CN111334482B - 一种复制性增强的减毒jev及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种复制性增强的减毒JEV及其制备方法与应用，属于生物医学技术领域。本发明的减毒JEV是日本乙型脑炎病毒NS5蛋白644位天冬氨酸突变为苏氨酸，和3’非编码区248位碱基T突变为C、254位碱基A突变为G、258位点碱基A突变为G，所得的日本乙型脑炎病毒。本发明方法获得的突变毒株在复制能力上有了明显的提升，同时致病性降低，用于疫苗生产中，可提高产量，降低成本。利用本发明方法获得突变毒株的时间周期短，操作简便，可加快弱毒毒株的培育和病毒致病机制研究的进程。

Description

一种复制性增强的减毒JEV及其制备方法与应用

技术领域

本发明属于生物医学技术领域，具体涉及一种复制性增强的减毒JEV及其制备方法与应用。

背景技术

日本乙型脑炎(Japanese encephalitis，JE)(简称乙脑)是由日本乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus，JEV)引起的一种虫媒性的人兽共患病。猪通常作为JEV感染人之前的储存宿主，在感染该病毒后，妊娠母猪会出现流产、死胎、胎儿畸形以及木乃伊胎；公猪则出现睾丸炎，繁殖障碍，对畜牧养殖业造成巨大影响。同时它还对人类健康造成巨大威胁，是人类中枢神经系统最常见的虫媒病之一。

JEV是由囊膜包被着的单股正链RNA病毒，大小为11Kb，基因组有一个长的开放阅读框(ORF)，编码三种结构蛋白(E、prM、C)和七种非结构蛋白(NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B、NS5)，在其基因组的5’端有一个帽子结构，3’端缺乏聚腺苷酸化的尾巴。JEV非结构蛋白与宿主细胞因子一起形成病毒复制酶复合物来指导在宿主细胞的细胞质中的病毒基因组RNA复制。病毒RNA复制过程是依靠两个最大的非结构蛋白进行加工完成的：(1)NS3可以同时发挥丝氨酸蛋白酶(NS2B作为其辅因子)、RNA刺激核苷三磷酸酶、RNA解旋酶与RNA三磷酸酶的功能；(2)NS5具有甲基转移酶、RNA鸟苷酰转移酶与RNA依赖RNA聚合酶的活性；除此之外，NS5蛋白还具有核定位信号与核输出序列的作用，其在病毒复制的过程扮演十分重要的角色。病毒RNA的复制过程中，还必须要通过非结构蛋白与细胞因子一起形成的病毒复制复合物并特异性识别由一级序列或二级/三级结构定义的病毒顺式作用RNA元件。这些RNA元件存在于基因组的不同位置，但最常见的是位于5’和3’非编码区，这些顺式作用RNA元件的鉴定与表征对于理解JEV基因组复制的完整周期以及病毒致病力是至关重要的。

黄病毒的基因组RNA中非编码区的RNA结构与NS5蛋白对病毒的生存、传播都有十分重要的影响，虽然目前对黄病毒非编码区RNA的研究已经进行的比较深入，但仍有RNA元件的功能不清楚，对RNA元件SL-IV的研究尚少。

发明内容

为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一种复制性增强的减毒JEV。

本发明的另一目的在于提供一种复制性增强的减毒JEV感染性克隆。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种复制性增强的减毒JEV，是日本乙型脑炎病毒NS5蛋白644位天冬氨酸突变为苏氨酸，和3’非编码区248位碱基T突变为C、254位碱基A突变为G、258位点碱基A突变为G，所得的日本乙型脑炎病毒。

所述的日本乙型脑炎病毒优选为日本乙型脑炎病毒SA14株(U14163)。

一种复制性增强的减毒JEV，所述的复制性增强的减毒JEV的基因组RNA的cDNA序列，是GenBank号为U14163的序列的第9101～10976位，替换为SEQ ID NO.2所示的序列的第1～1877位，所得的核苷酸序列。

一种复制性增强的减毒JEV，所述的复制性增强的减毒JEV的核苷酸序列，为SEQID NO.1所示序列的第484～11460位所示的序列。

一种复制性增强的减毒JEV感染性克隆，包含上述复制性增强的减毒JEV的基因组RNA的cDNA序列。

所述的复制性增强的减毒JEV感染性克隆，还包含多酶切位点序列、启动子序列和SV40poly(A)序列中的至少一种。

一种复制性增强的减毒JEV感染性克隆，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

用上述复制性增强的减毒JEV感染性克隆所拯救的复制性增强的减毒JEV。所述的拯救，具体包括如下步骤：

(1)将所述的复制性增强的减毒JEV感染性克隆用限制性内切酶进行酶切线性化，得到线性化产物；

(2)所得线性化产物进行体外转录，得到RNA产物；

(3)所得RNA产物按1μg/3.8～4.5×10⁵个细胞转染BHK-21细胞，经培养获得所述的复制性增强的减毒JEV病毒。

步骤(2)中所述的线性化产物进行转录前，用酚氯仿纯化抽提。

步骤(3)中所述的培养条件为37℃二氧化碳培养箱培养。

上述复制性增强的减毒JEV在制备预防乙型脑炎疫苗或治疗乙型脑炎药物中的应用。

上述复制性增强的减毒JEV感染性克隆在制备预防乙型脑炎疫苗或治疗乙型脑炎药物中的应用。

本发明发明人对近年来上传至GenBank数据库中的JEV基因组序列碳端非编码区进行比对分析发现，其基因组3’UTR区域第248位、第254位、第258位核苷酸有差异。进一步分析，发现当JEV 3’非编码区SL-IV结构区域248位点由T→C时，第258位点同时也会由A→G，推测乙型脑炎病毒在248位点与258位点在病毒的生命周期中必须形成茎，虽然C-G更稳定，然而自然界中存在较多的竟然是T-A，这种改变的原因不得而知，推测可能是由于病毒为应对宿主细胞适应性而做出的调整；而当254位点同时也发生了A→G的突变时，SL-IV结构侧链环增大而顶端环减小，这可能使SL-IV阻止Xrn1对病毒RNA降解的效率降低，减少了sfRNA产生从而使JEV病毒更易于激发机体天然免疫并且被清除，因此降低了对小鼠的致病性；另外，当JEV NS5蛋白644位点由天冬氨酸到苏氨酸的改变，与SL-IV区域248、254、258碱基的改变同时存在时，可在JEV复制前期使病毒产生大量的负链以提高病毒的复制水平，但这些改变同时也使JEV突破血脑屏障的能力降低，病毒无法进入易感细胞增殖。因此推测，SL-IV区域中248、254、258位点与NS5蛋白644位点的氨基酸存在一定的适配性，这种适配性会影响JEV复制能力，同时对病毒能否顺利通过血脑屏障也有影响，并且NS5蛋白644位点本身的改变也可能影响JEV对宿主免疫系统的逃逸，从而使病毒致病性降低。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

(1)本发明利用反向遗传系统，构建具有突变基因的乙型脑炎病毒全长感染性克隆，通过体外转录方式获得具有感染性的病毒RNA，随后转染细胞，拯救出突变病毒之后比较携带不同突变基因的病毒在BHK-21细胞上增殖、病毒复制能力以及对小鼠致病性的变化。本发明发现携带突变基因的SL-IV与乙型脑炎病毒改变了第644位氨基酸(Asn→Thr)的NS5蛋白在复制上存在协同作用，并且在病毒的复制前期，这种协同作用会产生大量病毒RNA负链，从而大大提高病毒的复制；虽然具有突变基因的SL-IV结构的突变病毒在细胞上的复制能力得到了显著提高，亦可产生细胞病变，然而病毒释放高峰延后，且对小鼠的致病力明显下降。

(2)本发明方法获得的突变毒株在复制能力上有了明显的提升，同时致病性降低，用于疫苗生产中，可提高产量，降低成本。

(3)利用本发明方法获得突变毒株的时间周期短，操作简便，可加快弱毒毒株的培育和病毒致病机制研究的进程。

(4)本发明对乙型脑炎病毒3’非编码区的RNA元件的功能研究进行了补充，对未来黄病毒的进一步研究提供新视角，对黄病毒以NS5蛋白作为药物靶标研制新型药物提供新的思路。

