CN110195129B - 一种靶向hbv耐药突变基因的pcr-crispr检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种靶向HBV耐药突变基因的PCR‑CRISPR检测方法,所述方法包括(1)以一对特异性引物PCR扩增待测样本的核酸,所述上游引物的5’端设置有能被T7RNA聚合酶识别并转录的序列;(2)在包括有识别HBV YMDD耐药突变位点的crRNA、T7RNA聚合酶、Cas13a蛋白和RNA酶报告分子的检测体系中对待测样本核酸的扩增产物中是否存在有耐药突变基因进行检测,所述耐药突变基因靶序列为HBV基因组YMDD区的YIDD或者YVDD基因突变。本发明还公开了能够靶向HBV的YIDD或者YVDD耐药基因突变的crRNA以及含有该crRNA的试剂盒。本发明提供的方法能够简便、快速地检测HBV耐药突变基因,具有极高的灵敏度和特异性。
Description
技术领域
本发明涉及一种crRNA分子及通过CRISPR-Cas13a系统对乙肝病毒耐药突变基因进行检测的技术,属于分子生物学技术领域。
背景技术
乙型肝炎是一种由乙型肝炎病毒(Hepatitis B Virus,HBV)引起的严重传染性疾病。全球约有2.4亿人为乙肝病毒表面抗原携带者,每年约有一百万人死于HBV引起的肝脏相关疾病。我国是乙肝大国,现有HBV感染者约9000万人,其中慢性乙型肝炎患者约2800万例,表明乙肝病毒感染已经成为危害公众健康的重大问题。
乙肝病毒的持续复制是乙肝致病的根本原因,乙肝治疗的根本目的是抑制病毒复制。常用的乙肝抗病毒治疗药物有干扰素和核苷类似物等。干扰素(Interferon,IFN)是一种广谱抗病毒药物,并不直接杀伤或抑制HBV,主要通过识别细胞表面受体使细胞产生抗病毒蛋白,从而抑制HBV的复制,同时还可以增强免疫细胞的活力,起到免疫调节作用。核苷类似物(Nucleostide Analogues,NAs)可通过抑制病毒DNA逆转录酶的活性从而抑制乙肝病毒的复制。抗HBV治疗的临床实践已证明核苷类似物的“有效性”、“易行性”和“安全性”,但治疗过程中所出现的“耐药性”已成为影响其长期抗病毒治疗的最大“临床问题”之一。乙肝病毒自身易发生变异,其在感染者体内可形成一个优势株为主的相关突变株病毒群,称为准种,有利于病毒在不良环境下生存。乙肝病毒准种的存在,严重干扰了核苷类药物的作用效果。一旦耐药发生,临床会出现HBV载量上升,ALT上升等现象,进而表现出肝炎复发、肝病急性加重、肝硬化,甚至肝衰竭、死亡等;对于肝移植患者,耐药甚至会引起肝移植发生排斥、导致肝移植失败。伴随着乙型肝炎抗病毒治疗的大规模展开,我国耐药性HBV毒株在治疗人群中逐渐增加,导致原本有效的抗病毒药物抑制病毒复制能力大大降低,甚至出现病情反复、疾病进展迅速等不良后果,而药物之间的交叉耐药也会给后续治疗的选择带来极大的困难。
因此,乙肝病毒耐药突变的检测对于乙肝患者的临床用药具有重要的指导意义。通过基因变异检测来快速判断耐药与否,从而指导临床用药,实现个体化医疗,已成为HBV耐药研究的常用手段。表型耐药是确定基因型耐药的金标准,但需要消耗大量人力、物力和时间。 HBV突变的基因型耐药检测一般采用直接测序法,这种方法操作简单易行、价格低廉,但敏感性差,耐药突变株比例低于20%时则无法检出;使用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱技术(matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight massspectrometry, MALDI-TOF MS)可以实现对低浓度、低比例耐药突变的检测,但是该方法的样本前处理过程复杂,检测成本以及对仪器设备和相关操作人员的要求均较高,不适合于临床检测。新发展的高通量深度测序具有通量大、敏感性高、可检出低频突变位点,但成本较高,耗时较长。
Cas13a(之前被称作C2c2)是一个RNA引导的CRISPR效应蛋白,在识别特定RNA序列后可激活其RNA酶活性。不同于靶向DNA 的CRISPR相关酶(如Cas9和Cpf1),Cas13a具有两种不同的RNA 切割活性,在切割靶RNA之后仍然保持活性,表现出非特异的切割活性,继续切割其他的非靶RNA,这一切割效应也被称作“附带切割 (collateral cleavage)”。研究人员利用Cas13a结合crRNA对靶序列的特异性识别及后续产生的附带切割活性,将其用于核酸的高灵敏、高特异性检测中。
2016年10月,Doudna研究组首次将LbuCas13a(Leptotrichia buccalis)蛋白应用于RNA靶标的检测。该方法首先将LbuCas13a蛋白与crRNA进行孵育,使其组装成LbuCas13a-crRNA复合体,孵育后的产物10倍稀释并加入反应缓冲液、靶点RNA以及报告RNA,报告RNA两端分别带有荧光基团和淬灭基团,用于检测体系中的 RNase(被激活的Cas13a)。体系中存在与crRNA互补的靶点RNA 时,LbuCas13a的构象变化,形成具有RNase活性的蛋白,从而剪切体系中的报告RNA,发出荧光。但是其检测灵敏度仅能达到10pmol/L。然而,对于实验室检测来说,埃摩(aM)级别的检出限才具有实际应用价值。
2017年4月,张峰等建立了基于CRISPR/Cas13a的核酸检测平台SHERLOCK(Specific High Sensitivity Enzymatic Reporter UnLOCKing),利用Leptotrichiawadei Cas13a蛋白(LwCas13a)的非特异剪切活性,结合可以高效扩增目的片段的重组聚合酶扩增技术 (Recombinase Polymerase Amplification,RPA),实现了对痕量核酸快速、廉价、高灵敏的检测。研究表明,Cas13a可用于生物样本(血液或尿液)中寨卡以及登革热病毒的鉴定,并进一步区分非洲毒株和美洲毒株的基因序列,还可用于鉴定细菌的特定类型、人体内游离的突变肿瘤DNA。以上均表明该技术在核酸检测中巨大应用前景。
