KR101288035B1 - 브루셀라균 종별 감별용 프라이머 세트 - Google Patents

브루셀라균 종별 감별용 프라이머 세트 Download PDF

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Abstract

본 발명은 Brucella canis , Brucella ceti , Brucella microti 및 10종의 브루셀라 균을 감별할 수 있는 프라이머 또는 프라이머 세트 및 이를 이용하여 상기 균을 감별하는 방법에 관한 것이다.
본 발명에 따른 프라이머를 이용할 경우, B. canis , B. ceti , B. microti를 유사균으로부터 감별할 수 있을 뿐 아니라, 현재까지 알려진 10종의 브루셀라균을 단일튜브에서 한번에 감별할 수 있어, 질병의 검색 및 진단, 전염경로 분석, 역학적 연구 및 치료 등에 유용하게 활용할 수 있다.

Description

브루셀라균 종별 감별용 프라이머 세트 {Primer set for discrimination of Brucella}
본 발명은 브루셀라균 종별 감별을 위한 프라이머 세트에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 현재까지 알려진 10개의 브루셀라 균간의 종별 염기서열 차이를 바탕으로, 브루셀라균의 종별 감별을 위한 단일튜브 멀티플렉스 PCR 프라이머 세트에 관한 것이다.
브루셀라병은 브루셀라 박테리아에 의하여 발생하는 전염병으로서, 가축뿐만 아니라 사람에게도 감염되는 인수공통전염병으로 소를 비롯한 다양한 숙주동물을 갖고 있으며, 전 세계적으로 발생하고 있는 질병이다. 이 질병은 소에서 잠복기간이 3주 내지 3개월로 오염된 사료, 물 등을 통한 경구감염, 태반을 통한 감염, 유두나 창상부위를 통하여도 감염될 수 있다. 체내에 침입하면 인접 임파절에 이르러 탐식세포 내에서 증식, 생존한다. 임신된 소에서는 임신 후반기에 전구증상 없이 유조산을 일으켜 양축농가에 막대한 경제적 손실을 초래하는 질병으로 사람에게도 감염될 수 있다.
브루셀라 균은 숙주의 특이성 등 생물학적 성상에 따라 B. melitensis (sheep and goats), B. abortus (cattle and other Bovidae), B. canis (dogs), B. ovis (rams), B. suis (pigs, reindeer, hare, wild rodents), B. neotomae (desert wood rats) 등 기존의 6종과 함께 2007년 해양포유동물에서 B. pinnipedialis (common seal), B. ceti (common dolphin) 2종, 2008년 토양유래의 B. microti와 2010년 사람에서 분리된 B. inopinata가 새롭게 추가되어 현재까지 총 10종이 알려져 있다.
브루셀라 균의 분류는 생화적 및 생물학적 특성을 기초로 하여 집락의 형태, oxidase, urease 및 phages에 대한 용해능에 따라 종(species)을 구분하고 더 나아가 CO2 요구, H2S 산생, 색소(thionin, basic fuchsin)에서의 배양, 특이혈청과의 응집 여부에 따라 생물형(biovar)을 구분하고 있어 최종 야외에서 분리된 브루셀라 균에 대하여 생물형까지 동정을 하기 위해서는 많은 시간이 소요되며 각 시험결과를 판독하기 위해서는 전문가의 도움을 필요로 하고 있으며 살아 있는 균을 다루기 때문에 매우 위험하다.
최근 이와 같은 단점을 극복하기 위해서 유전자를 이용한 분자생물학적인 기법으로 브루셀라 균을 좀 더 쉽게 감별하려는 시도가 계속되고 있다. 하지만 브루셀라 균은 DNA homology가 매우 높아 아직까지도 효과적인 감별진단법이 없는 실정이다. 단일 PCR에 의한 동정도 B. abortus, B. melitensis 등 몇 종에만 국한되어 있다. Bricker 등에 의해 90년대 중반에 소개된 AMOS PCR법은 B. abortus 1, 2, 4형, B. melitensis 1, 2, 3a형, B. ovis, B. suis 1형 및 백신 균주 등 일부 브루셀라 균만이 감별이 가능하였으며 2000년대 중후반에 소개된 8쌍의 프라이머를 이용한 Bruce-ladder PCR법은 많은 브루셀라 균을 감별 동정할 수 있으나 B. suis와 B. canis 또는 B. microti와의 감별, 해양포유동물 유래의 2종의 브루셀라균의 감별 등에 문제점을 가지고 있다,
이에, 본 발명자들은 상기의 문제점을 해결하고 브루셀라 균의 종별 감별을 위하여 예의 노력한 결과, B. canis의 감별, B. ceti의 감별, B. microti의 감별과 현재까지 알려진 총 10종의 브루셀라 균에 대하여 단일큐브 내 동시에 감별할 수 있는 PCR 프라이머 세트를 발명하기에 이르렀다.
본 발명의 목적은 Brucella canis 를 감별하기 위한 프라이머 세트 및 이를 이용하여 Brucella canis 를 감별하는 방법을 제공하기 위한 것이다.
또한 본 발명의 목적은 Brucella ceti를 감별하기 위한 프라이머 세트 및 이를 이용하여 Brucella ceti를 감별하는 방법을 제공하기 위한 것이다.
또한 본 발명의 목적은 이용하여 Brucella microti 를 감별하기 위한 프라이머 세트 및 이를 이용하여 Brucella microti 를 감별하는 방법을 제공하고자 함이다.
본 발명의 또 다른 목적은 브루셀라 균을 감별하기 위한 단일튜브-멀티플렉스 PCR 프라이머 세트 및 이를 이용하여 브루셀라 균을 단일튜브-멀티플렉스 PCR로 감별하는 방법을 제공하고자 함에 있다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 서열번호 5에 기재된 Brucella canis 감별용 프라이머 및 이 서열번호 5에 기재된 프라이머를 이용하여 Brucella canis 를 감별하는 방법을 제공한다.
또한 본 발명은 서열번호 6에 기재된 Brucella ceti 감별용 프라이머 및 서열번호 6에 기재된 프라이머를 이용하여 Brucella ceti 를 감별하는 방법을 제공한다.
또한 본 발명은 서열번호 11 및 서열번호 12에 기재된 Brucella microti 감별용 프라이머 세트 및 서열번호 11 및 서열번호 12에 기재된 프라이머 세트를 이용하여 Brucella microti 를 감별하는 방법을 제공한다.
또, 본 발명은 서열번호1 및 서열번호2에 기재된 프라이머 세트;
서열번호3 및 서열번호4에 기재된 프라이머 세트;
서열번호5 및 서열번호6에 기재된 프라이머 세트;
서열번호7 및 서열번호8에 기재된 프라이머 세트;
서열번호9 및 서열번호10에 기재된 프라이머 세트;
서열번호11 및 서열번호12에 기재된 프라이머 세트;
서열번호13 및 서열번호14에 기재된 프라이머 세트;
서열번호15 및 서열번호16에 기재된 프라이머 세트;
서열번호17 및 서열번호18에 기재된 프라이머 세트;
로 구성됨을 특징으로 하는 브루셀라 균을 감별하기 위한 단일튜브-멀티플렉스 PCR 프라이머 세트 및 상기 프라이머 세트를 이용하여 브루셀라 균을 감별하기 위한 단일튜브-멀티플렉스 PCR 방법을 제공한다. 또한, 상기 브루셀라 균은 바람직하게는 Brucella abortus , Brucella canis , Brucella suis , Brucella ovis , Brucella meotomae , Brucella melitensis , Brucella ceti , Brucella pinnipedialis , Brucella microti, Brucella inopinata 로 이루어진 군에서 선택된 것이다.
본 발명에 따른 프라이머를 이용할 경우, B. canis , B. ceti , B. microti를 유사균으로부터 감별할 수 있을 뿐 아니라, 현재까지 알려진 10종의 브루셀라균을 단일튜브에서 한번에 감별할 수 있어, 질병의 검색 및 진단, 전염경로 분석, 역학적 연구 및 치료 등에 유용하게 활용할 수 있다.
도1은 One-step multiplex PCR을 이용하여 10종의 브루셀라 균을 감별한 결과이다. M: 100-bp DNA 마커, 1~7열: B. abortus biovar(bv) 1~6과 9, 8열: B. canis, 9~13열: B. suis bv. 1~5, 14열: B. ovis , 15열: B. neotomae , 16~18열: B. melitensis bv. 1~3, 19열: B. ceti , 20열: B. pinnipedialis , 21열: B. microti , 22열: B. inopinata , 23~24열: B. canis 국내 분리주이다.
도2는 B. canis와 Brucella species 표준균주의 유전자 서열의 비교결과이다. 프라이머 부위는 밑줄로 표시하였다.
도3은 B. ceti와 Brucella species 표준균주의 유전자 서열의 비교결과이다. 프라이머 부위는 밑줄로 표시하였다.
도4는 B. microti 동정을 위한 특이 프라이머 세트 (344 bp)에 대한 Brucella species 표준균주의 유전자 시퀀스 비교결과이다. foward 및 reverse 프라이머 부위는 밑줄로 표시하였다.
이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다.
본 발명은 서열번호 5에 기재된 Brucella canis 감별용 프라이머 및 서열번호 5에 기재된 프라이머를 이용하여 Brucella canis 를 감별하는 방법을 제공한다.
본 발명에 있어서 “프라이머”란 짧은 자유 3말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열로 상보적인 주형(template)과 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 주형 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응을 위한 시약(DNA 중합효소 또는 역전사 효소) 및 상이한 4가지 dNTP(deoxynucleoside triphospate)의 존재하에서 DNA합성을 개시할 수 있다.
프라이머는 DNA 합성의 개시점으로 작용하는 프라이머의 기본 성질을 변화시키지 않는 추가의 특징을 혼입할 수 있다.
본 발명의 프라이머는 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법, 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 핵산 서열은 또한 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 비제한적인 예로는 메틸화, "캡화", 천연 뉴클레오타이드 하나 이상의 동족체로의 치환, 및 뉴클레오타이드 간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연결체(예: 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형이 있다. 핵산은 하나 이상의 부가적인 공유 결합된 잔기, 예를 들면, 단백질(예: 뉴클레아제, 독소, 항체, 시그날 펩타이드, 폴리-L-리신 등), 삽입제(예: 아크리딘, 프소랄렌 등), 킬레이트화제(예: 금속, 방사성 금속, 철, 산화성 금속 등), 및 알킬화제를 함유할 수 있다.
또한, 본 발명의 프라이머 핵산 서열은 필요한 경우, 분광학적, 광화학적, 생화학적, 면역화학적 또는 화학적 수단에 의해 직접적으로 또는 간접적으로 검출 가능한 표지를 포함할 수 있다. 표지의 예로는, 효소 (예를 들어, 호스래디쉬 퍼옥시다제, 알칼린 포스파타아제), 방사성 동위원소(예를 들어, 32P), 형광성 분자, 화학그룹 (예를 들어, 바이오틴) 등이 있다.
본 발명에 있어서 "감별"이란, B. canis를 다른 미생물뿐만 아니라 동종의 브루셀라 균으로부터 분리하여 식별할 수 있는 것을 의미한다.
본 발명에 있어서, 프라이머를 이용하여 미생물을 검출하는 방법은 당업자에게 공지된 다양한 핵산 증폭 방법에 따라 실시할 수 있다. 일 예로 1) 본 발명의 프라이머 또는 프라이머 세트를 포함하는 반응 조성물에 DNA 중합효소를 혼합하는 단계, 2) 상기 1) 단계에서 제조된 혼합물에 검체 DNA를 첨가하는 단계, 3) 상기 2) 단계에서 제조된 검체 DNA를 포함하는 반응액에 대하여 PCR을 수행하는 단계를 포함하는 과정으로 수행할 수 있다.
핵산 서열을 증폭하기 위한 본 발명의 방법은 소망하는 어떠한 브루셀라균의 핵산 분자의 증폭에도 이용될 수 있다. 이러한 핵산 분자는 DNA 이다. 상기 핵산 분자는 이중쇄이다. 출발물질로서 핵산이 이중쇄일 때, 두 쇄를 단일쇄로, 또는 부분적인 단일쇄 형태로 만드는 것이 바람직하다. 쇄를 분리하는 방법은, 열, 알카리, 포름아미드, 우레아 및 글리콕살 처리, 효소적 방법(예, 헬리카아제 작용) 및 결합 단백질을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 예를 들어, 쇄 분리는 80-105℃의 온도로 열처리하여 달성될 수 있다.
본 발명에 이용되는 프라이머는 주형의 한 부위에 혼성화 또는 어닐링되어, 이중쇄 구조를 형성한다.
다양한 DNA 중합효소가 본 발명의 증폭 단계에 이용될 수 있으며, E. coli DNA 중합효소 I의 “클레나우” 단편, 열안정성 DNA 중합효소 및 박테리오파아지 T7 DNA 중합효소를 포함한다. 바람직하게는, 중합효소는 다양한 박테리아 종으로부터 얻을 수 있는 열안정성 DNA 중합효소이고, 이는 Thermus aquaticus (Taq), Thermus thermophilus (Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis, 및 Pyrococcus furiosus (Pfu)를 포함한다. 상기 중합효소 대부분은 박테리아 그 자체로부터 분리될 수 있고 또는 상업적으로 구입할 수 있다. 또한, 본 발명에 이용되는 중합효소는 중합효소를 암호화하는 클로닝 유전자의 높은 레벨을 발현하는 세포로부터 수득할 수 있다.
중합 반응을 실시할 때, 반응 용기에 반응에 필요한 성분들을 과량으로 제공하는 것이 바람직하다. 증폭 반응에 필요한 성분들의 과량은, 증폭반응이 성분의 농도에 실질적으로 제한되지 않는 정도의 양을 의미한다. Mg2 +와 같은 조인자, dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP를 원하는 증폭 정도가 달성될 수 있을 정도로 반응 혼합물에 제공하는 것이 바람직하다.
증폭 반응에 이용되는 모든 효소들은 동일한 반응 조건에서 활성 상태일 수 있다. 사실, 완충액은 모든 효소들이 최적의 반응 조건에 근접하도록 한다. 따라서, 본 발명의 증폭 과정은 반응물의 첨가와 같은 조건의 변화 없이 단일 반응물에서 실시될 수 있다.
본 발명에 있어서 어닐링 또는 혼성화는 타깃 뉴클레오타이드 서열과 프라이머 사이에 특이적 결합을 가능하게 하는 엄격조건 (즉, 분할 구역이 타깃 서열에 수소결합을 할 수 없는 조건) 하에서 실시된다. 어닐링을 위한 엄격조건은 서열-의존적이며 주위 환경적 변수에 따라 다양하다. 바람직하게는, 어닐링 온도는 50℃ 내지 75℃이고 보다 바람직하게는 55℃ 내지 70℃이고, 가장 바람직하게는 65℃ 내지 68℃이다.
본 발명의 방법은 특정 목적을 위한 공지의 다른 과정과 결합될 수 있다. 예를 들어, 증폭 산물의 분리 (또는 정제)는 증폭과정에 후속될 수 있다. 상기 과정은 겔 전기영동, 컬럼 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피 또는 혼성화에 의해 실시될 수 있다. 또한, 본 발명의 증폭 산물은 클로닝용 담체에 삽입될 수 있다.
브루셀라 균은 10종 22개의 생물형으로 분류되고 있으며 현재까지 알려진 전장유전체는 일부 균주에서만 알려져 있다. 특히 종전 기술인 Bruce-ladder PCR에서는 B. canis 분리주가 B. canis 표준균주 (RM6/66)와 같이 794 bp가 증폭되지 않는 분리주와 이 부위가 증폭되는 분리주가 존재하며, 이러한 분리주는 B. suis로 오인될 수 있음이 보고되었다.
이에 따라 B. canis의 명확한 감별이 요구되며, 서열번호 5의 프라이머는 B. canis에서 특이적인 동시에 2가지 유전자형에 모두 존재하는 유전자상의 특징에 대한 프라이머로서, B. canis 표준균주 및 분리주에서 BME2 (B. melitensis의 표준균주 2형 염색체) 0722 유전자부위와 상동하는 부분에서 12 bp의 결손부위에 대한 프라이머이다 (도2).
또한, 본 발명은 서열번호 6에 기재된 Brucella ceti 감별용 프라이머 및 서열번호 6에 기재된 프라이머를 이용하여 Brucella ceti 를 감별하는 방법을 제공한다.
B. ceti는 해양포유동물에서 분리된 브루셀라균으로서 2007년에 B. pinnipedialis와 함께 새롭게 알려졌다. 이러한 B. ceti를 B. pinnipedialis 및 기타의 브루셀라균과의 감별이 요구되며, 서열번호6으로 이루어진 프라이머는 B. ceti B1/94 표준균주의 BME2 0721 유전자부위와 상동하는 부위에서 B. pinnipedialis와 달리 972bp가 결손된 부위에 대한 프라이머이다 (도3).
또한 본 발명은 서열번호 11 및 서열번호 12에 기재된 Brucella microti 감별용 프라이머 세트 및 서열번호 11 및 서열번호 12에 기재된 프라이머 세트를 이용하여 Brucella microti 를 감별하는 방법을 제공한다.
서열번호 11의 포워드 프라이머는 B. microti와 다른 10종의 브루셀라균과 유전적을 차이가 있는 부분을 기초하며, 리버스 프라이머는 B. inopinata와 프라이머 부위는 공유하지만 나머지 브루셀라균과 감별되는 부분에 기초한다 (도4).
또, 본 발명은 서열번호1 및 서열번호2에 기재된 프라이머 세트;
서열번호3 및 서열번호4에 기재된 프라이머 세트;
서열번호5 및 서열번호6에 기재된 프라이머 세트;
서열번호7 및 서열번호8에 기재된 프라이머 세트;
서열번호9 및 서열번호10에 기재된 프라이머 세트;
서열번호11 및 서열번호12에 기재된 프라이머 세트;
서열번호13 및 서열번호14에 기재된 프라이머 세트;
서열번호15 및 서열번호16에 기재된 프라이머 세트;
서열번호17 및 서열번호18에 기재된 프라이머 세트;
로 구성됨을 특징으로 하는 브루셀라균을 감별하기 위한 단일튜브-멀티플렉스 PCR 프라이머 세트 및 상기 프라이머 세트를 이용하여 브루셀라 균을 감별하기 위한 단일튜브-멀티플렉스 PCR 방법을 제공한다. 또한, 상기 브루셀라균은 바람직하게는 Brucella abortus , Brucella canis , Brucella suis , Brucella ovis , Brucella meotomae , Brucella melitensis , Brucella ceti , Brucella pinnipedialis , Brucella microti, Brucella inopinata 로 이루어진 군에서 선택된 것이다.
본 발명에 있어서 “멀티플렉스 PCR”은 PCR의 다른 변형 형태로서, 동일한 반응물에서 둘 이상의 프라이머쌍을 이용하여 하나 이상의 타깃 서열을 동시에 증폭할 수 있다. 그러나, 멀티플렉스 PCR로부터 얻은 결과는, 증폭 과정의 인위적 요소 때문에 종종 복잡하게 나오며, 이러한 오류의 결과는 반응 실패에 의한 위음 결과 그리고 가짜 생성물의 증폭과 같은 위양 결과를 포함한다. 따라서 이러한 오류를 줄이기 위하여 멀티플렉스 PCR 반응 조건을 최적화하는 데 인력과 시간을 많이 소비하지만, 만족할만한 결과를 얻기는 극히 힘들다. 본 발명의 방법은 이러한 종래의 멀티플렉스 PCR의 문제점을 극복하여, 하나의 PCR 반응 세트에서 10 종의 브루셀라균 모두를 동시에 오류 없이 증폭할 수 있다.
본 발명의 프라이머의 서열정보는 도5에 기재되어 있다.
본 발명의 프라이머 세트는 종래의 Bruce-ladder PCR법에서 소개된 8개의 프라이머 세트 중 7개의 프라이머 세트를 포함하며, 여기에 서열번호 5번 과 6번으로 이루어진 프라이머 세트와 서열번호 11번 과 12번으로 이루어진 프라이머 세트를 추가로 포함시켜 10종의 브루셀라 균을 단일튜브에서 동시에 감별 동정할 수 있도록 하였다.
이하, 본 발명을 실시예에 의거하여 보다 구체적으로 설명한다. 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
< 실시예1 > B. canis 감별용 프라이머 제작
B. canis 분리주는 Bruce-ladder PCR에서 B. canis 표준균주 (RM6/6)와 같이 794 bp가 증폭되지 않는 분리주와 이 부위가 증폭되는 분리주가 존재하며 이러한 분리주는 B. suis로 오인될 수 있음이 보고되었다. 이 두 종간의 감별을 위해서는 B suis의 5개 생물형 (biovar)과 B canis의 2가지 유전자형에 있어서 같은 종간에는 공동적으로 존재하며 다른 두 종간에는 특이부위를 찾기 위해서 광범위하게 유전자 분석을 실시하였다. 결론적으로 B. canis 표준균주에서 BME2 0722 유전자부위와 상동하는 부분에서 12 bp의 결손부위를 확인하고 다른 유전자형을 보이는 B. canis 분리주에서도 같은 결손부위가 존재함을 확인할 수 있었다. 이에 반하여 B. suis의 5개 생물형에 대하여 전장 유전체 또는 부분 유전체에서 확인한 결과 12bp가 모두 존재함을 확인함으로서 이 부위가 포함되는 특이 프라이머 (forward)를 적성하여 B. suis와 B. canis 감별을 시도하였다 (도 2).
< 실시예2 > B. ceti 감별용 프라이머 제작
또 한편으로는 두 종의 해양포유동물 유래의 브루셀라 균을 동시에 감별할 수 있는 부위를 선택하기 위해서 B. ceti B1/94 표준균주의 BME2 0721 유전자부위와 상동하는 부위에서 B. pinnipedialis와 달리 972bp가 결손된 부위를 확인하고 이 부위에서 특이 프라이머 (reverse)를 제작하였다. Bruce-ladder PCR에서 문제가 된 프라이머(794 bp)를 대체하기 위하여 새로이 제작되는 특이 프라이머 세트의 증폭산물의 크기를 766 bp로 제작하였다(도3).
새로 제작된 프라이머 세트는 B. suis 5개 생물형, B. ovis , B. neotomae, B. melitensis 3개 생물형, B. pinnipedialis , B. microti에서 증폭됨을 확인하여 유전자분석 결과와도 일치하는 결과를 보였다 (그림 1).
< 실시예3 > B. microti 감별용 프라이머 세트 제작
B. suis와의 감별을 위하여 B. microti을 동정하기 위한 특이 프라이머 제작을 시도하였다. 10종의 Brucella species를 대표하는 표준균주의 전장유전체 또는 일부 유전자 정보에서 23S rRNA 부위중 BME1 r02에 상동하는 유전자를 상호 비교하였다. 포워드 프라이머는 유전자 비교분석 결과 다른 10종의 브루셀라균과 유전자적으로 차이가 있는 부분으로 제작하였으며 리버스 프라이머는 B. inopinata와 프라이머 부위를 공유하지만 나머지 브루셀라 균과는 감별되는 부분으로 프라이머를 제작하여 344bp의 증폭산물을 얻도록 고안되었다 (도 4). 이는 Bruce-ladder PCR에서 다른 증폭산물과 겹치지 않고 명확히 구분될 수 있도록 증폭산물의 크기를 사전에 고려하였다.
이렇게 제작된 B. microti 동정을 위한 프라이머는 다른 9종의 브루셀라 균에서는 전혀 증폭되지 않고 특이적으로 해당 균주에서만 증폭됨을 확인하였다 (도1).
< 실시예4 > 단일튜브 멀티플렉스 PCR 방법
신규 제작한 2쌍의 프라이머와 기존 7쌍의 프라이머를 합하여 9쌍의 프라이머를 동시에 증폭하기 위하여 다양한 PCR 조건으로 증폭을 시도하였다. 최종적으로 어닐링 (annealing) 온도를 60℃ 2분으로 하여 각 9쌍의 프라이머가 동시에 증폭하도록 하였으며 증폭산물 또한 각각의 일정농도를 유지할 수 있도록 조정하여 PCR 조건을 initial denature 95℃ 5분으로 하고 denature 95℃ 30초, annealing 60℃ 2분, extension 72℃ 1분으로 30회 증폭하고 final extension 72℃ 5분으로 하는 PCR 조건을 수립하였다. 또한 시판되는 여러 종류의 멀티플렉스용 PCR 프리믹서를 비교하여 20㎕ 반응용 2× PCR premix kit, G-Taq (Cosmo genetech)가 선택되었으며 9쌍의 프라이머를 모두 효과적으로 증폭됨을 확인함으로서 브루셀라 종별 감별을 위한 단일튜브내 멀티플렉스 PCR법을 개발하였다. 이 결과는 10종의 브루셀라균 및 백신균주를 감별할 수 있는 증폭산물은 아래 표1과 같다.
균종(species) 증폭산물(bp)
B. abortus 1682, 587, 450, 152
B. canis 1682, 1071, 587, 450, 272, 152
B. suis 1682, 1071, 766, 587, 450, 272, 152
B. ovis 1071, 766, 587, 450, 152
B. neotomae 1682, 1071, 766, 587, 450, 272
B. melitensis 1682, 1071, 766, 587, 450, 152
B. ceti 1682, 1320, 1071, 587, 152
B. pinnipedialis 1682, 1320, 1071, 766, 587, 152
B. microti 1682, 1071, 766, 587, 450, 344, 272, 152
B. inopinata 1682, 587, 450, 272, 152
B. abortus S19 1682, 450, 152
B. abortus RB51 2524, 587, 450, 152
B. melitensis Rev1 1682, 1071, 766, 587, 450, 218, 152
또한, 10종의 브루셀라균 및 백신균주를 감별한 결과를 도1로 나타내었다.
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Claims (10)

  1. 삭제
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 서열번호1의 염기서열 및 서열번호2의 염기서열로 이루어진 프라이머쌍;
    서열번호3의 염기서열 및 서열번호4의 염기서열로 이루어진 프라이머쌍;
    서열번호5의 염기서열 및 서열번호6의 염기서열로 이루어진 프라이머쌍;
    서열번호7의 염기서열 및 서열번호8의 염기서열로 이루어진 프라이머쌍;
    서열번호9의 염기서열 및 서열번호10의 염기서열로 이루어진 프라이머쌍;
    서열번호11의 염기서열 및 서열번호12의 염기서열로 이루어진 프라이머쌍;
    서열번호13의 염기서열 및 서열번호14의 염기서열로 이루어진 프라이머쌍;
    서열번호15의 염기서열 및 서열번호16의 염기서열로 이루어진 프라이머쌍; 및
    서열번호17의 염기서열 및 서열번호18의 염기서열로 이루어진 프라이머쌍;으로 구성된, 브루셀라균을 감별하기 위한 단일튜브-멀티플렉스 PCR 프라이머 세트.
  5. 제4항에 있어서, 상기 브루셀라균은 Brucella abortus , Brucella canis, Brucella suis , Brucella ovis , Brucella meotomae , Brucella melitensis , Brucella ceti , Brucella pinnipedialis, Brucella microti , Brucella inopinata 로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 브루셀라 균인 것을 특징으로 하는 프라이머 세트.
  6. 삭제
  7. 삭제
  8. 삭제
  9. 서열번호1의 염기서열 및 서열번호2의 염기서열로 이루어진 프라이머쌍;
    서열번호3의 염기서열 및 서열번호4의 염기서열로 이루어진 프라이머쌍;
    서열번호5의 염기서열 및 서열번호6의 염기서열로 이루어진 프라이머쌍;
    서열번호7의 염기서열 및 서열번호8의 염기서열로 이루어진 프라이머쌍;
    서열번호9의 염기서열 및 서열번호10의 염기서열로 이루어진 프라이머쌍;
    서열번호11의 염기서열 및 서열번호12의 염기서열로 이루어진 프라이머쌍;
    서열번호13의 염기서열 및 서열번호14의 염기서열로 이루어진 프라이머쌍;
    서열번호15의 염기서열 및 서열번호16의 염기서열로 이루어진 프라이머쌍; 및
    서열번호17의 염기서열 및 서열번호18의 염기서열로 이루어진 프라이머쌍;으로 구성된 프라이머 세트를 이용하여 브루셀라 균을 감별하기 위한 단일튜브-멀티플렉스 PCR 방법.
  10. 제9항에 있어서, 상기 브루셀라균은 Brucella abortus, Brucella canis, Brucella suis, Brucella ovis, Brucella meotomae, Brucella melitensis, Brucella ceti, Brucella pinnipedialis, Brucella microti, Brucella inopinata 로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 브루셀라 균인 것을 특징으로 하는단일튜브-멀티플렉스 PCR 방법.

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CN115948588B (zh) * 2023-02-11 2024-04-19 昆明理工大学 布鲁氏菌属四个种的多重荧光定量pcr分种检测试剂

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J. Clin. Microbiol., Vol. 46, No. 10, pp. 3484-3485 (2008.08.20.) *
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