CN112063620A - 抑制猪流行性腹泻病毒M基因表达的shRNA - Google Patents

抑制猪流行性腹泻病毒M基因表达的shRNA Download PDF

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Abstract

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种用于抑制PEDV M基因表达的shRNA。本发明要解决的技术问题为猪流行性腹泻病毒变异多、增殖快、防疫困难。解决该问题的技术方案是提供一种用于抑制抑制PEDV复制的shRNA。该shRNA针对的靶点序列为：5’‑GCCAAGGCCACTACAACAATT‑3’。本发明shRNA能显著抑制M基因表达，从而抑制PEDV病毒的复制，具有广阔的应用前景。

Description

抑制猪流行性腹泻病毒M基因表达的shRNA
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种用于抑制PEDV M基因表达的shRNA。
背景技术
猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)引起的猪流行性腹泻(PED) 是一种以急性肠炎、呕吐和严重水样腹泻为特征的破坏性疾病，传染性极强。给全球生猪产业带来巨大的威胁和巨大的经济损失。PEDV的M基因在各种毒株之间保守性较高，全长681bp，分子量为27ku-32ku。作为组成病毒的表面结构蛋白，在病毒组装过程中发挥着非常重要的功能。有研究表明，M蛋白可以与M蛋白自身、N蛋白以及S蛋白相互作用。在感染PEDV的细胞中，病毒的M基因呈高表达，且对病毒的复制起着非常重要的作用。
RNA干扰在抵抗病毒入侵过程中起着十分重要的作用。基因沉默机制通常为小干扰 RNA或者短发夹RNA诱导实现靶mRNA降解，或者由小RNA抑制特定mRNA翻译。
研究表明,细胞为保护自身基因免受损害，如病毒入侵或转座子插入而采取基因沉默这一调节机制，目的是使入侵的外源基因失活，而不影响自身基因的表达，因此有学者称RNA 干扰为基因组的"免疫系统"。Shlomai以乙型肝炎(HBV)X区和核心区为靶点，构建siRNA 表达质粒pSUPER x和pSUPER core，将质粒分别导入HBV感染细胞后，发现能显著而特异性降低X蛋白和核心蛋白的表达水平(Shlomai,A.,and Shaul,Y.(2003).Inhibitionof hepatitis B virus expression and replication by RNAinterference.Hepatology(Baltimore,Md)37, 764-770.)。这表明，RNAi可以作为抗病毒的有力武器。尽管如此，RNAi最后要成为临床治疗的一种有效手段仍面临一些问题，比如siRNA稳定性的问题。体外合成siRNA虽然简单，但导入的siRNA易被RNase降解，且转染以瞬时表达为主。
发明内容
本发明的目的在于解决现有技术中猪流行性腹泻病毒变异多、增殖快、防疫困难的技术问题。
本发明解决这一技术问题的技术方案是提供一种用于抑制抑制PEDV复制的shRNA。该shRNA针对的靶点序列为：5’-GCCAAGGCCACTACAACAATT-3’(SEQ ID NO.1)。
进一步的，所述shRNA的正义链或反义链的DNA序列如下所示：
正义链(SEQ ID NO.2)：
5’-AAGGTATATTGCTGTTGACAGTGAGCGCGCCAAGGCCACTACAACAATTTAG TGAAGCCACAGATGTAAATTGTTGTAGTGGCCTTGGCTTGCCTACTGCCTCG-3’；
反义链(SEQ ID NO.3)：
5’-CGAGGCAGTAGGCAAGCCAAGGCCACTACAACAATTTACATCTGTGGCTTCA CTAAATTGTTGTAGTGGCCTTGGCGCGCTCACTGTCAACAGCAATATACCTT-3’。
本发明还提供了上述的shRNA在制备用于抑制PEDV药物中的用途。
本发明也提供了一种重组载体，其含有上述的用于抑制PEDV M基因表达的shRNA。进一步的，上述的重组载体基于miR30骨架构建而成。
本发明也提供了上述的重组载体在制备用于抑制PEDV复制的药物中的用途。
本发明还提供一种慢病毒，其含有上述的用于抑制PEDV M基因表达的shRNA。
进一步的，上述慢病毒其载体为含miR30骨架的载体。
本发明也提供上述的慢病毒在制备用于抑制PEDV M基因表达的药物中的用途。
