CN108715849B - 一种有效以Cas13a为基础的抗登革病毒的核酸靶点及其应用 - Google Patents

一种有效以Cas13a为基础的抗登革病毒的核酸靶点及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种有效以Cas13a为基础的抗登革病毒的核酸靶点及其应用。本发明提供了一种抑制登革病毒的CRISPR‑Cas13a系统，包括Cas13a蛋白和登革病毒的NS3基因靶点对应的crRNA，或二者形成的复合体；所述登革病毒的NS3基因靶点为登革病毒的NS3基因核苷酸序列第4657‑4685位。本发明发现一种新的抗登革病毒方法，不同于传统抗病毒方法，直接靶向病毒核酸，特异性降解靶基因，使病毒失去复制能力。因此，具有效率高、特异性强、可编程特点，不易产生传统抗病毒药物所产生的耐药性，未来可能成为一种新的抗病毒药物。

Description

一种有效以Cas13a为基础的抗登革病毒的核酸靶点及其应用
技术领域
本发明属于基因突变和基因工程技术领域,涉及一种有效以Cas13a为基础的抗登革病毒的核酸靶点及其应用。
背景技术
随着全球变暖和人群流动性日益增多，登革热日益成为重要的热带和亚热带地区的重要传染病，登革病毒是登革热的病原，分为四个血清型,分别命名为DENV-1,DENV-2,DENV-3和DENV-4。每年大约有5千万到1亿人感染登革病毒，其中大约有1％的感染者发展为重症患者需要住院治疗，表现为登革出血热和登革休克综合征，甚至死亡，目前由于抗体依赖的病毒感染增强作用(antibody-dependent enhancement，ADE)导致登革病毒疫苗的研发困难，也无特异性的治疗药物，临床治疗主要以支持疗法为主，因此，研发针对登革病毒的特异性治疗药物，探索新的抗病毒方法和技术是目前登革病毒研究的重要方向。其中筛选有效的抗登革病毒靶点是研发新的抗登革病毒药物和技术的关键。
登革病毒属于黄热病毒，为单正链RNA病毒，其基因组全长约为11kb，由5’UTR，一个长的开放阅读框和3’UTR。开放读框依次编码3个重要的结构蛋白(Capsid，PrM和Envelope)和7个非结构蛋白(NS1，NS2A,NS2B,NS3,NS4A,NS4B和NS5)。其中非结构蛋白在病毒的复制和组装等过程中发挥至关重要的作用。目前的研究策略以针对NS3和NS5的酶活性及其结构，设计不同的模拟化合物抑制剂，从而抑制病毒复制；或者通过抑制病毒包膜蛋白与宿主细胞膜融合设计肽抑制剂抑制病毒复制；或者通过siRNA技术靶向病毒的RNA从而抑制病毒的复制。但是筛选和研发新的抗登革病毒技术仍是登革病毒的重要问题。
近年来，CRISPR技术发展迅猛，基于CRISPR研发的CRISPR-Cas9技术已经被证明是高效、广泛适用的基因组编辑技术，其迅速推广应用正在改变生物学和医学的研究面貌。CRISPR技术的新一轮革命为群雄逐鹿新生物学时代提供了新的利器，同时该技术也已被应用到军事医学基础和应用研究的各个方面，全方位地提升了军事医学研究的原创水平。在抗病毒领域，研究人员已成功利用CRISPR-Cas9技术实现了对HPV、HBV等DNA病毒实现了精确靶向和高效抑制，然而CRISPR-Cas9系统仅能实现对DNA的编辑以及DNA病毒的靶向清除，目前还不能对RNA病毒实现直接地靶向清除。2017年10月，科研人员证实了此前能够非特异切割RNA的CRISPR-Cas13a系统能够特异性地降低哺乳动物细胞中的内源性RNA表达水平，同时能够抑制水稻内源性基因的表达。可以预见，新发现的CRISPR-Cas13a技术将在靶向清除RNA病毒以及生物安全防控领域具有不可估量的应用前景，该技术或将为成为一种精准靶向、安全有效的抗病毒治疗方式。
发明内容
本发明一个目的是提供一种抑制登革病毒的CRISPR-Cas13a系统。
本发明提供的CRISPR-Cas13a系统，包括Cas13a蛋白和登革病毒的NS3基因靶点对应的crRNA，或二者形成的复合体；
所述登革病毒的NS3基因靶点为登革病毒的NS3基因核苷酸序列第4657-4685位。
上述登革病毒的NS3基因靶点为登革病毒的NS3基因核苷酸序列GenBank ID：U87411第4657-4685位。
上述CRISPR-Cas13a系统中，所述登革病毒的NS3基因靶点为序列1。
上述CRISPR-Cas13a系统中，所述登革病毒的NS3基因靶点对应的crRNA为序列2。
上述的CRISPR-Cas13a系统在制备抑制登革病毒产品中的应用也是本发明保护的范围。
上述CRISPR-Cas13a系统在制备降低登革病毒载量产品中的应用也是本发明保护的范围。
上述CRISPR-Cas13a系统在制备登革病毒疫苗中的应用也是本发明保护的范围。
上述CRISPR-Cas13a系统在制备抗登革病毒产品中的应用也是本发明保护的范围。
本发明另一个目的是提供一种RNA片段。
本发明提供的RNA片段，其核苷酸序列为序列表中序列2。
上述RNA片段在制备抑制登革病毒产品中的应用也是本发明保护的范围；
