CN113151585A - 一种快速检测新型冠状病毒d614g突变的引物组合物及试剂盒 - Google Patents
一种快速检测新型冠状病毒d614g突变的引物组合物及试剂盒 Download PDFInfo
- Publication number
- CN113151585A CN113151585A CN202110050940.1A CN202110050940A CN113151585A CN 113151585 A CN113151585 A CN 113151585A CN 202110050940 A CN202110050940 A CN 202110050940A CN 113151585 A CN113151585 A CN 113151585A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- primer
- seq
- sequence
- set forth
- pna probe
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 239000000203 mixture Substances 0.000 title claims abstract description 41
- 241000711573 Coronaviridae Species 0.000 title claims abstract description 37
- 230000035772 mutation Effects 0.000 title claims abstract description 24
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims abstract description 22
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims abstract description 20
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims abstract description 9
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims abstract description 9
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 9
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 claims abstract description 3
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims description 21
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims description 21
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 claims description 9
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 claims description 9
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 9
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- PGSADBUBUOPOJS-UHFFFAOYSA-N neutral red Chemical compound Cl.C1=C(C)C(N)=CC2=NC3=CC(N(C)C)=CC=C3N=C21 PGSADBUBUOPOJS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 239000011535 reaction buffer Substances 0.000 claims description 8
- 239000001044 red dye Substances 0.000 claims description 8
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 7
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 7
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 claims description 4
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 claims description 2
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 claims description 2
- 238000000034 method Methods 0.000 abstract description 3
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 abstract description 3
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 abstract description 3
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 abstract description 3
- 239000003147 molecular marker Substances 0.000 abstract description 2
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 abstract description 2
- 238000007397 LAMP assay Methods 0.000 description 13
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 9
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 6
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 5
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 5
- 241001678559 COVID-19 virus Species 0.000 description 4
- 238000001917 fluorescence detection Methods 0.000 description 4
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 4
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 3
- 229940096437 Protein S Drugs 0.000 description 3
- 101710198474 Spike protein Proteins 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 3
- 102100031673 Corneodesmosin Human genes 0.000 description 2
- 101710139375 Corneodesmosin Proteins 0.000 description 2
- 241000709661 Enterovirus Species 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108020000999 Viral RNA Proteins 0.000 description 2
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 238000006073 displacement reaction Methods 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 241001493065 dsRNA viruses Species 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 2
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 2
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 2
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 230000000241 respiratory effect Effects 0.000 description 2
- 208000025721 COVID-19 Diseases 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 241000711467 Human coronavirus 229E Species 0.000 description 1
- 241001109669 Human coronavirus HKU1 Species 0.000 description 1
- 241000482741 Human coronavirus NL63 Species 0.000 description 1
- 241001428935 Human coronavirus OC43 Species 0.000 description 1
- 241000712431 Influenza A virus Species 0.000 description 1
- 241000713196 Influenza B virus Species 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 241000127282 Middle East respiratory syndrome-related coronavirus Species 0.000 description 1
- 206010035664 Pneumonia Diseases 0.000 description 1
- 241000725643 Respiratory syncytial virus Species 0.000 description 1
- 241000315672 SARS coronavirus Species 0.000 description 1
- 208000037847 SARS-CoV-2-infection Diseases 0.000 description 1
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 1
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 1
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 231100000517 death Toxicity 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 230000003950 pathogenic mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 230000005180 public health Effects 0.000 description 1
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 1
- 238000009877 rendering Methods 0.000 description 1
- 238000012827 research and development Methods 0.000 description 1
- 210000002345 respiratory system Anatomy 0.000 description 1
- 208000023504 respiratory system disease Diseases 0.000 description 1
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 1
- 230000000405 serological effect Effects 0.000 description 1
- 238000004088 simulation Methods 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
- C12Q1/701—Specific hybridization probes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/6858—Allele-specific amplification
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Immunology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Virology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明提供了一种快速检测新型冠状病毒D614G突变的引物组合物及试剂盒，该引物组合物包括引物组和PNA探针；该PNA探针的序列如SEQ ID NO：7所示；引物组包括F3引物、B3引物、FIP引物、BIP引物和LB引物，选自包括序列如SEQ ID NO：2～6的组合物、包括序列如SEQ ID NO：14～18的组合物、包括序列如SEQ ID NO：19～23的组合物和包括序列如SEQ ID NO：24～28的组合物的一组或者几组；或，引物组包括F3引物、B3引物、FIP引物、BIP引物、LB引物和LF引物，为序列如SEQ ID NO：8～13的组合物。本发明基于LAMP技术开发了一种快速检测新型冠状病毒D614G突变的引物组合物及试剂盒，无需复杂、昂贵的辅助设备，在30‑60min内即可实现核酸分子标志物的快速检测，检测结果可以通过目视法直接判断，具有良好的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及生物检测技术领域，尤其涉及一种快速检测新型冠状病毒D614G 突变的引物组合物及试剂盒。
背景技术
冠状病毒(Coronavirus，CoV)，因其包膜表面有一圈形似日冕的棘突而得 名，广泛存在于自然界中，是一种呼吸道病毒，其宿主包括人类、脊椎动物和无 脊椎动物。冠状病毒属套氏病毒目，冠状病毒科，冠状病毒属，为有包膜的正股 单链RNA病毒，直径为80～120nm，约有3万个碱基组成，其遗传物质是已知 RNA病毒中最大的。国际病毒分类命名委员会在2012年根据其遗传学差异和血 清学特性将冠状病毒分为α、β、γ、δ四群，其中β群CoV又进一步分为A、B、 C、D四个组。α、β两群易感染哺乳动物，包含了7种对人类致病的冠状病毒， 分别为HCoV-OC43、HCoV-229E、SARS-CoV、HCoV-NL63、HCoV-HKU1、 MERS-CoV和SARS-CoV-2；而γ、δ两群则主要感染禽类。冠状病毒是一种常 见的、易引发呼吸道疾病的病原体，在引起成人社区获得性肺炎的病毒中，冠状 病毒检出率与其他呼吸道病毒的检出率相似。SARS-CoV-2感染不仅会对人类的 生命安全构成威胁，还会对全球社会经济造成极大损失，我们需要“未雨绸缪”， 积极应对，对其流行病学和致病机制进行深入研究，积极研发新型特效药和疫苗， 并开发出更有效的检测手段，把冠状病毒扼杀于“摇篮”阶段，为人类的健康保 驾护航。
由于病毒自身的结构特征及宿主众多，导致该病毒极易发生变异，产生新类 型的冠状病毒突变体。变异新冠病毒不会增加疾病严重性，但其会导致更高的发 病率，产生更多住院及死亡病例，所以需要采取更严格的公共卫生措施来控制这 些变异病毒的传播，确保新冠肺炎“可防、可控、可治”。
D614G是出现的新冠病毒刺突蛋白(spike protein，S蛋白)里的一种氨基 酸的变异，即占据614号位置的是一个天冬氨酸(D)。而变异之后，这个位置 变成了甘氨酸(G)，S蛋白是病毒入侵细胞的“攻城锤”，也是许多疫苗和疗 法所针对的目标。因此，刺突蛋白上的突变可能会改变刺突蛋白的性质，让病毒 更容易入侵细胞，或者让疫苗和药物对其失去效果。目前D614G全球最主流的 SARS-CoV-2突变株之一，快速检测SARS-CoV-2突变情况，及时了解病毒株的 主流突变情况，对于疫情的防控、疾病的诊疗和疫苗的研发等均具有重要的意义。
目前逆转录实时PCR技术被认为是SARS-CoV-2检测“金标准”，然而该 技术操作复杂，扩增速度较慢(2-3个小时)，需要在要求较高的实验室内才能 进行，所需的检测设备价格昂贵，而且需要训练有素的专业技术人员才能进行检 测，导致该技术难以推广，尤其是基础设施薄弱、偏远落后的地区难以推广。而 环介导等温扩增技术(LAMP)是利用设计的四对特殊引物和具有连置换活性的 Bst DNA聚合酶(具有链置换特性)，在60-65℃恒温条件下进行特异、高效、 快速的扩增靶核酸。但目前未有采用LAMP技术检测新型冠状病毒D614G突变 的报道。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，提供了一种快速检测新型冠状病毒D614G突 变的引物组合物及试剂盒。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供了一种快速检测新型冠状病毒D614G突变的引物组 合物，包括引物组和PNA探针；该PNA探针的序列如SEQ ID NO：7所示；
上述引物组包括F3引物、B3引物、FIP引物、BIP引物和LB引物，选自 包括序列如SEQ ID NO：2～6的组合物、包括序列如SEQ ID NO：14～18的组合 物、包括序列如SEQ IDNO：19～23的组合物和包括序列如SEQ ID NO：24～28 的组合物的一组或者几组；或
上述引物组包括F3引物、B3引物、FIP引物、BIP引物、LB引物和LF引 物，为序列如SEQ ID NO：8～13的组合物。
进一步地，上述引物组合物包括序列如SEQ ID NO：2～6的引物和序列如 SEQ IDNO：7所示的PNA探针。
进一步地，上述引物组合物包括序列如SEQ ID NO：8～13的引物和序列如 SEQ IDNO：7所示的PNA探针。
进一步地，上述引物组合物包括序列如SEQ ID NO：14～18的引物和序列如 SEQID NO：7所示的PNA探针。
进一步地，上述引物组合物包括序列如SEQ ID NO：19～23的引物和序列如 SEQID NO：7所示的PNA探针。
进一步地，上述引物组合物包括序列如SEQ ID NO：24～28的引物和序列如 SEQID NO：7所示的PNA探针。
第二方面，本发明提供了包括上述引物组合物的快速检测新型冠状病毒 D614G突变的扩增体系，其还包括模板、反应缓冲液、酶溶液、中性红染料和/ 或荧光染料以及去离子水。
进一步地，在上述扩增体系中，F3引物和B3引物的终浓度为0.2μmol/L； FIP引物和BIP引物的终浓度为1.6μmol/L；LB引物和LF引物的终浓度为0.8 μmol/L；PNA探针的终浓度为0.8μmol/L。
进一步地，总体积为25μL的扩增体系包括如下组分：2×反应缓冲液12.5μL， F3引物1μL，B3引物1μL，FIP引物1μL，BIP引物1μL，LF引物0或者1μL， LB引物1μL，PNA探针1μL，8U酶溶液1μL，中性红染料1μL，去离子水2.5μL 或者1.5μL，模板2μL。
进一步地，上述扩增体系的反应条件为58℃-68℃，30-60min。
第二方面，本发明提供了包括上述引物组合物的快速检测新型冠状病毒 D614G突变的试剂盒，其还包括反应缓冲液、酶溶液、中性红染料和/或荧光染 料以及去离子水。
本发明采用以上技术方案，与现有技术相比，具有如下技术效果：
本发明基于LAMP技术开发了一种快速检测新型冠状病毒D614G突变的引 物组合物及试剂盒，无需复杂、昂贵的辅助设备，在30-60min内即可实现核酸 分子标志物的快速检测，检测结果可以通过目视法直接判断，具有良好的应用前 景。
附图说明
图1显示了本发明一实施例中检测LAMP检测体系的灵敏度的结果图；从右 到左依次为阴性对照、5×101copies/ml、5×102copies/ml、5×103copies/ml、 5×104copies/ml、5×105copies/ml、5×106copies/ml和5×107copies/ml的阳性模拟样 本；
图2显示了本发明一实施例中LAMP检测体系的灵敏度的荧光检测结果图；
图3显示了本发明一实施例中LAMP检测体系的特异性的荧光检测结果图。
具体实施方式
本发明针对如下序列的靶基因片段(其中128个碱基发生了G-A突变)， 提供了一种快速检测新型冠状病毒D614G突变的引物组合物、扩增体系和试剂 盒；
CACTACTGATGCTGTCCGTGATCCACAGACACTTGAGATTCTTGACATT ACACCATGTTCTTTTGGTGGTGTCAGTGTTATAACACCAGGAACAAATACTT CTAACCAGGTTGCTGTTCTTTATCAGAATGTTAACTGCACAGAAGTCCCTGT TGCTATTCATGCAGATCAACTTACTCCTACTTGGCGTGTTTATTCTACAGGTT CTAATGTTTTTCAAACACGTGCAGGCTGTTTAATAGGGGCTGAACATGTCA ACAACTCATATGAGTGTGACATACCCATTGGTGCAGGTATATGCGCTAGTTA TCAGACTCAGACTAATTC(SEQ ID NO：1)。
具体地，上述引物组合物选自以下引物体系之一，具体的序列信息如下表1。
表1引物组合物的序列信息
下面通过具体实施例和附图对本发明进行详细和具体的介绍，以使更好的理 解本发明，但是下述实施例并不限制本发明范围。
实施例中方法如无特殊说明的采用常规方法，使用的试剂如无特殊说明的使 用常规市售试剂或按常规方法配制的试剂。
实施例1
本实施例提供含有上述引物组合物的快速检测新型冠状病毒D614G突变的 试剂盒，其还包括模板、反应缓冲液、酶溶液、中性红染料和去离子水。
该试剂盒在使用时配制的LAMP扩增体系的总体积25μL，其包括如下体积 的组分：2×反应缓冲液(RM)12.5μL，F3引物(终浓度0.2μmol/L)1μL， B3引物(终浓度0.2μmol/L)1μL，FIP引物(终浓度1.6μmol/L)1μL，BIP引 物(终浓度1.6μmol/L)1μL，LF引物(终浓度0.8μmol/L)1μL(如果缺少 LF引物则加入1μL去离子水)，LB引物(终浓度0.8μmol/L)1μL，PNA(终浓度0.8μmol/L)1μL，酶溶液(8U)1μL，中性红染料1μL，去离子水1.5μL， 模板2μL。
上述LAMP扩增体系的LAMP反应条件为：58℃-68℃，30-60min；所用的 设备为普通PCR仪或恒温金属浴等能够稳定提供65℃恒温的设备。
使用该试剂盒检测新型冠状病毒D614G突变的结果判断：反应结束后，反 应液的颜色由原来的淡黄色变为红色，即判定为反应阳性。
验证实施例
本实施例对实施例1提供的扩增体系(其中，引物组合物采用表1中的第2 组引物体系)和试剂盒的灵敏度和特异性进行了检测，具体的步骤和实验结果如 下：
1.灵敏度：构建含靶片段的TA克隆质粒，将重组质粒与健康人的咽拭子样本 混合，制作梯度浓度的模拟样本，具体浓度为5×101copies/ml，5×102copies/ml， 5×103copies/ml，5×104copies/ml，5×105copies/ml，5×106copies/ml，5×107copies/ml，用上述LAMP扩增体系进行检测，得到的结果如图1所示。
此外，在上述不同浓度的模拟样本的扩增体系中同时加入SYBR，在AB 7300PCR仪器上进行实时荧光检测，结果如图2所示。
如图1～2可知，检测灵敏度可达5×102copies/ml。
2.特异性：采用所建立的上述LAMP扩增体系对临床常见的呼吸道病原： 甲型流感病毒RNA、乙型流感病毒RNA、鼻病毒RNA、呼吸道合胞病毒RNA、 肠道病毒RNA和未发生D614G突变的新型冠状病毒RNA进行扩增，均未发生 非特异扩增，表明所建立的LAMP检测体系具有良好的特异性。
在上述针对各个病毒RNA和阳性对照的扩增体系中同时加入SYBR，在AB 7300PCR仪器上进行实时荧光检测，结果如图3所示。
如图3可知，上述待测病毒RNA均未发生非特异扩增，仅有阳性对照可以 扩增。
以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并 不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行 的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范 围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。
序列表
<110> 复旦大学附属华山医院北院
<120> 一种快速检测新型冠状病毒D614G突变的引物组合物及试剂盒
<160> 28
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 327
<212> DNA
<213> 新型冠状病毒D614G突变序列
<400> 1
cactactgat gctgtccgtg atccacagac acttgagatt cttgacatta caccatgttc 60
ttttggtggt gtcagtgtta taacaccagg aacaaatact tctaaccagg ttgctgttct 120
ttatcagaat gttaactgca cagaagtccc tgttgctatt catgcagatc aacttactcc 180
tacttggcgt gtttattcta caggttctaa tgtttttcaa acacgtgcag gctgtttaat 240
aggggctgaa catgtcaaca actcatatga gtgtgacata cccattggtg caggtatatg 300
cgctagttat cagactcaga ctaattc 327
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
tttggtggtg tcagtgtt 18
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
actcatatga gttgttgaca tg 22
<210> 4
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
gacttctgtg cagttaacat cctgaccagg aacaaatact tctaacc 47
<210> 5
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
atgcagatca acttactcct acttggcccc tattaaacag cct 43
<210> 6
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
gcgtgtttat tctacaggtt ct 22
<210> 7
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
tagtcctaca at 12
<210> 8
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
ccaggaacaa atacttctaa cc 22
<210> 9
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
tgtcacactc atatgagttg t 21
<210> 10
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
tctgcatgaa tagcaacagg gaggttgctg ttctttatca gg 42
<210> 11
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
acttactcct acttggcgtg tttatgacat gttcagcccc tat 43
<210> 12
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
cttctgtgca gttaacat 18
<210> 13
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
caggttctaa tgtttttcaa acacg 25
<210> 14
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
cactactgat gctgtccg 18
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 15
cgccaagtag gagtaagttg 20
<210> 16
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 16
ggtgttataa cactgacacc accaatgatc cacagacact tgag 44
<210> 17
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 17
aggaacaaat acttctaacc aggttatctg catgaatagc aacag 45
<210> 18
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 18
tatcaggatg ttaactgcac agaag 25
<210> 19
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 19
cagacacttg agattcttga c 21
<210> 20
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 20
gtttgaaaaa cattagaacc tgtag 25
<210> 21
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 21
gaacagcaac ctggttagaa gtattgttct tttggtggtg tcag 44
<210> 22
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 22
atcaggatgt taactgcaca gaagaacacg ccaagtagga gta 43
<210> 23
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 23
tccctgttgc tattcatgca g 21
<210> 24
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 24
acattacacc atgttctttt gg 22
<210> 25
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 25
ccctattaaa cagcctgca 19
<210> 26
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 26
acatcctgat aaagaacagc aaccgtgtca gtgttataac accag 45
<210> 27
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 27
acagaagtcc ctgttgctat tcagtttgaa aaacattaga acctgtag 48
<210> 28
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 28
gcagatcaac ttactcctac ttggc 25
Claims (10)
1.一种快速检测新型冠状病毒D614G突变的引物组合物，其特征在于，包括引物组和PNA探针；所述PNA探针的序列如SEQ ID NO：7所示；
所述引物组包括F3引物、B3引物、FIP引物、BIP引物和LB引物，选自包括序列如SEQ IDNO：2～6的组合物、包括序列如SEQ ID NO：14～18的组合物、包括序列如SEQ ID NO：19～23的组合物和包括序列如SEQ ID NO：24～28的组合物的一组或者几组；或
所述引物组包括F3引物、B3引物、FIP引物、BIP引物、LB引物和LF引物，为序列如SEQ IDNO：8～13的组合物。
2.根据权利要求1所述的引物组合物，其特征在于，所述引物组合物包括序列如SEQ IDNO：2～6的引物和序列如SEQ ID NO：7所示的PNA探针。
3.根据权利要求1所述的引物组合物，其特征在于，所述引物组合物包括序列如SEQ IDNO：8～13的引物和序列如SEQ ID NO：7所示的PNA探针。
4.根据权利要求1所述的引物组合物，其特征在于，所述引物组合物包括序列如SEQ IDNO：14～18的引物和序列如SEQ ID NO：7所示的PNA探针。
5.根据权利要求1所述的引物组合物，其特征在于，所述引物组合物包括序列如SEQ IDNO：19～23的引物和序列如SEQ ID NO：7所示的PNA探针。
6.根据权利要求1所述的引物组合物，其特征在于，所述引物组合物包括序列如SEQ IDNO：24～28的引物和序列如SEQ ID NO：7所示的PNA探针。
7.一种包括如权利要求1-6任一项所述引物组合物的快速检测新型冠状病毒D614G突变的扩增体系，其特征在于，还包括DNA模板、反应缓冲液、DNA聚合酶、中性红染料和/或荧光染料以及去离子水。
8.根据权利要求7所述的扩增体系，其特征在于，在所述扩增体系中，F3引物和B3引物的终浓度为0.2μmol/L；FIP引物和BIP引物的终浓度为1.6μmol/L；LB引物和LF引物的终浓度为0.8μmol/L；PNA探针的终浓度为0.8μmol/L。
9.根据权利要求8所述的扩增体系，其特征在于，总体积为25μL的扩增体系包括如下组分：2×反应缓冲液12.5μL，F3引物1μL，B3引物1μL，FIP引物1μL，BIP引物1μL，LF引物0或者1μL，LB引物1μL，PNA探针1μL，8U酶溶液1μL，中性红染料1μL，去离子水2.5μL或者1.5μL，DNA模板2μL。
10.一种包括如权利要求1-6任一项所述引物组合物的快速检测新型冠状病毒D614G突变的扩增体系试剂盒，其特征在于，还包括反应缓冲液、酶溶液、中性红染料和/或荧光染料以及去离子水。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202110050940.1A CN113151585A (zh) | 2021-01-14 | 2021-01-14 | 一种快速检测新型冠状病毒d614g突变的引物组合物及试剂盒 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202110050940.1A CN113151585A (zh) | 2021-01-14 | 2021-01-14 | 一种快速检测新型冠状病毒d614g突变的引物组合物及试剂盒 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN113151585A true CN113151585A (zh) | 2021-07-23 |
Family
ID=76878689
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202110050940.1A Pending CN113151585A (zh) | 2021-01-14 | 2021-01-14 | 一种快速检测新型冠状病毒d614g突变的引物组合物及试剂盒 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN113151585A (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN114150088A (zh) * | 2021-11-30 | 2022-03-08 | 广东医科大学 | 一种新冠病毒基因单碱基突变检测方法及其应用 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111057798A (zh) * | 2020-01-20 | 2020-04-24 | 复旦大学附属华山医院 | 一种检测新型冠状病毒的lamp引物组合和试剂盒 |
| CN111518947A (zh) * | 2020-03-06 | 2020-08-11 | 齐鲁工业大学 | 检测新型冠状病毒SARS-CoV-2的RT-LAMP引物组及试剂盒 |
| CN112195275A (zh) * | 2020-10-14 | 2021-01-08 | 河南智泰生物科技有限公司 | Lamp联合检测甲型流感病毒、乙型流感病毒及新型冠状病毒的引物组、试剂盒及方法 |
-
2021
- 2021-01-14 CN CN202110050940.1A patent/CN113151585A/zh active Pending
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111057798A (zh) * | 2020-01-20 | 2020-04-24 | 复旦大学附属华山医院 | 一种检测新型冠状病毒的lamp引物组合和试剂盒 |
| CN111518947A (zh) * | 2020-03-06 | 2020-08-11 | 齐鲁工业大学 | 检测新型冠状病毒SARS-CoV-2的RT-LAMP引物组及试剂盒 |
| CN112195275A (zh) * | 2020-10-14 | 2021-01-08 | 河南智泰生物科技有限公司 | Lamp联合检测甲型流感病毒、乙型流感病毒及新型冠状病毒的引物组、试剂盒及方法 |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| GUOJUN CAO等: "Rapid detection of CALR type 1 and type 2 mutations using PNA-LNA clamping loop-mediated isothermal amplification on a CD-like microfluidic chip", 《ANALYTICA CHIMICA ACTA》 * |
| NORIHITO TARUMOTO等: "A novel peptide nucleic acid- and loop-mediated isothermal amplification assay for the detection of mutations in the 23S rRNA gene of Treponema pallidum", 《JOURNAL OF MEDICAL MICROBIOLOGY》 * |
| YANG ZHANG等: "Biosensing Detection of the SARS-CoV-2 D614G Mutation", 《TRENDS IN GENETICS》 * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN114150088A (zh) * | 2021-11-30 | 2022-03-08 | 广东医科大学 | 一种新冠病毒基因单碱基突变检测方法及其应用 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN113046475B (zh) | 一种快速检测突变型新型冠状病毒的引物组合物及试剂盒 | |
| CN112375847B (zh) | 一种基于CRISPR/Cas13a系统的乙型肝炎病毒基因分型检测方法 | |
| CN113025748A (zh) | 一种快速检测新型冠状病毒69-70del突变的引物组合物及试剂盒 | |
| US20220136075A1 (en) | Method for multiplex nucleic acid detection based on clustered regularly interspaced short palindromic repeat | |
| CN111057783A (zh) | 基于多酶恒温快速扩增技术检测结核分枝杆菌复合群及rpoB突变的引物探针组及其应用 | |
| KR20180052317A (ko) | 메르스 코로나바이러스 검출용 프라이머 세트 및 이의 용도 | |
| Magome et al. | Single-strand conformation polymorphism analysis of apple stem grooving capillovirus sequence variants | |
| WO2022257663A1 (zh) | 一种检测筛查新冠病毒n501y突变的方法及试剂盒 | |
| CN113046476A (zh) | 一种快速检测新型冠状病毒n501y突变的引物组合物及试剂盒 | |
| CN113684320A (zh) | 用于扩增或检测新型冠状病毒SARS-CoV-2核酸的引物组及其应用 | |
| CN113846185A (zh) | 一种用于新冠病毒e484k/q、k417n/t变异快速检测的引物组合物和试剂盒 | |
| CN113512548A (zh) | 一种基于CRISPR-Cas12a系统的新型冠状病毒检测试剂盒及其应用 | |
| CN113151585A (zh) | 一种快速检测新型冠状病毒d614g突变的引物组合物及试剂盒 | |
| WO2023207909A1 (zh) | 基于crispr的核酸检测试剂盒及其应用 | |
| CN116179511B (zh) | Cpf1蛋白在制备用于核酸检测的试剂盒中的应用 | |
| KR102018079B1 (ko) | 메르스 코로나바이러스 검출용 프라이머 세트 및 이의 용도 | |
| CN113897416B (zh) | 一种CRISPR/Cas12f的检测体系及其应用 | |
| US20230167511A1 (en) | An ultrasensitive rapid and portable case13d-based diagnostic assay | |
| CN113186359A (zh) | 猪星状病毒检测和分型富集多重pcr快速诊断试剂盒 | |
| CN112501166A (zh) | 一种化学修饰的高稳定性rna及试剂盒和方法 | |
| KR102009326B1 (ko) | cpa와 cpe 타겟 유전자를 통해 클로스트리디움 퍼프린젠스를 검출할 수 있는 Singleplex Real-Time PCR 키트 개발 | |
| CN107988429B (zh) | 一种检测狂犬病毒的试剂及其应用 | |
| JP3752102B2 (ja) | 小型球形ウイルスの検出方法 | |
| JPWO2007119557A1 (ja) | コイヘルペスウイルス（ｋｈｖ）の検出方法 | |
| WO2010032991A2 (ko) | 엔테로바이러스 검출용 프라이머, 탐침 및 이를 이용한 엔테로바이러스 검출방법 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20210723 |
|
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |