CN107557457A - 一种用于检测gbs的数字pcr检测试剂盒及检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于检测GBS的数字PCR检测试剂盒及检测方法，试剂盒包括DNA提取液、GBS阳性质控、GBS阴性质控、内标溶液，数字PCR反应缓冲液及检测GBS的特异性引物探针、内标的引物探针；检测方法包括以下步骤：①受检样品处理；②质控品的处理；③配制数字PCR反应混合液；④制作油包水PCR微反应液滴；然后对所述微反应液滴进行PCR扩增反应；⑤将PCR反应板放入荧光读取仪器中读数分析。本发明检测过程无需依靠标准曲线来测定核酸量，而是直接采用数字PCR检测系统通过微滴化处理，使得稀有检测片段从大量的复杂背景中分离出来，直接数出DNA分子的个数，大大简化操作步骤，使该方法结果判读直观可靠，具有可以稳定实施、精确度高、灵敏度高的特点。
Description
技术领域
本发明属于分子诊断生物学技术领域，特别涉及一种用于检测GBS的数字PCR检测试剂盒及检测方法。
背景技术
GBS(groupBstreptococcus,GBS)正常寄居于阴道和直肠，它是一种条件致病菌，一般正常健康人群感染GBS并不致病。如果新生儿带了这种菌，大约有1%～3%会出现早期侵入性感染，其中有5%会导致死亡。早在20世纪70年代GBS就已经被证实为围产期母婴感染的重要致病菌之一。GBS，可在分娩时垂直传播给新生儿，可引起新生儿败血症、肺炎、脑膜炎，甚至死亡。在感染后存活的新生儿，还有可能有严重的神经系统后遗症，包括脑积水、智力障碍、小头畸形、耳聋等。
目前国内GBS对35-37周的孕妇和新生儿的筛查，主要是通过细菌培养法、免疫学诊断法、实时荧光PCR法。细菌培养法，采用标准细菌培养方法来检测GBS的存在，取样后大约需要18-48小时得到检测结果，比较费时；免疫学诊断方法，血清学方法不能高通量处理样本。由于窗口期的存在，血清学的诊断存在滞后性，不能准确反映当前是否感染；荧光PCR法检测法比较方便，但其定量需要参考标品、标准曲线和内标校正荧光对有限的标本材料以及低拷贝数的样本准确性存在一定的限制。
因此急需一种更加准确的对GBS进行筛查的试剂。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于检测GBS的数字PCR检测试剂盒及检测方法，以解决无法快速、准确的对新生儿进行B族链球菌筛查的问题。
为实现上述目的，本发明所采取的技术方案是：一种用于检测GBS的数字PCR检测试剂盒，包含数字PCR反应缓冲液、检测GBS的特异性引物对和探针及内标的引物对和探针，所述数字PCR反应缓冲液包括Tris-HCL、KAC、DTT、MgCl2、硫酸铵、dNTP、PEG35K、UDG酶、Taq酶、上游引物F、下游引物R、探针P；所述检测GBS的特异性引物对和探针的序列如SEQ IDNO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3所示；所述内标的引物对和探针的序列如SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6所示。
进一步的，所述数字PCR反应缓冲液中的上游引物F包括检测GBS的上游引物和内标的上游引物。
进一步的，所述数字PCR反应缓冲液中的下游引物R包括检测GBS的下游引物和内标的下游引物。
进一步的，所述数字PCR反应缓冲液中的探针P包括检测GBS的探针和内标的探针。
进一步的，所述检测GBS的探针及内标探针5’端连接有荧光报告基团，所述检测GBS的探针及内标探针3’端连接有淬灭基团，所述荧光报告基团可选自FAM、CY5、HEX、VIC中任一种，所述淬灭基团均为BHQ。
进一步的，所述检测GBS的探针5’端连接FAM荧光报告基团，所述内标探针5’端连接VIC荧光报告基团。
进一步的，该试剂盒还包括DNA提取液、GBS阳性质控、GBS阴性质控、内标溶液。
进一步的，所述数字PCR反应缓冲液的组分包括：
组分 浓度（摩尔浓度/酶浓度/质量浓度）
Tris-HCL 100mmol/L~200mmol/L
KAC 20m mol/L~30mmol/L
DTT 2m mol/L~3mmol/L
MgCl2 5mmol/L~8mmol/L
硫酸铵 1m mol/L~5mmol/L
dNTP 100m mol/L~200mmol/L
PEG35K 2%~5%
UDG酶 1U/UL~2U/uL
Taq 酶 1U/UL~2U/uL
上游引物F 20Pmo1/uL~25Pmol/uL
下游引物R 20Pmo1'uL~25Pmol/uL
探针P 10Pmol uL~15Pmol/uL。
进一步的，所述Tris-HCL的pH为6.0~9.0。
进一步的，所述Tris-HCL的pH为8.0。
一种用于检测GBS的数字PCR检测试剂盒的检测方法，包括以下步骤：
①受检样品处理：取新生儿口腔黏液或孕妇阴道分泌物将作为待检测样品，将待测样品用无菌生理盐水洗涤并离心弃去上清液后，加入灭菌水震荡混匀，向震荡混匀后的溶液中加入所述试剂盒中的DNA提取液和内标溶液，剧烈震荡混匀，并于100℃恒温处理5分钟，再于12,000rpm离心5~10分钟，取上清液，作为PCR扩增样品DNA模板。
②质控品的处理：取所述试剂盒中的GBS阳性质控和阴性质控品，按照与步骤①相同的方法处理，得到GBS阳性质控和阴性质控的DNA模板；
③配制数字PCR反应混合液：向步骤①处理后得到的样品DNA模板、步骤②处理后得到的GBS阳性质控DNA模板、阴性质控DNA模板中分别加入灭菌水和所述试剂盒中的数字PCR反应缓冲液，分别配制得到样品、GBS阳性质控品、GBS阴性质控品的数字PCR反应混合液；
④制作油包水PCR微反应液滴：将步骤③制备的样品、GBS阳性质控、GBS阴性质控的数字PCR反应混合液分别制作为油包水PCR微反应液滴；然后对所述微反应液滴进行PCR扩增反应；
⑤将PCR反应板放入荧光读取仪器中读数分析。
进一步的，所述检测GBS的特异性引物对和探针以及内标的引物对和探针序列如下：
序号 序列（5’→3’）
SEQ ID NO:1 AACCGTCACCTTATTCTAGCA
SEQ ID NO:2 GTACTATTGCAGTGGCTAGCT
SEQ ID NO:3 CGAAGCCCAGCAAATGGA
SEQ ID NO:4 TACAGGATGCAGAAGGAGA
SEQ ID NO:5 GTGGAAGGTGGACAGTGAG
SEQ ID NO:6 TGGATCACATGTGGATTACTGGA
相比现有技术，本发明的有益效果在于：
①本发明用于检测GBS的数字PCR检测试剂盒及检测方法，检测过程不依赖于扩增曲线的阈值（CT）进行定量，不受扩增效率的影响，无需依靠标准曲线来测定核酸量，而是直接采用数字PCR检测系统通过微滴化处理，使得稀有检测片段从大量的复杂背景中分离出来，直接数出DNA分子的个数，大大简化操作步骤，使该方法结果判读直观可靠，具有可以稳定实施的特点，检测灵敏度及精确性都达到精准定量的要求，大大提高了检测的灵敏度和精确性。
②本发明可以检测GBS含量极低的样品检，通过微滴化处理可以大大减少背景和基质的干扰，灵敏度可以低至1个拷贝，解决了实时荧光定量PCR技术无法精确检测低浓度样本的不足之处。
附图说明
图1为阳性质控品分析结果图；
图2为阴性质控品分析结果图；
图3为临床阳性样本分析结果图；
图4为临床阴性样本分析结果图；
图5为拷贝数为1的样本分析结果；
图6为拷贝数为10的样本分析结果；
图7为拷贝数为100的样本分析结果。
具体实施方式
本发明提供了一种用于检测GBS的数字PCR检测试剂盒及检测方法。
一种用于检测GBS的数字PCR检测试剂盒，包含数字PCR反应缓冲液、检测GBS的特异性引物对和探针及内标的引物对和探针，所述数字PCR反应缓冲液包括Tris-HCL、KAC、DTT、MgCl2、硫酸铵、dNTP、PEG35K、UDG酶、Taq酶、上游引物F、下游引物R、探针P；所述检测GBS的特异性引物对和探针的序列如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3所示；所述内标的引物对和探针的序列如SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6所示。
一种用于检测GBS的数字PCR检测试剂盒的检测方法，包括以下步骤：
①受检样品处理：取新生儿口腔黏液或孕妇阴道分泌物将作为待检测样品，将待测样品用无菌生理盐水洗涤并离心弃去上清液后，加入灭菌水震荡混匀，向震荡混匀后的溶液中加入所述试剂盒中的DNA提取液和内标溶液，剧烈震荡混匀，并于100℃恒温处理5分钟，再于12,000rpm离心5~10分钟，取上清液，作为PCR扩增样品DNA模板。
