CN113897416B - 一种CRISPR/Cas12f的检测体系及其应用 - Google Patents

一种CRISPR/Cas12f的检测体系及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN113897416B
CN113897416B CN202111494633.9A CN202111494633A CN113897416B CN 113897416 B CN113897416 B CN 113897416B CN 202111494633 A CN202111494633 A CN 202111494633A CN 113897416 B CN113897416 B CN 113897416B
Authority
CN
China
Prior art keywords
sequence
cas12f
detection
amplification
sgrna
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202111494633.9A
Other languages
English (en)
Other versions
CN113897416A (zh
Inventor
季泉江
汤娜
吴兆韡
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
ShanghaiTech University
Original Assignee
ShanghaiTech University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by ShanghaiTech University filed Critical ShanghaiTech University
Priority to CN202111494633.9A priority Critical patent/CN113897416B/zh
Publication of CN113897416A publication Critical patent/CN113897416A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN113897416B publication Critical patent/CN113897416B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6827—Hybridisation assays for detection of mutation or polymorphism
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明提供一种CRISPR/Cas12f的检测体系及其应用。一种CRISPR/Cas12f的检测体系，其包括：Cas12f核酸酶、sgRNA、荧光探针以及待测序列，所述sgRNA含有如SEQ ID NO:42所示的序列以及靶向序列，所述待测序列中包含能够与所述sgRNA中的靶向序列碱基互补配对的靶序列，且所述靶序列的5’端上游具有PAM序列；当进行检测时，所述靶向序列与靶序列之间存在1个或2个错配碱基。本发明提供的检测体系能对SNP基因分型进行检测，且本发明的检测体系结合RPA扩增方法后不需要借助大型仪器设备，检测操作简便且快捷高效，能在短时间内得到检测结果；使用本发明的检测方法，待测序列的工作浓度高于500 pM时无需进行扩增，检测限低。

