 1 MOI에서 3X105 IU VRP로 감염시켰다. 존재할지 모르는 복제 가능한 바이러스 입자의 매우 적은 양을 증폭시키기 위하여, 상기 감염된 세포로부터 얻은 원액 상등액을 추가적으로 3 번 계대배양하였다. 3 번의 계대배양 결과, JEV 특이적 과면역성 혈청을 사용한 IFA에 의하여, 감염된 세포로부터 리포터 유전자 또는 바이러스 단백질의 발현을 테스트하였다. 어떠한 복제 가능한 바이러스 입자도 검출되지 않았다. 추가적으로 JEV 구조 단백질을 발현하는 Sindbis 레플리콘 RNA는 방출된 VRP에서 전혀 막으로 둘러싸이지 않았다.
상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 JEV 게놈 RNA의 완전한 뉴클레오타이드 염기서열 및 이로부터 합성한 전체-길이의 감염성이 있는 JEV cDNA는 신경침입성(neurovirulence) 및 병원성(pathogenesis)에 관여하는 JEV 유전자를 동정하는 것뿐만 아니라, JEV의 자가복제(replication), 전사(transcription), 및 번역(translation)에 관련된 분자생물학적인 메카니즘의 연구에 사용될 수 있다. 아울러 본 발명은 일본뇌염의 치료제, 백신, 진단시약 및 진단용 기구의 개발에 적용될 수 있으며, 다양한 외래 유전자의 발현벡터(gene expression vector)로 사용될 수 있다.
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infectious JEV cDNA therefrom, and use thereof
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<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer J7, complementary to nt 3986-4004 of the JEV genome
<400> 1
agcgctaaga ctggcatg 18
<210> 2
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer J8, complementary to nt 1-18 of the JEV genome
<400> 2
gatcggaccg agaagtttat ctgtgtga 28
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer J6, complementary to nt 3845-3865 of the JEV genome
<400> 3
gcccctagga ccagaaccac g 21
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer J4, complementary to nt 8150-8170 of the JEV genome
<400> 4
aggacgcgta gtgtgcgttg t 21
<210> 5
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer J20, complementary to nt 3266-3283 of the JEV genome
<400> 5
aaaccaggga ccttggga 18
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer J1, complementary to nt 10947-10967 of the JEV genome
<400> 6
gatcctgtgt tcttcctcac c 21
<210> 7
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer J12, complementary to nt 7565-7582 of the JEV genome
<400> 7
gatcggaccg aattccacca cagccac 27
<210> 8
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer J2, complementary to nt 10870-10893 of the JEV genome
<400> 8
agaagatctc ccagtctatt ccca 24
<210> 9
<211> 10818
<212> DNA
<213> Japanese encephalitis virus
<400> 9
agagattagt gcagtttaaa cagtttttta gaacggaaga taaccatgac taaaaaacca 60
ggagggcccg gtaaaaaccg ggctatcaat atgctgaaac gcggcctacc ccgcgtattc 120
ccactagtgg gagtgaagag ggtagtaatg agcttgttgg acggcagagg accagtacgt 180
ttcgtgctgg ctcttatcac gttcttcaag tttacagcat tagccccgac caaggcgctt 240
ttaggccgat ggaaagcagt ggaaaagagt gtggcaatga aacatcttac tagtttcaaa 300
cgagaacttg gaacactcat tgacgccgtg aacaagcggg gcagaaagca aaacaaaaga 360
ggaggaaatg aaggctcaat catgtggctc gcgagtttgg cagttgtcat agcttgtgta 420
ggagccatga agttgtcaaa tttccaaggg aagcttttga tgaccattaa caacacggac 480
attgcagacg tcatcgtgat tcctacctca aaaggagaga acagatgctg ggtccgggca 540
atcgatgtcg gctacatgtg tgaggacact atcacgtacg aatgtcctaa gcttaccatg 600
ggcaatgatc cagaggatgt ggattgctgg tgtgacaacc aagaagtcta cgtccaatat 660
ggacggtgca cgcggaccag gcattccaag cgaagcagga ggtccgtgtc ggtccaaaca 720
catggggaga gttcactagt gaataaaaaa gaggcttggc tggattcaac gaaagccaca 780
cgatatctca tgaaaactga gaactggatc ataaggaatc ctggctatgc tttcctggcg 840
gcggtacttg gctggatgct tggcagtaac aatggtcaac gcgtggtgtt taccatcctc 900
ctgctgttgg tcgctccggc ttacagtttt aattgtctgg gaatgggcaa ccgtgacttc 960
atagaaggag ccagtggagc cacttgggtg gacttagtgc tagaaggaga tagctgcttg 1020
acaatcatgg caaacgacaa accaacattg gacgtccgca tgattaacat cgaagccagc 1080
caacttgctg aggtcagaag ctattgctat catgcttcag tcactgacat ctcgacggtg 1140
gctcggtgcc ccacgactgg agaagcccac aacgagaagc gagctgatag tagctatgtg 1200
tgcaaacaag gtttcactga tcgtgggtgg ggcaacggat gtggactttt cgggaaggga 1260
agcattgaca catgtgcaaa attctcctgc accagtaagg cgattgggag aacaatccag 1320
ccagaaaaca tcaaatacga agttggcatt tttgtgcatg gaaccaccac ctcggaaaac 1380
catgggaatt attcagcgca agtaggggcg tcccaggcgg caaagtttac agtaacaccc 1440
aatgctcctt cgataaccct caaacttggt gactacggag aagtcacact ggactgtgaa 1500
ccaaggagtg gactgaacac tgaagcgttt tacgtcatga ccgtggggtc aaagtcattt 1560
ctggtccata gggaatggtt tcatgacctc gctctcccct ggacgtcccc ttcgagcaca 1620
gcgtggagaa acagagaact cctcatggaa tttgaagagg cgcacgccac aaaacagtcc 1680
gttgttgctc ttgggtcaca ggaaggaggc ctccatcagg cgctggcagg agccatcgtg 1740
gtggagtact caagctcagt gaagttaaca tcaggccacc tgaaatgtag gctgaaaatg 1800
gacaaactgg ctctgaaagg cacaacctat ggcatgtgta cagaaaaatt ctcgttcgcg 1860
aaaaatccgg cggacactgg ccacggaaca gttgtcattg aactctccta ttctgggagt 1920
gatggcccct gcaaaattcc gattgtctcc gttgcgagcc tcaatgacat gacccccgtt 1980
gggcggctgg tgacagtgaa ccccttcgtc gcgacttcca gtgccaactc aaaggtgctg 2040
gtcgagatgg aacccccctt cggagactcc tacatcgtag ttggaagggg agacaagcag 2100
atcaaccacc attggcataa agctggaagc acgctgggca aggctttttc aacaactttg 2160
aagggagctc aaagactggc agcgttgggc gacacagcct gggactttgg ctctattgga 2220
ggggtcttca actccatagg aaaggccgtt caccaagtgt ttggtggcgc tttcagaaca 2280
ctctttgggg gaatgtcttg gatcacacaa gggttaatgg gtgccctact actctggatg 2340
ggcatcaacg cacgagatcg atcaattgct ttggccttct tggccacagg aggtgtgctc 2400
gtgttcttag cgaccaatgt gcatgctgac actggatgtg ccattgacat cgcaagaaaa 2460
gagatgagat gcggaagtgg catcttcgtg cacaacgacg tggaagcctg ggtggatagg 2520
tataaatatt tgccagaaac gcccagatcc ctagcgaaga tcgtccacaa agcgcacaag 2580
gaaggcgtgt gcggagtcag atctgtcact agactggagc accaaatgtg ggaagccgtg 2640
cgggacgaat tgaacgtcct gctcaaagag aatgcagtgg acctcagtgt ggttgtgaac 2700
aagcccgtgg ggagatatcg ctcagcccca aaacgcctgt ccatgacgca agagaagttt 2760
gaaatgggct ggaaagcatg gggaaaaagc attctctttg ccccggaatt ggctaactcc 2820
acatttgttg tagatggacc tgagacaaag gaatgtcctg atgagcacag agcctggaac 2880
agcatgcaaa tcgaagactt cggctttggt atcacatcaa cccgtgtgtg gctgaagatt 2940
agagaggaaa gcactgacga gtgtgatgga gcgatcatag gcacagctgt caaaggacat 3000
gtggcagttc atagtgactt gtcgtactgg attgagagtc gctacaacga cacatggaaa 3060
cttgagaggg cagtctttgg agaggtcaaa tcttgcactt ggccagagac acacactctt 3120
tggggagatg gtgttgagga aagtgaactc atcatcccgc ataccatagc cggaccaaaa 3180
agcaagcaca atcggaggga agggtacaaa acacaaaacc agggaccttg ggacgaaaac 3240
ggcatagtct tggactttga ttattgccca gggacaaaag tcaccatcac agaggattgt 3300
ggcaagagag gcccttcggt cagaaccact actgacagtg gaaagttgat tactgactgg 3360
tgctgtcgca gttgctccct tccgccccta cgattccgga cagaaaatgg ctgctggtac 3420
ggaatggaaa tcagacctgt taggcatgat gaaacaacac tcgtcagatc acaggttgat 3480
gctttcaatg gtgaaatggt tgaccctttt cagctgggcc ttctggtgat gtttctggcc 3540
acccaggagg tccttcgcaa gaggtggacg gccagattga ccattcctgc ggttttgggg 3600
gccctgcttg tgctgatgct tgggggcatc acttacactg atttggcgag gtatgtggtg 3660
ctagtcgctg ctgctttcgc agaggccaat aatggaggag acgtcctgca ccttgctttg 3720
attgccgttt ttaagatcca accagctttt ctagtgatga acatgcttag cacgagatgg 3780
acgaaccaag aaaacgtggt cctggtccta ggggctgcct tctttcaatt ggcctcagta 3840
gatctgcaaa tcggagtcca cggaatcctg aatgccgccg ctatagcatg gatgattgtt 3900
cgagcgatca ccttccccac aacctcctcc gtcaccatgc cagtcttagc gcttctaact 3960
ccgggaatga gggctctata cctagacact tacagaatca tccttctcgt catagggatt 4020
tgctccctgc tgcaagagag gaaaaagacc atggcaaaaa agaaaggagc tgtactcttg 4080
ggcttagcgc tcacatccac tggatggttc tcgcccacca ccatagctgc tggacttatg 4140
gtctgcaacc caaacaagaa gagagggtgg ccagctactg agtttctgtc ggcagtcgga 4200
ttgatgtttg ccatcgtagg tggtttggcc gagttggata ttgaatccat gtcaataccc 4260
ttcatgctgg caggtcttat ggcagtgtcc tacgtagtgt caggaaaagc aacagatatg 4320
tggctcgaac gggccgccga catcagctgg gagatggatg ctgcaatcac aggaagcagt 4380
cggaggctgg atgtgaaact ggatgatgac ggagattttc acttgattga tgatcccggc 4440
gttccatgga aagtttgggt cttgcgcatg tcttgcattg gcttagccgc cctcacgcct 4500
tgggccattg ttcccgccgc tttcggttac tggctcactt taaaaacaac aaaaagaggg 4560
ggcgtgtttt gggacacgcc atccccgaaa ccttgcttaa aaggagacac cactacagga 4620
gtctaccgaa tcatggctag agggattctt ggcacctacc aggctggcgt cggagtcatg 4680
tacgagaatg ttttccacac actatggcac acaactagag gggcagccat tatgagtgga 4740
gaaggaaaat tgacgccata ctggggtagc gtgaaagaag accgcatagc ttacggaggc 4800
ccatggagat ttgatcgaaa atggaatgga acagatgacg tgcaagtgat cgtggtagaa 4860
ccggggaagg ctgcggtaaa catccagaca aaaccaggag tgtttcggac ccccttcggg 4920
gaggttgggg ctgttagcct ggattacccg cgaggaacat ccggctcacc cattctggat 4980
tccaatggag acatcatagg cctatacggc aatggagttg agcttggcga tggctcatac 5040
gtcagcgcca tcgtgcaggg tgaccgtcag gaggaaccag tcccagaagc ttacactcca 5100
aacatgttaa gaaagagaca gatgactgtg ttagatttgc accctggttc agggaaaacc 5160
aggaaaattc tgccacaaat aattaaggat gcaatccagc agcgcctaag aacagctgtg 5220
ttggcaccga cgcgggtggt agcagcagaa atggcagaag ctttgagagg gctcccagta 5280
cgataccaaa cttcagcagt gcagagagag caccaaggga atgaaatagt ggatgtgatg 5340
tgccacgcca ctctgaccca cagattgatg tcaccgaaca gagtgcccaa ctacaatcta 5400
tttgtcatgg atgaagctca tttcaccgac ccagccagca tagccgcacg aggatacatc 5460
gctaccaagg tggaattagg agaggcagca gccatcttta tgacagcgac cccgcctgga 5520
accacggatc cttttcccga ctcaaatgcc ccaatccatg atttacaaga tgagatacca 5580
gacagggcat ggagcagtgg atacgaatgg atcacagaat atgcgggtaa aaccgtgtgg 5640
tttgtggcga gcgtaaaaat ggggaatgag attgcaatgt gcctccaaag agcgggaaaa 5700
aaggtcatcc aactcaaccg caagtcctat gacacagaat acccaaaatg taagaatgga 5760
gactgggatt ttgtcattac caccgacatc tctgaaatgg gggctaactt cggtgcgagc 5820
agggtcatcg actgcagaaa gagcgtgaaa cccaccatct tagaagaggg agaaggcaga 5880
gtcatcctcg gaaacccatc tcccataacc agtgctagcg cagctcaacg gaggggcaga 5940
gtaggcagaa accccaacca agttggagat gaataccatt atggaggggc taccagtgaa 6000
gatgacagta acctagccca ttggacagag gcaaagatca tgttagacaa catacacatg 6060
cccaatgggc tggtggccca gctctatgga ccagagaggg aaaaggcttt cacaatggat 6120
ggcgaatacc gtctcagggg tgaagaaaag aaaaacttct tagagctgct taggacggct 6180
gaccttccgg tgtggctggc ctataaggtg gcgtccaatg gcattcagta caccgacaga 6240
aagtggtgtt ttgatgggcc gcgcacgaat gccatactgg aggacaacac cgaggtagag 6300
atagtcaccc ggatgggtga gagaaagatc ctcaagccga gatggcttga tgcaagagta 6360
tacgcagatc accaagccct caagtggttc aaagactttg cagcaggaaa gagatcggcc 6420
gttagcttca tagaggtgct cggtcgcatg cctgagcatt tcatgggaaa gacgcgggaa 6480
gctttagaca ccatgtactt ggtcgcaacg gctgagaaag gtgggaaggc acaccgaatg 6540
gctctcgaag agttgccgga tgcactggaa accatcacac ttattgttgc catcactgta 6600
atgacaggag gattcttcct actaatgatg cagcgaaagg gtatagggaa gatgggtctt 6660
ggagctctag tgctcacgct agctaccttc ttcctgtggg cggcagaggt tcctggaacc 6720
aaaatagcag ggaccctgct gatcgccctg ctgctgatgg tggttctcat cccagaaccg 6780
gaaaaacaga ggtcacagac agacaaccaa ctagcggtgt ttctcatctg cgtcttgacc 6840
gtggttggag tggtggcagc aaacgagtac gggatgctag aaaaaaccaa agcagatctc 6900
aagagcatgt ttggcggaaa gacacaggca tcaggactga ctggattgcc aagcatggca 6960
ctggacctgc gtccagccac agcctgggca ctgtatgggg ggagcacagt tgtgctaacc 7020
cctcttctga agcacctgat cacgtcggaa tatgtcacca catcgctagc ctcaattaac 7080
tcacaagctg gctcattatt cgtcttgcca cgaggcgtgc ctttcaccga tctagacctg 7140
accgttggcc tcgtcttcct tggctgctgg ggtcaaatca ccctcacaac gtttttgaca 7200
gccatggttc tggcgacact tcactatggg tacatgctcc ctggatggca agcagaagca 7260
ctcagggctg cccagagaag gacggcggct ggaataatga agaatgccgt tgttgacgga 7320
atggtcgcca ctgatgtgcc tgaactggaa aggactactc ctctgatgca aaagaaagtc 7380
ggacaggtgc tcctcatagg ggtgagcgtg gcagcgtttc tcgtcaaccc taatgtcacc 7440
actgtgagag aagcaggggt gttggtgacg gcggctacgc tcaccttgtg ggataatgga 7500
gccagtgccg tttggaattc caccacagcc acgggactct gccatgtcat gcgaggtagc 7560
tacctggctg gaggctctat tgcttggact cttatcaaga acgctgacaa gccctccttg 7620
aaaaggggaa ggcctggggg caggacgcta ggggagcagt ggaaggaaaa actaaatgcc 7680
atgagcagag aagagttttt taaataccgg agagaggcca taatcgaggt ggaccgcact 7740
gaagcacgca gggctagacg tgaaaataac atagtgggag gacatccggt ttcgcgaggc 7800
tcagcaaaac tccgttggct cgtggagaaa ggattcgtct cgccaatagg aaaagtcatt 7860
gatctagggt gtgggcgtgg aggatggagc tactacgcag caaccctgaa gaaggtccag 7920
gaagtcagag gatacacgaa aggtggggcg ggacatgaag agccgatgct catgcagagc 7980
tacggctgga acctggtctc cttgaagagt ggagtggatg tgttctacaa accttcagag 8040
cctagtgaca ccctgttctg tgacataggg gaatcctccc caagtccaga agtggaagaa 8100
caacgcacac tacgcgtcct agagatgaca tccgattggt tgcatcgagg acccagagag 8160
ttctgcataa aagttctctg cccttacatg cccaaggtca tagaaaaaat ggaagttctg 8220
cagcgccgct tcggaggtgg gctagtacgt ctccccctgt cccgaaactc caatcacgag 8280
atgtattggg ttagtggagc cgctggcaat gtggtgcacg ctgtgaacat gaccagccag 8340
gtactactgg ggcgaatgga tcgcacagtg tggagagggc caaagtatga ggaagatgtc 8400
aacctaggta gcggaacaag agccgtggga aagggagaag ttcatagcaa tcaggagaaa 8460
atcaagaaga gaatccagaa gcttaaagaa gaattcgcca caacgtggca caaagaccct 8520
gaacacccat accgcacttg gacataccac ggaagctatg aggtgaaggc tactggctca 8580
gccagctctc tcgtcaacgg agtggtgaag ctcatgagta aaccttggga cgccattgcc 8640
aacgtcacca ccatggccat gactgacacc accccttttg gacagcaaag agttttcaag 8700
gagaaagttg acacgaaagc tcctgagcca ccagctggag tcaaggaagt gctcaacgag 8760
accaccaact ggctgtgggc ccacttgtca cgggaaaaaa gaccccgctt gtgcaccaag 8820
gaagaattta taaagaaagt caatagcaac gcggctcttg gagcagtgtt tgctgaacag 8880
aatcaatgga gcacggcgcg tgaggctgtg gacgacccgc ggttttggga gatggtcaat 8940
gaagagaggg aaaaccatct gcgaggagag tgtcacacat gtatctacaa catgatggga 9000
aaaagagaga agaagcctgg agagtttgga aaagctaaag ggagcagggc catttggttc 9060
atgtggcttg gagcacggta tctagagttt gaagctttgg ggttcctgaa tgaagaccac 9120
tggctgagcc gagagaattc aggaggtgga gtagaaggct caggcgtcca aaagttggga 9180
tacatcctcc gtgacatagc aggaaagcaa ggagggaaaa tgtacgctga tgacaccgcc 9240
gggtgggaca ctagaattac tagaactgat ttagaaaatg aagctaaggt gctggagctc 9300
ctagatggtg aacaccgcat gctcgcccgg gccataattg aactgactta caggcacaaa 9360
gtggtcaagg tcatgagacc tgcagcagaa ggaaagaccg tgatggacgt gatatcaaga 9420
gaagaccaaa gggggagtgg acaggtggtc acttatgctc tcaacacttt cacgaacatc 9480
gctgtccagc tcgttaggct gatggaggct gagggggtca ttgggccaca acacttggaa 9540
cagctgccta ggaaaaacaa gatagctgtc aggacttggc tctttgagaa tggagaggag 9600
agagtgacca ggatggcgat cagcggagac gactgtgtcg tcaagccgct ggacgacaga 9660
ttcgccacgg ccctccattt cctcaacgca atgtcaaagg ttagaaaaga catccaggaa 9720
tggaagcctt cgcacggctg gcacgattgg cagcaagttc ccttctgctc taaccacttt 9780
caggagattg tgatgaaaga cggaaggagt atagttgtcc cgtgcagagg acaggatgag 9840
ctgataggca gggctcgcat ctctccagga gctggatgga atgtgaagga cacagcttgc 9900
ctggcaaaag catatgcaca gatgtggcta ctcctatact tccatcgtag ggacctgcgt 9960
ctcatggcaa atgcgatttg ctcagcagtg ccagtggatt gggtgcccac aggcaggaca 10020
tcctggtcaa tacactcgaa aggagagtgg atgaccacgg aagacatgct gcaggtctgg 10080
aacagagtct ggattgaaga aaatgaatgg atgatggata agactcccgt cacaagctgg 10140
acagacgttc cgtatgtggg aaagcgtgag gacatctggt gtggcagcct catcggaacg 10200
cgttccagag caacctgggc tgagaacatc tatgcggcga taaaccaggt tagagctgtc 10260
attgggaaag aaaattatgt tgactacatg acctcactca ggagatacga agacgtcttg 10320
atccaggaag acagggtcat ctagtgtgac ttaaggtaga aatgtaaata atgtgaatga 10380
gaaaatgcat gtatatggag tcaggccagc aaaagctgcc accggatact gggtagacgg 10440
tgctgcctgc gtctcagtcc caggaggact gggttaacaa atctgacaac agaaagtgag 10500
aaagccctca gaaccgtctc ggaagtaggt ccctgctcac tggaagttga aagaccaacg 10560
tcaggccacg aatttgtgcc actccgctgg ggagtgcggc ctgcgcagcc ccaggaggac 10620
tgggttacca aagccgttga ggcccccacg gcccaagcct cgtctaggat gcaatagacg 10680
aggtgtaagg actagaggtt agaggagacc ccgtggaaac aacaacatgc ggcccaagcc 10740
ccctcgaagc tgtagaggag gtggaaggac tagaggttag aggagacccc gcatttgcat 10800
caaacagcat attgacac 10818
<210> 10
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic oligodeoxyribonucleotide T
<400> 10
ccagtgttgt ggcctgcagg gcgaatt 27
<210> 11
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> oligonucleotide TR, which is complementary to oligonucleotide T
of the SEQ. ID. No. 10
<400> 11
gatgaattcg ccctgcaggc cacaaca 27
<210> 12
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer J35, complementary to nt 10259-10276 of the JEV genome
<400> 12
agcaacctgg gctgagaa 18
<210> 13
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer J40, complementary to nt 215-232 of the JEV genome
<400> 13
aaacgtactg gtcctctg 18
<210> 14
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer J39, which is complementary to nt 164-181 of the JEV
genome
<400> 14
cccactagtg ggaatacg 18
<210> 15
<211> 10968
<212> DNA
<213> Japanese encephalitis virus
<400> 15
agaagtttat ctgtgtgaac ttcttggctt agtatcgttg agaagaatcg agagattagt 60
gcagtttaaa cagtttttta gaacggaaga taaccatgac taaaaaacca ggagggcccg 120
gtaaaaaccg ggctatcaat atgctgaaac gcggcctacc ccgcgtattc ccactagtgg 180
gagtgaagag ggtagtaatg agcttgttgg acggcagagg accagtacgt ttcgtgctgg 240
ctcttatcac gttcttcaag tttacagcat tagccccgac caaggcgctt ttaggccgat 300
ggaaagcagt ggaaaagagt gtggcaatga aacatcttac tagtttcaaa cgagaacttg 360
gaacactcat tgacgccgtg aacaagcggg gcagaaagca aaacaaaaga ggaggaaatg 420
aaggctcaat catgtggctc gcgagtttgg cagttgtcat agcttgtgta ggagccatga 480
agttgtcaaa tttccaaggg aagcttttga tgaccattaa caacacggac attgcagacg 540
tcatcgtgat tcctacctca aaaggagaga acagatgctg ggtccgggca atcgatgtcg 600
gctacatgtg tgaggacact atcacgtacg aatgtcctaa gcttaccatg ggcaatgatc 660
cagaggatgt ggattgctgg tgtgacaacc aagaagtcta cgtccaatat ggacggtgca 720
cgcggaccag gcattccaag cgaagcagga ggtccgtgtc ggtccaaaca catggggaga 780
gttcactagt gaataaaaaa gaggcttggc tggattcaac gaaagccaca cgatatctca 840
tgaaaactga gaactggatc ataaggaatc ctggctatgc tttcctggcg gcggtacttg 900
gctggatgct tggcagtaac aatggtcaac gcgtggtgtt taccatcctc ctgctgttgg 960
tcgctccggc ttacagtttt aattgtctgg gaatgggcaa ccgtgacttc atagaaggag 1020
ccagtggagc cacttgggtg gacttagtgc tagaaggaga tagctgcttg acaatcatgg 1080
caaacgacaa accaacattg gacgtccgca tgattaacat cgaagccagc caacttgctg 1140
aggtcagaag ctattgctat catgcttcag tcactgacat ctcgacggtg gctcggtgcc 1200
ccacgactgg agaagcccac aacgagaagc gagctgatag tagctatgtg tgcaaacaag 1260
gtttcactga tcgtgggtgg ggcaacggat gtggactttt cgggaaggga agcattgaca 1320
catgtgcaaa attctcctgc accagtaagg cgattgggag aacaatccag ccagaaaaca 1380
tcaaatacga agttggcatt tttgtgcatg gaaccaccac ctcggaaaac catgggaatt 1440
attcagcgca agtaggggcg tcccaggcgg caaagtttac agtaacaccc aatgctcctt 1500
cgataaccct caaacttggt gactacggag aagtcacact ggactgtgaa ccaaggagtg 1560
gactgaacac tgaagcgttt tacgtcatga ccgtggggtc aaagtcattt ctggtccata 1620
gggaatggtt tcatgacctc gctctcccct ggacgtcccc ttcgagcaca gcgtggagaa 1680
acagagaact cctcatggaa tttgaagagg cgcacgccac aaaacagtcc gttgttgctc 1740
ttgggtcaca ggaaggaggc ctccatcagg cgctggcagg agccatcgtg gtggagtact 1800
caagctcagt gaagttaaca tcaggccacc tgaaatgtag gctgaaaatg gacaaactgg 1860
ctctgaaagg cacaacctat ggcatgtgta cagaaaaatt ctcgttcgcg aaaaatccgg 1920
cggacactgg ccacggaaca gttgtcattg aactctccta ttctgggagt gatggcccct 1980
gcaaaattcc gattgtctcc gttgcgagcc tcaatgacat gacccccgtt gggcggctgg 2040
tgacagtgaa ccccttcgtc gcgacttcca gtgccaactc aaaggtgctg gtcgagatgg 2100
aacccccctt cggagactcc tacatcgtag ttggaagggg agacaagcag atcaaccacc 2160
attggcataa agctggaagc acgctgggca aggctttttc aacaactttg aagggagctc 2220
aaagactggc agcgttgggc gacacagcct gggactttgg ctctattgga ggggtcttca 2280
actccatagg aaaggccgtt caccaagtgt ttggtggcgc tttcagaaca ctctttgggg 2340
gaatgtcttg gatcacacaa gggttaatgg gtgccctact actctggatg ggcatcaacg 2400
cacgagatcg atcaattgct ttggccttct tggccacagg aggtgtgctc gtgttcttag 2460
cgaccaatgt gcatgctgac actggatgtg ccattgacat cgcaagaaaa gagatgagat 2520
gcggaagtgg catcttcgtg cacaacgacg tggaagcctg ggtggatagg tataaatatt 2580
tgccagaaac gcccagatcc ctagcgaaga tcgtccacaa agcgcacaag gaaggcgtgt 2640
gcggagtcag atctgtcact agactggagc accaaatgtg ggaagccgtg cgggacgaat 2700
tgaacgtcct gctcaaagag aatgcagtgg acctcagtgt ggttgtgaac aagcccgtgg 2760
ggagatatcg ctcagcccca aaacgcctgt ccatgacgca agagaagttt gaaatgggct 2820
ggaaagcatg gggaaaaagc attctctttg ccccggaatt ggctaactcc acatttgttg 2880
tagatggacc tgagacaaag gaatgtcctg atgagcacag agcctggaac agcatgcaaa 2940
tcgaagactt cggctttggt atcacatcaa cccgtgtgtg gctgaagatt agagaggaaa 3000
gcactgacga gtgtgatgga gcgatcatag gcacagctgt caaaggacat gtggcagttc 3060
atagtgactt gtcgtactgg attgagagtc gctacaacga cacatggaaa cttgagaggg 3120
cagtctttgg agaggtcaaa tcttgcactt ggccagagac acacactctt tggggagatg 3180
gtgttgagga aagtgaactc atcatcccgc ataccatagc cggaccaaaa agcaagcaca 3240
atcggaggga agggtacaaa acacaaaacc agggaccttg ggacgaaaac ggcatagtct 3300
tggactttga ttattgccca gggacaaaag tcaccatcac agaggattgt ggcaagagag 3360
gcccttcggt cagaaccact actgacagtg gaaagttgat tactgactgg tgctgtcgca 3420
gttgctccct tccgccccta cgattccgga cagaaaatgg ctgctggtac ggaatggaaa 3480
tcagacctgt taggcatgat gaaacaacac tcgtcagatc acaggttgat gctttcaatg 3540
gtgaaatggt tgaccctttt cagctgggcc ttctggtgat gtttctggcc acccaggagg 3600
tccttcgcaa gaggtggacg gccagattga ccattcctgc ggttttgggg gccctgcttg 3660
tgctgatgct tgggggcatc acttacactg atttggcgag gtatgtggtg ctagtcgctg 3720
ctgctttcgc agaggccaat aatggaggag acgtcctgca ccttgctttg attgccgttt 3780
ttaagatcca accagctttt ctagtgatga acatgcttag cacgagatgg acgaaccaag 3840
aaaacgtggt cctggtccta ggggctgcct tctttcaatt ggcctcagta gatctgcaaa 3900
tcggagtcca cggaatcctg aatgccgccg ctatagcatg gatgattgtt cgagcgatca 3960
ccttccccac aacctcctcc gtcaccatgc cagtcttagc gcttctaact ccgggaatga 4020
gggctctata cctagacact tacagaatca tccttctcgt catagggatt tgctccctgc 4080
tgcaagagag gaaaaagacc atggcaaaaa agaaaggagc tgtactcttg ggcttagcgc 4140
tcacatccac tggatggttc tcgcccacca ccatagctgc tggacttatg gtctgcaacc 4200
caaacaagaa gagagggtgg ccagctactg agtttctgtc ggcagtcgga ttgatgtttg 4260
ccatcgtagg tggtttggcc gagttggata ttgaatccat gtcaataccc ttcatgctgg 4320
caggtcttat ggcagtgtcc tacgtagtgt caggaaaagc aacagatatg tggctcgaac 4380
gggccgccga catcagctgg gagatggatg ctgcaatcac aggaagcagt cggaggctgg 4440
atgtgaaact ggatgatgac ggagattttc acttgattga tgatcccggc gttccatgga 4500
aagtttgggt cttgcgcatg tcttgcattg gcttagccgc cctcacgcct tgggccattg 4560
ttcccgccgc tttcggttac tggctcactt taaaaacaac aaaaagaggg ggcgtgtttt 4620
gggacacgcc atccccgaaa ccttgcttaa aaggagacac cactacagga gtctaccgaa 4680
tcatggctag agggattctt ggcacctacc aggctggcgt cggagtcatg tacgagaatg 4740
ttttccacac actatggcac acaactagag gggcagccat tatgagtgga gaaggaaaat 4800
tgacgccata ctggggtagc gtgaaagaag accgcatagc ttacggaggc ccatggagat 4860
ttgatcgaaa atggaatgga acagatgacg tgcaagtgat cgtggtagaa ccggggaagg 4920
ctgcggtaaa catccagaca aaaccaggag tgtttcggac ccccttcggg gaggttgggg 4980
ctgttagcct ggattacccg cgaggaacat ccggctcacc cattctggat tccaatggag 5040
acatcatagg cctatacggc aatggagttg agcttggcga tggctcatac gtcagcgcca 5100
tcgtgcaggg tgaccgtcag gaggaaccag tcccagaagc ttacactcca aacatgttaa 5160
gaaagagaca gatgactgtg ttagatttgc accctggttc agggaaaacc aggaaaattc 5220
tgccacaaat aattaaggat gcaatccagc agcgcctaag aacagctgtg ttggcaccga 5280
cgcgggtggt agcagcagaa atggcagaag ctttgagagg gctcccagta cgataccaaa 5340
cttcagcagt gcagagagag caccaaggga atgaaatagt ggatgtgatg tgccacgcca 5400
ctctgaccca cagattgatg tcaccgaaca gagtgcccaa ctacaatcta tttgtcatgg 5460
atgaagctca tttcaccgac ccagccagca tagccgcacg aggatacatc gctaccaagg 5520
tggaattagg agaggcagca gccatcttta tgacagcgac cccgcctgga accacggatc 5580
cttttcccga ctcaaatgcc ccaatccatg atttacaaga tgagatacca gacagggcat 5640
ggagcagtgg atacgaatgg atcacagaat atgcgggtaa aaccgtgtgg tttgtggcga 5700
gcgtaaaaat ggggaatgag attgcaatgt gcctccaaag agcgggaaaa aaggtcatcc 5760
aactcaaccg caagtcctat gacacagaat acccaaaatg taagaatgga gactgggatt 5820
ttgtcattac caccgacatc tctgaaatgg gggctaactt cggtgcgagc agggtcatcg 5880
actgcagaaa gagcgtgaaa cccaccatct tagaagaggg agaaggcaga gtcatcctcg 5940
gaaacccatc tcccataacc agtgctagcg cagctcaacg gaggggcaga gtaggcagaa 6000
accccaacca agttggagat gaataccatt atggaggggc taccagtgaa gatgacagta 6060
acctagccca ttggacagag gcaaagatca tgttagacaa catacacatg cccaatgggc 6120
tggtggccca gctctatgga ccagagaggg aaaaggcttt cacaatggat ggcgaatacc 6180
gtctcagggg tgaagaaaag aaaaacttct tagagctgct taggacggct gaccttccgg 6240
tgtggctggc ctataaggtg gcgtccaatg gcattcagta caccgacaga aagtggtgtt 6300
ttgatgggcc gcgcacgaat gccatactgg aggacaacac cgaggtagag atagtcaccc 6360
ggatgggtga gagaaagatc ctcaagccga gatggcttga tgcaagagta tacgcagatc 6420
accaagccct caagtggttc aaagactttg cagcaggaaa gagatcggcc gttagcttca 6480
tagaggtgct cggtcgcatg cctgagcatt tcatgggaaa gacgcgggaa gctttagaca 6540
ccatgtactt ggtcgcaacg gctgagaaag gtgggaaggc acaccgaatg gctctcgaag 6600
agttgccgga tgcactggaa accatcacac ttattgttgc catcactgta atgacaggag 6660
gattcttcct actaatgatg cagcgaaagg gtatagggaa gatgggtctt ggagctctag 6720
tgctcacgct agctaccttc ttcctgtggg cggcagaggt tcctggaacc aaaatagcag 6780
ggaccctgct gatcgccctg ctgctgatgg tggttctcat cccagaaccg gaaaaacaga 6840
ggtcacagac agacaaccaa ctagcggtgt ttctcatctg cgtcttgacc gtggttggag 6900
tggtggcagc aaacgagtac gggatgctag aaaaaaccaa agcagatctc aagagcatgt 6960
ttggcggaaa gacacaggca tcaggactga ctggattgcc aagcatggca ctggacctgc 7020
gtccagccac agcctgggca ctgtatgggg ggagcacagt tgtgctaacc cctcttctga 7080
agcacctgat cacgtcggaa tatgtcacca catcgctagc ctcaattaac tcacaagctg 7140
gctcattatt cgtcttgcca cgaggcgtgc ctttcaccga tctagacctg accgttggcc 7200
tcgtcttcct tggctgctgg ggtcaaatca ccctcacaac gtttttgaca gccatggttc 7260
tggcgacact tcactatggg tacatgctcc ctggatggca agcagaagca ctcagggctg 7320
cccagagaag gacggcggct ggaataatga agaatgccgt tgttgacgga atggtcgcca 7380
ctgatgtgcc tgaactggaa aggactactc ctctgatgca aaagaaagtc ggacaggtgc 7440
tcctcatagg ggtgagcgtg gcagcgtttc tcgtcaaccc taatgtcacc actgtgagag 7500
aagcaggggt gttggtgacg gcggctacgc tcaccttgtg ggataatgga gccagtgccg 7560
tttggaattc caccacagcc acgggactct gccatgtcat gcgaggtagc tacctggctg 7620
gaggctctat tgcttggact cttatcaaga acgctgacaa gccctccttg aaaaggggaa 7680
ggcctggggg caggacgcta ggggagcagt ggaaggaaaa actaaatgcc atgagcagag 7740
aagagttttt taaataccgg agagaggcca taatcgaggt ggaccgcact gaagcacgca 7800
gggctagacg tgaaaataac atagtgggag gacatccggt ttcgcgaggc tcagcaaaac 7860
tccgttggct cgtggagaaa ggattcgtct cgccaatagg aaaagtcatt gatctagggt 7920
gtgggcgtgg aggatggagc tactacgcag caaccctgaa gaaggtccag gaagtcagag 7980
gatacacgaa aggtggggcg ggacatgaag agccgatgct catgcagagc tacggctgga 8040
acctggtctc cttgaagagt ggagtggatg tgttctacaa accttcagag cctagtgaca 8100
ccctgttctg tgacataggg gaatcctccc caagtccaga agtggaagaa caacgcacac 8160
tacgcgtcct agagatgaca tccgattggt tgcatcgagg acccagagag ttctgcataa 8220
aagttctctg cccttacatg cccaaggtca tagaaaaaat ggaagttctg cagcgccgct 8280
tcggaggtgg gctagtacgt ctccccctgt cccgaaactc caatcacgag atgtattggg 8340
ttagtggagc cgctggcaat gtggtgcacg ctgtgaacat gaccagccag gtactactgg 8400
ggcgaatgga tcgcacagtg tggagagggc caaagtatga ggaagatgtc aacctaggta 8460
gcggaacaag agccgtggga aagggagaag ttcatagcaa tcaggagaaa atcaagaaga 8520
gaatccagaa gcttaaagaa gaattcgcca caacgtggca caaagaccct gaacacccat 8580
accgcacttg gacataccac ggaagctatg aggtgaaggc tactggctca gccagctctc 8640
tcgtcaacgg agtggtgaag ctcatgagta aaccttggga cgccattgcc aacgtcacca 8700
ccatggccat gactgacacc accccttttg gacagcaaag agttttcaag gagaaagttg 8760
acacgaaagc tcctgagcca ccagctggag tcaaggaagt gctcaacgag accaccaact 8820
ggctgtgggc ccacttgtca cgggaaaaaa gaccccgctt gtgcaccaag gaagaattta 8880
taaagaaagt caatagcaac gcggctcttg gagcagtgtt tgctgaacag aatcaatgga 8940
gcacggcgcg tgaggctgtg gacgacccgc ggttttggga gatggtcaat gaagagaggg 9000
aaaaccatct gcgaggagag tgtcacacat gtatctacaa catgatggga aaaagagaga 9060
agaagcctgg agagtttgga aaagctaaag ggagcagggc catttggttc atgtggcttg 9120
gagcacggta tctagagttt gaagctttgg ggttcctgaa tgaagaccac tggctgagcc 9180
gagagaattc aggaggtgga gtagaaggct caggcgtcca aaagttggga tacatcctcc 9240
gtgacatagc aggaaagcaa ggagggaaaa tgtacgctga tgacaccgcc gggtgggaca 9300
ctagaattac tagaactgat ttagaaaatg aagctaaggt gctggagctc ctagatggtg 9360
aacaccgcat gctcgcccgg gccataattg aactgactta caggcacaaa gtggtcaagg 9420
tcatgagacc tgcagcagaa ggaaagaccg tgatggacgt gatatcaaga gaagaccaaa 9480
gggggagtgg acaggtggtc acttatgctc tcaacacttt cacgaacatc gctgtccagc 9540
tcgttaggct gatggaggct gagggggtca ttgggccaca acacttggaa cagctgccta 9600
ggaaaaacaa gatagctgtc aggacttggc tctttgagaa tggagaggag agagtgacca 9660
ggatggcgat cagcggagac gactgtgtcg tcaagccgct ggacgacaga ttcgccacgg 9720
ccctccattt cctcaacgca atgtcaaagg ttagaaaaga catccaggaa tggaagcctt 9780
cgcacggctg gcacgattgg cagcaagttc ccttctgctc taaccacttt caggagattg 9840
tgatgaaaga cggaaggagt atagttgtcc cgtgcagagg acaggatgag ctgataggca 9900
gggctcgcat ctctccagga gctggatgga atgtgaagga cacagcttgc ctggcaaaag 9960
catatgcaca gatgtggcta ctcctatact tccatcgtag ggacctgcgt ctcatggcaa 10020
atgcgatttg ctcagcagtg ccagtggatt gggtgcccac aggcaggaca tcctggtcaa 10080
tacactcgaa aggagagtgg atgaccacgg aagacatgct gcaggtctgg aacagagtct 10140
ggattgaaga aaatgaatgg atgatggata agactcccgt cacaagctgg acagacgttc 10200
cgtatgtggg aaagcgtgag gacatctggt gtggcagcct catcggaacg cgttccagag 10260
caacctgggc tgagaacatc tatgcggcga taaaccaggt tagagctgtc attgggaaag 10320
aaaattatgt tgactacatg acctcactca ggagatacga agacgtcttg atccaggaag 10380
acagggtcat ctagtgtgac ttaaggtaga aatgtaaata atgtgaatga gaaaatgcat 10440
gtatatggag tcaggccagc aaaagctgcc accggatact gggtagacgg tgctgcctgc 10500
gtctcagtcc caggaggact gggttaacaa atctgacaac agaaagtgag aaagccctca 10560
gaaccgtctc ggaagtaggt ccctgctcac tggaagttga aagaccaacg tcaggccacg 10620
aatttgtgcc actccgctgg ggagtgcggc ctgcgcagcc ccaggaggac tgggttacca 10680
aagccgttga ggcccccacg gcccaagcct cgtctaggat gcaatagacg aggtgtaagg 10740
actagaggtt agaggagacc ccgtggaaac aacaacatgc ggcccaagcc ccctcgaagc 10800
tgtagaggag gtggaaggac tagaggttag aggagacccc gcatttgcat caaacagcat 10860
attgacacct gggaatagac tgggagatct tctgctctat ctcaacatca gctactaggc 10920
acagagcgcc gaagtatgta gctggtggtg aggaagaaca caggatct 10968
<210> 16
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer J41
<400> 16
tccgtggaat gaacaatg 18
<210> 17
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer J43
<400> 17
acagataaac ttctctatag tgtcccctaa 30
<210> 18
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer J42
<400> 18
gagaagttta tctgtgtg 18
<210> 19
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer J40
<400> 19
aaacgtactg gtcctctg 18
<210> 20
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer J90
<400> 20
ttgaggcccc cacggcccaa 20
<210> 21
<211> 41
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer J45
<400> 21
agtactagtc ggtccgcggc cgctcgagat cctgtgttct t 41
<210> 22
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer J31
<400> 22
ggctgtgggc ccacttgt 18
<210> 23
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer J47
<400> 23
ccaaagcttc aaactcaaga tacc 24
<210> 24
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer J46
<400> 24
agtactagtc ggtccgcggc cgctctagag atcctgtgtt ctt 43
<210> 25
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer J81
<400> 25
tcttgcccgc ctgatgaa 18
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<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer J80
<400> 26
acagataaac ttctctatag tgagtcgtat 30
<210> 27
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer J42
<400> 27
gagaagttta tctgtgtg 18
<210> 28
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer J82
<400> 28
gcccatggta agcttagg 18
<210> 29
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer J48
<400> 29
actgagctca cgcgtcctcg agatgac 27
<210> 30
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer J3
<400> 30
gatttaatta acacctcctc tacagcttcg 30
<210> 31
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer J72
<400> 31
gaaggtaccc cattgtatgg 20
<210> 32
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer J73
<400> 32
ttctccttta cccatggttg tggcaagctt 30
<210> 33
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer J74
<400> 33
atgggtaaag gagaagaa 18
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<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer J75
<400> 34
aagatgcatt cattaaccgt cgactgcaga 30
<210> 35
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer J76
<400> 35
tttggcgtct tccatggttg tggcaagctt 30
<210> 36
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer J77
<400> 36
atggaagacg ccaaaaac 18
<210> 37
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer J78
<400> 37
cttaagatgc attcattaca cggcgatctt 30
<210> 38
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer J89
<400> 38
tgctttggcc ttcttggcca 20
<210> 39
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer J91
<400> 39
acccgcatat tctgtgatcc gtggttccag 30
<210> 40
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer J92
<400> 40
acagaatatg cgggtaaa 18
<210> 41
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer J93
<400> 41
agctaacggc cgatctcttt c 21
<210> 42
<211> 16847
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> sequence for pBAC/SV vector
<400> 42
attgacggcg tagtacacac tattgaatca aacagccgac caattgcact accatcacaa 60
tggagaagcc agtagtaaac gtagacgtag acccccagag tccgtttgtc gtgcaactgc 120
aaaaaagctt cccgcaattt gaggtagtag cacagcaggt cactccaaat gaccatgcta 180
atgccagagc attttcgcat ctggccagta aactaatcga gctggaggtt cctaccacag 240
cgacgatctt ggacataggc agcgcaccgg ctcgtagaat gttttccgag caccagtatc 300
attgtgtctg ccccatgcgt agtccagaag acccggaccg catgatgaaa tacgccagta 360
aactggcgga aaaagcgtgc aagattacaa acaagaactt gcatgagaag attaaggatc 420
tccggaccgt acttgatacg ccggatgctg aaacaccatc gctctgcttt cacaacgatg 480
ttacctgcaa catgcgtgcc gaatattccg tcatgcagga cgtgtatatc aacgctcccg 540
gaactatcta tcatcaggct atgaaaggcg tgcggaccct gtactggatt ggcttcgaca 600
ccacccagtt catgttctcg gctatggcag gttcgtaccc tgcgtacaac accaactggg 660
ccgacgagaa agtccttgaa gcgcgtaaca tcggactttg cagcacaaag ctgagtgaag 720
gtaggacagg aaaattgtcg ataatgagga agaaggagtt gaagcccggg tcgcgggttt 780
atttctccgt aggatcgaca ctttatccag aacacagagc cagcttgcag agctggcatc 840
ttccatcggt gttccacttg aatggaaagc agtcgtacac ttgccgctgt gatacagtgg 900
tgagttgcga aggctacgta gtgaagaaaa tcaccatcag tcccgggatc acgggagaaa 960
ccgtgggata cgcggttaca cacaatagcg agggcttctt gctatgcaaa gttactgaca 1020
cagtaaaagg agaacgggta tcgttccctg tgtgcacgta catcccggcc accatatgcg 1080
atcagatgac tggtataatg gccacggata tatcacctga cgatgcacaa aaacttctgg 1140
ttgggctcaa ccagcgaatt gtcattaacg gtaggactaa caggaacacc aacaccatgc 1200
aaaattacct tctgccgatc atagcacaag ggttcagcaa atgggctaag gagcgcaagg 1260
atgatcttga taacgagaaa atgctgggta ctagagaacg caagcttacg tatggctgct 1320
tgtgggcgtt tcgcactaag aaagtacatt cgttttatcg cccacctgga acgcagacct 1380
gcgtaaaagt cccagcctct tttagcgctt ttcccatgtc gtccgtatgg acgacctctt 1440
tgcccatgtc gctgaggcag aaattgaaac tggcattgca accaaagaag gaggaaaaac 1500
tgctgcaggt ctcggaggaa ttagtcatgg aggccaaggc tgcttttgag gatgctcagg 1560
aggaagccag agcggagaag ctccgagaag cacttccacc attagtggca gacaaaggca 1620
tcgaggcagc cgcagaagtt gtctgcgaag tggaggggct ccaggcggac atcggagcag 1680
cattagttga aaccccgcgc ggtcacgtaa ggataatacc tcaagcaaat gaccgtatga 1740
tcggacagta tatcgttgtc tcgccaaact ctgtgctgaa gaatgccaaa ctcgcaccag 1800
cgcacccgct agcagatcag gttaagatca taacacactc cggaagatca ggaaggtacg 1860
cggtcgaacc atacgacgct aaagtactga tgccagcagg aggtgccgta ccatggccag 1920
aattcctagc actgagtgag agcgccacgt tagtgtacaa cgaaagagag tttgtgaacc 1980
gcaaactata ccacattgcc atgcatggcc ccgccaagaa tacagaagag gagcagtaca 2040
aggttacaaa ggcagagctt gcagaaacag agtacgtgtt tgacgtggac aagaagcgtt 2100
gcgttaagaa ggaagaagcc tcaggtctgg tcctctcggg agaactgacc aaccctccct 2160
atcatgagct agctctggag ggactgaaga cccgacctgc ggtcccgtac aaggtcgaaa 2220
caataggagt gataggcaca ccggggtcgg gcaagtcagc tattatcaag tcaactgtca 2280
cggcacgaga tcttgttacc agcggaaaga aagaaaattg tcgcgaaatt gaggccgacg 2340
tgctaagact gaggggtatg cagattacgt cgaagacagt agattcggtt atgctcaacg 2400
gatgccacaa agccgtagaa gtgctgtacg ttgacgaagc gttcgcgtgc cacgcaggag 2460
cactacttgc cttgattgct atcgtcaggc cccgcaagaa ggtagtacta tgcggagacc 2520
ccatgcaatg cggattcttc aacatgatgc aactaaaggt acatttcaat caccctgaaa 2580
aagacatatg caccaagaca ttctacaagt atatctcccg gcgttgcaca cagccagtta 2640
cagctattgt atcgacactg cattacgatg gaaagatgaa aaccacgaac ccgtgcaaga 2700
agaacattga aatcgatatt acaggggcca caaagccgaa gccaggggat atcatcctga 2760
catgtttccg cgggtgggtt aagcaattgc aaatcgacta tcccggacat gaagtaatga 2820
cagccgcggc ctcacaaggg ctaaccagaa aaggagtgta tgccgtccgg caaaaagtca 2880
atgaaaaccc actgtacgcg atcacatcag agcatgtgaa cgtgttgctc acccgcactg 2940
aggacaggct agtgtggaaa accttgcagg gcgacccatg gattaagcag cccactaaca 3000
tacctaaagg aaactttcag gctactatag aggactggga agctgaacac aagggaataa 3060
ttgctgcaat aaacagcccc actccccgtg ccaatccgtt cagctgcaag accaacgttt 3120
gctgggcgaa agcattggaa ccgatactag ccacggccgg tatcgtactt accggttgcc 3180
agtggagcga actgttccca cagtttgcgg atgacaaacc acattcggcc atttacgcct 3240
tagacgtaat ttgcattaag tttttcggca tggacttgac aagcggactg ttttctaaac 3300
agagcatccc actaacgtac catcccgccg attcagcgag gccggtagct cattgggaca 3360
acagcccagg aacccgcaag tatgggtacg atcacgccat tgccgccgaa ctctcccgta 3420
gatttccggt gttccagcta gctgggaagg gcacacaact tgatttgcag acggggagaa 3480
ccagagttat ctctgcacag cataacctgg tcccggtgaa ccgcaatctt cctcacgcct 3540
tagtccccga gtacaaggag aagcaacccg gcccggtcaa aaaattcttg aaccagttca 3600
aacaccactc agtacttgtg gtatcagagg aaaaaattga agctccccgt aagagaatcg 3660
aatggatcgc cccgattggc atagccggtg cagataagaa ctacaacctg gctttcgggt 3720
ttccgccgca ggcacggtac gacctggtgt tcatcaacat tggaactaaa tacagaaacc 3780
accactttca gcagtgcgaa gaccatgcgg cgaccttaaa aaccctttcg cgttcggccc 3840
tgaattgcct taacctagga ggcaccctcg tggtgaagtc ctatggctac gccgaccgca 3900
acagtgagga cgtagtcacc gctcttgcca gaaagtttgt cagggtgtct gcagcgagac 3960
cagattgtgt ctcaagcaat acagaaatgt acctgatttt ccgacaacta gacaacagcc 4020
gtacacggca attcaccccg caccatctga attgcgtgat ttcgtccgtg tatgagggta 4080
caagagatgg agttggagcc gcgccgtcat accgcaccaa aagggagaat attgctgact 4140
gtcaagagga agcagttgtc aacgcagcca atccgctggg tagaccaggc gaaggagtct 4200
gccgtgccat ctataaacgt tggccgacca gttttaccga ttcagccacg gagacaggca 4260
ccgcaagaat gactgtgtgc ctaggaaaga aagtgatcca cgcggtcggc cctgatttcc 4320
ggaagcaccc agaagcagaa gccttgaaat tgctacaaaa cgcctaccat gcagtggcag 4380
acttagtaaa tgaacataac atcaagtctg tcgccattcc actgctatct acaggcattt 4440
acgcagccgg aaaagaccgc cttgaagtat cacttaactg cttgacaacc gcgctagaca 4500
gaactgacgc ggacgtaacc atctattgcc tggataagaa gtggaaggaa agaatcgacg 4560
cggcactcca acttaaggag tctgtaacag agctgaagga tgaagatatg gagatcgacg 4620
atgagttagt atggattcat ccagacagtt gcttgaaggg aagaaaggga ttcagtacta 4680
caaaaggaaa attgtattcg tacttcgaag gcaccaaatt ccatcaagca gcaaaagaca 4740
tggcggagat aaaggtcctg ttccctaatg accaggaaag taatgaacaa ctgtgtgcct 4800
acatattggg tgagaccatg gaagcaatcc gcgaaaagtg cccggtcgac cataacccgt 4860
cgtctagccc gcccaaaacg ttgccgtgcc tttgcatgta tgccatgacg ccagaaaggg 4920
tccacagact tagaagcaat aacgtcaaag aagttacagt atgctcctcc accccccttc 4980
ctaagcacaa aattaagaat gttcagaagg ttcagtgcac gaaagtagtc ctgtttaatc 5040
cgcacactcc cgcattcgtt cccgcccgta agtacataga agtgccagaa cagcctaccg 5100
ctcctcctgc acaggccgag gaggcccccg aagttgtagc gacaccgtca ccatctacag 5160
ctgataacac ctcgcttgat gtcacagaca tctcactgga tatggatgac agtagcgaag 5220
gctcactttt ttcgagcttt agcggatcgg acaactctat tactagtatg gacagttggt 5280
cgtcaggacc tagttcacta gagatagtag accgaaggca ggtggtggtg gctgacgttc 5340
atgccgtcca agagcctgcc cctattccac cgccaaggct aaagaagatg gcccgcctgg 5400
cagcggcaag aaaagagccc actccaccgg caagcaatag ctctgagtcc ctccacctct 5460
cttttggtgg ggtatccatg tccctcggat caattttcga cggagagacg gcccgccagg 5520
cagcggtaca acccctggca acaggcccca cggatgtgcc tatgtctttc ggatcgtttt 5580
ccgacggaga gattgatgag ctgagccgca gagtaactga gtccgaaccc gtcctgtttg 5640
gatcatttga accgggcgaa gtgaactcaa ttatatcgtc ccgatcagcc gtatcttttc 5700
cactacgcaa gcagagacgt agacgcagga gcaggaggac tgaatactga ctaaccgggg 5760
taggtgggta catattttcg acggacacag gccctgggca cttgcaaaag aagtccgttc 5820
tgcagaacca gcttacagaa ccgaccttgg agcgcaatgt cctggaaaga attcatgccc 5880
cggtgctcga cacgtcgaaa gaggaacaac tcaaactcag gtaccagatg atgcccaccg 5940
aagccaacaa aagtaggtac cagtctcgta aagtagaaaa tcagaaagcc ataaccactg 6000
agcgactact gtcaggacta cgactgtata actctgccac agatcagcca gaatgctata 6060
agatcaccta tccgaaacca ttgtactcca gtagcgtacc ggcgaactac tccgatccac 6120
agttcgctgt agctgtctgt aacaactatc tgcatgagaa ctatccgaca gtagcatctt 6180
atcagattac tgacgagtac gatgcttact tggatatggt agacgggaca gtcgcctgcc 6240
tggatactgc aaccttctgc cccgctaagc ttagaagtta cccgaaaaaa catgagtata 6300
gagccccgaa tatccgcagt gcggttccat cagcgatgca gaacacgcta caaaatgtgc 6360
tcattgccgc aactaaaaga aattgcaacg tcacgcagat gcgtgaactg ccaacactgg 6420
actcagcgac attcaatgtc gaatgctttc gaaaatatgc atgtaatgac gagtattggg 6480
aggagttcgc tcggaagcca attaggatta ccactgagtt tgtcaccgca tatgtagcta 6540
gactgaaagg ccctaaggcc gccgcactat ttgcaaagac gtataatttg gtcccattgc 6600
aagaagtgcc tatggataga ttcgtcatgg acatgaaaag agacgtgaaa gttacaccag 6660
gcacgaaaca cacagaagaa agaccgaaag tacaagtgat acaagccgca gaacccctgg 6720
cgactgctta cttatgcggg attcaccggg aattagtgcg taggcttacg gccgtcttgc 6780
ttccaaacat tcacacgctt tttgacatgt cggcggagga ttttgatgca atcatagcag 6840
aacacttcaa gcaaggcgac ccggtactgg agacggatat cgcatcattc gacaaaagcc 6900
aagacgacgc tatggcgtta accggtctga tgatcttgga ggacctgggt gtggatcaac 6960
cactactcga cttgatcgag tgcgcctttg gagaaatatc atccacccat ctacctacgg 7020
gtactcgttt taaattcggg gcgatgatga aatccggaat gttcctcaca ctttttgtca 7080
acacagtttt gaatgtcgtt atcgccagca gagtactaga agagcggctt aaaacgtcca 7140
gatgtgcagc gttcattggc gacgacaaca tcatacatgg agtagtatct gacaaagaaa 7200
tggctgagag gtgcgccacc tggctcaaca tggaggttaa gatcatcgac gcagtcatcg 7260
gtgagagacc accttacttc tgcggcggat ttatcttgca agattcggtt acttccacag 7320
cgtgccgcgt ggcggatccc ctgaaaaggc tgtttaagtt gggtaaaccg ctcccagccg 7380
acgacgagca agacgaagac agaagacgcg ctctgctaga tgaaacaaag gcgtggttta 7440
gagtaggtat aacaggcact ttagcagtgg ccgtgacgac ccggtatgag gtagacaata 7500
ttacacctgt cctactggca ttgagaactt ttgcccagag caaaagagca ttccaagcca 7560
tcagagggga aataaagcat ctctacggtg gtcctaaata gtcagcatag tacatttcat 7620
ctgactaata ccacaacacc accacctcta gacgcgtaga tctcacgtga gcatgcagga 7680
ttacacctgt cctactggca ttgagaactt ttgcccagag caaaagagca ttccaagcca 7740
tcagagggga aataaagcat ctctacggtg gtcctaaata gtcagcatag tacatttcat 7800
ctgactaata ctacaacacc accacctcta gctagagctt accatgaccg agtacaagcc 7860
cacggtgcgc ctcgccaccc gcgacgacgt cccccgggcc gtacgcaccc tcgccgccgc 7920
gttcgccgac taccccgcca cgcgccacac cgtcgacccg gaccgccaca tcgagcgggt 7980
caccgagctg caagaactct tcctcacgcg cgtcgggctc gacatcggca aggtgtgggt 8040
cgcggacgac ggcgccgcgg tggcggtctg gaccacgccg gagagcgtcg aagcgggggc 8100
ggtgttcgcc gagatcggcc cgcgcatggc cgagttgagc ggttcccggc tggccgcgca 8160
gcaacagatg gaaggcctcc tggcgccgca ccggcccaag gagcccgcgt ggttcctggc 8220
caccgtcggc gtctcgcccg accaccaggg caagggtctg ggcagcgccg tcgtgctccc 8280
cggagtggag gcggccgagc gcgccggggt gcccgccttc ctggagacct ccgcgccccg 8340
caacctcccc ttctacgagc ggctcggctt caccgtcacc gccgacgtcg agtgcccgaa 8400
ggaccgcgcg acctggtgca tgacccgcaa gcccggtgcc tgacgcccgc cccacgaccc 8460
gcagcgcccg accgaaagga gcgcacgacc ccatgatcgc tagaccatgg ggtaccgagc 8520
tcgaattcgc ctcgtcgcta ttaattatag gacttatgat ttttgcttgc agcatgatgc 8580
tgactagcac acgaagatga cgggcccaat gatccgacca gcaaaactcg atgtacttcc 8640
gaggaactga tgtgcataat gcatcaggct ggtacattag atccccgctt accgcgggca 8700
atatagcaac actaaaaact cgatgtactt ccgaggaagc gcagtgcata atgctgcgca 8760
gtgttgccac ataaccacta tattaaccat ttatctagcg gacgccaaaa actcaatgta 8820
tttctgagga agcgtggtgc ataatgccac gcagcgtctg cataactttt attatttctt 8880
ttattaatca acaaaatttt gtttttaaca tttcaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 8940
aaaaaaaaaa agggaattcc tcgattaatt aagcggccgc tcgaggggaa ttaattcttg 9000
aagacgaaag ggccaggtgg cacttttcgg ggaaatgtgc gcggaacccc tatttgttta 9060
tttttctaaa tacattcaaa tatgtatccg ctcatgagac aataaccctg ataaatgctt 9120
caataatccc tcgtccacgt ggcatctcga gacctttatt ccaaggcgtc gaaccactga 9180
cgactaccct gtactcaggg cttaagccat ccaacgaact caccactgtt gctacccccc 9240
tcattatgct agtcctacta agggcatggc tagcctcttt tcggccttcg ctgagaggga 9300
tttgttccct aggcctaatt attattttta attgcccaat acgtatacga gtgccttttc 9360
taattctcgt atactatagt gagtcgtatt atctagccgc ccgggccgtc gaccaattct 9420
catgtttgac agcttatcat cgaatttctg ccattcatcc gcttattatc acttattcag 9480
gcgtagcaac caggcgttta agggcaccaa taactgcctt aaaaaaatta cgccccgccc 9540
tgccactcat cgcagtactg ttgtaattca ttaagcattc tgccgacatg gaagccatca 9600
caaacggcat gatgaacctg aatcgccagc ggcatcagca ccttgtcgcc ttgcgtataa 9660
tatttgccca tggtgaaaac gggggcgaag aagttgtcca tattggccac gtttaaatca 9720
aaactggtga aactcaccca gggattggct gagacgaaaa acatattctc aataaaccct 9780
ttagggaaat aggccaggtt ttcaccgtaa cacgccacat cttgcgaata tatgtgtaga 9840
aactgccgga aatcgtcgtg gtattcactc cagagcgatg aaaacgtttc agtttgctca 9900
tggaaaacgg tgtaacaagg gtgaacacta tcccatatca ccagctcacc gtctttcatt 9960
gccatacgga attccggatg agcattcatc aggcgggcaa gaatgtgaat aaaggccgga 10020
taaaacttgt gcttattttt ctttacggtc tttaaaaagg ccgtaatatc cagctgaacg 10080
gtctggttat aggtacattg agcaactgac tgaaatgcct caaaatgttc tttacgatgc 10140
cattgggata tatcaacggt ggtatatcca gtgatttttt tctccatttt agcttcctta 10200
gctcctgaaa atctcgataa ctcaaaaaat acgcccggta gtgatcttat ttcattatgg 10260
tgaaagttgg aacctcttac gtgccgatca acgtctcatt ttcgccaaaa gttggcccag 10320
ggcttcccgg tatcaacagg gacaccagga tttatttatt ctgcgaagtg atcttccgtc 10380
acaggtattt attcgcgata agctcatgga gcggcgtaac cgtcgcacag gaaggacaga 10440
gaaagcgcgg atctgggaag tgacggacag aacggtcagg acctggattg gggaggcggt 10500
tgccgccgct gctgctgacg gtgtgacgtt ctctgttccg gtcacaccac atacgttccg 10560
ccattcctat gcgatgcaca tgctgtatgc cggtataccg ctgaaagttc tgcaaagcct 10620
gatgggacat aagtccatca gttcaacgga agtctacacg aaggtttttg cgctggatgt 10680
ggctgcccgg caccgggtgc agtttgcgat gccggagtct gatgcggttg cgatgctgaa 10740
acaattatcc tgagaataaa tgccttggcc tttatatgga aatgtggaac tgagtggata 10800
tgctgttttt gtctgttaaa cagagaagct ggctgttatc cactgagaag cgaacgaaac 10860
agtcgggaaa atctcccatt atcgtagaga tccgcattat taatctcagg agcctgtgta 10920
gcgtttatag gaagtagtgt tctgtcatga tgcctgcaag cggtaacgaa aacgatttga 10980
atatgccttc aggaacaata gaaatcttcg tgcggtgtta cgttgaagtg gagcggatta 11040
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ccctgttctg tgacataggg gaatcctccc caagtccaga agtggaagaa caacgcacac 8160
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aagttctctg cccttacatg cccaaggtca tagaaaaaat ggaagttctg cagcgccgct 8280
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tggactttga ttattgccca gggacaaaag tcaccatcac agaggattgt ggcaagagag 3360
gcccttcggt cagaaccact actgacagtg gaaagttgat tactgactgg tgctgtcgca 3420
gttgctccct tccgccccta cgattccgga cagaaaatgg ctgctggtac ggaatggaaa 3480
tcagacctgt taggcatgat gaaacaacac tcgtcagatc acaggttgat gctttcaatg 3540
gtgaaatggt tgaccctttt cagctgggcc ttctggtgat gtttctggcc acccaggagg 3600
tccttcgcaa gaggtggacg gccagattga ccattcctgc ggttttgggg gccctgcttg 3660
tgctgatgct tgggggcatc acttacactg atttggcgag gtatgtggtg ctagtcgctg 3720
ctgctttcgc agaggccaat aatggaggag acgtcctgca ccttgctttg attgccgttt 3780
ttaagatcca accagctttt ctagtgatga acatgcttag cacgagatgg acgaaccaag 3840
aaaacgtggt cctggtccta ggggctgcct tctttcaatt ggcctcagta gatctgcaaa 3900
tcggagtcca cggaatcctg aatgccgccg ctatagcatg gatgattgtt cgagcgatca 3960
ccttccccac aacctcctcc gtcaccatgc cagtcttagc gcttctaact ccgggaatga 4020
gggctctata cctagacact tacagaatca tccttctcgt catagggatt tgctccctgc 4080
tgcaagagag gaaaaagacc atggcaaaaa agaaaggagc tgtactcttg ggcttagcgc 4140
tcacatccac tggatggttc tcgcccacca ccatagctgc tggactaatg gtctgcaacc 4200
caaacaagaa gagagggtgg ccagctactg agtttctgtc ggcagtcgga ttgatgtttg 4260
ccatcgtagg tggtttggcc gagttggata ttgaatccat gtcaataccc ttcatgctgg 4320
caggtcttat ggcagtgtcc tacgtagtgt caggaaaagc aacagatatg tggctcgaac 4380
gggccgccga catcagctgg gagatggatg ctgcaatcac aggaagcagt cggaggctgg 4440
atgtgaaact ggatgatgac ggagattttc acttgattga tgatcccggc gttccatgga 4500
aagtttgggt cttgcgcatg tcttgcattg gcttagccgc cctcacgcct tgggccattg 4560
ttcccgccgc tttcggttac tggctcactt taaaaacaac aaaaagaggg ggcgtgtttt 4620
gggacacgcc atccccgaaa ccttgcttaa aaggagacac cactacagga gtctaccgaa 4680
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ttttccacac actatggcac acaactagag gggcagccat tatgagtgga gaaggaaaat 4800
tgacgccata ctggggtagc gtgaaagaag accgcatagc ttacggaggc ccatggagat 4860
ttgatcgaaa atggaatgga acagatgacg tgcaagtgat cgtggtagaa ccggggaagg 4920
ctgcggtaaa catccagaca aaaccaggag tgtttcggac ccccttcggg gaggttgggg 4980
ctgttagcct ggattacccg cgaggaacat ccggctcacc cattctggat tccaatggag 5040
acatcatagg cctatacggc aatggagttg agcttggcga tggctcatac gtcagcgcca 5100
tcgtgcaggg tgaccgtcag gaggaaccag tcccagaagc ttacactcca aacatgttaa 5160
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tgccacaaat aattaaggat gcaatccagc agcgcctaag aacagctgtg ttggcaccga 5280
cgcgggtggt agcagcagaa atggcagaag ctttgagagg gctcccagta cgataccaaa 5340
cttcagcagt gcagagagag caccaaggga atgaaatagt ggatgtgatg tgccacgcca 5400
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atgaagctca tttcaccgac ccagccagca tagccgcacg aggatacatc gctaccaagg 5520
tggaattagg agaggcagca gccatcttta tgacagcgac cccgcctgga accacggatc 5580
cttttcccga ctcaaatgcc ccaatccatg atttacaaga tgagatacca gacagggcat 5640
ggagcagtgg atacgaatgg atcacagaat atgcgggtaa aaccgtgtgg tttgtggcga 5700
gcgtaaaaat ggggaatgag attgcaatgt gcctccaaag agcgggaaaa aaggtcatcc 5760
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ttgtcattac caccgacatc tctgaaatgg gggctaactt cggtgcgagc agggtcatcg 5880
actgcagaaa gagcgtgaaa cccaccatct tagaagaggg agaaggcaga gtcatcctcg 5940
gaaacccatc tcccataacc agtgctagcg cagctcaacg gaggggcaga gtaggcagaa 6000
accccaacca agttggagat gaataccatt atggaggggc taccagtgaa gatgacagta 6060
acctagccca ttggacagag gcaaagatca tgttagacaa catacacatg cccaatgggc 6120
tggtggccca gctctatgga ccagagaggg aaaaggcttt cacaatggat ggcgaatacc 6180
gtctcagggg tgaagaaaag aaaaacttct tagagctgct taggacggct gaccttccgg 6240
tgtggctggc ctataaggtg gcgtccaatg gcattcagta caccgacaga aagtggtgtt 6300
ttgatgggcc gcgcacgaat gccatactgg aggacaacac cgaggtagag atagtcaccc 6360
ggatgggtga gagaaagatc ctcaagccga gatggcttga tgcaagagta tacgcagatc 6420
accaagccct caagtggttc aaagactttg cagcaggaaa gagatcggcc gttagcttca 6480
tagaggtgct cggtcgcatg cctgagcatt tcatgggaaa gacgcgggaa gctttagaca 6540
ccatgtactt ggtcgcaacg gctgagaaag gtgggaaggc acaccgaatg gctctcgaag 6600
agttgccgga tgcactggaa accatcacac ttattgttgc catcactgta atgacaggag 6660
gattcttcct actaatgatg cagcgaaagg gtatagggaa gatgggtctt ggagctctag 6720
tgctcacgct agctaccttc ttcctgtggg cggcagaggt tcctggaacc aaaatagcag 6780
ggaccctgct gatcgccctg ctgctgatgg tggttctcat cccagaaccg gaaaaacaga 6840
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tggtggcagc aaacgagtac gggatgctag aaaaaaccaa agcagatctc aagagcatgt 6960
ttggcggaaa gacacaggca tcaggactga ctggattgcc aagcatggca ctggacctgc 7020
gtccagccac agcctgggca ctgtatgggg ggagcacagt tgtgctaacc cctcttctga 7080
agcacctgat cacgtcggaa tatgtcacca catcgctagc ctcaattaac tcacaagctg 7140
gctcattatt cgtcttgcca cgaggcgtgc ctttcaccga tctagacctg accgttggcc 7200
tcgtcttcct tggctgctgg ggtcaaatca ccctcacaac gtttttgaca gccatggttc 7260
tggcgacact tcactatggg tacatgctcc ctggatggca agcagaagca ctcagggctg 7320
cccagagaag gacggcggct ggaataatga agaatgccgt tgttgacgga atggtcgcca 7380
ctgatgtgcc tgaactggaa aggactactc ctctgatgca aaagaaagtc ggacaggtgc 7440
tcctcatagg ggtgagcgtg gcagcgtttc tcgtcaaccc taatgtcacc actgtgagag 7500
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ggcctggggg caggacgcta ggggagcagt ggaaggaaaa actaaatgcc atgagcagag 7740
aagagttttt taaataccgg agagaggcca taatcgaggt ggaccgcact gaagcacgca 7800
gggctagacg tgaaaataac atagtgggag gacatccggt ttcgcgaggc tcagcaaaac 7860
tccgttggct cgtggagaaa ggattcgtct cgccaatagg aaaagtcatt gatctagggt 7920
gtgggcgtgg aggatggagc tactacgcag caaccctgaa gaaggtccag gaagtcagag 7980
gatacacgaa aggtggggcg ggacatgaag agccgatgct catgcagagc tacggctgga 8040
acctggtctc cttgaagagt ggagtggatg tgttctacaa accttcagag cctagtgaca 8100
ccctgttctg tgacataggg gaatcctccc caagtccaga agtggaagaa caacgcacac 8160
tacgcgtcct agagatgaca tccgattggt tgcatcgagg acccagagag ttctgcataa 8220
aagttctctg cccttacatg cccaaggtca tagaaaaaat ggaagttctg cagcgccgct 8280
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accgcacttg gacataccac ggaagctatg aggtgaaggc tactggctca gccagctctc 8640
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aaaaccatct gcgaggagag tgtcacacat gtatctacaa catgatggga aaaagagaga 9060
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gtgacatagc aggaaagcaa ggagggaaaa tgtacgctga tgacaccgcc gggtgggaca 9300
ctagaattac tagaactgat ttagaaaatg aagctaaggt gctggagctc ctagatggtg 9360
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tcatgagacc tgcagcagaa ggaaagaccg tgatggacgt gatatcaaga gaagaccaaa 9480
gggggagtgg acaggtggtc acttatgctc tcaacacttt cacgaacatc gctgtccagc 9540
tcgttaggct gatggaggct gagggggtca ttgggccaca acacttggaa cagctgccta 9600
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ccctccattt cctcaacgca atgtcaaagg ttagaaaaga catccaggaa tggaagcctt 9780
cgcacggctg gcacgattgg cagcaagttc ccttctgctc taaccacttt caggagattg 9840
tgatgaaaga cggaaggagt atagttgtcc cgtgcagagg acaggatgag ctgataggca 9900
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tcgtattatc tagccgcccg ggccgtcgac caattctcat gtttgacagc ttatcatcga 11160
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ccgatcaacg tctcattttc gccaaaagtt ggcccagggc ttcccggtat caacagggac 12060
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tctgattatt agtctggaac cacggtccca ctcgtatcgt cggtctgatt attagtctgg 17160
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<213> Artificial Sequence
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tgaacgtcct gctcaaagag aatgcagtgg acctcagtgt ggttgtgaac aagcccgtgg 2760
ggagatatcg ctcagcccca aaacgcctgt ccatgacgca agagaagttt gaaatgggct 2820
ggaaagcatg gggaaaaagc attctctttg ccccggaatt ggctaactcc acatttgttg 2880
tagatggacc tgagacaaag gaatgtcctg atgagcacag agcctggaac agcatgcaaa 2940
tcgaagactt cggctttggt atcacatcaa cccgtgtgtg gctgaagatt agagaggaaa 3000
gcactgacga gtgtgatgga gcgatcatag gcacagctgt caaaggacat gtggcagttc 3060
atagtgactt gtcgtactgg attgagagtc gctacaacga cacatggaaa cttgagaggg 3120
cagtctttgg agaggtcaaa tcttgcactt ggccagagac acacactctt tggggagatg 3180
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gtgaaatggt tgaccctttt cagctgggcc ttctggtgat gtttctggcc acccaggagg 3600
tccttcgcaa gaggtggacg gccagattga ccattcctgc ggttttgggg gccctgcttg 3660
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ctgcggtaaa catccagaca aaaccaggag tgtttcggac ccccttcggg gaggttgggg 4980
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tgccacaaat aattaaggat gcaatccagc agcgcctaag aacagctgtg ttggcaccga 5280
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gcgtaaaaat ggggaatgag attgcaatgt gcctccaaag agcgggaaaa aaggtcatcc 5760
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gtgggcgtgg aggatggagc tactacgcag caaccctgaa gaaggtccag gaagtcagag 7980
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ggctgtgggc ccacttgtca cgggaaaaaa gaccccgctt gtgcaccaag gaagaattta 8880
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ttcactccag agcgatgaaa acgtttcagt ttgctcatgg aaaacggtgt aacaagggtg 11640
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ggattggctg agacgaaaaa catattctca ataaaccctt tagggaaata ggccaggttt 11520
tcaccgtaac acgccacatc ttgcgaatat atgtgtagaa actgccggaa atcgtcgtgg 11580
tattcactcc agagcgatga aaacgtttca gtttgctcat ggaaaacggt gtaacaaggg 11640
tgaacactat cccatatcac cagctcaccg tctttcattg ccatacggaa ttccggatga 11700
gcattcatca ggcgggcaag aatgtgaata aaggccggat aaaacttgtg cttatttttc 11760
tttacggtct ttaaaaaggc cgtaatatcc agctgaacgg tctggttata ggtacattga 11820
gcaactgact gaaatgcctc aaaatgttct ttacgatgcc attgggatat atcaacggtg 11880
gtatatccag tgattttttt ctccatttta gcttccttag ctcctgaaaa tctcgataac 11940
tcaaaaaata cgcccggtag tgatcttatt tcattatggt gaaagttgga acctcttacg 12000
tgccgatcaa cgtctcattt tcgccaaaag ttggcccagg gcttcccggt atcaacaggg 12060
acaccaggat ttatttattc tgcgaagtga tcttccgtca caggtattta ttcgcgataa 12120
gctcatggag cggcgtaacc gtcgcacagg aaggacagag aaagcgcgga tctgggaagt 12180
gacggacaga acggtcagga cctggattgg ggaggcggtt gccgccgctg ctgctgacgg 12240
tgtgacgttc tctgttccgg tcacaccaca tacgttccgc cattcctatg cgatgcacat 12300
gctgtatgcc ggtataccgc tgaaagttct gcaaagcctg atgggacata agtccatcag 12360
ttcaacggaa gtctacacga aggtttttgc gctggatgtg gctgcccggc accgggtgca 12420
gtttgcgatg ccggagtctg atgcggttgc gatgctgaaa caattatcct gagaataaat 12480
gccttggcct ttatatggaa atgtggaact gagtggatat gctgtttttg tctgttaaac 12540
agagaagctg gctgttatcc actgagaagc gaacgaaaca gtcgggaaaa tctcccatta 12600
tcgtagagat ccgcattatt aatctcagga gcctgtgtag cgtttatagg aagtagtgtt 12660
ctgtcatgat gcctgcaagc ggtaacgaaa acgatttgaa tatgccttca ggaacaatag 12720
aaatcttcgt gcggtgttac gttgaagtgg agcggattat gtcagcaatg gacagaacaa 12780
cctaatgaac acagaaccat gatgtggtct gtccttttac agccagtagt gctcgccgca 12840
gtcgagcgac agggcgaagc cctcgagtga gcgaggaagc accagggaac agcacttata 12900
tattctgctt acacacgatg cctgaaaaaa cttcccttgg ggttatccac ttatccacgg 12960
ggatattttt ataattattt tttttatagt ttttagatct tcttttttag agcgccttgt 13020
aggcctttat ccatgctggt tctagagaag gtgttgtgac aaattgccct ttcagtgtga 13080
caaatcaccc tcaaatgaca gtcctgtctg tgacaaattg cccttaaccc tgtgacaaat 13140
tgccctcaga agaagctgtt ttttcacaaa gttatccctg cttattgact cttttttatt 13200
tagtgtgaca atctaaaaac ttgtcacact tcacatggat ctgtcatggc ggaaacagcg 13260
gttatcaatc acaagaaacg taaaaatagc ccgcgaatcg tccagtcaaa cgacctcact 13320
gaggcggcat atagtctctc ccgggatcaa aaacgtatgc tgtatctgtt cgttgaccag 13380
atcagaaaat ctgatggcac cctacaggaa catgacggta tctgcgagat ccatgttgct 13440
aaatatgctg aaatattcgg attgacctct gcggaagcca gtaaggatat acggcaggca 13500
ttgaagagtt tcgcggggaa ggaagtggtt ttttatcgcc ctgaagagga tgccggcgat 13560
gaaaaaggct atgaatcttt tccttggttt atcaaacgtg cgcacagtcc atccagaggg 13620
ctttacagtg tacatatcaa cccatatctc attcccttct ttatcgggtt acagaaccgg 13680
tttacgcagt ttcggcttag tgaaacaaaa gaaatcacca atccgtatgc catgcgttta 13740
tacgaatccc tgtgtcagta tcgtaagccg gatggctcag gcatcgtctc tctgaaaatc 13800
gactggatca tagagcgtta ccagctgcct caaagttacc agcgtatgcc tgacttccgc 13860
cgccgcttcc tgcaggtctg tgttaatgag atcaacagca gaactccaat gcgcctctca 13920
tacattgaga aaaagaaagg ccgccagacg actcatatcg tattttcctt ccgcgatatc 13980
acttccatga cgacaggata gtctgagggt tatctgtcac agatttgagg gtggttcgtc 14040
acatttgttc tgacctactg agggtaattt gtcacagttt tgctgtttcc ttcagcctgc 14100
atggattttc tcatactttt tgaactgtaa tttttaagga agccaaattt gagggcagtt 14160
tgtcacagtt gatttccttc tctttccctt cgtcatgtga cctgatatcg ggggttagtt 14220
cgtcatcatt gatgagggtt gattatcaca gtttattact ctgaattggc tatccgcgtg 14280
tgtacctcta cctggagttt ttcccacggt ggatatttct tcttgcgctg agcgtaagag 14340
ctatctgaca gaacagttct tctttgcttc ctcgccagtt cgctcgctat gctcggttac 14400
acggctgcgg cgagcgctag tgataataag tgactgaggt atgtgctctt cttatctcct 14460
tttgtagtgt tgctcttatt ttaaacaact ttgcggtttt ttgatgactt tgcgattttg 14520
ttgttgcttt gcagtaaatt gcaagattta ataaaaaaac gcaaagcaat gattaaagga 14580
tgttcagaat gaaactcatg gaaacactta accagtgcat aaacgctggt catgaaatga 14640
cgaaggctat cgccattgca cagtttaatg atgacagccc ggaagcgagg aaaataaccc 14700
ggcgctggag aataggtgaa gcagcggatt tagttggggt ttcttctcag gctatcagag 14760
atgccgagaa agcagggcga ctaccgcacc cggatatgga aattcgagga cgggttgagc 14820
aacgtgttgg ttatacaatt gaacaaatta atcatatgcg tgatgtgttt ggtacgcgat 14880
tgcgacgtgc tgaagacgta tttccaccgg tgatcggggt tgctgcccat aaaggtggcg 14940
tttacaaaac ctcagtttct gttcatcttg ctcaggatct ggctctgaag gggctacgtg 15000
ttttgctcgt ggaaggtaac gacccccagg gaacagcctc aatgtatcac ggatgggtac 15060
cagatcttca tattcatgca gaagacactc tcctgccttt ctatcttggg gaaaaggacg 15120
atgtcactta tgcaataaag cccacttgct ggccggggct tgacattatt ccttcctgtc 15180
tggctctgca ccgtattgaa actgagttaa tgggcaaatt tgatgaaggt aaactgccca 15240
ccgatccaca cctgatgctc cgactggcca ttgaaactgt tgctcatgac tatgatgtca 15300
tagttattga cagcgcgcct aacctgggta tcggcacgat taatgtcgta tgtgctgctg 15360
atgtgctgat tgttcccacg cctgctgagt tgtttgacta cacctccgca ctgcagtttt 15420
tcgatatgct tcgtgatctg ctcaagaacg ttgatcttaa agggttcgag cctgatgtac 15480
gtattttgct taccaaatac agcaatagta atggctctca gtccccgtgg atggaggagc 15540
aaattcggga tgcctgggga agcatggttc taaaaaatgt tgtacgtgaa acggatgaag 15600
ttggtaaagg tcagatccgg atgagaactg tttttgaaca ggccattgat caacgctctt 15660
caactggtgc ctggagaaat gctctttcta tttgggaacc tgtctgcaat gaaattttcg 15720
atcgtctgat taaaccacgc tgggagatta gataatgaag cgtgcgcctg ttattccaaa 15780
acatacgctc aatactcaac cggttgaaga tacttcgtta tcgacaccag ctgccccgat 15840
ggtggattcg ttaattgcgc gcgtaggagt aatggctcgc ggtaatgcca ttactttgcc 15900
tgtatgtggt cgggatgtga agtttactct tgaagtgctc cggggtgata gtgttgagaa 15960
gacctctcgg gtatggtcag gtaatgaacg tgaccaggag ctgcttactg aggacgcact 16020
ggatgatctc atcccttctt ttctactgac tggtcaacag acaccggcgt tcggtcgaag 16080
agtatctggt gtcatagaaa ttgccgatgg gagtcgccgt cgtaaagctg ctgcacttac 16140
cgaaagtgat tatcgtgttc tggttggcga gctggatgat gagcagatgg ctgcattatc 16200
cagattgggt aacgattatc gcccaacaag tgcttatgaa cgtggtcagc gttatgcaag 16260
ccgattgcag aatgaatttg ctggaaatat ttctgcgctg gctgatgcgg aaaatatttc 16320
acgtaagatt attacccgct gtatcaacac cgccaaattg cctaaatcag ttgttgctct 16380
tttttctcac cccggtgaac tatctgcccg gtcaggtgat gcacttcaaa aagcctttac 16440
agataaagag gaattactta agcagcaggc atctaacctt catgagcaga aaaaagctgg 16500
ggtgatattt gaagctgaag aagttatcac tcttttaact tctgtgctta aaacgtcatc 16560
tgcatcaaga actagtttaa gctcacgaca tcagtttgct cctggagcga cagtattgta 16620
taagggcgat aaaatggtgc ttaacctgga caggtctcgt gttccaactg agtgtataga 16680
gaaaattgag gccattctta aggaacttga aaagccagca ccctgatgcg accacgtttt 16740
agtctacgtt tatctgtctt tacttaatgt cctttgttac aggccagaaa gcataactgg 16800
cctgaatatt ctctctgggc ccactgttcc acttgtatcg tcggtctgat aatcagactg 16860
ggaccacggt cccactcgta tcgtcggtct gattattagt ctgggaccac ggtcccactc 16920
gtatcgtcgg tctgattatt agtctgggac cacggtccca ctcgtatcgt cggtctgata 16980
atcagactgg gaccacggtc ccactcgtat cgtcggtctg attattagtc tgggaccatg 17040
gtcccactcg tatcgtcggt ctgattatta gtctgggacc acggtcccac tcgtatcgtc 17100
ggtctgatta ttagtctgga accacggtcc cactcgtatc gtcggtctga ttattagtct 17160
gggaccacgg tcccactcgt atcgtcggtc tgattattag tctgggacca cgatcccact 17220
cgtgttgtcg gtctgattat cggtctggga ccacggtccc acttgtattg tcgatcagac 17280
tatcagcgtg agactacgat tccatcaatg cctgtcaagg gcaagtattg acatgtcgtc 17340
gtaacctgta gaacggagta acctcggtgt gcggttgtat gcctgctgtg gattgctgct 17400
gtgtcctgct tatccacaac attttgcgca cggttatgtg gacaaaatac ctggttaccc 17460
aggccgtgcc ggcacgttaa ccgggctgca tccgatgcaa gtgtgtcgct gtcgacgagc 17520
tcgcgagctc ggacatgagg ttgccccgta ttcagtgtcg ctgatttgta ttgtctgaag 17580
ttgtttttac gttaagttga tgcagatcaa ttaatacgat acctgcgtca taattgatta 17640
tttgacgtgg tttgatggcc tccacgcacg ttgtgatatg tagatgataa tcattatcac 17700
tttacgggtc ctttccggtg atccgacagg ttacggggcg gcgacctcgc gggttttcgc 17760
tatttatgaa aattttccgg tttaaggcgt ttccgttctt cttcgtcata acttaatgtt 17820
tttatttaaa ataccctctg aaaagaaagg aaacgacagg tgctgaaagc gagctttttg 17880
gcctctgtcg tttcctttct ctgtttttgt ccgtggaatg aacaatggaa gtccgagctc 17940
atcgctaata acttcgtata gcatacatta tacgaagtta tattcgatgc ggcgctgagg 18000
tctgcctcgt gaagaaggtg ttgctgactc ataccaggcc tgaatcgccc catcatccag 18060
ccagaaagtg agggagccac ggttgatgag agctttgttg taggtggacc agttggtgat 18120
tttgaacttt tgctttgcca cggaacggtc tgcgttgtcg ggaagatgcg tgatctgatc 18180
cttcaactca gcaaaagttc gatttattca acaaagccac gtgtctcaaa atctctgatg 18240
ttacattgca caagataaaa atatatcatc atgaacaata aaactgtctg cttacataaa 18300
cagtaataca aggggtgtta tgagccatat tcaacgggaa acgtcttgct cgacgatgat 18360
aagctgtcaa acatgagaat tgggtcgtca atatgctaaa acgcggcata ccccgcgtat 18420
tcccactagt taatcgtacg aattccgtat ggcaatgaaa gacggtgagc tggtgatatg 18480
ggatagtgtt cacccttgtt acaccgtttt ccatgagcaa actgaaacgt tttcatcgct 18540
ctggagtgaa taccacgacg atttccggca gtttctacac atatattcgc aagatgtggc 18600
gtgttacggt gaaaacctgg cctatttccc taaagggttt attgagaata tgtttttcgt 18660
ctcagccaat ccctgggtga gtttcaccag ttttgattta aacgtggcca atatggacaa 18720
cttcttcgcc cccgttttca ccatgggcaa atattatacg caaggcgaca aggtgctgat 18780
gccgctggcg attcaggttc atcatgccgt ttgtgatggc ttccatgtcg gcagaatgct 18840
taatgaatta caacagtact gcgatgagtg gcagggcggg gcgtaatttt tttaaggcag 18900
ttattggtgc ccttaaacgc ctggttgcta cgcctgaata agtgataata agcggatgaa 18960
tggcagaaat tcgatgataa gctgtcaaac atgagaattg gtcgacggcc cgggcggcta 19020
gataatacga ctcactatag 19040
<210> 49
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer EGFPF
<400> 49
tcgccaccat ggtgagca 18
<210> 50
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer EGFPR
<400> 50
cataggcctc tattaaccgt cgactgcaga 30
<210> 51
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer PACF
<400> 51
gatcacgttg tgagttggat agttgtg 27
<210> 52
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer PACR
<400> 52
atcatgcatt catggggtcg tgcgctc 27
<210> 53
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer DelF
<400> 53
gatttaatta acctgcaggg ggctgtt 27
<210> 54
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer C1R
<400> 54
gatctcgagc cggtttttac cgggccc 27
<210> 55
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer C2F
<400> 55
gatctcgaga aaagaggagg aaatgaa 27
<210> 56
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer DelR
<400> 56
tgtggccaag aaggccaaag caattga 27
<210> 57
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer C3R
<400> 57
gatctcgagc attactaccc tcttcac 27
<210> 58
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer prM1R
<400> 58
gatctcgagg tccgtgttgt taatggt 27
<210> 59
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer prM2F
<400> 59
gatctcgagg attcaacgaa agccaca 27
<210> 60
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer E1R
<400> 60
gatctcgagg gctccactgg ctccttc 27
<210> 61
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer E2F
<400> 61
gatctcgaga caactttgaa gggagct 27
<210> 62
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer NS1R
<400> 62
ggcacatcca gtgtcggctc ctacacaagc 30
<210> 63
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer NS1F
<400> 63
gacactggat gtgccatt 18
<210> 64
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer RR
<400> 64
tcgtcccgca cggcttccca c 21
<210> 65
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer JEVCF
<400> 65
gattctagaa tgactaaaaa acca 24
<210> 66
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer JEVER
<400> 66
gatgtttaaa ctattaagca tgcacattgg t 31
<210> 67
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer JEVNS1R
<400> 67
gatgtttaaa ctattaagca tcaacctgtg a 31
Claims (33)
- 서열번호 15로 기재되는 한국형 일본뇌염바이러스(Japanese encephalitis virus; JEV) 게놈 RNA.
- 제 1항의 일본뇌염바이러스 게놈 RNA로부터 유래한 cDNA.
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- JEV 게놈 RNA의 5'-말단 앞에 프로모터, JEV 게놈 RNA에 상응하는 cDNA 서열 및 상기 JEV 게놈 RNA의 3'-말단 바로 뒤에 런-오프 자리로서 제한효소 인식 염기서열부위를 순차적으로 포함하는 감염성이 있는 JEV cDNA를 포함하는 재조합 BAC(bacterial artificial chromosome) 벡터.
- 1) 일본뇌염바이러스가 감염된 세포로부터 JEV 게놈 RNA를 분리하는 단계;2) 상기 RNA로부터 역전사 및 RT-PCT을 통해 JEV 게놈 RNA에 상응하는 cDNA를 수득하는 단계;3) 상기 cDNA의 5' 말단 및 3' 말단의 서열을 확인하는 단계;4) 상기 cDNA의 5' 말단의 바로 앞에 프로모터 서열을, 3' 말단에 런 오프 반응을 위한 제한효소 인식 염기서열부위를 연결하여 감염성이 있는 JEV cDNA를 제조하는 단계;5) 상기 감염성이 있는 JEV cDNA를 BAC 벡터에 클로닝하는 단계를 포함하는 제 7항의 재조합 BAC 벡터의 제조방법.
- 제 7항에 있어서, 상기 프로모터는 SP6 또는 T7 프로모터인 것을 특징으로 하는 재조합 BAC 벡터.
- 제 7항에 있어서, 상기 제한효소 인식 염기서열 부위는 JEV 바이러스 게놈 RNA에 존재하지 않는 염기서열인 것을 특징으로 하는 재조합 BAC 벡터.
- 제 7항에 있어서, 상기 제한효소 인식 염기서열 부위는 XhoI 또는 XbaI인 것을 특징으로 하는 재조합 BAC 벡터.
- 제 7항에 있어서, 감염성이 있는 JEV cDNA는 SP6 프로모터를 포함하는 서열번호 43, 서열번호 44, 및 서열번호 45로 구성된 군으로부터 선택되는 염기서열 또는 T7 프로모터를 포함하는 서열번호 46, 서열번호 47 및 서열번호 48로 구성된 군으로부터 선택되는 염기서열을 갖는 것을 특징으로 하는 재조합 BAC 벡터.
- 제 7항에 있어서, JEV cDNA는 제 2항의 cDNA인 것을 특징으로 하는 재조합 BAC 벡터.
- 삭제
- 제 7항에 있어서, 도 3의 개열지도로 표시되며, 서열번호 43으로 기재되는 pBACSP6/JVFL/XhoI, 서열번호 44로 기재되는 pBACSP6/JVFLx/XhoI, 서열번호 45로 기재되는 pBACSP6/JVFLx/XbaI, 서열번호 46으로 기재되는 pBACT7/JVFL/XhoI, 서열번호 47로 기재되는 pBACT7/JVFLx/XhoI 및 서열번호 48로 기재되는 pBACT7/JVFLx/XbaI로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 재조합 BAC 벡터.
- 제 15항에 있어서, T7 프로모터를 가지는 pBACT7/JVFLx/XbaI인 것을 특징으로 하는 재조합 BAC 벡터(수탁번호: KCTC 10346BP).
- 제 15항에 있어서, SP6 프로모터를 가지는 pBACSP6/JVFLx/XbaI인 것을 특징으로 하는 재조합 BAC 벡터(수탁번호: KCTC 10347BP).
- 1) 제 7항의 재조합 BAC 벡터의 런-오프 부위에 존재하는 제한효소 인식부위를 제한효소로 절단하는 단계;2) 상기 절단된 재조합 BAC 벡터를 주형으로 하여, RNA 폴리머라아제, 캡 유사체, rUTP, rGTP, rCTP 및 rATP를 포함하는 버퍼 내에서 시험관 내 전사반응을 수행하는 단계를 포함하는 감염성이 있는 합성 JEV RNA 전사체의 제조방법
- 제 18항에 있어서, 3'-말단에 바이러스와 연관되지 아니하는 뉴클레오타이드를 제거하는 단계를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 제조방법
- 제 19항에 있어서, 녹두 뉴클레아제(mung bean nuclease)로 처리함으로써 바이러스와 연관되지 아니하는 뉴클레오타이드를 제거한 것을 특징으로 하는 제조방법.
- 제 18항의 방법으로 제조되는 감염성이 있는 합성 JEV RNA 전사체.
- 제 21항의 감염성이 있는 합성 JEV RNA 전사체로 형질전환된 형질전환체.
- 제 22항의 형질전환체를 배양하여 얻어지는 합성된 JEV 바이러스(synthetic JEV).
- 1) 제 7항의 재조합 BAC 벡터에 이형 유전자를 삽입시켜 재조합된 JEV cDNA 발현 벡터를 제조하는 단계;2) 상기 재조합된 JEV cDNA 발현벡터로부터 JEV RNA 전사체를 제조하는 단계;3) 상기 JEV RNA 전사체를 숙주세포에 형질전환시켜 형질전환체를 제조하는 단계; 및4) 상기 형질전환체를 배양하여 외래 단백질을 발현시키는 단계로 구성되는 JEV cDNA를 이용하여 이형 유전자를 발현시키는 방법.
- 제 24항에 있어서, 외래 단백질의 유전자를 JEV 전체-길이의 감염성이 있는 cDNA상의 JEV 3'NTR 시작부위에 삽입하여 제조하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 7항의 재조합 BAC 벡터에 이형유전자가 삽입된 감염성있는 전장길이 JEV cDNA의 발현벡터.
- 제 26항에 있어서, 상기 이형유전자는 리포터유전자인 것을 특징으로 하는 발현벡터.
- 제 28항에 있어서, 상기 리포터유전자는 루시퍼라제(Luciferase, LUC) 유전자, 형광발현유전자(enhanced green flouorescent protein, EGFP) 및 베타-갈락토시다제(β-galactosidase, LacZ) 유전자로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 발현벡터.
- 제 18항에 있어서, 캡 유사체는 m7G(5')ppp(5')A 또는 m7G(5')ppp(5')G인 것을 특징으로 하는 제조방법.
- 제 18항에 있어서, 제한효소는 Xho I 또는 Xba I인 것을 특징으로 하는 제조방법.
- 제 18항에 있어서, RNA 폴리머라아제는 SP6 또는 T7 폴리머라아제인 것을 특징으로 하는 제조방법.
- 제 27항의 발현벡터로부터 획득되는 감염성있는 JEV RNA 전사체로 형질전환된 형질전환세포에 후보화합물을 투여하고 리포터유전자의 발현정도를 측정하는 단계를 포함하는 일본뇌염 치료제의 스크리닝 방법.
- 통상적인 재조합 DNA 기법(recombinant DNA technology)을 사용하여 제 7항의 재조합 BAC 벡터를 조작하는 단계를 포함하는 JEV 백신의 제조방법.
Applications Claiming Priority (2)
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