CN110548134A - Cas13a在拮抗病毒中的应用 - Google Patents

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virus
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Abstract

本发明公开了Cas13a在拮抗病毒中的应用，所述Cas13a来自Leptotrichia buccalis、Listeria seeligeri、Leptotrichia shahii、Leptotrichia wadei CRISPR系统中的任一种，所述病毒为人类的DNA病毒、RNA病毒和逆转录病毒中的一种或多种。本发明通过利用上述具有较高RNase活性的Cas13a这一基因编辑技术对三种不同类型的病毒(DNA病毒、RNA病毒和逆转录病毒)在细胞内的生活周期进行抑制，结果显示出较高RNA切割活性和更加广泛的应用范围。

Description

Cas13a在拮抗病毒中的应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及Cas13a在拮抗病毒中的应用。
背景技术
CRISPR/Cas系统是目前发现存在于大多数细菌与所有的古菌中的一种免疫系统，被用来识别和摧毁抗噬菌体和其他病原体入侵的防御系统。在CRISPR/Cas系统中，CRISPR是规律间隔性成簇短回文重复序列(clustered regularly interspaced shortpalindromic repeats)的简称，涉及细菌基因组中的独特DNA区域，也是储存病毒DNA片段从而允许细胞能够识别任何试图再次感染它的病毒的地方，CRISPR经转录产生的RNA序列(被称作crRNA)识别入侵性病毒的遗传物质。Cas是CRISPR相关蛋白(CRISPR-associatedproteins,Cas)的简称，Cas蛋白像一把分子剪刀那样切割细菌基因组上的靶DNA。
CRISPR/Cas系统是古菌和细菌的抵抗病毒和质粒侵染的重要免疫防御系统。CRISPR-Cas系统划分为两大类，第一大类CRISPR-Cas系统由多亚基组成的效应复合物发挥功能；第二大类是由单个效应蛋白(如Cas9,Cpf1,C2c1、C2c2等)来发挥功能。其中，Cas9,Cpf1,C2c1和C2c2(也被称作Cas13a)均具有RNA介导的DNA核酸内切酶活性。
Cas13a(也称作C2C2)属于2类VI-A型CRISPR-Cas系统，含有两个具有RNase活性的HEPN结构域，分别负责crRNA的加工成熟和目标RNA的降解。2016年，Abudayyeh等对Leptotrichia shahii的CRISPR系统研究，发现其CRISPR系统中由Cas1，Cas2，C2C2和一个CRISPR阵列组成。Cas1，Cas2参与间隔序列的获取，C2C2作为效应蛋白质，其含有两个与RNase活性相关的HEPN结构域。然而，目前主要是利用Cas13a针对植物病毒中的RNA组分进行切割，从而抑制植物病毒，但是针对人类病毒还没有进行尝试，所以需要对Cas13a抑制人类病毒进行研究，开发出利用Cas13a拮抗人类病毒的手段。
发明内容
本发明针对人类病毒，研究了Cas13a在拮抗病毒中的应用。
为了实现上述目的，本发明提供的技术方案如下：
本发明提供了Cas13a在拮抗病毒中的应用，上述Cas13a来自Leptotrichiabuccalis、Listeria seeligeri、Leptotrichia shahii、Leptotrichia wadei CRISPR系统中的任一种，所述病毒为人类的DNA病毒、RNA病毒和逆转录病毒中的一种或多种。利用Cas13a切割RNA的活性，除了可以直接针对RNA病毒的遗传物质以及自身转录产生的RNA进行切割，可以针对DNA病毒转录产生的RNA进行切割，从而干扰各种病毒生活周期的完整性，抑制病毒的复制。
优选地，上述DNA病毒为双链DNA病毒，更优选为痘苗病毒。
优选地，上述RNA病毒为负链RNA病毒或正链RNA病毒。更优选地，负链RNA病毒为甲型流感病毒。正链RNA病毒为肠道病毒71型。
优选地，上述逆转录病毒为人类免疫缺陷病毒。
优选地，上述DNA病毒为单链线状DNA病毒。
更优选地，上述DNA病毒为腺病毒相关病毒。
与现有技术相比，本发明的技术效果：