Description

一种CRISPR/Cas12f的检测体系及其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种CRISPR/Cas12f的检测体系、一种基因的检测方法、CRISPR/Cas12f的检测体系以及Cas12f核酸酶在基因检测中的应用，特别涉及一种基于极小型CRISPR/Cas12f核酸酶的新型基因检测方法。
背景技术
基因检测又称核酸检测，是生物技术领域的重要组成部分。基于不同生物以及物种的遗传物质DNA与RNA的序列特异性，已开发出不同的核酸检测方法。传统的核酸检测包括测序技术，恒温扩增技术等，可以对各种病原体的DNA或者RNA特异序列进行检测，也可分析检测疾病相关的SNP位点。
新兴的CRISPR/Cas（Clustered regularly interspaced short palindromicrepeats/CRISPR-associated protein）技术，因该系统功能多样且操作简易高效，已被广泛应用于科学研究，医疗，农业等领域；除了在基因编辑领域有相当广泛的应用，同时该系统也被开发为基因检测工具。
Cas12f核酸酶属于V-F型CRISPR系统中关键的效应蛋白，研究表明Cas12f与crRNA复合体不仅具有定向的双链DNA(dsDNA)切割活性，同时还具有非特异性的单链DNA(ssDNA)切割活性。当Cas12f-crRNA-tracrRNA复合体结合到目标DNA底物后，非特异性的旁系ssDNA切割活性则被激活，利用这一特殊性质可以实现在体外的基因检测。
通常的基因检测技术流程包括样品收集与扩增，之后对扩增产物进行测序，这对检测的仪器设备有着较高的要求，并且检测时间相对较长；而实际应用中基因检测常常需要在某些苛刻条件下进行，没有仪器设备则难以开展快速的检测，很大程度上限制了基因检测技术的应用。CRISPR/Cas系统基因检测工具可在很大程度上缩减这一流程，而目前已有的基于CRISPR/Cas系统的基因检测检测技术绝大多数只能实现对某种基因存在的检测，而无法做到对针对特定基因型的检测，例如SNP（Single Nucleotide Polymorphism）位点等只有个别碱基的差异的检测则需要经过更复杂的测序技术才能实现，这也极大限制了基因检测技术的应用。
因此开发出更为简便高效且低成本的检测工具，即减少基因检测技术设备仪器的需求，同时能具有基因检测与基因型分型检测功能的综合性优良的基因检测工具系统尤为迫切。
发明内容
鉴于现有技术中存在的问题，本发明提供了一种CRISPR/Cas12f的检测体系、一种基因的检测方法以及Cas12f核酸酶在基因检测中的应用。所述基因的检测方法对仪器设备需求低，操作简便，检测效率高。利用本发明的检测系统能够快速实现基因检测，并且能够检测SNP基因分型。
本发明第一方面提供一种CRISPR/Cas12f的检测体系，其包括：Cas12f核酸酶、sgRNA、荧光探针以及待测序列，所述sgRNA含有如SEQ ID NO: 42所示的序列以及靶向序列，所述待测序列中包含能够与所述sgRNA中的靶向序列碱基互补配对的靶序列，且所述靶序列的5’端上游具有PAM序列；当进行检测时，所述靶向序列与靶序列之间存在1个或2个错配碱基。
本发明的检测体系中，所述错配碱基较佳地位于所述PAM序列3’端后第3位、第5位、第6位或者第7位，或者同时位于两个碱基上，例如同时位于第7位与8位，或者同时位于第9位与10位，再或者同时位于第11位与12位。
在本发明某一较佳实施方案中，所述待测序列为SNP分型，所述错配碱基位置位于SNP位点处。
在本发明某一较佳实施方案中，所述Cas12f核酸酶为互营单胞菌（Syntrophomonas palmitatica）Cas12f（SpCas12f1）、嗜热细菌（Acidibacillus sulfuroxidans）Cas12f（AsCas12f）、惰性真杆菌（Eubacterium siraeum）Cas12f（EsCas12f1）或诺维氏梭状芽胞杆菌（Clostridium novyi）Cas12f (CnCas12f1)。
编码所述嗜热细菌（Acidibacillus sulfuroxidans）Cas12f的核酸序列优选包含如SEQ ID NO: 27所示的序列。
在本发明某一较佳实施方案中，所述荧光探针的5’端含有荧光基团，3’端含有淬灭基团，所述荧光基团和淬灭基团由一段4 nt至20 nt的单链DNA链接。
所述单链DNA优选含有如SEQ ID NO: 26所示的核苷酸序列。
本发明第二方面提供一种基因的检测方法，通过使用如本发明第一方面所述的检测体系进行检测。
本发明所述的检测方法中，所述待测序列的工作浓度至少为500pM。
所述检测方法较佳地包括步骤如下：
（1）扩增获得待测序列；
（2）使用如本发明第一方面所述的检测体系对步骤（1）所得的待测序列进行检测。
所述检测方法中，所述sgRNA的工作浓度较佳地为10-100nM，例如50nM。
所述检测方法中，所述Cas12f核酸酶的工作浓度较佳地为10-100 nM，例如50 nM。
所述检测方法中，所述荧光探针的工作浓度较佳地为100-1000 nM，例如500 nM。
本发明的检测方法中，步骤（1）所述扩增可为本领域常规，较佳地为PCR扩增、MDA扩增、LAMP扩增、RPA扩增以及RT-RPA扩增中的一种或多种。
在某一较佳实施方案中，所述RPA扩增的体系包括：T4UvsX重组酶、T4UvsY重组酶、T4gp32单链结合蛋白、Bsu DNA聚合酶、磷酸肌酸激酶、磷酸肌酸、dNTP、ATP以及PEG35K。
所述RPA扩增的反应温度较佳地为37℃-42℃，反应时间较佳地为15 min-60 min，例如37℃下反应30min。
本发明第三方面提供一种如本发明第一方面所述的检测体系在基因检测中的应用。
本发明第四方面提供Cas12f核酸酶在基因检测中的应用。
在某一较佳实施方案中，编码所述Cas12f核酸酶的核酸序列较佳地含有如SEQ IDNO: 27所示的序列。
本发明所述的sgRNA含有可变区部分（即靶向序列）以及固定区部分，其中固定区部分的序列如SEQ ID NO: 42所示；可变区部分的序列随待测序列中靶序列的变化而变化。
本发明所述的sgRNA的靶向序列包含20个核糖核苷酸，可以选择性地与待检测位点的通过碱基互补配对结合。针对特定基因片段，sgRNA协助Cas12f蛋白靶向到目标序列,同时激活旁系切割活性，使得ssDNA荧光探针被切断释放荧光；对于不同SNP基因型个别碱基的差异，sgRNA中靶向序列与靶序列完全互补或者形成碱基错配，两种不同形式直接地决定了效应蛋白Cas12f核酸酶旁系切割活性是否被激活，从而达到识别SNP位点检测目的。
本发明所述碱基错配是指，在待测突变位点处有与目标序列不互补的错配碱基。
本发明所述检测方法的扩增优选RPA扩增方法，即通过聚合酶重组酶扩增反应实现；利用此方法可以实现恒温扩增，且操作简单，不需要大型的PCR扩增设备,且能够检测到1 aM数量级即个位数分子的核酸样品。
优选地，RPA扩增反应体系包含T4UvsX重组酶，T4UvsY重组酶，T4gp32单链结合蛋白，BsuDNA聚合酶，磷酸激酶，磷酸肌酸，PEG35K，dATP，dCTP，dGTP，dTTP，ATP，正向引物，反向引物，待检测核酸样品等。
优选地，RPA扩增反应所用引物包括正向引物与反向引物，单条引物长度30-35nt，更优选为32 nt。
其中，步骤(1)中所述的扩增反应在待测序列的工作浓度高于500 pM时可以省略。
本发明中，若无特殊说明，所述工作浓度为该组分占反应体系的终浓度。
本发明的PAM位点与Cas12f核酸酶的种类有关，例如AsCas12f可识别的PAM序列为5’-TTR (R代表A或G)，还能有效识别5’-TTTC、5’-TTTT、5’-TTCA和5’-CTCA等。例如EsCas12f1和SpCas12f1可识别5’-TTY （Y代表C或T）；CnCas12f1可识别5’-CCN（N代表A、T、C和G）。
本发明所述的SNP分型指的是单核酸多态性（Single Nucleotide Polymorphism）基因分型。
本发明的积极进步效果：
（1）本发明提供了一种基于CRISPR-Cas系统的基因检测工具，通过适当的扩增方法得到含有靶序列的扩增产物，结合CRISPR-Cas12f检测体系，利用sgRNA中导向部分的特异性进行特定核酸序列检测或者利用sgRNA导向部分特定位置的错配碱基来实现目标基因SNP基因型的检测。
（2）本发明的检测体系结合RPA扩增方法后不需要借助大型仪器设备，检测操作简便且快捷高效，能在短时间内得到检测结果。
（3）1 aM的底物样品经过RPA反应扩增后能被本发明的检测方法高效检测，且使用本发明的检测方法，待测序列的工作浓度高于500 pM时无需进行扩增，检测限低。
附图说明
图1为基于CRISPR-Cas系统的检测工具的实验原理。
图2为sgRNA与靶向位点的不同位置的单碱基与双碱基的错配对AsCas12f体外切割活性的影响。
图3为实施例1中sgRNA与靶向位点的不同位置的单碱基与双碱基的错配对基于CRISPR-Cas12f的检测系统荧光信号产生的影响。结果显示，3位，5位，6，位，7位的单碱基错配以及第7与8位，9与10位，11与12位的双碱基错配会使产生的荧光信号明显减弱甚至不产生荧光信号。
图4为实施例2中运用基于CRISPR/Cas12f的检测系统对ALDH2基因的SNP位点rs671进行检测的荧光信号结果。图4的a结果显示，分别用检测A与G基因型的sgRNA检测Sbj2的样品均产生荧光信号（分别代表图中A_Sbj2和G_Sbj2曲线），则样品Sbj2基因型检测结果为A/G；用检测A基因型的sgRNA检测Sbj3的样品无信号（代表图中A_Sbj3），而用检测G基因型的sgRNA检测Sbj3的样品有荧光信号（代表图中G_Sbj3），则Sbj3基因型检测结果为G/G。图4的b为样品Sbj2与Sbj3在rs671位点的实际测序结果，结果显示实际测序与检测结果相符合。
图5为实施例3中CRISPR-Cas12f的检测系统在样品未经扩增时对不同浓度底物样品检测的信号结果，表明检测系统检测限。结果显示，待检测DNA底物浓度在500pM及以上时，该检测系统能够产生明显检测信号。
图6为实施例4中运用基于CRISPR/Cas12f的检测系统与重组聚合酶扩增反应相结合对耐药基因Tet位点进行检测的结果。结果显示，与RPA扩增结合后，该系统可检测到只含有1 aM 待测DNA的原始样品。
具体实施方式
下面结合附图与具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
首先结合图1简单阐述本发明实验原理：本发明中主要使用的CRISPR系统是V型CRISPR系统，其中效应蛋白主要为Cas12家族，该类核酸酶普遍具有非特异性的ssDNA切割活性，只有当Cas12效应蛋白与sgRNA复合体正确靶向到目标序列后，非特异切割活性才被激活。通过加入一个ssDNA荧光探针，探针带有荧光基团与荧光淬灭基团例如FAM与BHQ1，则当样品中存在目标靶向序列时，效应蛋白旁系切割活性被激活，探针被切断释放荧光，从而实现目标基因序列的检测。
进一步实验发现，当sgRNA的靶向序列与靶序列之间存在碱基的错配时，会对旁系切割活性造成影响，在特定位置的错配甚至会导致切割活性明显地减弱甚至丧失，例如图2所示。基于此，可实现针对SNP位点的检测。
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。
实施例中所用引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购得的常规产品。
实施例1 sgRNA导向部分（靶向序列）不同位错配所致的荧光信号区别
本实施例给出了当sgRNA导向部分（靶向序列）与靶序列之间存在错配时，应用本发明所述系统进行检测的荧光信号区别。以大肠杆菌中的hisD基因片段为待检测底物进行实验。
hisD基因待检测底物序列如下（SEQ ID NO: 1）：
5’-tgccgaaagtggacaaaatcttcgggccgggcaacgcctttgtcaccgaagcaaaacgccaggtaagccagcgtcttgacggtgcg gcgatcgatatgcccgcaggcccgtcggaagtgctggtgattgctgacagcggcgctacgccggatttcgtggcttctgatttgctctcccaggctgaacacggcccggactctcaggtgattttactga cgcccgatgctgatatggcgcgtcaagttgccgaagctgtcgaacgccagctggcagaactgccgcgtgccgaaaccgcacgtcaggcactgagcaccagccgcctgatcgtgaccaacgatttagcgcagtgcgtagagatatctaaccagtacggtccggagcacctgatcattcagacccgcaacgcacgcgaactggtcgatagcatcaccagtgccggttcggtatttcttggtgactggt-3’
划线部分为依据AsCas12f的PAM序列TTTA选定靶向序列（如SEQ ID NO: 2所示）：5’-ctgacgcccgatgctgatat-3’
hisD基因待检测底物的制备。
以大肠杆菌DH5α菌株基因组为模板对hisD基因片段进行PCR扩增。
hisD基因片段扩增正向引物序列为（如SEQ ID NO: 3所示）：5’-tgccgaaagtggacaaaatcttc-3’
hisD基因片段扩增反向引物序列为（如SEQ ID NO: 4所示）：5’-accagtcaccaagaaataccgaa-3’
PCR反应体系如表1。
表1
Figure 60217DEST_PATH_IMAGE001
其中DNA聚合酶使用南京诺唯赞生物科技股份有限公司生产的2×Phanta MaxMaster Mix。其中模板DNA使用大肠杆菌DH5a菌株的基因组。
上述PCR反应体系配好后进行聚合酶链式反应(PCR)，循环如下：98℃ 1 min；之后98℃ 10 s，55℃ 30 s，72℃ 30 s，共30个循环；最后72℃ 2 min。使用生工生物工程(上海) 股份有限公司生产的SanPrep柱式PCR产物纯化试剂盒对PCR产物进行回收。PCR产物纯化的具体步骤按照试剂盒使用操作手册进行。
sgRNA序列的DNA模板为：
5’-TAATACGACTCACTATAGGattcgtcggttcagcgacgataagccgagaagtgccaataaaactgttaagtggtttgg taacgctcggtaaggtagccaaaaggctgaaactccgtgcacaaagaccgcacggacgcttcacatatagctcataaacaagggtttgcgagctagcttgtggagtgtgaacctgacgcccgatgctgatat-3’
划线部分为靶向序列（如SEQ ID NO: 5所示），未划线部分为固定区（SEQ ID NO:42所示）。将靶向序列与靶序列分别设置不同位置的单碱基与双碱基的错配，将选定试验的sgRNA模板靶向部分替换如下（如SEQ ID NO: 6-25所示）：
MM-01: 5’- Atgacgcccgatgctgatat-3’
MM-02: 5’-cGgacgcccgatgctgatat-3’
MM-03: 5’-ctTacgcccgatgctgatat-3’
MM-04: 5’-ctgCcgcccgatgctgatat-3’
MM-05: 5’-ctgaAgcccgatgctgatat-3’
MM-06: 5’-ctgacTcccgatgctgatat-3’
MM-07: 5’-ctgacgAccgatgctgatat-3’
MM-09: 5’-ctgacgccAgatgctgatat-3’
MM-11: 5’-ctgacgcccgCtgctgatat-3’
MM-13: 5’-ctgacgcccgatTctgatat-3’
MM-15: 5’-ctgacgcccgatgcGgatat-3’
MM-17: 5’-ctgacgcccgatgctgCtat-3’
MM-19: 5’-ctgacgcccgatgctgatCt-3’
MM-0708: 5’-ctgacgAAcgatgctgatat-3’
MM-0910: 5’-ctgacgccATatgctgatat-3’
MM-1112: 5’-ctgacgcccgCGgctgatat-3’
MM-1314: 5’-ctgacgcccgatTAtgatat-3’
MM-1516: 5’-ctgacgcccgatgcGTatat-3’
MM-1718: 5’-ctgacgcccgatgctgCGat-3’
MM-1920: 5’-ctgacgcccgatgctgatCG-3’
sgRNA的制备。
sgRNA转录模板序列由生工生物合成，经PCR扩增后用作转录模板。RNA用上述模板通过HiScribe T7 High Yield RNA Synthesis Kit (New England Biolabs)试剂盒转录制备。制备后的sgRNA经过酚氯仿抽提和乙醇沉淀进行纯化。
荧光探针序列为：5’-FAM-T12-BHQ1-3’，由生工生物工程(上海) 股份有限公司合成，其中T12表示荧光基团与淬灭基团之间有12个胸腺嘧啶脱氧核糖核苷酸（如SEQ ID NO:26所示）。
AsCas12f核酸酶制备。
AsCas12f基因（如SEQ ID NO: 27所示）经过PCR扩增克隆到大肠杆菌表达载体pET28a。克隆成功后的质粒转入大肠杆菌蛋白表达菌株BL21(DE3)（购自上海唯地生物技术有限公司）。将含有AsCas12f表达载体的BL21(DE3)菌株在1 L LB中，37℃条件下进行培养。当OD600到达0.6时，在菌液中加入250 μl 1 M IPTG，并将温度调至16℃诱导表达过夜。次日离心收集细菌，使用高压细胞破碎仪破碎后，用Ni-NTA (GE Healthcare)柱子进行纯化。纯化后的产物经过Gel filtration (GE Healthcare)进一步纯化。得到的蛋白保存在1 MNaCl, 10 mM Tris-HCl, pH=7.5, 1 mM DTT, 10%甘油的缓冲液中。
检测反应体系为20μl，具体成分如表2。
表2
Figure 389567DEST_PATH_IMAGE002
其中10×反应缓冲液中包含100 mM Tris-HCl, pH=7.5, 100 mM MgCl2, 500 mMNaCl。
检测反应置于荧光定量PCR仪CFX96 Real-Time System (Bio-Rad)，反应温度为45℃，每间隔两分钟记录一次FAM荧光信号，共计录120次，并且每个反应平行重复三次。使用Bio-Rad CFX Manager记录检测信号得到检测结果如图3所示。
结果显示靶向序列3’端后第3位，5位，6位，7位的单碱基错配对检测信号的产生具有明显影响，同时第7与8位，9与10位，11与12位的双碱基错配几乎使得检测系统不产生荧光信号，而当出现显著降低的荧光信号时，即说明该位点可用于进行突变基因检测。
实施例2 SNP位点rs671基因型检测
本实施例提供一种基于CRISPR-Cas12f系统的SNP基因分型检测方法，以ALDH2基因的SNP位点rs671为例进行实验。
ALDH2基因的SNP位点rs671存在A与G两种基因型。
rs671的A基因型参考序列如下（如SEQ ID NO: 28所示）：
5’-CAACTGCTATGATGTGTTTGGAGCCCAGTCACCCTTTGGTGGCTACAAGATGTCGG GGAGTGGCCGGGAGTTGGGCGAGTACGGGCTGCAGGCATACACTAAAGTGAAAACTGTGAGTGTGGGACCTGCTGGGGGCTCAGGGCCTGTTGGGGCTTGAGGGTCTGCTGGTGGCTCGGAGCCTGCTGGGGGATTGGGGTCTGT-3’
rs671的G基因型参考序列如下（如SEQ ID NO: 29所示）：
5’-CAACTGCTATGATGTGTTTGGAGCCCAGTCACCCTTTGGTGGCTACAAGATGTCGG GGAGTGGCCGGGAGTTGGGCGAGTACGGGCTGCAGGCATACACTGAAGTGAAAACTGTGAGTGTGGGACCTGCTGGGGGCTCAGGGCCTGTTGGGGCTTGAGGGTCTGCTGGTGGCTCGGAGCCTGCTGGGGGATTGGGGTCTGT-3’
其中划线部分碱基为rs671突变位点。
人体两条染色体上可包含三种不同基因型组合：
（1）G/G，G纯合型；
（2）A/G，A/G杂合型；
（3）A/A，A纯合型。
在ALDH2基因的rs617单碱基突变位点处选定靶向序列，靶向序列的3’端具有TTTT序列作为PAM，并使得SNP位点处于距离PAM序列的第6位。
选定检测ALDH2基因A基因型的sgRNA模板的靶向部分如下（如SEQ ID NO: 30所示）：
5’-cacttTagtgtatgcctgca-3’
选定检测ALDH2基因G基因型的sgRNA模板的靶向部分如下（如SEQ ID NO: 31所示）：
5’-cacttCagtgtatgcctgca-3’
sgRNA的制备。
sgRNA转录模板序列由生工生物合成，经PCR扩增后用作转录模板。RNA用上述模板通过HiScribe T7 High Yield RNA Synthesis Kit (New England Biolabs)试剂盒转录制备。制备后的sgRNA经过酚氯仿抽提和乙醇沉淀进行纯化。
待检测样品制备。