或上述RNA片段在制备降低登革病毒载量产品中的应用也是本发明保护的范围；
或上述RNA片段在制备登革病毒疫苗中的应用也是本发明保护的范围。
或上述RNA片段在制备抗登革病毒产品中的应用也是本发明保护的范围。
上述RNA片段和Cas13a蛋白或二者形成的复合体在如下中的应用也是本发明保护的范围：
1)制备抑制登革病毒复制的产品；
2)制备降低登革病毒载量产品；
3)制备登革病毒疫苗；
4)制备抗登革病毒产品。
上述中，所述产品为试剂盒或药物。
上述登革病毒为2型登革病毒。
本发明的实验证明，本发明发现一种新的抗登革病毒CRISPR-Cas13a系统，不同于传统抗病毒方法，直接靶向病毒核酸，特异性降解靶基因，使病毒失去复制能力。因此，具有效率高、特异性强、可编程特点，不易产生传统抗病毒药物所产生的耐药性，未来可能成为一种新的抗病毒药物。
附图说明
图1为Cas13a蛋白离子交换柱纯化后SDS-PAGE电泳图。
图2为定量RT-PCR筛选不同靶点的体外抗病毒活性。
图3为RT-PCR检测细胞和上清中的病毒滴度。
图4为流式细胞检测细胞感染DENV情况。
图5为空斑试验检测上清中的病毒滴度。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、靶向登革病毒的CRISPR-Cas13a靶点序列的制备和筛选
1、靶向登革热病毒DENV-2的crRNA序列的设计、合成
以2型登革热病毒DENV-2(16681株)的基因组序列(Genebank ID：U87411)为参考序列，针对2型登革热病毒的6个基因(PrM、NS2a、NS2b、NS3、NS4a、3’UTR)，在每个基因序列中挑选出一个连续29个核苷酸序列作为CRISPR-Cas13a系统的靶点序列。
将选择的6个靶点序列分别进行反向互补，得到6个反向互补链；
再将6个反向互补链的序列的5’端加上GGGGATTTAGACTACCCCAAAAACGAAGGGGACTAAAAC，合成得到正向寡核苷酸序列(表1)；
以正向寡核苷酸序列为模板，用T7-crRNA-F：TAATACGACTCACTATAGGGGATTTAGACTACCCCAA为上游引物，以R-NNN(表1:扩增不同靶点crRNA所用下游引物序列))为下游引物进行扩增，随后利用T7转录试剂盒对扩增产物进行转录，得到不同靶点的crRNA如表2所示。
表1为扩增不同靶点crRNA所用下游引物序列
Figure BDA0001645606230000031
Figure BDA0001645606230000041
表2靶向登革病毒的CRISPR-Cas13a靶点序列
Figure BDA0001645606230000042
2、Cas13a蛋白纯化表达
Cas13a蛋白氨基酸序列为序列3。
(1)Cas13a蛋白诱导表达：
Cas13a蛋白表达质粒(Addgene-PC013)Twinstrep-SUMO-huLwCas13a转化康为世纪Rosetta(DE3)Competent Cell感受态细胞，将其涂布于Amp+的LB平板，挑取单菌落接入5ml TB培养基，37℃，200rpm培养过夜；过夜培养5ml菌液接入300ml TB培养基中，37℃300rpm摇菌，至OD600＝0.6(约3h)，加入IPTG使终浓度为500uM，18℃200rpm培养16h诱导蛋白表达；于4℃条件下5200g离心15min，弃上清，收集菌体沉淀,-80℃保存备用。
以下蛋白的纯化是应用GE公司的AKTA Prime plus进行的。
(2)Cas13a蛋白镍柱纯化：
配置洗脱液A液：20mM Tris-HCl+10Mm咪唑+0.2M NaCl(pH＝8.0)；B液：Buffer A+500mM咪唑(pH＝8.0)。收集的菌块称重5g，加入50mL lysis buffer(20mM Tris-HCl,500mMNaCl,1mM DTT,pH 8.0)+(溶菌酶1:100,1mg/ml+全能核酸酶+蛋白酶抑制剂)超声破碎，超声5s，停10s，超声时间1.5h(净超声时间30min)；转速12000rpm，4℃离心10min；离心后的蛋白上清加入咪唑，终浓度10mM,调节A液pH至8.0，用0.22um滤膜过滤；5ml镍柱(美国GE)依次通过水、0.5M NaOH、水、100％B、100％A、上样、100％A到基线；用100mM咪唑洗去杂蛋白(20％B),200mM(40％B)、300mM咪唑(60％B)，0.5M NaOH洗脱蛋白。柱子挂镍：镍柱分别过水、0.1M EDTA-Na2、水、0.5M硫酸镍、水；清洗机器及柱子：镍柱分别通过水、0.5M NaOH、水、20％乙醇；洗脱的蛋白进行透析去除高浓度的咪唑。
(3)Cas13a蛋白透析：
洗脱的蛋白(40％-1，40％-2)加入30kd透析袋(北京瑞达恒辉)，封口，放入500mLSUMO Digest Buffer(30mM Tris-HCl,500mM NaCl,1mM DTT,0.15％Igepal NP-40，pH8.0)，4℃搅拌透析，约1小时换一次外液；透析后的蛋白用碧云天蛋白浓度检测试剂盒检测浓度。取1000μg融合蛋白中加入20μl SUMO Protease Buffer、2μl SUMO酶，用ddH2O调至终体积1ml，放入混悬仪4℃酶切过夜。