此前文献中建立的SHERLOCK核酸检测技术,是将LwCas13a 蛋白与重组聚合酶等温扩增技术RPA相结合,实现了对目的核酸的高灵敏、高特异性检测。然而,考虑到RPA等温扩增技术成本较高,且扩增过程容易发生污染,目前尚不适用于常规的临床检测。
发明内容
为解决上述技术问题,基于PCR的检测技术具有成熟度高,系统稳定且已广泛应用于临床分子检测领域的技术优势,本发明的目的在于将PCR技术与基于Cas13a蛋白的CRISPR项结合结合,通过设计、构建、筛选,最终提供一段能靶向HBV耐药性基因突变位点,并激活CRISPR-Cas13a系统的crRNA,利用该靶点构建的 CRISPR-Cas13a系统能够特异性地检测耐药性基因突变位点。
为实现上述目的,本发明以CRISPR-Cas13a系统的原理及靶序列的选择原则为基础,通过比对根据保守区设计的3条crRNA,优选出对CRISPR-Cas13a系统激活效果最好的crRNA进行乙肝病毒DNA 耐药基因的检测。
基于上述研究,本发明首先提供了一种基于非诊断目的的PCR 结合CRISPR检测乙肝病毒DNA耐药基因的方法,所述方法包括以下步骤:
(1)以一对上下游特异性引物PCR扩增待测样本的核酸,所述下游引物的5’端设置有能被T7RNA聚合酶识别并转录的序列;
(2)在包括有识别HBV DNA靶序列的crRNA、T7RNA聚合酶、 Cas13a蛋白和报告RNA的检测体系中对待测样本核酸的扩增产物中是否存在有靶序列进行检测,所述耐药基因靶序列为HBV基因组 YMDD区的YIDD或者YVDD基因突变。
在一个优选的实施方案中,所述上游引物的序列如SEQ ID NO.1 所示,所述下游引物的序列如SEQ ID NO.2所示。
在一个更为优选实施方案中,所述crRNA的序列如SEQ ID NO.3,所述crRNA靶向YIDD,或者crRNA的序列如SEQ ID NO.5所示,所述crRNA靶向YVDD;或者crRNA的序列如SEQID NO.6所示,所述crRNA靶向YVDD。
在一个更为优选的实施方案中,,所述Cas13a蛋白为LwCas13a 蛋白。
更为优选地,在所述的检测体系中,还含有RNA酶抑制剂。
更为优选地,在所述的检测体系中,还含有RNA酶活性报告分子。
尤为优选地,所述RNA酶活性报告分子为一端标记有淬灭基团,另一端标记有荧光基团的RNA分子,所述分子被激活RNA酶活性的Cas13a剪切,并释放荧光。
其次,本发明还提供了一种能够靶向HBV DNA耐药基因靶序列 YIDD的crRNA,所述crRNA的序列由SEQ ID NO.3所示。
再次,本发明还提供了一种能够靶向HBV DNA耐药基因靶序列 YVDD的crRNA,所述crRNA的序列由SEQ ID NO.5或者SEQ ID NO.6所示。
最后,本发明提供了一种含有上述crRNA,用于检测待测样本中 HBV DNA耐药基因的试剂盒,所述试剂盒还含有LwCas13a蛋白,以及一对PCR扩增上下游引物,所述上游引物的序列如SEQ ID NO.1 所示,所述下游引物的序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明提供的方法简单、快捷、灵敏、特异,可在短时间内通过荧光信号的变化检测到含有相应突变的目标核酸。在对YVDD的检测中,反应进行到6分钟时,突变型基因的荧光信号就明显高于野生型基因。该方法可以区分单拷贝的YVDD突变株与106拷贝的野生株,灵敏度高于qPCR。在对YIDD的检测中,表明该方法可最短在4分钟内鉴定出102拷贝的乙肝病毒YIDD突变,而在10分钟时,突变株的荧光检测信号更强,更易与野生型区分。该方法可以有效区分 102拷贝的YIDD突变株与106拷贝的野生株。在对临床样本的实际检测中,本发明方法检测血清样本YVDD突变的敏感度为100%,95% CI:67.86-100%,特异度99.03%,95%CI:97.37-99.69%;本发明方法检测血清样本YIDD突变的敏感度为100%,95%CI:87.68-100%,特异度97.94%,95%CI:95.82-99.04%。
附图说明
图1.靶向HBVYMDD耐药突变基因的PCR-CRISPR示意图;
图2.YMDD区序列保守性分析示意图;
图3.rt204位点YIDD、YVDD耐药突变crRNA设计示意图;
图4.YVDD crRNA-a特异性检测对照图;
图5.YVDD crRNA-a和b特异性检测及对照图;
图6.YVDD crRNA-c对不同ssRNA序列的荧光信号变化图;
图7.YIDD crRNA-c对不同ssRNA序列的荧光信号变化图;
图8.HBV质粒PCR扩增后琼脂糖凝胶电泳图谱;
图9. 10分钟时YVDD不同浓度突变株与野生株突变荧光信号比较图;图10.反应前10分钟1copy/μL YVDD突变株与野生株荧光信号变化图;
图11. 10分钟时1copy/μL YVDD突变株与106copies/μL野生株荧光信号比较图;
图12.qPCR检测YVDD突变的灵敏度曲线图;
图13. 10分钟时YIDD不同浓度突变株与野生株突变荧光信号比较图;
图14. 100copy/μLYIDD突变株与野生株荧光信号变化图;
图15. 10分钟时100copies/μL YIDD突变株与106copies/μL野生株荧光信号比较图;
图16.qPCR检测YIDD突变的灵敏度曲线图;