附图说明

图1为pACYC-SA14/U14163质粒示意图。

图2为病毒增殖曲线图。

图3为突变病毒感染细胞后复制情况图；其中，A为感染细胞后14h时负链检测结果，B为感染细胞后14h时正链检测结果，C为感染细胞后20h时负链检测结果，D为感染细胞后20h时正链检测结果。

图4为突变病毒颅内注射攻毒对小鼠的致病性研究实验结果图；其中，A小鼠致死情况结果图，B为小鼠体重变化结果图，C为脑内病毒滴度结果图。

图5突变病毒腹腔注射攻毒小鼠的致病性研究实验结果图；其中，A为小鼠致死情况结果图，B为小鼠体重变化结果图，C为第5天、第7天脑内病毒滴度结果图。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

下述实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW，Molecular Cloning:a Laboratory Manual，2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。

下述实施例中所述的乙型脑炎病毒全长感染性隆质粒pACYC-JEV-SA14/U14163已在文献“Li,X.-D,Li,X.-F,Ye,H.-Q,等.Recovery of a chemically synthesizedJapanese encephalitis virus reveals two critical adaptive mutations in NS2Band NS4A[J].Journal of General Virology,95(Pt_4):806-815.”中公开。

本发明发明人在前期研究中，得到一个核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的序列，该序列第1～1294位对应日本乙型脑炎病毒的NS5蛋白RdRp(RNA依赖性RNA聚合酶)区域，第1294～1877位对应日本乙型脑炎病毒3’非编码区。将其命名为M-NS5-3’UTR(1884bp)，委托擎科生物公司合成该片段。

SEQ ID NO.2：

CATTTGGTTCATGTGGCTTGGAGCACGGTATCTAGAGTTTGAAGCTTTGGGGTTCCTGAATGAAGACCATTGGCTGAGCCGAGAGAATTCAgGAGGTGGAGTGGAAGGCTCAgGCGTCCAAAAGCTGGGATACATCCTCCGTGACATAGCAgGAAAGCAAGGAGGGAAAATGTACGCTGATGACACCGCCGGATGGGACACTAGAATTACCAGAACTGATTTAGAAAATGAAGCTAAGGTGCTGGAGCTCCTAGACGGTGAACACCGCATGCTCGCCCGAGCCATAATTGAACTGACTTACAGGCACAAAGTGGTCAAGGTCATGAGACCTGCAGCAGAAGGAAAGACCGTAATGGACGTGATATCAAGAGAAGATCAAAGGGGGAGTGGACAGGTGGTCACTTATGCCCTTAACACTTTCACGAACATCGCTGTCCAGCTCGTCAGGCTGATGGAGGCTGAGGGGGTCATTGGACCACAACACTTGGAACAGCTACCTAGAAAAACCAAGATAGCTGTCAGGACCTGGCTCTTTGAGAATGGAGAGGAGAGAGTGACCAGGATGGCGATCAGCGGAGACGACTGTGTCGTCAAGCCGCTGGACGACAGATTCGCCACAGCCCTCCACTTCCTCAACGCAATGTCAAAGGTCAGAAAAGACATCCAGGAATGGAAGCCTTCGCATGGCTGGCACGACTGGCAGCAAGTTCCCTTCTGCTCTAACCATTTTCAGGAGATTGTGATGAAAGATGGAAGGAGTATAGTTGTCCCGTGCAGAGGACAGGATGAGCTGATAGGCAGGGCTCGCATCTCTCCAGGAGCTGGATGGAATGTGAAGGACACAGCTTGCCTGGCCAAAGCATATGCACAGATGTGGCTACTCCTATACTTCCATCGTAGGGACTTGCGTCTCATGGCAAATGCGATTTGCTCAGCAGTGCCAGTGGATTGGGTGCCCACAGGCAGGACGTCCTGGTCAATACACTCGAAAGGAGAGTGGATGACCACGGAAGACATGCTGCAGGTCTGGAACAGAGTCTGGATTGAAGAAAATGAATGGATGATGGACAAGACTCCAATCACAAGCTGGACAGACGTTCCGTATGTGGGAAAGCGTGAGGACATCTGGTGTGGTAGCCTCATCGGAACGCGATCCAGAGCAACCTGGGCTGAGAACATCTATGCGGCGATAAACCAGGTTAGAGCTGTCATTGGGAAAGAAAATTATGTTGACTACATGACCTCACTCAGGAGATACGAAGACGTCTTGATCCAGGAAGACAGGGTCATCTAGTGTGATTTAAGGTAGAAAAGTAGACTATGTAAATAATGTAAATGAGAAAATGCATGCATATGGAGTCAGGCCAGCAAAAGCTGCCACCGGATACTGGGTAGACGGTGCTGCCTGCGTCTCAGTCCCAGGAGGACTGGGTTAACAAATCTGACAACAGAAAGTGAGAAAGCCCTCAGAACCGTCTCGGAAGTAGGTCCCTGCTCACTGGAAGTTGAAAGACCAACGTCAGGCCACAAATTTGTGCCACCCCGCTGGGGGGTGCGGCCTGCGCAGCCCCAGGAGGACTGGGTTACCAAAGCCGTTGAGGCCCCCACGGCCCAAGCCTCGTCTAGGATGCAATAGACGAGGTGTAAGGACTAGAGGTTAGAGGAGACCCCGTGGAAACAACAACATGCGGCCCAAGCCCCCTCGAAGCTGTAGAGGAGGTGGAAGGACTAGAGGTTAGAGGAGACCCCGCATTTGCATCAAACAGCATATTGACACCTGGGAATAGACTGGGAGATCTTCTGCTCTATCTCAACATCAGCTACTAGGCACAGAGCGCCGAAGTATGTAGCTGGTGGTGAGGAAGAACACAAGATCTGGGTCGG。

下述实施例中涉及的引物，如下表1所示：

表1引物名称及合成序列

实施例1 pACYC-SA14-M-NS5-3’UTR感染性克隆的构建

1.以质粒pACYC-JEV-SA14/U14163(简称pACYC-SA14/U14163，下同)为模板，pACYC-full4、WH-HDVr-F为引物，进行PCR反应。PCR反应体系为：5×Q5 Reaction Buffer10μL、2.5M dNTP mix 4μL、pACYC-full4 2.5μL(10μmol/μL)、WH-HDVr-F 2.5μL(10μmol/μL)、Q5High-Fidelity DNA Polymerase 0.5μL、模板0.5μL、去离子水补足至50μL。PCR反应条件为：98℃预变性1min；98℃变性10s，58℃退火30s，72℃延伸20s，进行30个循环，最后在72℃延伸5min，所得产物命名为HDVr-SV40 poly(A)。

2.将片段HDVr-SV40 poly(A)(278bp)与M-NS5-3’UTR(1 884bp)以相等摩尔数(两片段总质量为700ng，HDVr-SV40 poly(A)90ng，M-NS5-3’UTR 610ng)通过融合PCR反应进行组装，两片段间有62bp的重叠区域，以XbaI-F和pACYC-full 4为引物。PCR反应体系为：5×Q5 Reaction Buffer 10μL、2.5M dNTP mix 4μL、XbaI-F 2.5μL(10μmol/μL)、pACYC-full42.5μL(10μmol/μL)、Q5 High-Fidelity DNA Polymerase 0.5μL、HDVr-SV40 poly(A)90ng、M-NS5-3’UTR 610ng去离子水补足至50μL。PCR反应条件为：98℃预变性1min；98℃变性10s，60℃退火30s，72℃延伸70s，进行30个循环后，最后在72℃延伸10min。所得产物命名为M-NS5-3’UTR-poly(A)(2 100bp)。

5.用限制性内切酶XbaI与XhoI对质粒pACYC-SA14/U14163以及PCR产物M-NS5-3’UTR-poly(A)分别进行酶切消化和回收，然后用T4 DNA连接酶进行连接，连接体系为：10×T4 DNA Ligase Buffer 1μL、T4 DNA Ligase 1μL、pACYC-SA14/U14163载体4μL、M-NS5-3’UTR-poly(A)的酶切产物1μL、去离子水补足至10μL。混匀后，置于16℃连接仪2h，所得连接产物直接用于转化。

将连接产物5μL加入到50μL HB101感受态细胞(购于上海唯地生物技术有限公司)悬液中，轻轻旋转以混匀内容物，冰浴30min，随后42℃水浴90s，期间不摇动离心管，再迅速冰浴2min，加入500μL不含抗生素的LB液体培养基，37℃摇床220r/min振荡培养1h，2000r/min离心后弃去300μL上清液，轻柔混匀内含物，取200μL均匀涂布于37℃预热的含氨苄青霉素(30ng/μL)的LB平板上，待菌液完全吸收后放入温箱，37℃倒置培养14h～16h。

从转化培养的平板中挑取10个单菌落，分别接种于500μL含30ng/μL的氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃、220r/min振荡培养6h；以XbaI-F和pACYC-full4为引物，进行PCR扩增鉴定目的基因是否突变成功。反应体系为：Premix rTaq(2×)10μL、XbaI-F(10μmol/μL)0.5μL、pACYC-full4(10μmol/μL)0.5μL、菌液1μL、去离子水补足至20μL。反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸2min15 s，进行30个循环，最后在72℃延伸8min。

PCR初步鉴定正确后，取2个阳性克隆送至北京擎科新业生物技术有限公司进行测序鉴定。测序正确后，将含有正确阳性克隆的菌接种于30mL 30ng/μL的氨苄青霉素的LB中，37℃摇床，220r/min 8h，随后将30mL菌液按照去内毒素提取质粒试剂盒的说明书，提取质粒。所得阳性克隆命名为pACYC-SA14-M-NS5-3’UTR，置于-20℃保存，备用。

实施例2 pACYC-SA14-M-NS5感染性克隆的构建

1.以质粒pACYC-SA14-M-NS5-3’UTR为模板，XbaI-F、NS5-R为引物，进行PCR扩增。PCR反应体系参照式实例1。PCR反应条件为：98℃预变性1min；98℃变性10s，58℃退火30s，72℃延伸40s，进行30个循环，最后在72℃延伸5min。所得产物命名为M-NS5(1 305bp)。

2.以质粒pACYC-SA14/U14163为模板，3’UTR-F、pACYC-full4为引物，进行PCR扩增。PCR反应体系参照式实例1。PCR反应条件为：98℃预变性1min；98℃变性10s，58℃退火30s，72℃延伸25s，进行30个循环，最后在72℃延伸5min。所得产物命名为SA14-3’UTR(816bp)。

3.将片段M-NS5(1 305bp)与SA14-3’UTR(816bp)以相等摩尔数(两片段总质量为700ng，M-NS5 430.7ng，SA14-3’UTR 269.3ng)通过融合PCR反应进行组装，两片段间有22bp的重叠区域，以XbaI-F和pACYC-full4为引物。PCR反应体系参照式实例1。PCR反应条件为：98℃预变性1min；98℃变性10s，58℃退火30s，72℃延伸70s，进行30个循环，最后在72℃延伸10min。所得产物命名为M-NS5-SA14-3’UTR(2 099bp)，其两端带有酶切位点XbaI、XhoI。

4.将纯化后的PCR产物M-NS5-SA14-3’UTR与质粒pACYC-SA14/U14163分别用限制性内切酶XbaI与XhoI进行酶切消化和回收，连接。连接产物以XbaI-F和pACYC-full4为引物进行PCR扩增鉴定(参照实施例1)。鉴定正确后送公司进行测序鉴定，测序正确后，将含有正确阳性克隆的菌按照去内毒素提取质粒试剂盒的说明书提取质粒。所得阳性克隆命名为pACYC-SA14-M-NS5，置于-20℃保存，备用。

实施例3 pACYC-SA14-M-3’UTR感染性克隆的构建

1.以质粒pACYC-SA14/U14163为模板，XbaI-F、NS5-R为引物，进行PCR扩增(参照实施例1)。PCR反应体系参照式实例1。PCR反应条件为：98℃预变性1min；98℃变性10s，58℃退火30s，72℃延伸25s，进行30个循环，最后在72℃延伸5min。所得产物命名为SA14-NS5(1305bp)。

2.以质粒pACYC-SA14-M-NS5-3’UTR为模板、3’UTR-F、pACYC-full4为引物，进行PCR扩增。PCR反应体系参照式实例1。PCR反应条件为：98℃预变性1min；98℃变性10s，58℃退火30s，72℃延伸40s，进行30个循环，最后在72℃延伸5min。所得产物命名为M-3’UTR(817bp)

3.将片段SA14-NS5(1 305bp)与M-3’UTR(817bp)以相等摩尔数(两片段总质量为700ng，SA14-NS5 430.5ng，M-3’UTR 269.5ng)通过融合PCR反应进行组装，两片段间有22bp的重叠区域，以XbaI-F和pACYC-full4为引物。PCR反应体系参照式实例1。PCR反应条件为：反应条件：98℃预变性1min；98℃变性10s，58℃退火30s，72℃延伸70s，进行30个循环，最后在72℃延伸10min。所得产物命名为SA14-NS5-M-3’UTR(2 100bp)，其两端带有酶切位点XbaI、XhoI。

4.将纯化后的PCR产物SA14-NS5-M-3’UTR(2100bp)与质粒pACYC-SA14/U14163分别用限制性内切酶XbaI与XhoI进行酶切消化，连接。连接产物以XbaI-F和pACYC-full4为引物进行PCR扩增鉴定(参照实施例1)。鉴定正确后送公司进行测序鉴定，测序正确后，将含有正确阳性克隆的菌按照去内毒素提取质粒试剂盒的说明书提取质粒。所得阳性感染性克隆命名为pACYC-SA14-M-3’UTR，置于-20℃保存，备用。

实施例4体外转录及细胞转染

1.质粒的线性化与回收：将含有乙型脑炎病毒全长基因组的感染性克隆(pACYC-SA14/U14163、pACYC-SA14-M-NS5-3’UTR、pACYC-SA14-M-NS5、pACYC-SA14-M-3’UTR)进行酶切线性化，以用于体外转录。酶切体系为：Cutsmart 10μL、XhoI 2μL、阳性感染性克隆10μg、去离子水补足至100μL。反应条件：37℃水浴2h。

把上一步所得酶切产物，用酚氯仿纯化抽提线性化产物，步骤如下：

a.酶切产物中加入等体积的Tris平衡酚(100μL)，混匀组分，12 000r/min离心5min；

b.小心吸取上层液体于新的Ep管①中，在原Ep管中加入100μL无菌水混匀，12000r/min离心5min；

c.小心吸取上一步中离心后的上层液体与EP管①中液体合并(总体积约200μL)，加入等体积三氯甲烷混匀后，最大速度离心5min；

d.小心吸取上层液体于无菌Ep管②中(约100μL)，加入1/10体积3mol/L NaAc(pH5.2)混匀，再加2.5体积无水乙醇混匀，-20℃沉淀至少30min，最大速度离心5min；

e.弃去上层清液，加入1mL 70％乙醇轻柔洗涤，最大速度离心5min，弃去液体；

f.在超净台中风干30min，用11μL无菌水溶解DNA，置于-20℃保存。

2.体外转录RNA：所得线性化产物使用Ambion公司的T7/SP6 mMESSAGE mMACHINEkit进行体外转录，试验中所用耗材均做了去RNA酶处理。将试剂盒中2×NTP/CAP、10×buffer、GTP以及Water迅速溶解后，置于室温，随后进行体外转录，反应体系如为：2×NTP/CAP 10μL、10×buffer 2μL、GTP 1μL、线性化DNA 1μg、Enzyme Mix 2μL、水补足至20μL。轻敲混匀组分后，瞬时离心，随后置于37℃水浴2h。所得产物中加入1μL Turbo Dnase，混匀后置于37℃水浴15min，随后加入30μL氯化锂，混匀后置于-20℃沉淀不少于30min；之后13000r/min离心15min，小心移去液体，加入1mL 70％无水乙醇轻柔洗涤后，13000r/min离心15min；小心移去液体，于室温风干30min，随后用100μL Nuclease-Free Water溶解RNA。将RNA进行变性胶电泳检测，并分装RNA(1ug/管)置于-80℃保存备用。

3.细胞转染：按照Thermo公司的Lipofectamine^TM2 000Transfection Reagent说明书，将1μg所得RNA产物转染3.8～4.5×10⁵个BHK-21细胞(ATCC)，转染后于37℃二氧化碳培养箱中培养4h，用无血清opiti-MEM换液，于72h后收样后分为两份，一份继续传代，另一份冻存于-80℃，备用。拯救出的病毒分别命名为SA14/U4163、SA14-M-NS5-3’UTR、SA14-M-NS5、SA14-M-3’UTR。

实施例5突变病毒鉴定以及细胞上的生物学特性测定

1.突变病毒的PCR鉴定

将培育传代至第5代突变拯救病毒的DMEM培养液用总RNA抽提试剂盒提取乙型脑炎病毒基因组RNA，反转录提取病毒cDNA，以突变病毒cDNA为模板，参考中华人民共和国国家标准日本乙型脑炎检测方法(GB/T 22333-2008)进行行PCR扩增鉴定是否含有乙型脑炎病毒基因组RNA，所用引物的序列为JD-F和JD-R。PCR反应体系为：Premix rTaq(2×)10μL、JD-F(10μmol/μL)0.5μL、JD-R(10μmol/μL)0.5μL、cDNA 1μL、去离子水补足至20μL。PCR反应条件为：94℃变性4min；94℃20s，55℃20s，72℃4min，进行30个循环，最后在72℃延伸8min。在紫外灯下，观察是否有目标条带(375bp)。

使用引物XbaI-F、M-3’-R2，以突变病毒cDNA为模板，进行PCR反应，反应体系以及条件参照实施例1，获得PCR产物进行凝胶电泳，在紫外灯下，切下目的片段，按GelExtraction Kit的说明书进行琼脂糖凝胶回收。回收产物送至公司测序。

2.突变病毒的增殖曲线测定

将BHK-21细胞均匀铺于12孔细胞板中，待每孔细胞达到80％～90％时，用PBS冲洗细胞2次，随后接种MOI为0.01的突变病毒300μL，对照组不加入病毒液而是加入300μL新鲜DMEM，置于37℃二氧化碳培养箱中1h后，弃去液体，加入新鲜无血清DMEM，置于37℃二氧化碳培养箱培养。待24h、48h、72h时分别收取样品冻存于-80℃，备用。将24h、48h、72h收取样品反复冻融后，收取病毒液。将病毒液按10倍倍比稀释，随后依次接入96孔板的BHK-21细胞中，随后置于37℃二氧化碳培养箱48h后，取出进行免疫组化试验(ICC)。通过ICC试验，测定三个时间点突变病毒的病毒滴度来绘制病毒增殖曲线。将拯救出的病毒SA14-M-NS5-3’UTR、SA14-M-NS5、SA14-M-3’UTR与亲本毒株同时测定病毒增殖曲线，结果如图2示。发现在72h时，SA14-M-NS5-3’UTR病毒滴度明显高于亲本毒株，并且突变毒株在72h时才达到病毒滴度的峰值。而亲本毒株在48h时达到病毒滴度峰值。SA14-M-NS5与亲本毒株相比没有明显变化。

3.突变病毒的复制能力评估

通过检测突变病毒在增殖过程中产生RNA正链与负链的CT值，来比较几株突变病毒的复制能力。将BHK-21细胞均匀铺于12孔细胞板中，待细胞量达到80％～90％，分别接种MOI为0.01的各突变病毒，37℃二氧化碳培养箱培养；分别于14h、20h收取样品，收样时，弃去细胞废液，加入飞捷生物总RNA极速抽提试剂盒中RA 1裂解液200μL/孔对细胞进行裂解2min，吸取裂解后的细胞液至干净的1.5mLEp管随后按说明书进行RNA抽提，得到的RNA样品测定其浓度。

将获得的RNA分别进行正链与负链的特异性反转录，其中反转正链cDNA产物的特异性引物为Nagetive-strand、GAPDH-r；反转负链cDNA产物的特异性引物为Positive-strand、GAPDH-r，反应条件为PCR仪42℃、1h。反转录所得cDNA使用TAKARA公司的TBGreen^TMPremix Ex Taq^TMII进行qPCR检测，JEV正负链检测引物为Positive-strand、Nagetive-strand；内参检测引物为GAPDH-r、GAPDH-f，反应体系与反应条件设置按照说明书进行，其中细胞GAPDH为细胞内参。

对突变病毒第一个复制周期中病毒正链与负链进行qPCR检测，结果如图3所示。发现同时替换NS5₆₄₄位氨基酸和3’UTR基因的SA14-M-NS5-3’UTR病毒在复制初期(14h时)，如图3A、3B所示，负链的产生明显高于亲本毒株和其他突变毒株，而只替换了3’UTR基因的突变毒株，同亲本毒株相比负链减少，但正链产生明显高于亲本毒株和只替换NS5₆₄₄氨基酸的毒株。在20h时，病毒复制情况如图3C、3D所示，病毒复制的正负链情况基本一致，同时替换NS5₆₄₄位氨基酸和3’UTR基因的突变病毒和只替换了3’UTR基因的突变病毒负链与正链均高于其他毒株，同时替换NS5₆₄₄位氨基酸和3’UTR基因的突变病毒复制能力最高。

4.突变病毒颅内攻毒对SPF BALB/c小鼠的致病性研究

(1)突变病毒颅内攻毒对SPF BALB/c小鼠的致病性研究

将SA14/U4163毒株与三株突变拯救病毒SA14-M-NS5-3’UTR、SA14-M-NS5、SA14-M-3’UTR用DMEM稀释至1×10²TCID₅₀/30μL，置于冰上，用微量注射器取30μL病毒稀释液，采用颅内注射方式注射于3周龄SPF BALB/c小鼠脑内。每株病毒感染8只小鼠，其中5只小鼠观察接毒后体重变化，其余3只在攻毒后第5天剖杀；另取5只同批次BALB/c小鼠作为对照组，经颅内注射接种DMEM细胞培养液。将攻毒当天记为0d，连续观察14d，每天观察小鼠的状态并称重。攻毒后第5d每组随机选取3只小鼠取脑、心置于-80℃保存，用于随后的病毒滴度测定。把0d小鼠体重作为初始体重，当攻毒后小鼠的体重下降到初始体重的75％时，视为死亡，将该小鼠安乐死。实验结果如图4所示。

由图4中可以看出，亲本毒株SA14在攻毒后第六天全部死亡，而突变病毒SA14-M-NS5-3’UTR与SA14-M-3’UTR的小鼠存活率均为80％，SA14-M-NS5突变病毒对小鼠不致死(图4A)。对比攻毒后小鼠体重变化情况，突变毒株SA14-M-NS5-3’UTR与SA14-M-3’UTR体重相对与对照组，在第5天之后体重没有明显变化，而SA14-M-NS5毒株对小鼠体重没有影响(图4B)。在攻毒后第5天每组病毒随机剖取三只小鼠，取小鼠脑部研磨后，将病毒液接种BHK-21细胞，用ICC测定脑部病毒滴度。第5天亲本毒株SA14病毒脑部滴度已达到Lg8.5，SA14-M-NS5-3’UTR毒株的脑部病毒滴度次之，稍高于其他两株病毒(图4C)。

(2)突变病毒腹腔攻毒对SPF BALB/c小鼠的致病性研究

SA14/U4163毒株与三株突变病毒SA14-M-NS5-3’UTR、SA14-M-NS5、SA14-M-3’UTR用DMEM稀释至1×10⁷TCID₅₀/200μL，置于冰上，用1mL注射器取200μL病毒稀释液，采用腹腔注射方式注射于3周龄SPF BALB/c小鼠，以研究突变病毒对小鼠的侵袭力。每株病毒感染11只小鼠，其中5只小鼠用于观察小鼠存活及体重变化，其余6只小鼠分别于攻毒后第5天和第7天剖杀；另取5只同批次BALB/c小鼠作为对照组，分别用腹腔注射接种DMEM细胞培养液。将攻毒当天记为0d，连续观察14d，每天观察小鼠的状态并称重。攻毒后第5d、7d每组随机选取3只小鼠取脑、心置于-80℃保存，用于随后的病毒滴度测定。把0d小鼠体重作为初始体重，当攻毒后小鼠的体重下降到初始体重的75％时，视为死亡，将该小鼠安乐死。实验结果如图5所示。

由图5中可以看出，除了亲本毒株SA14在第5天之后出现明显体重下降(图5B)；第8天时出现明显症状，如被毛凌乱、战栗、消瘦，并且于第10天时出现开始死亡(图5A)以外，其他突变毒株对小鼠致病力明显降低，没有出现症状也没有死亡。分别对攻毒后第5天和第7天小鼠随机剖解，除了在亲本毒株SA14脑部检测到病毒，其余毒株均未检到病毒(图5C)。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 华南农业大学

