CN105624303B - 牛羊猪犬布鲁氏菌分型荧光pcr检测试剂盒及其制备与应用 - Google Patents

牛羊猪犬布鲁氏菌分型荧光pcr检测试剂盒及其制备与应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物技术检测领域，具体涉及一种牛羊猪犬布鲁氏菌分型荧光PCR检测试剂盒及其制备与应用。本发明所述试剂盒中包括牛布鲁氏菌检测引物及探针、羊布鲁氏菌检测引物及探针、猪布鲁氏菌检测引物及探针、犬布鲁氏菌检测引物及探针，所述试剂盒检测灵敏度高，最低检出限为1×103copy/ml，准确率及阳性率均高达100%。

Description

牛羊猪犬布鲁氏菌分型荧光PCR检测试剂盒及其制备与应用
技术领域
本发明属于生物技术检测领域，具体涉及一种牛羊猪犬布鲁氏菌分型荧光PCR检测试剂盒及其制备与应用。
背景技术
布鲁氏菌是革兰氏阴性，无芽孢兼性细胞内寄生的细菌，是引起人畜共患传染病布病的病原体。家畜感染后能引起母畜流产，公畜睾丸炎，导致患病家畜繁殖能力和生产性能下降，并影响畜产品的质量和安全，可造成严重经济损失；人感染后能引起波浪热、关节炎以及睾丸炎、附睾炎，孕妇可引起流产等，严重者可丧失劳动能力。严重影响我国畜牧业发展和人类健康。
布鲁氏菌的主要宿主为牛羊猪犬等家畜和野生动物，也存在于海洋动物中。通过刀伤、擦伤、口腔粘膜、鼻腔、眼结膜、生殖道，甚至未损伤的皮肤等途径而感染。人的感染几乎都是由于接触感染动物所致，人和人之间的传播罕见(母乳感染婴儿除外)。
布鲁氏菌属目前分为10个种，包括牛种(B.abortus)、羊种(B.melitensis)、猪种(B.suis)、犬种(B.canis)、绵羊附睾种(B.ovis)、沙漠森林野鼠种(B.neotomae)、田鼠种(B.microti)、B.ceti(分离自鲸鱼和海豚)、B.pinnipedialis(分离自鳍足类)、和B.inopinata(分离自病人)。
每年由于牛羊流产给养殖业造成了巨大的经济损失，猪和犬感染也比较常见，这些动物与人类关系密切，容易导致人换布鲁氏病。
目前用于布鲁氏菌分型的方法很多，有限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)、Rep-PCR和ERIC-PCR、rpoB基因多态性、多位点测序分型(MLST)及测序法等。但没有统一的标准，很多方法都存在实验过程比较繁琐、耗时，且多数方法都有一部分非典型株用现有方法无法分型。严重影响了布病的流行病学调查和疫病预防。
基于荧光定量PCR法联合检测布鲁氏菌羊种、猪种、犬种和牛种布鲁氏菌试剂盒能够快速诊断出哪种布鲁氏菌感染，更简便快捷准确地对布鲁氏菌属进行分型。有利于分子流行病学调查、病原菌的溯源及分析菌株间的差异关系。
发明内容
针对现有技术中所存在的问题，本发明的目的在于提供一种牛羊猪犬布鲁氏菌分型荧光PCR检测试剂盒及其制备与应用。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明的第一方面，提供一种牛羊猪犬布鲁氏菌分型荧光PCR检测试剂盒，所述试剂盒中包括牛布鲁氏菌检测引物及探针、羊布鲁氏菌检测引物及探针、猪布鲁氏菌检测引物及探针、犬布鲁氏菌检测引物及探针，所述牛布鲁氏菌检测引物包括核苷酸序列如SEQID NO.1所示的上游引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的下游引物，牛布鲁氏菌检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述羊布鲁氏菌检测引物包括核苷酸序列如SEQ IDNO.4所示的上游引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示的下游引物，所述羊布鲁氏菌检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，所述猪布鲁氏菌检测引物包括核苷酸序列如SEQID NO.7所示的上游引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示的下游引物，所述猪布鲁氏菌检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示，所述犬布鲁氏菌检测引物包括核苷酸序列如SEQID NO.10所示的上游引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示的下游引物，所述犬布鲁氏菌检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示，所述牛布鲁氏菌检测探针、羊布鲁氏菌检测探针、猪布鲁氏菌检测探针、犬布鲁氏菌检测探针标记有荧光报告基团和荧光淬灭基团。
优选地，所述牛布鲁氏菌检测探针、羊布鲁氏菌检测探针、猪布鲁氏菌检测探针、犬布鲁氏菌检测探针的5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团。
进一步优选地，所述牛布鲁氏菌检测探针5’端标记的荧光报告基团为FAM荧光基团，3’端标记的荧光淬灭基团为BHQ-1。
进一步优选地，所述羊布鲁氏菌检测探针5’端标记的荧光报告基团为HEX荧光基团，3’端标记的荧光淬灭基团为BHQ-1。
进一步优选地，所述猪布鲁氏菌检测探针5’端标记的荧光报告基团为Cal Red610荧光基团，3’端标记的荧光淬灭基团为BHQ-2。
进一步优选地，所述犬布鲁氏菌检测探针5’端标记的荧光报告基团为CY5荧光基团，3’端标记的荧光淬灭基团为BHQ-3。
本发明的试剂盒采用多重荧光PCR技术在单管中同时进行牛羊猪犬布鲁氏菌的检测，根据扩增及检测情况可分析判断布鲁氏菌感染情况、并对所感染布鲁氏菌进行准确分型。因此，引物及探针的设计是本发明试剂盒的关键。
基于本发明所述试剂盒是采用多重荧光PCR技术来进行检测的，所以试剂盒中还可以包括其他一些PCR所需要的常规试剂，如：dNTP、MgCl2、PCR缓冲液、Taq DNA聚合酶、尿嘧啶-N-糖基化酶(UNG)、PCR缓冲液、无菌水(ddH2O)的一种或多种。由于此类PCR常用试剂均可经市场途径单独购得或者自行配置，因此具体需要将哪些试剂装配入试剂盒，可以根据客户实际需要配置，为方便起见，也可全部装配入试剂盒。
所述PCR反应体系中，引物、探针、dNTP、MgCl2、PCR缓冲液、Taq DNA聚合酶、尿嘧啶-N-糖基化酶(UNG)、PCR缓冲液、无菌水(ddH2O)均为常见组分，其含量亦为常规。
所述PCR反应体系可自行配置，也可直接以市售的不含引物及探针的通用PCR反应液加入引物及探针获得。例如，所述试剂盒中还可以dNTP、MgCl2、PCR缓冲液、Taq DNA聚合酶、尿嘧啶-N-糖基化酶(UNG)、无菌水(ddH2O)，加入本发明的引物及探针、待检样本即可获得PCR反应体系。
所述试剂盒中还可含有阳性对照。所述阳性对照为含有牛布鲁氏菌阳性对照质粒、羊布鲁氏菌阳性对照质粒、猪布鲁氏菌阳性对照质粒、犬布鲁氏菌阳性对照质粒的溶液。可单独市购或根据现有技术自行构建。
所述试剂盒中还可含有阴性对照。阴性对照可为各种不含有牛羊猪犬布鲁氏菌的溶液，如PCR反应缓冲液、无菌水(ddH2O)、生理盐水等。
本发明的第四方面，提供了前述牛羊猪犬布鲁氏菌分型荧光PCR检测试剂盒的使用方法，包括如下步骤：
(1)提取样品基因组DNA；
(2)加样：将样品基因组DNA、阳性对照或阴性对照分别加入装有PCR反应体系的PCR管中，获得对应的样品反应管、阳性反应管或阴性反应管，所述PCR反应体系中含有前述牛羊猪犬布鲁氏菌分型荧光PCR检测引物及探针；
(3)PCR反应：反应管置于PCR仪上，设置循环参数，进行PCR反应；
(4)PCR反应结束后，分析结果。
步骤(1)中，提取样品基因组DNA为现有技术。
优选地，步骤(3)中，PCR反应的条件设置为：37℃×2min；94℃×2min；再按93℃×15sec→60℃×60sec，循环40次。
本发明的第三方面，提供了前述试剂盒在制备牛羊猪犬布鲁氏菌分型检测产品中的用途。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明采用多重荧光PCR检测试剂盒，设计了牛布鲁氏菌检测引物及探针、羊布鲁氏菌检测引物及探针、猪布鲁氏菌检测引物及探针、犬布鲁氏菌检测引物及探针，在单个PCR反应管中同时检测4种类型的布鲁氏菌，能够在检测布鲁氏菌是否存在的同时对其进行准确的分型，缩短了实验周期，提高了检测效率，为及时检测并诊断布鲁氏菌的类型提供了有力工具。
本发明所采用的荧光PCR检测试剂盒灵敏度高，最低检出限为1×103copy/ml，准确率及阳性率均高达100％；所用引物和探针均基于GenBank公共数据库中序列设计，特异性好；操作简便，无需对PCR产物进行额外处理。PCR扩增和荧光检测在同一反应管中进行，全程处于封闭状态，大大降低了样本间交叉污染和环境污染的风险。可直接对各种类型的样品进行检测，无需富集培养。
附图说明
图1A：待检布鲁氏菌分型阳性对照品(S1～S4，从左自右分别为S1、S2、S3、S4)在FAM荧光通道下的扩增曲线。
图1B：待检布鲁氏菌分型阳性对照品(S1～S4，从左自右分别为S1、S2、S3、S4)在HEX荧光通道下的扩增曲线。
图1C：待检布鲁氏菌分型阳性对照品(S1～S4，从左自右分别为S1、S2、S3、S4)在Cal Red 610荧光通道下的扩增曲线。
图1D：待检布鲁氏菌分型阳性对照品(S1～S4，从左自右分别为S1、S2、S3、S4)在CY5荧光通道下的扩增曲线。
图2A：SA阳参以及待检样本SA-1、SA-2、SA-3、SA-4(从左自右分别为SA阳参以及待检样本SA-1、SA-2、SA-3、SA-4)在FAM荧光通道下的扩增曲线。
图2B：SM阳参以及待检样本SM-1、SM-2、SM-3、SM-4(从左自右分别为SM阳参以及待检样本SM-1、SM-2、SM-3、SM-4)在HEX荧光通道下的扩增曲线。
图2C：SS阳参以及待检样本SS-1、SS-2、SS-3、SS-4(从左自右分别为SS阳参以及待检样本SS-1、SS-2、SS-3、SS-4)在Cal Red 610荧光通道下的扩增曲线。
图2D：SC阳参以及待检样本SC-1、SC-2、SC-3、SC-4(从左自右分别为SC阳参以及待检样本SC-1、SC-2、SC-3、SC-4)在CY5荧光通道下的扩增曲线。
图3A：采用FAM通道检测SA阳参、以及待检样本SM-1、SM-2、SM-3、SM-4、SS-1、SS-2、SS-3、SS-4、SC-1、SC-2、SC-3、SC-4，结果，只能检测到SA阳参，而待检样本SM-1、SM-2、SM-3、SM-4、SS-1、SS-2、SS-3、SS-4、SC-1、SC-2、SC-3、SC-4均显示阴性。
图3B：采用HEX通道检测SM阳参、待检样本SA-1、SA-2、SA-3、SA-4、SS-1、SS-2、SS-3、SS-4、SC-1、SC-2、SC-3、SC-4，结果，只能检测到SM阳参，而待检样本SA-1、SA-2、SA-3、SA-4、SS-1、SS-2、SS-3、SS-4、SC-1、SC-2、SC-3、SC-4均显示阴性。
图3C：采用Cal Red 610通道检测SS阳参以及待检样本SA-1、SA-2、SA-3、SA-4、SM-1、SM-2、SM-3、SM-4，结果，只能检测到SS阳参，而待检样本SA-1、SA-2、SA-3、SA-4、SM-1、SM-2、SM-3、SM-4均显示阴性。
图3D：采用CY5通道检测SC阳参以及待检样本SA-1、SA-2、SA-3、SA-4、SM-1、SM-2、SM-3、SM-4、SS-1、SS-2、SS-3、SS-4，结果，只能检测到SC阳参，而待检样本SA-1、SA-2、SA-3、SA-4、SM-1、SM-2、SM-3、SM-4、SS-1、SS-2、SS-3、SS-4均显示阴性。
具体实施方式
在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。
当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。
实施例1 试剂盒的制备及使用方法
分别设计并合成牛布鲁氏菌检测引物及探针、羊布鲁氏菌检测引物及探针、猪布鲁氏菌检测引物及探针、犬布鲁氏菌检测引物及探针，其核苷酸序列如下表1所示：
表1
上述各组引物对及探针可单独包装，也可以组合配成多重荧光PCR检测混合液。所述多重荧光PCR检测混合液中，所含上述各引物及探针的量采用本领域技术人员所知悉的常规用量即可。
也就是说，本发明的试剂盒，可以是含有上述独立包装的各组引物对及探针，也可以是含有配置好的含有各组引物对及探针的多重荧光PCR检测混合液。
进一步地，所述试剂盒还可以含有Taq DNA聚合酶、尿嘧啶-N-糖基化酶、无菌水(ddH2O)等等。
采用本发明的试剂盒进行牛羊猪犬布鲁氏菌检测时，质量控制：阴性对照品检测结果应为四个通道检测结果显示Undetermined(ABI7500)或N/A(CFX96)或No Ct(SLAN)；阳性对照品检测结果应为：FAM通道和VIC通道Ct值均≤38。否则实验视为无效。试验结果的判断标准如下：
若待检样本Ct值在38～40之间，需重复测定，如重复测定得到的Ct值仍在38～40之间，则判为低于检测限，报告为阴性。
实施例2 试剂盒的灵敏度分析
1.实验方法
1.1多重荧光PCR检测混合液的配制：
按照本领域的常规用量，配置含有实施例1中四组引物对及探针、dNTP、ddH2O、Mg2+、2xPCR buffer的多重荧光PCR检测混合液，共36μl。
1.2待检布鲁氏菌分型阳性对照品的准备：
牛布鲁氏菌阳性对照质粒的构建方法：将牛布鲁氏菌的扩增子序列化学合成后构建到载体pGH上。克隆位点为SmaI。所插入的牛布鲁氏菌的扩增子序列长度为171bp，核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示，具体为：
GCAACAATTCACGTCATGATGGCCAATACGGCGATTTCAGCGATGATCGTGATGTCGCTGATGGCGGCGTAAGCACCGGCAAGATCGCCTACACCTTCACCGGCGGAAACGGCTTCTCGGCTGTGATCGCTCTCGAACAGGGTGGCGAAGACGTTGACAACGATTACACGA。
经测序鉴定，序列正确无误。所获得重组质粒作为牛布鲁氏菌阳性对照质粒。
羊布鲁氏菌阳性对照质粒的构建方法：将羊布鲁氏菌的扩增子序列化学合成后构建到载体pGH上。克隆位点为SmaI。所插入的羊布鲁氏菌的扩增子序列长度为110bp，核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示，具体为：
GATGCGAGAAAACATTGACCGCATTCATGGGCTTCGTCCATCTCGCATGCGCTATGATCTGGTTACGTTGAATGCAGACACGCCCTAGGGGTGAATCTGGAAATTGTCAG。
经测序鉴定，序列正确无误。所获得重组质粒作为羊布鲁氏菌阳性对照质粒。
猪布鲁氏菌阳性对照质粒的构建方法：将猪布鲁氏菌的扩增子序列化学合成后构建到载体pGH上。克隆位点为SmaI。所插入的猪布鲁氏菌的扩增子序列长度为150bp，核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示，具体为：
CTGGCTACTTCTACATTCCGGGCACCGAAACCTGCCTGCGCGTCCATGGTTACGTCCGTTACGACGTAAAGGGCGGCGACGACGTTTATACCGGCTCGGATCGTAAAGGCTGGGACAAGGGCGCTCGTTTCGCACTCATGTTCAACACGA。
经测序鉴定，序列正确无误。所获得重组质粒作为猪布鲁氏菌阳性对照质粒。
犬布鲁氏菌阳性对照质粒的构建方法：将犬布鲁氏菌的扩增子序列化学合成后构建到载pGH上。克隆位点为SmaI。所插入的犬布鲁氏菌的扩增子序列长度为72bp，核苷酸序列如SEQ ID NO.16所示，具体为：
CTGGCCGAAAACATGATCCAGCGCCAGCAAGGCCACCACGCAGGCGATCAGGATTGTATTTAAAAGCGCCAC。
经测序鉴定，序列正确无误。所获得重组质粒作为犬布鲁氏菌阳性对照质粒。
分别取浓度均为4x10^7copies/ml的上述已经构建好的牛、羊、猪、犬布鲁氏菌阳性对照质粒等体积混匀，获得浓度为1X10^7copies/ml的布鲁氏菌分型阳性对照品。按照1:10、1:100、1:1000、1:10000的比例进行稀释，分别获得待检布鲁氏菌分型阳性对照品S1(浓度为1x10^6copies/ml)、待检布鲁氏菌分型阳性对照品S2(浓度为1x10^5copies/ml)、待检布鲁氏菌分型阳性对照品S3(浓度为1x10^4copies/ml)、待检布鲁氏菌分型阳性对照品S4(浓度为1x10^3copies/ml)。亦即，获得S1～S4共四份待检布鲁氏菌分型阳性对照品。
1.3加样：
取n×36μl多重荧光PCR检测混合液与n×0.4μl酶【Taq DNA聚合酶(5U/μl)0.27ul以及尿嘧啶-N-糖基化酶(UNG，5U/μl)0.13ul】，振荡混匀数秒，3000rpm，离心数秒(n为反应管数)，得混合液。每支PCR管中取上述混合液36μl，然后向每支PCR管中再分别加入不同浓度的待检布鲁氏菌分型阳性对照品(S1～S4)各4μl，盖好PCR管盖，立即进行PCR扩增反应。
1.4PCR扩增：
反应管置于定量荧光PCR仪上，推荐循环参数设置：37℃×2min；94℃×2min；再按93℃×15sec→60℃×60sec，循环40次；单点荧光检测在60℃。反应体系为40μl。
1.5荧光通道的选择：
荧光通道检测选择：选用FAM、HEX(或VIC/JOE)、Cal Red 610和CY5通道。
2.检测结果
待检布鲁氏菌分型阳性对照品(S1～S4)在各个荧光通道下的扩增曲线如图1A～图1D所示。检测Ct值结果见下表2所示。
表2 试剂盒灵敏度检测结果
表2结果表明：S1～S4在FAM、HEX、Cal Red 610、CY5四个通道检测均为阳性，表明本发明试剂盒检测牛羊猪犬布鲁氏菌的检测灵敏度能够达到1×10^3copies/ml。
实施例3 试剂盒的应用
1、实验方法
1.1实验对象
采用本发明试剂盒以下样本进行荧光检测：牛种布鲁氏菌全血白细胞样本2例(编号为SA-1、SA-2)、人全血白细胞样本1例(编号为SA-3)及牛乳1例(编号为SA-4)；羊布鲁氏菌全血白细胞样本2例(编号为SM-1、SM-2)、人全血白细胞样本2例(编号为SM-3、SM-4)；猪布鲁氏菌全血白细胞样本3例(编号为SS-1，SS-2，SS-3)，阴道分泌物1例(编号为SS-4)；犬布鲁氏菌全血白细胞样本3例(编号为SC-1、SC-2、SC-3)，阴道分泌物1例(编号为SC-4)，并设置阳性对照(SA阳参为实施例2中制备的浓度为4x10^7copies/m的牛布鲁氏菌阳性对照质粒、SM阳参为实施例2中制备的浓度为4x10^7copies/m的羊布鲁氏菌阳性对照质粒、SS阳参为实施例2中制备的浓度为4x10^7copies/m的猪布鲁氏菌阳性对照质粒、SC阳参为实施例2中制备的浓度为4x10^7copies/m的犬布鲁氏菌阳性对照质粒)、阴性对照(无菌ddH2O)，验证本发明试剂盒多重荧光定量PCR反应的特异性。以上样本均选自测序验证为阳性的样本。
1.2实验对象处理
血样处理：取抗凝血1ml，与生理盐水1:1混匀后，小心加入2ml的细胞分离液的页面上2000rpm离心15min，收集界面上的细胞(中间呈白色层)，置于1.5ml eppendorf管中，2000rpm离心10min，弃上清液。沉淀中加入50ul核酸提取液，振荡10s，99℃干浴或水浴10min，13000rpm离心10min，保留上清备用。
奶样处理：取奶3ml，13000rpm离心2min；弃上清，沉淀中直接加入100ul DNA提取液充分混匀，沸水浴10min。13000rpm离心5min，取上清4ul做PCR反应。
1.3多重荧光PCR检测混合液配制与加样
本实施例中所用多重荧光PCR检测混合液与实施例2中1.1的多重荧光PCR检测混合液相同。
取n×36μl多重荧光PCR检测混合液与n×0.4μl酶【Taq DNA聚合酶(5U/μl)0.27ul以及尿嘧啶-N-糖基化酶(UNG，5U/μl)0.13ul】，振荡混匀数秒，3000rpm，离心数秒(n为反应管数)，得混合液。每支PCR管中取上述混合液36μl，然后向每支PCR管中再分别加入本实施例上述已经制备好的待检样本、阳性对照品、阴性对照品各4μl，盖好PCR管盖，立即进行PCR扩增反应。
1.4PCR扩增
反应管置于定量荧光PCR仪上，推荐循环参数设置：37℃×2min；94℃×2min；再按93℃×15sec→60℃×60sec，循环40次；单点荧光检测在60℃。反应体系为40μl。荧光通道检测选择：选用FAM、HEX、Cal Red 610、CY5通道。
2.检测结果
阳性对照以及待检样本在各个荧光通道下的扩增曲线如图2A～2D所示。检测Ct值结果见下表3所示。
表3 试剂盒特异性检测结果
由实验结果可知，样本SA-1至SA-4中均含有牛布鲁氏菌，样本SM-1至SM-4中均含有羊布鲁氏菌，样本SS-1至SS-4中均含有猪布鲁氏菌，样本SC-1至SC-4中均含有犬布鲁氏菌。实验结果反应出本试剂盒样本检测灵敏度高，特异性好，样本之间无交叉反应。
此外，对试剂盒进行交叉实验。
如图3A所示，采用FAM通道检测SA阳参、以及待检样本SM-1、SM-2、SM-3、SM-4、SS-1、SS-2、SS-3、SS-4、SC-1、SC-2、SC-3、SC-4，结果，只能检测到SA阳参，而待检样本SM-1、SM-2、SM-3、SM-4、SS-1、SS-2、SS-3、SS-4、SC-1、SC-2、SC-3、SC-4均显示阴性。
如图3B所示，采用HEX通道检测SM阳参、待检样本SA-1、SA-2、SA-3、SA-4、SS-1、SS-2、SS-3、SS-4、SC-1、SC-2、SC-3、SC-4，结果，只能检测到SM阳参，而待检样本SA-1、SA-2、SA-3、SA-4、SS-1、SS-2、SS-3、SS-4、SC-1、SC-2、SC-3、SC-4均显示阴性。
如图3C所示，采用Cal Red 610通道检测SS阳参以及待检样本SA-1、SA-2、SA-3、SA-4、SM-1、SM-2、SM-3、SM-4，结果，只能检测到SS阳参，而待检样本SA-1、SA-2、SA-3、SA-4、SM-1、SM-2、SM-3、SM-4均显示阴性。
如图3D所示，采用CY5通道检测SC阳参以及待检样本SA-1、SA-2、SA-3、SA-4、SM-1、SM-2、SM-3、SM-4、SS-1、SS-2、SS-3、SS-4，结果，只能检测到SC阳参，而待检样本SA-1、SA-2、SA-3、SA-4、SM-1、SM-2、SM-3、SM-4、SS-1、SS-2、SS-3、SS-4均显示阴性。
以上结果充分说明，本实验阴性对照正常，说明实验操作无误，没有污染。以上实验数据真实可信。故试剂盒特异性良好,各布鲁氏菌分型检测无交叉情况。
上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。

Claims (8)

1.一种牛羊猪犬布鲁氏菌分型荧光PCR检测试剂盒，所述试剂盒中包括牛布鲁氏菌检测引物及探针、羊布鲁氏菌检测引物及探针、猪布鲁氏菌检测引物及探针、犬布鲁氏菌检测引物及探针，所述牛布鲁氏菌检测引物由核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的上游引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的下游引物组成，牛布鲁氏菌检测探针的核苷酸序列如SEQID NO.3所示，所述羊布鲁氏菌检测引物由核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示的上游引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示的下游引物组成，所述羊布鲁氏菌检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，所述猪布鲁氏菌检测引物由核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示的上游引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示的下游引物组成，所述猪布鲁氏菌检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示，所述犬布鲁氏菌检测引物由核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示的上游引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示的下游引物组成，所述犬布鲁氏菌检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示，所述牛布鲁氏菌检测探针、羊布鲁氏菌检测探针、猪布鲁氏菌检测探针和犬布鲁氏菌检测探针的5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团。
2.根据权利要求1所述的牛羊猪犬布鲁氏菌分型荧光PCR检测试剂盒，其特征在于，所述牛布鲁氏菌检测探针5’端标记的荧光报告基团为FAM荧光基团，3’端标记的荧光淬灭基团为BHQ-1。
3.根据权利要求1所述的牛羊猪犬布鲁氏菌分型荧光PCR检测试剂盒，其特征在于，所述羊布鲁氏菌检测探针5’端标记的荧光报告基团为HEX荧光基团，3’端标记的荧光淬灭基团为BHQ-1。
4.根据权利要求1所述的牛羊猪犬布鲁氏菌分型荧光PCR检测试剂盒，其特征在于，所述猪布鲁氏菌检测探针5’端标记的荧光报告基团为Cal Red 610荧光基团，3’端标记的荧光淬灭基团为BHQ-2。
5.根据权利要求1所述的牛羊猪犬布鲁氏菌分型荧光PCR检测试剂盒，其特征在于，所述犬布鲁氏菌检测探针5’端标记的荧光报告基团为CY5荧光基团，3’端标记的荧光淬灭基团为BHQ-3。
6.根据权利要求1所述的牛羊猪犬布鲁氏菌分型荧光PCR检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括dNTP、MgCl2、PCR缓冲液、Taq DNA聚合酶、尿嘧啶-N-糖基化酶、和无菌水。
7.根据权利要求1所述的牛羊猪犬布鲁氏菌分型荧光PCR检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括阳性对照或阴性对照中的一种或多种。
8.如权利要求1～7任一所述的牛羊猪犬布鲁氏菌分型荧光PCR检测试剂盒在制备布鲁氏菌分型检测产品中的用途。
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