②质控品的处理：取所述试剂盒中的GBS阳性质控和阴性质控品，按照与步骤①相同的方法处理，得到GBS阳性质控和阴性质控的DNA模板；
③配制数字PCR反应混合液：向步骤①处理后得到的样品DNA模板、步骤②处理后得到的GBS阳性质控DNA模板、阴性质控DNA模板中分别加入灭菌水和所述试剂盒中的数字PCR反应缓冲液，分别配制得到样品、GBS阳性质控品、GBS阴性质控品的数字PCR反应混合液；
④制作油包水PCR微反应液滴：将步骤③制备的样品、GBS阳性质控、GBS阴性质控的数字PCR反应混合液分别制作为油包水PCR微反应液滴；然后对所述微反应液滴进行PCR扩增反应；
⑤将PCR反应板放入荧光读取仪器中读数分析。
本发明通过数字PCR反应缓冲液的配制与检测GBS的特异性引物对和探针、内标的引物对和探针，结合数字PCR检测的方法，达到了检测灵敏度高、能精确检测低浓度样本的技术效果，且能稳定实施。
实施例1 一种用于检测GBS的数字PCR检测试剂盒的组成
一种用于检测GBS的数字PCR检测试剂盒，主要包含以下几种成分：DNA提取液、数字PCR反应缓冲液、GBS阳性质控、GBS阴性质控、和内标溶液。具体组分如下：
所述数字PCR反应缓冲液中的上游引物F包括检测GBS的上游引物和内标的上游引物。
所述数字PCR反应缓冲液中的下游引物R包括检测GBS的下游引物和内标的下游引物。
所述数字PCR反应缓冲液中的探针P包括检测GBS的探针和内标的探针。
所述检测GBS的特异性引物对和探针以及内标的引物对和探针序列如下：
序号 序列（5’→3’）
GBS上游引物 AACCGTCACCTTATTCTAGCA
GBS下游引物 GTACTATTGCAGTGGCTAGCT
GBS探针 CGAAGCCCAGCAAATGGA
内标上游引物 TACAGGATGCAGAAGGAGA
内标下游引物 GTGGAAGGTGGACAGTGAG
内标探针 TGGATCACATGTGGATTACTGGA
所述检测GBS的探针5’端连接FAM荧光报告基团，所述内标探针5’端连接VIC荧光报告基团，所述检测GBS的探针与内标探针3’端均连接BHQ淬灭基团。
实施例2 试剂盒精确度检测
一种用于检测GBS的数字PCR检测试剂盒具体检测方法包括如下步骤：
①受检样品处理：取新生儿口腔黏液或孕妇阴道分泌物将作为待检测样品，将待测样品用无菌生理盐水1ML洗涤并离心弃去上清液后，加入灭菌水500ul震荡混匀，向震荡混匀后的溶液中加入所述试剂盒中的DNA提取液50ul和内标溶液100ul，剧烈震荡混匀，并于100℃恒温处理5分钟，再于12,000rpm离心5分钟，取上清液，作为PCR扩增样品DNA模板。
②质控品的处理：取所述试剂盒中的GBS阳性质控和阴性质控品，按照与步骤①相同的方法处理， GBS阳性质控和阴性质控的DNA模板；
③配制数字PCR反应混合液：向步骤①处理后得到的样品DNA模板、步骤②处理后得到的GBS阳性质控DNA模板、阴性质控DNA模板与灭菌水和所述试剂盒中的数字PCR反应缓冲液2:1:2比例加入，分别配制得到样品、GBS阳性质控品、GBS阴性质控品的数字PCR反应混合液。
④将步骤③制备的样品、GBS阳性质控、GBS阴性质控的数字PCR反应混合液分别制作为油包水PCR微反应液滴，将制备好的相应PCR微反应液滴转移至96孔反应板，并用封板膜进行热封，生成的微反应液滴数量为10,000~20,000个，然后对所述微反应液滴进行PCR扩增反应；
⑤读取荧光信号：步骤④PCR扩增后，将PCR反应板放入荧光读取仪器中，PCR扩增反应条件可以为：50℃ 3min，95℃ 5min，95℃ 5s，55℃ 30S，30个循环；分别在FAM和VIC通道检测FAM和VIC荧光信号。FAM通道检测GBS，VIC通道检测内标，根据荧光微滴数量，通过Quantasoft软件对各自通道样品进行定量。
⑥结果分析：阳性质控品在FAM通道和VIC通道中检测到，即FAM通道检测到GBS阳性质粒，VIC通道检测到GBS内标，根据荧光微滴数，通过配套软件Quantasoft计算，可以计算出GBS的拷贝数。阴性对照为生理盐水，在FAM和VIC通道都无检测反应，阴性对照反应微滴数应为0，计算出来的拷贝数为0。
本实施例中，
图1为阳性质控品分析结果，FAM通道和VIC通道都可以检测到信号，拷贝数均为100copies/ul。
图2为阴性质控品分析结果，FAM通道和VIC通道检测都无信号，阴性样品定量结果为0copies/ul。