(4)Cas13a蛋白离子交换纯化：
配置缓冲液A：20mM PB+5％甘油(pH＝8.0)；缓冲液B：20mM PB+1M NaCl(pH＝8.0)。经计算Cas13a+SUMO等电点PI＝9.6，Cas13a等电点PI＝9.37。蛋白样品用水稀释至NaCl浓度为200mM，调节pH＝8.0；阳离子交换柱(美国GE)用A液平衡至pH 8.0后上样，上样结束后A液平衡至基线，用30％、50％、100％B、0.5M NaOH洗脱。
经过镍柱纯化、SUMO酶切去除His、透析、离子交换四个步骤的纯化，最终离子交换纯化过程中在50％B液洗脱后得到较纯的Cas13a蛋白，分子量约为130kDa(图1)，蛋白定量后浓度为300ng/μl，体外实验表明具有较好的生物活性，保存于蛋白储存液中(600mMNaCl，50mM Tris-HCl，5％甘油，2mM DTT，pH 7.5)，-80℃待用。
3、筛选抑制登革热病毒DENV-2效率最高的CRISPR-Cas13a靶序列的筛选
(1)登革病毒(DENV2)感染VERO细胞：
VERO细胞(国家实验细胞资源共享平台，资源编号：3111C0001CCC000060)在含10％FBS(EallBio)，1％青/链霉素的DMEM培养基(gibco，C11995500BT)中培养扩增3天后，将生长状态良好的VERO离心洗涤后，以10％FBS，1％青/链霉素的DMEM培养基(GIBCO)重悬，加入24孔板中，每孔加入1ml(2.5-3×105细胞)，过夜培养后，吸取去除培养基，PBS洗涤后，加入300μl DMEM(Gibco)稀释的登革病毒DENV2(博奥派克生物，Dengue Type 2,strain16681)(感染复数MOI为0.1)，37℃，5％CO2的细胞培养箱中孵育90min(期间每隔15-30min轻轻晃动培养板)后，吸取弃除板中的病毒悬液，PBS洗涤后，加入500μl的Opti-MEM(GIBCO，31985-070)，待进行不同的后续处理。
(2)转染Cas13a/不同靶序列crRNA复合体至已感染登革病毒的VERO细胞
将上述表1中10种不同的crRNA分别和纯化的Cas13a蛋白利用LipofectamineCRISPRMax试剂盒(Thermo Fisher，CMAX00003)分别转染至已经感染登革病毒的VERO细胞，按照说明书配置转染体系(每孔)：管1中加入0.75μL
Figure BDA0001645606230000061
CRISPRMax Reagent和25μL Opti-MEM；管2中加入500ng Cas13a蛋白、125ng crRNA(表1中的6个中的任一个)、0.5μL PLUS Reagent和25μL Opti-MEM。将管1和管2混匀后室温孵育5-25分钟。将配好的转染体系加入24孔板的各孔中，置于37℃、5％CO2培养箱中继续培养，72小时后收取细胞上清。同时设置以管2中只加入Cas13a不加入crRNA的对照(命名为Cas13a对照)，和不加任何转染体系仅加入登革病毒的对照组(命名为DV2对照)。
其中，不同的crRNA分别和Cas13a蛋白构成CRISPR-Cas13a系统并在细胞中形成转染Cas13a/不同靶序列crRNA复合体。
crRNA-PrM对应的crRNA序列和Cas13a蛋白构成crRNA-PrM靶点的CRISPR-Cas13a系统；
crRNA-NS2a对应的crRNA序列和Cas13a蛋白构成crRNA-NS2a靶点的CRISPR-Cas13a系统；
crRNA-NS2b对应的crRNA序列和Cas13a蛋白构成crRNA-NS2b靶点的CRISPR-Cas13a系统；
crRNA-NS3对应的crRNA序列和Cas13a蛋白构成crRNA-NS3靶点的CRISPR-Cas13a系统；
crRNA-NS4a对应的crRNA序列和Cas13a蛋白构成crRNA-NS4a靶点的CRISPR-Cas13a系统；
crRNA-3’UTR对应的crRNA序列和Cas13a蛋白构成crRNA-3’UTR靶点的CRISPR-Cas13a系统。
(3)细胞上清中登革热病毒基因组RNA的提取
利用QIAGEN病毒RNA提取试剂盒提取(2)得到的细胞上清中的病毒RNA，首先按照说明书进行裂解液的配置：n×0.56ml＝Y ml(Buffer AVL)(n-样本数)Yml×10μl＝Z ml(carrier RNA)；在新的EP管中，560μl裂解液+140μl病毒，涡旋振荡，短暂离心，室温静置10min；向其中加560μl酒精(96％-100％)，涡旋振荡15s，短暂离心；从上管中取630μl加入到收集管中，6000g离心1min，将柱子放入干净的管中，重复这一步骤；打开管盖，加入500μlBuffer AW1，6000g离心1min，将柱子放入干净的管中；打开管盖，加入500μl Buffer AW2，最高转速离心3min；将柱子放入1.5ml干净的EP管中，加入60μl Buffer AVE，静置1min，6000g离心1min，即得到需要的RNA。
(4)细胞培养上清中登革热病毒RNA定量检测：
使用登革热病毒3’UTR基因作为检测位点，通过实时定量PCR(一步法反转录-荧光定量试剂盒，TAKARA)进行检测，所用引物序列见如下：DENV-F：AAGGACTAGAGGTTAGAGGAGACCC；DENV-R：CGTTCTGTGCCTGGAATGATG；试剂盒各组分及RNA模板放在冰上完全融化后，短暂离心，置于冰上，定量PCR反应体系按照以下比例配制：每个反应管中加入12.5μl 2×buffer、0.5μl ExTaq、0.5μl RT-Enzyme、2μl上述(3)的RNA、1μlDENV-F、1μl DENV-R和7.5μl ddH2O使终体积达到25μl。启动实时定量PCR仪，将配制好的各反应体系放入实时定量PCR仪中，反应条件如下：37℃，15min；85℃，5min；95℃，30s；(95℃，10s，60℃，30s)×40个循环。根据标准曲线计算病毒载量，以单独转染Cas13a不加入crRNA的Cas13a对照组的病毒载量为1，其它组的病毒滴度/Cas13a单独转染的病毒滴度的比值即为病毒相对定量。
结果如图2所示：相比加入Cas13a的对照组，转染各靶点对应的CRISPR-Cas13a系统后，细胞上清中的登革病毒载量出现了下降，其中转染crRNA-NS3对应的CRISPR-Cas13a系统后细胞上清中的登革病毒载量下降幅度最大，下降约50％，而转染crRNA-PrM、crRNA-NS2a、crRNA-NS2b、crRNA-NS4a、crRNA-3’UTR、crRNA-NS5靶点的CRISPR-Cas13a系统后，细胞上清中的登革病毒载量与对照组相比无显著变化。上述结果表明，相比其余靶点，crRNA-NS3靶点的CRISPR-Cas13a系统对登革病毒复制与表达的抑制效率最高。
实施例2、crRNA-NS3靶点的CRISPR-Cas13a系统在体外抑制登革病毒复制与表达的效率
按照实施例1的3的方法进行病毒感染和crRNA-NS3靶点的CRISPR-Cas13a系统进行转染，在感染后第三天分别收集上清和细胞，上清用于定量RT-PCR和空斑检测，细胞用于流式细胞术检测登革病毒阳性的细胞以及细胞内的病毒RT-PCR检测。
1、定量RT-PCR检测细胞和上清中的病毒载量
①上清中病毒RNA的提取步骤实施例1的3。
②细胞RNA的提取
利用QIAGEN细胞RNA提取试剂盒提取细胞内病毒RNA提取步骤如下：收集细胞；通过加Buffer RLT Plus来破坏细胞：轻弹管子来弹松细胞，加入350μl Buffer RLT Plus；漩涡振荡1min，使裂解液充分裂解细胞；将充分裂解的裂解液转移到一个2ml的收集管中，8000g离心30s，丢掉柱子，留下收集管；加入350μl 70％乙醇，然后吹打混匀，不要离心；转移700μl样品，包括可能形成的任何沉淀到2ml收集管中，轻轻盖上盖子，8000g离心15s，丢弃液体，留下收集管；加入700μl Buffer RW1，轻轻盖上管盖，8000g离心15s，丢弃液体，留下收集管；加入500μl Buffer RPE，轻轻盖上盖子，8000g离心15s，丢弃液体，留下收集管；加入500μl Buffer RPE，轻轻盖上盖子，8000g离心2min；将柱子放入新的2ml收集管中，丢弃旧收集管，全速离心1min；将柱子放入新的1.5mlEP管中，加入30μl RNase-free水，轻轻盖上盖子，8000g离心1min，过滤出RNA；如果预期的RNA产量>30μg，将得到的RNA重新加入柱子，重复上述步骤；将得到的RNA置于冰上，用Nanodrop测定每一样品RNA的浓度。
③定量RT-PCR检测上清和细胞中的病毒
通过实时定量PCR(一步法反转录-荧光定量试剂盒，TAKARA)细胞上清中及细胞内登革热病毒RNA进行定量检测，步骤同上。细胞内的定量RT-PCR与上清中不同之处是以β-actin为内参，计算不同处理组细胞的相对病毒含量。
仅加入登革病毒的对照组为感染登革病毒后不加转染系统。
仅加入Cas13a蛋白的对照组为感染登革病毒后转染系统中管2中只加入Cas13a不加入crRNA。
病毒感染3天后，分别收集细胞(A)和上清(B)，利用RT-PCR检测细胞和上清中的病毒拷贝数结果如图3所示：相比仅加入登革病毒的对照组和仅加入Cas13a蛋白的对照组，转染crRNA-NS3靶点的CRISPR-Cas13a系统后，细胞上清中的登革病毒载量出现了显著下降，相比仅加入登革病毒的对照组下降73％，相比加入登革病毒和Cas13a蛋白的对照组下降84％。细胞内中的登革病毒载量也出现了显著下降，相比仅加入登革病毒的对照组下降72％，相比加入登革病毒和Cas13a蛋白的对照组下降81％，与上清中的结果一致。上述结果表明，crRNA-NS3靶点的CRISPR-Cas13a系统(命名为Cas13a/crRNA-NS3)可在细胞内高效抑制登革病毒的复制与表达。
2、流式细胞术进一步证明Cas13a/crRNA-NS3可以显著抑制登革病毒的复制
病毒感染VERO细胞第3天，收集上清后，每孔加入胰酶-EDTA(GIBCO)消化2-3分钟，加入10％FBS的DMEM培养基，离心(1000rpm，6min)，弃上清；然后分别以1×BD LysingSolution(BD Bioscience)室温孵育10min，3ml PBS离心(1000rpm，6min)洗涤；再加入破膜剂(eBioscience)室温孵育10min，3ml PBS离心(1000rpm，6min)洗涤；加入以破膜剂1:500稀释的D1-11抗体(Abcam)，室温孵育40-60min，离心洗涤后加入1:200稀释的抗小鼠IgG-FITC抗体，继续室温孵育40-60min，离心洗涤后，加入4％的多聚甲醛(国化集团)固定后，流式细胞仪(MILLIPORE，guava easyCyte HT)收集细胞，利用FlowJo软件进行分析。
VERO细胞在感染DENV2-16681 90min后，再加入含有不同成分的转染试剂，病毒感染3天后，收集细胞，利用抗DENV特异性抗体胞内染色，分析不同处理的细胞病毒感染率，图A为代表性结果，图B为不同处理组细胞的统计结果。结果如图4，未加入转染试剂的细胞对照组细胞DENV阳性的细胞平均为31.88±2.23％，仅转染Cas13a的对照组DENV阳性的细胞平均为40.63±2.24％，而转染含有特异性登革病毒靶点的Cas13a/crRNA-NS3实验组DENV阳性的细胞显著降低(13.66±1.55％)，比病毒单独感染降低了58％，比Cas13a单独转染的下降约77％，具有显著差异(P<0.001)，说明Cas13a/crRNA-NS3可以有效降低登革病毒的感染率。
3、空斑试验确定Cas13a/crRNA-NS3可以显著抑制登革病毒的复制
收集感染DENV病毒3天的VERO细胞培养上清，将上清以无血清的DMEM系列10倍稀释，加入含有生长状态良好的VERO细胞的96孔板中，每孔加入40μl，在5％CO2的细胞培养箱中37℃孵育90min后，去除培养基，PBS洗涤后，加入200μl的2％FBS DMEM配置的1.5％甲基纤维素(1.5g甲基纤维素溶解于100ml的2％FBS的DMEM培养基)，继续孵育4天。用PBS洗涤96孔板，加入4％多聚甲醛固定，用TBS溶液(以10×TBS溶液利用蒸馏水稀释，10×TBS溶液：24.23g的TRIS，80.06g NaCl，1000ml蒸馏水，pH 7.6)洗涤一遍后，加入0.1％Triton-X100TBS 50ul，室温10min，然后用3％BSA-TBS，室温封闭20min，加入以1％BSA-TBS 1:1000稀释的D1-11(Abcam)抗体，室温孵育2h，TBS洗涤三遍，然后加入50uL 1％BSA-TBS 1:500稀释的m-IgGκBP-B(SantaCruz，sc-516142)室温孵育2h；TBS洗涤三遍后，加入50uL 1％BSA-TBS1:1000稀释的AP-Streptavidin conjugate(Thermal Fisher SCIENTIFIC，43-4322)，室温孵育1.5-2h；最后加入50uL 0.4μm过滤的底物BCIP/NBT-plus(MABTECH，3650-10)，避光15-30min，弃孔中液体，蒸馏水终止，待干后观察结果。
病毒感染3天后，收集上清进行空斑检测，图A为代表结果，图B为不同处理组细胞的统计结果如图5所示，其上清中的感染性病毒颗粒在不同处理的VERO细胞中的病毒滴度显著不同，单独转染Cas13a的细胞与未加入转染试剂VERO细胞的上清中的感染性病毒颗粒(以PFU/ml表示)无显著差异，而转染含有特异性登革病毒靶点的Cas13a/crRNA-NS3实验组细胞上清中的感染性病毒数量显著降低(p<0.001)，比单独感染病毒的细胞对照组降低92％，与只转染Cas13a的细胞对照组下降84％，进一步说明Cas13a/crRNA-NS3更加有效降低了登革病毒感染性病毒颗粒，具有抗病毒活性。
综上所述，从定量RT-PCR、流式细胞术和空斑实验三个方面证明Cas13a/crRNA-NS3可以显著抑制登革病毒的复制，表明Cas13a为基础的技术可以用于抗病毒治疗，NS3(4657-4685in Genebank ID：U87411)UUCCAUACAAUGUGGCAUGUCACACGUGG是Cas13a为基础的有效的抗登革病毒的靶点。
序列表
<110> 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 中国人民解放军疾病预防控制所
<120> 一种有效以Cas13a为基础的抗登革病毒的核酸靶点及其应用
<160> 3
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 29
<212> DNA
<213>人工序列
<400> 1
ttccatacaa tgtggcatgt cacacgtgg 29
<210> 2
<211> 29
<212> DNA
<213>人工序列
<400> 2
uuccauacaa uguggcaugu cacacgugg 29
<210> 3
<211> 1152
<212> PRT
<213>人工序列
<400> 3
Met Lys Val Thr Lys Val Asp Gly Ile Ser His Lys Lys Tyr Ile Glu
1 5 10 15
Glu Gly Lys Leu Val Lys Ser Thr Ser Glu Glu Asn Arg Thr Ser Glu
20 25 30
Arg Leu Ser Glu Leu Leu Ser Ile Arg Leu Asp Ile Tyr Ile Lys Asn
35 40 45
Pro Asp Asn Ala Ser Glu Glu Glu Asn Arg Ile Arg Arg Glu Asn Leu
50 55 60
Lys Lys Phe Phe Ser Asn Lys Val Leu His Leu Lys Asp Ser Val Leu
65 70 75 80
Tyr Leu Lys Asn Arg Lys Glu Lys Asn Ala Val Gln Asp Lys Asn Tyr
85 90 95
Ser Glu Glu Asp Ile Ser Glu Tyr Asp Leu Lys Asn Lys Asn Ser Phe
100 105 110
Ser Val Leu Lys Lys Ile Leu Leu Asn Glu Asp Val Asn Ser Glu Glu
115 120 125
Leu Glu Ile Phe Arg Lys Asp Val Glu Ala Lys Leu Asn Lys Ile Asn
130 135 140
Ser Leu Lys Tyr Ser Phe Glu Glu Asn Lys Ala Asn Tyr Gln Lys Ile
145 150 155 160
Asn Glu Asn Asn Val Glu Lys Val Gly Gly Lys Ser Lys Arg Asn Ile
165 170 175
Ile Tyr Asp Tyr Tyr Arg Glu Ser Ala Lys Arg Asn Asp Tyr Ile Asn
180 185 190
Asn Val Gln Glu Ala Phe Asp Lys Leu Tyr Lys Lys Glu Asp Ile Glu
195 200 205
Lys Leu Phe Phe Leu Ile Glu Asn Ser Lys Lys His Glu Lys Tyr Lys
210 215 220
Ile Arg Glu Tyr Tyr His Lys Ile Ile Gly Arg Lys Asn Asp Lys Glu
225 230 235 240
Asn Phe Ala Lys Ile Ile Tyr Glu Glu Ile Gln Asn Val Asn Asn Ile
245 250 255
Lys Glu Leu Ile Glu Lys Ile Pro Asp Met Ser Glu Leu Lys Lys Ser
260 265 270
Gln Val Phe Tyr Lys Tyr Tyr Leu Asp Lys Glu Glu Leu Asn Asp Lys
275 280 285
Asn Ile Lys Tyr Ala Phe Cys His Phe Val Glu Ile Glu Met Ser Gln
290 295 300
Leu Leu Lys Asn Tyr Val Tyr Lys Arg Leu Ser Asn Ile Ser Asn Asp
305 310 315 320
Lys Ile Lys Arg Ile Phe Glu Tyr Gln Asn Leu Lys Lys Leu Ile Glu
325 330 335
Asn Lys Leu Leu Asn Lys Leu Asp Thr Tyr Val Arg Asn Cys Gly Lys
340 345 350
Tyr Asn Tyr Tyr Leu Gln Val Gly Glu Ile Ala Thr Ser Asp Phe Ile
355 360 365
Ala Arg Asn Arg Gln Asn Glu Ala Phe Leu Arg Asn Ile Ile Gly Val
370 375 380
Ser Ser Val Ala Tyr Phe Ser Leu Arg Asn Ile Leu Glu Thr Glu Asn
385 390 395 400
Glu Asn Asp Ile Thr Gly Arg Met Arg Gly Lys Thr Val Lys Asn Asn
405 410 415
Lys Gly Glu Glu Lys Tyr Val Ser Gly Glu Val Asp Lys Ile Tyr Asn
420 425 430
Glu Asn Lys Gln Asn Glu Val Lys Glu Asn Leu Lys Met Phe Tyr Ser
435 440 445
Tyr Asp Phe Asn Met Asp Asn Lys Asn Glu Ile Glu Asp Phe Phe Ala
450 455 460
Asn Ile Asp Glu Ala Ile Ser Ser Ile Arg His Gly Ile Val His Phe
465 470 475 480
Asn Leu Glu Leu Glu Gly Lys Asp Ile Phe Ala Phe Lys Asn Ile Ala
485 490 495
Pro Ser Glu Ile Ser Lys Lys Met Phe Gln Asn Glu Ile Asn Glu Lys
500 505 510
Lys Leu Lys Leu Lys Ile Phe Lys Gln Leu Asn Ser Ala Asn Val Phe
515 520 525
Asn Tyr Tyr Glu Lys Asp Val Ile Ile Lys Tyr Leu Lys Asn Thr Lys
530 535 540
Phe Asn Phe Val Asn Lys Asn Ile Pro Phe Val Pro Ser Phe Thr Lys
545 550 555 560
Leu Tyr Asn Lys Ile Glu Asp Leu Arg Asn Thr Leu Lys Phe Phe Trp
565 570 575
Ser Val Pro Lys Asp Lys Glu Glu Lys Asp Ala Gln Ile Tyr Leu Leu
580 585 590
Lys Asn Ile Tyr Tyr Gly Glu Phe Leu Asn Lys Phe Val Lys Asn Ser
595 600 605
Lys Val Phe Phe Lys Ile Thr Asn Glu Val Ile Lys Ile Asn Lys Gln
610 615 620
Arg Asn Gln Lys Thr Gly His Tyr Lys Tyr Gln Lys Phe Glu Asn Ile
625 630 635 640
Glu Lys Thr Val Pro Val Glu Tyr Leu Ala Ile Ile Gln Ser Arg Glu
645 650 655
Met Ile Asn Asn Gln Asp Lys Glu Glu Lys Asn Thr Tyr Ile Asp Phe
660 665 670
Ile Gln Gln Ile Phe Leu Lys Gly Phe Ile Asp Tyr Leu Asn Lys Asn
675 680 685
Asn Leu Lys Tyr Ile Glu Ser Asn Asn Asn Asn Asp Asn Asn Asp Ile
690 695 700
Phe Ser Lys Ile Lys Ile Lys Lys Asp Asn Lys Glu Lys Tyr Asp Lys
705 710 715 720
Ile Leu Lys Asn Tyr Glu Lys His Asn Arg Asn Lys Glu Ile Pro His
725 730 735
Glu Ile Asn Glu Phe Val Arg Glu Ile Lys Leu Gly Lys Ile Leu Lys
740 745 750
Tyr Thr Glu Asn Leu Asn Met Phe Tyr Leu Ile Leu Lys Leu Leu Asn
755 760 765
His Lys Glu Leu Thr Asn Leu Lys Gly Ser Leu Glu Lys Tyr Gln Ser
770 775 780
Ala Asn Lys Glu Glu Thr Phe Ser Asp Glu Leu Glu Leu Ile Asn Leu
785 790 795 800
Leu Asn Leu Asp Asn Asn Arg Val Thr Glu Asp Phe Glu Leu Glu Ala
805 810 815
Asn Glu Ile Gly Lys Phe Leu Asp Phe Asn Glu Asn Lys Ile Lys Asp
820 825 830
Arg Lys Glu Leu Lys Lys Phe Asp Thr Asn Lys Ile Tyr Phe Asp Gly
835 840 845
Glu Asn Ile Ile Lys His Arg Ala Phe Tyr Asn Ile Lys Lys Tyr Gly