进一步的，本发明还提供了制备上述慢病毒的方法，包括如下步骤：
a、合成针对PEDV M基因的shRNA，并添加酶切位点，正义链及反义链DNA序列如下所示：
正义链：
5’-TCGAGAAGGTATATTGCTGTTGACAGTGAGCGCGCCAAGGCCACTACAACAATTT AGTGAAGCCACAGATGTAAATTGTTGTAGTGGCCTTGGCTTGCCTACTGCCTCGG-3’ (SEQ ID NO.4)
反义链：
5’-AATTCCGAGGCAGTAGGCAAGCCAAGGCCACTACAACAATTTACATCTGTGGCTT CACTAAATTGTTGTAGTGGCCTTGGCGCGCTCACTGTCAACAGCAATATACCTTC-3’ (SEQ ID NO.5)；
b、将等量的正义链和反义链DNA混合，进行退火，形成DNA双链，得到shRNA模板；
c、用XhoI和EcoRI双酶切pPRIME-CMV-Neo-FF3载体，得到线性化载体；
d、将步骤2)中的shRNA模板与步骤3)中线性化的载体进行连接，得到重组质粒；
e、将上述重组质粒同pMD2.G和psPAX2通过lipofectamin2000共转染293T细胞，通过病毒空斑纯化，包装成完整病毒颗粒并进行收集。
本发明的有益效果在于：与现有技术相比，本发明shRNA及相应的shRNA表达质粒可以解决现有基因治疗技术的靶向性、安全性、整合效率等方面还不够理想的问题，能显著抑制M基因表达，从而抑制PEDV病毒的复制，具有广阔应用前景。
附图说明
图1、实施例2中以cDNA为模板，鉴定单克隆细胞的验证结果。
图2、实施例3中荧光定量检测shRNA干扰质粒对M基因转录水平上的抑制作用结果。
具体实施方式
以下是对本发明的一个具体实施方式进行描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制，实施例中涉及的试剂均能通过公共渠道获得。
实施例1含有抑制猪流行性腹泻病毒shRNA的获取
从NCBI提供全基因组RNA序列的360个PEDV毒株中选择了其中有代表性的234条，将其E、M、N基因的编码序列逐一截取下来得到“E、M、N基因片段”后，用AlignX对这些“E、M、N基因片段”进行比对，结果我们发现在M基因与N基因中存在相对较多的长片段保守序列，最长的保守序列片段可达38bp。再在备选靶序列中优选得到针对M基因的靶序列GCCAAGGCCACTACAACAATT。随后进行shRNA设计，人工合成干扰片段。经验证，在所有毒株之间，它的coverage达到了99.7％。
本发明的抑制猪流行性腹泻病毒的干扰序列的DNA序列为：
正义链:
5’-TCGAGAAGGTATATTGCTGTTGACAGTGAGCGCGCCAAGGCCACTACAACAAT TTAGTGAAGCCACAGATGTAAATTGTTGTAGTGGCCTTGGCTTGCCTACTGCCTCGG-3’，如SEQ ID NO.4所示。
反义链：
5’-AATTCCGAGGCAGTAGGCAAGCCAAGGCCACTACAACAATTTACATCTGTGGC TTCACTAAATTGTTGTAGTGGCCTTGGCGCGCTCACTGTCAACAGCAATATACCTTC-3’，如SEQ ID NO.5所示。
上述正义链及反义链包含酶切位点、前导序列、后导序列以及shRNA序列，靶序列为： GCCAAGGCCACTACAACAATT，其中TAGTGAAGCCACAGATGTA为loop结构。是分别在SEQ IDNO.2、SEQ ID NO.3所示序列的两端加入了XhoI酶切位点、EcoRI酶切位点所得；
根据上述干扰序列，制备能够抑制猪流行性腹泻病毒的shRNA表达质粒。
S1、人工合成上述干扰序列(生工生物工程股份有限公司(上海))；
S2、配制反应体系：0.5ug/mL的Top strand与Bottom strand各20uL，Annealingbuffer(5×)10uL。该反应体系退火得到双链shRNA；
S2中退火温度为：95℃5min,80℃10min,5-7h ramp from 80℃to 4℃(-0.5℃every 2.5min)；
S3、配制20uL反应体系：2uL的10x Buffer、1uL的XhoI、1uL的EcoRI、2uL的表达载体、 14uL的H2O；该反应体系于37℃孵育4h，得到线性化表达载体；其中，表达载体的浓度为600ng/uL； S3中表达载体为载体pPRIME-CMV-Neo-FF3(Addgene plasmid#11665)；
S4、配制20uL反应体系：1uL的双链shRNA序列、100ng的线性化表达载体、2uL的ligase buffer、1uL的T4 DNA Ligase、剩余用ddH2O补齐至20uL，反应条件为22℃过夜连接。转化并制备质粒DNA，测序验证正确，质粒命名为pPRIME-CMV-Neo-PEDV-shRNA-M。
实施例2含有抑制猪流行性腹泻病毒shRNA的Vero E6细胞的制备
主要试剂：大肠杆菌菌株DH5α、限制性内切酶XhoI和EcoRI、、T4连接酶、质粒DNA抽提试剂盒、凝胶回收试剂盒、琼脂糖、琼脂粉、DNA ladder、DMEM+10％FBS、Trypsin-EDTASolution(0.25％Trypsin-EDTA,Gibco)、细胞培养孔板、DEPC处理的枪头及EP管、TrizolReagent、异丙醇(分析纯)、三氯甲烷(分析纯)、DEPC-H2O、Reverse Transcriptase、QPCRmix。
(1)细胞培养
细胞在含有10％胎牛血清以及1％双抗的高糖DMEM细胞培养液中，于37℃，5％CO2培养箱中进行培养。细胞生长密度达到90％时，按照1：3的比例进行传代培养。
(2)构建稳转细胞系
细胞与质粒：Vero-E6细胞、干扰载体pPRIME-CMV-Neo-PEDV-shRNA-M
实验方法：NCBI上下载PEDV的E、M、N序列，筛选出保守序列作为备选靶序列，最后确认靶序列为：GCCAAGGCCACTACAACAATT。根据shRNA设计的一般原则进行设计，人工合成干扰片段(参见实施例1)，并且按照实施例1中的方法构建shRNA表达质粒。
其中，制备好线性化表达载体后对该产物进行琼脂糖凝胶电泳检测酶切效果，将目的条带切胶回收。
转化(感受态细胞：DH5α)：将构建的表达质粒转化至氯霉素抗性平板，37℃培养过夜后挑菌，37℃220r/min摇菌16h。收集菌液测序以验证阳性克隆，进行高纯度质粒抽提。
将表达质粒包装成慢病毒，具体为将上述重组质粒同pMD2.G和psPAX2通过lipofectamin2000共转染293T细胞，通过病毒空斑纯化，包装成完整病毒颗粒并进行收集纯化。由上海吉凯基因化学技术有限公司完成。
在24孔板中培养Vero E6细胞，待汇合度达到50％左右时，用纯化好的慢病毒通过直接加入到培养基中感染Vero E6细胞，MOI＝5。3)慢病毒感染后4h、10h分别观察细胞。感染后24h 以内更换为新的不含慢病毒的培养基。感染2天后开始添加终浓度为1000ug/mLG418。筛选14 天后挑取单克隆细胞。
使用表1中的跨Neo基因及miR30的引物进行DNA水平的鉴定。经鉴定，得到慢病毒成功侵染的细胞株(结果参见图1)。
表1、DNA水平鉴定的引物
名称 序列(5'→3')
NeomiR30-F1 F：GCAGGATCTCCTGTCATCTCACCTTG(SEQ IDNO.6)
NeomiR30-R1 R：CCAAGATGTGCAGGCAACGATTCT(SEQ IDNO.7)
NeomiR30-F2 F：GCAGCTGTGCTCGACGTTGT(SEQ IDNO.8)
NeomiR30-R3 R：GCTCGAGCCTTCTGTTGGGT(SEQ IDNO.9)
实施例3本发明shRNA抗PEDV感染和复制的实验
1、shRNA稳定转染的Vero-E6细胞上对PEDV复制的抑制
细胞、以及病毒：稳转shRNA质粒的Vero-E6细胞、猪流行性腹泻病毒经典毒株CV777(中国农业大学动物科技学院库存毒株)。
主要试剂：高糖DMEM、特级胎牛血清、胰酶、双抗(青霉素、链霉素)、PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(大连宝生物技术有限公司)
(1)PEDV接种
将稳转细胞系与正常Vero-E6细胞按照MOI＝1分别接种CV777。接毒后48h观察细胞变化。
(2)实时定量PCR试验检测病毒mRNA表达
用TRIzol裂解法提取细胞总RNA。在六孔板中加入1mLTRIzol，反复吹打吸取液体至 1.5mL EP管中静置5min，加入200uL氯仿混合均匀静置2min，4℃、10000rpm离心15min，吸取上清液转移至新的EP管，加入等体积异丙醇，-20℃静置30min，4℃、10000rpm离心10min，预冷的75％乙醇洗涤两遍，待沉淀干燥后加入70uLRNasefree H2O。检测RNA质量以及浓度。以RNA总量为1ug为模板，加入5x gDNA Eraser Buffer 2uL，gDNA Eraser 1uL，RNase free dH2O补齐至10uL，室温下静置10min；在反应管中再加入RNase free dH2O 1uL，5x PrimeScript Buffer 2(for real time)4uL，RT Primer Mix 4uL，PrimeScript RTEnzyme Mix Ⅰ 1uL。反应程序为：37℃15min，85℃5sec。上步试验所得为cDNA。实时定量PCR反应总体系为20uL，SYBR Mix 10uL，cDNA 2uL，上下游引物各1uL，ddH2O 6uL，扩增程序为：：95℃预变性30s；95℃变性5s，60℃退火10s，72℃收集荧光20s，共40个循环。采用2-ΔΔCt方法对qPCR所得的数据进一步处理，采用SPSS19.0软件中单因素方差分析(one-wayANOVA)程序进行方差分析。P<0.05 和P<0.01分别为差异显著和极显著水平。用GraphPadPrism 5软件绘制图表。
按照上述方法接种病毒后，在倒置显微镜下观察细胞状态。经观察，正常细胞系接毒48h 后，细胞产生较多细胞病变效应(cytopathic effect，CPE)。稳转细胞系接毒48h后，虽产生 CPE但数量很少。
2、实时定量PCR试验结果
对正常读细胞以及稳转细胞系进行实时定量PCR试验，结果如图2所示，稳转细胞系中M 基因的表达被显著抑制，抑制效率达到79.78％。
由于PEDV为单股正链RNA病毒，变异速度快，这严重阻碍了现有技术疫苗的接种效果。而本发明由于优选了选择了病毒基因组中保守性最高的M序列，并在其中优选出了靶序列设计出了本发明的shRNA，试验表明其能大大提高对PEDV不同毒株的抵抗性。
序列表
<110> 中国人民解放军陆军军医大学
<120> 抑制猪流行性腹泻病毒M基因表达的shRNA
<160> 9
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gccaaggcca ctacaacaat t 21
<210> 2
<211> 104
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
aaggtatatt gctgttgaca gtgagcgcgc caaggccact acaacaattt agtgaagcca 60
cagatgtaaa ttgttgtagt ggccttggct tgcctactgc ctcg 104
<210> 3
<211> 104
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
cgaggcagta ggcaagccaa ggccactaca acaatttaca tctgtggctt cactaaattg 60
ttgtagtggc cttggcgcgc tcactgtcaa cagcaatata cctt 104
<210> 4
<211> 110
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
tcgagaaggt atattgctgt tgacagtgag cgcgccaagg ccactacaac aatttagtga 60
agccacagat gtaaattgtt gtagtggcct tggcttgcct actgcctcgg 110
<210> 5
<211> 110
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
aattccgagg cagtaggcaa gccaaggcca ctacaacaat ttacatctgt ggcttcacta 60
aattgttgta gtggccttgg cgcgctcact gtcaacagca atataccttc 110
<210> 6
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gcaggatctc ctgtcatctc accttg 26
<210> 7
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
ccaagatgtg caggcaacga ttct 24
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
gcagctgtgc tcgacgttgt 20
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
gctcgagcct tctgttgggt 20

Claims (10)

1.一种用于抑制PEDV M基因表达的shRNA，其特征在于：其靶点序列为：
5’-GCCAAGGCCACTACAACAATT-3’。
2.根据权利要求1所述的shRNA，其特征在于所述shRNA的正义链或反义链的DNA序列如下所示：
正义链：
5’-AAGGTATATTGCTGTTGACAGTGAGCGCGCCAAGGCCACTACAACAATTTAGTGAAGCCACAGATGTAAATTGTTGTAGTGGCCTTGGCTTGCCTACTGCCTCG-3’；
反义链：
5’-CGAGGCAGTAGGCAAGCCAAGGCCACTACAACAATTTACATCTGTGGCTTCACTAAATTGTTGTAGTGGCCTTGGCGCGCTCACTGTCAACAGCAATATACCTT-3’。
3.权利要求1或2所述的shRNA在制备用于抑制PEDV药物中的用途。
4.一种重组载体，其特征在于：其含有权利要求1所述的用于抑制PEDV M基因表达的shRNA。
5.根据权利要求3所述的一种重组载体，其特征在于：所述载体基于miR30骨架构建而成。
6.权利要求4所述的重组载体在制备用于抑制PEDV复制的药物中的用途。
7.一种慢病毒，其特征在于：含有权利要求1所述的用于抑制PEDV M基因表达的shRNA。
8.根据权利要求6所述的一种慢病毒，其特征在于：其载体为含miR30骨架的载体。
9.权利要求7-8任一项所述的慢病毒在制备用于抑制PEDV M基因表达的药物中的用途。
10.制备权利要求6所述的慢病毒的方法，其特征在于包括如下步骤：
a、合成针对PEDV M基因的shRNA的DNA序列，并添加酶切位点，正义链及反义链各自的DNA序列如下所示：
正义链：
5’-TCGAGAAGGTATATTGCTGTTGACAGTGAGCGCGCCAAGGCCACTACAACAATTTAGTGAAGCCACAGATGTAAATTGTTGTAGTGGCCTTGGCTTGCCTACTGCCTCGG-3’
反义链：
5’-AATTCCGAGGCAGTAGGCAAGCCAAGGCCACTACAACAATTTACATCTGTGGCTTCACTAAATTGTTGTAGTGGCCTTGGCGCGCTCACTGTCAACAGCAATATACCTTC-3’
b、将等量的正义链和反义链DNA混合，进行退火，形成DNA双链，得到shRNA模板；
c、用XhoI和EcoRI双酶切pPRIME-CMV-Neo-FF3载体，得到线性化载体；
d、将步骤2)中的shRNA模板与步骤3)中线性化的载体进行连接，得到重组质粒；
e、将上述重组质粒同pMD2.G和psPAX2通过lipofectamin2000共转染293T细胞，通过病毒空斑纯化，包装成完整病毒颗粒并收集。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114836418A (zh) * 2021-02-02 2022-08-02 中国农业大学 用于敲降猪流行性腹泻病毒的CRISPR-Cas13d系统

Citations (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20060257852A1 (en) * 2003-04-10 2006-11-16 Chiron Corporation Severe acute respiratory syndrome coronavirus
US20100272706A1 (en) * 2007-06-22 2010-10-28 Jason Mercer Antivirals
CN102648288A (zh) * 2009-06-11 2012-08-22 台湾神隆股份有限公司 基于抑制的对细胞克隆的高通量筛选方法
CN102851301A (zh) * 2012-07-06 2013-01-02 广东大华农动物保健品股份有限公司 一种猪流行性腹泻病毒m基因全序列的扩增方法
CN103397034A (zh) * 2013-08-14 2013-11-20 重庆大学 miRNA-19a作为哺乳动物宿主细胞增殖调控靶标的应用
CN106267195A (zh) * 2016-08-30 2017-01-04 天津市中升挑战生物科技有限公司 一种猪病毒性腹泻三联抗原抗体复合物及其制备方法
CN110272900A (zh) * 2019-04-19 2019-09-24 中国人民解放军陆军军医大学 用于制备骨骼发育异常猪模型的sgRNA及其应用
CA3096283A1 (en) * 2018-04-27 2019-10-31 The Curators Of The University Of Missouri Pathogen-resistant animals having modified aminopeptidase n (anpep) genes
CN110746501A (zh) * 2019-11-11 2020-02-04 南京农业大学 猪白细胞介素11在抵抗猪流行性腹泻病毒感染中的用途
CN111454954A (zh) * 2020-04-22 2020-07-28 深圳市金新农科技股份有限公司 抑制猪流行性腹泻病毒M基因表达的shRNA和重组表达载体及其应用
CN111549028A (zh) * 2020-05-08 2020-08-18 中国农业大学 一种shRNA及其应用
CN111690769A (zh) * 2019-07-24 2020-09-22 安徽农业大学 一种猪细小病毒7型SYBR Green I荧光定量PCR检测方法
CN112316129A (zh) * 2014-04-03 2021-02-05 勃林格殷格翰动物保健美国有限公司 猪流行性腹泻病毒疫苗
GB202107651D0 (en) * 2015-07-31 2021-07-14 Univ Minnesota Modified cells and methods of therapy

Patent Citations (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20060257852A1 (en) * 2003-04-10 2006-11-16 Chiron Corporation Severe acute respiratory syndrome coronavirus
US20100272706A1 (en) * 2007-06-22 2010-10-28 Jason Mercer Antivirals
CN102648288A (zh) * 2009-06-11 2012-08-22 台湾神隆股份有限公司 基于抑制的对细胞克隆的高通量筛选方法
CN102851301A (zh) * 2012-07-06 2013-01-02 广东大华农动物保健品股份有限公司 一种猪流行性腹泻病毒m基因全序列的扩增方法
CN103397034A (zh) * 2013-08-14 2013-11-20 重庆大学 miRNA-19a作为哺乳动物宿主细胞增殖调控靶标的应用
CN112316129A (zh) * 2014-04-03 2021-02-05 勃林格殷格翰动物保健美国有限公司 猪流行性腹泻病毒疫苗
GB202107651D0 (en) * 2015-07-31 2021-07-14 Univ Minnesota Modified cells and methods of therapy
CN106267195A (zh) * 2016-08-30 2017-01-04 天津市中升挑战生物科技有限公司 一种猪病毒性腹泻三联抗原抗体复合物及其制备方法
CA3096283A1 (en) * 2018-04-27 2019-10-31 The Curators Of The University Of Missouri Pathogen-resistant animals having modified aminopeptidase n (anpep) genes
CN110272900A (zh) * 2019-04-19 2019-09-24 中国人民解放军陆军军医大学 用于制备骨骼发育异常猪模型的sgRNA及其应用
CN111690769A (zh) * 2019-07-24 2020-09-22 安徽农业大学 一种猪细小病毒7型SYBR Green I荧光定量PCR检测方法
CN110746501A (zh) * 2019-11-11 2020-02-04 南京农业大学 猪白细胞介素11在抵抗猪流行性腹泻病毒感染中的用途
CN111454954A (zh) * 2020-04-22 2020-07-28 深圳市金新农科技股份有限公司 抑制猪流行性腹泻病毒M基因表达的shRNA和重组表达载体及其应用
CN111549028A (zh) * 2020-05-08 2020-08-18 中国农业大学 一种shRNA及其应用

Non-Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CUI-CUI LI 等: "Three kinds of treatment with Homoharringtonine, Hydroxychloroquine or shRNA and their combination against coronavirus PEDV in vitro", 《VIROLOGY JOURNAL》 *
HAIYAN SHEN 等: "Effective inhibition of porcine epidemic diarrhea virus by RNA interference in vitro", 《VIRUS GENES》 *
KAI LI 等: "Significant inhibition of re-emerged and emerging swine enteric coronavirus in vitro using the multiple shRNA expression vector", 《ANTIVIRAL RESEARCH》 *
南文金等: "猪传染性胃肠炎病毒分子结构、检测和疫苗研究进展", 《畜牧与兽医》 *
牛山: "小干扰RNA抑制猪流行l陛腹泻病毒在Vero细胞内的复制", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库（电子期刊）》 *
王隆柏 等: "猪流行性腹泻病毒E和M基因的克隆及变异分析", 《福建农业学报》 *
陈智毅 等编著: "《分子影像学-基础与应用》", 31 January 2013, 广东高等教育出版社 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114836418A (zh) * 2021-02-02 2022-08-02 中国农业大学 用于敲降猪流行性腹泻病毒的CRISPR-Cas13d系统
CN114836418B (zh) * 2021-02-02 2024-07-12 中国农业大学 用于敲降猪流行性腹泻病毒的CRISPR-Cas13d系统

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