本发明的Cas13a可以在crRNA指导下识别特定的PFS位点(非G)，介导DNA病毒、RNA病毒和逆转录病毒的RNA切割，进而拮抗病毒。具有较高RNA切割活性的有Leptotrichiabuccalis(Lbu)，Listeria seeligeri(Lse)，Leptotrichia shahii(Lsh)和Leptotrichiawadei(Lwa)等，本发明通过利用上述具有较高RNase活性的Cas13a这一基因编辑技术对三种不同类型的病毒(DNA病毒、RNA病毒和逆转录病毒)在细胞内的生活周期进行抑制，结果显示出较高RNA切割活性和更加广泛的应用范围。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明中记载的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例1 LbuCas13a/crRNA抑制HIV报告基因YFP表达流式细胞图。
图2是本发明实施例1 LbuCas13a/crRNA抑制HIV报告基因YFP表达柱状分析图。
图3为本发明实施例1 HIV-1侵入细胞的RNA柱状分析图。
图4为本发明实施例1反转录晚期的病毒DNA柱状分析图。
图5为本发明实施例1整合的病毒DNA柱状分析图。
图6为本发明实施例2 Lbu抑制IAV后NP实时定量PCR图。
图7为本发明实施例2 Lbu抑制IAV后NP mRNA柱状分析图。
图8为本发明实施例2 Lbu抑制IAV后NP vRNA柱状分析图。
图9为本发明实施例2 Lwa抑制IAV后NP实时定量PCR图。
图10为本发明实施例2 Lwa抑制IAV后NP mRNA柱状分析图。
图11为本发明实施例2 Lwa抑制IAV后NP vRNA柱状分析图。
图12为本发明实施例2 Lbu抑制IAV后PB2实时定量PCR图。
图13为本发明实施例2 Lbu抑制IAV后PB2 mRNA柱状分析图。
图14为本发明实施例2 Lbu抑制IAV后PB2 vRNA柱状分析图。
图15为本发明实施例2 Lwa抑制IAV后PB2实时定量PCR图。
图16为本发明实施例3 Western blotting实验检测EV71蛋白表达结果。
图17为本发明实施例3 qPCR实验检测EV71的mRNA水平结果。
图18为本发明实施例3病毒滴度检测结果。
图19为本发明实施例4 LshCas13a/crRNA抑制VACV的柱状分析图。
图20为本发明实施例1 LbuCas13a/crRNA抑制HIV-1感染性克隆的流式分析图。
图21为本发明实施例5 LshCas13a/crRNA抑制AVV的柱状分析图。
具体实施方式
为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面将结合附图对本发明作进一步的详细介绍。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为常规生化试剂商店购买得到的。
下面结合具体实施例对本发明做进一步详细的描述。
实施例1Cas13a抑制HIV
在本实验中，我们欲利用Cas13a靶向作用HIV-1RNA来抑制HIV-1复制。首先，设计合成靶向HIV-1各种区域的crRNA，实验结果发现在特异crRNA存在下，Cas13a显著降低了HIV报告基因YFP的表达。随后，将进一步检测HIV-1RNA含量，验证Cas13a切割导致HIV RNA降解，进而影响了最终整合至宿主细胞基因组的DNA水平。
1.1Cas13a/crRNA干扰HIV-1复制
我们设计了靶向HIV-1各种区域的crRNA(crRNA靶向序列见表1)，构建LbuCas13a/crRNA。将Lbu Cas13a/crRNA转染到293T细胞中，转染24小时后，感染VSV-G包装的HIV-1NL4-3-△E-YFP病毒。感染24小时后，收集细胞，利用细胞流式术分析黄色荧光蛋白YFP表达比例，检测HIV-1基因表达和病毒复制情况。结果如图1和图2所示，在特异crRNA存在下，LbuCas13a显著降低HIV-YFP表达。
表1 HIV-1 crRNA靶向序列
名称 靶向序列
crNT TAGATTGCTGTTCTACCAAGTAATCCAT
crLTR1 GCTCAGATCTGGTCTAACCAGAGAGACC
crLTR2 AGTCACACAACAGACGGGCACACACTAC
crLTR3 CTTTCAAGTCCCTGTTCGGGCGCCACTG
crGag CTGTCATCATTTCTTCTAGTGTCGCTCC
crTat GGCTCTAGTCTAGGATCTACTGGCTCCA
crRev CTTCTTCTATTCCTTCGGGCCTGTCGGG
crYFP ACTTGAAGAAGTCGTGCTGCTTCATGTG
1.2 Cas13a对于HIV生活周期的影响
在本实验中，利用HIV-1复制阶段特异的引物，反转录早期R-U5，反转录晚期U5-gag，以及整合的HIV基因组Alu-LTR，进行实时荧光定量PCR，检测HIV-1复制周期各阶段基因组拷贝数。实验结果发现，Cas9编辑后，HIV-1侵入细胞的RNA(图3)以及反转录晚期的病毒DNA(图4)和整合的病毒DNA(图5)拷贝数显著下降。
此外，我们设计了针对HIV感染性克隆各个位置的crRNA(crRNA靶向序列见表1，构建了LbuCas13a/crRNA。将LbuCas13a/crRNA和HIV感染性克隆pNL4-3-△E-YFP共转染至293T细胞中，48小时后收集细胞进行流式分析，结果入下图(图20)所示，在特异的crRNA存在下，LbuCas13a/crRNA显著降低EGFP的荧光强度。
实施例2Cas13a抑制IAV(甲型流感病毒)
我们设计了靶向IAV(WSN,H3N2)的NP以及PB2的crRNA(crRNA靶向序列见表2)，构建Lbu Cas13a/crRNA和LwaCas13a/crRNA。将Lbu Cas13a/crRNA和LwaCas13a/crRNA转染到293T细胞中，转染24小时后，感染IAV(WSN,H3N2)病毒。感染24小时后，收集细胞，利用实时定量PCR，检测IAV的NP mRNA和vRNA水平。结果如图6-图15所示，在有特异的crRNA存在下，Lbu Cas13a和LwaCas13a/crRNA显著降低IAV的NP mRNA和vRNA水平。
表2 IAV crRNA靶向序列
名称 靶向序列
NP crRNA1 ATCGTTTGGTGCCTTTGGTCGCCATGAT
NP crRNA4 ATCATGGCGACCAAAGGCACCAAACGAT
PB2 crRNA1 ATCTGCTGATACTGTGGCTCTTCTTACT
PB2 crRNA4 AGTAAGAAGAGCCACAGTATCAGCAGAT
实施例3Cas13a抑制EV71
EV71为单股正链RNA病毒，结构基因2A、3D、3C在序列上相对保守。我们设计了靶向EV71的2A，3D和3C的crRNA(crRNA靶向序列见表3)，构建Lwa Cas13a/crRNA。将Lwa Cas13a/crRNA转染到293T细胞中，转染24小时后，感染EV71病毒，收集细胞进行Western blotting实验检测EV71蛋白表达(图16)，qPCR实验检测EV71的mRNA水平(图17)，收集上清检测病毒滴度(图18)。结果如图16-图18所示，在有特异的crRNA存在下，Lwa Cas13a显著降低EV71蛋白，mRNA水平以及释放出来的病毒滴度。
表3 EV71 crRNA靶向序列
名称 靶向序列
cr2A CAATCGCAACGGGCAATCGTGTCACAAC
cr3D GCATCATAACCTGAGTAGTCAAAGGCAA
cr3C ACATGGTGAAATGCCCCTGGTCTGTTTG
实施例4 Cas13a抑制痘苗病毒(VACV)
痘苗病毒(VACV)是一种与天花病毒遗传相关的大型双链DNA痘病毒，在其生活周期中需要转录合成mRNA并翻译成相关蛋白质，从而完成生命周期。我们设计了靶向VACV(Tiantan)必需基因D5R的crRNA(crRNA靶向序列见表4)，构建LshCas13a/crRNA。将LshCas13a/crRNA转染到Vero细胞中，转染24小时后，感染VACV，感染48小时后，收集病毒检测滴度如图19所示，在特异crRNA存在下，LshCas13a显著降低VACV的滴度。
表4 VACV必需基因D5R的crRNA靶向序列
名称 靶向序列
VACV crRNA1 AAACTGTTTAATATTGCACAAAGAATTT
VACV crRNA2 AACACCTTGTGCATTATGTAAAAAACGA
VACV crRNA3 CGAAAGACTGTAGAAGCTAACATACGAG
实施例5Cas13a抑制腺病毒相关病毒(AAV)