收集受试者的唾液样品，不同受试者包含具有饮酒后脸红与不脸红的表型（分别代表ALDH2基因上的rs617单碱基突变位点的两种基因型）。使用生工生物工程(上海) 股份有限公司生产的Ezup柱式唾液、尿液基因组提取试剂盒提取基因组样品。经过PCR扩增待检测位点序列。
扩增ALDH2 rs671位点所用正向序列为（如SEQ ID NO: 32所示）：5’-ctttggggcaatacaggggg-3’
扩增ALDH2 rs671位点所用反向序列为（如SEQ ID NO: 33所示）：5’-cagaccctaaatccctggca-3’
扩增反应体系参考表1。
PCR反应体系配好后进行聚合酶链式反应(PCR)，循环如下：98℃ 30 s；之后 98℃10 s，55℃ 30 s，72℃ 30 s，共30个循环；最后72℃ 2 min。使用生工生物工程(上海) 股份有限公司生产的SanPrep柱式PCR产物纯化试剂盒对PCR产物进行回收。PCR产物纯化的具体步骤按照试剂盒使用操作手册进行。扩增制备好的样品底物用于检测。
CRISPR-Cas12f检测体系参考表2，其中sgRNA分别使用检测rs671位点的A和G基因型的sgRNA进行实验。
检测反应置于荧光定量PCR仪CFX96 Real-Time System (Bio-Rad)，反应温度为45℃，每间隔两分钟记录一次FAM荧光信号，共计录120次。每个样品分别使用只包含检测A基因型和只包含检测G基因型的sgRNA分别进行检测，并且每个反应重复三次。使用Bio-RadCFX Manager记录检测信号得到检测结果如图4所示。
结果显示，检测系统能够有效地检测出ALDH2基因rs671位点的基因型，对于样品Sbj2基因型检测结果为AG，对于样品Sbj3基因型检测结果为GG，与样品实际测序结果相符合。
实施例3 CRISPR-Cas12f检测体系检测限实验
本实施例给出了当待检测样品未经过PCR等方式的扩增时，本发明所述系统对不同浓度的目标样品的检测效果。以金黄色葡萄球菌N315菌株中的耐药基因mecA基因片段为检测底物进行实验。
mecA基因片段参考序列如下（如SEQ ID NO: 34所示）：
5’-ttagaccgaaacaatgtggaattggccaatacaggaacagcatatgagataggcatcgttccaaagaatgtatctaaaaaagattata aagcaatcgctaaagaactaagtatttctgaagactatatcaaacaacaaatggatcaaaattgggtacaagatgataccttcgttccacttaaaaccgttaaaaaaatggatgaatatttaagtgatttcgcaaaaaaatttcatcttacaactaatgaaacagaaagtcgtaactatcctctaggaaaagcgacttcacatctattaggttatgttggtcccattaactctgaagaattaaaacaaaaagaatataaaggctataaagatgatgcagttattggtaaaaagggactcgaaaaactttacgataaaaagctccaacatgaagatggctatcgtgtcacaatcgtt gacgataatagcaatacaatcgcacatacattaatagagaaaaagaaaaaagatggcaaagatattcaactaactattgatgctaaagttcaaaagagtatttataacaacatgaaaaatgattatggctcaggtactgctatccaccctcaaacaggtgaattattagcacttgtaagcacaccttcatatgacgtctatccatttatgtatggcatgagtaacgaagaatataataaattaaccgaagataaaaaagaacctctgctcaacaagttccagattacaacttcaccaggttcaactcaaaaaatattaacagcaatgattgggttaaataacaaaacattagacgataaaacaagttataaaatcgatggtaaaggttggcaaaaagataaatcttggggtggttacaacgttacaagatatgaagtggtaaatggtaatatcgacttaaaacaagcaatagaatcatcagataacattttctttgctagagtagcactcgaatt-3’
划线部分为依据AsCas12f的PAM序列ATTA选定靶向序列（如SEQ ID NO: 35所示）：5’-tcgtcaacgattgtgacacg-3’（为划线部分的反向互补序列）。
标准浓度底物的制备。通过PCR反应扩增mecA基因底物片段（此扩增获得的片段作为标准品使用，用于测定检测限），扩增体系参考表1，其中DNA底物使用金黄色葡萄球菌N315菌株的基因组。
PCR反应循环如下：98℃ 30 s；之后 98℃ 10 s，55℃ 30 s，72℃ 30s，共30个循环；最后72℃ 2 min。使用生工生物工程(上海) 股份有限公司生产的SanPrep柱式PCR产物纯化试剂盒对PCR产物进行回收。PCR产物纯化的具体步骤按照试剂盒使用操作手册进行。扩增制备好的底物样品用Nanodrop 2000 Spectrophotometer (Thermo SCIENTIFIC) 进行浓度测定,并进行梯度稀释。
检测体系如表3所示。
表3
Figure 181942DEST_PATH_IMAGE003
其中DNA底物在检测反应体系中最终的浓度分别为2 nM, 1 nM, 500 pM, 250pM, 125 pM。
其中sgRNA靶向部分的模板序列为选定的mecA基因片段靶向序列。
检测反应置于荧光定量PCR仪CFX96 Real-Time System (Bio-Rad)，反应温度为45℃，每间隔两分钟记录一次FAM荧光信号，共计录120次，并且每个反应重复三次。使用Bio-Rad CFX Manager记录检测信号得到检测结果如图5所示。
结果显示，在初始样品未经过PCR等扩增时，本发明所述的检测反应系统对样品的检测限可以低至500 pM，即待测样品中至少含有500 pM的靶向序列以及PAM位点时，可不需要扩增富集就能直接进行检测。
实施例4 与常温扩增相结合对耐药基因tet位点进行检测
本实施例提供了一种以常温扩增方法重组聚合酶扩增（RPA）反应联合CRISPR/Cas12f检测系统的检测方法，该系统的组合能够最大程度减少仪器设备的使用，并达到极高的检测效果。选用普遍存在的细菌四环素耐药基因tet基因片段为目标底物进行实验。
tet基因位点片段参考序列为（如SEQ ID NO: 36所示）：
5’-ATCTTGCTCGTCTCGCTGGCCGGCGCCACTGTCGACTACGCCATCATGGCGACA GCGCCTTTCCTTTGGGTTCTCTATATCGGGCGGATCGTGGCCGGCATCACCGGGGCGACTGGGGCGGTAGCCGGCGCTTATATTGCCGATATCACTGATGGCGATGAGCGCGCGCGGCACTTCGGCTTCATGAGCGCCTGTTTCGGGTTCGGGATGGTCGCGGGACCTGTGCTCGGTGGGCTGATGGGCGGTTTCTCCCCCCACGCTCCGTTCTTCGCCGCGGCAGCCTTGAACGGCCTCAATTTCCTGACGGGCTGTTTCCTTTTGCCGGAGTCGCACAAAGGCGAACGCCGGCCGTTACGCCGGGAGGCTCT CAACCCGCTCGCTTCGTTCCGGTGGGCCCGGGGCATGACCGTCGTCGCCGCCCTGATGGCGGTCTTCTTCATCATGCAACTTGTCGGACAGGTGCCGGCCGCGCTTTGGGTCATTTTCGGCGAGGATCGCTTTCACTGGGACGCGACCACGATCGGCATTTCGCTTGCCGCATTTGGCATTCTGCATTCACTCGCCCAGGCAATGATCACCGGCCCTGTAGCCGCCCGGCTCGGCGAAAGGCGGGCACTCATGCTCGGAATGATTGCCGACGGCACAGGCTACATCCTGCTTGCCTTCGCGACACGGGGATGGATGGCGTTCCCGATCATGGTCCTGCTTGCTTCGGGTGGCATCGGAATGCCGGCGCTGCAAGCAATGTTGTCCAGGCAGGTGGATGAGGAACGTCAGGGGCAGCTGCAAGGCTCACTGGCGGCGCTCACCAGCCTGACCTCGATCGTCGGACCCCTCCTCTTCACGGCGATCTATGCGGCTTCTATAACAACGTGGAACGGGTGGGCATGGATTGCAGGCGCTGCCCTCTACTTGCTCTGCCTGCCG-3’
划线部分为依据AsCas12f的PAM序列GTTA选定靶向序列5’-CGCCGGGAGGCTCTCAACCC-3’（如SEQ ID NO: 37所示）。
待检测底物样品的制备。
首先制备用于恒温扩增的DNA模板，以pCasPA（Addgene）质粒为模板进行PCR扩增反应，反应体系参考表1。
扩增所用正向引物为（如SEQ ID NO: 38所示）：5’-ATCTTGCTCGTCTCGCTGGC-3’
扩增所用反向引物为（如SEQ ID NO: 39所示）：5’-CGGCAGGCAGAGCAAGTAGA-3’
PCR反应循环如下：98℃ 30 s；之后 98℃ 10 s，55℃ 30 s，72℃ 30s，共30个循环；最后72℃ 1 min。使用生工生物工程(上海) 股份有限公司生产的SanPrep柱式PCR产物纯化试剂盒对PCR产物进行回收。PCR产物纯化的具体步骤按照试剂盒使用操作手册进行。
将扩增好的DNA模板进行纯化以及浓度梯度稀释后作为恒温扩增待检测位点的DNA模板。
重组聚合酶扩增反应(RPA)。
RPA反应扩增所用正向引物为（如SEQ ID NO: 40所示）：5’-
AGCCTTGAACGGCCTCAATTTCCTGACGGG-3’
RPA反应扩增所用反向引物为（如SEQ ID NO: 41所示）：5’-
ACCTGTCCGACAAGTTGCATGATGAAGAAGACC-3’
反应体系如表4所示。
表4
Figure 54084DEST_PATH_IMAGE004
其中10×RPA缓冲液中包含10 mM DTT, 200 mM Tris-HCl (pH=7.9)，500 mMK2OAC。
将反应体系按上述表格配好后，加入MgSO4至体系终浓度为14 mM,混匀后迅速放置到37℃恒温反应至少30分钟。反应结束后的产物可用于检测。
检测反应体系如表5所示。
表5
Figure 375343DEST_PATH_IMAGE005
其中DNA底物使用RPA反应后的直接产物。
检测反应置于荧光定量PCR仪CFX96 Real-Time System (Bio-Rad)，反应温度为45℃，每间隔两分钟记录一次FAM荧光信号，共计录120次，并且每个反应重复三次。使用Bio-Rad CFX Manager记录检测信号得到检测结果如图6所示。
结果显示，1 aM的底物样品经过RPA反应扩增后的产物能够被本发明所述系统高效地检测。
SEQUENCE LISTING
<110> 上海科技大学
<120> 一种CRISPR/Cas12f的检测体系及其应用
<130> P21017247C
<160> 42
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 462
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> hisD基因待检测序列
<400> 1
tgccgaaagt ggacaaaatc ttcgggccgg gcaacgcctt tgtcaccgaa gcaaaacgcc 60
aggtaagcca gcgtcttgac ggtgcggcga tcgatatgcc cgcaggcccg tcggaagtgc 120
tggtgattgc tgacagcggc gctacgccgg atttcgtggc ttctgatttg ctctcccagg 180
ctgaacacgg cccggactct caggtgattt tactgacgcc cgatgctgat atggcgcgtc 240
aagttgccga agctgtcgaa cgccagctgg cagaactgcc gcgtgccgaa accgcacgtc 300
aggcactgag caccagccgc ctgatcgtga ccaacgattt agcgcagtgc gtagagatat 360
ctaaccagta cggtccggag cacctgatca ttcagacccg caacgcacgc gaactggtcg 420
atagcatcac cagtgccggt tcggtatttc ttggtgactg gt 462
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> hisD基因中的靶向序列
<400> 2
ctgacgcccg atgctgatat 20
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> hisD基因正向引物
<400> 3
tgccgaaagt ggacaaaatc ttc 23
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> hisD基因反向引物
<400> 4
accagtcacc aagaaatacc gaa 23
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> sgRNA的导向序列
<400> 5
ctgacgcccg atgctgatat 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MM-01
<400> 6
atgacgcccg atgctgatat 20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MM-02
<400> 7
cggacgcccg atgctgatat 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MM-03
<400> 8
cttacgcccg atgctgatat 20
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MM-04
<400> 9
ctgccgcccg atgctgatat 20
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MM-05
<400> 10
ctgaagcccg atgctgatat 20
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MM-06
<400> 11
ctgactcccg atgctgatat 20
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MM-07
<400> 12
ctgacgaccg atgctgatat 20
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MM-09
<400> 13
ctgacgccag atgctgatat 20
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MM-11
<400> 14
ctgacgcccg ctgctgatat 20
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MM-13
<400> 15
ctgacgcccg attctgatat 20
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MM-15
<400> 16
ctgacgcccg atgcggatat 20
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MM-17
<400> 17
ctgacgcccg atgctgctat 20
<210> 18
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MM-19
<400> 18
ctgacgcccg atgctgatct 20
<210> 19
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MM-0708
<400> 19
ctgacgaacg atgctgatat 20
<210> 20
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MM-0910
<400> 20
ctgacgccat atgctgatat 20
<210> 21
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MM-1112
<400> 21
ctgacgcccg cggctgatat 20
<210> 22
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MM-1314
<400> 22
ctgacgcccg attatgatat 20
<210> 23
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MM-1516
<400> 23
ctgacgcccg atgcgtatat 20
<210> 24
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MM-1718
<400> 24
ctgacgcccg atgctgcgat 20
<210> 25
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MM-1920
<400> 25
ctgacgcccg atgctgatcg 20
<210> 26
<211> 12
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 荧光探针序列中的T12
<400> 26
tttttttttt tt 12
<210> 27
<211> 1266
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> AsCas12f基因
<400> 27
atgatcaaag tttaccgtta tgaaatcgtt aaaccgctgg acctggattg gaaagaattc 60
ggcaccatcc tgcgtcagct gcagcaggaa acccgcttcg cgctgaacaa agcaacccag 120
ctggcgtggg aatggatggg tttcagctct gattacaaag acaaccatgg cgaatacccg 180
aaaagcaaag acatcctggg ctacaccaac gttcacggtt acgcatacca caccatcaaa 240
accaaagctt atcgtctgaa cagcggcaac ctgagccaga ccatcaaacg tgcgaccgat 300
cgcttcaaag cgtaccagaa agaaatcctg cgtggtgaca tgtccatccc gtcttacaaa 360
cgtgatatcc cgctggatct gatcaaagaa aacatcagcg ttaaccgtat gaaccacggt 420
gattatatcg cttccctgtc cctgctgtct aacccggcga aacaggaaat gaacgttaaa 480
cgtaaaatct ccgtgattat catcgttcgt ggcgcgggta aaaccatcat ggatcgcatc 540
ctgagcggcg aataccaggt gagcgcgagc cagatcatcc acgacgaccg taaaaacaaa 600
tggtacctga acatctctta tgatttcgaa ccgcagaccc gtgttctgga tctgaacaaa 660
atcatgggca tcgatctggg tgttgcggtg gcggtgtaca tggcgttcca gcacaccccg 720
gcgcgctaca aactggaagg cggtgaaatc gaaaacttcc gtcgtcaggt ggagtctcgt 780
cgcatctcca tgctgcgcca gggtaaatac gcgggtggtg ctcgtggcgg tcacggccgt 840
gataaacgta tcaaaccgat cgaacagctg cgtgacaaaa tcgctaactt ccgcgatacc 900
actaaccacc gttactctcg ttacatcgtt gatatggcta tcaaagaagg ttgcggtacc 960
attcagatgg aagatctgac caacatccgt gatatcggct ctcgtttcct gcagaactgg 1020
acctactacg atctgcagca gaaaatcatc tacaaagcgg aagaagcggg catcaaagtt 1080