图17.血清样本rt204位点测序结果图。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明,本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的,并不对本发明的保护范围构成任何限制。
本发明实施例涉及的实验材料
1.试剂:蛋白酶抑制剂、2×Pfu taq Mix(CW0717M),TRIzon 总RNA提取试剂盒(CW0580S)、anti-his-HRP抗体、广谱彩虹预染蛋白Marker(江苏康为世纪生物科技有限公司),SOC液体培养基、 IPTG(全氏金生物,GF101-01),溶菌酶、全能核酸酶、SUMO蛋白酶、NTPmix(Solarbio),EDTA、1M Tris pH 8.0,Bradford蛋白浓度测定试剂盒,SDS-Page相关缓冲液、考马斯亮蓝染色套装(碧云天),报告RNA试剂盒(RNAse Alert v2,4479768)、ECL显色液(SuperSignal West Femto Maximum Sensitivity Substrate,34096)、透析袋Slide-A-Lyzer G2Dialysis Cassettes,20K(Thermo),琼脂糖凝胶电泳DNA纯化回收试剂盒(天根生化),黑色96孔培养板(Costar, 3916),RNA合成试剂盒(T7Quick High Yield RNASynthesis kit), RNA酶抑制剂(Murine RNase inhibitor),T7RNA聚合酶(NEB), RNA纯化磁珠(Agencourt RNAClean XP,Beckman Coulter,A63987)、 ExTaqTM Version 2.0(TaKaRa,RR003A),二硫苏糖醇(DTT,北京欣经科生物技术有限公司),氨苄西林钠(华北制药股份有限公司), NP-40(FLUKA,74385)、咪唑等化学试剂(国药集团化学试剂有限公司),酵母提取物、胰蛋白胨(OXOID),Tris平衡酚(灏样生物, TBD0001HY)。蛋白纯化柱:HisTrapHP column(GE Healthcare Life Science),UniGel-50SP(Nano-Micro Tech)。
2.LwCas13a蛋白
(1)LwCas13a蛋白诱导表达、纯化及鉴定:
质粒Addgene-PC013,Twinstrep-SUMO-huLwCas13a(购于 Addgene公司),将质粒转入Rosetta(DE3)感受态细胞中,TB液体培养基37℃,200rpm培养14h以上,1:100接入新的Amp+抗性TB培养基中,37℃,300rpm培养至OD600=0.6左右,加入IPTG使终浓度为500uM,18℃,200rpm培养16h。离心收集菌体经超声破碎后的收集蛋白上清,并利用LwCas13a蛋白所带的His标签通过Ni柱(HisTrap HP column,GE Healthcare Life Science)进行初步纯化,利用SUMO 将所带标签部分进行酶切,再利用LwCas13a蛋白的等电点特性通过阳离子交换柱(UniGel-50SP,Nano-Micro Tech)进行第二次纯化,实验过程中利用SDS-PAGE蛋白电泳鉴定每一步得到的蛋白,进行蛋白大小分析,同时利用His标签抗体进行蛋白的初步鉴定,以确定诱导的蛋白为目的蛋白。
(2)LwCas13a蛋白浓度及活性鉴定
使用蛋白活性检测试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司)检测 LwCas13a蛋白浓度,利用报告RNA试剂盒(invitrgen),检测490nm 激发、520nm波长下的发射光的荧光值,判断体系中的Cas13a蛋白是否被激活。即在靶点RNA、与靶点对应的crRNA的存在下,Cas13a蛋白是否能被激活并剪切体系中的报告RNA,使其发出荧光,同时设置非特异性靶点进行特异性检测,以及人细胞总RNA作为背景 RNA,检测体系是否会受到背景RNA的干扰。检测结果发现,本发明纯化得到纯度较高的LwCas13a蛋白,并且无RNase的污染,该蛋白与crRNA结合形成的复合体,可被特异的靶序列激活,并剪切体系中的报告RNA,从而发出荧光信号,该蛋白可用于后续的检测实验。同时,在蛋白终浓度为45nM时即可检测到明显的荧光信号变化。
LwCas13a蛋白的表达、纯化及活性鉴定的详细技术内容参见 CN108715849A,本发明引用该专利作为说明书的一部分。
3、乙肝病毒YMDD耐药突变检测方法的设计
乙肝病毒YMDD区序列(TATATGGATGAT)存在两种耐药突变,YVDD和YIDD,这两种耐药突变YVDD和YIDD分别表示其中的甲硫氨酸M(ATG)突变为缬氨酸V(GTG,GTA,GTC,GTT) 和异亮氨酸I(ATT,ATC,ATA)。首先,我们根据这两种突变的具体序列类型分别设计了针对这两种耐药突变的crRNA,用于耐药突变的检测。具体方法为:首先将耐药突变区进行PCR扩增,扩增引物5’端带有T7转录序列,取部分PCR产物分别用结合有YVDD crRNA 和YIDDcrRNA的LwCas13a进行检测。检测体系中含有T7RNA聚合酶可将第一步得到的dsDNA转录成ssRNA,当体系中的crRNA与ssRNA匹配结合后,激活LwCas13a的平行切割效应,剪切体系中的报告RNA发出荧光。突变检测方法的示意图如图1所示。
4.YMDD区基因序列分析及耐药突变质粒的构建
由氨基酸密码子分析可知,GTG,GTA,GTC,GTT四种密码子均编码Val氨基酸,但是GTA,GTC,GTT这三种突变需要野生型HBV 同时突变两个碱基,此种耐药突变发生的概率较低;故针对YVDD 突变,我们构建了其突变为GTG的质粒作为YVDD突变的标准品。 ATT,ATA,ATC均编码异亮氨酸Ile,根据第二部分得到的乙肝病毒 P区基因序列分析结果,我们发现,ATT,ATA,ATC三种突变在7717 个分析结果中,突变比例分别为:3.16%(244/7717),0.51%(39/7717) 和0.04%(3/7717)。故我们首先针对突变比例最高的ATT构建了相应的YIDD耐药突变标准品。质粒序列如下:
表1.HBV-DNA rt204位点野生型及突变型质粒序列
实施例1:用于本发明的crRNA和PCR引物的设计和制备
(1)YVDD和YIDD耐药突变crRNA的设计
对YMDD区上下游共32bp(725-756bp)的核苷酸进行了序列保守性的分析(见图2),对于保守性较低的位点,选择每个位点出现概率最高的碱基设计crRNA。图2中方框标记rt204位点,分析结果显示,除nt732,nt735和nt753这三个位点以外,该处其他位点的序列均比较保守。根据该部分序列的保守性特点,我们设计了相应的 crDNA模板和PCR引物(见表2),用于制备突变检测用crRNA。 DNA序列由北京天一辉远公司合成。
表2.用于制备突变检测用crRNA的crDNA模板和PCR引物
YMDD突变检测crRNA设计结果如图3所示。图3靶序列中 YVDD、YIDD突变位点分别标记(ATG中的A和G);加粗部分显示为加入的错配碱基位点。
2.YVDD和YIDD耐药突变crRNA的制备
根据文献中的研究方法,经DNA的合成、退火、转录、纯化步骤,合成相应的crRNA(J.T.Huang,et al.Clinical chemistry 61,290-296 (2015).)。(RNA相关操作避免RNase的污染),具体步骤为:
将上述序列用ddH2O稀释成10μM。配制PCR反应体系如下:上游引物为T7-crRNA-F,模板分别为HBV-1,2,3-crDNA,对应下游引物分别为HBV-1,2,3R。
表3.PCR扩增体系
PCR反应条件:95℃5min热变性;95℃30s,60℃30s,72℃ 15s共38个循环;72℃自动延伸10min;4℃保存PCR产物。
PCR产物使用Tris平衡酚进行产物的纯化,过程如下:
Tris平衡酚(灏样生物)取500μL,加入等体积的三氯甲烷,振荡混匀后短暂离心,弃上清;取150μL酚氯仿混合液加入PCR产物中,混匀后12,000rpm离心1min;取上清液到一个新的1.5mL离心管,加入无水乙醇使上清与乙醇比例为3:7,12,000rpm离心10min,弃上清;加入200μL 75%的乙醇,12,000rpm离心10min,弃上清(该步骤共进行三次)。得到的沉淀室温晾干(约10min),加入50μL无 RNA酶的水,Nanodrop检测浓度,-20℃保存。
取1μg纯化的PCR产物使用T7转录试剂盒(NEB公司)转录 crRNA,体系如下表4:
表4.crRNA转录体系
注:*X为DNA模板体积。
上述体系混匀后,37℃转录过夜,使用DNaseⅠ去除多余的DNA:上一步得到的转录产物加入20μL无RNase的水,加入2μL DNaseⅠ,混匀,37℃孵育15min。
按照Agencourt RNAClean XP说明书(Beckman Coulter)纯化转录的RNA:
磁珠振荡混匀,向转录产物中加入1.8倍体积的磁珠,吹打10 次或涡旋30s以混匀磁珠和转录体系,室温静置5min。将反应体系放到磁力架,静置5-10min以分离磁珠。轻轻吸出体系中的液体,避免磁珠被吸出,向磁珠中加入200μl 70%的乙醇(无RNase水配制),室温孵育30s,吸出乙醇;重复此过程清洗磁珠,共3次。室温晾干体系,去除体系中的乙醇,约10min。加入50μL RNase-free水,涡旋30s或用移液器吹打10次,吸出上清液,放入无RNase的1.5mL 离心管中,Nanodrop测定纯化得到的crRNA浓度,-80℃分装备用。
共制备出4种crRNA:YIDD-crDNA、YVDD-crDNA-a、 YVDD-crDNA-b、YVDD-crDNA-c,用于下面的CRISPR-Cas13a检测 HBV耐药突变(见表5)。将HBV耐药突变检测的靶点序列转录得到相应的ssRNA,用所述crRNA进行检测,比较不同crRNA的信号强弱,选择荧光信号最强的crRNA作为后续的检测crRNA。
(2)PCR扩增引物的设计
设计PCR扩增HBV DNA检测靶点序列的引物,在所述引物的 5’端具有一段T7转录序列,使得PCR扩增得到的双链DNA(dsDNA) 可以被T7RNA聚合酶识别并且进行转录(见表5)。DNA序列由北京天一辉远公司合成。
表5.YMDD耐药突变相关crRNA序列和引物
表中位点的计数参考基因组位点信息Genebank ID:D00329。
实施例2.YVDD和YIDD耐药突变crRNA的特异性检测
将乙肝病毒野生株和两种耐药突变株的靶序列转录成相应的 ssRNA,分别利用上述两个耐药突变crRNA检测其对三个序列的特异性。
(1)突变crRNA对野生型和突变型序列的检测
利用前文所述构建的野生型、两种耐药突变型质粒和设计的引物 HBV-F、HBV-R,进行扩增、转录、ssRNA的纯化,反应体系和条件同前。用两种crRNA分别检测三个序列的ssRNA,配制检测体系如下:
表6.ssRNA靶点剪切体系
随后37℃,荧光定量PCR仪FAM通道检测体系的荧光信号变化。
(2)YVDD crRNA-a的特异性检测
根据上一步对YMDD区序列保守性的分析,我们首先设计了与 YVDD(TATGTGGATGAT)和YIDD(TATATTGATGAT)突变序列完全匹配的crRNA:YVDD crRNA-a和YIDDcrRNA。我们检测了 YVDD crRNA-a对已转录为HBV ssRNA的野生型(YMDD)、YVDD 突变型和YIDD突变型序列的检测效果,结果如图4所示。结果显示,阴性对照在检测的1h内荧光信号保持在56.18±8.93a.u.范围内不变;加入野生型、YIDD突变型和YVDD突变型的模板后均出现了荧光信号的升高,其中与YVDD crRNA完全匹配的YVDD ssRNA模板的信号最强,在1h时荧光信号为10075.29a.u.,野生型ssRNA模板的信号(7230.58a.u.)较弱,YIDD突变型模板的信号最弱(2628.98)。由靶点crRNA的设计可知,野生型模板(rt204位点处为AUG)与设计的YVDD crRNA-a(rt204位点处为GUG)仅有一个碱基不匹配,而与YIDD突变序列(rt204位点处为AUU)有两个碱基不匹配,因此导致YVDD crRNA-a对YIDD ssRNA模板的信号更低。
然而结果显示:设计的YVDD crRNA-a不仅可以与YVDD突变序列结合激活LwCas13a的剪切活性,该系统同时还可以对YIDD突变序列以及野生型YMDD产生荧光信号。虽然与后两个序列反应的信号较YVDD突变弱,但是该靶点区分YVDD突变序列效果欠佳,因此我们进一步改进了YVDD突变检测crRNA的设计。
(3)YVDD crRNA-b、c的特异性检测
前期研究显示(J.S.Gootenberg,et al.Science 356,438-442 (2017).),在crRNA序列中适当引入错配的核苷酸位点,可大幅提高 crRNA对单碱基突变的检测特异性,因此,我们另外设计了两个含有单碱基错配的crRNA,分别为YVDD crRNA-b、c,进一步对这两个crRNA的特异性进行了检测。
如图5A所示,使用YVDD crRNA-b检测不同模板的荧光信号时, 1h内,阴性对照荧光信号保持在138.4±8.85a.u.范围内不变;野生型模板荧光信号由64.36a.u.变为230.32a.u.;YIDD突变型模板荧光信号由169.28a.u.变为255.98a.u.;而YVDD突变模板的荧光信号从 174.83a.u.迅速上升至3592.17a.u.,反应1h后荧光信号约为阴性对照的26倍,野生型模板的15倍,YIDD突变型模板的15倍。如图5B 所示,在使用YVDD crRNA-c检测不同模板的荧光信号时,出现了与YVDD crRNA-b相似的结果。1h内,阴性对照荧光信号保持在133.53±9.16a.u.范围内不变;野生型模板荧光信号由96.75a.u.升高至 554.57a.u.;YIDD突变型模板荧光信号由130.12a.u.升高至269.20 a.u.;而YVDD突变模板的荧光信号从253.91a.u.上升至14825.01a.u.,荧光信号约为阴性对照的99倍,野生型模板的26倍,YIDD突变型模板的55倍。上述结果显示,YVDD crRNA-b、c对YVDD序列有明显的荧光信号,而对YMDD野生型和YIDD突变型序列的荧光信号较弱,表明这两个crRNA具有较高的特异性。为了筛选出最优的 crRNA,我们进一步比较了这两个crRNA对YVDD突变型模板荧光信号的强度差异,结果如图5C,YVDD crRNA-c这一突变crRNA较 YVDD crRNA-b的荧光信号更强,因此,我们选择YVDD crRNA-c 作为后续检测该突变的crRNA序列。
(4)进一步比较YVDD crRNA-c对不同突变类型荧光信号的强度,YVDD crRNA-c的荧光信号变化见图6A。由30min时的数据可知(见图6B),YVDD crRNA-c对YVDD突变序列(7524±529.72 a.u.)的荧光信号显著高于野生型(1248±90.42a.u.)和YIDD突变型(1104±161.69a.u.)序列(t检验,P<0.001),可以特异性地区分 YVDD突变序列,而后两者与阴性对照(1364±185.30a.u.)之间无统计学差异。说明筛选出的crRNA具有较强的特异性。
(5)YIDD突变crRNA的筛选
采用相同的方法,我们对YIDD突变crRNA的特异性进行了检测,结果如图7,图7中,A.1h内YIDD crRNA对不同ssRNA序列的荧光信号变化折线图,B.30min时YIDD crRNA对不同ssRNA序列的荧光信号强度比较结果。结果显示,在反应1h内,阴性对照荧光值1h保持在1039±30.36a.u.范围内不变;YIDD ssRNA模板序列的荧光信号明显高于阴性对照、野生型和YVDD突变型,且荧光信号在检测的前10min内迅速升高,从2919a.u.上升至7285a.u.,10min 后变化缓慢,至1h时荧光信号上升至10544a.u.(约为阴性对照的 10倍);野生型模板的荧光信号在1h内变化平缓,荧光信号从1202 a.u.上升至2774a.u.(约为阴性对照的2.5倍);YVDD突变型模板的荧光信号变化与野生型类似,荧光信号由1253a.u.升高至3042a.u. (约为阴性对照的3倍)。
YIDD crRNA对YIDD突变序列进行检测时出现明显的荧光信号,对野生型和YVDD突变型序列在检测时只出现了较弱的荧光信号。通过分析30min时的数据可知,YIDD crRNA对YIDD突变序列 (9624±263.33a.u.)的荧光信号显著高于野生型(2598±156.21a.u.) 和YVDD突变型(2737±68.44a.u.)序列(t检验,P<0.001)。提示该crRNA可以有效区分YIDD突变序列。通过比较野生型、YVDD 与阴性对照(1056±23.51a.u.)的荧光信号我们发现:野生型和YVDD 模板的信号与阴性对照相比也具有显著性差异(t检验,P<0.001),表明该crRNA存在一定的非特异反应,后续实验中为了防止野生型序列以及YVDD突变型序列对于YIDD突变株检测的干扰,需同时设置这两个序列作为阴性对照,荧光信号显著高于这两种模板的样品方可以判定为YIDD突变株。
综上,我们通过本部分的研究筛选出了两个crRNA可以分别特异性地检测出YVDD和YIDD突变序列。
实施例3.YMDD耐药突变的灵敏度检测
(1)琼脂糖凝胶电泳检测
将YVDD、YIDD突变质粒和YMDD野生型质粒标准品梯度稀释后作为模板进行PCR扩增,随后用1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测,电泳结果如图8所示。图8中。A.HBV WT野生型质粒梯度稀释PCR 后电泳结果,B.HBV YIDD突变质粒梯度稀释PCR后电泳结果,C. HBV YVDD突变质粒梯度稀释PCR后电泳结果。三组模板对应的阴性对照(NC)无条带,说明扩增过程中无污染;结果显示:在250-500bp 之间出现一条与目的条带大小(304bp)一致的单一条带;同时,三组模板浓度在104-106copies/μL时,均可观察到清晰的电泳条带;而当模板浓度低于为103copies/μL时则观察不到扩增条带,说明利用琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物,其灵敏度约能达到103copies/μL左右。
(2)YVDD突变的灵敏度及与qPCR的比较
进一步利用YVDD crRNA对上一步野生型和YVDD突变标准品的PCR扩增产物进行检测,比较突变crRNA对野生型和耐药突变型 HBV的检测荧光强度差异。此外,我们利用HBV-1crRNA作为阳性质控同时对目标核酸进行检测。
从图9中可以看出:反应进行10min时的数据显示,突变型模板(Mut)对应的荧光信号显著高于野生型(WT)以及阴性对照(NC,扩增模板为ddH2O)的荧光信号,分析结果显示:10-105copies/μL 的YVDD突变株荧光信号显著高于对应浓度的野生型,并且荧光强度具有显著性差异(t检验,p<0.001),100和106copies/μL的YVDD 突变荧光信号较对应浓度野生型模板也具有明显差异;野生型模板的荧光信号接近于阴性对照的荧光信号,并且随着模板浓度的升高,荧光信号无明显变化,表明野生型模板的荧光信号与模板浓度无关;突变型模板的检测结果显示,当突变型模板<103拷贝时,随着突变型模板浓度的升高,荧光信号逐渐增强,突变型模板>103拷贝时,荧光信号呈波动性变化,荧光信号无明显差异。
进一步分析了单拷贝模板前10min的荧光信号变化,如图10所示。结果显示:在检测的前10min内,阴性对照和野生型模板的荧光信号基本没有变化;而突变模板随时间变化荧光信号明显升高;并且在检测的前6min内,阴性对照、野生型和突变型模板的荧光信号无明显差异;6min时,突变型模板(1377±61.10a.u.)荧光信号高于野生型(1045±35.36a.u.);8min时,突变型荧光信号强度 (1820±112.69a.u.)与阴性对照(840±480.83a.u.)有统计学差异(t 检验,p<0.05),与野生型(1100±127.28a.u.)也具有明显差异(t 检验,p<0.01)。上述结果表明:该方法不仅灵敏度高,还具有反应速度快的特点,可在短时间内通过荧光信号的变化检测到含有相应突变的目标核酸。
为了避免高浓度的野生型HBV DNA模板对YVDD突变检测的干扰,我们比较了单拷贝的YVDD突变株与106拷贝的野生株之间的荧光信号差异。如图11所示。结果显示:单拷贝的YVDD突变株 (2380±166.43a.u.)与106拷贝的野生株(1310±424.26a.u.)荧光信号具有显著差异(t检验,p=0.059)。为了避免扩增效率等原因造成的突变型与野生型荧光信号差异,我们用检测HBV DNA特异性 crRNA HBV-1作为阳性质控对PCR扩增产物进行同时检测,发现106野生株(3485±144.14a.u.)的荧光信号明显高于单拷贝的YVDD突变株(467±282.90a.u.),表明106拷贝的野生型模板经PCR扩增后体系中有HBV DNA存在,YVDD突变crRNA检测得到的信号差异是由其扩增的靶点序列决定,并且该方法可以区分单拷贝的YVDD 突变株与106拷贝的野生株。
接下来,我们利用乙肝病毒YMDD突变检测试剂盒(qPCR法,湖南圣湘生物科技有限公司)对相应的突变质粒进行检测,结果如图 12所示。当模板浓度为101-106copies/μL时,可以看到明显的扩增曲线,并且模板浓度为103-106copies/μL时,Ct<38;当模板浓度为101和102copies/μL时,Ct>38,但仍可以观察到扩增曲线。而模板浓度为1copy/μL时,可观察到较小的扩增曲线,但是无法显示相应的Ct 值。
实施例4.YIDD突变检测灵敏度
用上述同样的方法检测了YIDD突变检测的灵敏度,结果如图 13所示。检测10min时的数据显示,模板浓度为102-106copies/μL 的突变型荧光信号显著高于相同浓度下野生型的荧光信号。野生型模板的荧光信号接近于阴性对照的荧光信号,并且随着模板浓度的升高,荧光信号呈无规律的波动形式,说明野生型模板的荧光信号与模板浓度无关;模板浓度为100和102copies/μL时,突变株与野生株对应的荧光信号分别为607±59.75a.u.vs 684±55.34a.u.和604±64.94a.u.vs 716±61.06a.u.,各组荧光强度之间无统计学差异。
进一步分析102copies/μL模板前10min的荧光信号变化(参见图14),发现检测的前10min内,阴性对照和野生型模板的荧光信号之间不存在显著差异;而突变模板组荧光强度随反应时间的延长明显升高,并且在4min时,突变型(1059±334.51a.u.)荧光信号强度即相比阴性对照(431±144.49a.u.)及野生型(402±83.26a.u.)出现明显差异(t检验,p<0.05)。表明该方法可最短在4分钟内鉴定出 102拷贝的乙肝病毒YIDD突变,而在10min时,突变株的荧光检测信号更强,更易与野生型区分。
同样,为了防止高浓度的野生型HBV对YIDD突变检测的干扰,我们进一步比较了102拷贝的YIDD突变株(1767±281.63a.u.)与106拷贝的野生株(840±172.39a.u.)之间的荧光信号差异,并利用HBV DNA特异性crRNA HBV-1作为阳性质控。结果如图15显示:浓度为106拷贝的野生株检测荧光信号(3872±197.63a.u.)显著高于102拷贝的YIDD突变株(1222±137.33a.u.),提示利用该方法可以有效区分102拷贝的YIDD突变株与106拷贝的野生株。
随后,我们又利用qPCRHBVYMDD突变检测试剂盒检测了相应的质粒模板,结果如图16所示,当质粒模板浓度为102-106copies/μL 时,可以观察到明显的扩增曲线,当模板浓度为102-106copies/μL时, Ct<38;当模板浓度为101和102copies/μL时,Ct>40,可以观察到较弱的扩增曲线。对于100和101拷贝的质粒模板,虽可观察到较低的荧光信号,但是根据试剂盒的判别要求,由于这两个模板检测的 Ct值大于40,不能判定为YIDD突变株,故该试剂盒仅可检出102拷贝的YIDD突变,qPCR试剂盒对YIDD突变的检测灵敏度与 PCR-CRISPR相当。
实施例5.临床样本检测
采用直接测序法、qPCR法和PCR-CRISPR三种方法分别检测了 424份血清样本的YVDD和YIDD序列突变。424份血清样本中,168 样本HBV DNA>100IU/mL,256样本HBV DNA<100IU/mL。直接测序法成功测序98个样本的耐药区序列,326份样本测序失败。对于这些样本通过上述三种方法检测YVDD和YIDD耐药突变的结果,具体实验结果如下。
(1)血清样本YVDD突变检测
用三种方法检测了血清样本中的YVDD突变情况,结果如表7 所示,424份血清样本中,5个血清样本(病毒载量>103IU/mL)三种方法均可检测出YVDD耐药突变;6个样本qPCR和crRNA检测出YVDD耐药突变,而直接测序法未检测出。4个样本(病毒载量 <100IU/mL)PCR-CRISPR检测出YVDD耐药突变而直接测序法和 qPCR法均没有检测出YVDD突变。
表7.血清样本YVDD突变检测结果
注:1,2病毒载量和耐药突变由湖南圣湘相关试剂盒检测。
3YVDD突变定义为样品荧光强度与野生型标准品具有显著性差异。
#:样本的直接测序结果显示有双峰。
-:未得到扩增条带,无法测序。
(2)血清样本YIDD突变检测
同样采用三种方法检测了血清样本中YIDD的突变情况,结果如表8所示,424份血清样本中,7份血清样本(病毒载量>100IU/mL) 通过三种方法均检测出YIDD(ATT)耐药突变;15份血清样本(病毒载量>104IU/mL)通过三种方法均检测出YIDD耐药突变,而测序结果显示,该位点核酸序列为ATG突变为ATA;有5个样本qPCR 和crRNA检测出YIDD耐药突变,因模板浓度太低,PCR后无明显条带,无法进行测序;8个样本(病毒载量<100IU/mL)PCR-CRISPR 检测出YIDD耐药突变而直接测序法和qPCR法均未检测出YIDD突变。
此外,上述检测结果中有15例样本显示为YIDD突变,核酸序列由ATG突变为ATA,我们设计的检测YIDD突变的crRNA靶向突变为ATT的YIDD突变,检测结果显示,使用PCR-CRISPR的方法也检测到了这15个样本的突变。
表8.血清样本YIDD突变检测结果
1,2病毒载量和耐药突变由湖南圣湘相关试剂盒检测。
3YVDD突变定义为样品荧光强度与野生型标准品具有显著性差异。
#该样本的直接测序结果显示有双峰。
-:未得到扩增条带,无法测序。
通过查阅S114样本的患者信息我们发现,该患者具10余年肝病史,10年前诊断为慢性乙型肝炎,使用拉米夫定进行抗病毒治疗,3 年后产生耐药突变,改用阿德福韦酯抗病毒治疗。提示该患者很可能在拉米夫定治疗后产生了YMDD耐药突变。
(3)血清样本YMDD突变的测序验证
前期研究表明:通常情况下突变株比例达20%以上时才能被直接测序法检出(J.H.Kim,et al.,World journal of gastroenterology 20, 5708-5720(2014).A.S.Lok,,et al.Journal of clinical microbiology 40, 3729-3734(2002))。因此,直接测序法可能对某些突变比例较低的耐药突变存在漏检,因此,我们每个测序结果的峰图进行了进一步分析,结果发现几例样本在rt204突变位点存在双峰,如图17所示。R3样本测序结果为YIDD突变(ATT),但是测序结果显示,该样本在碱基A处存在一个较小的碱基G的信号峰,表明rt204位点可能存在序列为GTT的突变株(即YVDD突变型),而qPCR和PCR-CRISPR的结果也显示该位点处确实存在两种耐药突变。同时,R3样本rt204 位点第二个碱基T处也存在一个较小的碱基G的信号峰,表明该位点处可能存在序列为ATG的野生株(即YMDD基因型)。由此可知, R3样本可能为一个混合样本,其中含有野生型(ATG)、YIDD突变型(ATT)和YVDD突变型(GTT或GTG)几种基因型的样本,而 YIDD突变含量最高,故直接测序的序列结果仅判定为该突变类型。
同样,在R4样本中,rt204位点的碱基G处存在一个碱基T的信号峰,由此可知,虽然测序结果显示R4样本为野生型(ATG),但是该样本也存在YIDD(ATT)突变株,而这一分析结果也与qPCR 以及PCR-CRISPR的检测结果一致。
此外,样本R27和R19的测序结果显示,rt204位点第二个碱基 T处存在一个碱基G的信号峰,其中样本R27的G碱基峰较高,约为主峰高度的一半,样本R19其峰值较低。表明这两个样本中主要为YIDD突变株,同时存在少量的野生株HBV。
从我们对这几个特殊的血清样本的测序结果分析可以看出,血清样本中可能含有多种不同基因型别的HBV病毒株,而PCR-CRISPR 这一方法可以准确检测出混合样本中相应的耐药突变。
PCR-CRISPR与qPCR检测血清样本YVDD突变结果比较
以qPCR为标准检测方法,列出四格表如下:
表9. 424例血清样本YVDD突变检测结果
根据上表计算PCR-CRISPR检测血清样本YVDD突变的敏感度和特异度:
敏感度sensitivity=11/11=100%,95%CI:67.86-100%
特异度specificity=409/413=99.03%,95%CI:97.37-99.69%
PCR-CRISPR与qPCR检测血清样本YIDD突变结果比较
同样方法检测血清样本YIDD突变。
表10. 424例血清样本YIDD突变检测结果
根据上表计算PCR-CRISPR检测血清样本YIDD突变的敏感度和特异度:
敏感度sensitivity=35/35=100%,95%CI:87.68-100%
特异度specificity=381/389=97.94%,95%CI:95.82-99.04%。
序 列 表
<110> 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院
中国人民解放军疾病预防控制中心
<120> 一种靶向HBV耐药突变基因的PCR-CRISPR检测方法
<160> 6
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial)
<400> 1
cctwcggayg gaaaytgcac ctgtattccc 30
<210> 2
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial)
<400> 2
aattctaata cgactcacta tagggcccat gaarttaagg gagtagccc 49
<210> 3
<211> 62
<212> RNA
<213> 人工序列(artificial)
<400> 3
ggggauuuag acuaccccaa aaacgaaggg gacuaaaacu ggcuuucagu uauauugaug 60
au 62
<210> 4
<211> 62
<212> RNA
<213> 人工序列(artificial)
<400> 4
ggggauuuag acuaccccaa aaacgaaggg gacuaaaacu ggcuuucagu uauguggaug 60
au 62
<210> 5
<211> 64
<212> RNA
<213> 人工序列(artificial)
<400> 5
ggggauuuag acuaccccaa aaacgaaggg gacuaaaacu ucaguuaugu ggaugaugcg 60
guau 64
<210> 6
<211> 64
<212> RNA
<213> 人工序列(artificial)
<400> 6
ggggauuuag acuaccccaa aaacgaaggg gacuaaaacu ucaguuaugu ggaugauaug 60
guau 64
Claims (8)
1.一种非诊断目的的靶向HBV耐药突变基因的PCR-CRISPR检测方法,所述方法包括以下步骤:
(1) 以一对序列如SEQ ID NO.1所示的上游特异性引物和序列如SEQ ID NO.2所示的下游特异性引物扩增待测样本的核酸,所述下游引物的5’端设置有能被T7 RNA聚合酶识别并转录的序列;
(2)在包括有识别HBV DNA靶序列的序列如SEQ ID NO.3和/或SEQ ID NO.6所示crRNA、T7 RNA聚合酶、Cas13a蛋白和报告RNA的检测体系中对待测样本核酸的扩增产物中是否存在有靶序列进行检测,所述耐药基因靶序列为HBV基因组YMDD区的YIDD或者YVDD基因突变。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述Cas13a蛋白为LwCas13a蛋白。
3.根据权利要求2所述的方法,其特征在于,在所述的检测体系中,还含有RNA酶抑制剂。
4.根据权利要求2所述的方法,其特征在于,在所述的检测体系中还含有RNA酶活性报告分子。
5.根据权利要求4所述的方法,其特征在于,所述RNA酶活报告分子为一端标记有淬灭基团,另一端标记有荧光基团的RNA分子,所述分子被激活RNA酶活性的Cas13a剪切,并释放荧光。
6.一种靶向HBV DNA耐药基因靶序列YIDD的crRNA,其特征在于,所述crRNA的序列由SEQ ID NO.3所示。
7.一种靶向HBV DNA耐药基因靶序列YVDD的crRNA,其特征在于,所述crRNA的序列SEQID NO.6所示。
8.一种含有权利要求6和/或7所述crRNA,用于检测待测样本中HBV DNA耐药基因的试剂盒,所述试剂盒还含有LwCas13a蛋白,以及一对PCR扩增上下游引物,所述上游引物的序列如SEQ ID NO.1所示,所述下游引物的序列如SEQ ID NO.2所示。
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PB01 | Publication | ||
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GR01 | Patent grant | ||
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