腺病毒相关病毒(adenovirus associated virus，AAV)是一类单链线状DNA病毒，重组腺相关病毒是基因传递和表达的一个重要工具。我们设计了靶向重组AVV所表达的EGFP的crRNA(crRNA靶向序列见表5)，构建了LbuCas13a/crRNA。将LbuCas13a/crRNA转染至293T细胞中，转染24小时后，感染重组AAV，感染48小时后，收集细胞进行流式分析，结果如图21所示，在特异的crRNA存在下，LbuCas13a/crRNA显著降低了EGFP的荧光强度。
表5 AAV表达EGFP的crRNA序列
名称 靶向序列
crEGFP-1 AACTTGTGGCCGTTTACGTCGCCGTCCA
crEGPF-2 ACTTGAAGAAGTCGTGCTGCTTCATGTG
crEGPF-2 AACTCCAGCAGGACCATGTGATCGCGCT
以上这五种病毒分别为逆转录病毒(人类免疫缺陷病毒，HumanImmunodeficiency Virus,HIV)，负链RNA病毒(甲型流感病毒，Influenza A virus,IAV)，正链RNA病毒(肠道病毒71型，EV71)双链DNA病毒(痘苗病毒)和单链DNA病毒(腺病毒相关病毒)。结果显示Cas13a/crRNA显著抑制了HIV-1、IAV、EV71、痘苗病毒(VACV)和腺病毒相关病毒的复制。
以上只通过说明的方式描述了本发明的某些示范性实施例，毋庸置疑，对于本领域的普通技术人员，在不偏离本发明的精神和范围的情况下，可以用各种不同的方式对所描述的实施例进行修正。因此，上述附图和描述在本质上是说明性的，不应理解为对本发明权利要求保护范围的限制。
序列表
<110> 中国医学科学院病原生物学研究所
<120> Cas13a在拮抗病毒中的应用
<160> 21
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 28
<212> DNA
<213> 人类免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus)
<400> 1
tagattgctg ttctaccaag taatccat 28
<210> 2
<211> 28
<212> DNA
<213> 人类免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus)
<400> 2
gctcagatct ggtctaacca gagagacc 28
<210> 3
<211> 28
<212> DNA
<213> 人类免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus)
<400> 3
agtcacacaa cagacgggca cacactac 28
<210> 4
<211> 28
<212> DNA
<213> 人类免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus)
<400> 4
ctttcaagtc cctgttcggg cgccactg 28
<210> 5
<211> 28
<212> DNA
<213> 人类免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus)
<400> 5
ctgtcatcat ttcttctagt gtcgctcc 28
<210> 6
<211> 28
<212> DNA
<213> 人类免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus)
<400> 6
ggctctagtc taggatctac tggctcca 28
<210> 7
<211> 28
<212> DNA
<213> 人类免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus)
<400> 7
cttcttctat tccttcgggc ctgtcggg 28
<210> 8
<211> 28
<212> DNA
<213> 人类免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus)
<400> 8
acttgaagaa gtcgtgctgc ttcatgtg 28
<210> 9
<211> 28
<212> DNA
<213> 甲型流感病毒(Influenza A virus)
<400> 9
atcgtttggt gcctttggtc gccatgat 28
<210> 10
<211> 28
<212> DNA
<213> 甲型流感病毒(Influenza A virus)
<400> 10
atcatggcga ccaaaggcac caaacgat 28
<210> 11
<211> 28
<212> DNA
<213> 甲型流感病毒(Influenza A virus)
<400> 11
atctgctgat actgtggctc ttcttact 28
<210> 12
<211> 28
<212> DNA
<213> 甲型流感病毒(Influenza A virus)
<400> 12
agtaagaaga gccacagtat cagcagat 28
<210> 13
<211> 28
<212> DNA
<213> 肠道病毒71型(enterovirus71)
<400> 13
caatcgcaac gggcaatcgt gtcacaac 28
<210> 14
<211> 28
<212> DNA
<213> 肠道病毒71型(enterovirus71)
<400> 14
gcatcataac ctgagtagtc aaaggcaa 28
<210> 15
<211> 28
<212> DNA
<213> 肠道病毒71型(enterovirus71)
<400> 15
acatggtgaa atgcccctgg tctgtttg 28
<210> 16
<211> 28
<212> DNA
<213> 痘苗病毒(Acne virus)
<400> 16
aaactgttta atattgcaca aagaattt 28
<210> 17
<211> 28
<212> DNA
<213> 痘苗病毒(Acne virus)
<400> 17
aacaccttgt gcattatgta aaaaacga 28
<210> 18
<211> 28
<212> DNA
<213> 痘苗病毒(Acne virus)
<400> 18
cgaaagactg tagaagctaa catacgag 28
<210> 19
<211> 28
<212> DNA
<213> 腺病毒相关病毒(adenovirus associated virus)
<400> 19
aacttgtggc cgtttacgtc gccgtcca 28
<210> 20
<211> 28
<212> DNA
<213> 腺病毒相关病毒(adenovirus associated virus)
<400> 20
acttgaagaa gtcgtgctgc ttcatgtg 28
<210> 21
<211> 28
<212> DNA
<213> 腺病毒相关病毒(adenovirus associated virus)
<400> 21
aactccagca ggaccatgtg atcgcgct 28

Claims (9)

1.Cas13a在拮抗病毒中的应用，其特征在于，所述Cas13a来自Leptotrichiabuccalis、Listeria seeligeri、Leptotrichia shahii、Leptotrichia wadeiCRISPR系统中的任一种，所述病毒为人类的DNA病毒、RNA病毒和逆转录病毒中的一种或多种。
2.根据权利要求1所述的Cas13a在拮抗病毒中的应用，其特征在于，所述DNA病毒为双链DNA病毒。
3.根据权利要求2所述的Cas13a在拮抗病毒中的应用，其特征在于，所述DNA病毒为痘苗病毒。
4.根据权利要求1所述的Cas13a在拮抗病毒中的应用，其特征在于，所述RNA病毒为负链RNA病毒或正链RNA病毒。
5.根据权利要求4所述的Cas13a在拮抗病毒中的应用，其特征在于，所述负链RNA病毒为甲型流感病毒。
6.根据权利要求4所述的Cas13a在拮抗病毒中的应用，其特征在于，所述正链RNA病毒为肠道病毒71型。
7.根据权利要求1所述的Cas13a在拮抗病毒中的应用，其特征在于，所述逆转录病毒为人类免疫缺陷病毒。
8.根据权利要求1所述的Cas13a在拮抗病毒中的应用，其特征在于，所述DNA病毒为单链线状DNA病毒。
9.根据权利要求8所述的Cas13a在拮抗病毒中的应用，其特征在于，所述DNA病毒为腺病毒相关病毒。
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