atcaaaattg atccgcagta caccagccag cgttgcagcg aatgcggcaa catcgattcc 1140
ggtaaccgta tcggtcaggc gatcttcaaa tgccgtgctt gcggctacga agcgaacgcg 1200
gactacaacg cagctcgtaa catcgcgatc ccgaacatcg ataaaatcat cgcggaaagc 1260
atcaaa 1266
<210> 28
<211> 201
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> rs671的A基因型
<400> 28
caactgctat gatgtgtttg gagcccagtc accctttggt ggctacaaga tgtcggggag 60
tggccgggag ttgggcgagt acgggctgca ggcatacact aaagtgaaaa ctgtgagtgt 120
gggacctgct gggggctcag ggcctgttgg ggcttgaggg tctgctggtg gctcggagcc 180
tgctggggga ttggggtctg t 201
<210> 29
<211> 201
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> rs671的G基因型
<400> 29
caactgctat gatgtgtttg gagcccagtc accctttggt ggctacaaga tgtcggggag 60
tggccgggag ttgggcgagt acgggctgca ggcatacact gaagtgaaaa ctgtgagtgt 120
gggacctgct gggggctcag ggcctgttgg ggcttgaggg tctgctggtg gctcggagcc 180
tgctggggga ttggggtctg t 201
<210> 30
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> rs617的A基因型的sgRNA的靶向部分
<400> 30
cactttagtg tatgcctgca 20
<210> 31
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> rs617的G基因型sgRNA的靶向部分
<400> 31
cacttcagtg tatgcctgca 20
<210> 32
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> rs671的正向引物
<400> 32
ctttggggca atacaggggg 20
<210> 33
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> rs671的反向引物
<400> 33
cagaccctaa atccctggca 20
<210> 34
<211> 959
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> mecA基因
<400> 34
ttagaccgaa acaatgtgga attggccaat acaggaacag catatgagat aggcatcgtt 60
ccaaagaatg tatctaaaaa agattataaa gcaatcgcta aagaactaag tatttctgaa 120
gactatatca aacaacaaat ggatcaaaat tgggtacaag atgatacctt cgttccactt 180
aaaaccgtta aaaaaatgga tgaatattta agtgatttcg caaaaaaatt tcatcttaca 240
actaatgaaa cagaaagtcg taactatcct ctaggaaaag cgacttcaca tctattaggt 300
tatgttggtc ccattaactc tgaagaatta aaacaaaaag aatataaagg ctataaagat 360
gatgcagtta ttggtaaaaa gggactcgaa aaactttacg ataaaaagct ccaacatgaa 420
gatggctatc gtgtcacaat cgttgacgat aatagcaata caatcgcaca tacattaata 480
gagaaaaaga aaaaagatgg caaagatatt caactaacta ttgatgctaa agttcaaaag 540
agtatttata acaacatgaa aaatgattat ggctcaggta ctgctatcca ccctcaaaca 600
ggtgaattat tagcacttgt aagcacacct tcatatgacg tctatccatt tatgtatggc 660
atgagtaacg aagaatataa taaattaacc gaagataaaa aagaacctct gctcaacaag 720
ttccagatta caacttcacc aggttcaact caaaaaatat taacagcaat gattgggtta 780
aataacaaaa cattagacga taaaacaagt tataaaatcg atggtaaagg ttggcaaaaa 840
gataaatctt ggggtggtta caacgttaca agatatgaag tggtaaatgg taatatcgac 900
ttaaaacaag caatagaatc atcagataac attttctttg ctagagtagc actcgaatt 959
<210> 35
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> mecA基因中的靶向序列
<400> 35
tcgtcaacga ttgtgacacg 20
<210> 36
<211> 927
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> tet基因
<400> 36
atcttgctcg tctcgctggc cggcgccact gtcgactacg ccatcatggc gacagcgcct 60
ttcctttggg ttctctatat cgggcggatc gtggccggca tcaccggggc gactggggcg 120
gtagccggcg cttatattgc cgatatcact gatggcgatg agcgcgcgcg gcacttcggc 180
ttcatgagcg cctgtttcgg gttcgggatg gtcgcgggac ctgtgctcgg tgggctgatg 240
ggcggtttct ccccccacgc tccgttcttc gccgcggcag ccttgaacgg cctcaatttc 300
ctgacgggct gtttcctttt gccggagtcg cacaaaggcg aacgccggcc gttacgccgg 360
gaggctctca acccgctcgc ttcgttccgg tgggcccggg gcatgaccgt cgtcgccgcc 420
ctgatggcgg tcttcttcat catgcaactt gtcggacagg tgccggccgc gctttgggtc 480
attttcggcg aggatcgctt tcactgggac gcgaccacga tcggcatttc gcttgccgca 540
tttggcattc tgcattcact cgcccaggca atgatcaccg gccctgtagc cgcccggctc 600
ggcgaaaggc gggcactcat gctcggaatg attgccgacg gcacaggcta catcctgctt 660
gccttcgcga cacggggatg gatggcgttc ccgatcatgg tcctgcttgc ttcgggtggc 720
atcggaatgc cggcgctgca agcaatgttg tccaggcagg tggatgagga acgtcagggg 780
cagctgcaag gctcactggc ggcgctcacc agcctgacct cgatcgtcgg acccctcctc 840
ttcacggcga tctatgcggc ttctataaca acgtggaacg ggtgggcatg gattgcaggc 900
gctgccctct acttgctctg cctgccg 927
<210> 37
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> tet基因的靶向序列
<400> 37
cgccgggagg ctctcaaccc 20
<210> 38
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> tet基因的正向引物
<400> 38
atcttgctcg tctcgctggc 20
<210> 39
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> tet基因的反向引物
<400> 39
cggcaggcag agcaagtaga 20
<210> 40
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RPA使用的正向引物
<400> 40
agccttgaac ggcctcaatt tcctgacggg 30
<210> 41
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RPA使用的反向引物
<400> 41
acctgtccga caagttgcat gatgaagaag acc 33
<210> 42
<211> 190
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> sgRNA的固定区
<400> 42
taatacgact cactatagga ttcgtcggtt cagcgacgat aagccgagaa gtgccaataa 60
aactgttaag tggtttggta acgctcggta aggtagccaa aaggctgaaa ctccgtgcac 120
aaagaccgca cggacgcttc acatatagct cataaacaag ggtttgcgag ctagcttgtg 180
gagtgtgaac 190

Claims (13)

1.一种CRISPR/Cas12f的检测体系，其包括：Cas12f核酸酶、sgRNA、荧光探针以及待测序列，所述sgRNA含有如SEQ ID NO: 42所示的序列以及靶向序列，所述待测序列中包含能够与所述sgRNA中的靶向序列碱基互补配对的靶序列，且所述靶序列的5’端上游具有PAM序列；当进行检测时，所述靶向序列与靶序列之间存在1个或2个错配碱基；所述错配碱基位于所述PAM序列3’端后第3位，第5位，第6位或者第7位；或同时位于第7位与8位，或同时位于第9位与10位，或同时位于第11位与12位。
2.如权利要求1所述的检测体系，其特征在于，所述检测体系满足以下条件中的一种或多种：
所述待测序列为SNP分型，所述错配碱基位置位于SNP位点处；
所述Cas12f核酸酶为互营单胞菌（Syntrophomonas palmitatica）Cas12f、嗜热细菌（Acidibacillus sulfuroxidans）Cas12f、惰性真杆菌（Eubacterium siraeum）Cas12f或诺维氏梭状芽胞杆菌（Clostridium novyi）Cas12f；
所述荧光探针的5’端含有荧光基团，3’端含有淬灭基团，所述荧光基团和所述淬灭基团由一段4 nt至20 nt的单链DNA连接。
3.如权利要求2所述的检测体系，其特征在于，编码所述嗜热细菌（Acidibacillus sulfuroxidans）Cas12f的核酸序列包含如SEQ ID NO: 27所示的序列。
4.如权利要求2或3所述的检测体系，其特征在于，所述单链DNA含有如SEQ ID NO: 26所示的核苷酸序列。
5.一种基因的检测方法，其特征在于，通过使用如权利要求1-4任一项所述的检测体系进行检测。
6.如权利要求5所述的检测方法，其特征在于，所述待测序列的工作浓度至少为500pM。
7.如权利要求5所述的检测方法，其特征在于，所述待测序列通过扩增获得。
8.如权利要求7所述的检测方法，其特征在于，所述检测体系满足以下条件中的一种或多种：
所述sgRNA的工作浓度为10-100 nM；
所述Cas12f核酸酶的工作浓度为10-100 nM；
所述荧光探针的工作浓度为100-1000 nM。
9.如权利要求8所述的检测方法，其特征在于，所述sgRNA的工作浓度为50nM，和/或，所述Cas12f核酸酶的工作浓度为50 nM，和/或，所述荧光探针的工作浓度为500 nM。
10.如权利要求7-9任一项所述的检测方法，其特征在于，所述扩增为PCR扩增、MDA扩增、LAMP扩增、RPA扩增和RT-RPA扩增中的一种或多种。
11.如权利要求10所述的检测方法，其特征在于，所述RPA扩增的体系包括：T4UvsX重组酶、T4UvsY重组酶、T4gp32单链结合蛋白、Bsu DNA聚合酶、磷酸肌酸激酶、磷酸肌酸、dNTP、ATP以及PEG35K；
和/或，所述RPA扩增的反应温度为37℃-42℃，反应时间为15 min-60 min。
12.如权利要求11所述的检测方法，其特征在于，所述RPA扩增为在37℃下反应30min。
13.如权利要求1-4任一项所述的检测体系在基因检测中的应用。
CN202111494633.9A 2021-12-09 2021-12-09 一种CRISPR/Cas12f的检测体系及其应用 Active CN113897416B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202111494633.9A CN113897416B (zh) 2021-12-09 2021-12-09 一种CRISPR/Cas12f的检测体系及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202111494633.9A CN113897416B (zh) 2021-12-09 2021-12-09 一种CRISPR/Cas12f的检测体系及其应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN113897416A CN113897416A (zh) 2022-01-07
CN113897416B true CN113897416B (zh) 2022-05-20