850 855 860
Met Leu Asn Leu Leu Glu Lys Ile Ala Asp Lys Ala Lys Tyr Lys Ile
865 870 875 880
Ser Leu Lys Glu Leu Lys Glu Tyr Ser Asn Lys Lys Asn Glu Ile Glu
885 890 895
Lys Asn Tyr Thr Met Gln Gln Asn Leu His Arg Lys Tyr Ala Arg Pro
900 905 910
Lys Lys Asp Glu Lys Phe Asn Asp Glu Asp Tyr Lys Glu Tyr Glu Lys
915 920 925
Ala Ile Gly Asn Ile Gln Lys Tyr Thr His Leu Lys Asn Lys Val Glu
930 935 940
Phe Asn Glu Leu Asn Leu Leu Gln Gly Leu Leu Leu Lys Ile Leu His
945 950 955 960
Arg Leu Val Gly Tyr Thr Ser Ile Trp Glu Arg Asp Leu Arg Phe Arg
965 970 975
Leu Lys Gly Glu Phe Pro Glu Asn His Tyr Ile Glu Glu Ile Phe Asn
980 985 990
Phe Asp Asn Ser Lys Asn Val Lys Tyr Lys Ser Gly Gln Ile Val Glu
995 1000 1005
Lys Tyr Ile Asn Phe Tyr Lys Glu Leu Tyr Lys Asp Asn Val Glu
1010 1015 1020
Lys Arg Ser Ile Tyr Ser Asp Lys Lys Val Lys Lys Leu Lys Gln
1025 1030 1035
Glu Lys Lys Asp Leu Tyr Ile Arg Asn Tyr Ile Ala His Phe Asn
1040 1045 1050
Tyr Ile Pro His Ala Glu Ile Ser Leu Leu Glu Val Leu Glu Asn
1055 1060 1065
Leu Arg Lys Leu Leu Ser Tyr Asp Arg Lys Leu Lys Asn Ala Ile
1070 1075 1080
Met Lys Ser Ile Val Asp Ile Leu Lys Glu Tyr Gly Phe Val Ala
1085 1090 1095
Thr Phe Lys Ile Gly Ala Asp Lys Lys Ile Glu Ile Gln Thr Leu
1100 1105 1110
Glu Ser Glu Lys Ile Val His Leu Lys Asn Leu Lys Lys Lys Lys
1115 1120 1125
Leu Met Thr Asp Arg Asn Ser Glu Glu Leu Cys Glu Leu Val Lys
1130 1135 1140
Val Met Phe Glu Tyr Lys Ala Leu Glu
1145 1150

Claims (9)

1.一种抑制登革病毒的CRISPR-Cas13a系统，包括Cas13a蛋白和登革病毒的NS3基因靶点对应的crRNA，或二者形成的复合体；
所述登革病毒的NS3基因靶点为序列1。
2.根据权利要求1所述的CRISPR-Cas13a系统，其特征在于：所述登革病毒的NS3基因靶点对应的crRNA为序列2。
3.权利要求1-2中任一所述的CRISPR-Cas13a系统在制备抑制登革病毒产品中的应用。
4.权利要求1-2中任一所述的CRISPR-Cas13a系统在制备降低登革病毒载量产品中的应用。
5.权利要求1-2中任一所述的CRISPR-Cas13a系统在制备登革病毒疫苗中的应用；
或权利要求1-2中任一所述的CRISPR-Cas13a系统在制备抗登革病毒产品中的应用。
6.一种RNA片段，其核苷酸序列为序列表中序列2。
7.权利要求6所述的RNA片段在制备抑制登革病毒产品中的应用；
或权利要求6所述的RNA片段在制备降低登革病毒载量产品中的应用；
或权利要求6所述的RNA片段在制备登革病毒疫苗中的应用；
或权利要求6所述的RNA片段在制备抗登革病毒产品中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述产品为试剂盒。
9.权利要求6所述的RNA片段和Cas13a蛋白或二者形成的复合体在如下1)-4)至少一种中的应用：
1)制备抑制登革病毒复制的产品；
2)制备降低登革病毒载量产品；
3)制备登革病毒疫苗；
4)制备抗登革病毒产品。
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