图3为临床样品分析结果，FAM通道可以检测到信号，拷贝数为50~1500copies/ul；VIC通道可以检测到信号，拷贝数为100~1000copies/ul；说明此样品为临床阳性
图4为临床样品分析结果，FAM通道检测不到信号，拷贝数为0copies/ul；VIC通道都可以检测到信号，拷贝数为200~1000copies/ul；说明此样品为临床阴性。
本发明提供的方法和试剂盒检测结果精确，可以在具有数字PCR的医院或科研机构完成，结果判读直观可靠。
实施例3 试剂盒灵敏度检测
①受检样品处理：取拷贝数为1、10、100拷贝的待测样本，加入所述试剂盒中的DNA提取液50ul和内标溶液100ul，剧烈震荡混匀，并于100℃恒温处理5分钟，再于12,000rpm离心5分钟，取上清液，作为PCR扩增样品DNA模板。
②配制数字PCR反应混合液：向步骤①处理后得到的样本DNA模板和所述试剂盒中的数字PCR反应缓冲液2:1:2比例加入，配制得到样本的数字PCR反应混合液。
③将步骤②制备的样品的数字PCR反应混合液制作为油包水PCR微反应液滴，将制备好的相应PCR微反应液滴转移至96孔反应板，并用封板膜进行热封，生成的微反应液滴数量为10,000~20,000个，然后对所述微反应液滴进行PCR扩增反应；
④读取荧光信号：步骤③PCR扩增后，将PCR反应板放入荧光读取仪器中，PCR扩增反应条件可以为：50℃ 3min，95℃ 5min，95℃ 5s，55℃ 30S，30个循环；分别在FAM和VIC通道检测FAM和VIC荧光信号。FAM通道检测GBS，VIC通道检测内标，根据荧光微滴数量，通过Quantasoft软件对各自通道样品进行定量。
⑤结果分析：样本在FAM通道和VIC通道中检测到，根据荧光微滴数，通过配套软件Quantasoft计算，可以计算出GBS的拷贝数。
本实施例中，图5为拷贝数为1的样本分析结果，FAM通道和VIC通道都可以检测到信号，FAM通道拷贝数为1copies/ul。图6为拷贝数为10的样本分析结果，FAM通道和VIC通道都可以检测到信号，FAM通道拷贝数为10copies/ul。图7为拷贝数为100的样本分析结果，FAM通道和VIC通道都可以检测到信号，FAM通道拷贝数为100copies/ul。
本实施例中试剂盒可检测出低至1个拷贝数，灵敏度高，解决了实时荧光定量PCR技术无法精确检测低浓度样本的不足之处。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 广州和实生物技术有限公司
<120> 一种用于检测GBS的数字PCR检测试剂盒及检测方法
<130> 2017
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> B族链球菌(Sagalactiae)
<400> 1
aaccgtcacc ttattctagc a 21
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> B族链球菌(Sagalactiae)
<400> 2
gtactattgc agtggctagc t 21
<210> 3
<211> 18
<212> DNA
<213> B族链球菌(Sagalactiae)
<400> 3
cgaagcccag caaatgga 18
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> B族链球菌(Sagalactiae)
<400> 4
tacaggatgc agaaggaga 19
<210> 5
<211> 19
<212> DNA
<213> B族链球菌(Sagalactiae)
<400> 5
gtggaaggtg gacagtgag 19
<210> 6
<211> 23
<212> DNA
<213> B族链球菌(Sagalactiae)
<400> 6
tggatcacat gtggattact gga 23
Claims (9)
1.一种用于检测GBS的数字PCR检测试剂盒，其特征在于：该试剂盒包含数字PCR反应缓冲液、检测GBS的特异性引物对和探针及内标的引物对和探针，所述数字PCR反应缓冲液包括Tris-HCL、KAC、DTT、MgCl2、硫酸铵、dNTP、PEG35K、UDG酶、Taq酶、上游引物F、下游引物R、探针P；所述检测GBS的特异性引物对和探针的序列如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ IDNO:3所示；所述内标的引物对和探针的序列如SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6所示。
2.根据权利要求1所述的一种用于检测GBS的数字PCR检测试剂盒，其特征在于：所述数字PCR反应缓冲液中的上游引物F包括检测GBS的上游引物和内标的上游引物。
3.根据权利要求1所述的一种用于检测GBS的数字PCR检测试剂盒，其特征在于：所述数字PCR反应缓冲液中的下游引物R包括检测GBS的下游引物和内标的下游引物。
4.根据权利要求1所述的一种用于检测GBS的数字PCR检测试剂盒，其特征在于：所述数字PCR反应缓冲液中的探针P包括检测GBS的探针和内标的探针。
5.根据权利要求1所述的一种用于检测GBS的数字PCR检测试剂盒，其特征在于：所述检测GBS的探针及内标探针5’端连接有荧光报告基团，所述检测GBS的探针及内标探针3’端连接有淬灭基团，所述荧光报告基团可选自FAM、CY5、HEX、VIC中任一种，所述淬灭基团均为BHQ。
6.根据权利要求1所述的一种用于检测GBS的数字PCR检测试剂盒，其特征在于：该试剂盒还包括DNA提取液、GBS阳性质控、GBS阴性质控、内标溶液。
7. 根据权利要求1所述的一种用于检测GBS的数字PCR检测试剂盒，其特征在于：所述数字PCR反应缓冲液的组分包括：
组分 浓度（摩尔浓度/酶浓度/质量浓度）
Tris-HCL 100mmol/L~200mmol/L
KAC 20m mol/L~30mmol/L
DTT 2m mol/L~3mmol/L
MgCl2 5mmol/L~8mmol/L
硫酸铵 1m mol/L~5mmol/L
dNTP 100m mol/L~200mmol/L
PEG35K 2%~5%
UDG酶 1U/UL~2U/uL
Taq 酶 1U/UL~2U/uL
上游引物F 20Pmo1/uL~25Pmol/uL
下游引物R 20Pmo1'uL~25Pmol/uL
探针P 10Pmol uL~15Pmol/uL。
8.根据权利要求7所述的一种用于检测GBS的数字PCR检测试剂盒，其特征在于：所述Tris-HCL的pH为6.0~9.0。
9.一种用于检测GBS的数字PCR检测试剂盒的检测方法，其特征在于：该方法包括以下步骤：
①受检样品处理：取新生儿口腔黏液或孕妇阴道分泌物将作为待检测样品，将待测样品用无菌生理盐水洗涤并离心弃去上清液后，加入灭菌水震荡混匀，向震荡混匀后的溶液中加入所述试剂盒中的DNA提取液和内标溶液，剧烈震荡混匀，并于100℃恒温处理5分钟，再于12,000rpm离心5~10分钟，取上清液，作为PCR扩增样品DNA模板。
②质控品的处理：取所述试剂盒中的GBS阳性质控和阴性质控品，按照与步骤①相同的方法处理，得到GBS阳性质控和阴性质控的DNA模板；
③配制数字PCR反应混合液：向步骤①处理后得到的样品DNA模板、步骤②处理后得到的GBS阳性质控DNA模板、阴性质控DNA模板中分别加入灭菌水和所述试剂盒中的数字PCR反应缓冲液，分别配制得到样品、GBS阳性质控品、GBS阴性质控品的数字PCR反应混合液；
④制作油包水PCR微反应液滴：将步骤③制备的样品、GBS阳性质控、GBS阴性质控的数字PCR反应混合液分别制作为油包水PCR微反应液滴；然后对所述微反应液滴进行PCR扩增反应；
⑤将PCR反应板放入荧光读取仪器中读数分析。
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| CN108866164A (zh) * | 2018-07-05 | 2018-11-23 | 南方医科大学 | B族链球菌的检测方法及试剂盒 |
| CN113462768A (zh) * | 2021-07-29 | 2021-10-01 | 中国医学科学院整形外科医院 | 一种利用ddPCR检测小耳畸形患者ECR区域的拷贝数的引物及试剂盒 |
| CN113462768B (zh) * | 2021-07-29 | 2023-05-30 | 中国医学科学院整形外科医院 | 一种利用ddPCR检测小耳畸形患者ECR区域的拷贝数的引物及试剂盒 |
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