CN1786189A - 乙型肝炎病毒基因组耐药突变检测方法 - Google Patents
乙型肝炎病毒基因组耐药突变检测方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN1786189A CN1786189A CN 200410052531 CN200410052531A CN1786189A CN 1786189 A CN1786189 A CN 1786189A CN 200410052531 CN200410052531 CN 200410052531 CN 200410052531 A CN200410052531 A CN 200410052531A CN 1786189 A CN1786189 A CN 1786189A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- seq
- virus
- hybridization
- hepatitis
- dna
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明涉及检测突变型乙型肝炎病毒的方法，特别是涉及使用DNA反向点杂交技术，快速准确地区分临床血液样品中野生型和拉米夫定耐受突变型乙型肝炎病毒的方法。本发明进一步涉及用于该临床检测的试剂盒。
Description
发明领域
本发明涉及检测突变型乙型肝炎病毒的方法，特别是涉及使用DNA反向斑点杂交技术，快速准确地区分临床血液样品中野生型和拉米夫定耐受突变型乙型肝炎病毒的方法。本发明进一步涉及用于该临床检测的试剂盒。
发明背景
乙型肝炎病毒(HBV)是引起病毒性肝炎的主要病原体。由HBV所引起的乙型肝炎是一种危害严重的传染性疾病。目前，全世界慢性HBV感染者至少有3.5亿，而中国作为乙型肝炎的高流行区，有大约占总人口9％左右的人群(约1.2亿)为慢性HBV感染者。持续慢性HBV感染在临床上可表现为各种不同类型的疾病，包括无症状携带状态、急或慢性肝炎、肝硬化等，严重的可能发展为原发性肝癌(HCC)。目前全世界每年有120万人死于HBV感染引起的疾病(Maynard，Vaccine，1990，R(Suppl)：S18-S20；Clarke and Bloor J Clin Virol，2002，25：S41-S45.)。
HBV基因组共含有4个转录单元，每个转录单元构成一个独立的开放读码框(ORF)，分别为P，X，C，S，这4个开放读码框的总长为4.7Kb。P开放读码框长2532bp，编码844个氨基酸的P蛋白(即HBV DNA多聚酶)，是病毒复制的主要功能单位，也是抗病毒药物开发的主要靶标。P蛋白包括4个功能区域(Lanfordet al，J.Virol.，1999，73：1885-1893；Locarnini SA.，Hepatology，1998，27：294-297)，从氨基端开始分别为：(1)末端蛋白区(TP)，该区在逆转录过程中与负链DNA结合；(2)间隔区(SD)，该区具有耐受突变，缺失并不影响聚合酶的活性；(3)逆转录酶区(RT)，该区含有维持逆转录酶活性所必须的序列，该区又包含5个功能性保守序列A-E：A(AA421-436)，B(AA506-528)，C(AA546-550)，D(AA576-589)和E(AA592-600)，其中A、C、D为逆转录酶与三磷酸核苷的结合域，B和E为RNA模板和引物定位域；(4)RNase H区。
目前临床上使用的核苷类似药物的主要作用位点是位于HBV DNA多聚酶逆转录酶区的B和C保守序列。HBV多聚酶的催化活性区是位于C保守序列中的YMDD基序(Hilleman，AIDS Res.Hum.Retroviruses，1994，10(11)：1409-1419)。虽然HBV多聚酶的催化结构在自然条件下很少发生变异，但在长期药物治疗后则极易发生变异，导致用药者出现耐药性。
拉米夫定(Lamivudine)是目前世界公认的最安全有效的抑制乙肝病毒复制的核苷类似物药物，其原理是通过抑制HBV DNA多聚酶的活性来抑制HBV前基因组RNA逆转录为负链DNA及终止DNA链延伸而有效的抑制HBV DNA复制(Lai et al.，N Engl J Med，1998，339：61-68)(Cammack et al.，Biochem.Pharmacol.，1992，43(10)：2059-2064)，降低HBV DNA水平。但是短期的拉米夫定治疗并不能彻底清除HBV DNA，拉米夫定对HBV的共价闭合环状DNA(cccDNA)无直接作用，大多数病人需要长期的抗病毒治疗以耗竭体内cccDNA库来达到清除HBV的目的(Moraleda et al.J Viral，1997，71：9392-9399)，而长期使用拉米夫定治疗后，病毒在药物和人体免疫选择压力下可能产生耐药性。研究表明，大部分乙型肝炎病毒中拉米夫定耐药突变主要集中在病毒DNA聚合酶的酪氨酸-甲硫氨酸-天冬氨酸-天冬氨酸(YMDD)基序，表现为编码甲硫氨酸的核苷酸发生碱基替代(ATG→ATT/GTG)，从而使其编码的氨基酸发生相应的变化(M→I/V)。突变导致拉米夫定疗效下降，血清病毒滴度增加和谷丙转氨酶(ALT)活性升高。因此，在拉米夫定治疗过程中，定期监测病毒基因组的变化将具有重要的临床意义。
YMDD基序是HBV DNA聚合酶活性所必需的，是HBV逆转录酶的高保守区。测序结果发现，拉米夫定耐药突变通常发生在YMDD基序及其相邻的区域(Marchelle IA.et al，Hepatology，1998，27：1670-1677)，主要表现为DNA聚合酶552位氨基酸的M突变为I/V，相应的基因序列中的ATG突变为ATT/GTG。现已有充分证据表明，M552V突变是拉米夫定耐药突变的主要形式。目前耐药突变的检测方法主要有以下几种：质谱分析(Pyo Hong et al.，J Hepatol.，2004，40(5)：837-844)，荧光偏振(Bai et al.，World J.Gastroenterol，2003，9(10)：2344-2347)，PCR-肽核酸(Ohishi and Chayama，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1989，86：7059-7062)，限制性片段长度多态方法RFLP(孙剑，侯金林，肖蕾等人，中华实验和临床病毒学杂志，2003，17(1)：18-20)，线性探针分析法(LiPA)(Stuyver etal.，J.Clin.Microbiol.，2000，38：702-707)，荧光定量PCR熔解曲线分析法(Whalley，et al，J.Clin.Microbiol.，2001，39：1456-1459)和基因芯片技术(JeongH，et al，J.Korean Med.Sci.，2004，19：541-546)。然而，这些方法大多成本昂贵，操作繁琐，不利于广大基层医院开展。因此，本发明人试图结合已知的核酸点印迹杂交技术和过滤杂交方法，建立一种能够在短时间内检测和分析乙肝病毒拉米夫定耐受突变基因型的方法。
发明目的
本发明的一个目的是提供检测野生型和突变型乙型肝炎病毒的方法，特别是提供了一种使用DNA反向斑点杂交(RDB)技术，鉴定和区分临床血液样品中野生型和拉米夫定耐受突变型乙型肝炎病毒的方法，该方法包括以下步骤：(1)提供待检血清标本并从中提取DNA；(2)使用合成的特定寡核苷酸引物，利用聚合酶链反应技术扩增包含酪氨酸-甲硫氨酸-天冬氨酸-天冬氨酸(YMDD)基序及其突变形式的靶DNA片段；(3)使被标记的靶DNA与特异性寡核苷酸探针杂交；(4)杂交膜经显色后，根据显色结果分析并判断乙型肝炎病毒拉米夫定耐药突变的存在及其相对量，特征在于聚合酶链反应扩增体系中使用的正向和反向引物分别是：
(1)5′-TGCTGCTATGCCTCATCT-3′(SEQ ID NO：1)
(2)生物素-5′-CAGAGACAAAAGAAAATT-3′(SEQ ID NO：2)，
其中反向引物5′端用生物素标记，用于杂交的5′端氨基标记的寡核苷酸探针分别是：
(3)NH2-5′-TTTCAGTTATATGGATGATGT-3′(SEQ ID NO：3)；
(4)NH2-5′-TTTCAGTTATATTGATGATGT-3′(SEQ ID NO：4)；
(5)NH2-5′-TTTCAGTTATGTGGATGATGT-3′(SEQ ID NO：5)，
以及5′端生物素标记和3′端氨基标记的显色对照寡核苷酸探针6：
(6)生物素-5′-GCCGTAACCGTCACAATCCGT-3′-NH2(SEQ ID NO：6)。
根据本发明的一个优选实施方案，其中杂交过程是在带有多孔滤板和减压抽吸部件的核酸分子杂交装置中进行的。
根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的标记分子是生物素。
根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的乙型肝炎病毒来自被检测者血清乙型肝炎病毒的任何一种已知的变异体。
根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的突变是野生型乙型肝炎病毒向拉米夫定耐受型乙型肝炎病毒的突变。
根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的野生型乙型肝炎病毒具有酪氨酸-甲硫氨酸-天冬氨酸-天冬氨酸(YMDD)基序。
根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的拉米夫定耐受突变型乙型肝炎病毒具有酪氨酸-异亮氨酸-天冬氨酸-天冬氨酸(YIDD)或酪氨酸-缬氨酸-天冬氨酸-天冬氨酸(YVDD)基序。
本发明的另一个目的是提供用于检测拉米夫定耐受突变型乙型肝炎病毒的试剂盒，该试剂盒包括(1)核酸提取试剂；(2)聚合酶链反应试剂；(3)杂交膜及反向斑点杂交反应试剂，其特征在于聚合酶链反应扩增体系中使用的正向和反向引物(引物1和2)分别是：
(1)5′-TGCTGCTATGCCTCATCT-3′(SEQ ID NO：1)；
(2)生物素-5′-CAGAGACAAAAGAAAATT-3′(SEQ ID NO：2)，
其中反向引物5′端是用生物素标记的，用于杂交的5′端氨基标记的寡核苷酸探针是：
(3)NH2-5′-TTTCAGTTATATGGATGATGT-3′(SEQ ID NO：3)；
(4)NH2-5′-TTTCAGTTATATTGATGATGT-3′(SEQ ID NO：4)；
(5)NH2-5′-TTTCAGTTATGTGGATGATGT-3′(SEQ ID NO：5)，
以及5′端生物素标记和3′端氨基标记的用于监测杂交过程的显色对照寡核苷酸探针是：
(6)生物素-5′-GCCGTAACCGTCACAATCCGT-3′-NH2(SEQ ID NO：6)。
根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的核酸提取试剂即为DNA提取液。
根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的聚合酶链反应试剂由聚合酶链反应(PCR)缓冲液、上游引物、下游引物、包括脱氧尿嘧啶核苷三磷酸(dUTP)在内的脱氧核糖核苷三磷酸(dNTPs)、耐热Taq酶和尿嘧啶-DNA-糖基化酶(UDG酶)组成的聚合酶链反应体系，及阳性标准品(野生型和突变型HBV DNA质粒)。
根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的反向斑点杂交反应试剂包括杂交液I和II、溶液I、II、III和IV及标准对照品。
根据本发明的再一个优选实施方案，其中用于靶多核苷酸扩增反应的正向和反向引物分别是引物1：(1)5′-TGCTGCTATGCCTCATCT-3′(SEQ ID NO：1)和生物素标记的引物2：(2)生物素-5′-CAGAGACAAAAGAAAATT-3′(SEQ IDNO：2)。
根据本发明的再一个优选实施方案，用于核酸杂交的5′端氨基标记的寡核苷酸探针分别是：
(3)NH2-5′-TTTCAGTTATATGGATGATGT-3′(SEQ ID NO：3)；
(4)NH2-5′-TTTCAGTTATATTGATGATGT-3′(SEQ ID NO：4)；
(5)NH2-5′-TTTCAGTTATGTGGATGATGT-3′(SEQ ID NO：5)，
并且用于监测杂交过程的显色对照寡核苷酸探针是：
(6)生物素-5′-GCCGTAACCGTCACAATCCGT-3′-NH2(SEQ ID NO：6)。
发明内容
本发明提供了检测拉米夫定耐药突变型乙型肝炎病毒的方法，特别是提供了一种使用DNA反向斑点杂交技术快速准确的区分临床血液样品中野生型和拉米夫定耐受突变型乙型肝炎病毒的方法。本发明还进一步提供了用于临床拉米夫定耐药突变检测的试剂盒。
为了克服现有技术中的缺陷和不足，本发明提供了一个适用于检测乙型肝炎病毒拉米夫定耐药突变的方法，该方法包括；(1)提供待检血清标本并从中提取DNA；(2)使用合成的寡核苷酸引物，分别对血清样品和对照样品DNA进行常规聚合酶链反应以扩增包含酪氨酸-甲硫氨酸-天冬氨酸-天冬氨酸(YMDD)基序及其突变形式的靶DNA片断；(3)使被标记的靶DNA与特异性寡核苷酸探针杂交；(4)生物素标记片段与显色反应基团结合后，杂交膜经显色，根据显色结果分析并判断乙型肝炎病毒拉米夫定耐药突变的存在及其相对量，本发明的特征在于所说的聚合酶链反应扩增体系中所使用的正向和反向引物分别为：
(1)5′-TGCTGCTATGCCTCATCT-3′(SEQ ID NO：1)；
(2)生物素-5′-CAGAGACAAAAGAAAATT-3′(SEQ ID NO：2)。
根据本发明的一个优选实施方案，用于核酸杂交的5′端氨基标记的寡核苷酸探针分别是：
(3)NH2-5′-TTTCAGTTATATGGATGATGT-3′(SEQ ID NO：3)；
(4)NH2-5′-TTTCAGTTATATTGATGATGT-3′(SEQ ID NO：4)；
(5)NH2-5′-TTTCAGTTATGTGGATGATGT-3′(SEQ ID NO：5)，
并且用于监测杂交过程的显色对照寡核苷酸探针是：
(6)生物素-5′-GCCGTAACCGTCACAATCCGT-3′-NH2(SEQ ID NO：6)。
根据本发明的另一个优选实施方案，其中所说的待检血清标本来自有乙型肝炎病毒感染的被检测者血清。
根据本发明的再一个优选实施方案，其中用于扩增标本中待检核酸的聚合酶链反应条件是50℃预处理3分钟，95℃预变性5分钟，然后按93℃30秒，55℃30秒，72℃40秒扩增，共35个循环；最后72℃保温7分钟。
根据本发明的再一个优选实施方案，其中核酸杂交过程是在带有多孔滤板和减压抽吸部件的核酸分子杂交装置中进行的。
根据本发明的再一个优选实施方案，其中所说的标记分子是生物素或氨基。
根据本发明的再一个优选实施方案，其中所说的包含YMDD基序的靶DNA的基因型包括野生型(YMDD)和拉米夫定耐受突变型(YIDD或YVDD)。
众所周知，常用的印迹杂交方法是将靶DNA固定于尼龙膜或硝酸纤维素膜上，用标记的探针与待检靶DNA相互接触并杂交，显影或显色后判定结果。用这种方法每次杂交反应只能检测一个待测DNA中是否含有某一种探针的互补序列，即一次只能判断一种基因型。如果某个基因座位有多种等位基因(如HLA-A，HLA-B，HLA-DR位点)或要检测多个靶序列(如地中海贫血突变基因，ABO血型等)，用这种点杂交方法一次性检测就很繁杂，甚至难以完成。而反向斑点杂交方法则是先设计针对各等位基因的特异性探针，并将探针点加到杂交基质上，然后再将待测DNA样品(一般是使用5′-端标记有生物素或地高辛等分子的引物PCR扩增靶DNA片段后的产物)与之杂交，这样待测样本就会与具有互补序列的探针结合，洗涤除去未结合的DNA后，即可检测到特异性结合的靶序列。因此，使用该方法可一次同时检测某一位点的正常及其相关的多种突变形式，或不同位点的正常或突变。
为了完成本发明的方法，首先常规分离和制备待检血清样品，并于-20℃下保存备用。检测时，取血清标本约40μl，加入等量DNA提取液，混匀，然后沸水浴约10分钟。为了使标本中含有的病毒颗粒充分裂解，必要时可将血清标本和DNA提取液的混合物转至4℃静置8～12小时。离心后取上清用于聚合酶链反应(PCR)。所使用的50μl反应体系中包括：1×定性PCR缓冲液、0.2mM dNTPs、2U Taq酶、0.2μM引物1(SEQ ID NO：1)和2(SEQ ID NO：2)。在UDG酶(1U)的存在下，对处理后的标本或用于后继平行检测的标准品进行常规PCR反应。其中所使用的反应条件是：50℃预处理3分钟，94℃预变性5分钟，然后按93℃30秒，55℃30秒，72℃40秒扩增，共35个循环；最后72℃保温7分钟。杂交时，先95℃变性PCR扩增产物5分钟，然后置冰中冷却2分钟以上，再在约44℃预热的杂交液I的存在下，于带有多孔滤板和负压抽吸泵的核酸分子快速杂交仪的杂交槽内，使PCR扩增产物与5′端氨基标记的探针杂交约7分钟，所使用的探针分别为：
(3)NH2-5′-TTTCAGTTATATGGATGATGT-3′(SEQ ID NO：3)
(4)NH2-5′-TTTCAGTTATATTGATGATGT-3′(SEQ ID NO：4)
(5)NH2-5′-TTTCAGTTATGTGGATGATGT-3′(SEQ ID NO：5)，
用44℃预热的杂交液II清洗(三次)杂交膜后，再使所说的PCR扩增产物及显色对照探针(6)Biotin-5′-GCCGTAACCGTCACAATCCGT-3′-NH2(SEQ IDNO：6)与结合液反应(25℃)约2分钟。杂交膜经杂交液I洗涤(三次)后，加入新鲜制备的显色液显色约6分钟。真空抽干显色液后，观测杂交膜上斑点颜色并借以判断标本中乙型肝炎病毒拉米夫定耐药突变位点的存在及其相对量。在显色时间内，以杂交膜上出现清晰可见的蓝色圆斑点为阳性检测结果，无色或极淡的显色均为阴性结果。
本发明的方法中，由于使用了针对各种类型HBV核酸序列所设计的引物扩增靶核酸序列，并设计了显色对照探针及检测野生型YMDD和突变型YIDD/YVDD基序的寡核苷酸探针进行核酸杂交分析，所以该方法能够准确而有效地鉴别和区分HBV野生型YMDD及其拉米夫定耐药突变型YIDD和YVDD。而且，本发明的方法不仅能用于检测单一HBV感染，而且能够定性和定量地检测HBV的混合感染或突变，从而为乙型肝炎的临床个体化治疗提供分子病毒学证据，为临床用药提供有意义的参考。另一方面，由于本发明的方法中使用了具有独特的导流杂交原理的核酸分子杂交装置，从而大大提高了核酸分子的扩散率、局部反应的浓度及其杂交效率。一般说来，使用本发明的方法，从样本处理到结果判读最快仅需2-3小时(传统的杂交方法需要至少2个工作日)。所以，与传统的杂交方法相比，本方法的发明显然还具有操作简单、快速方便的优点。
本发明的另一个目的是提供用于检测拉米夫定耐受突变型乙型肝炎病毒的试剂盒，该试剂盒包括(1)核酸提取试剂；(2)聚合酶链反应试剂；(3)杂交膜及反向斑点杂交反应试剂，其特征在于聚合酶链反应扩增体系中使用的正向和反向引物分别是：
(1)5′-TGCTGCTATGCCTCATCT-3′(SEQ ID NO：1)
(2)生物素-5′-CAGAGACAAAAGAAAATT-3′(SEQ ID NO：2)，
其中反向引物5′端用生物素标记。
用于杂交的5′端氨基标记的寡核苷酸探针分别是：
(3)NH2-5′-TTTCAGTTATATGGATGATGT-3′(SEQ ID NO：3)；
(4)NH2-5′-TTTCAGTTATATTGATGATGT-3′(SEQ ID NO：4)；
(5)NH2-5′-TTTCAGTTATGTGGATGATGT-3′(SEQ ID NO：5)；
及5′端生物素标记和3′端氨基标记的显色对照寡核苷酸探针6：
(6)生物素-5′-GCCGTAACCGTCACAATCCGT-3′-NH2(SEQ ID NO：6)。
根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的核酸提取试剂即为DNA提取液。
根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的聚合酶链反应试剂包括由PCR缓冲液、上游引物(引物1)、下游引物(引物2)、含脱氧尿嘧啶核苷三磷酸(dUTP)在内的脱氧核糖核苷三磷酸(dNTPs)、耐热Taq酶和尿嘧啶-DNA-糖基化酶(UDG酶)组成的PCR反应体系，以及阳性标准品野生型(YMDD)和突变型(YIDD和YVDD)HBV阳性质粒。
根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的反向斑点杂交反应试剂包括杂交液I和II、溶液I、II、III和IV及标准对照品。
根据本发明的再一个优选实施方案，其中用于靶DNA扩增反应的正向和反向引物分别是引物1：(1)5′-TGCTGCTATGCCTCATCT-3′(SEQ ID NO：1)和生物素标记的引物2：(2)生物素-5′-CAGAGACAAAAGAAAATT-3′(SEQ IDNO：2)。
根据本发明的再一个优选实施方案，用于核酸杂交的5′端氨基标记的寡核苷酸探针是：
(3)NH2-5′-TTTCAGTTATATGGATGATGT-3′(SEQ ID NO：3)
(4)NH2-5′-TTTCAGTTATATTGATGATGT-3′(SEQ ID NO：4)
(5)NH2-5′-TTTCAGTTATGTGGATGATGT-3′(SEQ ID NO：5)，
以及用于监测杂交过程的显色对照寡核苷酸探针是：
(6)生物素-5′-GCCGTAACCGTCACAATCCGT-3′-NH2(SEQ ID NO：6)。
结果的判定原则是，用于监测杂交过程的显色对照探针6(SEQ ID NO：6)应在所有的检测中都显色。如探针3(SEQ ID NO：3)、4(SEQ ID NO：4)、5(SEQID NO：5)出现单一显色，则分别表示样品中有YMDD野生型、YIDD突变型、YVDD突变型单一HBV DNA的存在；如果探针3(SEQ ID NO：3)和4(SEQ IDNO：4)同时显色，则表明样品中存在YMDD野生型和YIDD突变型混合感染；如探针3(SEQ ID NO：3)和5(SEQ ID NO：5)同时显色，则表明样品中存在YMDD野生型和YVDD突变型混合感染；如探针4(SEQ ID NO：4)和5(SEQID NO：5)同时显色，则表明样品中存在YVDD和YIDD两种突变型HBV的混合感染；如探针3(SEQ ID NO：3)、4(SEQ ID NO：4)、5(SEQ ID NO：5)三种探针同时显色，即表明样品中同时存在YMDD野生型、YIDD和YVDD突变型HBV的混合感染。
本发明的试剂盒主要用于检测和鉴别野生型(YMDD)和拉米夫定耐受突变型(YIDD和YVDD)HBV DNA，借以判断HBV拉米夫定耐药病毒的临床分型。整个检测过程包括提取血清样品中的HBV DNA、PCR扩增包含YMDD/YIDD/YVDD基序的靶DNA片段，以及PCR扩增产物的杂交等主要步骤。为了完成这些步骤，本发明的试剂盒又可分为PCR反应试剂盒和反向斑点杂交试剂盒两个部分。其中，前者包括DNA提取液、Taq酶、阳性标准品(YMDD野生型及YIDD/YVDD突变型HBV DNA质粒)和尿嘧啶-DNA-糖基化酶(UDG酶)。后者包括杂交液I和II、溶液I、II、III和IV，以及杂交膜。杂交用试剂主要为常规的20×SSC、十二烷基磺酸钠(SDS)、链霉抗生物素蛋白-辣根过氧化酶结合物(POD)、四甲基联苯胺(TMB)。试剂盒组成包括杂交液I(2×SSC-0.1％SDS)、杂交液II(0.5×SSC-0.1％SDS)、溶液I(250u/mlPOD)、溶液II(0.1mol/L柠檬酸钠)、溶液III(2mg/mlTMB)、溶液IV(3％H2O2)、阴性和阳性标准对照品，以及用作杂交反应载体的膜条。
本发明的试剂盒不仅提供了各型HBV所对应的特异性探针，而且还提供了显色对照探针和野生型及突变型HBV的阳性标准品，从而使试剂盒具有完善的质量控制体系。同时，由于配备了具有独特导流杂交系统的核酸分子杂交装置，所以极其有利于核酸分子的扩散和局部反应浓度的提高，以改善核酸杂交效率。一般说来，从样本处理到结果判断只需3小时左右的时间。特别是由于使用了设计严谨的核酸探针，使得拉米夫定耐药型HBV的检测具有更好的灵敏度和特异性。因此，本发明的试剂盒为临床标本的快速检测和大样本普查(一次可检测15人份或更多样本)提供了新的工具，并为拉米夫定的临床使用提供了可靠的实验室依据。
附图说明
图1显示靶DNA扩增片段经2％的琼脂糖凝胶电泳图。其中第1、2和3泳道为从血清HBV DNA中扩增出的特异性靶DNA片段(233bp)；第4、5和6泳道为从质粒DAN中扩增出的特异性靶DNA片段(233bp)；M泳道为标准分子量标志。
图2显示六种不同的HBV基因型血清样品反向斑点杂交检测结果。其中：A：YMDD感染、B：YIDD感染、C：YVDD感染、D：YMDD、YIDD混合感染、E：YMDD、YVDD混合感染、F：YIDD、YVDD混合感染。
发明的具体实施方式：
实施例1：血清DNA的提取
无菌采集待检乙型肝炎病人的静脉血约1ml，分别于室温和4℃静置2小时和1小时后，离心(8,000rpm，5分钟)分离并收集血清标本200μl。然后从中取血清样品40μl，向其中加入等量DNA提取液，充分混匀并在沸水浴中放置10分钟。为了保证血清内所含的病毒颗粒能够被充分裂解，进一步将此混合物于4℃下继续静置10小时。然后离心(10,000rpm，5分钟)并收集上清液2μl并将其用于进一步PCR反应。
实施例2：包含YMDD基序的片段的PCR扩增
取单管单人份PCR反应液若干管，每管加入1μl UDG酶，再直接加入2μl模板(或阴阳性标准品)，充分混匀后瞬时(3秒)离心。然后将各反应管放入PCR仪，50℃预处理3分钟，按下列条件扩增：94℃5分钟，然后按93℃30秒，55℃30秒，72℃40秒，共35个循环，最后72℃延伸7分钟。扩增产物经2％的琼脂糖凝胶电泳检测(见附图1)。所使用的PCR扩增体系包括：1×定性PCR缓冲液、0.2mM dNTPs、2U Taq酶、0.2μM引物1(SEQ ID NO：1)和2(SEQ ID NO：2)。
实施例3：三种已知基因型的样品反向斑点杂交检测
杂交前，取杂交液I(2×SSC-0.1％SDS)与杂交液II预热至44℃备用。根据待检样品的数目取3个1.5ml离心管，各管分别加入0.5ml杂交液I并预加热至44℃。将PCR扩增产物95℃变性处理10分钟后，置于冰水混合物中放置4分钟。然后取1000μl杂交液I+2μl溶液I(1000∶2)混合溶液作为结合液4℃保存备用，并取溶液II∶溶液III∶溶液IV(1900∶200∶1)的混合物(1.9ml溶液II+0.2ml溶液III+1μl溶液IV)作为显色液避光保存备用。
杂交前用蒸馏水充满反应室，放置好金属多孔板，开启负压泵以排出多孔板上的水份。设定杂交仪温度为44℃，首先将塑料垫片置于金属多孔板上并将耐药检测膜条置于塑料垫片上，盖好硅胶分隔室和压扣盖。再将变性后的PCR扩增产物内加入44℃预热的0.5ml杂交液I中，混匀后加入杂交槽中温育7分钟并打开泵进行导流杂交。然后加入44℃预热的杂交液II清洗膜条(每孔1ml，重复洗3次)。设定杂交仪温度为25℃(或室温)并加入结合液(每孔1ml)。静置2分钟后泵出结合液，再加入室温杂交液I清洗膜条(每孔1ml，重复洗3次)。随后加入溶液II稍静置后泵干，最后加入新鲜配制的显色液(每孔1ml)，显色约6分钟并开泵抽干显色液观察结果(参见附图2)。
由图2所示的结果可以看出，各探针显色清晰可见，无非特异性杂交。
实施例4：不同基因型样品的反向斑点杂交基因分型检测及其结果判定
使用本发明的方法和试剂盒，对49份采自广州市第八人民医院高度疑似耐药的乙肝病人血清样品进行HBV耐药突变检测。结果检出：YMDD(4例)、YIDD(2例)、YVDD(10例)、YMDD+YIDD(1例)、YMDD+YVDD(26例)、YIDD+YVDD(2例)、YMDD+YIDD+YVDD(4例)。为了进一步证实本发明方法的准确性，对所有样品的PCR产物进行测序。结果表明，使用本发明的试剂盒检测的结果和测序结果基本吻合，特异性达97.1％。
实施例5：本发明方法的临床应用
本方法的发明可为临床拉米夫定用药方案的制定提供科学的、个体化的分子生物学实验数据，为乙肝病人的治疗提供可靠的分子病毒学证据。如果病人血清中出现拉米夫定耐药突变型病毒存在，则要立即减少拉米夫定的用量甚至停药，改用其他药物治疗，避免浪费时间和金钱，也避免延误病情和治疗而产生不必要的后果。本发明的结果判读可有七种情况：
探针6(SEQ ID NO：6)和3(SEQ ID NO：3)显色判定为YMDD野生型感染；
探针6(SEQ ID NO：6)和4(SEQ ID NO：4)显色判定为YIDD突变型感染；
探针6(SEQ ID NO：6)和5(SEQ ID NO：5)显色判定为YVDD突变型感染；
探针6(SEQ ID NO：6)、3(SEQ ID NO：3)和4(SEQ ID NO：4)显色可判定为YMDD野生型和YIDD突变型混合感染；
探针6(SEQ ID NO：6)、3(SEQ ID NO：3)和5(SEQ ID NO：5)显色可判定为YMDD野生型和YVDD突变型混合感染；
探针6(SEQ ID NO：6)、4(SEQ ID NO：4)和5(SEQ ID NO：5)显色可判定为YIDD和YVDD突变型混合感染；
探针6(SEQ ID NO：6)、3(SEQ ID NO：3)、4(SEQ ID NO：4)和5(SEQ IDNO：5)显色可判定为YMDD野生型、YIDD和YVDD突变型混合感染(参见表1和图2)。
表1 七种不同的HBV感染情况及其判断
| 样品号 | 显色探针组合 | 病毒感染情况 |
| 1 | 6(SEQ ID NO：6)和3(SEQ ID NO：3) | YMDD感染 |
| 2 | 6(SEQ ID NO：6)和4(SEQ ID NO：4) | YIDD感染 |
| 3 | 6(SEQ ID NO：6)和5(SEQ ID NO：5) | YVDD感染 |
| 4 | 6(SEQ ID NO：6)、3(SEQ ID NO：3)、4(SEQ ID NO：4) | YMDD+YIDD混合感染 |
| 5 | 6(SEQ ID NO：6)、3(SEQ ID NO：3)、5(SEQ ID NO：5) | YMDD+YVDD混合感染 |
| 6 | 6(SEQ ID NO：6)、4(SEQ ID NO：4)、5(SEQ ID NO：5) | YIDD+YVDD混合感染 |
| 7 | 6(SEQ ID NO：6)、3(SEQ ID NO：3)、4(SEQ ID NO：4)、5(SEQ ID NO：5) | YMDD+YIDD+YVDD混合感染 |
序列表
<110>中山大学安达基因股份有限公司
<120>乙型肝炎病毒基因组耐药突变检测方法
<140>
<141>
<160>6
<210>1
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。
<400>1
TGCTGCTATG CCTCATCT
<210>2
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。
<400>2
CAGAGACAAA AGAAAATT
<210>3
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作杂交探针。
<400>3
TTTCAGTTAT ATGGATGATGT
<210>4
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作杂交探针。
<400>4
TTTCAGTTAT ATTGATGATGT
<210>5
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作杂交探针。
<400>5
TTTCAGTTAT GTGGATGATGT
<210>6
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作杂交探针。
<400>6
GCCGTAACCG TCACAATCCGT
Claims (9)
1、鉴定和区分临床血液样品中野生型和拉米夫定耐受突变型乙型肝炎病毒的方法，该方法包括以下步骤：(1)提供待检血清标本并从中常规提取DNA；(2)使用合成的特定寡核苷酸引物，分别对血清样品和对照样品DNA进行聚合酶链反应以扩增包含酪氨酸-甲硫氨酸-天冬氨酸-天冬氨酸(YMDD)基序及其突变形式的靶DNA片段；(3)使被标记的靶DNA与特异性寡核苷酸探针杂交；(4)杂交膜经显色后，根据显色结果分析并判断乙型肝炎病毒拉米夫定耐药突变型病毒的存在及其相对量。
2、根据权利要求1的方法，其中待检核酸扩增所使用的正向和反向引物分别是：
(1)5′-TGCTGCTATGCCTCATCT-3′(SEQ ID NO：1)
(2)生物素-5′-CAGAGACAAAAGAAAATT-3′(SEQ ID NO：2)，
3、根据权利要求1的方法，其中用于分子杂交的5′端氨基标记的寡核苷酸探针分别是：
(3)NH2-5′-TTTCAGTTATATGGATGATGT-3′(SEQ ID NO：3)；
(4)NH2-5′-TTTCAGTTATATTGATGATGT-3′(SEQ ID NO：4)；
(5)NH2-5′-TTTCAGTTATGTGGATGATGT-3′(SEQ ID NO：5)，以及用于显色对照的5′端生物素标记和3′端氨基标记的寡核苷酸探针是：
(6)生物素-5′-GCCGTAACCGTCACAATCCGT-3′-NH2(SEQ ID NO：6)。
4、根据权利要求1的方法，其中杂交过程是在带有多孔滤板和减压抽吸部件的核酸分子快速杂交装置中进行的。
5、根据权利要求1的方法，其中所说的乙型肝炎病毒选自乙型肝炎病毒的任何一种已知的变异体。
6、根据权利要求1的方法，其中所说的拉米夫定耐受突变型乙型肝炎病毒具有酪氨酸-异亮氨酸-天冬氨酸-天冬氨酸(YIDD)或酪氨酸-缬氨酸-天冬氨酸-天冬氨酸(YVDD)基序。
7、用于检测拉米夫定耐受突变型乙型肝炎病毒的试剂盒，该试剂盒包括(1)聚合酶链反应试剂；(2)杂交膜及反向斑点杂交反应试剂。其中(1)由DNA提取液、耐热Taq酶、阳性标准品和尿嘧啶-DNA-糖基化酶组成；(2)由杂交液I和II、溶液I、II、III和Ⅳ以及杂交膜组成。
8、根据权利要求8的试剂盒，其中用于靶多核苷酸扩增反应的正向和反向引物分别是：
(1)5′-TGCTGCTATGCCTCATCT-3′(SEQ ID NO：1)
(2)生物素-5′-CAGAGACAAAAGAAAATT-3′(SEQ ID NO：2)。
9、根据权利要求8的试剂盒，其中用于分子杂交的5′端氨基标记的寡核苷酸探针是：
(3)NH2-5′-TTTCAGTTATATGGATGATGT-3′(SEQ ID NO：3)；
(4)NH2-5′-TTTCAGTTATATTGATGATGT-3′(SEQ ID NO：4)；
(5)NH2-5′-TTTCAGTTATGTGGATGATGT-3′(SEQ ID NO：5)；
以及用于显色对照的5′端生物素标记和3′端氨基标记的寡核苷酸探针是：
(6)生物素-5′-GCCGTAACCGTCACAATC CGT-3′-NH2(SEQ ID NO：6)。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CNB2004100525311A CN100339488C (zh) | 2004-12-07 | 2004-12-07 | 乙型肝炎病毒基因组耐药突变检测方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CNB2004100525311A CN100339488C (zh) | 2004-12-07 | 2004-12-07 | 乙型肝炎病毒基因组耐药突变检测方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN1786189A true CN1786189A (zh) | 2006-06-14 |
| CN100339488C CN100339488C (zh) | 2007-09-26 |
Family
ID=36783802
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CNB2004100525311A Active CN100339488C (zh) | 2004-12-07 | 2004-12-07 | 乙型肝炎病毒基因组耐药突变检测方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN100339488C (zh) |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101988130A (zh) * | 2009-08-03 | 2011-03-23 | 复旦大学附属华山医院 | 乙肝病毒拉米夫定耐药变异株的检测探针及其应用方法 |
| CN101565756B (zh) * | 2008-04-25 | 2013-07-10 | 中山大学达安基因股份有限公司 | 一种乙型肝炎病毒核苷类似物耐药相关突变检测试剂盒 |
| TWI575070B (zh) * | 2011-07-12 | 2017-03-21 | 傳斯堅公司 | Ｈｂｖ聚合酶突變體 |
| CN110195129A (zh) * | 2019-06-05 | 2019-09-03 | 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 | 一种靶向hbv耐药突变基因的pcr-crispr检测方法 |
| CN110656204A (zh) * | 2019-11-14 | 2020-01-07 | 郑州安图生物工程股份有限公司 | 一种乙型肝炎病毒ymdd基因突变检测试剂盒及检测方法 |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1184255A (zh) * | 1997-10-21 | 1998-06-10 | 曾真 | 乙型肝炎病毒基因亚型检测方法及试剂盒 |
| CN1236070C (zh) * | 2002-10-14 | 2006-01-11 | 山东省医药生物技术研究中心 | 乙型肝炎病毒突变位点的肽核酸检测芯片及其制备方法 |
-
2004
- 2004-12-07 CN CNB2004100525311A patent/CN100339488C/zh active Active
Cited By (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101565756B (zh) * | 2008-04-25 | 2013-07-10 | 中山大学达安基因股份有限公司 | 一种乙型肝炎病毒核苷类似物耐药相关突变检测试剂盒 |
| CN101988130A (zh) * | 2009-08-03 | 2011-03-23 | 复旦大学附属华山医院 | 乙肝病毒拉米夫定耐药变异株的检测探针及其应用方法 |
| TWI575070B (zh) * | 2011-07-12 | 2017-03-21 | 傳斯堅公司 | Ｈｂｖ聚合酶突變體 |
| TWI623618B (zh) * | 2011-07-12 | 2018-05-11 | 傳斯堅公司 | Ｈｂｖ聚合酶突變體 |
| CN110195129A (zh) * | 2019-06-05 | 2019-09-03 | 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 | 一种靶向hbv耐药突变基因的pcr-crispr检测方法 |
| CN110195129B (zh) * | 2019-06-05 | 2023-04-07 | 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 | 一种靶向hbv耐药突变基因的pcr-crispr检测方法 |
| CN110656204A (zh) * | 2019-11-14 | 2020-01-07 | 郑州安图生物工程股份有限公司 | 一种乙型肝炎病毒ymdd基因突变检测试剂盒及检测方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN100339488C (zh) | 2007-09-26 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN1814805A (zh) | H5、h7、h9亚型禽流感病毒的实时荧光定量pcr检测方法 | |
| CN1274757A (zh) | 有效检测丙型肝炎病毒(hcv)的寡核苷酸引物及其应用方法 | |
| CN104450963B (zh) | 一种hbv dna数字pcr定量检测试剂盒及其应用 | |
| CN1932041A (zh) | 对于赤鹿、梅花鹿、马鹿以及驯鹿的基因特异的引物以及利用该引物识别鹿茸品种的方法 | |
| CN1944673A (zh) | 乙型肝炎病毒荧光定量pcr检测方法及专用试剂盒 | |
| CN1455819A (zh) | 与疾病相关的核酸 | |
| CN1223682C (zh) | 诊断试验 | |
| CN1279182C (zh) | 通用多变异体检测系统 | |
| CN1164767C (zh) | 一种快速定量检测猪瘟病毒和猪瘟兔化弱毒疫苗的荧光定量pcr试剂盒及应用 | |
| CN1675378A (zh) | 用于甲型肝炎病毒核酸捕捉、检测和定量的寡核苷酸的鉴定 | |
| CN100339488C (zh) | 乙型肝炎病毒基因组耐药突变检测方法 | |
| CN101045939A (zh) | 一种hbv dna基因分型的检测方法及其试剂盒 | |
| CN1406285A (zh) | 腺病毒的检测与定量方法 | |
| CN1904068A (zh) | 一种h5n1型禽流感病毒荧光扩增检测试剂盒及检测方法 | |
| CN1824801A (zh) | 柑桔溃疡病菌实时荧光pcr检测引物、探针、固相化试剂盒及其检测方法 | |
| CN1289692C (zh) | Sars冠状病毒rna磁性捕获方法及应用该方法的pcr检测 | |
| CN1384888A (zh) | 抗乙型肝炎药物抗性的检测 | |
| CN1188530C (zh) | Sars病毒的基因检测试剂盒及检测方法 | |
| CN1588066A (zh) | 乙型肝炎病毒基因分型的荧光pcr检测方法及其试剂盒 | |
| KR101503039B1 (ko) | Ｃ형 간염 바이러스 진단용 프라이머, 프로브, 이를 포함하는 키트 및 상기 키트를 이용한 ｃ형 간염 바이러스 진단 방법 | |
| CN101565756B (zh) | 一种乙型肝炎病毒核苷类似物耐药相关突变检测试剂盒 | |
| CN1772925A (zh) | 肺特异性X蛋白mRNA表达量检测试剂盒及其专用引物与探针 | |
| CN1786188A (zh) | 检测载脂蛋白e基因型的方法和试剂盒 | |
| CN106755567B (zh) | 猴srv病毒实时荧光定量pcr检测引物、探针、检测试剂盒和检测方法 | |
| CN101177715A (zh) | 检测乙型肝炎病毒前c/bcp区基因突变的方法和试剂盒 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| ASS | Succession or assignment of patent right |
Owner name: SHANGHAI DAAN MEDICAL TESTING CENTER OF CO., LTD. Free format text: FORMER OWNER: DA AN GENE COMPANY, ZHONGSHAN UNIVERSITY Effective date: 20080822 |
|
| C41 | Transfer of patent application or patent right or utility model | ||
| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20080822 Address after: No. 898, 2 Harley Road, Zhangjiang hi tech park, Shanghai, China Patentee after: Shanghai Anthony Medical Testing Center Co. Ltd. Address before: Room 80, Hua Lian business building, 2710 martyrs Road, Dongshan District, Guangdong, Guangzhou Patentee before: Daan Gene Co., Ltd., Zhongshan Univ. |
|
| DD01 | Delivery of document by public notice |
Addressee: Cai Zhaorong Document name: Notification that Application Deemed not to be Proposed |
|
| C56 | Change in the name or address of the patentee |
Owner name: SHANGHAI DA AN MEDICAL TEST INSTITUTE CO., LTD. Free format text: FORMER NAME: SHANGHAI DA AN MEDICAL TEST CENTER CO., LTD. |
|
| CP01 | Change in the name or title of a patent holder |
Address after: 201203, 2, 898, Harley Road, Zhangjiang hi tech park, Shanghai Patentee after: Shanghai Da An Medical Test Institute Co., Ltd. Address before: 201203, 2, 898, Harley Road, Zhangjiang hi tech park, Shanghai Patentee before: Shanghai Anthony Medical Testing Center Co. Ltd. |