Family

ID=79025746

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202111494633.9A Active CN113897416B (zh) 2021-12-09 2021-12-09 一种CRISPR/Cas12f的检测体系及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN113897416B (zh)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2023173682A1 (zh) * 2022-03-18 2023-09-21 山东舜丰生物科技有限公司 一种优化的Cas蛋白及其应用
CN117210593B (zh) * 2023-10-25 2024-06-14 四川省畜牧科学研究院 特异性检测多杀性巴氏杆菌和溶血性曼氏杆菌的引物组以及检测方法

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111757889A (zh) * 2018-10-29 2020-10-09 中国农业大学 新型CRISPR/Cas12f酶和系统

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2020247883A2 (en) * 2019-06-07 2020-12-10 Scribe Therapeutics Inc. Deep mutational evolution of biomolecules
CN111996236B (zh) * 2020-05-29 2021-06-29 山东舜丰生物科技有限公司 基于crispr技术进行靶核酸检测的方法
CN112980933B (zh) * 2020-12-30 2023-08-29 南方科技大学 一种基于CRISPR-Cas体系的SNP分型检测方法及其应用
CN112680536A (zh) * 2021-02-02 2021-04-20 海南大学 一种基于crispr-cas12f1检测病原微生物RNA的方法
CN112980924B (zh) * 2021-02-10 2023-07-25 华南师范大学 一种免扩增的dna单分子定量检测方法、试剂盒和缓冲液

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111757889A (zh) * 2018-10-29 2020-10-09 中国农业大学 新型CRISPR/Cas12f酶和系统

Also Published As

Publication number Publication date
CN113897416A (zh) 2022-01-07

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7431453B2 (ja) 耐高温Ｃａｓタンパク質の使用および標的核酸分子の検出方法とキット
CN109055499B (zh) 基于CRISPR-Cas的等温核酸检测方法及试剂盒
CN107849603B (zh) 利用有限核苷酸组成的引物扩增
CN113897416B (zh) 一种CRISPR/Cas12f的检测体系及其应用
US10100351B2 (en) High-throughput sequencing detection method for methylated CpG islands
CN112501254A (zh) 一种Cas蛋白的用途及靶标核酸分子的检测方法和试剂盒
JP7033602B2 (ja) ロングレンジ配列決定のためのバーコードを付けられたｄｎａ
JP2023519782A (ja) 標的化された配列決定の方法
JP2012514461A (ja) 標的核酸の交差プライミング増幅
CN111979303A (zh) 一种核酸检测试剂盒、方法及其应用
CN113502335B (zh) 一种与绵羊生长性状相关的分子标记及其应用
CN111154739B (zh) 一种新型重组酶依赖型扩增方法及试剂盒
JP2012080871A (ja) Ｒｎａの直接検出法
CN101979659A (zh) 一种快速检测绵羊多胎FecB基因的方法
CN112877410B (zh) 一种优化的基于crispr介导的核酸检测系统及其检测方法
CN113913530B (zh) 一种与绵羊体高相关的分子标记及其应用
CN106399553B (zh) 一种基于多重pcr的人线粒体全基因组高通量测序方法
CN107083427B (zh) Dna连接酶介导的dna扩增技术
Chen et al. Multiplex PCR with the blunt hairpin primers for next generation sequencing
CN105793435A (zh) 多重探针
KR101288035B1 (ko) 브루셀라균 종별 감별용 프라이머 세트
CN107557355A (zh) 建构环状模板和检测dna分子的方法
JP2015528281A (ja) 拡大された基質範囲を有する新規のｄｎａポリメラーゼ
CN113151585A (zh) 一种快速检测新型冠状病毒d614g突变的引物组合物及试剂盒
US20240279728A1 (en) Detecting a dinucleotide sequence in a target polynucleotide

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant