CN1829796B - 新的日本脑炎病毒的全长基因组RNA、来自它的感染性的JEV cDNA及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及新的日本脑炎病毒(JEV)的基因组RNA和来自它的感染性的JEV cDNA。更具体地，本发明涉及由SEQ.ID.No 15表示的JEV的全长基因组RNA和来自它的感染性的JEV cDNA。本发明的JEV基因组RNA和感染性的JEV cDNA不但可以用于鉴别JEV基因，而且可以用于分子生物学研究，包括JEV复制、转录和翻译。而且，它们还可以用于开发日本脑炎的治疗剂、疫苗、诊断剂和诊断装置，还可以用作多种外源基因的表达载体。
Description
发明领域
本发明涉及可靠的日本脑炎病毒(JEV)基因组RNA序列的测定、感染性的JEV cDNA克隆的构建、和该克隆或其衍生物在治疗、疫苗和诊断应用目的中的利用。另外，本发明还涉及JEV载体，例如用于异源基因的表达系统、遗传免疫和瞬时基因治疗。
背景
JEV是黄病毒科(Flaviviridae)家族的成员，通过蚊子传播。它是一种重要的人病原体，会造成永久性的神经精神后遗症和甚至致命疾病，特别是在儿童中(Tsai，Vaccine，2000，18(Suppl 2)，1-25；Solomon，Neurological Infections和Epidemiology，1997，2，191-199；Umenai等，Bull.W.H.O.，1985，63，625-631)。每年报道高达50,000个病例，其死亡率约25％，约半数存活者表现出永久性的神经精神后遗症(Vaughn和Hoke，Epidemiol.Rev.，1992，14，197-221；Burke和Leake，Japanese encephalitis，1988，63-92，CRC Press Publisher)。JEV主要分布在亚洲，从前苏联至印度。但是，近年来，已经在南半球发现了该病毒的传播，这表明该病毒会威胁全世界的公众健康(Hanna，等，Med.J.Aust.，1999，170，533-536；Hanna，等，Med.J.Aust.，1996，165，256-260；Mackenzie等，Arch.Virol.，1994，136，447-467)。
JEV是小的有包膜病毒，具有长约11kb的单链有义RNA基因组。基因组含有一个由5’和3’非翻译区(NTR)连接的长开放阅读框架(ORF)，它们是用于病毒复制的重要顺式作用元件。JEV的RNA基因组在其5’-端具有I型帽结构，但是在其3’端没有poly(A)尾巴。ORF被翻译成较大的多蛋白，它在共翻译或翻译后被加工成3个结构性的和7个非结构性的蛋白，它们的在基因组中的基因如下：C-prM-E-NS1-NS2A-NS2B-NS3-NS4A-NS4B-NS5(Lindenbach和Rice，Flaviviridae：The viruses andtheir replication，2001，991-1041，Lippincott Williams & WilkinsPublishers；Venugopal和Gould，Vaccine，1994，12，966-975；Chamber等，Ann.Rev.Microbiol.，1990，44，649-688)。其它信息(例如，大多数JEV基因产物的功能和参与JEV复制的分子机制、神经毒力和发病机理)非常有限，因为没有可靠的反向遗传系统。
反向遗传系统的进展已经显著地促进了关于有义RNA病毒的研究。在这里，构建了所述病毒基因组的感染性cDNA克隆，并将其用作能生成合成病毒的感染性的RNA的合成模板。有两种用于反向遗传系统的方案，使用RNA的方案和使用DNA的方案。在典型的“使用RNA的”方案中，用从感染性的cDNA克隆制备出的RNA转录物转染细胞，然后从这些细胞中回收合成的病毒(Satyanarayana等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1999，96，7433-7438 van Dinten等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1997，94，991-996；Liljestrom和Garoff，Biotechnology，1991，9，1356-1361Rice等，NewBiol.，1989，1，285-296，Rice等，J.Virol.，1987，61，3809-3819)。在备选的“使用DNA的”方案中，通过将感染性的cDNA克隆直接转染进易感细胞中，生成合成的病毒。该方案首次报道用于脊髓灰质炎病毒(Racaniello和Baltimore，Science，1981，214，916-919)，并且已经用于甲病毒(Schlesinger和Dubensky，Curr.Opin.Biotechnol.，1999，10，434-439)。
这两个方案已用于构建许多有义RNA病毒家族的感染性的cDNA克隆，包括冠形病毒，它具有最大的RNA基因组(Almazan等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，2000，97，5516-5521)。这些克隆对于解决许多关于有义RNA病毒的问题是无价的。但是，JEV的全长感染性的cDNA克隆的构建受到了阻碍，主要是因为克隆的cDNA的遗传不稳定性。尽管作了大量努力，仍然没有得到遗传稳定的JEV的全长感染性的cDNA分子克隆(Mishin等，Virus Res.，2001，81，113-123；Zhang等，J.Virol.Methods，2001，96，171-182；Sumiyoshi等，J.Infect.Dis.，1995，171，1144-1151；Sumiyoshi等，J.Virol.，1992，66，5425-5431)。
因而，本发明人已经公开了JEV株CNU/LP2(从一群韩国传播蚊子(circulating mosquitoes)分离出)的完整的全长核苷酸序列。基于该序列，本发明人还已经通过合成全长感染性的JEV cDNA分子克隆开发了方便可靠的用于JEV的反向遗传系统。基于本发明的新的感染性的JEVcDNA的反向遗传系统可以有效地用于研究JEV基因产物的功能和与JEV的复制、神经毒力和发病机理相关的其它分子生物学机制。而且，本发明人已经通过确认感染性的JEV cDNA能以多种方式有效地用作用于表达异源基因的载体完成了本发明。
优选实施方案的详细描述
本发明的一个目的是提供可靠的JEV基因组RNA序列、来自它的感染性的JEV cDNA克隆、和该克隆或其衍生物在新的基因表达载体中的应用。
为了实现上述目的，
1)本发明提供了可靠的JEV基因组RNA序列。
2)本发明提供了感染性的JEV cDNA克隆，它能生成可自我复制的JEV RNA转录物。
3)本发明提供了基于JEV的载体。
4)本发明提供了从上述基于JEV的载体合成的可自我复制的RNA转录物。
5)本发明提供了重组的JEV病毒，它获自用从基于JEV的载体合成的合成RNA转录物转染的细胞。
6)本发明提供了基于JEV的表达载体。
7)本发明提供了多种使用基于JEV的表达载体表达异源基因的策略。
下文中本发明的其它特征将是明显的。
I.本发明提供了可靠的JEV基因组RNA序列。
本发明的韩国分离物JEV基因组RNA由5’非翻译区(NTR)、多肽编码区和3’NTR组成。具体地，全长RNA基因组的长度为10,968bp，由95bp的5’NTR、随后的10,299bp的单个开放阅读框架和末端的574bp的3’NTR组成。
根据本发明的优选实施方案，JEV的新型基因组RNA具有SEQ.ID.No15.所示的序列。本发明的新型基因组RNA还包括与SEQ.ID.No 15.所示的JEV基因组RNA具有98％同源性的任何序列。
本发明的韩国分离物JEV是通过利用噬斑-纯化技术从韩国JEV株K87P39分离和纯化的，并命名为“JEV CNU/LP2”(见图1)。
为了检测CNU/LP2(韩国分离物JEV)的完整核苷酸序列，本发明人使用长反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增了缺少5’和3’端的完整病毒RNA基因组，并且产生了3种重叠的cDNA产物，表示为JVF(核苷酸(nt)1-3865)、JVM(nt 3266-8170)和JVR(nt 7565-10893)(长度分别为约3.9、4.9和3.3kb)(见图2A)。
将合成的寡核苷酸T连接到它上面后，分析了CNU/LP2病毒RNA的3’-末端序列。寡核苷酸T作为cDNA合成和PCR扩增的特异性引发位点(见图2B)。琼脂糖凝胶电泳表明，扩增产物形成2条带：约700bp的较大条带和约450bp的较小条带(见图2C)。纯化并克隆两条带，对20和10个随机选取的含有较大和较小条带的克隆分别进行测序。正如大多数完整测序的JEV分离物已经记载的，本发明人发现，具有较大插入物(约700bp)的所有克隆都用-GATCT10968作为病毒基因组的末端。相反地，具有较小插入物(约450bp)的所有克隆表现出在nt 10,684处被截断的病毒基因组，它生成的更短284bp的条带。在装配全长JEV cDNA的过程中，本发明人使用了较大插入物的核苷酸序列，因为较小的插入物在病毒基因组的3’端不含有284个核苷酸。
通过用烟酸焦磷酸酶孵育除去其5’端的帽结构后，检查CNU/LP2病毒RNA的5’-末端序列。然后让得到的病毒RNA自连接，对3’-5’连接进行cDNA合成和PCR扩增，使用互补于临近病毒3’端(nt 10259-nt 10276)的序列的有义引物和与临近病毒5’端(nt 164-nt 181)的序列相对应的反义引物用于RT-PCR(见图2D)。琼脂糖凝胶电泳表明，扩增产物是约850bp的单独条带(见图2E)。克隆扩增子，对12个随机选取的克隆进行测序。在所有的12个克隆中，病毒3’-末端序列的-GATCT10968后面是5’-末端序列1AGAAGT-(见图2B和2C)。
因此，本发明人已经确定了SEQ.ID.No 15所示的JEV CNU/LP2分离物的完整核苷酸序列。JEV CNU/LP2的全长RNA基因组的长度是10,968bp，由95bp的5’NTR、随后的10,299bp的单个开放阅读框架和末端的574bp的3’NTR组成。本发明人对比了CNU/LP2分离物的完整核苷酸序列和所有可从GenBank数据库得到的26个JEV株(Ishikawa，K94P05，FU，CH2195LA，CH2195SA，RP-2ms，RP-9，CH1392，T1P1，YL，JaGAr01，HVI，TC，TL，Beijing-1，Ling，Vellore P20778，p3，SA14-14-2，SA(A)，SA14-12-1-7，SA14-2-8，SA14，SA(V)，GP78和JaOArS982)的序列。下面简单地说明了关于用于对比的病毒株的分离地点、分离年度、来源和GenBank保藏号的信息(见表1)。
表1
IU：信息不明
通过对比CNU/LP2分离物的核苷酸序列与其它JEV株的核苷酸序列，证实了JEV分离物CNU/LP2基因组与这些其它基因组具有不同程度的序列相似度[89.0％(Ishikawa)，89.1％(K94P05)，89.3％(FU)，95.8％(CH2195LA)，95.9％(CH2195SA)，97.1％(RP-2ms)，97.2％(RP-9)，97.3％(CH1392)，97.3％(T1P1)，97.0％(YL)，97.4％(JaGAr01)，97.1％(HVI)，96.9％(TC)，96.7％(TL)，96.4％(北京-1)，96.3％(Ling)，96.0％(VelloreP20778)，97.1％(p3)，97.4％(SA14-14-2)，97.5％(SA(A))，97.5％(SA14-12-1-7)，97.7％(SA14-2-8)，97.9％(SA14)，97.9％(SA(V))，96.3％(GP78)和97.1％(JaOArS982)](见表2)。因此，本发明的权利要求类别中可以包括与SEQ.ID.NO 15所示的本发明的核苷酸序列具有超过98％序列相似度的JEV病毒基因组RNA的核苷酸序列。
表2
a完整基因组的核苷酸序列同一性的百分比在右上角。完整基因组的氨基酸序列同一性的百分比在左下角。CNU/LP2序列同一性的百分比表示为粗体字。
除了检测JEV的多肽编码区的核苷酸序列以外，还利用分子生物学方法检测了5’和3’NTR的核苷酸序列，包括参与调节病毒的复制、转录和翻译的顺式作用元件。这两个区域的重要性已经得到了一些早期研究文献的支持，即体外地(You和Padmanabhan，J.Biol.Chem.，1999，274，33714-33722)和体内地(Khromykh等，J.Virol.，2001，75，6719-6728)启动黄病毒RNA的复制需要5’-和3’-末端区域。尤其是，高度预期1AGAAGT-和-GATCT10968(证实了是在本发明中JEV CNU/LP2的5’-和3’-末端区域的核苷酸序列)在病毒的自我复制中起重要作用。
本发明人通过下文所述的实验证实了，用具有JEV的全长核苷酸序列的合成的RNA转录物转染细胞时能生成感染性的合成JEV，而且，发明人首次证实了JEV自我复制所必需的完整全长核苷酸序列的功能。
II.本发明提供了能生成可自我复制的JEV RNA转录物的感染性的JEV cDNA克隆。
用SEQ.ID.No 15所示的核苷酸序列或与其具有超过98％序列相似度的全长JEV基因组RNA的核苷酸序列合成了本发明的感染性的JEVcDNA克隆，并且用作通过体外转录合成可自我复制的JEV RNA转录物的模板。为了构建全长JEV cDNA克隆，通过RT-PCR扩增病毒基因组RNA(包括5’-和3’-末端区域)，随后顺序装配得到的重叠的cDNA。
为了通过体外失控转录(runoff transcription)反应生产全长的合成的JEV RNA转录物，使SP6或T7启动子转录起始位点位于JEV基因组RNA的5’-端前面，使独特的限制内切酶识别位点位于病毒基因组的末端(见图3A)。在本发明的优选实施方案中，通过使用3个重叠的JEV cDNA(JVF，JVM和JVR)和2个另外的cDNA构建了3个SP6-驱动的全长JEV cDNA和3个T7-驱动的全长JEV cDNA；一个对应着5’-末端区域(包括SP6或T7启动子序列)，其它的对应着3’-末端区域(包括作为失控位点的XhoI和Xba I识别序列)(见图3B和3C)。但是，也可以使用上述2种启动子以外的其它启动子，这是本领域普通技术人员的常识。本发明开发的全长JEV cDNA使用Xho I和Xba I作为失控位点，但是其它的限制酶可以如通常所知的那样使用。
使用细菌人工染色体(BAC)质粒pBeloBAC11作为载体，通过生产含有许多重叠的cDNA的亚克隆并随后将这些亚克隆连接到全长JEV cDNA中，构建了本发明的JEV cDNA克隆。
在本发明的优选实施方案中，本发明的发明人提供了一组3种具有SP6启动子的JEV cDNA克隆，分别由SEQ.ID.No 43、No 44和No 45表示。另外，本发明的发明人还提供了其它组3种具有T7启动子的JEVcDNA克隆组，分别由SEQ.ID.No 46、No 47和No 48表示(见图3B和3C)。为了保证病毒基因组的3’端在失控转录后是可靠的，在所有的实验中，本发明的发明人在病毒基因组的末端设置了独特的限制内切酶识别位点Xho I或Xba I(见图3B和3C)。
III.本发明提供了基于JEV的载体。
本发明的载体的特征在于包含全长的感染性的JEV cDNA。在本发明的优选实施方案中，本发明的发明人提供了载体“pBACsp6/JVFL/XhoI”、“pBACsp6/JVFLx/XhoI”和“pBACsp6/JVFLx/XbaI”，它们都具有SP6启动子，且分别由SEQ.ID.No 43、No 44和No 45表示，还提供了载体“pBACT7/JVFL/XhoI”、“pBACT7/JVFLx/XhoI”和“pBACT7/JVFLx/XbaI”，它们都具有T7启动子，且分别由SEQ.ID.No 46、No 47和No 48表示。本发明的发明人于2002年10月2日将上面的两种最有效的载体pBACT7/JVFLx/XbaI和pBACSP6/JVFLx/XbaI保藏在韩国生物科学和生物技术研究所(Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology)(KRIBB)的基因库中(保藏号：KCTC 10346BP，KCTC 10347BP)。
IV.本发明提供了从上述基于JEV的载体合成的可自我复制的RNA转录物。
为了体外失控转录，通过用Xho I或Xba I酶切使JEV cDNA模板线性化，其在工程上用于在紧邻病毒基因组3’-末端区域后的失控位点(run-off site)(见图3)。两种Xho I-线性化的质粒(pBACSP6/JVFL/XhoI和pBACSP6/JVFLx/XhoI)在存在m7G(5′)ppp(5′)A帽结构类似物的情况下的SP6聚合酶失控转录生成了带帽的合成的RNA，在它们的3’端含有与病毒无关的序列的3个核苷酸(CGA)(见图3B)。这是复制Xho I酶切剩下的5’突出物的结果。类似地，Xba I-线性化的pBACSP6/JVFLx/XbaI质粒在存在m7G(5′)ppp(5′)A帽结构类似物的情况下的SP6聚合酶失控转录生成了带帽的合成的RNA，在它们的3’端含有与病毒无关的序列的4个核苷酸(CTAG)(见图3B)。
本发明的发明人已经进行了侵染中心试验，以检测合成的JEV RNA转录物的特异感染性。结果，当用合成的RNA转录物转染易感的BHK-21细胞时，全部是高感染性的(3.4-4.3×105PFU/μg)(见表3)。从T7聚合酶失控转录的T7-驱动的cDNA构建体转录的合成RNA得到了类似结果(2.9-3.8×105PFU/μg)(见表3)。
已经报道，对于一些黄病毒，存在于从感染性的cDNA转录的合成RNA的3’端的与病毒无关的序列会减少或消除它们的特异感染性(Yamshchikov等，Virology，2001，281，294-304)。基于该报道，本发明的发明人生成了在它们的3’端缺少与病毒无关的序列的合成RNA，并对比了它们的特异感染性。具体地，通过在转录反应之前用绿豆核酸酶(MBN)处理Xba I-线性化的pBACsp6/JVFLx/XbaI质粒除去4个多余的核苷酸CTAG，本发明的发明人生成了缺少无关序列的合成RNA。为了验证MBN活性，使Xba I-线性化的和MBN-处理过的pBACSP6/JVFLx/XbaI质粒自连接，对其病毒3’端测序，证实去除了4个多余的核苷酸CTAG。与未处理的转录物相比，来自Xba I-线性化的和MBN-处理过的pBACSP6/JVFLx/XbaI和pBACT7/JVFLx/XbaI(pBACSP6/JVFLx/XbaIMBN见图3B，pBACT7/JVFLx/XbaIMBN见图3C)的RNA转录物都具有增强的特异感染性。更准确地，估计从pBACSP6/JVFLx/XbaIMBN转录的RNA的特异感染性为3.1×106PFU/μg，约是未修饰模板的特异感染性(3.4×105PFU/μg)的10倍(见表3，感染性)。源自pBACT7/JVFLx/XbaI的RNA在MBN修饰后也具有增强的特异感染性(2.7×106PFU/μg)(见表3，感染性)。因此，本发明的发明人确信，应当存在JEV基因组的可靠的3’端，以确保生成高感染性的合成的JEV RNA转录物。因而，本发明的感染性的JEVcDNA克隆能用作失控转录的模板，生成高感染性的合成的RNA，其特异感染性为105～106PFU/μg。
以前的装配全长的感染性的JEV cDNA的尝试(Mishin等，Virus Res.，2001，81，113-123；Zhang等，J.Virol.Methods，2001，96，171-182；Sumiyoshi等，J.Infect.Dis.，1995，171，1144-1151；Sumiyoshi等，J.Virol.，1992，66，5425-5431)都失败了，因为克隆的JEV cDNA的遗传不稳定性。一项研究尝试通过设计下述系统来克服该问题：其中体外地连接2个重叠的JEV
cDNA来生成模板(Sumiyoshi等，J.Virol.，1992，66，5425-5431)。该模板然后用于体外地合成感染性的RNA转录物。但是，这些转录物的特异感染性是约100PFU/μg，该值太低，使得该系统不能用于病毒生物学的分子和遗传分析(Sumiyoshi等，J.Virol.，1992，66，5425-5431)。
在本发明中，本发明人能通过将JEV cDNA克隆进BAC质粒(它在大肠杆菌中维持1或2个拷贝)中来克服它的遗传不稳定性。在大肠杆菌中繁殖的过程中，感染性的cDNA质粒的遗传结构和功能完整性能在至少180代中维持稳定(见图7)。所以，本发明的发明人通过导入BAC解决了制备全长的感染性的JEV cDNA时的遗传不稳定性问题，并且具有稳定地处理合成的感染性的JEV cDNA的技术。
生产全长的感染性的JEV cDNA是重要的，在体外转录中它能生成具有可靠的5’和3’端的RNA转录物，因为几项研究已经证实，体外地(You和Padmanabhan，J.Biol.Chem.，1999，274，33714-33722)和体内地(Khromykh等，J.Virol.，2001，75，6719-6728)启动黄病毒RNA转录需要5’-和3’-末端区域。为实现该目的，本发明的发明人采用了先前用于其它黄病毒的方法(van der Werf等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1986，83，2330-2334；Rice等，New Biol.，1989，1，285-296)。JEV基因组RNA的帽结构后面是双核苷酸AG，它是黄病毒的绝对保守的特征(Rice，Flaviviridae：The viruses and their replication，1996，931-960，Lippincott-RavenPublisher)。通过将SP6或T7启动子转录起点置于病毒基因组的起始，确保了5’端的可靠性。通过将m7G(5′)ppp(5′)A帽结构类似物整合进SP6或T7聚合酶驱动的转录反应(Contreras等，Nucleic Acids Res.，1982，10，6353-6362)，本发明的发明人合成了具有可靠的5’端的带帽的RNA转录物，它们在转染进易感细胞中时是高感染性的。另外，将m7G(5′)ppp(5′)G帽结构类似物整合进SP6或T7的聚合酶驱动的转录反应(Contreras等，Nucleic Acids Res.，1982，10，6353-6362)会将不相关的G核苷酸置于双核苷酸AG的上游。如以前报道(Rice等，New Biol.，1989，1，285-296)的，本发明的发明人确实发现，回收的JEV子代的基因组RNA丢失了多余的核苷酸。而且，本发明的发明人未观察到，如果发明人添加额外的核苷酸，会改变从感染性的cDNA模板转录的合成RNA的感染性或复制。
在黄病毒中，位于JEV RNA的3’端的双核苷酸CT是绝对保守的(Rice，Flaviviridae：The viruses and their replication，1996，931-960，Lippincott-Raven Publisher)。这表明，这些核苷酸在病毒复制中是重要的，来自感染性的cDNA的转录物必须具有可靠的3’端。因而，本发明的发明人设计了用于JEV的反向遗传系统，使合成的RNA能以可靠的3’端结束。实际上，本发明的发明人证实了，具有可靠的3’端的RNA转录物比在它们的3’端连接有3或4个与病毒无关的核苷酸的转录物的感染性高10倍。
V.本发明提供了获自用从基于JEV的载体合成的RNA转录物转染的细胞的重组JEV病毒。
在本发明中，生产了用从全长的感染性的JEV cDNA合成的JEV RNA转录物转染的细胞生产的合成JEV病毒。转染的细胞表现出明显的由JEV病毒感染诱导的细胞病理效应，在噬斑形态学、致细胞病性、生长动力学、蛋白表达和RNA积累方面，所有的合成病毒都不能与CNU/LP2亲代病毒区分开(见图5)。而且，通过诱导JEV cDNA的特定区域上的定点突变可以生成重组的JEV病毒突变株，这表明，可以在大肠杆菌中操纵感染性的JEV cDNA。因而，使用本发明的感染性的JEV cDNA的反向遗传系统可以有效地用于关于JEV基因组的复制机制的遗传研究。
VI.本发明提供了基于JEV的表达载体。
本发明提供了JEV cDNA作为新型表达载体在多种细胞类型中的应用。甲病毒也是RNA病毒，可以在多种常用的动物细胞中复制并因而已经成功地开发用作细胞培养和体内中的真核表达载体(Agapov等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1998，95，12989-12944；Frolov等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1996，93，11371-11377；Schlesinger，Trends Biotechnol.，1993，11，18-22)。有报道说，JEV跟甲病毒一样，也能在来自人、小鼠、猴子、猪和仓鼠的多种初始的和传代细胞培养物中复制(Burke和Monath，Flaviviruses，2001，1043-1125，Lippincott Williams & Wilkins Publishers)。这表明，JEV可以用作在多种不同细胞中表达异源基因的载体。当全长的感染性的JEV cDNA用作表达载体(其中插入了异源基因)时，通过体外转录反应生成了具有异源基因的RNA转录物。那些转录物由于转染进了细胞中而能自我复制，所以可以生产大量外源蛋白。
表达盒有效地插入在用于表达外源基因的JEV 3’NTR的起始处。在CNP/LP2和3种其它的完全测序的JEV株的病毒的3’NTR的起始处缺失9-25bp(Williams等，J.Gen.Virol.，2000，81，2471-2480；Nam等，Am.J.Trop.Med.Hyg.，2001，65，388-392；Jan等，Am.J.Troop.Med.Hyg.，1996，55，603-609)，表明这可以是良好的插入外源基因的位点。因而，本发明开发的感染性的JEV cDNA可以用作在多种细胞(包括哺乳动物细胞)中快速表达外源基因的载体。
VII.本发明提供了多种使用基于JEV的表达载体表达外源基因的策略。
表达载体的一个功能是将目标外源基因输送进用于表达这些基因的细胞中。在本发明中，已经证实了全长的感染性的JEV cDNA在多种细胞类型(包括哺乳动物细胞)中起外源基因表达载体的作用。
在这里，本发明的发明人还描述了基于全长的感染性的JEV cDNA(它起BAC的作用)的外源基因表达系统(Yun等，J.Virol.，2003，77，6450-6465)。作为瞬时表达系统，JEV具有多个优点：(i)快速生成高滴度的病毒，(ii)该病毒能感染广范围的宿主细胞，包括昆虫和哺乳动物细胞类型，(iii)遗传稳定的感染性的cDNA是可以得到的，并且可以容易地操作，和(iv)RNA基因组的细胞质复制使其整合进行宿主基因组中的可能性和后续的不希望发生的突变结果最小化。
本发明的发明人在这里证实了，基于JEV的系统可以用于以3种不同的方式表达外源基因。一种包括编码外源基因的感染性的重组载体RNA/病毒，第二种包括生产能进行病毒复制但是增殖缺陷型的JEV病毒复制子载体RNA。第三种包括使用用于形成病毒复制子颗粒(VRP)的包装系统。因而，本发明的发明人已经在这里证实了，JEV系统可以用来生产JEV病毒/感染性的RNA/复制子RNA/VRP载体，它们能在多种哺乳动物细胞类型中快速表达目标外源基因。
使用本发明的感染性的或复制子JEV cDNA载体表达外源基因的基本方法由下述步骤组成：
1)通过将外源基因插入到感染性的或复制子JEV cDNA载体中，制备重组JEV cDNA表达载体；
2)从上述的重组JEV cDNA表达载体生产JEV RNA转录物；
3)用上述的JEV RNA转录物转染宿主细胞，制备转化体；
4)通过培养上述转化体表达外源蛋白。
根据前文所述的方法，本发明的发明人生产了表达绿荧光蛋白(GFP)、增强的GFP(EGFP)、荧光素酶(LUC)、LacZ基因和显性选择性标记嘌呤霉素N-乙酰基转移酶(PAC)(它能赋予对药物嘌呤霉素的抗性)的全长的感染性的重组JEV cDNA(见图8和9)。用从重组JEV cDNA转录出的JEV RNA转录物转染BHK-21细胞。GFP、EGFP、LUC、LacZ和PAC表达如图8和10所示。另外，从培养上清液中制备了含有那些外源基因的重组的感染性JEV病毒颗粒。在用重组病毒感染了多种动物细胞系(BHK-21，Vero，NIH/3T3，ST，HeLa，MDCK，CRFK，B103和SHSY-5Y)(它们已经常规地用于生物和医药领域)之后，进一步研究了那些外源基因的表达。结果，在所有的测试细胞中都表达了插入在病毒基因组中的GFP或LUC基因(见表4)。因而，证实了重组的JEV cDNA、JEVRNA转录物和重组的JEV病毒颗粒可以有效地用作在多种细胞类型中表达外源基因的载体。
为了用JEV RNA复制机器独立地表达外源基因，本发明的发明人通过删除1个、2个或全部病毒结构基因生成了一组能自我复制、自限制的且满足严格安全要求的病毒复制子(图l1A)。这些病毒复制子能依靠RNA转染启动复制和基因表达(见图11B和11C)。
通过开发能一组包装细胞系(PCL)的稳定复制子(它们能组成型地反向表达所有JEV病毒结构蛋白(C、prM和E))，进一步说明了基于JEV复制子的表达载体的使用(见图12)。这些PCL能反向补充JEV病毒复制子的有效包装。因而，证实了这些PCL用于通过导入JEV病毒复制子有效地生产高滴度的病毒VRP(见图12)。
本发明的发明人还证实，可以将编码高达3kb的外源基因的感染性的JEV重组病毒RNA包装进病毒颗粒中。通过选择JEV病毒复制子载体如JEV/Rep/ΔC+ΔprM+ΔE和JEV/Rep/NS1，估计可以将至少5kb的外源基因包装进JEV VRP中。令人感兴趣的是，检查可以包装进JEV病毒粒子的外源序列的大小上限。如果想表达长基因(例如囊性纤维化跨膜电导调节物，其编码序列约4.5kb)，这可能是一个重要的问题(Flotte等，J.Biol.Chem.，1993，268，3781-3790)。另外，如果想添加2个或多个表达单元，大包装容量的JEV病毒复制子会是有用的(Thiel等，J.Virol.，2003，77，9790-9798；Agapov等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1998，95，12989-12994)。在基于腺相关病毒的载体的情况下，已经优越地扩展了其包装容量，避免了其自然大小的限制(Duan等，Nat.Med.，2000，6，595-598；Yan等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，2000，97，6716-6721)，这表明，可以以类似的方式扩展JEV病毒复制子的包装容量。
至于源自RNA病毒的其它载体(Agapov等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1998，95，12989-12994；Pushko等，Virology，1997，239，389-401；Berglund等，Nat.Biotechnol.，1998，16，562-565；Basak等，J.Interferon Cytokine Res.，1998，18，305-313；Barclay等，J.Gen.Virol.，1998，79，1725-1734；Khromykh和Westaway，J.Virol.，1997，71，1497-1505；Molenkamp等，J.Virol.，2003，77，1644-1648；Shi等，Virology，2002，296，219-233；Varnavski和Khromykh，Virology，1999，255，366-375；Perri等，J.Virol.，2000，74，9802-9807；Curtis等，J.Virol.，2002，76，1422-1434)，本发明的发明人还能构建多种JEV病毒复制子载体RNA，通过使用基于甲病毒的表达系统反向提供结构蛋白时，可以包装它们(Agapov等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1998，95，12989-12994)。因而，已经清楚地证实了包装系统有效地生成生物安全的JEV载体的能力。与甲病毒(Frolova等，J.Virol.，1997，71，248-258；White等，J.Virol.，1998，72，4320-4326)和反转录病毒(Rein，Arch.Virol.Suppl.，1994，9，513-522)不同，关于黄病毒(包括JEV)所采用的包装信号所知甚少。我们的JEV反向互补系统提供的证据表明，整个JEV结构区域不太可能在包装中起作用。因而，该系统可以用于定义JEV RNA中的包装信号和结构蛋白中的参与RNA包壳和形态发生的区域。该信息会进一步增加我们的基于JEV的表达系统的效用。
总之，本发明的全长JEV基因组RNA和来自它的感染性的JEV cDNA不但能鉴别与神经毒力和发病机制相关的JEV基因，而且可以用于研究JEV复制、转录和翻译的分子机制。另外，全长JEV基因组RNA和感染性的JEV cDNA可以有效地用于开发针对JEV的治疗剂、疫苗、诊断试剂和诊断试剂盒，和在真核细胞中表达外源目标基因的载体。而且，本发明所述的基于JEV的载体系统是一种有前途的系统，通过它可以将外源基因体外地输送进细胞中，并且可能体内地用于DNA免疫和瞬时基因治疗。
附图简述
参考附图会很好地理解本发明的优选实施方案的应用，其中：
图1中的一组照片对比了形成大噬斑的JEV分离物CNU/LP2和原始的K87P39株。(A-B)中的一组照片显示了使用(A)BHK-21细胞或(B)Vero细胞时的噬斑形态学。用原始的JEV K87P39株模拟感染(模拟感染的)或感染(K87P39-感染的)(A)BHK-21或(B)Vero细胞，形成病毒噬斑大小的异源混合物。在本发明中纯化的CNU/LP2分离物形成了大噬斑的同源群体(CNU/LP2-感染的)。(C)JEV蛋白表达的水平和图谱。用K87P39、CNU/LP2或黄热病病毒株YF17D模拟感染或感染BHK-21细胞。18小时后，将其固定，依次用JEV-特异性的小鼠超免疫腹水、异硫氰酸荧光素-缀合的山羊抗小鼠免疫球蛋白G(绿色荧光)染色，随后进行共焦显微镜检查。在存在Rnase A的情况下用碘化丙锭(红荧光)染色，使胞核可视化。
图2中的一组简图和一对电泳照片显示了用于对CNU/LP2的基因组RNA进行测序的策略。(A)该示意图显示了代表脱离5’和3’末端的整个JEV基因组RNA的3个重叠的cDNA扩增子的RT-PCR扩增。RNA表示为灰色，cDNA用实平行线表示。上区块示意性地说明了CNU/LP2JEV基因组RNA(长10,968bp)。下区块描绘了3个重叠的cDNA：JVF(nt 1-3865)、JVM(nt 3266-8170)和JVR(nt 7565-10893)。(B)该示意图显示了对CNU/LP2基因组RNA的3’端进行测序的程序。用T4RNA连接酶将5’-磷酸化的和3’-封闭的寡核苷酸T(寡T)连接到JEV基因组RNA的3’端，然后用得到的RNA进行cDNA合成，并用箭头所示的引物进行扩增。对得到的产物进行克隆和测序。(C)该电泳照片显示了从(B)所述的寡核苷酸T-连接的JEV基因组RNA合成的JEV-特异性的扩增子。用寡核苷酸TR(与寡核苷酸T互补)合成第一链cDNA，在存在(泳道1)或没有(泳道2)上标II逆转录酶(Superscript II reverse transcriptase)的情况下进行RT反应。用寡核苷酸TR和引物J35(它与nt 10259-10276互补)扩增cDNA。预期PCR产物的大小是727bp。在1.2％琼脂糖凝胶上分离产物，通过溴化乙锭(EtBr)染色使其可视化。(D)该示意图显示了对CNU/LP2基因组RNA的5’端进行测序的程序。用烟酸焦磷酸酶除去病毒基因组RNA的帽结构，然后用T4 RNA连接酶使脱帽的病毒RNA自连接，并用于cDNA合成和扩增。对得到的扩增产物进行克隆和测序。(E)该电泳照片显示了从(D)所述的自连接的JEV基因组RNA合成的JEV-特异性的扩增子。用与nt 215-232互补的引物J40进行第一链cDNA的合成。在存在(泳道1)或没有(泳道2)上标II逆转录酶的情况下进行RT反应。用引物J35和引物J39(它与nt 164-181互补)扩增cDNA。预期PCR产物的大小是890bp。在1.2％琼脂糖凝胶上分离扩增产物，通过EtBr染色使其可视化。泳道M表示100bp的DNA大小梯度标记物(按碱基对数)。
图3中的一组图表显示了细菌人工染色体(BAC)pBeloBAC11中的全长JEV cDNA克隆的构建。(A)在pBeloBAC11中构建的全长JEV cDNA的示意图。在代表病毒基因组的5’和3’NTR的两个末端用粗实线指示病毒蛋白。SP6和T7启动子转录起始位点和独特的限制内切酶识别位点(确保失控转录)分别显示在5’和3’端。(B-C)该组示意图显示了全长JEVcDNA克隆的5’和3’末端。JEV基因组RNA的核苷酸序列显示为粗斜体小写字母。解释了4个SP6-驱动的(B)和4个T7-驱动的(C)全长JEV cDNA模板的5’末端。为了产生SP6和T7RNA聚合酶失控产物，通过Xho I酶切，对2个SP6-驱动的(B，pBACSP6/JVFL/XhoI和pBACSP6/JVFLx/XhoI)和2个T7-驱动的(C，pBACT7/JVFL/XhoI和pBACT7/JVFLx/XhoI)JEVcDNA模板的3’末端进行线性化，在3’末端生成3个核苷酸的与病毒无关的序列(CGA)。类似地，用Xba I剪切SP6-驱动的(B，pBACSP6/JVFLx/XbaI)和T7-驱动的(C，pBACT7/JVFLx/XbaI)JEV cDNA模板的3’末端，在3’末端得到4个核苷酸(CTAG)的与病毒无关的序列。相反地，当用Xba I酶切线性化SP6-驱动的(B，pBACSP6/JVFLx/XbaIMBN)和T7-驱动的(C，pBACT7/JVFLx/XbaIMBN)JEV cDNA模板时，存在可靠的JEV基因组RNA的3’端，然后用绿豆核酸酶(MBN)处理，除去不相关的单链序列。导入在病毒基因组的3’端的限制内切酶识别位点标有下划线。箭头表示剪切位点。
图4中的一组照片和图片证实了下述事实，单独的全长JEV cDNA模板不是感染性的，但是在体外地转录生成感染性的合成RNA的过程中需要它。(A)电泳照片显示了cDNA模板和合成的RNA转录物。(B)图片显示了用体外转录反应混合物(其含有全长JEV cDNA模板和合成的RNA转录物)转染BHK-21细胞得到的感染性。在没有(A，泳道1；B，未处理)或有(A，泳道2；B，Dnase I处理过程中)Dnase I存在的情况下，将Xba I线性化的和用MBN处理过的pBACSP6/JVFLx/XbaI(100-200ng)用于SP6聚合酶转录。合成后，用Dnase I(A，泳道3；B，Dnase I处理后)或RNaseA(A，泳道4；B，Rnase A处理后)在37℃处理转录反应混合物30分钟。作为对照，在没有SP6RNA聚合酶(A，泳道5；B，没有SP6Pol)存在的情况下进行反应。(A)处理后，在0.6％琼脂糖凝胶上分离5％的反应混合物，通过用EtBr染色使cDNA模板和RNA转录物可视化。(B)用反应混合物转染BHK-21细胞，评估噬斑的感染中心。
图5中的一组照片和图片对比了合成的JEV和亲代病毒CNU/LP2。(A)合成的JEV和亲代CNU/LP2的代表性的噬斑试验。用亲代或合成的病毒感染BHK-21细胞，覆盖琼脂糖，3天后用结晶紫染色。(B)合成的JEV和亲代CNU/LP2(以0.01、1和10感染复数(MOI))的BHK-21细胞的生长动力学。在指定的感染后小时(h.p.i)收集病毒，通过噬斑试验确定滴度。(C-D)分别通过(C)免疫印迹和(D)RNA印迹分析病毒蛋白和RNA水平。用MOI为1的合成的JEV(泳道1-4)或CNU/LP2(泳道5)感染或模拟感染(泳道6)BHK-21细胞，并培养18小时。(C)从约3×104细胞制备蛋白提取物，在10％SDS-聚丙烯酰胺凝胶上分离。通过用JEV-特异性的小鼠超免疫腹水进行免疫印迹，使病毒蛋白可视化(上区块)。平行地，检测作为装载和转移对照的肌动蛋白(下区块)。与病毒蛋白相关的切割中间产物和肌动蛋白的位置用左边的箭头标示。以kDa为单位的分子量标记标示在右边。(D)从约1×105细胞提取总RNA，通过使用32p-标记的反义核探针(它与包含nt 9143-9351的NS5基因序列杂交)的RNA印迹进行分析(上区块)。Etbr-染色的18S rRNA条带显示为装载对照(下区块)。全长基因组病毒RNA(11kb)和18S rRNA标示在左边。
图6中的一组简图和电泳照片显示了在来自pBACSP6/JVFLx/gm/XbaI的重组JEV中存在Xho I遗传标记。(A)Xho I酶切后预期的JVFLx/XbaIMBN和JVFLx/gm/XbaIMBN RT-PCR片段的示意图。标示的是用于RT-PCR(箭头)的引物、导入的Xho I位点(星号)和RT-PCR产物的大小(2,580bp)，以及用Xho I酶切JVFLx/gm/XbaIMBN后预期的2个Xho I酶切产物(1,506bp和1,074bp)。(B)用从pBACSP6/JVFLx/XbaIMBN 或pBACSP6/JVFLx/gm/XbaIMBN转录出的合成的RNA转染BHK-21细胞。24小时后收获病毒，在0.1感染复数下对BHK-21细胞连续传代。在每一代中，进行下一轮感染之前，将病毒与DNase I和RNase A一起孵育。在第1代和第3代，从含有释放出来的病毒的培养上清液中提取病毒RNA，用于RT-PCR。在有(+)或没有(-)Xho I的情况下孵育PCR产物，在1％琼脂糖凝胶上分离，用EtBr染色。未酶切的和酶切的PCR产物的预计大小显示在左边。泳道M标示了1-kb的DNA梯度标记物(按碱基对)。
图7中的图显示了从繁殖了180代的感染性的JEV cDNA克隆(pBACSP6/JVFLx/XbaI)转录的合成RNA的特异感染性。在37℃，将两个携带有pBACSP6/JVFLx/XbaI(实心和空心圆)的独立克隆在含有氯霉素的2xYT中培养过夜。通过106倍稀释和添加用于过夜生长的新鲜培养基，每天繁殖原代培养物，进行9天。每个传代细胞估计为约20代。在指定的传代细胞，纯化DNA质粒，通过Xba I酶切线性化，并用MBN处理，用作使用SP6RNA聚合酶的失控转录的模板。然后用转录物转染BHK-21细胞，以检测特异感染性。
图8是显示了用JEV cDNA作为载体表达外源基因的一组简图、照片和图片。(A)用于SP6RNA聚合酶的失控转录的cDNA模板的示意图。标示的是脑心肌炎病毒(EMCV)内部核糖体进入位点(IRES)-驱动的GFP或LUC基因(它们插入在病毒基因组3’NTR的起点)、SP6启动子转录起点和失控位点(通过Xba I酶切和MBN处理(XbaI/MBN)生成)。在pBACSP6/JVFLx/LUCREP-/XbaIMBN中，垂直的实线表示在NS3基因(它在nt 5596(星号)预先终止病毒的翻译)的中间的83个核苷酸缺失(nt5580-5663)。(B)GFP蛋白的表达。用2μg从pBACSP6/JVFLx/GFP/XbaIMBN模板(JVFLx/GFP/XbaIMBN)转录出来的合成RNA模拟转染(模拟)或转染BHK-21细胞，孵育30小时，然后固定并通过共焦显微镜检查。(C)LUC蛋白的诱导。用2μg从pBACSP6/JVFLx/LUC/XbaIMBN(●)或pBACSP6/JVFLx/LUCREP-/XbaIMBN(○)模板转录出来的合成RNA模拟转染(模拟)或转染BHK-21细胞(8×106)，以6×105细胞/孔的密度接种6-孔平板。在指定的时间点裂解细胞，检测LUC活性。从3个独立实验得到的标准偏差用误差棒标示。
图9显示了基于双顺反子的全长感染性的JEV cDNA(它作为BAC)编码外源基因的感染性重组JEV的构建和特征。(A)构建感染性的重组JEV cDNA的策略。亲代感染性的JEV cDNA(pJEV/FL)的结构记载在(Yun等，J.Virol.，2003，77，6450-6465)。通过两端(它们表示病毒基因组的5’和3’NTR)的粗实线解释了病毒的ORF。使用独特的天然Nsi I位点，将由EMCV IRES驱动的其它表达单元插入到3’NTR的起点。标示了SP6启动子转录起始位点(SP6启动子)和通过Xba I酶切和MBN处理生成的失控位点(XaI/MBN)。×标示目标外源基因。(B)显示了在本发明中构建的感染性的重组JEV cDNA的结构。将3中常用的报道基因(EGFP，768bp；LUC，1653bp；和LacZ，3012bp)或显性选择性标记PAC(600bp)工程地构建到3’NTR的起点。关于能复制的pJEV/FL/LUC cDNA，还用不能复制的pJEV/FL/LUCREP-cDNA作为阴性对照，这通过将83个核苷酸缺失(■)引入到NS3基因的中间来实现，这会导致病毒翻译在nt 5596(*)提前终止，如以前所述(Yun等，J.Virol.，2003，77，6450-6465)。(C-D)对比了重组JEV和亲代的感染性。如标示的，用2μg亲代或重组JEV RNA(它们已经从相关的JEV cDNA转录出来)模拟转染或转染BHK-21细胞(8×106)。(C)代表性的噬斑。将转化后的细胞覆盖琼脂糖，5天后用结晶紫染色。(D)病毒蛋白积累。在指定的时间点，用1X样品装载缓冲液裂解转染的细胞(4×105)，将蛋白提取物溶解到10％SDS-聚丙烯酰胺凝胶上。通过使用JEV-特异性的小鼠超免疫血清的免疫印迹使病毒蛋白可视化(Yun等，J.Virol.，2003，77，6450-6465)。病毒蛋白(E和NS1)和与切割有关的中间产物的位置通过左边的箭头标示。分子量标记(按kDa)标示在右边。V标示了用JEV CNU/LP2-感染的BHK-21细胞，而N标示了原初BHK-21细胞。
图10显示了常用的报道基因和用感染性的JEV cDNA作载体的显性选择标记的表达。用2μg亲代或重组JEV RNA(它们已经从每个质粒转录出来)模拟转染或转染BHK-21细胞(8×106)。(A-B)pJEV/FL/EGFP，(C)pJEV/FL/LacZ，(D)pJEV/FL/LUC或pJEV/FL/LUCREP-，(E)pJEV/FL/PAC。(A-B)EGFP的表达。转染后36小时，制备转染的细胞，用于(A)共焦显微镜检查和(B)流式细胞分析。-标示了JEV/FL/EGFP RNA-转染的细胞，……标示了模拟转染的细胞。(C)LacZ的表达。转染后36小时，处理转染的细胞，进行X-gal染色。(D)LUC的诱导。以4×105细胞/孔的密度，将转染的细胞接种到6-孔平板上。在指定的时间点，用细胞裂解物进行LUC试验。试验一式三份，平均值通过误差棒表示。●标示了JEV/FL/LUC RNA-转染的细胞，○标示了JEV/FL/LUCREP-RNA-转染的细胞，-标示了原初细胞的背景荧光的水平。(E)PAC的表达。将转染的细胞涂布到6-孔平板上，并在完全培养基(平皿1，3，5，和7)中或含有0.5％琼脂糖的涂层(平皿2，4，6，和8)中孵育。孵育2天后，在有(平皿5-8)或没有(平皿1-4)10μg/ml嘌呤霉素存在的情况下，将平皿再孵育3天。然后固定细胞，用结晶紫染色。
图11显示了JEV病毒复制子的结构和载体特征。(A)显示了JEV病毒复制子的结构。实框(■)表示已经导入感染性的pJEV/FL/LUC构建体的基因组中的框架内缺失。4个构建体，即pJEV/Rep/ΔCC/LUC，pJEV/Rep/ΔC/LUC，pJEV/Rep/ΔprM/LUC和pJEV/Rep/ΔE/LUC都有单一的在每个JEV结构基因中的框架内缺失。pJEV/Rep/ΔCC/LUC具有一个延伸至猜想的在C基因的5’区域中环化序列基序的缺失，这与pJEV/Rep/ΔC/LUC不同。3个构建体，即pJEV/Rep/ΔC+ΔprM/LUC，pJEV/Rep/ΔC+ΔE/LUC和pJEV/Rep/ΔprM+ΔE/LUC含有2个框架内缺失，而pJEV/Rep/ΔC+ΔprM+ΔE/LUC在所有的结构蛋白中具有3个框架内缺失。pJEV/Rep/NS1/LUC也是工程化的，其编码C蛋白的35个N-末端和24个C-末端氨基酸，该C蛋白的后面紧跟着NS1蛋白的N-末端和其它病毒基因组。(B)LUC的诱导。用2μg亲代或JEV病毒复制子RNA(它们已经从每个质粒转录出来)转染原初BHK-21细胞(8×106)，然后以4×105细胞/孔的密度接种到6-孔平板上。在指定的时间点，对细胞裂解物进行LUC试验。试验一式三份地进行，并显示平均值。●黑色，pJEV/FL/LUC；◆黑色，pJEV/FL/LUCREP-；◆蓝色，pJEV/Rep/ΔCC/LUC；■蓝色，pJEV/Rep/ΔC/LUC；▲蓝色，pJEV/Rep/ΔprM/LUC；●蓝色，pJEV/Rep/ΔE/LUC；■红色，pJEV/Rep/ΔC+ΔprM/LUC；▲红色，pJEV/Rep/ΔC+ΔE/LUC；●红色，pJEV/Rep/ΔprM+ΔE/LUC；■绿色，pJEV/Rep/ΔC+ΔprM+ΔE/LUC；●绿色，pJEV/Rep/NS1/LUC。-标示了原初细胞的背景荧光水平。(C)病毒蛋白的积累。转染后48小时，用1X样品装载缓冲液裂解转染的细胞(4×105)，将蛋白提取物溶解到10％SDS-聚丙烯酰胺凝胶上。将蛋白转移到硝酸纤维素膜上，用JEV-特异性的小鼠超免疫血清进行免疫印迹。
图12显示了用于JEV病毒复制子的包装系统的构建。(A)以基于新培斯病毒的表达载体为基础的JEV结构蛋白表达盒的结构。pSinRep19是双亚基因组的无致细胞病性的RNA载体。使用分开的亚基因组启动子表达外源基因和PAC基因，如箭头所示。pSinRep19/JEV C-E盒编码JEV C、prM和E基因。pSinRep19/JEV C-E-BglII盒编码JEV C、prM和E基因，其后是NS1的N末端的58个残基，而pSinRep19/JEV C-NS1携带NS1基因的剩余物。MCS标示了多克隆位点。(B)从3个JEV结构蛋白表达盒表达出的JEV结构蛋白的蛋白质印迹分析。用每种JEV结构蛋白表达载体RNA模拟转染或转染BHK-21细胞，48小时后获得裂解物。将等量的细胞裂解物溶解到SDS-PAGE上，用JEV-特异性的超免疫血清检测。标示在右边的是病毒蛋白E和NS1的位置，在左边的是分子量标记(按kDa)。(C)该示意图显示了如何通过下述方法生成JEV VRP：(i)共转染JEV结构蛋白表达载体RNA和JEV病毒复制子RNA，或(ii)用JEV病毒复制子RNA转染能表达JEV结构蛋白的PCL。(D-E)JEV VRP的生产。使用了两个方案。一个方案包括用2种载体RNA，即(D)所示的JEV结构蛋白表达载体RNA和JEV病毒复制子载体RNA共转染原初BHK-21细胞。另一个方案包括用(E)所示的JEV病毒复制子载体RNA转染的JEVPCL。使用的JEV病毒复制子RNA如下：□绿色，JEV/Rep/ΔC+ΔprM+ΔE/EGFP；■绿色，JEV/Rep/NS1/EGFP；□蓝色，JEV/Rep/ΔC+ΔprM+ΔE/LacZ；■蓝色，JEV/Rep/NS1/LacZ；□黑色，JEV/Rep/ΔC+ΔprM+ΔE/LUC；■黑色，JEV/Rep/NS1/LUC。转染后48小时收集上清液，并用来感染原初BHK-21细胞来滴定VRP和检测各报道基因表达。-标示了原初细胞的背景荧光水平。
实施例
下面的实施例解释了本发明的可行的和目前优选的实施方案。
但是，本领域的技术人员能够明白，参考公开的内容，可以在本发明的精神和范围内进行修改和改进。
实施例1：JEV病毒的分离
<1-1>细胞系和病毒
BHK-21细胞系由Rockefeller大学的Charles M.Rice博士提供，并维持在α-极限必需培养基(MEM)中，该培养基中添加了10％胎牛血清(FBS)、2mM L-谷氨酰胺、维生素和抗生素。在细胞培养中使用的所有试剂均购自Gibco/BRL Life Technologies，Inc.，Gaithersburg，MD。韩国JEV株K87P39(Chung等，Am.J.Trop.Med.Hyg.，1996，55，91-97)是从韩国国家健康研究所(Korean National Institute of Health)得到。该JEV K87P39在1987年分离自韩国野生型蚊子，并在乳小鼠脑中经历了5代。YF17D黄热病毒株由感染性的cDNA pACNR/YF17D(Charles M.Rice博士提供)通过如下所述的SP6聚合酶失控转录生成。
<1-2>噬斑纯化
用MEM覆盖感染了JEV K87P39株的细胞，所述MEM含有10％胎牛血清和0.5％SeaKem LE琼脂糖(FMC BioProducts，Rockland，Maine)，并在5％CO2、37℃的培养箱中孵育3至4天。培养3至4天后，用3.7％甲醛在室温固定感染的细胞4小时。然后，除去覆盖细胞的琼脂糖。通过结晶紫染色使噬斑可视化。结果，K87P39株形成了病毒噬斑大小的异源混合物(图1A，K87P39-感染的)。
随后，本发明的发明人用BHK-21细胞进行了噬斑纯化试验，以分离同源群体的形成大噬斑的变体，本发明的发明人命名为CNU/LP2。用MEM覆盖感染了JEV K87P39株的BHK-21细胞，所述MEM含有10％胎牛血清和0.5％ SeaKem LE琼脂糖，并在5％ CO2、37℃的培养箱中孵育3至4天。用无菌的巴氏滴管挑取单独的噬斑，重新悬浮到1ml MEM中。在4℃从琼脂糖洗脱病毒2小时。将洗脱液在BHK-21细胞中仅扩增一次，并在-80℃储存。
进行噬斑试验，对比用JEV K87P39和JEV CNU/LP2株感染的易感BHK-21细胞的病毒噬斑大小。结果，用K87P39感染的易感BHK-21细胞的病毒噬斑大小发生了变化(图1A，K87P39-感染的)。另一方面，在本发明中纯化的CNU/LP2形成了同源群体的大噬斑(图1A，CNU/LP2-感染的)。另外，当用JEV K87P39和JEV CNU/LP2株感染Vero细胞时，还观察到了类似的噬斑形态学(图1B)。
<1-3>免疫荧光
为了通过共焦显微镜检查感染的BHK-21细胞中的JEV表达，将细胞(2×105)接种到4孔分室载玻片中，孵育12小时，然后用MOI为1的原始的JEV K87P39株、JEV CNU/LP2分离物或YF17D株模拟感染或感染18小时。在含有0.37％(v/v)甲醛的磷酸盐缓冲盐水(PBS)中在25℃孵育30分钟，第一次固定细胞，完成JEV病毒蛋白的免疫染色。然后用PBS洗涤细胞3次，用含有0.2％(v/v)Triton X-100的PBS在37℃透化处理10分钟。此后，用PBS洗涤细胞4次，在PBS中再水化15分钟，用含有5％(w/v)牛血清白蛋白(BSA)的PBS在37℃封闭1小时。然后用对JEV特异性的1∶500-稀释的小鼠超免疫腹水液在25℃孵育细胞2小时，用PBS洗涤3次，用1∶500-稀释的FITC-缀合的山羊抗-小鼠IgG(JacksonImmunoResearch Labs Inc.)在25℃孵育2小时，再用PBS洗涤3次。此后，将细胞在含有5μg/ml碘化丙锭和5μg/ml RNase A的PBS中在37℃孵育30分钟，以定位核，并用0.2ml 80％甘油封固。在Zeiss Axioskop共焦显微镜成像，其装配有带有Bio-Rad MRC 1024的63X物镜和LaserSharp软件。
用抗-JEV的超免疫腹水进行的共焦显微镜检查表明，感染了CNU/LP2的BHK-21细胞在核膜周围表达JEV病毒蛋白(图1C，CNU/LP2-感染的)，这类似于K87P39-感染的细胞(图1C，K87P39-感染的)。在模拟感染的BHK-21细胞中没有观察到这样的荧光染色(图1C，模拟感染的)。作为阴性对照，用黄热病毒17D(与JEV密切相关的黄病毒)感染的BHK-21细胞没有染上抗-JEV的超免疫腹水(图1C，YF17D-感染的)。多种动物细胞系(包括神经元的SHSY-5Y(人)和B103(小鼠)细胞系和无神经元的Vero(猴子)和MDCK(狗)细胞系)的CNU/LP2感染在培养上清液中产生了高病毒滴度(106-107PFU/ml)。因而，本发明的发明人决定使用CNU/LP2作为亲代株来开发用于JEV的反向遗传系统。
实施例2：JEV CNU/LP2基因组RNA的完整核苷酸序列分析
根据生产商(Gibco/BRL)的推荐，使用300μl TRIzol LS试剂从100μl含有病毒的培养液中提取病毒的基因组RNA，然后重新悬浮到20μl无RNase的水中。为了分析病毒基因组RNA的完整核苷酸序列，通过长RT-PCR扩增了代表整个病毒RNA基因组的5个重叠的cDNA(JVF，JVM，JVR，JV3NTR和JV35NTR)(图2)。根据可以从GenBank数据库得到的全部16个完整测序的JEVRNA基因组(CH2195LA、CH2195SA、FU、GP78、HVI、JaGAr01、JaOArS982、K94P05、Vellore P20778、p3、SA(A)、SA(V)、SA14、SA14-14-2、TC和TL株)的共有序列设计了用于cDNA合成和扩增的寡核苷酸。
<2-1>JEV CNU/LP2基因组RNA的核苷酸序列分析
对于JVF扩增子(nt 1-3865)，将引物J7(由SEQ.ID.No 1标示，且与JEV基因组的nt 3986-4003互补)用于cDNA合成(图2A)。用于PCR扩增的引物是SEQ.ID.No 2所代表的且与nt 1-18互补的引物J8、由SEQ.ID.No 3所代表的且与nt 3845-3865互补的引物J6。对于JVM扩增子(nt3266-8170)，将引物J4(由SEQ.ID.No 4标示，且与JEV基因组的nt8150-8170互补)用于cDNA合成。用于PCR扩增的引物是SEQ.ID.No 5所代表的且与nt 3266-3283互补的引物J20和引物J4。对于JVR扩增子(nt7565-10893)，将引物J1(由SEQ.ID.No 6标示，且与JEV基因组的nt10947-10967互补)用于cDNA合成。用于PCR扩增的引物是SEQ.ID.No7所代表的且与nt 7565-7582互补的引物J12、由SEQ.ID.No 8所代表的且与nt 10870-10893互补的引物J2。在20μl反应混合物中进行标准的RT反应，所述反应混合物含有10μl提取的病毒RNA、5pmol合适的引物、100U上标II逆转录酶(Gibco/BRL)、40U RNaseOUT(Gibco/BRL)、0.1mM二硫苏糖醇(DTT)、10mM三磷酸脱氧核苷酸(dNTP)混合物和由生产商(Gibco/BRL)提供的RT缓冲液。将反应混合物在37℃孵育1小时，然后在70℃加热15分钟。随后用RT混合物的5μl等份试样进行PCR扩增，使用Pyrobest DNA聚合酶(Takara Bio Inc.，Shiga，Japan)和合适的引物对。PCR进行30个循环，其中在94℃变性30秒、在60℃退火30秒并在72℃延伸5分钟，最后在72℃延伸10分钟。为了避免由于克隆导致的选择偏差，用自动化的3700DNA测序仪对扩增产物的未克隆物在两个方向直接测序。对2种独立分离的病毒RNA制品的测序分析产生了等同的序列。
结果，检测了除3’-和5’-末端区域以外的JEV CNU/LP2整个病毒基因组的完整核苷酸序列，并由SEQ.ID.No 9表示。
<2-2>检测JEV CNU/LP2基因组RNA的3’-末端序列
为了对JEV CNU/LP2基因组RNA的3’-末端序列进行测序，将SEQ.ID.No 10所示的合成的寡核苷酸T连接到病毒基因组RNA的3’端，以提供用于cDNA合成和PCR扩增的引物结合位点(Kolykhalov等，J.Virol.，1996，70，3363-3371)。首先通过用末端脱氧核苷酸转移酶(Takara)(它会阻断寡核苷酸T的分子内和分子间连接)整合ddATP修饰寡核苷酸T的3’端。寡核苷酸T的5’端还用T4多核苷酸激酶(Takara)磷酸化。此后，通过T4RNA连接酶(New England Biolabs，Inc.，Beverly，MA)将修饰的寡核苷酸T连接到病毒基因组RNA的3’端。20μl连接反应混合物含有10UT4 RNA连接酶、40U RNaseOUT、10pmol寡核苷酸T、病毒基因组RNA和由生产商(NEB)提供的缓冲液。在16℃孵育12小时后，用苯酚提取连接的病毒RNA，用乙醇沉淀，用20μl无RNase的水重新悬浮。随后，将10μl寡核苷酸-连接的病毒RNA和SEQ.ID.No11代表的寡核苷酸TR(如前所述，它与寡核苷酸T互补)用于cDNA合成。用SEQ.ID.No 12表示的且与nt 10259-10276互补的引物J35和引物TR扩增第一链cDNA。为了PCR，用Pyrobest DNA聚合酶和30个循环(94℃30秒、60℃30秒、和72℃1分钟)并最后在72℃延伸10分钟来扩增5μl等份试样的RT反应混合物。PCR混合物如上所述。使用分别整合进正义引物和反义引物中的Hind III和EcoR I位点，将命名为JV3NTR的cDNA扩增子克隆进pRS2载体(由Charles M.Rice博士提供)(图2B)。
琼脂糖凝胶电泳的结果表明，扩增产物迁移成2条带，较大的带约700bp，较小的带约450bp(图2C)。纯化和克隆两条带，分别对20个和10个随机挑取的含有较大带和较小带的克隆进行测序。如已经记载的大多数完全测序的JEV分离物，本发明的发明人发现所有的含有较大插入物(约700bp)的克隆的病毒基因组末端都是-GATCT10968。相反地，所有的含有较小插入物(约450bp)的克隆的病毒基因组在nt 10684处被截断，产生的带短了284bp。在装配全长JEV cDNA的过程中，本发明的发明人使用了较大插入物的核苷酸序列，因为较小的插入物在病毒基因组的3’端缺少284个核苷酸。
<2-3>检测JEV CNU/LP2基因组RNA的5’-末端序列
通过病毒RNA的自连接检测JEV CNU/LP2基因组RNA的5’-末端序列(Campbell和Pletnev，Virology，2000，269，225-237)。首先用烟酸焦磷酸酶(TAP)切除病毒基因组RNA的帽结构。剪切反应混合物(20μl)含有10U TAP(Epicentre Technology Co.，Madison，WI)、10μl病毒RNA和生产商(Epicentre Technology Co.)提供的缓冲液。在37℃孵育1小时后，用苯酚提取TAP-处理的病毒RNA，用乙醇沉淀，用20μl无RNase的水重新悬浮。如上所述，用T4RNA连接酶使一半(10μl)去帽的病毒RNA在20μl反应混合物中自连接。将四分之一(5μl)自连接的病毒RNA和SEQ.ID.No 13表示的且与nt 215-232互补的引物J40一起用于cDNA合成。用SEQ.ID.No 14表示的且与nt 164-181互补的引物J39和引物J35进行PCR扩增第一链cDNA(图2D)。琼脂糖凝胶电泳表明，作为单一带的扩增产物是约850bp(图2E)。用Apo I和Spe I酶切扩增的cDNA扩增子(JV35NTR)，并连接进已经用Apo I和Xba I酶切的pRS2载体，生成构建体pRS2/JV3′5′。
为了对JEV CNU/LP2基因组RNA的5’-末端序列测序，对12个随机挑取的克隆进行了测序。在所有的12个克隆中，本发明的发明人发现，病毒3’-末端序列的-GATCT10968后面跟着5’-末端序列1AGAAGT-(图2B和2C)。通过对未克隆物进行直接循环测序，也得到了相同的结果。因而，本发明的发明人已经检测了CNU/LP2分离物的完整核苷酸序列，并确定其序列如SEQ.ID.No 15所示。
实施例3：构建用于JEV的全长感染性的cDNA
在我们初始尝试克隆CNU/LP2RNA基因组的cDNA时，发现病毒基因组的特定区域与在大肠杆菌中克隆高拷贝数的质粒不相容，因为克隆的DNA要经历遗传重排。这些困难在其它黄病毒中也已经有报道(Campbell和Pletnev，Virology，2000，269，225-237；Polo等，J.Virol，1997，71，5366-5374；Gritsun和Gould，Virology，1995，214，611-618；Sumiyoshi等，J.Infect.Dis.，1995，171，1144-1151；Sumiyoshi等，J.Virol，1992，66，5425-5431；Rice等，New Biol.，1989，1，285-296)。由于遗传不稳定性和低DNA产率，将该区域克隆进低拷贝数的细菌质粒中的尝试也没有成功。因此，本发明的发明人使用细菌人工染色体(BAC)质粒pBeloBAC11作为载体来容纳JEV的全长感染性的cDNA。
<3-1>亚克隆3个长的重叠的JEV cDNA扩增子
本发明的发明人使用了根据标准方法的重组DNA技术(Sambrook等，Molecular cloning，1989，Cold Spring Harbor Laboratory)。首先，将3个起始用于完整核苷酸序列分析的重叠的cDNA扩增子(JVF，JVM和JVR)亚克隆进SEQ.ID.No 42表示的pBAC/SV(pBeloBAC11质粒的衍生物)中。pBAC/SV质粒含有pACNR/NADL的491bp的Not I-Aat II(T4 DNA聚合酶处理过的)片段(Mendez等，J.Virol.，1998，72，4737-4745)、pSINrep19的9,215bp的Sac I(T4 DNA polymeras处理过的)-Ssp I(T4DNA聚合酶处理过的)片段(Frolov等，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA.，1996，93，11371-11377)和pBeloBAC11的6,875bp的Sfi I(T4DNA聚合酶处理过的)-Not I片段。因而，JVF扩增子的3,863bp的Rsr II-Avr II片段、JVM扩增子的4,717bp的BspE I-Mlu I片段和JVR扩增子的3,326bp的Rsr II-Bgl II片段被插入到了pBAC/SV质粒(它已经用相同的酶酶切)中。这分别生成了pBAC/JVF、pBAC/JVM、pBAC/JVR亚克隆构建体。使这些BAC质粒在大肠杆菌DH10B细胞中生长，并测序。克隆的cDNA的核苷酸序列与CNU/LP2的相同，只是在pBAC/JVR的NS5基因中有点突变：T8906→C(沉默)。T8906→C的取代是翻译水平的沉默，并且一定是在克隆过程中产生的，因为对8个随机挑取的单个克隆进行的测序表明在nt 8906处有T残基。尽管T8906→C的取代没有改变对应的氨基酸，但是该变化可能会影响病毒复制(van Dinten等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1997，94，991-996)，因此，本发明的发明人将该取代修正回T残基。T8906→C取代是通过再克隆315bp的Apa I-Hind III片段(对应于nt 8827-9142)来修正的，生成构建体pBAC/JVRR。在它们的操作和在大肠杆菌菌株DH10B中繁殖的过程中，所有3个亚克隆的JEV cDNA保持遗传稳定。
<3-2>将SP6启动子插入全长JEV cDNA的5’端
为了有利于将噬菌体SP6启动子转录起点精确连接到全长JEV cDNA的5’端，本发明的发明人修饰了pBAC/JVF。首先，通过pBAC/SV的PCR(使用SEQ.ID.No 16表示的引物J41和SEQ.ID.No 17表示的引物J43，它整合了SP6启动子的反义序列)和pBAC/JVF的PCR(使用SEQ.ID.No18表示的引物J42和SEQ.ID.No 19表示的引物J40)分离了两个片段。通过第二轮的PCR(使用引物J41和J40)，将这2个片段融合。用Pac I和Pme I酶切得到的扩增子，连接到pBAC/JVF(它已经用相同的两种酶酶切)。这生成pBACSP6/JVF。
<3-3>构建全长的含有SP6启动子的JEV cDNA
为了在病毒基因组的3’端被线性化的质粒失控转录的过程中生成可靠的或近乎可靠的3’末端，本发明的发明人修饰了pBAC/JVRR，使可靠的3’末端的核苷酸序列后跟着独特的限制内切酶Xho I或Xba I的识别位点。为了创建在病毒基因组的末端含有独特的Xho I位点的pBAC/JVRR/XhoI亚克隆，用使用SEQ.ID.No 20表示的引物J90和SEQ.ID.No 21表示的引物J45(它整合有Xho I位点)的pRS2/JV3’5’的PCR扩增合成了片段I。用pBAC/JVRR(它已经用Sfi I和Nhe I酶切)连接片段I扩增子的298bp的Sfi I-Spe I部分。为了创建pBAC/JVRRx/XbaI(其在病毒基因组的末端具有Xba I位点)，首先通过PCR导入沉默点突变(A9134→T)，使NS5基因中的核苷酸9,131至9,136处的Xba I位点失活。在该构建体中，“x”表示存在破坏原始的Xba I位点的沉默点突变(A9134→T)。更具体地，用SEQ.ID.No 22表示的引物J31和用SEQ.ID.No 23表示的引物J47(其包含A9134→T的取代)扩增了pBAC/JVRR。将cDNA扩增子的315bp的Apa I-Hind III部分(与核苷酸8,828至9,143对应)克隆进pBAC/JVRR，生成构建体pBAC/JVRRx。随后，按照对于pBAC/JVRR/XhoI描述的相同方式，构建了pBAC/JVRRx/XbaI。通过pRS2/JV3’5’(使用引物J90和SEQ.ID.No 24表示的引物J46，其包含XbaI位点)的PCR扩增得到了片段II。然后将片段II扩增子的298bp的Sfi I-SpeI部分连接进pBAC/JVRRx(它已经用Sfi I和Nhe I酶切)。为了创建含有独特的Xho I位点和A9134→T取代的pBAC/JVRRx/XhoI，将片段I扩增子的298bp的Sfi I-Spe I部分连接进pBAC/JVRRx(它已经用Sfi I和Nhe I酶切)。
因而，本发明的发明人构建了5个质粒：pBACSP6/JVF、pBAC/JVM、pBAC/JVRR/XhoI、pBAC/JVRRx/XbaI和pBAC/JVRRx/XhoI。这些质粒含有JEV基因组的邻接区域，并且现在可以用于组装3个不同的全长JEVcDNA(图3)。首先，通过将pBAC/JVM的4,717bp的BspE I-Mlu I片段、pBACSP6/JVF的8,970bp的BspE I-Xba I片段和pBAC/SV的3,670bp的XbaI-Mlu I片段连接到一起，构建了pBACSP6/JVFM亚克隆。随后，将pBACSP6/JVFM的2个片段(8,142bp的Pac I-Sap I片段和4,801bp的PacI-BsrG I片段)与i)pBAC/JVRR/XhoI的5,620bp的Sap I-BsrG I片段相连生成pBACSP6/JVFL/XhoI，与ii)pBAC/JVRRx/XbaI的5,662bp Sap I-BsrGI片段相连生成pBACSP6/JVFLx/XbaI，或与iii)pBAC/JVRRx/XhoI的5,620bp的Sap I-BsrG I片段相连生成pBACSP6/JVFLx/XhoI。最后，将3个组装的全长JEV cDNA命名为pBACSP6/JVFL/XhoI、pBACSP6/JVFLx/XhoI和pBACSP6/JVFLx/XbaI，并且分别由SEQ.ID.No 43、No 44和No 45表示(图3B)。这些cDNA克隆都在病毒基因组的起始处具有SP6启动子转录起点，所以使用SP6RNA聚合酶进行体外转录能生成具有可靠的5’端的合成的RNA转录物(图3B，灰框)。为了确保失控转录后的病毒基因组的3’端是近乎可靠的，本发明的发明人在病毒基因组的末端设置了一个独特的限制内切酶Xho I或Xba I的识别位点(图3B，标有下划线的)。因而，pBACSP6/JVFL/XhoI携带有位于病毒基因组末端的Xho I位点。对于含有Xba I位点(紧挨病毒基因组末端)的构建体，由于该病毒基因组在NS5基因中已经含有Xba I位点，该位点必须通过导入沉默点突变(A9134→T)来破坏掉。该构建体命名为pBACSP6/JVFLx/XbaI，其中“x”表示存在能破坏原始的Xba I位点的沉默点突变。第三个克隆pBACSP6/JVFLx/XhoI含有在病毒基因组末端的Xho I位点和A9134→T的取代。
本发明的发明人于2002年10月2日将pBACSP6/JVFLx/XbaI保藏在韩国生物科学和生物技术研究所(Korea Research Institute of Bioscienceand Biotechnology)(KRIBB)的基因库中(保藏号：KCTC 10347BP)。
<3-4>构建含有T7启动子的全长JEV cDNA
除了SP6-驱动的JEV cDNA以外，本发明的发明人还以与实施例<3-3>类似的方式构建了一组3个T7-驱动的全长JEV cDNA。首先，用SEQ.ID.No 25表示的引物J81和SEQ.ID.No 26表示的引物J80进行PCR，合成了来自pBAC/NADLcIn-/PAC(由Charles M.Rice博士提供)的片段。还用SEQ.ID.No 27表示的引物J42和SEQ.ID.No 28表示的引物J82合成了来自pBACSP6/JVFLx/XbaI的片段。通过用引物J81和J82的第二轮的PCR，使这2个片段融合。将得到的扩增子的793bp的EcoR I-SpeI片段插入用EcoR I和Xba I酶切过的pRS2载体，生成构建体pRS2T7/5’JV。将pRS2T7/5’JV的675bp的Pvu I-Pme I片段，与i)pBACSP6/JVFL/XhoI的18,364bp的Pac I-Pme I片段相连接，生成pBACT7/JVFL/XhoI，与ii)pBACSP6/JVFLx/XhoI的18,364bp的Pac I-Pme I片段相连接，生成pBACT7/JVFLx/XhoI，或与iii)pBACSP6/JVFLx/XbaI的18,366bp的Pac I-Pme I片段相连接，生成pBACT7/JVFLx/XbaI。最后，将3个组装的全长JEV cDNA命名为pBACT7/JVFL/XhoI、pBACT7/JVFLx/XhoI和pBACT7/JVFLx/XbaI，并分别由SEQ.ID.No 46、No 47和No 48表示(图3C)。在组装过程中的每一个步骤，通过广泛的限制和核苷酸序列分析判断克隆的cDNA的结构完整性。没有观察到导致缺失或重排的结构不稳定性。
本发明的发明人于2002年10月2日将pBACT7/JVFLx/XbaI保藏在韩国生物科学和生物技术研究所(Korea Research Institute ofBioscience andBiotechnology)(KRIBB)的基因库中(保藏号：KCTC 10346BP)。
实施例4：转录和转染
本发明的发明人通过体外转录合成了RNA转录物。更具体地，将100至200ng模板DNA(用Xho I或Xba I酶切线性化，并且在有些情况下用MBN修饰过)加入到25-μl由下述组分组成的反应混合物中：生产商提供的缓冲液(Gibco/BRL)+0.6mM帽类似物[m7G(5′)ppp(5′)A或m7G(5′)ppp(5′)G，NEB Inc.]，0.5μM[3H]UTP(1.0mCi/ml，50Ci/mmol，NewEngland Nuclear Corp.，Boston，MA)，10mM DTT，1mM各UTP、GTP、CTP和ATP，40U RNaseOUT和15U SP6RNA聚合酶(Gibco/BRL)。将该反应混合物在37℃孵育1小时。通过RNA向DE-81(Whatman，Maidstone，UK)滤纸的吸附检测[3H]UTP的整合，在此基础上对RNA定量(Sambrook等，Molecular cloning，1989，Cold Spring Harbor Laboratory)。通过琼脂糖凝胶电泳检测反应混合物的1-至1.5-μl等份试样，并在使用前将等份试样储存在-80℃。
为了进行RNA转染，使用型号为ECM 830的电穿孔仪(BTX Inc.，SanDiego，CA)，按照生产商的说明，用合成的RNA对细胞进行电穿孔。简要而言，用胰蛋白酶处理分汇合的细胞，用冰冷却的无RNase的PBS洗涤3次，以2×l07细胞/ml的密度重新悬浮到PBS中。将悬浮液的400-μl等份试样与2μg合成的RNA相混合，立即在预先确定为最佳的条件(980V，99-μs脉冲长度，和5个脉冲)下进行电穿孔细胞。然后将电穿孔后的混合物转移至10ml新鲜培养基。
用感染性中心试验定量合成的RNA的特异感染性。更具体地，为了失控转录，通过用Xho I或Xba I酶切，使JEV cDNA模板线性化。在存在m7G(5′)ppp(5′)A帽结构类似物的情况下，2个Xho I-线性化的质粒(pBACSP6/JVFL/XhoI和pBACSP6/JVFLx/XhoI)的SP6聚合酶失控转录生成了带帽的合成的RNA，在其3’端含有3个核苷酸(CGA)的与病毒无关的序列(图3B)。这是复制Xho I酶切剩下的5’突出物的结果(图3B)。类似地，在存在m7G(5′)ppp(5′)A帽结构类似物的情况下，Xba I-线性化的pBACSP6/JVFLx/XbaI质粒的SP6聚合酶失控转录生成了带帽的合成的RNA，在其3’端含有4个核苷酸(CTAG)的与病毒无关的序列(图3B)。将电穿孔的细胞系列稀释10倍，在6-孔平板涂布未转染的细胞的单层(5×105)。让细胞向平板吸附6小时，然后如上所述用含有0.5％SeaKem LE琼脂糖的MEM覆盖它们。将平板在37℃、5％CO2下孵育3至4天，通过结晶紫染色使感染性的噬斑中心可视化。
当易感的BHK-21细胞受到来自这些构建体的合成的RNA的转染时，都是高度感染性的(表3)。也就是说，在最佳电穿孔条件转染的来自pBACSP6/JVFL/XhoI，pBACSP6/JVFLx/XhoI和pBACSP6/JVFLx/XbaI的合成的RNA分别具有3.5×105、4.3×105和3.4×105PFU/μg的特异感染性(表3，感染性)。还从来自T7-驱动的cDNA构建体转录的合成的RNA(通过T7聚合酶失控转录)得到了类似的结果(表3，感染性)。
表3从全长JEV cDNA生成的体外RNA转录物的特异感染性和病毒滴度
a：所有的全长JEV cDNA都用用于失控转录的合适的限制内切酶(如在cDNA的名字中标示的)线性化。关于pBACSP6/JVFLx/XbaIMBN和pBACT7/JVFLx/XbaIMBN，这些cDNA模板是通过Xba I酶切线性化、然后用MBN处理来制备的。
b：用SP6或T7RNA聚合酶体外转录后，如标示的，将样品用于电穿孔BHK-21细胞，并检测感染性的噬斑中心。
c：在电穿孔后24和48小时时的病毒滴度。
<4-1>构建在其3’端缺失与病毒无关的序列的JEV RNA转录物
已经报道，对于一些黄病毒，存在于从感染性的cDNA转录的合成RNA的3’端的无关序列会减少或消除它们的特异感染性(Yamshchikov等，Virology，2001，281，294-304)。基于该报道，本发明的发明人生成了在它们的3’端缺少与病毒无关的序列的合成RNA，并对比了它们的特异感染性。更具体地，通过在转录反应之前用MBN处理Xba I-线性化的pBACsp6/JVFLx/XbaI质粒除去4个多余的核苷酸CTAG，本发明的发明人生成了缺少与病毒无关的序列的合成JEV RNA。与未处理的转录物相比，来自Xba I-线性化的和MBN-处理过的pBACSP6/JVFLx/XbaI和pBACT7/JVFLx/XbaI(pBACSP6/JVFLx/XbaIMBN，图3B；和pBACT7/JVFLx/XbaIMBN，图3C)的RNA转录物都具有增强的特异感染性。更精确地，估计从pBACSP6/JVFLx/XbaIMBN转录出的RNA的特异感染性为3.1×106PFU/μg，约是未修饰模板的特异感染性(3.4×105PFU/μg)的10倍(表3，感染性)。源自pBACT7/JVFLx/XbaI的RNA在MBN修饰后也具有增强的特异感染性(2.7×106PFU/μg)(表3，感染性)。因此，本发明的发明人证实了，应当存在JEV基因组的可靠的3’端，以确保生成高度感染性的合成的JEV RNA转录物。
另外，由于在3’端存在3或4个与病毒无关的核苷酸，改变的RNA转录物的特异感染性还会影响从转染的BHK-21细胞的培养上清液中收获的病毒滴度。从未用MBN处理过的pBACSP6/JVFL/XhoI、pBACSP6/JVFLx/XhoI和pBACSP6/JVFLx/XbaI得到RNA转录物转染的BHK-21细胞释放出的病毒滴度的范围在转染后24小时为2.1×105至4.4×105PFU/ml(表3，病毒滴度24小时)，这时仍有半数转染的细胞吸附在培养皿上，证实了病毒诱导的强烈的细胞病理效应。在转染后48小时，这些滴度升高了约10倍，达到3.2×106至5.2×106PFU/ml(表3，病毒滴度48小时)，这时大多数细胞已经死亡，并且从培养皿底部脱落。相反地，从用来自MBN-处理过的pBACSP6/JVFLx/XbaIMBN的RNA转录物转染BHK-21细胞释放的病毒滴度在转染后24小时已经达到了6.2×106PFU/ml，这时大多数转染的细胞已经死亡，(表3，病毒滴度24小时)。在转染后48小时，该滴度略微下降，达到1.4×106PFU/ml(表3，病毒滴度48小时)。用T7聚合酶驱动的RNA转录物观察到了类似的病毒生成情况(表3)。
实施例5：确认合成的RNA转录物的特异感染性
本发明的发明人确认了，特异性的感染性需要来自全长JEV cDNA模板的RNA的转录，它使用全长cDNA克隆pBACSP6/JVFLx/XbaIMBN(图4)。单独的cDNA模板不是感染性的(图4A，泳道5和B，无SP6Pol)，但是在转录反应的过程中需要完整的cDNA模板，因为Dnase I处理会消除感染性(图4A，泳道2和B，DNaseI处理过程中)。转录反应后的添加DNaseI相对于完整的反应混合物(图4A，泳道1和B，未处理)没有作用(图4A，泳道3和B，DNaseI处理后)，但是RNaseA处理消除转录的合成RNA的感染性(图4A，泳道4和B，RNaseA处理后)。
实施例6：从全长的感染性的cDNA回收的合成JEV和CNU/LP2亲代病毒
之间的对比
本发明的发明人对比了从全长感染性的cDNA(pBACSP6/JVFL/XhoI、pBACSP6/JVFLx/XhoI、pBACSP6/JVFLx/XbaI和pBACSP6/JVFLx/XbaIMBN)回收的合成JEV和原始用于cDNA构建的亲代病毒CNU/LP2(噬斑形态学、生长动力学、蛋白表达、RNA生产等)。
<6-1>通过噬斑试验对比噬斑形态学
从全长感染性的cDNA(pBACSP6/JVFL/XhoI、pBACSP6/JVFLx/XhoI、pBACSP6/JVFLx/XbAI和pBACSP6/JVFLx/XbaIMBN)回收的合成JEV和亲代病毒CNU/LP2感染BHK-21细胞。用含有10％胎牛血清和0.5％SeaKemLE琼脂糖(FMC BioProducts，Rockland，Maine)的MEM覆盖细胞，在5％CO2、37℃的培养箱中孵育3至4天。培养3至4天后，用3.7％甲醛在室温固定感染的细胞4小时。然后，除去覆盖细胞的琼脂糖。通过结晶紫染色使噬斑可视化。如图5A所示，与感染了CNU/LP2(盘5)的细胞类似，感染了从pBACSP6/JVFL/XhoI(盘1)、pBACSP6/JVFLx/XhoI(盘2)、pBACSP6/JVFLx/XbaI(盘3)和pBACSP6/JVFLx/XbaIMBN(盘4)回收的合成的JEV的BHK-21细胞形成了同源大噬斑。
<6-2>生长动力学的对比
本发明的发明人用从全长的感染性的cDNA(pBACSP6/JVFL/XhoI、pBACSP6/JVFLx/XhoI、pBACSP6/JVFLx/XbaI和pBACSP6/JVFLx/XbaIMBN)回收的合成JEV和亲代病毒CNU/LP2感染了BHK-21细胞。用低(0.01PFU/细胞)、中(1.0PFU/细胞)和高(10PFU/细胞)MOI感染BHK-21细胞，此后周期地收集细胞培养液，用于检测感染性病毒随时间释放的动力学。更具体地，在指定的时间点收集病毒，通过噬斑试验检测滴度。如图5B所示，MOI-依赖性的病毒滴度随时间的积累类似于4种回收的病毒(pBACSP6/JVFL/XhoI、pBACSP6/JVFLx/XhoI、pBACSP6/JVFLx/XbaI和pBACSP6/JVFLx/XbaIMBN)和亲代病毒CNU/LP2。
<6-3>通过蛋白质印迹分析对比病毒蛋白水平
本发明的发明人对比了在感染了从全长的感染性的cDNA(pBACSP6/JVFL/XhoI、pBACSP6/JVFLx/XhoI、pBACSP6/JVFLx/XbaI和pBACSP6/JVFLx/XbaIMBN)回收的合成JEV的BHK-21细胞中表达的病毒蛋白和在感染了亲代病毒CNU/LP2的BHK-21细胞中的表达的病毒蛋白。更具体地，用200μl样品装载缓冲液[80mM Tri-HCl(pH 6.8)，2.0％SDS，10％甘油，0.1M DTT，0.2％溴苯酚蓝]裂解BHK-21细胞(3×105)，将十分之一裂解液沸腾5分钟，在SDS-聚丙烯酰胺凝胶上分级。用Trans-Blot SD电泳转细胞仪(Bio-Rad Laboratories Inc.，Hercules，CA)，将蛋白电泳地转移到甲醇活化的聚偏氟乙烯膜上，在室温下，用5％脱脂奶粉的洗涤液(0.2％Tween 20的PBS溶液)封闭膜1小时。用洗涤液洗涤3次后，在室温下，将膜与单克隆抗-肌动蛋白抗体(A4700，Sigma，St.Louis，MO)(它能识别在所有肌动蛋白异构体的C末端保守的表位)或对JEV特异性的小鼠超免疫腹水液(ATCC VR-1259AF，American Type Culture Collection)一起孵育2小时。然后用洗涤液洗涤膜3次，在室温下，与碱性磷酸酶(AP)-缀合的山羊抗-小鼠免疫球蛋白G(Jackson ImmunoResearch Labs Inc.，West Grove，PA)一起孵育2小时。将膜用洗涤液洗涤3次，用PBS洗涤1次。通过与底物5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸和氮蓝四唑一起孵育，使肌动蛋白和JEV蛋白带可视化。结果表明，合成的JEV和亲代病毒生成了类似量的和相同带型的病毒-特异性的蛋白(图5C，上区块)。检测作为内部样品装载对照的肌动蛋白，发现在模拟感染的和感染的细胞中存在等同水平的肌动蛋白(图5C，下区块)。
<6-4>通过RNA印迹分析对比病毒RNA水平
本发明的发明人对比了在感染了从全长的感染性的cDNA(pBACSP6/JVFL/XhoI、pBACSP6/JVFLx/XhoI、pBACSP6/JVFLx/XbaI和pBACSP6/JVFLx/XbaIMBN)回收的合成JEV的BHK-21细胞中表达的病毒RNA和在感染了亲代病毒CNU/LP2的BHK-21细胞中表达的病毒RNA。更具体地，用1ml TRIzol试剂(Gibco/BRL)，从感染的BHK-21细胞(3×105)中提取总RNA。通过RNA印迹分析，对三分之一RNA分析JEV-特异性的RNA(Sambrook等，Molecular cloning，1989，Cold Spring HarborLaboratory)。将RNA在变性2.2M甲醛-1％琼脂糖凝胶上电泳，并转移到尼龙膜(Amersham Biosciences Inc.，Piscataway，NJ)上。通过用254-nm光源(Stratalinker UV cross-linker，Stratagene，La Jolla，CA)辐照，使膜上的RNA交联，通过与[32P]CTP-标记的反义核探针(它能结合JEV基因组的核苷酸9,143至9,351)杂交，检测JEV-特异性的RNA。已经通过从BamHI-线性化的cDNA克隆pGEM3Zf(+)/JV9143(它通过将pBACSP6/JVFLx/XbaI的209bp的Hind III-Sac I片段与用相同酶酶切的pGEM3Zf(+)相连来构建)体外地转录合成了该探针。根据生产商的说明，使用T7-MEGAscript试剂盒(Ambion，Austin，TX)，使用20-μl含有3.12μM[α-32P]CTP(800Ci/mmol，Amersham)的反应混合物转录了该克隆。用DNaseI处理后，将反应混合物在Quick Spin G-50Sephadex柱(BoehringerMannheim)中离心，除去未整合的核糖核苷三磷酸。在55℃，将膜在杂交溶液[5×SSPE(0.9M NaCl，50mM NaH2PO4和5mM EDTA pH 7.7)，5×Denhardt氏试剂，0.5％SDS，100μg/ml变性的鲑鱼精子DNA，50％甲酰胺]中预杂交6小时，然后在含有107cpm标记的核探针的杂交溶液中在55℃孵育过夜。用1×SSPE-0.5％SDS在55℃洗涤膜3次10分钟，用0.1×SSPE-0.5％SDS洗涤1次10分钟。通过放射自显影法使病毒RNA带可视化，并用分子成像机(Bio-Rad Lab)定量。结果，病毒RNA的水平都是类似的(图5D)。通过图像分析对这些印迹进行定量，发现病毒基因组RNA(图5D，上区块)与18S rRNA(图5D，下区块)的比例没有显著变化，表明所有病毒基因组RNA都以类似水平生成。
因而，在噬斑形态学、致细胞病性、生长动力学、蛋白表达和RNA生成方面，从全长的感染性的cDNA(pBACSP6/JVFL/XhoI、pBACSP6/JVFLx/XhoI、pBACSP6/JVFLx/XbaI和pBACSP6/JVFLx/XbaIMBN)回收的所有合成病毒与亲代病毒CNU/LP2没有差别。而且，分析3’端序列后，在源自任何合成病毒的病毒RNA基因组的3’端没有发现多余的3个(CGA)或4个(CTAG)核苷酸的与病毒无关的序列。这些结果验证了本发明开发的感染性的JEV cDNA克隆在将来的分子遗传学中的应用。
实施例7：检查转染的培养物被亲代病毒污染的可能性
尽管上面的结果已经有力地证明了JEV cDNA克隆能在SP6或T7聚合酶转录后生成高感染性的RNA转录物，仍未正式排出转染的培养物受到亲代病毒CNU/LP2污染的可能性。为了评价这种极小的可能性，本发明的发明人使用了基于PCR的定点诱变，以将一个遗传标记(gm)导入pBACSP6/JVFLx/XbaI构建体。更具体地，通过基于PCR的定点诱变，将点突变A8171→C(沉默)置于pBACSP6/JVFLx/XbaI中的NS5基因内，以生成pBACSP6/JVFLx/gm/XbaI(图6A)。点突变的结果是得到了独特的XhoI限制内切酶识别位点。首先通过使用SEQ.ID.No 29表示的引物J48(其中Xho I通过A8171→C取代来创建)和SEQ.ID.No 30表示的引物J3的PCR生成了来自pBACSP6/JVFLx/XbaI的片段。然后将得到的扩增子的665bp的Mlu I-Apa I片段连接到4,802bp的Apa I-BsrG I和pBACSP6/JVFLx/XbaI的5,874bp的BsrG I-Mlu I片段，生成pBACSP6/JVFLx/gm/XbaI构建体。感染了来自Xba I-线性化的MBN-处理过的pBACSP6/JVFLx/gm/XbaIMBN的RNA转录物的BHK-21细胞会生成含有遗传标记的感染性病毒(指示为JVFLx/gm/XbaIMBN)(图6A)。JVFLx/gm/XbaIMBN的表型特征与起始病毒JVFLx/XbaIMBN的没有差别，表明A8171→C的取代没有影响病毒复制。
为了证实已经从pBACSP6/JVFLx/gm/XbaIMBN的cDNA模板回收了JVFLx/gm/XbaIMBN病毒，本发明的发明人将回收的病毒在BHK-21细胞中进行了连续传代(MOI＝0.1)。将在每一代中得到的病毒与RNaseA和DNaseI一起孵育，防止带出导入的转录物RNA和模板质粒cDNA(Mendez等，J.Virol.，1998，72，4737-4745)。从第1代和第3代释放的JVFLx/gm/XbaIMBN和JVFLx/XbaIMBN病毒提取病毒RNA，用于RT-PCR，扩增包含A8171→C取代的2,580bp的产物(图6B，泳道1、3和5)。用Xho I酶切来自JVFLx/gm/XbaIMBN的扩增产物，生成2个1,506和1,074bp的片段(图6B，泳道2和4)。另一方面，来自JVFLx/XbaIMBN的RT-PCR产物未受到Xho I酶切(图6B，对比泳道5和泳道6)，表明在JVFLx/gm/XbaIMBN病毒中确实存在A8171→C的取代。因此，证实了回收的病毒JVFLx/gm/XbaIMBN源自全长的感染性的cDNApBACSP6/JVFLx/gm/XbaIMBN。
实施例8：全长的感染性的JEV cDNA的遗传稳定性
早期的研究已经证实，含有全长JEV cDNA的构建体经常在编码结构蛋白prM和E的区域发生稳定无意义的突变(Sumiyoshi等，J.Virol.，1992，66，5425-5431)。由于对JEV的分子遗传学的研究必不可少地需要使用可靠的感染性的JEV分子克隆用于操纵，本发明的发明人以几种方式调控pBACSP6/pJVFLx/XbaI，并广泛地研究了其遗传结构和功能完整性。
更具体地，如下分析了感染性的JEV cDNA的遗传结构和功能完整性。用pBACSP6/JVFLx/XbaI转化大肠杆菌菌株DH10B，使两个独立来源的克隆在37℃、在10ml 2×YT(含有12.5μg/ml氯霉素)中生长过夜。通过每天稀释106倍，将来自原代培养物的细胞维持9天(Almazan等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，2000，97，5516-5521)。在本发明的实验条件下，每传代细胞代表了约20代，它与以前进行的观察一致(Alamzan等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，2000，97，5516-5521)。第3、6和9代后，通过SDS-碱性方法大规模制备感染性的cDNA质粒，并进一步通过氯化铯密度梯度离心纯化(Sambrook等，Molecular cloning，1989，Cold Spring HarborLaboratory)。通过其限制内切酶图谱，监测质粒DNA的遗传结构。通过限制酶分析，检测从第0、3、6和9代的两种培养物中提取的质粒。第3、6和9代的限制酶图谱与第0代的图谱没有可视的差异。因而，在琼脂糖凝胶电泳分析的分辨率内，两种感染性的cDNA克隆在结构上看起来是稳定的。
通过检测从cDNA模板(它通过Xba I酶切线性化和MBN处理)转录出的合成的RNA的特异感染性，还研究了JEV cDNA质粒的功能完整性。结果，从两种cDNA克隆制备出的RNA转录物的感染性在第0代和第9代之间没有差异(图7)。上述结果证实了，在大肠杆菌中的系列生长中，感染性的JEV cDNA保持功能稳定性。
实施例9：感染性的JEV cDNA作为外源基因表达的载体
如已经记载的(Burke和Monath，Flaviviruses，2001，1043-1125，Lippincott Williams & Wilkins Publishers)，本发明的发明人发现，JEV能在广范围的源自许多种属(包括人、鼠、猴子、猪、狗、锚和仓鼠)的真核细胞中复制。这表明，JEV可以在多种不同细胞中用作表达外源基因的载体。为了证实这一点，将两种常用的报道基因(Aequeorea victoria GFP和Photinus pyralis LUC)插入到pBACSP6/JVFLx/XbaI的病毒3’NTR的起点，作为由EMCV的IRES元件驱动的表达盒(图8A)。
为了创建pBACSP6/JVFLx/GFP/XbaI构建体(图8A)，用SEQ.ID.No31表示的引物J72和SEQ.ID.No 32表示的引物J73进行PCR，扩增来自pBACSP6/JVFLx/XbaI的片段。还用SEQ.ID.No 33表示的引物J74和SEQ.ID.No 34表示的引物J75，从pRSGFP-C1扩增了一个片段。通过第二轮PCR(使用引物J72和J75)，将这两个片段融合。然后将得到的扩增子的913bp的Kpn I-Nsi I片连接到pBACSP6/JVFLx/XbaI的8,011bp的Nsi I-PacI和11,021bp的Pac I-Kpn I片段，生成pBACSP6/JVFLx/GFP/XbaI构建体。
为了生成pBACSP6/JVFLx/LUC/XbaI构建体(图8A)，用引物J72和SEQ.ID.No 35表示的引物J76扩增了pBACSP6/JVFLx/XbaI片段。还用SEQ.ID.No 36表示的引物J77和SEQ.ID.No 37表示的引物J78，从pACNR/NADLcIn-/LUC(由Charles M.Rice博士提供)扩增了一个片段。通过第二轮PCR(使用引物J72和J78)，将这两个片段融合。然后将得到的扩增子的1,801bp的Kpn I-Nsi I片段连接到pBACSP6/JVFLx/XbaI的8,011bp的Nsi I-Pac I和11,021bp的Pac I-KpnI片段，生成pBACSP6/JVFLx/LUC/XbaI。
为了生成在其NS3基因的中间含有83个核苷酸缺失(核苷酸5,581至5,663)(该缺失会在核苷酸5,596处造成病毒翻译的过早终止)的pBACSP6/JVFLx/LUCREP-/XbaI(图8A)，用SEQ.ID.No 38表示的引物J89和SEQ.ID.No 39表示的引物J91扩增了pBACSP6/JVFLx/LUC/XbaI片段。还用SEQ.ID.No 40表示的引物J92和SEQ.ID.No 41表示的引物J93，从pBACSP6/JVFLx/LUC/XbaI扩增了一个片段。通过第二轮PCR(使用引物J89和J93)，将这两个片段融合。然后将得到的扩增子的3,960bp的SfiI-Eag I片段连接到pBACSP6/JVFLx/LUC/XbaI的6,493bp的Eag I-Sfi I和10,297bp的Sfi I-Sfi I片段，生成pBACSP6/JVFLx/LUCREP-/XbaI。
在CNP/LP2的病毒3’NTR的起点和3种其它的完全测序的JEV株中存在9至25核苷酸的缺失(Williams等，J.Gen.Virol.，2000，81，2471-2480；Nam等，Am.J.Trop.Med.Hyg.，2001，65，388-392；Jan等，Am.J.Troop.Med.Hyg.，1996，55，603-609)，表明这是插入外源基因的较好位点。因此，当BHK-21细胞转染了从pBACSP6/JVFLx/GFP/XbaI和pBACSP6/JVFLx/LUC/XbaI cDNA转录出的合成的RNA时，该插入不会改变合成的RNA转录物的特异感染性。
为了检测GFP表达，用从pBACSP6/JVFLx/GFP/XbaIMBN模板转录出的感染性的合成的RNA转染原初BHK-21细胞，并通过共焦显微镜检查。更具体地，用2μg JVFLx/GFP/XbaIMBN RNA模拟转染或转染BHK-21细胞。将转染的细胞(1×105)在4孔分室载玻片中孵育30小时。用PBS洗涤细胞2次，通过在25℃、在含有0.37％(v/v)甲醛的PBS中孵育30分钟予以固定，用0.2ml 80％甘油封固。通过共焦显微镜检查细胞，并分析。结果，表达GFP的BHK-21细胞在核和细胞质中都显示出绿荧光(图8B，JVFLx/GFP/XbaIMBN)，因为GFP足够小，能在核和细胞质之间扩散。如预期的，在模拟转染的细胞(图8B，模拟的)或用来自pBACSP6/JVFLx/XbaIMBN的RNA转录物转染的细胞中没有观察到该荧光。
为了以定量的方式监视LUC随时间的诱导，本发明的发明人不但生成了能复制的来自pBACSP6/JVFLx/LUC/XbaIMBN的RNA转录物、而且生成了不能复制的来自pBACSP6/JVFLx/LUCREP-/XbaIMBN的RNA转录物(图8A)。pBACSP6/JVFLx/LUCREP-/XbaIMBN模板在NS3基因的中间含有83个核苷酸的缺失(核苷酸5,581至核苷酸5,663)，它在核苷酸5,596处过早终止病毒翻译(见图8A中的*，pBACSP6/JVFLx/LUCREP-/XbaIMBN)。
关于LUC 试验，用2μg JVFLx/LUC/XbaIMBN RNA或JVFLx/LUCREP-/XbaIMBN RNA模拟转染或转染BHK-21细胞(8×106)。以6×105细胞/孔的浓度，将细胞接种到6孔平板中，培养。在给定的时间点，用无Ca2+和Mg2+的PBS溶液洗涤细胞，然后通过向每孔细胞加入0.2ml裂解缓冲液[25mM Tris-磷酸盐(pH 7.8)，2mM DTT，2mM 1，2-二氨基环己烷-N，N，N′，N′-四醋酸，10％甘油，1％Triton X-100(v/v)]进行裂解。将细胞裂解物在室温孵育10分钟，然后通过离心除去细胞碎片。迅速将上清液置于-80℃保藏，直至使用。为了检测LUC活性，将20μl细胞裂解物置于含有100μl LUC试验试剂[20mM Tricine，1.07mM(MgCO3)4Mg(OH)2·5H2O，2.67mM MgSO4，0.1mM EDTA，33.3mM DTT，270μM辅酶A，470μM荧光素(Promega)，530μM ATP]的发光计管中。通常检测活性10秒。每一个数据点代表了3个独立实验的结果。
结果，在用能复制的JVFLx/LUC/XbaIMBN RNA转染的BHK-21细胞中(图8C，●)，转染后6小时的原始LUC活性是2.4×103±0.2×103相对光单位(RLU)。转染后30小时，该活性急剧增加至5.3×104±0.1×104RLU，在转染后54小时，达到7.8×105±0.6×105RLU小时，这时超过50％的细胞是死亡的。相反地，用不能复制的JVFLx/LUCREP-/XbaIMBNRNA的转染的BHK-21细胞中，转染后6小时的原始LUC活性是1.9×103±0.4×103RLU(图8C，○)，这类似于JVFLx/LUC/XbaIMBN-转染的细胞(图8C，●)，但是该活性随着时间逐渐地降低，在转染后54小时降至16±1.2RLU，这是原初细胞的背景荧光水平(图8C，○)。因而，随时间表达的LUC活性的水平根据是否存在病毒复制而变化。
根据前文所述的方法，本发明的发明人生成了具有GFP和LUC基因的全长的感染性的重组JEV cDNA。用从重组JEV cDNA转录出的JEVRNA转录物转染BHK-21细胞，然后从培养上清液中回收含有GFP和LUC基因的重组JEV JVFLx/GFP/XbaIMBN和JVFLx/LUC/XbaIMBN。在用病毒感染了多种已经普遍用于生物和医学领域的动物细胞系(BHK-21，Vero，NIH/3T3，ST，HeLa，MDCK，CRFK，B103和SHSY-5Y)之后，研究了GFP和LUC基因在重组JEV中的表达。结果，插入到病毒基因组中的GFP或LUC基因在所有的检验细胞中都有表达(表4)。因而，证实了重组的JEVcDNA、JEV RNA转录物和重组的JEV病毒颗粒可以有效地用作在多种细胞类型中表达外源基因的载体。
表4在感染性的JEV cDNA中工程化的GFP和LUC基因的表达
| 细胞系 | GFP表达<sup>a</sup> | LUC诱导<sup>b</sup> |
| BHK-21 | 有表达 | 有表达 |
| Vero | 有表达 | 有表达 |
| HeLa | 有表达 | 有表达 |
| MDCK | 有表达 | 有表达 |
| CRFK | 有表达 | 有表达 |
| 细胞系 | GFP表达<sup>a</sup> | LUC诱导<sup>b</sup> |
| NIH/3T3 | 有表达 | 有表达 |
| ST | 有表达 | 有表达 |
| B103 | 有表达 | 有表达 |
| SHSY-5Y | 有表达 | 有表达 |
a：用重组JEV JVFLx/GFP/XbaIMBN感染细胞后，分析GFP蛋白的表达。
b：用重组JEV JVFLx/LUC/XbaIMBN感染细胞后，分析LUC蛋白的表达。
实施例10：感染件的JEV cDNA作为新型外源基因表达系统的应用。
本发明的发明人还研究了基于JEV的表达系统在表达目标外源基因中的应用。首先，本发明的发明人构建了全长病毒基因组，以表达3个常用的和不同大小的异源报道基因，即改进版的Aequorea victoria GFP基因(EGFP，768bp)、来自Photinus pyralis的LUC基因(1653bp)，和LacZ(3012bp)基因(图9B)。本发明的发明人还导入了显性选择标记PAC(600bp)，它会赋予对药物嘌呤霉素的抗性(图9B)。
<10-1>异源基因编码的感染性的重组JEV(它以作为BAC的双顺反子的全长的感染性的JEV cDNA为基础)的构建和表征。
<10-1-1>感染性的重组JEV载体的质粒构建
所有的质粒都通过标准的分子生物方法构建(Sambrook等，Molecularcloning：a laboratory manual，2nd ed.Cold Spring Harbor Laboratory，ColdSpring Harbor，N.Y.，1989)，并通过测序验证了PCR扩增的所有区域。本发明中使用的所有重组JEV载体都是在pBACSP6/JVFLx/XbaI(它在下文中称作pJEV/FL)的基础上构建(Yun等，J.Virol.，2003，77，6450-6465)(图9A)。
本发明的发明人构建了一组4个表达LUC、EGFP、LacZ和PAC基因的感染性的重组JEV载体。pJEV/FL/LUC与前面在实施例9中命名为pBACSP6/JVFLx/LUC/XbaI的构建体相同(图9B)。为了构建pJEV/FL/LacZ，首先将pJEV/FL/LUC的2,409bp的Kpn I-Avr II片段亚克隆进用Kpn I和Xba I酶切的pGEM3Zf(+)中，生成pGEM/LUC。将pSinRep3/LacZ(由Charles Rice博士惠赠)的3,177bp的Nco I-Stu I片段连接到pGEM/LUC的3,935bp的Nco I-Nsi I(T4DNA聚合酶处理过的)片段，生成pGEM/LacZ。将pGEM/LacZ的3,873bp的Kpn I-Not I片段连接到pJEV/FL/LUC的7,456bp的Not I-Pac I和11,021bp的Pac I-KpnI片段，生成pJEV/FL/LacZ(图9B)。为了有利于pJEV/FL/EGFP的构建，将pJEV/FL/LacZ的5,792bp的Sac II-Not I片段插入用相同酶处理的pRS2，生成pRS/LacZ。使用引物EGFPF(由SEQ.ID.No 49表示)和EGFPR(由SEQ.ID.No 50表示)进行pEGFP-C1的PCR扩增，生成了编码EGFP的序列片段。将EGFP片段扩增子的773bp的Nco I-Stu I部分连接到pRS/LacZ的3,241bp的EcoR V-SacII和2,062bp的Sac II-Nco I片段，生成pRS/EGFP。将pRS/EGFP的3,406bp的Sac II-Not I片段连接到pJEV/FL/LUC的7,456bp的Not I-Pac I和9,102bp的Pac I-Sac II片段，生成pJEV/FL/EGFP(图9B)。为了生成pJEV/FL/PAC，使用引物PACF(由SEQ.ID.No 51表示)和PACR(由SEQ.ID.No 52表示)PCR扩增pACNR/NADLcIns-/PAC(由Charles Rice博士惠赠)片段。将得到的扩增子的881bp的Dra III-Nsi I部分连接到pJEV/FL/LUC的8,011bp的Nsi I-Pac I、10,096bp的Pac I-Nde I和842bp的Nde I-Dra III片段，生成pJEV/FL/PAC(图9B)。将EMCV IRES驱动的表达盒插入到pJEV/FL的病毒3’NTR的起点(图9A和9B)。
<10-1-2>EGFP表达的试验
转染后36-48小时，将细胞接种到4孔分室载玻片中。孵育后，通过在含有0.37％(v/v)甲醛的PBS中孵育固定细胞，然后用0.2ml 80％甘油封固。在配备由合适滤镜的共焦显微镜下观察细胞。还通过流式细胞仪分析检测了EGFP的表达。更具体地，用胰蛋白酶处理细胞，用PBS洗涤一次，重新悬浮到在0.37％(v/v)甲醛的PBS溶液中，随后用FACScan流式细胞仪FACSCalibur(Becton Dickinson)分析。通过合适的前和侧光散射门排除死细胞。计数一万存活的细胞。
<10-1-3>β-半乳糖苷酶试验
用PBS洗涤细胞1次，用0.05％(v/v)戊二醛的PBS溶液在室温固定15分钟，用PBS小心地洗涤3次。通过在染色溶液[5mM铁氰化钾，5mM亚铁氰化钾，2mM MgCl2的PBS溶液]中与5-溴-4-氯-3-吲哚-β-吡喃半乳糖苷(Sigma)一起在37℃孵育，检测细胞的β-gal活性。
<10-1-4>荧光素酶试验
如前所述，通过使用底物荧光素(Promega)分析细胞的LUC活性(Yun等，J.Virol.，2003，77，6450-6465)。每个实验进行一式三份，取平均值。
<10-1-5>嘌呤霉素筛选
将细胞接种到6-孔平板中，在37℃培养6小时。为了检测PurR foci的形成，用在MEM(含有10％热灭活的FBS和青霉素/链霉素)中的0.5％SeaKem LE琼脂糖(FMC BioProducts，Rockland，Maine)覆盖细胞，在37℃孵育2天。此后，在有或没有嘌呤霉素(10μg/ml)存在的情况下将平板再孵育3天。筛选后，通过对甲醛固定的细胞进行结晶紫染色，使PurR foci可视化(Yun等，J.Virol.，2003，77，6450-6465)。对于PurR细胞培养物，细胞不覆盖琼脂糖，在完全培养基中在37℃培养2天。随后，在含有10μg/ml嘌呤霉素的完全培养基中培养细胞，筛选后24-48小时，通过结晶紫染色使存活的细胞可视化。
<10-1-6>在转染了/感染了重组合成的含有其它表达单元的JEVRNA/病毒的BHK-21细胞中表达异源蛋白
为了检测插入的表达盒是否会改变其特异性的感染性/复制，本发明的发明人检测了合成的RNA(它已经从4个携带有SP6-驱动的外源基因的感染性的JEV cDNA构建体转录出来)的特异性的体外感染性(表5)。通过Xba I酶切使纯化的pJEV/FL和其衍生物质粒线性化，随后用MBN处理。如前所述，将线性化的质粒用于采用SP6RNA聚合酶的体外转录反应(25μl)。转录后，用10U Dnase I进一步孵育反应混合物30分钟，并用苯酚-氯仿-异戊醇提取。通过RNA向DE-81滤纸(Whatman，Maidstone，UK)的吸附检测[3H]UTP的整合，在此基础上对RNA的产量进行定量。如前所述，通过电穿孔，将RNA(2μg)转染进细胞(Yun等，J.Virol.，2003，77，6450-6465)。
导入易感的BHK-21细胞中的源自pJEV/FL/PAC、pJEV/FL/EGFP、pJEV/FL/LUC和pJEV/FL/LacZ的合成的RNA分别具有3.5×106、2.5×106、3.4×106和1.1×106PFU/μg的特异感染性，这与亲代pJEV/FL的感染性(3.2×106PFU/μg)类似。但是，转染了重组合成的RNA的BHK-21细胞确实形成了比pJEV/FL-转染的细胞更小的同源噬斑(图9C)。这与感染性病毒的迟延生成(表5，病毒滴度)和在重组RNA-转染的细胞中观察到的降低的致细胞病性(表5，CPE)相一致。本发明的发明人还证实了，重组RNA-转染的BHK-21细胞中的病毒蛋白的迟延积累(图9D)与已经插入的外源基因的长度相关(图9B)。
表5从含有不同报道基因的全长JEV cDNA衍生物生成的体外RNA转录物的特异感染性和重组病毒滴度
a：用于体外转录反应的所有JEV cDNA模板都是通过Xba I酶切进行线性化、随后用MBN处理制备的。
b：用SP6RNA聚合酶体外转录后，将样品用于电穿孔BHK-21细胞，检测感染性的噬斑中心(Yun等，J.Virol.，2003，77，6450-6465)。
c：电穿孔后48小时和72小时时的病毒滴度。
d：用RNA转录物(从全长JEV cDNA衍生物生成)电穿孔后观察到了病毒诱导的CPE。在电穿孔后24小时，在亲代pJEV/FL观察到强烈的CPE，如++++所示。对于pJEV/FL/PAC和pJEV/FL/EGFP，在电穿孔后60小时观察的CPE，如++所示。对于pJEV/FL/LacZ，在电穿孔后72小时出现清楚的CPE，如+所示。-表示无CPE。
使用感染性的JEV cDNA进行的EGFP、LUC、LacZ和PAC表达如图10所示。JEV/FL/EGFP RNA-转染的BHK-21细胞在荧光显微镜下显示出明亮的绿色荧光(图10A)。如通过流式细胞仪分析所测定的，与模拟转染的细胞(……)相比，绿色荧光的细胞(-)包含99.7％的细胞(图10B)。图10C说明了表达JEV/FL/LacZ RNA的BHK-21细胞的X-gal染色图案。本发明的发明人还监测了已经用能复制的JEV/FL/LUC RNA(●)或不能复制的JEV/FL/LUCREP-RNA(○)(它缺少能在核苷酸5596(*)处过早终止病毒翻译的部分)转染的BHK-21细胞随时间的LUC活性。这表明，增强的病毒复制与增强的LUC活性相关(图10D)，如前所述(Yun等，J.Virol.，2003，77，6450-6465)。而且，用嘌呤霉素对JEV/FL/PAC RNA-转染的BHK-21细胞进行的筛选(图10E)表明，JEV/FL/PAC RNA-转染的细胞能存活，并且在含有嘌呤霉素的培养基(平皿7)中汇合，或在用含有嘌呤霉素的培养基(平皿8)铺成的半固体琼脂层下形成PurR foci，而模拟转染的细胞则在筛选24小时内死亡(平皿5-6)。如预期的，两种细胞类型在没有嘌呤霉素的情况下都能汇合(平皿1-4)。
<10-2>JEV病毒复制子的构建和载体特征
<10-2-1>JEV病毒复制子载体的质粒构建
在pJEV/FL/LUC(在结构蛋白的编码序列中工程地框架内缺失)的基础上构建了用于所有JEV病毒复制子的质粒。所有的缺失通过新的Xho I位点(它会插入两个残基，即Leu和Glu)予以区别。首先，本发明的发明人生成了一组4个在每个结构蛋白中含有一个框架内缺失的JEV病毒复制子载体。为了构建在C基因中含有273个核苷酸缺失(核苷酸132-404)的pJEV/Rep/ΔCC/LUC，通过PCR扩增pJEV/FL合成了2个片段，即片段C1使用引物DelF(由SEQ.ID.No 53表示)和C1R(由SEQ.ID.No54表示)，片段C2使用引物C2F(由SEQ.ID.No 55表示)和DelR(由SEQ.ID.No 56表示)。将2个片段(C1片段扩增子的267bp的Pac I-Xho I部分和C2片段扩增子的226bp的Xho I-BsiW I部分)连接到pJEV/FL/LUC的20,073bp的BsiW I-Pac I片段，生成pJEV/Rep/ΔCC/LUC构建体。为了生成在C基因中含有204个核苷酸缺失(核苷酸201-404)的pJEV/Rep/ΔC/LUC，通过使用引物DelF和C3R(由SEQ.ID.No 57表示)的PCR从pJEV/FL扩增片段C3。将得到的扩增子的336bp的Pac I-Xho I片段连接到pJEV/Rep/ΔCC/LUC的12,850bp的Xho I-Rsr II和7,449bp的Rsr II-Pac I片段，生成pJEV/Rep/ΔC/LUC构建体。为了创建在prM基因中含有282个核苷酸缺失(核苷酸531-812)的pJEV/Rep/ΔprM/LUC，通过PCR扩增pJEV/FL得到2个片段，即，片段prM1使用引物DelF和prM1R(由SEQ.ID.No 58表示)，片段prM2使用引物prM2F(由SEQ.ID.No 59表示)和DelR。将2个片段(prM1片段扩增子的666bp的Pac I-Xho I部分和prM2片段扩增子的1,616bp的Xho I-Sfi I部分)连接到pJEV/FL/LUC的10,264bp的Sfi I-Nsi I和8,011bp的Nsi I-Pac I片段，生成pJEV/Rep/ΔprM/LUC构建体。为了生成在E基因中含有1,170个核苷酸缺失(核苷酸1,032-2,201)的pJEV/Rep/ΔE/LUC，通过PCR扩增pJEV/FL生成了2个片段，即，片段E1使用引物DelF和E1R(由SEQ.ID.No 60表示)，片段E2使用引物E2F(由SEQ.ID.No 61表示)和DelR。将2个片段(prM1片段扩增子的1,167bp的Pac I-Xho I部分和prM2片段扩增子的227bp的Xho I-Sfi I部分)连接到pJEV/FL/LUC的10,264bp的Sfi I-Nsi I和8,011bp的Nsi I-Pac I片段，生成pJEV/Rep/ΔE/LUC构建体(图11A)。
其次，本发明的发明人构建了一组3个在JEV结构基因中含有2个框架内缺失的JEV病毒复制子载体。将2个pJEV/FL/LUC片段(10,264bp的Sfi I-Nsi I和8,011bp的Nsi I-Pac I片段)连接到(i)pJEV/Rep/ΔC/LUC的438bp的Pac I-Hind III片段和pJEV/Rep/ΔprM/LUC的1,646bp的HindIII-Sfi I片段，生成pJEV/Rep/ΔC+ΔprM/LUC，(ii)pJEV/Rep/ΔC/LUC的866bp的Pac I-Mlu I片段和pJEV/Rep/ΔE/LUC的330bp的Mlu I-Sfi I片段，生成pJEV/Rep/ΔC+ΔE/LUC，或(iii)pJEV/Rep/ΔprM/LUC的788bp的Pac I-Mlu I片段和pJEV/Rep/ΔE/LUC的330bp的Mlu I-Sfi I片段，生成pJEV/Rep/ΔprM+ΔE/LUC(图11A)。