<120> 一种复制性增强的减毒JEV及其制备方法与应用

<160> 14

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 13614

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> pACYC-SA14-M-NS5-3’UTR

<400> 1

acgggataat accgcgccac atagcagaac tttaaaagtg ctcatcattg gaaaacgttc 60

ttcggggcga aaactctcaa ggatcttacc gctgttgaga tccagttcga tgtaacccac 120

tcgtgcaccc aactgatctt cagcatcttt tactttcacc agcgtttctg ggtgagcaaa 180

aacaggaagg caaaatgccg caaaaaaggg aataagggcg acacggaaat gttgaatact 240

catactcttc ctttttcaat attattgaag catttatcag ggttattgtc tcatgagcgg 300

atacatattt gaatgtattt agaaaaataa acaaataggg gttccgcgca catttccccg 360

aaaagtgcca cctgacgtct aagaaaccat tattatcatg acattaacct ataaaaatag 420

gcgtatcacg aggccctttc gtcttcaaga attttataag gtacctaata cgactcacta 480

tagagaagtt tatctgtgtg aacttcttgg cttagtatcg ttgagaagaa tcgagagatt 540

agtgcagttt aaacagtttt ttagaacgga agataaccat gactaaaaaa ccaggagggc 600

ccggtaaaaa ccgggctatc aatatgctga aacgcggcct accccgcgta ttcccactag 660

tgggagtgaa gagggtagta atgagcttgt tggacggcag agggccagta cgtttcgtgc 720

tggctcttat cacgttcttc aagtttacag cattagcccc gaccaaggcg cttttaggcc 780

gatggaaagc agtggaaaag agtgtggcaa tgaaacatct tactagtttc aaacgagaac 840

ttggaacact cattgacgcc gtgaacaagc ggggcagaaa gcaaaacaaa agaggaggaa 900

atgaaggctc aatcatgtgg ctcgcgagct tggcagttgt catagcttgt gcaggagcca 960

tgaagttgtc gaatttccag gggaagcttt tgatgaccat caacaacacg gacattgcag 1020

acgttatcgt gattcccacc tcaaaaggag agaacagatg ctgggtccgg gcaatcgacg 1080

tcggctacat gtgtgaggac actatcacgt acgaatgtcc taagcttacc atgggcaatg 1140

atccagagga tgtggattgc tggtgtgaca accaagaagt ctacgtccaa tatggacggt 1200

gcacgcggac caggcattcc aagcgaagca ggagatccgt gtcggtccaa acacatgggg 1260

agagttcact agtgaataaa aaagaggctt ggctggattc aacgaaagcc acacgatatc 1320

tcatgaaaac tgagaactgg atcataagga atcctggcta tgctttcctg gcggcggtac 1380

ttggctggat gcttggcagt aacaacggtc aacgcgtggt atttaccatc ctcctgctgt 1440

tggtcgctcc ggcttacagt tttaattgtc tgggaatggg caatcgtgac ttcatagaag 1500

gagccagtgg agccacttgg gtggacttgg tgctggaagg agatagctgc ttgacaatca 1560

tggcaaacga caaaccaaca ttggacgtcc gcatgattaa catcgaagct agccaacttg 1620

ctgaggtcag aagttactgc tatcatgctt cagtcactga catctcgacg gtggctcggt 1680

gccccacgac tggagaagcc cacaacgaga agcgagctga tagtagctat gtgtgcaaac 1740

aaggcttcac tgaccgtggg tggggcaacg gatgtggact tttcgggaag ggaagcattg 1800

acacatgtgc aaaattctcc tgcaccagta aagcgattgg gagaacaatc cagccagaaa 1860

acatcaaata cgaagttggc atttttgtgc atggaaccac cacttcggaa aaccatggga 1920

attattcagc gcaagttggg gcgtcccagg cggcaaagtt tacagtaaca cccaatgctc 1980

cttcgataac cctcaaactt ggtgactacg gagaagtcac actggactgt gagccaagga 2040

gtggactgaa cactgaagcg ttttacgtca tgaccgtggg gtcaaagtca tttctggtcc 2100

atagggagtg gtttcatgac ctcgctctcc cctggacgtc cccttcgagc acagcgtgga 2160

gaaacagaga actcctcatg gaatttgaag aggcgcacgc cacaaaacag tccgttgttg 2220

ctcttgggtc acaggaagga ggcctccatc aggcgttggc aggagccatc gtggtggagt 2280

actcaagctc agtgaagtta acatcaggcc acctgaaatg taggctgaaa atggacaaac 2340

tggctctgaa aggcacaacc tatggcatgt gtacagaaaa attctcgttc gcgaaaaatc 2400

cggcggacac tggtcacgga acagttgtca ttgaactctc ctactctggg agtgatggcc 2460

cctgcaaaat tccgattgtt tccgttgcga gcctcaatga catgaccccc gttgggcggc 2520

tggtgacagt gaaccccttc gtcgcgactt ccagtgccaa ctcaaaggtg ctggtcgaga 2580

tggaaccccc cttcggagac tcctacatcg tagttggaag gggagacaag cagatcaacc 2640

accattggca caaagctgga agcacgctgg gcaaggcctt ttcaacaact ttgaagggag 2700

ctcaaagact ggcagcgttg ggcgacacag cctgggactt tggctctatt ggaggggtct 2760

tcaactccat aggaaaagcc gttcaccaag tgtttggtgg tgccttcaga acactctttg 2820

ggggaatgtc ttggatcaca caagggctaa tgggtgccct actgctctgg atgggcgtca 2880

acgcacgaga ccgatcaatt gctttggcct tcttagccac agggggtgtg ctcgtgttct 2940

tagcgaccaa tgtgcatgct gacactggat gtgccattga catcacaaga aaagagatga 3000

gatgtggaag tggcatcttc gtgcacaacg acgtggaagc ctgggtggat aggtataaat 3060

atttgccaga aacgcccaga tccctagcga agatcgtcca caaagcgcac aaggaaggcg 3120

tgtgcggagt cagatctgtc actagactgg agcaccaaat gtgggaagcc gtaagggacg 3180

aattgaacgt cctgctcaaa gagaatgcag tggacctcag tgtggttgtg aacaagcccg 3240

tgggaagata tcgctcagcc cctaaacgcc tatccatgac gcaagagaag tttgaaatgg 3300

gctggaaagc atggggaaaa agcatcctct ttgccccgga attggctaac tccacatttg 3360

tcgtagatgg acctgagaca aaggaatgcc ctgatgagca cagagcttgg aacagcatgc 3420

aaatcgaaga cttcggcttt ggcatcacat caacccgtgt gtggctgaaa attagagagg 3480

agagcactga cgagtgtgat ggagcgatca taggcacggc tgtcaaagga catgtggcag 3540

tccatagtga cttgtcgtac tggattgaga gtcgctacaa cgacacatgg aaacttgaga 3600

gggcagtctt tggagaggtc aaatcttgca cttggccaga gacacacacc ctttggggag 3660

atgatgttga ggaaagtgaa ctcatcattc cgcacaccat agccggacca aaaagcaagc 3720

acaatcggag ggaagggtat aagacacaaa accagggacc ttgggatgag aatggcatag 3780

tcttggactt tgattattgc ccagggacaa aagtcaccat tacagaggat tgtagcaaga 3840

gaggcccttc ggtcagaacc actactgaca gtggaaagtt gatcactgac tggtgctgtc 3900

gcagttgctc ccttccgccc ctacgattcc ggacagaaaa tggctgctgg tacggaatgg 3960

aaatcagacc tgttaggcat gatgaaacaa cactcgtcag atcacaggtt gatgctttca 4020

atggtgaaat ggttgaccct tttcagctgg gccttctggt gatgtttctg gccacccagg 4080

aggtccttcg caagaggtgg acggccagat tgaccattcc tgcggttttg ggggccctac 4140

ttgtgctgat gcttgggggc atcacttaca ctgatttggc gaggtatgtg gtgctagtcg 4200

ctgctgcttt cgcagaggcc aacagtggag gagacgtcct gcaccttgct ttgattgccg 4260

tttttaagat ccaaccagca tttctagtga tgaacatgct tagcacgaga tggacgaacc 4320

aagaaaacgt ggttctggtc ctaggggctg cctttttcca attggcctca gtagatctgc 4380

aaataggagt ccacggaatc ctgaatgccg ccgctatagc atggatgatt gtccgagcga 4440

tcaccttccc cacaacctcc tccgtcacca tgccagtctt agcgcttcta actccgggga 4500

tgagggctct atacctagac acttacagaa tcatcctcct cgtcataggg atttgctccc 4560

tgctgcacga gaggaaaaag accatggcaa aaaagaaagg agctgtactc ttgggcttag 4620

cgctcacatc cactggatgg ttctcgccca ccactatagc tgccggacta atggtctgca 4680

acccaaacaa gaagagaggg tggccagcta ctgagttttt gtcggcagtt ggattgatgt 4740

ttgccatcgt aggtggtttg gccgagttgg atattgaatc catgtcaata cccttcatgc 4800

tggcaggtct catggcagtg tcctacgtgg tgtcaggaaa agcaacagat atgtggcttg 4860

aacgggccgc cgacatcagc tgggagatgg atgctgcaat cacaggaagc agtcggaggc 4920

tggatgtgaa actggatgat gacggagatt ttcacttgat tgatgatccc ggtgttccat 4980

ggaaggtctg ggtcctgcgc acgtcttgca ttggcttagc cgccctcacg ccttgggcca 5040

tcgttcccgc cgctttcggt tattggctca ctttaaaaac aacaaaaaga gggggcgtgt 5100

tttgggacac gccatcccca aaaccttgct caaaaggaga caccactaca ggagtctacc 5160

gaattatggc tagagggatt cttggcactt accaggccgg cgtcggagtc atgtacgaga 5220

atgttttcca cacactatgg cacacaacta gaggagcagc cattatgagt ggagaaggaa 5280

aattgacgcc atactggggt agtgtgagag aagaccgcat agcttacgga ggcccatgga 5340

ggtttgaccg aaaatggaat ggaacagatg acgtgcaagt gatcgtggta gaaccgggga 5400

aggctgcagt aaacatccag acaaaaccag gagtgtttcg gactcccttc ggggaggttg 5460

gggctgttag tctggattac ccgcgaggaa catccggctc acccattctg gattccaatg 5520

gagacattat aggcctatac ggcaatggag ttgagcttgg cgatggctca tacgtcagcg 5580

ccatcgtgca gggtgaccgt caggaggaac cagtcccaga agcttacacc ccaaacatgt 5640

tgagaaagag acagatgact gtgctagatt tgcaccctgg ttcagggaaa accaggaaaa 5700

ttctgccaca aataattaag gacgccatcc agcagcgcct aagaacagct gtgttggcac 5760

cgacgcgggt ggtagcagca gaaatggcag aagctttgag agggctccca gtacgatatc 5820

aaacttcagc agtgcagaga gagcaccaag ggaatgaaat agtggatgtg atgtgccacg 5880

ccactctgac ccatagactg atgtcaccga acagagtgcc caactacaac ctatttgtca 5940

tggatgaagc tcatttcacc gacccagcca gtatagccgc acgaggatac attgctacca 6000

aggtggaatt aggggaggca gcagccatct ttatgacagc gaccccgcct ggaaccacgg 6060

atccttttcc tgactcaaat gccccaatcc atgatttgca agatgagata ccagacaggg 6120

catggagcag tggatacgaa tggatcacag aatatgcggg taaaaccgtg tggtttgtgg 6180

cgagcgtaaa aatggggaat gagattgcaa tgtgcctcca aagagcgggg aaaaaggtca 6240

tccaactcaa ccgcaagtcc tatgacacag aatacccaaa atgtaagaat ggagactggg 6300

attttgtcat taccaccgac atctctgaaa tgggggccaa cttcggtgcg agcagggtca 6360

tcgactgtag aaagagcgtg aaacccacca tcttagaaga gggagaaggc agagtcatcc 6420

tcggaaaccc atctcccata accagtgcaa gcgcagctca acggaggggc agagtaggca 6480

gaaaccccaa ccaagttgga gatgaatacc actatggggg ggctaccagt gaagatgaca 6540

gtaacctagc ccattggaca gaggcaaaga tcatgttaga caacatacac atgcccaatg 6600

gactggtggc ccagctctat ggaccagaga gggaaaaggc tttcacaatg gatggcgaat 6660

accgtctcag aggtgaagaa aagaaaaact tcttagagct gcttaggacg gctgacctcc 6720

cggtgtggct ggcctacaag gtggcgtcca atggcattca gtacaccgac agaaagtggt 6780

gttttgatgg gccgcgtacg aatgccatac tggaggacaa caccgaggta gagatagtca 6840

cccggatggg tgagaggaaa atcctcaagc cgagatggct tgatgcaaga gtttatgcag 6900

atcaccaagc cctcaagtgg ttcaaagact ttgcagcagg gaagagatca gccgttagct 6960

tcatagaggt gctcggtcgc atgcctgagc atttcatggg aaagacgcgg gaagctttag 7020

acaccatgta cttggttgca acggctgaga aaggtgggaa agcacaccga atggctctcg 7080

aagagctgcc agatgcactg gaaaccatca cacttattgt cgccattact gtgatgacag 7140

gaggattctt cctactaatg atgcagcgaa agggtatagg gaggatgggt cttggagctc 7200

tagtgctcac gctagctacc ttcttcctgt gggcggcaga ggttcctgga accaaaatag 7260

cagggaccct gctgatcgcc ctgctgctga tggtggttct catcccagaa ccggaaaaac 7320

agaggtcaca gacagataac caactggcgg tgtttctcat ctgtgtcttg accgtggttg 7380

gagtggtggc agcaaacgag tacgggatgc tagaaaaaac caaagcagat ctcaagagca 7440

tgtttggcgg aaagacgcag gcatcaggac tgactggatt gccaagcatg gcactggacc 7500

tgcgtccagc cacagcctgg gcactgtatg gggggagcac agtcgtgcta acccctcttc 7560

tgaagcacct gatcacgtcg gaatacgtca ccacatcgct agcctcaatt aactcacaag 7620

ctggctcatt attcgtcttg ccacgaggcg tgccttttac cgacctagac ttgaccgttg 7680

gcctcgtctt ccttggctgt tggggtcaaa tcaccctcac aacgtttctg acagccatgg 7740

ttctggcgac acttcactat gggtacatgc tccctggatg gcaagcagaa gcactcaggg 7800

ctgcccagag aaggacagcg gctggaataa tgaagaatgc cgttgttgac ggaatggtcg 7860

ccactgatgt gcctgaactg gaaaggacta ctcctctgat gcaaaagaaa gtcggacagg 7920

tgctcctcat aggggtaagc gtggcagcgt tcctcgtcaa ccctaatgtc accactgtga 7980

gagaagcagg ggtgttggtg acggcggcta cgcttacttt gtgggacaat ggagccagtg 8040

ccgtttggaa ttccaccaca gccacgggac tctgccatgt catgcgaggt agctacctgg 8100

ctggaggctc cattgcttgg actctcatca agaacgctga taagccctcc ttgaaaaggg 8160

gaaggcctgg gggcaggacg ctaggggagc agtggaagga aaaactaaat gccatgagca 8220

gagaagagtt ttttaaatac cggagagagg ccataatcga ggtggaccgc actgaagcac 8280

gcagggccag acgtgaaaat aacatagtgg gaggacatcc ggtttcgcga ggctcagcaa 8340

aactccgttg gctcgtggag aaaggatttg tctcgccaat aggaaaagtc attgatctag 8400

ggtgtgggcg tggaggatgg agctactacg cagcaaccct gaagaaggtc caggaagtca 8460

gaggatacac gaaaggtggg gcgggacatg aagaaccgat gctcatgcag agctacggct 8520

ggaacctggt ctccctgaag agtggagtgg acgtgtttta caaaccttca gagcccagtg 8580

acaccctgtt ctgtgacata ggggaatcct ccccaagtcc agaagtagaa gaacaacgca 8640

cactacgcgt cctagagatg acatctgact ggttgcaccg aggacctaga gagttctgca 8700

ttaaagttct ctgcccttac atgcccaagg ttatagaaaa aatggaagtt ctgcagcgcc 8760

gcttcggagg tgggctagtg cgtctccccc tgtcccgaaa ctccaatcac gagatgtatt 8820

gggttagtgg agccgctggc aatgtggtgc acgctgtgaa catgaccagc caggtactac 8880

tggggcgaat ggatcgcaca gtgtggagag ggccaaagta tgaggaagat gtcaacctag 8940

ggagcggaac aagagccgtg ggaaagggag aagtccatag caatcaggag aaaatcaaga 9000

agagaatcca gaagcttaaa gaagaattcg ccacaacgtg gcacaaagac cctgagcatc 9060

cataccgcac ttggacatac cacggaagct atgaagtgaa ggctactggc tcagccagct 9120

ctctcgtcaa cggagtggtg aagctcatga gcaaaccttg ggacgccatt gccaacgtca 9180

ccaccatggc catgactgac accacccctt ttggacagca aagagttttc aaggagaaag 9240

ttgacacgaa ggctcctgag ccaccagctg gagccaagga agtgctcaac gagaccacca 9300

actggctgtg ggcccacttg tcacgggaaa aaagaccccg cttgtgcacc aaggaagaat 9360

tcataaagaa agtcaacagc aacgcggctc ttggagcagt gttcgctgaa cagaatcaat 9420

ggagcacggc gcgtgaggct gtggatgacc cgcggttttg ggagatggtt gatgaagaga 9480

gggaaaacca tctgcgagga gagtgtcaca catgtatcta caacatgatg ggaaaaagag 9540

agaagaagcc tggagagttt ggaaaagcta aaggaagcag ggccatttgg ttcatgtggc 9600

ttggagcacg gtatctagag tttgaagctt tggggttcct gaatgaagac cattggctga 9660

gccgagagaa ttcaggaggt ggagtggaag gctcaggcgt ccaaaagctg ggatacatcc 9720

tccgtgacat agcaggaaag caaggaggga aaatgtacgc tgatgacacc gccggatggg 9780

acactagaat taccagaact gatttagaaa atgaagctaa ggtgctggag ctcctagacg 9840

gtgaacaccg catgctcgcc cgagccataa ttgaactgac ttacaggcac aaagtggtca 9900

aggtcatgag acctgcagca gaaggaaaga ccgtaatgga cgtgatatca agagaagatc 9960

aaagggggag tggacaggtg gtcacttatg cccttaacac tttcacgaac atcgctgtcc 10020

agctcgtcag gctgatggag gctgaggggg tcattggacc acaacacttg gaacagctac 10080

ctagaaaaac caagatagct gtcaggacct ggctctttga gaatggagag gagagagtga 10140

ccaggatggc gatcagcgga gacgactgtg tcgtcaagcc gctggacgac agattcgcca 10200

cagccctcca cttcctcaac gcaatgtcaa aggtcagaaa agacatccag gaatggaagc 10260

cttcgcatgg ctggcacgac tggcagcaag ttcccttctg ctctaaccat tttcaggaga 10320

ttgtgatgaa agatggaagg agtatagttg tcccgtgcag aggacaggat gagctgatag 10380

gcagggctcg catctctcca ggagctggat ggaatgtgaa ggacacagct tgcctggcca 10440

aagcatatgc acagatgtgg ctactcctat acttccatcg tagggacttg cgtctcatgg 10500

caaatgcgat ttgctcagca gtgccagtgg attgggtgcc cacaggcagg acgtcctggt 10560

caatacactc gaaaggagag tggatgacca cggaagacat gctgcaggtc tggaacagag 10620

tctggattga agaaaatgaa tggatgatgg acaagactcc aatcacaagc tggacagacg 10680

ttccgtatgt gggaaagcgt gaggacatct ggtgtggtag cctcatcgga acgcgatcca 10740

gagcaacctg ggctgagaac atctatgcgg cgataaacca ggttagagct gtcattggga 10800

aagaaaatta tgttgactac atgacctcac tcaggagata cgaagacgtc ttgatccagg 10860

aagacagggt catctagtgt gatttaaggt agaaaagtag actatgtaaa taatgtaaat 10920

gagaaaatgc atgcatatgg agtcaggcca gcaaaagctg ccaccggata ctgggtagac 10980

ggtgctgcct gcgtctcagt cccaggagga ctgggttaac aaatctgaca acagaaagtg 11040

agaaagccct cagaaccgtc tcggaagtag gtccctgctc actggaagtt gaaagaccaa 11100

cgtcaggcca caaatttgtg ccaccccgct ggggggtgcg gcctgcgcag ccccaggagg 11160

actgggttac caaagccgtt gaggccccca cggcccaagc ctcgtctagg atgcaataga 11220

cgaggtgtaa ggactagagg ttagaggaga ccccgtggaa acaacaacat gcggcccaag 11280

ccccctcgaa gctgtagagg aggtggaagg actagaggtt agaggagacc ccgcatttgc 11340

atcaaacagc atattgacac ctgggaatag actgggagat cttctgctct atctcaacat 11400

cagctactag gcacagagcg ccgaagtatg tagctggtgg tgaggaagaa cacaagatct 11460

gggtcggcat ggcatctcca cctcctcgcg gtccgacctg ggctacttcg gtaggctaag 11520

ggagaagaac ttgtttattg cagcttataa tggttacaaa taaagcaata gcatcacaaa 11580

tttcacaaat aaagcatttt tttcactgca ttctagttgt ggtttgtcca aactcatcaa 11640

tgtatcttat catgtctctc gagcaagacg tttcccgttg aatatggctc ataacacccc 11700

ttgtattact gtttatgtaa gcagacagtt ttattgttca tgatgatata tttttatctt 11760

gtgcaatgta acatcagaga ttttgagaca caacgtggct ttgttgaata aatcgaactt 11820

ttgctgagtt gaaggatcag atcacgcatc ttcccgacaa cgcagaccgt tccgtggcaa 11880

agcaaaagtt caaaatcacc aactggtcca cctacaacaa agctctcatc aaccgtggct 11940

ccctcacttt ctggctggat gatggggcga ttcaggcctg gtatgagtca gcaacacctt 12000

cttcacgagg cagacctcag cgctagcgga gtgtatactg gcttactatg ttggcactga 12060

tgagggtgtc agtgaagtgc ttcatgtggc aggagaaaaa aggctgcacc ggtgcgtcag 12120

cagaatatgt gatacaggat atattccgct tcctcgctca ctgactcgct acgctcggtc 12180

gttcgactgc ggcgagcgga aatggcttac gaacggggcg gagatttcct ggaagatgcc 12240

aggaagatac ttaacaggga agtgagaggg ccgcggcaaa gccgtttttc cataggctcc 12300

gcccccctga caagcatcac gaaatctgac gctcaaatca gtggtggcga aacccgacag 12360

gactataaag ataccaggcg tttccccctg gcggctccct cgtgcgctct cctgttcctg 12420

cctttcggtt taccggtgtc attccgctgt tatggccgcg tttgtctcat tccacgcctg 12480

acactcagtt ccgggtaggc agttcgctcc aagctggact gtatgcacga accccccgtt 12540

cagtccgacc gctgcgcctt atccggtaac tatcgtcttg agtccaaccc ggaaagacat 12600

gcaaaagcac cactggcagc agccactggt aattgattta gaggagttag tcttgaagtc 12660

atgcgccggt taaggctaaa ctgaaaggac aagttttggt gactgcgctc ctccaagcca 12720

gttacctcgg ttcaaagagt tggtagctca gagaaccttc gaaaaaccgc cctgcaaggc 12780

ggttttttcg ttttcagagc aagagattac gcgcagacca aaacgatctc aagaagatca 12840

tcttattaag gggtctgacg ctcagtggaa cgaaaactca cgttaaggga ttttggtcat 12900

gagattatca aaaaggatct tcacctagat ccttttaaat taaaaatgaa gttttaaatc 12960

aatctaaagt atatatgagt aaacttggtc tgacagttac caatgcttaa tcagtgaggc 13020

acctatctca gcgatctgtc tatttcgttc atccatagtt gcctgactcc ccgtcgtgta 13080

gataactacg atacgggagg gcttaccatc tggccccagt gctgcaatga taccgcgaga 13140

cccacgctca ccggctccag atttatcagc aataaaccag ccagccggaa gggccgagcg 13200

cagaagtggt cctgcaactt tatccgcctc catccagtct attaattgtt gccgggaagc 13260

tagagtaagt agttcgccag ttaatagttt gcgcaacgtt gttgccattg ctgcaggcat 13320

cgtggtgtca cgctcgtcgt ttggtatggc ttcattcagc tccggttccc aacgatcaag 13380

gcgagttaca tgatccccca tgttgtgcaa aaaagcggtt agctccttcg gtcctccgat 13440

cgttgtcaga agtaagttgg ccgcagtgtt atcactcatg gttatggcag cactgcataa 13500

ttctcttact gtcatgccat ccgtaagatg cttttctgtg actggtgagt actcaaccaa 13560

gtcattctga gaatagtgta tgcggcgacc gagttgctct tgcccggcgt caac 13614

<210> 2

<211> 1884

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> M-NS5-3’UTR

<400> 2

catttggttc atgtggcttg gagcacggta tctagagttt gaagctttgg ggttcctgaa 60

tgaagaccat tggctgagcc gagagaattc aggaggtgga gtggaaggct caggcgtcca 120

aaagctggga tacatcctcc gtgacatagc aggaaagcaa ggagggaaaa tgtacgctga 180

tgacaccgcc ggatgggaca ctagaattac cagaactgat ttagaaaatg aagctaaggt 240

gctggagctc ctagacggtg aacaccgcat gctcgcccga gccataattg aactgactta 300

caggcacaaa gtggtcaagg tcatgagacc tgcagcagaa ggaaagaccg taatggacgt 360

gatatcaaga gaagatcaaa gggggagtgg acaggtggtc acttatgccc ttaacacttt 420

cacgaacatc gctgtccagc tcgtcaggct gatggaggct gagggggtca ttggaccaca 480

acacttggaa cagctaccta gaaaaaccaa gatagctgtc aggacctggc tctttgagaa 540

tggagaggag agagtgacca ggatggcgat cagcggagac gactgtgtcg tcaagccgct 600

ggacgacaga ttcgccacag ccctccactt cctcaacgca atgtcaaagg tcagaaaaga 660

catccaggaa tggaagcctt cgcatggctg gcacgactgg cagcaagttc ccttctgctc 720

taaccatttt caggagattg tgatgaaaga tggaaggagt atagttgtcc cgtgcagagg 780

acaggatgag ctgataggca gggctcgcat ctctccagga gctggatgga atgtgaagga 840

cacagcttgc ctggccaaag catatgcaca gatgtggcta ctcctatact tccatcgtag 900

ggacttgcgt ctcatggcaa atgcgatttg ctcagcagtg ccagtggatt gggtgcccac 960

aggcaggacg tcctggtcaa tacactcgaa aggagagtgg atgaccacgg aagacatgct 1020

gcaggtctgg aacagagtct ggattgaaga aaatgaatgg atgatggaca agactccaat 1080

cacaagctgg acagacgttc cgtatgtggg aaagcgtgag gacatctggt gtggtagcct 1140

catcggaacg cgatccagag caacctgggc tgagaacatc tatgcggcga taaaccaggt 1200

tagagctgtc attgggaaag aaaattatgt tgactacatg acctcactca ggagatacga 1260

agacgtcttg atccaggaag acagggtcat ctagtgtgat ttaaggtaga aaagtagact 1320

atgtaaataa tgtaaatgag aaaatgcatg catatggagt caggccagca aaagctgcca 1380

ccggatactg ggtagacggt gctgcctgcg tctcagtccc aggaggactg ggttaacaaa 1440

tctgacaaca gaaagtgaga aagccctcag aaccgtctcg gaagtaggtc cctgctcact 1500

ggaagttgaa agaccaacgt caggccacaa atttgtgcca ccccgctggg gggtgcggcc 1560

tgcgcagccc caggaggact gggttaccaa agccgttgag gcccccacgg cccaagcctc 1620

gtctaggatg caatagacga ggtgtaagga ctagaggtta gaggagaccc cgtggaaaca 1680

acaacatgcg gcccaagccc cctcgaagct gtagaggagg tggaaggact agaggttaga 1740

ggagaccccg catttgcatc aaacagcata ttgacacctg ggaatagact gggagatctt 1800

ctgctctatc tcaacatcag ctactaggca cagagcgccg aagtatgtag ctggtggtga 1860

ggaagaacac aagatctggg tcgg 1884

<210> 3

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> XbaI-F

<400> 3

catttggttc atgtggcttg gagcacggta 30

<210> 4

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> WH-HDVr-F

<400> 4

actaggcaca gagcgccgaa gta 23

<210> 5

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> pACYC-full4

<400> 5

attcaacggg aaacgtcttg ctcga 25

<210> 6

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> NS5-R

<400> 6

cttaaatcac actagatgac cctgtcttcc 30

<210> 7

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 3’UTR-F

<400> 7

gggtcatcta gtgtgattta aggtagaaaa 30

<210> 8

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> M-3’-R2

<400> 8

ccgacccaga tcttgtgttc ttcctcacca 30

<210> 9

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> JD-F

<400> 9

cattccaagc gaagcaggag atcc 24

<210> 10

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> JD-R

<400> 10

gacgtccaat gttggtttgt cg 22

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> Positive-strand

<400> 11

tcgggaaggg aagcattgac 20

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> Nagetive-strand

<400> 12

ctgtaaactt tgccgcctgg 20

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> GAPDH-f

<400> 13

aaggccatca ccatcttcca 20

<210> 14

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> GAPDH-r

<400> 14

gccagtagac tccacaacat ac 22

Claims (7)

1.一种复制性增强的减毒JEV，其特征在于：所述的复制性增强的减毒JEV的核苷酸序列，为SEQ ID NO. 1所示序列的第484～11460位所示的序列。

2.一种复制性增强的减毒JEV感染性克隆，其特征在于：包含权利要求1所述的复制性增强的减毒JEV的基因组RNA的cDNA序列。

3.根据权利要求2所述的复制性增强的减毒JEV感染性克隆，其特征在于：还包含多酶切位点序列、启动子序列和SV40 poly(A)序列中的至少一种。

4.一种复制性增强的减毒JEV感染性克隆，其特征在于：其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。

5.用权利要求4所述的复制性增强的减毒JEV感染性克隆所拯救的复制性增强的减毒JEV。

6.权利要求1所述的复制性增强的减毒JEV在制备预防乙型脑炎疫苗或治疗乙型脑炎药物中的应用。

7.权利要求2、3、4所述的复制性增强的减毒JEV感染性克隆在制备预防乙型脑炎疫苗或治疗乙型脑炎药物中的应用。

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