再次，本发明的发明人创建了一组2个JEV病毒复制子载体，其中缺失所有的JEV结构蛋白。为了生成pJEV/Rep/ΔC+ΔprM+ΔE/LUC，将pJEV/FL/LUC的2个片段(10,264bp的Sfi I-Nsi I和8,011bp的Nsi I-PacI片段)连接到pJEV/Rep/ΔC+ΔprM/LUC的590bp的Pac I-Mlu I片段和pJEV/Rep/ΔE/LUC的330bp的Mlu I-Sfi I片段。本发明的发明人还构建了pJEV/Rep/NS1/LUC，它含有C蛋白(其后紧跟着NS1蛋白的N-末端)的35个N-末端和24个C-末端氨基酸、和病毒基因组的其余部分。首先通过使用引物DelF和NS1R(由SEQ.ID.No 62表示)的PCR，从pJEV/Rep/ΔC/LUC合成了1个片段。然后用引物NS1F(由SEQ.ID.No 63表示)和RR(由SEQ.ID.No 64表示)，从pJEV/FL合成了1个片段。通过使用引物DelF和RR的第2轮PCR，将这2个片段融合。将得到的扩增子的474bp的Pac I-ApaL I片段连接到pJEV/FL/LUC的3,038bp的ApaLI-BamH I和15,122bp的BamH I-Pac I片段，生成pJEV/Rep/NS1/LUC(图11A)。
除了pJEV/Rep/ΔC+ΔprM+ΔE/LUC和pJEV/Rep/NS1/LUC之外，本发明的发明人还构建了8个其它的JEV病毒复制子载体。将pJEV/FL/EGFP的6,797bp的BamH I-Not I片段连接到(i)pJEV/Rep/ΔC+ΔprM+ΔE/LUC的11,529bp的BamH I-Not I片段，生成pJEV/Rep/ΔC+ΔprM+ΔE/EGFP，或(ii)pJEV/Rep/NS1/LUC的10,968bp的BamH I-Not I片段，生成pJEV/Rep/NS1/EGFP。将pJEV/FL/LacZ的5,792bp的Sac II-Not I片段连接到(i)pJEV/Rep/ΔC+ΔprM+ΔE/LUC的7,456bp的Not I-Pac I和7,464bp的Pac I-Sac II片段，生成pJEV/Rep/ΔC+ΔprM+ΔE/LacZ，或(ii)pJEV/Rep/NS 1/LUC的7,456bp的Not I-Pac I和6,903bp的Pac I-Sac II片段，生成pJEV/Rep/NS1/LacZ。将pJEV/FL/PAC的6,663bp的BamH I-Not I片段连接到(i)pJEV/Rep/ΔC+ΔprM+ΔE/LUC的11,529bp的BamH I-Not I片段，生成pJEV/Rep/ΔC+ΔprM+ΔE/PAC，或(ii)pJEV/Rep/NS 1/LUC的10,968bp的BamH I-Not I片段，生成pJEV/Rep/NS1/PAC。
<10-2-2>在多种自我复制的、自限制的JEV病毒复制子中表达异源蛋白
为了利用JEV RNA复制机制独立地表达外源基因，本发明的发明人生成了一组能满足严格安全要求的自我复制的、自限制的病毒复制子(图11A)。开始，本发明的发明人使用了LUC报道基因作为外源基因，因为它有利于以敏感的和定量的方式监测病毒复制。因而，考虑每种蛋白的膜定位，通过使pJEV/FL/LUC在框架内缺失1个、2个或全部病毒结构基因(C、prM和E)，小心地构建了多种复制子载体(图11A)。
用已经转染了不同病毒复制子的BHK-21细胞的LUC活性，对时间作图(图11B)。用转染了能复制的JEV/FL/LUC RNA(●，黑色)的BHK-21细胞作为阳性对照，转染后6小时的起始LUC活性是5.5±0.3×103RLU。该活性在转染后48小时急剧增加至2.7±0.5×106RLU，并且维持至转染后96小时。在转染了不能复制的JEV/FL/LUCREP-RNA(◆，黑色)的BHK-21细胞中，在转染后6小时，从导入的病毒RNA表达的初始LUC活性近似，即5.2±0.6×103RLU。但是，该活性随着时间逐渐降低，在转染后96小时降至8.8±1.0RLU，这与原初细胞的背景荧光等同。且不说pJEV/Rep/ΔCC/LUC(◆，蓝色)，其缺少与猜想的3’NTR(它在所有黄病毒中都是保守的)中的环化序列互补的序列(Bredenbeek等，J.Gen.Virol.，2003，84，1261-1268；Lo等，J.Virol.，2003，77，10004-10014；Khromykh等，J.Virol.，2001，75，6719-6728)，转染了病毒复制子(其缺少一个或多个结构蛋白基因的一部分)的BHK-21细胞的LUC活性在转染后6-48小时与能复制的JEV/FL/LUC RNA-转染的BHK-21细胞(●，黑色)几乎相同。但是，这些活性此后随着时间急剧下降，因为不能进行病毒扩散，这类似于JEV/FL/LUCREP-。有趣的是，由于JEV/Rep/NS1/LUC RNA(●，绿色)而不是JEV/Rep/ΔC+ΔprM+ΔE/LUC RNA(■，绿色)造成的LUC活性在全部时间点都约是其它能复制的病毒复制子的活性的5倍。
如通过使用JEV-特异性的超免疫血清的免疫印迹所定量的，LUC的表达图谱与病毒蛋白的积累相一致(图11C)。本发明的发明人还证实了，通过使用基于JEV的复制子载体例如pJEV/Rep/NS1和pJEV/Rep/ΔC+ΔprM+ΔE，其它报道基因也能在多种常用的动物细胞中有效地表达。
<10-3>用于JEV病毒复制子的包装系统的构建
<10-3-1>以pSinRep19载体为基础的JEV结构蛋白表达载体的质粒构建
本发明的发明人以pSinRep19为基础构建了3个JEV结构蛋白表达载体(Agapov等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1998，95，12989-12994)。对于pSinRep19/JEV C-E，用包含Xba I位点(标有下划线的)的引物JEVCF(5’-GATTCTAGAATGACTAAAAAACCA，由SEQ.ID.No 65表示)和包含PmeI位点(标有下划线的)的引物JEVER(5’-GATGTTTAAACTATTAAGCATGCACATTGGT，由SEQ.ID.No 66表示)扩增了pJEV/FL片段。将得到的扩增子的2,393bp的Xba I-Pme I片段连接到pSinRep19的10,864bp的Xba I-Mlu I(T4DNA聚合酶处理过的)片段，构建pSinRep19/JEV C-E(图12A)。对于pSinRep19/JEV C-NS1，用引物JEVCF和包含Pme I位点(标有下划线的)的引物JEVNS1R(5’-GATGTTTAAACTATTAAGCATCAACCTGTGA，由SEQ.ID.No 67表示)PCR扩增pJEV/FL得到1个片段。然后将得到的扩增子的3,449bp的Xba I-Pme I片段连接到pSinRep19的10,864bp的Xba I-Mlu I(T4DNA聚合酶处理过的)片段，构建pSinRep19/JEV C-NS1(图12A)。对于pSinRep19/JEV C-E-BglII，将pSinRep19/JEV C-NS1的2,559bp的Xba I-BglII(T4DNA聚合酶处理过的)片段连接到pSinRep19的10,864bp的XbaI-Mlu I(T4DNA聚合酶处理过的)片段(图12A)。
<10-3-2>源自JEV的复制子载体RNA的包装细胞系的生成。
通过开发能组成型表达所有的JEV结构蛋白(C、prM和E)并反向补充JEV病毒复制子的有效包装的包装细胞系(PCL)，详述了基于JEV复制子的表达载体的应用。在含有亚基因组启动子(它有利于筛选)驱动的PAC基因的pSinRep19表达载体的基础上(图12A)，本发明的发明人构建了3个不同的JEV结构蛋白表达盒构建体，它们编码C-E(pSinRep19/JEVC-E)、C-E+NS1的58个N-末端残基(pSinRep19/JEV C-E-BglII)和C-NS1(pSinRep19/JEV C-NS1)的序列。
在转染了合成的RNA(它们已经从相应载体体外地转录)的BHK-21细胞中评价了这些载体产生的蛋白表达。通过Xho I酶切，使pSinRep19和其衍生物线性化。如前所述，线性化的质粒用于使用SP6RNA聚合酶的体外转录反应(25μl)。转录后，用10U DNase I进一步孵育反应混合物30分钟，用苯酚-氯仿-异戊醇提取。通过RNA向DE-81滤纸(Whatman，Maidstone，UK)的吸附检测[3H]UTP的整合，在此基础上对RNA的产量进行定量。如前所述，通过电穿孔将RNA(2μg)转染进细胞(Yun等，J.Virol.，2003，77，6450-6465)。当用JEV-特异性的超免疫血清进行免疫印迹、分析转染的细胞的细胞裂解物时，在转染了3种载体中的每一种的BHK-21细胞中检测到了等量的病毒糖蛋白E(图12B)。如设计的，只在SinRep19/JEVC-NS1RNA-转染的细胞中检测到了NS1蛋白(图12B)。
图12C解释了生产JEV病毒复制子颗粒(VRP)的2个方法。一个包括用能表达JEV结构蛋白的SinRep19载体RNA瞬时共转染体外转录的JEV复制子载体RNA。通过用VRP感染原初BHK-21细胞然后检测报道基因的表达，可以滴定和监测包装的VRP。在几个实验中，用表达EGFP的JEV病毒复制子RNA[JEV/Rep/ΔC+ΔprM+ΔE/EGFP(□，绿色)或JEV/Rep/NS1/EGFP(■，绿色)]共转染SinRep19/JEV C-NS 1RNA，生成了1.1-4.3×104感染单位/ml(IU/ml)的VRP(图12D)。使用表达LacZ的JEV病毒复制子，即，JEV/Rep/ΔC+ΔprM+ΔE/LacZ(□，蓝色)或JEV/Rep/NS1/LacZ(■，蓝色)得到了类似结果。当使用SinRep19/JEVC-NS1或SinRep19/JEV C-E-BglII JEV结构蛋白表达盒时，没有观察到差异。但是，将SinRep19/JEV C-E载体RNA和表达EGFP或LacZ的病毒复制子共转染生成了少了≈100倍的VRP(图12D)。通过将所有的JEV结构蛋白表达载体RNA和表达LUC的JEV复制子RNA，即JEV/Rep/ΔC+ΔprM+ΔE/LUC(□，黑色)或JEV/Rep/NS1/LUC(■，黑色))共转染，证实了该结果(图12D)。
生产JEVVRP的其它方法以使用连续的PCL(通过用JEV结构蛋白表达载体RNA转染细胞和用嘌呤霉素筛选建立)为基础。如前所述，用JEV结构蛋白表达载体RNA转染BHK-21细胞。转染后，将细胞接种培养约24小时，将培养基替换为新鲜的含有10μg/ml嘌呤霉素(Sigma)的完全培养基。此后，将细胞维持在存在嘌呤霉素的条件下，并传代和冷冻作为亲代BHK-21细胞。
证实选择的细胞能稳定地表达JEV结构蛋白，并且对宿主细胞没有任何有害作用，在生产基于JEV的VRP方面也比亲代BHK-21细胞略微更有效。在所有的情况下，与包括用2个载体RNA共转染亲代BHK-21细胞的方法相比，用JEV病毒复制子载体RNA转染这些PCL得到了更高的VRP滴度(1.0×103-1.2×105IU/ml)(图12E)。
为了检测在本发明开发的包装系统中存在能复制的病毒颗粒，用3×105IU VRP(MOI＝1)感染原初BHK-21细胞72小时。将从感染的细胞得到的未稀释的上清液进一步传代3次，扩增可能存在的非常小量的能复制的病毒颗粒。在这些传代结束时，使用JEV-特异性的超免疫血清进行IFA，检测感染的细胞中的报道基因或病毒蛋白的表达。没有检测出能复制的病毒颗粒。而且，表达JEV结构蛋白的Sindbis复制子RNA没有包封在释放的VRP中。
工业实用性
如前所述，本发明的JEV基因组RNA的可靠的核苷酸序列和从其合成的全长的感染性的JEV cDNA不但可以用于鉴别JEV基因，而且可以用于分子生物学研究，包括JEV复制、转录和翻译。而且，它们还可以用于开发日本脑炎的治疗剂、疫苗、诊断剂和诊断装置，还可以用作表达多种外源基因的载体。
本领域的技术人员应当明白，前面的说明书中公开的概念和具体实施方案可以容易地用作实现本发明的相同目的的其它实施方案的修改基础和设计基础。本领域的技术人员还应当明白，这样的等同实施方案没有脱离权利要求书所述的发明精神和范围。
用于专利程序的国际承认的微生物保藏布达佩斯条约
国际表格
微生物保藏证明
按照细则Rule 7.1发行
致：李荣敏
医学院，国立忠北大学，(College of Medicine，Chungbuk National University)#48，Gaeshin-dong，Heungduk-ku，Cheongju-si，Chungbuk，361，763韩国
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Claims (18)
1.一种载体，其包括遗传稳定的日本脑炎病毒的全长感染性的cDNA克隆，其中将日本脑炎病毒的全长cDNA克隆到BAC质粒中以获得所述载体。
2.如权利要求1所述的载体，其中所述的cDNA克隆含有在对应于日本脑炎病毒基因组RNA的DNA序列的5’端起始处的启动子和在所述DNA序列的3’端的作为失控位点的限制内切酶识别序列。
3.如权利要求2所述的载体，其中所述的启动子是SP6或T7。
4.如权利要求2所述的载体，其中所述的限制内切酶识别序列来自不同于日本脑炎病毒基因组RNA的来源。
5.如权利要求2所述的载体，其中所述的限制内切酶识别序列是Xho I或Xba I。
6.如权利要求2所述的载体，其中所述的cDNA克隆选自由SEQ.ID.No 43、No 44和No 45表示的全部具有SP6启动子的序列，和SEQ.ID.No 46、No 47和No 48表示的全部具有T7启动子的序列组成的组。
7.如权利要求1所述的载体，其中所述BAC质粒是pBeloBAC11。
8.如权利要求2所述的载体，其中所述日本脑炎病毒基因组RNA由5’非翻译区域、单独的多肽编码区和3’非翻译区域组成。
9.如权利要求8所述的载体，其中所述的日本脑炎病毒基因组RNA来源于韩国日本脑炎病毒并且核苷酸序列如SEQ.ID.No.15所示。
10.如权利要求1所述的载体，其中所述的载体选自由下述组成的组：含有由SEQ.ID.No 43表示的日本脑炎病毒cDNA的pBACSP6/JVFL/XhoI，含有由SEQ.ID.No 44表示的日本脑炎病毒cDNA的pBACSP6/JVFLx/XhoI，含有由SEQ.ID.No 45表示的日本脑炎病毒cDNA的pBACSP6/JVFLx/XbaI，含有由SEQ.ID.No 46表示的日本脑炎病毒cDNA的pBACT7/JVFL/XhoI，含有由SEQ.ID.No 47表示的日本脑炎病毒cDNA的pBACT7/JVFLx/XhoI，和含有由SEQ.ID.No 48表示的日本脑炎病毒cDNA的pBACT7/JVFLx/XbaI。
11.如权利要求10所述的载体，其中所述的载体是具有T7启动子的pBACT7/JVFL/XhoI，其保藏号为KCTC 10346BP。
12.如权利要求10所述的载体，其中所述的载体是具有SP6启动子的pBACSP6/JVFLx/XbaI，其保藏号为KCTC 10347BP。
13.从权利要求1所述的载体合成的感染性的全长日本脑炎病毒RNA转录物。
14.如权利要求13所述的感染性的全长日本脑炎病毒RNA转录物，其中除去了所述RNA在其3’端的与病毒无关的核苷酸。
15.如权利要求14所述的感染性的全长日本脑炎病毒RNA转录物，其中通过用绿豆核酸酶处理除去了与病毒无关的核苷酸。
16.一种细胞，其转染了如权利要求13所述的全长日本脑炎病毒RNA转录物。
17.一种表达外源基因的方法，其包括下述步骤：
1)通过将外源基因插入到权利要求1的载体中，制备重组日本脑炎病毒cDNA表达载体；
2)从上述的重组日本脑炎病毒cDNA表达载体生产日本脑炎病毒RNA转录物；
3)制备转染了上述日本脑炎病毒RNA转录物的细胞；
4)通过培养上述细胞表达外源蛋白。
18.如权利要求17所述的方法，其中所述的外源基因插入在日本脑炎病毒cDNA的日本脑炎病毒3’非翻译区域的起点。
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| Ni Het al.U14163.NCBI.1994,1-6. * |
| Ni Het al.U15763.NCBI.1995,1-5. * |
| Shihyun Y. et al.A Novel in Vitro Replication System for Dengue Virus.J. Biological Chemistry274 47.1999,274(47),33714-33722. |
| Shihyun Y. et al.A Novel in Vitro Replication System for Dengue Virus.J. Biological Chemistry274 47.1999,274(47),33714-33722. * |
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